Получение рекомбинантных энтеротоксинов Staphylococcus aureus в Escherichia coli. Исследование на их модели роли сигнальных пептидов в транслокации белков в периплазматическое пространство E. coli. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Манувера, Валентин Александрович

• Манувера, Валентин Александрович
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Манувера, Валентин Александрович

1 Введение.

2 Трансмембранный транспорт белков у бактерий.

2.1 Истинная секреция у грамотрицательных бактерий.

2.2 Бес-система трансмембранной транслокации белков у бактерий.

2.2.1 Адресация синтезируемых полипептидов в транслоказу.

2.2.1.1 Структура сигнальной последовательности субстратов Secтранслоказы.

2.2.1.2 Адресация при участии SRP.

2.2.1.3 Адресация при участии шаперона SecB.

2.2.1.4 Взаимоотношение SRP- и SecB/SecA-зависимых способов адресации.

2.2.2 Структура и функции See-транслоказы.

2.2.2.1 Стехиометрия компонентов транслоказы.

2.2.2.2 SecA— молекулярный мотор транслоказы.

2.2.2.3 Трансмембранный комплекс SecYEG — кор транслоказы.

2.2.2.4 Роль Sec-транслоказы в биогенезе мембранных белков.

2.2.2.5 Сигнальные пептидазы первого типа (SPasel).

2.2.2.6 Общая схема функционирования Бес-системы транслокации.

2.2.3 Образование транслоцированными полипептидами нативной конформации в периплазме.

2.3 ТАТ-система трансмембранной транслокации белков у бактерий.

2.3.1 Сигнальные пептиды субстратов ТАТ-системы.

2.3.2 Структурные компоненты ТАТ-системы.

2.3.3 Особенности функционирования ТАТ-системы транслокации.

2.4 Использование трансмембранного транспорта при получении рекомбинантных белков.

3 Энтеротоксины Staphylococcus aureus.

3.1 Структура стафилококковых энтеротоксинов.

3.1.1 Пространственная структура.

3.1.2 Взаимодействие SE с молекулами МНС II.

3.1.3 Связывание с TCR.

3.2 Роль стафилококковых энтеротоксинов в патогенезе.

3.2.1 Стафилококковые пищевые отравления (SFP).

3.2.2 Синдром токсического шока (TSS).

3.3 Медицинское значение энтеротоксинов S.aureus.

3.3.1 Усиление специфичного иммунного ответа.

3.3.2 Терапия опухолей.

3.3.3 Создание вакцин против стафилококковых энтеротоксинов.

3.3.4 Перспективы медицинского применения стафилококковых энтеротоксинов.

4 Материалы и методы.

4.1 Материалы.

4.1.1 Реактивы.

4.1.2 Ферменты.

4.1.3 Бактериальные штаммы и плазмиды.

4.1.4 Микробиологические среды.

4.1.5 Олигонуклеотиды.

4.2 Методы.

4.2.1 Полимеразная цепная реакция.

4.2.2 Выделение хромосомной ДНК S.aureus.

4.2.3 Операции с ДНК.

4.2.4 Электрофоретическое разделение белков.

4.2.5 Иммуноблот.

4.2.6 Фракционирование клеток E.coli.

4.2.7 Очистка рекомбинантного SEB с помощью ионообменной хроматографии.

4.2.8 Очистка рекомбинантных SEA и SEB с помощью аффинной хроматографии.

5 Результаты и обсуждение.

5.1 Клонирование генов, кодирующих SEA и SEB. Изучение их экспрессии в

E.coli.

5.1.1 Получение плазмид для экспрессии SEA и SEB в E.coli.

5.1.2 Исследование экспрессии рекомбинантных SEA и SEB в клетках E.coli.

5.2 Исследование влияния на эффективность трансмембранной транслокации энтеротоксина А первичной структуры его сигнального пептида.

5.2.1 Конструирование форм энтеротоксина А с измененным сигнальным пептидом и исследование накопления рекомбинантных белков в клетках

E.coli.

5.2.2 Вероятный механизм влияния исследованных вариантов аминокислотных замен в сигнальном пептиде SEA на его функцию.

5.3 Очистка рекомбинантных SEB и SEA.

5.3.1 Очистка SEB путем ионообменной хроматографии.

5.3.2 Биологическое тестирование очищенного препарата SEB.

5.3.3.0чистка SEA и SEB путем аффинной хроматографии.

5.3.3.1 Получение форм SEA и SEB, несущих С-концевой гексагистидиновый мотив.

5.3.3.2 Проведение аффинной хроматографии.

5.4 Исследование роли сигнальных пептидов в транслокации рекомбинантных белков в периплазматическое пространство E.coli на модели энтеротоксинов из S. aureus.

5.4.1 Клонирование гена, кодирующего ТогА и исследование его внутриклеточной локализации при гиперэкспрессии в E.coli.

5.4.2 Конструирование плазмид для исследование роли сигнальных пептидов в транслокации рекомбинантных белков.

5.4.3 Исследование накопления гибридных белков в клетках Е.coli.

5.4.4 Возможные механизмы взаимного влияния сигнального пептида и зрелой части белка на эффективность процесса транслокации.

6 Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение рекомбинантных энтеротоксинов Staphylococcus aureus в Escherichia coli. Исследование на их модели роли сигнальных пептидов в транслокации белков в периплазматическое пространство E. coli.»

Бактериальная клетка отделена от внешней среды плазматической мембраной, основу которой составляет гидрофобный двойной слой липидов. Основополагающая функция мембраны — барьерная. Она отделяет содержимое клетки от окружающей среды, делая возможным поддержание гомеостаза и защищая от внешних воздействий. При этом, мембрана работает как высоко селективный фильтр, избирательно пропуская одни соединения, задерживая другие и активно перемещая третьи. Задачи транспорта решаются целым рядом селективных белковых каналов и активных транспортеров, ассоциированных с мембраной.

