Изучение роли первичной структуры щелочной фосфатазы и ее секреция через цитоплазматическую мембрану Escherichia coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Золов, Сергей Николаевич

• Золов, Сергей Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Золов, Сергей Николаевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Основные принципы организации секреторного аппарата Escherichia coli.

1.1.1. Цитоплазматические факторы секреции.

1.1.2. Белок SecA - транслокационная АТФ-аза.

1.1.3. Мембранная часть транслокационного аппарата.

1.1.4. Сигнальные пептидазы.

1.1.5. Фосфолипиды как интегральная часть секреторного аппарата.

1.1.6. Каталитический цикл транслоказы белков-предшественников.

1.2. Особенности первичной структуры секретируемых белков.

1.2.1. Роль первичной структуры сигнального пептида.

1.2.2. N-область сигнального пептида.:'.

1.2.3. С-область сигнального пептида.

1.2.3. Особенности структуры зрелой части экспортируемых белков.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Бактериальные штаммы, бактериофаги и плазмиды.

2.2. Среды и условия культивирования.

2.3. Ферменты и реактивы.

2.4. Методы работы с ДНК.

2.5. Олигонуклеотид-направленный мутагенез.

2.6. Полимеразная цепная реакция.

2.7. Определение скорости превращения предшественника щелочной фосфатазы в зрелую форму in vivo.

2.8. Субклеточное фракционирование и выделение щелочной фосфатазы.

2.9. Изучение кинетических параметров щелочных фосфатаз.

2.10. Аналитические методы.

2.11. Статистический анализ.

2.12. Молекулярное моделирование.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Получение мутантных форм щелочной фосфатазы Е. coli и генетическая оптимизация условий их экспрессии и секреции.

3.1.1. Введение направленных мутаций в ген щелочной фосфатаз Е. coli.

3.1.2. Клонированние генов щелочной фосфатазы Е. coli под контроль арабинозного Pbad промотора.

3.2. Изучение зависимости секреции PhoA от заряда N-концевой области сигнального пептида и его взаимодействия с анионными фосфолипидами мембраны.

3.3. Изучение влияния первичной структуры С-концевой области сигнального пептида на эффективность процессинга предшественника щелочной фосфатазы сигнальной пептидазой.

3.3.1. Статистический анализ сайта процессинга известных секреторных белков грам-положительных и грам-отрицательных микроорганизмов.

3.3.2. Изучение созревания мутантных щелочных фосфатаз с заменами аминокислот в С-концевом домене сигнального пептида.

3.4. Обнаружение экспорт-инициирующего домена в N-концевой области зрелой полипептидной цепи щелочной фосфатазы

Е. coli и изучение его роли в секреции.

3.4.1. Статистический анализ распределения заряда в N-концевой области зрелых полипептидных цепей секретируемых белков.

3.4.2. Анализ секреции мутантных щелочных фосфатаз Е. coli.

3.4.3. Замены аминокислот в N-концевой области зрелой полипептидной цепи щелочной фосфатазы влияют на секрецию фермента.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение роли первичной структуры щелочной фосфатазы и ее секреция через цитоплазматическую мембрану Escherichia coli»

Актуальность проблемы.

Многие белки, синтезируемые в цитоплазме бактерий, для осуществления своих функций должны транслоцироваться через цитоплазматическую мембрану и занять определенное место в клеточной оболочке бактериальной клетки или выделиться в окружающую среду. Этот процесс, называемый секрецией белков, лежит в основе биогенеза этих белков и надмолекулярных клеточных структур, и взаимодействия клетки с окружающей средой. Высокая потребность в белках, имеющих практическое применение, требует создания оптимальных систем по выводу их из клеток. Таким образом, выяснение молекулярного механизма секреции белков необходимо для решения многих проблем клеточной биологии и биотехнологии.

Состояние проблемы.

Биогенез и секреция белков являются актуальными проблемами современной биохимии. Несмотря на значительные успехи в понимании молекулярных основ этих процессов, механизм переноса гидрофильных молекул секретируемых белков через гидрофобный липидный бислой мембран остается еще во многом неясным. Согласно имеющимся в настоящее время данным и представлениям транслокация белка через мембрану определяется прежде всего структурой самого белка и его специфических доменов (Blobel, 1980, Gierasch, 1989; Maclntyre, Henning, 1990). Большинство секретируемых белков синтезируется в виде предшественников, содержащих на N-конце сигнальный пептид (СП). Он необходим для транслокации белка через мембрану (von Heijne, 1990; Pugsley, 1993; Fekkes, Driessen, 1999; Mori, Ito, 2001) и отщепляется после завершения транслокации сигнальной пептидазой. При отсутствии строгой гомологии в аминокислотных последовательностях сигнальные пептиды имеют ряд общих черт: содержат положительно заряженную N-концевую область, центральную гидрофобную часть и более полярную С-концевую область. Потребность в сигнальном пептиде для узнавания белком секреторного аппарата клетки и в инициации секреции к настоящему времени можно считать доказанной. Однако вопрос о конкретной роли других доменов СП, а также зрелой части белка в секреции остается до конца не решенным.

N-концевая область СП и наличие в этой области положительно заряженных остатков является важным для транслокации ряда белков: PhoA (Nesmeyanova et al., 1997), липопротеина (Inouye et al., 1982), OmpA (Lehnhardt etal., 1988; Tanji etal., 1991), OmpF-Lpp (Yamane, Mizushima, 1988; Sasaki etal., 1990), белка внешней мембраны PhoE (Bosch et al., 1989). Однако функция положительно заряженных остатков остается не ясной. Предполагается, что они взаимодействуют с отрицательно заряженными фосфолипидами мембран, что подтверждено in vitro, но вопрос о характере такого взаимодействия in vivo остается до сих пор открытым.

С-концевая область сигнального пептида интересна из-за ее вовлечения в специфическое взаимодействие с сигнальной пептидазой, осуществляющей процессинг. Структура этой области подчиняется правилу "-3 -1": в этих положениях встречаются только небольшие и незаряженные аминокислотные остатки (von Heijne, 1983). Изучение мутантных секретируемых белков с единичными аминокислотными заменами в этих положениях подтвердило их важность для процессинга (созревании) белка. Подробное изучение влияния аминокислотных замен в С-концевой области сигнального пептида на процессинг ранее было проведено только на мальтозосвязывающем белке (МВР) и белке оболочки фага М13 (Fikes et al., 1990; Shen et al., 1991; Barcocy-Gallagher et al., 1994). Несмотря на то, что в целом правило "-3 -1" было подтверждено, экспериментально детальный анализ процессинга был существенно затруднен наличием альтернативного сайта отщепления сигнального пептида. Кроме того, результаты по изучению мутаций в белке оболочки фага М13 указывали на то, что детерминантами специфичности сигнальной пептидазы могут быть не только аминокислотные остатки в положениях -3 и -1, но и Pro, находящийся на границе гидрофобного и С-концевого доменов. Детальный анализ области -5 +1 на примере npePhoA, проведенный ранее в нашей лаборатории, также показал важность аминокислотных остатков не только в пложениях -3 -1, но и в -5 положении (Karamyshev et al, 1998). Однако, роль -5 положения в формировании сайта процессинга, наиболее компетентного для узнавания сигнальной пептидазой, была не определена.