Для нормального функционирования клетки необходимо перенести через плазматическую мембрану или встроить в нее большое количество различных белков. Задачу по перемещению через гидрофобный слой высокомолекулярных полипептидных субстратов решают специальные системы, состоящие из большого количества компонентов и утилизирующие производимую клеткой энергию в виде нуклеозидтрифосфатов и/или трансмембранного электрохимического потенциала [2]. Основная система трансмембранного транспорта белков — 8ес-транслоказа. С её помощью происходит выведение из цитоплазмы наружу несвернутых полипептидов или их встраивание в мембрану. Открытая позднее ТАТ-система позволяет преодолевать мембранный барьер белкам, имеющим нативную третичную или даже четвертичную структуру [3].

Актуальность темы исследования.

Активные исследования трансмембранного транспорта белков ведутся в течение последних четырех десятилетий, что позволило вскрыть молекулярные аспекты этого процесса. В тоже время, в данной области в настоящее время остается значительное количество нерешенных проблем. Доказано, что для транспорта полипептида через мембрану он должен иметь аминоконцевой участок с характерной структурой — т.н. сигнальный пептид [2]. Однако, как следует из большого количества экспериментов, его наличие в составе рекомбинантных белков далеко не всегда приводит к их транслокации. В настоящее время до конца не ясно, какое влияние на трансмембранный транспорт полипептидов оказывает структура их зрелой части, в частности, присутствуют ли в полипептидах какие-либо необходимые для переноса элементы, помимо сигнального пептида. Не разработана также проблема взаимного влияния структуры сигнального пептида и остальной части белка. Одной из нерешенных окончательно проблем остается эффективная секреция рекомбинантных белков в периплазматическое пространство или кулыуральную среду.

Одним из характерных субстратов Бес-системы транслокации являются энтеротоксины грамположительной патогенной бактерии Staphylococcus aureus. В процессе размножения в организме млекопитающих, данный микроорганизм секретирует большое количество энтеротоксинов нескольких типов [4]. По механизму действия они относятся к группе так называемых суперантигенов — белков, вызывающих неспецифическую активацию больших субпопуляций Т-лимфоцитов. Их главная задача — подавление иммунного ответа организма-хозяина [4]. Действием стафилококковых энтеротоксинов обусловлен ряд заболеваний, в том числе пищевые отравления и синдром токсического шока [4]. Особенности воздействия стафилококковых энтеротоксинов на иммунную систему человека делают их потенциальным объектом для создания медицинских препаратов различного назначения — иммуностимуляторов, усилителей иммунного ответа при вакцинации, компонентов противоопухолевых лекарств (см. п. 3.3).

В настоящее время стафилококковые энтеротоксины, в том числе и рекомбинантные, получают, в основном, из культур S.aureus. Данный микроорганизм одновременно продуцирует большое количество различных токсинов, поэтому получение препарата со степенью очистки, допускающей медицинское применение, связано со значительными трудностями. Получение рекомбинантных энтеротоксинов в экспрессионной системе Escherichia coli позволяет упростить наработку и выделение данных белков. Поскольку генно-инженерные методы для E.coli отработаны лучше, чем для любого другого организма, при этом открываются широкие возможности по модификации исходных белков посредством сайт-направленого мутагенеза и созданию комплексных многофункциональных препаратов в виде энтеротоксинов, слитых с другими белками.

Нами было показано, что аутентичные сигнальные пептиды ряда стафилококковых энтеротоксинов обеспечивают транспорт этих белков в периплазму при гетерологичной экспрессии в клетках E.coli. Несмотря на сходство пространственной структуры, разные типы стафилококковых энтеротоксинов имеют идентичность аминокислотной последовательности лишь около 30% [5] и различные по структуре сигнальные пептиды. Данное обстоятельство позволило нам использовать полученные рекомбинантные токсины в качестве модели, комбинируя различные лидерные последовательности и зрелые части белков, заведомо способных к переносу в перплазматическое пространство E.coli. Подобный подход мы использовали для ответа на вопросы о том, является ли наличие сигнального пептида достаточным условием для трансмембранной транслокации полипептидов и в какой степени сигнальные последовательности могут быть взаимозаменяемыми.

Цели и задачи работы.

Целью работы являлось:

1. конструирование штаммов-продуцентов E.coli для получения стафилококковых энтеротоксинов А и В;

2. выделение рекомбинантных энтеротоксинов А и В в гомогенной форме;

3. изучение влияния сигнальных пептидов на внутриклеточную локализацию белков на модели энтеротоксинов S. aureus при их гетерологичной экспрессии в E.coli.

В ходе работы ставились следующие задачи:

1. клонировать участки ДНК, кодирующие стафилококковые энтеротоксины А и В и получить экспрессионные плазмиды для E.coli;

2. отработать гетерологичную экспрессию стафилококковых энтеротоксинов А и В в E.coli, изучить их внутриклеточную локализацию;

3. отработать методы очистки энтеротоксинов А и В;

4. провести перекрестный обмен сигнальными пептидами между энтеротоксинами А, В, Н из S. aureus, стрептавидином из Streptomyces avidinii, а также получить формы этих белков с заменой аутентичного сигнала транслокации на сигнальный пептид белка E.coli ТогА, который является субстратом альтернативной Sec-транелоказе транспортной системы — TAT (twin arginine translocation);

5. исследовать внутриклеточную локализацию полученных гибридных белков;

6. изучить влияние ряда аминокислотных замен на функциональную роль сигнального пептида энтеротоксина А.

Научная новизна.