Согласно теории белкового топогенеза Г. Блобла (Blobel, 1980) информация о секреции заключена не только в СП но и в топогенных последовательностях зрелого белка. Изучение секреции гибридных белков действительно показало, что наличие сигнального пептида не всегда обеспечивает эффективную секрецию. Попытки индуцировать секрецию гибридных белков, содержащих сигнальные последовательности секретируемых и полипептидные цепи цитоплазматических белков, часто были неудачными (Bassford et al., 1979; Boyd, Beckwith J., 1990; Kadonaga et al., 1984; Moreno et al., 1980; Palva et al., 1982). Это подтверждает наличие экспортного сигнала не только в сигнальном пептиде предшественника, но и в N-концевой области зрелой полипептидной цепи секретируемого белка. При изучении мутантного мембранного белка, лидерной пептидазы, было показано, что для эффективной транслокации такого белка важна последовательность первых 30 аминокислотных остатков N-концевого домена (Andersson, von Heijne, 1991). Однако точный размер и свойства экспортного сигнала в зрелой полипептидной цепи не установлены.

Цель работы - установить роль первичной структуры N- и С- концевых доменов сигнального пептида, а также N-концевого домена зрелой полипептидной цепи в секреции белка на примере щелочной фосфатазы Escherichia coli.

В соответствии с целью были определены следующие задачи исследования:

1) получить набор мутантных генов щелочной фосфатазы, кодирующих замены аминокислот в С-концевой области сигнального пептида и в N-концевой области зрелой полипептидной цепи;

2) изучить влияние заряда N-концевой области сигнального пептида и анионных фосфолипидов цитоплазматической мембраны на эффективность секреции;

3) изучить влияние первичной структуры С-концевой области сигнального пептида на эффективность процессинга предшественника щелочной фосфатазы и выявить структурные принципы взаимодействия этой области с сигнальной пептидазой;

4) установить размер N-концевого домена зрелой полипептидной цепи, определяющего эффективность секреции и изучить его роль в этом процессе.

Научная новизна работы

Для изучения влияния замен аминокислот на биогенез и секрецию щелочной фосфатазы Е. coli с помощью модифицированного метода олигонуклеотид направленного мутагенеза получен широкий набор ее мутантных форм. Показано, что эффективность секреции белка зависит от заряда сигнального пептида, и эта зависимость не определяется содержанием анионных фосфолипидов в цитоплазматической мембране при их природных количествах и ниже. Это позволяет предположить о возможном вовлечении во взаимодействие СП с фосфолипидами in vivo, на начальной стадии транслокации, липид-зависимого белкового компонента секреторной машины, например, белка SecA.

Показано, что первичная структура не только сайта процессинга (положения -3 -1), но и за его пределами (вблизи -5 положения) влияет на эффективность процессинга сигнального пептида сигнальной пептидазой. По результатам мутационного анализа и молекулярного моделирования была выявлена пространственная структура С-концевой области сигнального пептида узнаваемая сигнальной пептидазой, а также ориентация сигнального пептида в цитоплазматической мембране.

Определен размер экспорт-инициирующего домена N-концевой области зрелой щелочной фосфатазы Е. coli, равный 18 аминокислотным остаткам. Показано, что область этого домена, расположенная вблизи сигнального пептида, особенно важна для секреции, а весь домен должен быть заряжен отрицательно или не иметь заряда.

Научно-практическое значение работы

Полученные в работе новые данные о биогенезе и секреции щелочной фосфатазы расширяют наше представление о механизме взаимодействия топогенных последовательностей с секреторным аппаратом клетки. Настоящая работа по своему характеру относится к разряду фундаментальных исследований, однако, некоторые ее результаты могут иметь практическое применение. Полученные мутантные щелочные фосфатазы широко используются в работах лаборатории для изучения различных вопросов биогенеза белка. Выявленные в работе закономерности во влиянии первичной структуры некоторых доменов белка на его секрецию могут использоваться при конструировании векторных систем для секреции гомологичных и гетерологичных белков клетками микроорганизмов, широко применяемыми для получения полипептидов, необходимых в медицине и народном хозяйстве.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Золов, Сергей Николаевич

ВЫВОДЫ

1. Получено 20 мутантных щелочных фосфатаз Е. coli, имеющих замены аминокислот в N- и С-концевой области сигнального пептида и в N-концевой области зрелой полипептидной цепи, предположительно важных для секреции.

2. Показано, что заряд N-концевой области сигнального пептида важен для эффективной транслокации предшественника щелочной фосфатазы через цитоплазматическую мембрану in vivo независимо от содержания в мембране анионных фосфолипидов в пределах от 7 до 17%.

3. Показано, что эффективность процессинга щелочной фосфатазы определяется не только консервативной областью сайта процессинга (положения -3 -1), но и первичной структурой сигнального пептида вне этого сайта (положения -6 -5 -4). На основе мутационного анализа проведено молекулярное моделирование трехмерной структуры сайта процессинга, компетентного для узнавания сигнальной пептидазой. Установлено, что наиболее компетентными являются конформации

0t6 5 Р4 ИЛИ рбр50и.

4. Установлен размер экспорт-инициирующего домена в N-концевой области зрелой щелочной фосфатазы Е. coli, который составляет 18 аминокислотных остатков. Область этого домена, расположенная вблизи сигнального пептида наиболее важна для секреции, а весь домен должен быть заряжен отрицательно или не иметь заряда.

86

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Согласно теории белкового топогенеза (Blobel, 1980; Gierasch, 1989; Maclntyre, Henning, 1990), информация о секреции и локализации белка содержится в первичной структуре самого секретируемого белка, в его специфических топогенных последовательностях. Эта информация реализуется с помощью сложного секреторного аппарата клетки. Несмотря на значительные успехи в понимании молекулярных основ белкового топогенеза, механизм переноса гидрофильных молекул секретируемых белков через гидрофобный липидный бислой мембран остается еще во многом неясным. Главным образом это происходит из-за большого пробела в понимании природы межмолекулярных взаимодействий между компонентами секреторного аппарата и их взаимодействия с секретеруемым белком. Наиболее изученной, с этой точки зрения, является N-концевая последовательность предшественников секретируемых белков, известная как сигнальный пептид, которая выполняет основную роль в секреции белков, Важность гидрофобной области сигнального пептида для взаимодействия его с мембраной вполне очевидна и доказана. Однако принципы взаимодействия N-и С-концевой области сигнального пептида, а также N-концевой области зрелого белка с секреторным аппаратом ждут своего окончательного выяснения. Ранее в нашей лаборатории начат анализ влияния первичной последовательности указанных доменов щелочной фосфатазы Е. coli. на эффективность транслокации, на взаимодействие С-концевой области СП с сигнальной пептидазой (Karamyshev et al., 1998), и N-концевой области СП с анионными фосфолипидами (Калинин и др., 1999). Предполагается, что взаимодействие этих участков npePhoA с секреторным аппаратом необходимо для транслокации и посттрансляционной модификации, приводящих к образованию активной макромолекулы фермента. Однако некоторые аспекты такого взаимодействия, касающиеся механизма вовлечения первичной структуры указанных областей в обеспечении эффективности транслокации белков, оставались не выясненными. В частности, оставалось не ясным: почему все предшественники секреторных белков имеют положительно заряженные остатки в N-концевой области СП, участвует ли эта область СП во взаимодействии с фосфолипидами непосредственно или это взаимодействие опосредовано белками; каковы механизмы узнавания сигнального пептида сигнальной пептидазой и какова роль пространственной структуры С-концевой области вокруг сайта процессинга. Неясно, существуют ли экспорт-инициирующие домены в зрелой части белка и каковы их характер и функции? В настоящей работе мы детально рассмотрели влияние первичной структуры N- и С- концевых областей сигнального пептида, а также N-концевой области зрелой полипептидной цепи щелочной фосфатазы Е. coli на их взаимодействие с некоторыми мембранными компонентами секреторной системы в процессе секреции белка.

Ранее было показано, что эффективность транслокации щелочной фосфатазы существенно снижается при смене заряда ее СП в результате замены положительно заряженного Lys -20 на отрицательно заряженную Glu или не заряженный Ala. Возможной причиной этому могло быть нарушение взаимодействия СП с анионными фосфолипидами, предположительно важного для инициации секреции. Возможность такого взаимодействия была теоретически рассчитана при помощи молекулярного моделирования (Kajava et al1991). В последующих работах нашей лаборатории (Nesmeyanova et al., 1997; Калинин и др. 1999) получены данные, свидетельствующие о прямом взаимодействии между анионными фосфолипидами с положительно заряженной N-концевой областью сигнального пептида npePhoA в системе in vivo. Показано, что блокирование процессинга в результате замен аминокислот в сайте отщепления СП сигнальной пептидазой ведет к «заякориванию» npePhoA в цитоплазматической мембране (сигнальный пептид в ориентации Nin-Cout) и одновременно к накоплению как предшественника, так и анионных фосфолипидов в мембране (Калинин и др. 1996). При этом в случае «заякоривания» npePhoA, лишенных положительного заряда, накопление АФЛ не происходило.

Для получения более прямых доказательств такого взаимодействия in vivo в настоящей работе впервые использован дифференцированный подход. Он включал использование одновременно природного и мутантных npePhoA, обладающих разным зарядом N-конца сигнального пептида, с одной стороны, и штамма Е. coli с контролируемым синтезом анионных фосфолипидов, с другой. Предполагалось, что в случае прямого взаимодействия между положительно заряженным участком СП и анионными фосфолипидами, зависимость секреции от заряда СП будет определяться содержанием анионных фосфолипидов и, в частности, при снижении количества анионных фосфолипидов npePhoA, не несущие положительный заряда на N-конце, будут более эффективно транслоцироваться через мембрану. Для модификации содержания АФЛ использовали штамм Е. coli HDL11, в котором содержание АФЛ регулируется присутствием в среде ИПТГ, индуктора гена pgsA, находящегося под контролем /ас-промотора. Продукт этого гена -фосфатидилглицерол-фосфат синтетаза ответственней за синтез АФЛ.

В культурах штамма Е. coli HDL11 с разным составом АФЛ, продуцирующих как природную, так и мутантные фосфатазы с измененным зарядом N-конца сигнального пептида, была обнаружена высокая фосфатазная активность. Это подтверждает, что смена заряда СП не подавляет секрецию полностью, но влияет на ее эффективность. Это показано с помощью двух подходов: анализа активности фермента в культуре клеток и динамики созревания импульсно меченого предшественника. Импульсное мечение белка позволило выявить, что на эффективность секреции влияет также и содержание АФЛ: снижение их содержания снижает скорость созревания белка - его транслокацию. Смена заряда имеет более выраженный эффект, чем снижение содержания АФЛ. При этом мы не обнаружили увеличения скорости секреции npePhoA с незаряженным СП в клетках с меньшим содержанием АФЛ, а даже обнаружили дополнительное снижение скорости транслокации мутанта. Это указывает либо на отсутствие in vivo прямого электростатического взаимодействия между СП и АФЛ на начальной стадии транслокации белка, либо на трудность его обнаружения при изученных вариациях в содержании АФЛ (от 7 до 17%). Недавно, однако, при вариации в содержании АФЛ от 17 до 100% АФЛ такое взаимодействие было обнаружено (Головастов, Несмеянова, 2002). Кроме того, в нашей лаборатории параллельно проведены исследования преРЬоА-фосфолипидного взаимодействия in vitro с использованием очищенных предшественников мутантных и природной фосфатаз и липосом, полученных из фосфолипидов мутантных штаммов Е. coli с разным фосфолипидным составом. Эти исследования также показали зависимость встраивания предшественников в модельные мембраны, как от заряда СП, так и от содержания АФЛ. Более того, было показано, что это взаимодействие нарушается в присутствии KCL, подтверждая его электростатический характер. При этом зависимость встраивания предшественника от заряда СП определялась содержанием анионных фосфолипидов, свидетельствуя о возможности непосредственного взаимодействия между положительно заряженным N-концевым участком СП и анионными фосфолипидами. В связи со всем вышесказанным следует, однако подчеркнуть, что анионные фосфолипиды вовлекаются в транслокацию белка на различных ее этапах, не только путем возможного взаимодействия с секретируемым белком, но и усиливая в системе in vivo функционирование белковых компонентов секреторной машины (De Vrije et al., 1990; Kusters et al, 1994; Hendrick, Wickner, 1991; Kontinen, Tokuda, 1995, Benach et al, 2002). Это усложняет оценку зависимости транслокации белка от анионных фосфолипидов на молекулярном уровне. Вполне возможно, что взаимодействие сигнального пептида с фосфолипидами in vivo на начальной стадии транслокации может быть опосредовано липид-зависимыми белковыми компонентами секреторной машины, например, белком SecA, функционирование которого зависит от фосфолипидов, и который также может взаимодействовать предположительно с N-концевой областью СП.