В результате проведенных исследований впервые получены штаммы E.coli, продуцирующие стафилококковые энтеротоксины А и В в растворимой форме. Показано, что аутентичные сигнальные пептиды данных белков обеспечивают их локализацию в периплазме при гетерологичной экспрессии в E.coli. Отработана высокотехнологичная хроматографическая методика выделения SEA и SEB и получены очищенные препараты данных белков. Сконструирован ряд гибридных полипептидов и исследована их локализация в клетках E.coli, в результате чего показано, что наличие сигнального пептида является необходимым, но недостаточным условием для трансмембранной транслокации данных белков.

Практическая значимость.

Практическая значимость данной работы заключается в двух аспектах. Во-первых, полученные штаммы-продуценты SEA и SEB могут быть использованы для наработки препаратов данных белков в значительных количествах без использования в работе патогенных культур S.aureus. При этом открываются широкие возможности по модификации данных токсинов, генетическому и химическому конъюгированию их с другими белками. Это, в свою очередь, позволяет проводить исследования воздействия энтеротоксинов на иммунную систему млекопитающих и их противоопухолевой активности. В перспективе, модифицированные токсины могут найти практическое применение в медицинской практике — данному направлению в настоящее время уделяется большое внимание при конструировании противоопухолевых препаратов нового типа.

Во-вторых, проведенные исследования влияния сигнальных пептидов на трансмембранный транспорт модельных белков позволяют определить несколько направлений анализа структурно-функциональных взаимоотношений в системе сигнальный пептид — секретируемый полипептид. Результаты, полученные в данной работе закладывают хорошую базу для дальнейших исследований в данной области, которые могут помочь в поиске путей оптимизации переноса рекомбинантных белков в периплазму E.coli, что является актуальной задачей современной биотехнологии. Периплазматическая локализация существенно облегчает выделение и очистку рекомбинантных белков, а также позволяет существенно уменьшить проблемы, связанные с токсичностью продукта для продуцирующих его клеток и, в значительной степени, с образованием телец включения.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Манувера, Валентин Александрович

6 Выводы

1. Получены штаммы-продуценты на основе E.coli, синтезирующие рекомбинантные энтеротоксины А и В Staphylococcus aureus. Впервые достоверно показано, что в культуре клеток E.coli, продуцирующих про-энтеротоксин В, его зрелая форма накапливается в периплазматической фракции клеток. При продукции клетками E.coli зрелой формы энтеротоксина В он обнаруживается в цитоплазматической фракции. Показано, что в культуре E.coli, продуцирующих про-энтеротоксин А, рекомбинантный белок в периплазме не накапливается, а ассоциирован с мембранной фракцией клеток.

2. С помощью сайт-направленного мутагенеза получены варианты энтеротоксина А с измененным сигнальным пептидом, которые приобрели способность к транслокации в периплазматическое пространство E.coli. Показано, что для внутриклеточной локализации данного белка существенную роль играет структура С-участка его сигнального пептида.

3. Отработаны методики очистки зрелых энтеротоксинов А и В. Белки выделены в гомогенной форме.

4. Исследовано взаимное влияние сигнального пептида и зрелой части белка на эффективность процесса трансмембранной транслокации. Показано, что наличие сигнального пептида является необходимым, но недостаточным условием для трансмембранной транслокации белков посредством Бес-системы. Для трансмембранного переноса белка дополнительно требуется совместимость его сигнального пептида и зрелой части.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Манувера, Валентин Александрович, 2009 год

1. Roberts R.J., Belfort М., Bestor Т., Bhagwat A.S., Bickle Т.А., et al. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes // Nucleic Acids Res 2003 - Vol. 31 - №7 - R 18051812.

2. Pugsley A. The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria //Microbiol. Rev 1993 - Vol.50 -№1 -P. 50-108.

3. Natale P., Briiser Т., Driessen A.J.M. Sec- and Tat-mediated protein secretion across the bacterial cytoplasmic membrane — distinct translocases and mechanisms //Biochim. Biophys. Acta -2008 -Vol. 1778 -P. 1735-1756.

4. Dinges M.M., Orwin P.M., Schlievert P.M. Exotoxins of Staphylococcus aureus II Clin. Microbiol. Rev -2000 Vol. 13 -№1 -P. 16-34.

5. Beveridge T.J., Graham L.L. Surface layers of bacteria // Microbiol. Rev. -1991 -Vol. 55-№4 -P. 684-705.

6. Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем. М.:Мир, 1987.-567с.

7. Lee V.T., Schneewind О. Protein secretion and the pathogenesis of bacterial infections // Genes and Development 2001 - Vol. 15 - P. 1725-1752.

8. Kostakioti M., Newman C.L., Thanassi D.G., Stathopoulos C. Mechanisms of protein export across the bacterial outer membrane // J. Bacteriol. 2005 - Vol. 187 -№13-P. 4306-4314.

9. Henderson I. R., Navarro-Garcia F., Desvaux M., Fernandez R.C., Ala'Aldeen D. Type V protein secretion pathway: the autotransporter story // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004 - Vol. 68 - №4 - P. 692-744.

10. Lory S. Determinants of extracellular protein secretion in gram-negative bacteria // J. Bacteriol. 1992 - Vol. 174 - №11 - P. 3423-3428.

11. Holland I.B., Schmitt L., Young J. Type 1 protein secretion in bacteria, the ABC-transporter dependent pathway // Mol. Membr. Biol. 2005 - Vol. 22 - P. 2939.

12. Fath M.J., Kolter R. ABC transporters: bacterial exporters // Microbiol. Rev. -1993 Vol. 57-№4-P. 995-1017.

13. Sandkvist, M. Biology of type II secretion // Mol. Microbiol. 2001 - Vol. 40-P. 271-283.

14. Thanassi, D. G. Ushers and secretins: channels for the secretion of folded proteins across the bacterial outer membrane // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2002 - Vol. 4-P. 11-20.