Следующий этап секреторного процесса, в результате которого образуется зрелый белок, и который изучался в настоящей работе, это процессинг (отщепление) сигнального пептида. Поэтому изучение роли первичной структуры С-концевой области сигнального пептида в процессинге является важным для понимания структурных принципов узнавания сигнального пептида СПазой. В предыдущей работе нашей лаборатории уже проводились подобные исследования (Карамышев и др. 1997, Karamishev et al 1998). В них осуществлен широкий скрининг влияния мутаций в положениях -5 -1 с использованием большого количества аминокислотных замен (было получено около 70 мутантных npePhoA при помощи амбер-супрессорного мутагенеза). Он не только подтвердил известное правило -3 -1 (von Heijne, 1983), но и показал важность первичной структуры полипептидной цепи вблизи сайта процессинга для узнавания СПазой. В частности, было показано влияние размера аминокислотного остатка в -5 положении на эффективность процессинга сигнальной пептидазой (Karamyshev et al1998).

Проведенный в настоящей работе статистический анализ известных последовательностей секретируемых белков показал, что большие гидрофобные остатки находятся в -5 положении только тогда, когда в соседнем положении находится пролин (-6 или -4), или серин в положениях-4 или -2, или валин в -3 положении. Для установления роли пролина в С-концевой области СП вблизи сайта процессинга щелочной фосфатазы мы провели мутационный анализ. С помощью олигонуклеотид направленного мутагенеза был получен набор мутантных аллелей гена щелочной фосфатазы, кодирующих единичные замены пролина в -5 положении на лейцин, изолейцин или триптофан, а также комбинации таковых замен с другими заменами в области сайта процессинга. Было установлено, что введение лейцина, изолейцина или тирозина в положение -5 почти полностью подавляет поцессинг. Однако введение пролина по обе стороны от -5 положения (положения -6 и -4) в присутствии указанных выше аминокислотных остатков в этом положении (белки P(-6)L(-5), L(-5)P(-4), P(-6)I(-5), I(-5)P(-4), P(-6)Y(-5), Y(-5)P(-4)) полностью восстанавливает процессинг. Введение при этом серина в положения -4 и -2 или валина в -3 положение только частично супрессирует мутацию с Leu в -5 положении (белки L(-5)S(-4), L(-5)S(-2) и L(-5)V(-3) соответственно). Созревание мутантного npePhoA с тремя подряд пролинами в положениях -6, -5 и -4 (белок Р(-6,-5,-4)) происходит со скоростью созревания природного предшественника, указывая на то, что введение дополнительных пролинов в эту область создает структуру сходную по свойствам природной.

По результатам мутагенеза, для понимания механизма взаимодействия npePhoA с активным центром СПазы, совместно с к.б.н. А.В. Каявой было проведено молекулярное моделирование такого взаимодействия. С учетом известной структуры комплекса /?-лактамного ингибитора с активным центром СПазы (Paetzel et al., 1998), была смоделированна пространственная структура С-области сигнального пептида щелочной фосфатазы, комплементарная активному центру сигнальной пептидазы. Как показано раньше, область -3 -1 пептидного субстрата может эффективно связываться с активным центром пептидазы только при наличии /i-конформации (Paetzel et al., 1998; Karamyshev et al., 1998; Luo et al., 2001). Область -6 -4 сигнального пептида расположена вне активного центра пептидазы, и основываясь исключительно на данных конформационного анализа невозможно выявить единственно возможную конформацию этой области. Однако благодаря тому, что мутантая фосфатаза Р(-6,-5,-4) с областью -6 -4 стерически зафиксированной в полипролиновой конформации процессируется так же, как и природная фосфатаза, мы определили, по крайней мере, одну конформацию, которая допускает процессинг (см. Рис. 10). Моделирование подтвердило, что эта конформация пептидного субстрата не имеет стерических припятствий для взаимодействия с СПазой (Рис. 18.) (на рисунке полипролиновая структура обозначена -4'-5'-6").

Рис. 18. Молекулярная модель взаимодействия активного центра сигнальной пептидазы с сайтом процессинга предшественника щелочной фосфатазы.

Однако полипролиновая конформация одна не может объяснить ингибиторный эффект больших остатков в -5 положении и его супрессию при дополнительной замене аминокислотных остатков в позициях -6 или -4 на пролин. Анализ трехмерной структуры СПазы, доступной сегодня (Paetzel et al., 1998), показал, что имеется достаточно пространства для размещения таких остатков как Leu или Met в -5 положении. Зная эти данные мы предполагаем, что введение гидрофобных аминокислот в это положение вместо Pro восстанавливает «-спираль и тем самым нарушает взаимодействие этой области с СПазой. Однако дополнительное введение Pro по обе стороны от -5 положения снова разрушает образование а-спирали и тем самым восстанавливает способность эффективно процессировать сигнальный пептид СПазой. Следует отметить, что введение Pro в -6 положение во всех случаях более эффективно супрессирует мутацию в -5 положении, чем при введении Pro в -4 положение. По всей видимости чем раньше будет разрушена а-спираль, тем более оптимальна будет структура сайта процессинга для узнавания СПазой.

На основе проведенного молекулярного моделирования оказалось возможным предположить также модель пространственного расположения сигнального пептида и сигнальной пептидазы относительно друг друга в цитоплазматической мембране (Рис. 19.). Согласно модели N-концевая область сигнального пептида (-21 -7) в виде а-спирали направлена в сторону от СПазы внутрь мембраны, что обеспечивает С-концевой области дополнительную степень ограничения в выборе возможных конформаций, среди которых полипролиновая структура - участок N2. Ранее было предположено, что вся С-область сигнального пептида имеет /?-конформацию -участок Ni. Результаты мутагенеза, проведенного в настоящей работе, показали, что возможны, еще две коформации области от -6 до -4: абО5(34 -(N3) и |3бР-5ои - (N4) (где а и Р обозначают а-спиральную и |3-конформацию индивидуальных остатков). Они удовлетворяют двум необходимым условиям: отсутствию пространственных конфликтов с СПазой и ориентированию а-спирали сигнального пептида (остатки -21-7) внутрь мембраны.