15. Ghosh P. Process of protein transport by the type III secretion system // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004 - Vol. 68 - №4 - P. 771-795.

16. Gauthier A., Thomas N.A., Finlay B. Bacterial injection machines // J. Biol. Chem. 2003 - Vol. 278 - P. 25273-25276.

17. Hueck C.J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998 - Vol. 62 - №2 - P. 379-433.

18. Manting E.H., Driessen A. J. M. Escherichia coli translocase: the unravelling of a molecular machine // Mol. Microbiol. 2000 - Vol. 37 - №2 - P. 226-238.

19. Dalbey R.E., Kuhn A. Evolutionarily related insertion pathways of bacterial, mitochondrial, and thylakoid membrane proteins // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2000 -Vol. 16-P. 51-87.

20. Harrison S.C., Rapoport T.A. X-ray structure of a protein-conducting channel // Nature 2004 - Vol. 427 - 36-44.

21. Robson A., Collinson I. The structure of the Sec complex and the problem of protein translocation // EMBO rep. 2006 - Vol. 7 - №11 - R 1099-1103.

22. Rusch S.L., Kendall D.A. Oligomeric states of the SecA and SecYEG core components of the bacterial Sec translocon. Biochim // Biophys. Acta 2007 - Vol. 1768- P. 5-12.

23. Bieker K. L., Phillips G. J., Silhavy T. J. The sec and prl genes of Escherichia coli // J. Bioenerg. Biomembr. 1990 - Vol. 22 - P. 291-310.

24. Schatz P. J., Beckwith J. Genetic analysis of protein export in Escherichia coli//Annu. Rev. Genet. 1990 - Vol. 24 - P. 215-248.

25. Hanada M., Nishiyama K.I., Mizushima S., Tokuda H. Reconstitution of an efficient protein translocation machinery comprising SecA and the three membrane proteins, SecY, SecE, and SecG (pi2) // J. Biol. Chem. 1994 - Vol. 269 - P. 2362523631.

26. Brundage L., Hendrick J.P., Schiebel E., Driessen A.J.M., Wickner W. The purified E.coli integral membrane protein SecY/E is sufficient for reconstitution of SecA-dependent precursor protein translocation // Cell 1990 - Vol. 62 - P. 649-657.

27. Blobel G., Dobberstein B. Transfer of proteins across membranes // J. Cell Biol. 1975 - Vol. 67 - P. 835-851.

28. Kim J., Kendall D.A. Sec-dependent protein export and the involvement of the molecular chaperone SecB // Cell Stress Chaperones 2000 - Vol. 5 - P. 267275.

29. Fekkes P., Driessen A.J.M. Protein targeting to the bacterial cytoplasmic membrane // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999 - Vol. 63 -№1 - P. 161-173.

30. Choi J.H., Lee S.Y. Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli //Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004 - Vol. 64 - P. 625-635.

31. Tuteja R. Type I signal peptidase: An overview // Arch. Biochem. Biophys. -2005-Vol. 441-P.107-111.

32. Nagai K., Oubridge C., Kuglstatter A., Menichelli E., Isel C., Jovine L. Structure, function and evolution of the signal recognition particle // EMBO J. -2003 Vol. 22 - №14 - P. 3479-3485.

33. Yamane K., Bunai K., Kakeshita H. Protein traffic for secretion and related machinery of Bacillus subtilis // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2004 - Vol. 68 -№10-P. 2007-2023.

34. Batey R. T., Rambo R. P., Lucast L., Rha B., Doudna J. A. Crystal structure of the ribonucleoprotein core of the signal recognition particle // Science 2000 - Vol. 287 - P. 1232-1239.

35. Poritz M.A., Strub K., Walter P. Human SRP RNA and E.coli 4,5S RNA contain a highly homologous structural domain // Cell 1988 - Vol. 55 - P. 4-6.

36. Nakamura K., Fujii Y., Shibata T., Yamane K. Depletion of Escherichia coli 4,5S RNA leads to an increase in the amount of protein elongation factor EF-G associated with ribosomes // Eur. J. Biochem. 1999 - Vol. 259 - P. 543-550.

37. Ribes V., Romisch K., Giner A., Dobberstein B., Tollervey D. E.coli 4.5S RNA is part of a ribonucleoprotein particle that has properties related to signal recognition particle // Cell 1990 - Vol. 63 - P. 591-600.

38. Nakamura K., Imai Y., Nakamura A., Yamane K. Small cytoplasmic RNA of Bacillus subtilis: functional relationship with human signal recognition particle 7S RNA and Escherichia coli 4,5S RNA // J. Bacteriol. 1992 - Vol. 174 - №7 - P. 2185-2192.

39. Bernstein H. D., Poritz M. A., Strub K., Hoben P. J., BrennerS., Walter P. Model for signal sequence recognitionfrom amino-acid sequence of 54K subunit of signal recognitionparticle // Nature 1989 - Vol. 340 - P. 482-486.

40. Keenan R. J., Freymann D. M., Stroud, R. M., Walter P. The signalrecognition particle //Annu. Rev. Biochem. 2001 - Vol. 70 - P. 755-775.

41. Romisch It., Webb J., Lingelbach K., Gausepohl H., Dobberstein B. The 54-kD protein of signal recognition particle contains a methionine-rich RNA binding domain// J. Cell. Biol 1990-Vol. Ill-P. 1793-1802.

42. Zorf D., Bernstein H.D., Walter P. GTPase domain of the 54-kD subunit of the mammalian signal recognition particle is required for protein translocation but not for signal sequence binding // J. Cell Biol. 1993 - Vol. 120-P. 1113-1121.

43. Keenan R. J., Freymann D. M., Walter P., Stroud R. M. Crystal structure of the signal sequence binding subunitof the signal recognition particle // Cell 1998 -Vol. 94-P. 181-191.

44. Dekker C., de Kruijff B., Grosb P. Crystal structure of SecB from Escherichia coli // J. Struct. Biol. 2003 - Vol. 144 - P. 313-319.

45. Xu Z., Knafels J. D., Yoshino K. Crystal structure of the bacterial protein export chaperone SecB // Nat. Struct. Biol. 2000 - Vol. 7 - P. 1172-1177.

46. Knoblauch N., Rudiger S., Schonfeld H.-J., Driessen A.J.M., Schneider-Mergener J., Bukau B. Substrate specificity of the SecB chaperone // J. Biol. Chem. -1999-Vol. 274-P. 34219-34225.

47. Fekkes P., van der Does C., Driessen A. J. M. The molecular chaperone SecB is released from the carboxy-terminus of SecA during initiation of precursor protein translocation // EMBO J. 1997 - Vol. 16 - №20 - P. 6105-6113.

48. Hesterkamp T., Hauser S., Lutclce H., Bukau, B. Escherichia coli trigger factor is a prolyl isomerase that associates with nascent polypeptide chains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 - Vol. 93 - P. 4437-4441.

49. Valent Q.A., Kendall D.A., High S., Kusters R., Oudega B., Luirink J. Early events in preprotein recognition in E. coli: interaction of SRP and trigger factor with nascent polypeptides // EMBO J. 1995 - Vol. 14 - №22 - P. 5494-5505.

50. Beck K., Wu L.F., Brunner J., Muller M. Discrimination between SRP- and SecA/SecB-dependent substrates involves selective recognition of nascent chains by SRP and trigger factor // EMBO J. 2000 - Vol. 19 - №1 - P. 134-143.

51. Lee H. C. and Bernstein H. D. Trigger factor retards protein export in Escherichia coli//J. Biol. Chem. 2002 - Vol. 277 - P. 43527-43535.

52. Nishiyama K., Hanada M., Tokuda H. Disruption of the gene encoding pl2 (SecG) reveals the direct involvement and important function of SecG in the protein translocation of Escherichia coli at low temperature // EMBO J. 1994 - Vol. 13 -№14-P. 3272-3277.

53. Tomkiewicz D., Nouwen N., Driessen A.J.M. Pushing, pulling and trapping -Modes of motor protein supported protein translocation // FEBS Let. 2007 - Vol. 581 - P. 2820-2828.

54. Rusch S.L., Kendall D.A. Oligomeric states of the Sec A and SecYEG core components of the bacterial Sec translocon // Biochim. Biophys. Acta 2007 - Vol. 1768-P. 5-12.

55. Vrontou E., Economou A. Structure and function of SecA, the preprotein translocase nanomotor // Biochim. Biophys. Acta 2004 - Vol. 1694 - P. 67-80.

56. Veenendaal A.K.J., van der Does C., Driessen A.J.M. The protein-conducting channel SecYEG // Biochim. Biophys. Acta 2004 - Vol. 1694 - P. 81-95.

57. Bessonneau P., Besson V., Collison I., Duong F. The SecYEG preprotein translocation channel is a conformationally dynamic and dimeric structure // EMBO J.-2002-Vol. 21 -№5-P. 995-1003.

58. Collinson I., Breyton C., Duong F., Tziatzios C., Schubert D., Or E., Rapoport T., Kuhlbrandt W. Projection structure and oligomeric properties of a bacterial core protein translocase // EMBO J. 2001 - Vol. 20 - №10 - P. 2462-2471.

59. Papanikolau Y., Papadovasilaki M., Ravelli R.B.G., McCarthy A.A., Cusack S., Economou A., Petratos K. Structure of dimeric SecA, the Escherichia coli preprotein translocase motor // J. Mol. Biol. 2007 - Vol. 366 - P. 1545-1557.

60. Breyton C., Haase W., Rapoport T.A., Kuhlbrandt W., Collinson I. Three-dimensional structure of the bacterial protein-translocation complex SecYEG //

61. Nature 2002 - Vol. 418 - P. 662-665.

62. Mitra K., Schaffitzel C., Shaikh Т., Tama F., Jenni S., Brooks C.L. 3rd, Ban N., Frank J. Structure of the E. coli protein-conducting channel bound to a translating ribosome // Nature 2005 - Vol. 438 - P. 318-324.

63. Cristobal S., Scotti P., Luirink J., von Heijne G., de Gier J.W. The signal recognition particle-targeting pathway does not necessarily deliver proteins to the sec-translocase in Escherichia coli // J. Biol. Chem. 1999 - Vol. 274 - P. 2006820070.

64. Dalbey R., Chen M. Sec-translocase mediated membrane protein biogenesis // Biochim. Biophys. Acta 2004 - Vol. 1694 - P. 37-53.

65. Dabley R., Kuhn A. YidC family members are involved in the membrane insertion, lateral integration, folding, and assembly of membrane proteins // J. Cell Biol. 2004 - Vol. 166 - №6 - P. 769-774.

66. Dalbey R.E., Lively M.O., Bron S., Van Dijl J.M., The chemistry and enzymology of the type I signal peptidases // Protein Sci. 1997 - Vol. 6 - P. 599604.

67. Missiakas D., Raina S. Protein folding in the bacterial periplasm // J. Bacteriol. 1997 - Vol. 179 - №8 - P. 2465-2471.