Рис. 19. Модель расположения сигнального пептида в мембране в зависимости от структуры области -6 -4.

Изучение роли первичной структуры N-концевой области зрелой полипептидной цепи щелочной фосфатазы в секреции фермента позволило установить точный размер и свойства экспортного сигнала в этой области. О существовании экспортного сигнала в N-концевой области зрелой полипептидной цепи указывал тот факт, что введение положительно заряженных аминокислот непосредственно после СП приводит к нарушению секреции, тогда как расположение зарядов вдали от СП не влияет на эффективность секреции. При этом данные о размере такого домена были противоречивы. Единственная работа с неприродным гибридным белком обозначила значимый для секреции домен размером 30 аминокислотных остатков (Andersson, von Heijne, 1991). Однако статистический анализ распределения заряда в N-концевой области зрелой полипептидной цепи 191 известного секреторного белка из грам-отрицательных бактерий показал, что N-концевая область размером 14-18 аминокислотных остатков несет либо отрицательный заряд, либо не заряжен. Это позволило предположить, что значимый для секреции домен должен находиться в пределах этой области. Набор мутантных генов щелочной фосфатазы продукты, которых имели замены аминокислот в положениях +2+3 на два лизина, и в +5+6, +14+15, +19+20 на два аргинина или два лизина, позволили проверить это предположение.

Оказалось, что аминокислотные замены, расположенные в пределах до 18 аминокислотных остатков на разном расстояние от сигнального пептида в N-концевом домене зрелой полипептидной цепи PhoA, снижают эффективность секреции. Наибольший эффект наблюдался в случае замен, расположенных вблизи сигнального пептида. При введении Lys на расстоянии 19 аминокислот от сигнального пептида, секреция уже не нарушалась. При наличии Arg в этом положении полного восстановления эффективности секреции не происходило. Однако это, по-видимому, связано со специфичностью его структуры, приводящей к т.н. - "аргининовому эффекту" (Bernstein et al, 1989; Chaddock et al, 1995; Bogsch et al, 1997; Bogsch et al, 1998), а не связано с зарядом.

Был проведен анализ созревания мутантного npePhoA, замены аминокислот в котором имеют самое выраженное влияние на его транслокацию (К(2,3)), с помощью импульсного мечения белков in vivo в клетках с разным содержанием анионных фосфолипидов. Он показал отсутствие взаимосвязи между влиянием на секрецию белка мутаций и содержания фосфолипидов. Таким образом, природа нарушения транслокации при введении дополнительных зарядов, по-видимому, не связана с

85

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Золов, Сергей Николаевич, 2002 год

1. Головастое В.В., Михалева Н.И., Кадырова Л.Ю., Несмеянова М.А. Основной фосфолипид Escherichia coli - фосфатидилэтаноламин -необходим для эффективной продукции и секреции щелочной фосфатазы. - Биохимия, 2000, 65, с. 1295-1304.

2. Головастов В.В., Несмеянова М.А. Влияние фосфолипидного состава мембран и сигнального пептида щелочной фосфатазы Escherichia coli на эффективность секреции. Биохимия, 2002, принята в печать.

3. Зайцев Е.Н., Зайцева Е.М., Бахланова И.В., Горелов В.И., Кузьмин Н.П., Крюков В.М., Ланцов В.А. Клонирование и характеристика гена гесА из Pseudomonas aeruginosa. Генетика, 1986, N11, с.2721-2727.

4. Калинин А.Е., Михалева Н.И., Карамышев А.Л., Карамышева З.Н., Несмеянова М.А. Взаимодействие предшественников мутантных щелочных фосфатаз с фосфолипидами мембран in vivo и in vitro. -Биохимия, 1999, т.64, с. 1214-1223.

5. Карамышева З.Н., Карамышев А.Л., Ксензенко В.Н., Несмеянова М.А. Анализ влияния замен Lys(-20) в сигнальном пептиде щелочной фосфатазы на секрецию этого фермента. Биохимия, 1996, т.61, с.745.754.

6. Кононова С.В., Хохлова О.В., Золов С.Н., Несмеянова М.А. Влияние экспорт-специфического цитоплазматического шаперона, белка SecB, на секрецию щелочной фосфатазы Escherichia coli. -Биохимия, 2001, т.66, с. 985-990.

7. Лойда 3., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. М: Мир, 1982, с 272.

8. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, 1976, с 436.

9. Несмеянова М.А., Крупянко В.И., Калинин В.А., Кадырова Л.Ю. Выделение и некоторые свойства мутантных щелочных фосфатаз Escherichia coli. Биохимия, 1996, т.61, с. 89-99.

10. Akita М., Sasaki S., Matsuyama S., Mizushima S. SecA interacts with secretory proteins by recognizing the positive charge at the amino terminus of the signal peptide in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1990, v.265, p.8164-8169.

11. Akiyama Y., Ito K. Topology analysis of the SecY protein, an integral membrane protein involved in protein export in Escherichia coli. -EMBO J., 1987, v.6, p.3465-3470.

12. Andersson, H. and von Heijne, G. A 30-residue-long "export initiation domain" adjacent to the signal sequence is critical for protein translocation across the inner membrane of Escherichia coli. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1991, v. 88, p.9751-9754.

13. Andersson H., von Heijne G. Membrane protein topology: effects of

14. Лцн+ on the translocation of charged residues explain the "positive inside" rule. EMBO J., 1994, v. 13, p.2267-2272.

15. Arkowitz R.A., Wickner W. SecD and SecF are required for the proton electrochemical gradient stimulation of preprotein translocation. EMBO J., 1994, v.13, p.954-963.

16. Barkocy-Gallagher G.A., Cannon J.G., Bassford P.J. (3-turn formation in the processing region is important for efficient maturation of Escherichia coli maltose-binding protein by signal peptidase I in vivo. J.Biol.Chem., 1994, v.269, p. 13609-13613.

17. Bassford, P.J.Jr., T. J. Silhavy, and J. R. Beckwith. Use of gene fusion to study secretion of maltose-binding protein in Escherichia coli periplasm. -J. Bacterid., 1979, v. 139, p.19-31.