68. Sklar J.G., Wu Т., Kahne D., Silhavy T.J. Defining the roles of the periplasmic chaperones SurA, Skp, and DegP in Escherichia coli //Genes Dev. 2007 - Vol. 21 -P. 2473-2484.

69. Gleiter S., Bardwell J.C.A. Disulfide bond isomerization in prokaryotes // Biochim. Biophys. Acta. 2008 - Vol. 1783 - P. 530-534.

70. Bothmann H., Pluckthun A. The Periplasmic Escherichia coli peptidylprolyl cis,trans-isomerase FkpA. I. Increased functional expression of antibody fragments with and without cis-prolines // J. Biol. Chem. 2000 - Vol. 275 - P. 17100-17105.

71. Missiakas D., Betton J.M., Raina S. New components of protein folding in extracytoplasmic compartments of Escherichia coli SurA, FkpA and Skp/OmpH // Mol. Microbiol. 1996-Vol. 21 -№4-P. 871-884.

72. Ramm K., Pluckthun A. The periplasmic Escherichia coli peptidylprolylcis,trans-Isomerase FkpA. II. Isomerase-independent chaperone activity in vitro // J. Biol. Chem. 2000 - Vol. 275 - P. 17106-17113.

73. Chen, R., Henning, U. A periplasmic protein (Skp) of Escherichia coli selectively binds a class of outer membrane proteins // Mol. Microbiol 1996 - Vol. 19-P. 1287-1294.

74. Georgiou G., Segatori L. Preparative expression of secreted proteins in bacteria: status report and future prospects // Curr. Opin. Biotechnol. 2005 - Vol. 16- P. 538-545.

75. Meerman H.J., Georgiou G. Construction and characterization of a set of E.coli strains deficient in all known loci affecting the proteolytic stability of secreted recombinant proteins // Biotechnology (NY) 1994 - Vol. 12 - №11 - P. 1107-1110.

76. Sargent E, Bogsch E.G., Stanley N.R., Wexler M., Robinson C., Berks B.C., Palmer T. Overlapping functions of components of a bacterial Sec-independent protein export pathway//EMBO J. 1998 - Vol. 17 -№13 -P. 3640-3650.

77. Berks B., Sargent F., Palmer T. The Tat protein export pathway // Mol. Microbiol. 2000 - Vol. 35 - №2 - P. 260-274.

78. Palmer T., Berks B. C. Moving folded proteins across the bacterial cell membrane // Microbiol. 2003 - Vol. 149 - P. 547-556.

79. Blaudeck N., Kreutzenbeck P., Freudl R., Sprenger G.A. Genetic analysis of pathway specificity during posttranslational protein translocation across the Escherichia coli plasma membrane // J. Bacteriol. 2003 - Vol. 185 - №9 - P. 28112819.

80. Cristobal S., de Gier J.-W., Nielsen H., von Heijne G. Competition between Sec- and TAT-dependent protein translocation in Escherichia coli //EMBO J. 1999 -Vol. 18 -№11-P. 2982-2990.

81. Behrendt J., Standar K., Lindenstrauss U., Brtiser T. Topological studies onthe twin-arginine translocase component TatC // FEMS Microbiol. Lett. 2004 -Vol. 234-P. 303-308.

82. Bolhuis A., Mathers J.E., Thomas J.D., Barrett C.M.L., Robinson C. TatB and TatC form a functional and structural unit of the twin-arginine translocase from Escherichia coli //J. Biol. chem. 2001 - Vol. 276 - P. 20213-20219.

83. Pop O., Martin U., Abel C., Muller J. P. The twin-arginine signal peptide of PhoD and the TatAd/Cd proteins of Bacillus subtilis form an autonomous Tat translocation system // J. Biol. Chem. 2002 - Vol. 277 - P. 3268-3273.

84. Yen M.R., Tseng Y.H., Nguyen E.H., Wu L.F, Saier M.H. Jr. Sequenceand phylogenetic analyses of the twin-arginine targeting (Tat) protein export system // Arch. Microbiol. 2002 - Vol. 177 - P. 441-450.

85. Georgiou G, Segatori L. Preparative expression of secreted proteins in bacteria: status report and future prospects // Curr. Opin. Biotechnol. 2005 - Vol. 16 - P. 538-45.

86. Mergulhäo F.J., Summers D.K., Monteiro G.A. Recombinant protein secretion in Escherichia coli //Biotechnol. Adv. 2005 Vol. 23 - №3 - P. 177-202.

87. Carriö M.M., Villaverde A. Construction and deconstruction of bacterial inclusion bodies // J. Biotechnol. 2002 - Vol. 96 - P. 3-12.

88. Liao Y.D., Jeng J.C., Wang C.F., Wang S.C., Chang S.T. Removal of N-terminal methionine from recombinant proteins by engineered E. coli methionine aminopeptidase //Protein Sei. 2004 Vol. 13 - P. 1802-1810.

89. Lee S., Kim I., Kim D., Bae K., Byun S. High level secretion of recombinantstaphylokinase into periplasm of Escherichia coli // Biotechno 1. Lett. 1998 - Vol. 20-P. 113-116.

90. Winter J., Neubauer P., Glockshuber R., Rudolph R. Increased production of human proinsulin in the periplasmic space of Escherichia coli by fusion to DsbA // J. Biotechnol. 2001 - Vol. 84-P. 175-185.

91. Kaderbhai M.A., Ugochukwu C.C., Kelly S.L., Lamb D.C. Export of cytochrome P450 105D1 to the periplasmic space of Escherichia coli // Appl. Environ. Microbiol. 2001 - Vol. 67 - P. 2136-2138.