18. Bernstein HD, Poritz MA, Strub K, Hoben PJ, Brenner S, Walter P. Model for signal sequence recognition from amino-acid sequence of 54K subunit of signal recognition particle. Nature, 1989, v.340, p.482-486

19. Bilgin N., Lee J.N., Zhu H.-Y, Dalbey R., von Heijne G. Mapping of catalitically important domains in Escherichia coli leader peptidase. -EMBO J., 1990, v.9, p.2712-2722.

20. Blobel G., Dobberstein B. Transfer of proteins across membranes. I. Presence of proteolytically processed and unprocessed nascent immunoglobulin light chains on membrane-bound ribosomes of murine myeloma. J. Cell. Biol., 1975, v.67, p.835-851.

21. Blobel, G. Intracellular protein topogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, v.77, p. 1496-1500.

22. Blondel A., Bedouelle H. Export and purification of a cytoplasmic dimeric protein of fusion to the maltose-binding protein of Escherichia coli.-Вт. J. Biochem., 1994, v. 193, p.325-330.

23. Bogsch E, Brink S, Robinson C. Pathway specificity for a delta pH-dependent precursor thylakoid lumen protein is governed by a 'Sec-avoidance' motif in the transfer peptide and a 'Sec-incompatible' mature protein. EMBO J., 1997, v. 16, p.3851-3859.

24. Bogsch E.G., Sargent F, Stanley N.R., Berks B.C., Robinson C, Palmer T. An essential component of a novel bacterial protein export system with homologues in plastids and mitochondria. J. Biol. Chem., 1998, v.273, p. 18003-18006.

25. Bosch D., Boer P., Bitter W., Tommasen J. The role of the positively charged N-terminus of the signal sequence of Escherichia coli outer membrane protein PhoE in export. Biochim. Biophys. Acta, 1989, v. 979, p.69-76.

26. Boyd D., Beckwith J. The role of charged amino acids in the localization of secreted and membrane proteins. Cell, 1990, v.62, p. 1031-1033.

27. Briggs M.S., Cornell R.G., Dluhy R.A., Gierasch L.M. Conformations of signal peptides induced by lipids suggest initial steps in protein export. -Science, 1986, v.233, p.206-208.

28. Brooks, B.R., Bruccoleri, R.E., Olafson, B.D., States, D.J., Swaminathan, S., and Karplus, M. J. Сотр. Chem., 1983, 4, 187-217

29. Brundage L., Fimmel C.J., Mizushima S., Wickner W. SecY, SecE, and Band 1 form the membrane-embedded domain of Escherichia coli preprotein translocase. J. Biol. Chem., 1992, v.267, p.4166-4170.

30. Cabelli R.J., Chen L., Tai P.C., Oliver D.B. SecA protein is required for secretory protein translocation into Escherichia coli membrane vesicles. -Cell, 1988, v.55, p.683-692.

31. Cabelli R.J., Dolan K.M., Qian L., Oliver D.B. Characterization of membrane-associated and soluble states of SecA protein from wild-type and secA51(TS) mutant strains of Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1991, v.266, p.24420-24427.

32. Chang C.N., Inouye H., Model P., Beckwith J. Processing of alkaline phosphatase precursor to the mature enzyme by on Escherichia coli inner membrane preparation. J. Bacteriol., 1980, v.142, p.726-728.

33. Chou P.Y., Fasman G.D., Empirical predictions of protein conformation.- Annu. Rev. Biochem., 1978, v.47, p.251-276.

34. Collier D.N., Bassford P. J., Jr. Mutations that improve export of maltose-binding protein in SecB" cells of Escherichia coli. J. Bacteriol., 1989, v. 171, p.4640-4647.

35. Cunningham K., Wickner W. Specific recognition of the leader region of precursor proteins is required for the activation of the translocation ATPase of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, v.86, p.8630-8634.

36. Dalbey R.E., von Heijne G. Signal peptidases in prokaryotes and eukaryotes a new protease family. - Trends Biochem. Sci., 1992, v. 17, p.474-478.

37. Davis, B. J. Disc electrophoresis. II. Method and application to human serum proteins. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1964, v. 121, p.404-427.

38. Demel R.A., Goormaghtigh E., de Kruijff B. Lipid and peptide specificities in signal peptide lipid interactions in model membranes. -Biochim. Biophys. Acta, 1990, v. 1027, p. 155-162.

39. Derman A.I., Puziss J.W., Bassford P.J., Jr., Beckwith J. A signal sequence is not required for protein export in prlA mutants of Escherichiacoli. EMBO J., 1993, v. 12, p.879-888.

40. Douville K., Price A., Eichler J., Economou A., Wickner W. SecYEG and SecA are the stoichiometric components of preprotein translocase. J. Biol. Chem., 1995, v.270, p.20106-20111.

41. Driessen A.J.M. Precursor protein translocation by the Escherichia coli translocase is directed by the protonmotive force. EMBO J., 1992, v.l 1, p. 847-853.

42. Driessen A.J.M. SecA, the peripheral subunit of the Escherichia coli precursor protein translocase, is functional as a dimer. Biochemistry, 1993, v.32, p. 13190-13197.

43. Duong F., Wickner W. Distinct catalytic roles of the Sec YE, SecG and SecDFyajC subunits of preprotein translocase holoenzyme. EMBO J., 1997a, v. 16, p.2756-2768.

44. Duong F., Wickner W. The SecDFyajC domain of preprotein translocase controls preprotein movement by regulating SecA membrane cycling. -EMBO J., 1997b, v. 16, p.4871-4879.

45. Economou A., Pogliano J.A., Beckwith J., Oliver D.B., Wickner W. SecA membrane cycling at SecYEG is driven by distinct ATP binding and hydrolysis events and is regulated by SecD and SecF. Cell, 1995, v.83, p. 1171-1181.

46. Eichler J., Wickner W. Both an N-terminal 65-kDa domain and a C-terminal 30-kDa domain of SecA cycle into the membrane at SecYEG during translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v.94, p.5574-5581.

47. Emr S.D., Hanley-Way S., Silhavy T.J. Suppressor mutations that restore export of a protein with a defective signal sequence. Cell, 1981, v.23, p.79-88.

48. Emr S.D., Silhavy T.J. Importance of secondary structure in the signal sequence for protein export. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, v.80,р.4599-4603.

49. Fandl J.P., Cabelli R., Oliver D„ Tai P.C. SecA supresses the temperature-sensitive SecY24 defect in protein translocation in Escherichia coli membrane vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, v.85, p.8953-8957.

50. Fekkes, P., and Driessen, A.J.M. Protein targeting to the bacterial cytoplasmic membrane. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1999, v.63, p. 161173.

51. Fikes J.D., Bassford P.J., Jr. Export of unprocessed maltose-binding protein to the periplasm of Escherichia coli cells. J. Bacterid., 1987, v.169, p.2352-2359.

52. Fikes J.D., Barkocy-Gallagher G.A., Klapper D.G., Bassford P.J.Jr. Maturation of Escherichia coli maltose-binding protein by signal peptidase I in vivo. J.Biol.Chem., 1990, v.265, p.3417-3423.

53. Gardel C., Johnson K., Jacq A., Beckwith J. The secD locus of Escherichia coli codes for two membrane proteins required for protein export. EMBO J., 1990, v.9, p.3209-3216.

54. Geller B.L., Movva N.R., Wickner W. Both ATP and the electrochemical potential are required for optimal assembly of pro-OmpA into Escherichia coli inner membrane vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, v.83, p.4219-4222.

55. Gierasch L.M. Signal sequences. Biochemistry, 1989, v.28, p.923-930.

56. Guzman, L.M., Belin D., Carson M.J., and Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose Pbad promoter. J. Bacteriol., 1995, v. 177, p.4121-4130.

57. Hall M.N., Gabay J., Schwartz M. Evidence for a coupling of synthesis and export of an outer membrane protein in Escherichia coli. EMBO J., 1983, v.2, p.15-19.

58. Hanada M., Nishiyama K., Mizushima S., Tokuda H. Reconstitution of anefficient protein translocation machinery comprising SecA and the three membrane proteins, SecY, SecE and SecG (pi2). J. Biol. Chem., 1994, v.269, p.23625-23631.

59. Hartl F.-U., Lecker S., Schiebel E., Hendrick J.P., Wickner W. The binding cascade of SecB to SecA to SecY/E mediates preprotein targeting to the Escherichia coli plasma membrane. Cell, 1990, v.63, p.269-279.

60. Hartl F.-U., Wiedmann M. Procariotic secretion: a signal recognition particle in Escherichia coli. Curr. Biol., 1993, v.3, p.86-89.

61. Hartman E., Sommer Т., Prehn S., Gorlich D., Jentsch S., Rapoport T. Evolutionary conservation of components of the protein translocation apparatus. Nature, 1994, v.367, p.654-657.

62. Hendrick J.P., Wickner W. SecA protein needs both acidic phospholipids and SecY/E protein for functional, high-affinity binding to the Escherichia coli plasma membrane. J. Biol. Chem., 1991, v.266, p.24596-24600.

63. Hoffschulte H.K., Drees В., Miiller M. Identification of a soluble SecA/SecB complex by means of a subfractionated cell-free export system. J. Biol. Chem., 1994, v.269, p. 12833-12839.

64. Inouye H., Beckwith J. Synthesis and processing of alkaline phosphatase precursor in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, v.74, p. 1440-1444.

65. Inouye M., Halegoua S. Secretion and membrane localization of proteins in Escherichia coli. Crit. Rev. Biochem., 1980, v.7, p. 339-371.

66. Inouye H., Michaelis S., Wright A., Beckwith J. Cloning and restriction mapping of alkaline phosphatase structural gene (phoA) of Escherichia coli and generation of deletion mutant in vitro. J. Bacteriol., 1981, v. 146, p.668-675.

67. Inouye S., Soberon X., Franceschini Т., Nakamura K., Itakura K., Inouye M. Role of positive charge on the amino-terminal region of the signal peptide in protein secretion across the membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, v.79, p.3438-3441.

68. Jain R.G., Rusch S.L., Kendall D.A. Signal peptide cleavage regions. Functional limits on length and topological implications. J. Biol.Chem., 1994, v.269, p. 16305-16310.

69. Joly J.C., Wickner W. The SecA and SecY subunits of translocase are the nearest neighbors of a translocating preprotein, shielding it from phospholipids. EMBO J., 1993, v. 12, p.255-263.

70. Kadonaga, J.T., Gautier, A.E., Straus, D.R., Charles, A.D., Edge, M.D., and Knowles, J.R. The role of the beta-lactamase signal sequence in the secretion of proteins by Escherichia coli. J. Biol. Chem. 1984, v. 259, p.2149-2154.

71. Kajava, A. V., Bogdanov, M. V., Nesmeyanova, M. A. Stereochemical analysis of interaction of signal peptide with phospholipids at the initiation of protein translocation across the membrane. J. Biomol. Struct Dyn., 1991, v.9, p.143-157.

72. Kamitani S., Akiyama Y., Ito K. Identification and characterization of an Escherichia coli gene required for the formation of correctly folded alkaline phosphatase, a periplasmic enzyme. EMBO J., 1992, v. 11, p.57-62.

73. Karamanou S, Vrontou E, Sianidis G, Baud C, Roos T, Kuhn A, Politou A.S, Economou A. A molecular switch in SecA protein couples ATP hydrolysis to protein translocation. Mol. Microbiol., 1999, v.34, p.l 133

74. Karamyshev, A.L., Karamysheva, Z.N., Kajava, A.V. Ksenzenko, V.N. Nesmeyanova, M.A. Processing of Escherichia coli alkaline phosphatase: role of the primary structure of the signal peptide cleavage region. J. Mol. Biol., 1998. v.277, p.859-870.

75. Kato M., Tokuda H., Mizushima S. In vitro translocation of secretory proteins possessing no charges at the mature domain takes place efficiently in a protonmotive force-dependent manner. J. Biol. Chem., 1992, v.267, p.413-418.

76. Kimura E., Akita M., Matsuyama S., Mizushima S. Determination of a region in SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1991, v.266, p.6600-6606.

77. Kleina L.G., Masson J.-M., Normanly J., Abelson J., Miller J.H. Construction of E. coli amber suppressor tRNA genes. II. Synthesis of additional tRNA genes and improvement of suppressor efficiency. J. Mol. Biol., 1990, v.213, p.705-717.

78. Kontinen V.P., Tokuda H. Overexpression of phosphatidylglycerophosphate syntase restores protein translocation in a secG deletion mutant of Escherichia coli at low temperature. FEBS Lett., 1995, v.364, p.157-160.

79. Kraulis, P.J. MOLSCRIPT: a program to produce both detailed and schematic plots of protein structures. J. App. Crystall., 1991, v.24, p. 946950.

80. Kumamoto C.A., Beckwith J. Evidence for specificity at an early step in protein export in Escherichia coli. J. Bacterid., 1985, v. 163, p.267-274.