92. Вейко В.П., Гулько Л.Б., Окорокова H.A., Дьяков H.A., Дебабов В.Г. Клонирование гена стрептавидина из Streptomyces avidinii и его экспрессия в E.coli. Секреция стрептавидина клетками E.coli // Биоорг. химия 1999 - Т. 25 -№3 - С. 185-189.

93. Mukherjee K.J., Rowe D.C.D., Watkins N.A., Summers D.K. Studies of single-chain antibody expression in quiescent Escherichia coli // Appl. Environ. Micobiol. 2004 - Vol. 70 - P. 3005- 3012.

94. Xu R., Du P., Fan J.J., Zhang Q., Li T.P., Gan R.B. High-level expression and secretion of recombinant mouse endostatin by Escherichia coli // Protein. Expr. Purif. 2002 - Vol. 24 - P. 453-459.

95. Kenny В., Haigh R., Holland I.B. Analysis of the haemolysin transport process through the secretion from Escherichia coli of PCM, CAT or beta-galactosidase fused to the Hly C-terminal signal domain // Mol. Microbiol. 1991 -Vol. 5-P. 2557-2568.

96. Gentschev I., Hess J., Goebel W. Change in the cellular localization of alkaline phosphatase by alteration of itscarboxy-terminal sequence // Mol. Gen. Genet. 1990 - Vol. 222 - P. 211 -216

97. Li Y., Chen C.X., von Specht B.U., Hahn H.P. Cloning and hemolysinmediated secretory expression of a codon-optimized synthetic human interleukin-6 gene in Escherichia coli //Protein Expr. Purif. 2002 - Vol. 25 - P. 437-447.

98. Fernandez L.A., Sola I., Enjuanes L., de Lorenzo V. Specific secretion of active single-chain Fv antibodies into the supernatants of Escherichia coli cultures by use of the hemolysin system // Appl. Environ. Microbiol. 2000 - Vol. 66 - P. 50245029.

99. Palacios J.L., Zaror I., Martinez P., Uribe F., Opazo P., Socías T., Gidekel M., Venegas A. Subset of hybrid eukaryotic proteins is exported by the type I secretion system of Erwinia chrysanthemi // J. Bacterid. 2001 - Vol. 183 - №4 -P. 1346-1358.

100. Baker M.D., Acharya K.R. Superantigens: Structure-function relationships // Int. J. Med. Microbiol. 2004 - Vol. 293 - P. 529-537.

101. Torres B.A., Kominsky S., Perrin G.Q., Hobeika A.C., Johnson H.M. Superantigens: The Good, the Bad, and the Ugly // Exp. Biol. Med. (Maywood) -2001 Vol. 226 -№3 - P. 164-176.

102. Bavari S., Ulrich R.G., LeClaire R.D. Cross-reactive antibodies prevent the lethal effects of Staphylococcus aureus superantigens I I J. Infect. Dis. 1999 - Vol. 180 - №4 - P. 1365-1369.

103. Stiles B.G., Garza A.R., Ulrich R.G., Boles J.W. Mucosal vaccination with recombinantly attenuated staphylococcal enterotoxin B and protection in a murine model // Infect. Immun. 2001 - Vol. 69 - №4 - P. 2031-2036.

104. Alouf J.P., Muller-Alouf H. Staphilococcal and streptococcal superantigens: molecular, biological and clinical aspects // Int. J. Med. Microbiol. 2003 - Vol. 292 -P. 429-440.

105. Schad E. M., Zaitseva I., Zaitsev V.N., Dohlsten M., Kalland T, Schlievert P.M., Ohlendorf D.H., Svensson L.A. Crystal structure of the superantigen staphylococcal enterotoxin type A // EMBO J. 1995 - Vol. 14 - №14 - P. 32923301.

106. Petersson K., Forsberg G., Walse B. Interplay between superantigens and immunoreceptors // Scand. J. Immunol. 2004 - Vol. 59 - P. 345-355.

107. Petersson K., Hakansson M., Nilsson H., Forsberg G., Svensson L. A., Liljas A., Walse B. Crystal structure of a superantigen bound to MHC class II displays zinc and peptide dependence // EMBO J. 2001 - Vol. 20 - №13 - P. 3306-3312.

108. Petersson K., Pettersson H., Skartved N. J., Walse B., Forsberg G. Staphylococcal enterotoxin H induces Va-specific expansion of T cells // J. Immunol. -2003-Vol. 170-P. 4148-4154.

109. Kotb M. Bacterial pyrogenic exotoxins as superantigens // Clin. Microbiol. Rev. 1995 - Vol. 8 - №3 - P. 411-426.

110. Miethke T., Gaus H., Wahl C., Heeg K., Wagner H. T-celldependent shock induced by a bacterial superantigen // Chem. Immunol. 1992 - Vol. 55 - P. 172-184.

111. Florquin S., Goldman M. Immunoregulatory mechanisms of T-Cell-dependent shock induced by a bacterial superantigen in mice // Infect. Immun. 1996 - Vol. 64 - №9 - P. 3443-3445.

112. Torres B.A., Perrin G.Q., Mujtaba M.G., Subramaniam P.S., Anderson A.K., Johnson H.M. Superantigen enhancement of specific immunity: antibody production and signaling pathways // J. Immunol. 2002 - Vol. 169 - P. 2907-2914.

113. Ulrich R.G., Olson M.A., Bavari S. Development of engineered vaccines effective against structurally related bacterial superantigens // Vaccine 1998 - Vol.16.P. 1857-1864.

114. Kaempfer R. Peptide antagonists of superantigen toxins // Mol. Divers. -2004-Vol. 8-P. 113-120.

115. Llewelyn M., Cohen J. Superantigen antagonist peptides // Crit. Care. 2001 - Vol. 5-P. 53-55.

116. Kominsky S.L., Torres B.A., Hobeika A.C., Lake F.A., Johnson H.M. Superantigen enhanced protection against a weak tumor-specific melanoma antigen: implications for prophylactic vaccination against cancer // Int. J. Cancer. 2001 -Vol. 94-P. 834-841.

117. Mondai T.K., Bhatta D., Biswas S., Pal P. Superantigen-induced apoptotic death of tumor cells is mediated by cytotoxic lymphocytes, cytokines, and nitric oxide // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002 - Vol. 290 - P. 1336-1342.

118. McConnell E.J., Pathangey L.B., Madsen C.S., Gendler S.J., Mukherjee P. Dendritic cell-tumor cell fusion and staphylococcal enterotoxin B treatment in a pancreatic tumor model // J. Surg. Res. 2002 - Vol. 107, P. 196-202.

119. Okamoto S., Kawabata S., Nakagawa I., Hamada S. Administration of superantigens protects mice from lethal Listeria monocytogenes infection by enhancing cytotoxic T cells // Infect. Immun. 2001 - Vol. 69 - №11 - P. 66336642.

120. Nichterlein Т., Kretschmar M., Mussotter A., Fleischer В., Hof H. Influence of staphylococcal enterotoxin В (SEB) on the course of murine listeriosis // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1995 - Vol. 11 - P. 213-218.

121. Mondal Т.К., Bhatta D., Biswas S., Pal P. Repeated treatment with S. aureus superantigens expands the survival rate of Ehrlich ascites tumor bearing mice // Immunol. Invest. 2002 - Vol. 31 - P. 13-28.

122. Rosendahl A., Kristensson K., Hansson J., Ohlsson L., Kalland Т., Dohlsten M. Repeated treatment with antibody-targeted superantigens strongly inhibits tumor growth // Int. J. Cancer. 1998 - Vol. 76 - P. 274-83.

123. Sundstedt A., Celander M., Hedlund G. Combining tumor-targeted superantigens with interferon-alpha results in synergistic anti-tumor effects // Int. Immunopharmacol. 2008 - Vol. 8 - P. 442-452.

124. Krakauer T. Chemotherapeutics targeting immune activation by staphylococcal superantigens // Med. Sci. Monit 2005 - Vol. 11 - P. 290-295.

125. Schlievert P.M.Enhancement of host susceptibility to lethal endotoxin shock by staphylococcal pyrogenic exotoxin type С // Infect. Immun. 1982 - Vol. 36 -№1 - P. 123-128.

126. Faulkner L., Cooper A., Fantino C., Altmann D.M., Sriskandan S. The mechanism of superantigen-mediated toxic shock: not a simple Thl cytokine storm // J. Immunol. 2005 - Vol. 175 - P. 6870-6877.

127. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

128. Sanger F., Nicklen S., Chase A.R. DNA sequencing with chain terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977 - Vol. 74 - P. 5463-5468.

129. Ho S.N., Hunt H.D., Horton R.M., Pullen J.K., Pease L.R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction // Gene 1989 -Vol. 77-P. 51-59.

130. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature 1970 - Vol. 227 - P. 680 — 685.

131. Schantz E.J., Roessler W.G., Wagman J., Spero L., Dunnery D.A., Bergdoll M.S. Purification of staphylococcal enterotoxin В // Biochemistry 1965 - Vol. 4 -№6 - P. 1011-1016.

132. Iandolo J.J., Tweten R.K. Purification of staphylococcal enterotoxins // Methods Enzymol. 1988 - Vol. 165 - P. 43-52.

133. Bendtsen J.D., Nielsen H., von Heijne G., Brunak S. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0 // J. Mol. Biol. 2004 - Vol. 340 - P. 783-795.

134. Betley M.J., Mekalanos J.J. Nucleotide sequence of the type A staphylococcal enterotoxin gene // J. Bacteriol. 1988 - Vol. 170 - №1 - P. 34-41.

135. Jones C.L., Khan S.A. Nucleotide sequence of the enterotoxin В gene from

136. Staphylococcus aureus //J. Bacteriol. 1986 - Vol. 166 - №1 - P. 29-33.

137. Ranelli D.M., Jones C.L., Johns М.В., Mussey G.J., Khan S.A. Molecular cloning of staphylococcal enterotoxin В gene in Escherichia coli and Staphylococcus aureus// Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1985 - Vol. 82-P. 5850-5854.

138. Kuhn A., Wickner W. Conserved residues of the leader peptide are essential for cleavage by leader peptidase // J. Biol. Chem. 1985 - Vol. 260 - P. 1591415918.

139. Koshland D., Sauer R.T., Botstein D. Diverse effects of mutations in the signal sequence on the secretion of beta-lactamase in Salmonella typhimurium // Cell 1982-Vol. 30-P. 903-914.

140. Dalbey R.E., Wickner W. Leader peptidase catalyzes the release of exported proteins from the outer surface of the Escherichia coli plasma membrane. J. Biol. Chem. 1985-Vol. 260-P. 15925-15931.

141. Ansaldi М., Theraulaz L., Baraquet С., Panis G., Mejean V. Aerobic TMAO respiration in Escherichia coli //Mol. Microbiol. 2007 - Vol. 66 - №2 - P. 484-494.

142. Buchanan G., Maillard J., Nabuurs S.B., Richardson D.J., Palmer Т., Sargent F. Features of a twin-arginine signal peptide required for recognition by a Tat proofreading chaperone // FEBS Lett. 2008 - Vol. 582 - P. 3979-3984.

143. Panahandeh S., Maurer C., Moser M., Delisa M.P., Miiller M. Following the path of a twin-arginine precursor along the TatABC translocase of Escherichia coli //

144. J. Biol. Chem. 2008 - Vol. 283 - P. 33267-33275.