81. Kumamoto, С. A., and A. K. Nault. Characterization of the Escherichia coli protein-export gene secB. Gene, 1989, v.75, p. 167-175.

82. Kumamoto, C. A., and O. Francetic. Highly selective binding of nascent polypeptides by an Escherichia coli chaperone protein in vivo. J. Bacterid., 1993, v. 175, p.2184-2188.

83. Kusters R., Breukink E., Gallusser A., Kuhn A., de Kruijff B. A dual role for phosphatidyl glycerol in protein translocation across Escherichia coli inner membrane. J. Biol. Chem., 1994, v.269, p. 1560-1563.

84. Kusters R., Dowhan W. and de Kruijff B. Negatively charged phospholipids restore prePhoE translocation across phosphatidylglycerol-depleted Escherichia coli inner membrane vesicles. J. Biol. Chem. 1991, v.266, p. 8659-8662.

85. Kusukawa N., Yura Т., Ueguchi C., Akiyama Y., Ito K. Effects of mutations in heat-shock genes groES and groEL on protein export in Escherichia coli. EMBO J., 1989, v.8, p.3517-3521.

86. Laemmli U.K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, v.227, p.680-685.

87. Laforet G.A., Kendall D.A. Functional limits of conformation, hydrophobicity, and steric constraints in prokaryotic signal peptide cleavage regions. Wild type transport by a simple polymeric signal sequence. J. Biol. Chem., 1991, v.266, p. 1326-1334.

88. Lee C., Beckwith J. Cotranslational and posttranslational protein translocation in procaryotic systems. Annu. Rev. Cell Biol., 1986, v.2, p.315-336.

89. Lee С., Li P., Inouye H., Beckwith J. Genetic studies on the inability of (3-galactosidase to be translocated across the Escherichia coli cytoplasmic membrane. J. Bacterid., 1989, v.171, p.4609-4616.

90. Lehnhardt S., Pollitt N.S., Goldstein J., Inouye M. Modulation of the effects of mutations in the basic region of the OmpA signal peptide by the mature portion of the protein. J. Biol. Chem., 1988, v.263, p. 1030010303.

91. Li P., Beckwith J., Inouye H. Alteration of the amino terminus of the mature sequence of a periplasmic protein can severely affect protein export in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, v.85, p.7685-7689.

92. Lill R., Crooke E., Guthrie В., Wickner W. The "trigger factor cycle" includes ribosomes, presecretory proteins and the plasma membrane. -Cell, 1988, v.54, p. 1013-1018.

93. Lill R., Do whan W., Wickner W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell, 1990, v.60, p.271-280.

94. Liu G., Topping T.B., Randall L.L. Physiological role during export for the retardation of folding by the leader peptide of maltose-binding protein. -Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, v.86, p.9213-9217.

95. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin-phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951, v. 193, p.265-275.

96. Luirink J., ten Hagen-Jongman C.M., van der Weijden C.C., Oudega В., High S., Wood H., Dobberstein В., Kusters R. An alternative protein targeting pathway in Escherichia coli: studies on the role of FtsY. -EMBO J., 1994, v.13, p.2289-2296.

97. Luirink, J. and B. Dobberstein. Mammalian and Escherichia coli signal recognition particles. Mol. Microbiol., 1994, v. 11, p.9-13.

98. Luo, Y., Pfuetzner, R.A., Mosimann, S., Paetzel, M., Frey, E.A., Cherney, M., Kim, В., Little, J.W., and Strynadka, N.C. Crystal Structure of LexA: A Conformational Switch for Regulation of Self-Cleavage. Cell, 2001, v. 106, p.585-594

99. Maclntyre S., Henning U. The role of the mature part of secretory proteins in translocation across the plasma membrane and in regulation of their synthesis in Escherichia coli. Biochimie, 1990, v.72, p. 157-167.

100. Manting, E. H. Driessen, A. Escherichia coli translocase: the unraveling of molecular machine. Mol. Microbiol., 2000, v.37, p. 226-238.

101. Matsuyama S., Kimura E., Mizushima S. Complementation of two overlapping fragments of SecA, a protein translocation ATPase of Escherichia coli, allows ATP binding to its amino-terminal region. J. Biol. Chem., 1990, v.265, p.8760-8765.

102. Matsuyama S., Fujita Y., Mizushima S. SecD is involved in the release of translocated secretory proteins from the cytoplasmic membrane of Escherichia coli. EMBO J., 1993, v. 12, p.265-270.

103. Michaelis S., Inouye H., Oliver D., Beckwith J. Mutations that alter the signal sequence of alkaline phosphatase in Escherichia coli. J. Bacteriol, 1983, v. 154, p.366-374.

104. Michaelis S., Hunt J.F., Beckwith J. Effects of signal sequence mutations on the kinetics of alkaline phosphatase export to the periplasm in

105. Escherichia coli. J. Bacterid., 1986, v. 167, p. 160-167.

106. Mitchell C., Oliver D. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Mol. Microbiol., 1993, v. 10, p.483-497.

107. Miura Т., Mizushima S. Separation by density gradient centrifugation of two types of membrane from spheroplast membrane of Escherichia coli K12. Biochim. Biophys. Acta, 1968, v. 150, p. 159-161.

108. Moreno, F., A. V. Fowler, M. Hall, T. J. Silhavy, I. Zabin, and M. Schwartz. A signal sequence is not sufficient to lead beta-galactosidase out of the cytoplasm. Nature, 1980, v. 286, p.356-359.

109. Mori, H., Araki, M., Hikita, C., Tagaya, M., and Mizushima, S. The hydrophobic region of signal peptides is involved in the interaction with membrane-bound SecA. Biochim. Biophys. Acta, 1997, v. 1326, p.23-36.

110. Mori H. and Ito K. The Sec protein-translocation pathway. TRENDS Microbiology, 2001, v.9, p. 494-500.

111. Murphy C.K., Beckwith J. Residues essential for the function of SecE, a membrane component of the Escherichia coli secretion apparatus, are located in a conserved cytoplasmic region. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, v.91, p.2557-2561.

112. American society for microbiology, Washington, D.C., 1987, p. 139-141.

113. Nakatogawa, H., Mori, H. and Ito, K. Two independent mechanisms down-regulate the intrinsic SecA ATPase activity. J.Biol.Chem., 2000, v.275, p.33209-33212.

114. Nesmeyanova M.A. On the possible participitation of acid phospholipids in the translocation of secreted proteins through the bacterial cytoplasmic membrane. FEBS Lett., 1982, v. 142, p. 189-193.

115. Nesmeyanova M.A., Bogdanov M.V. Participation of acid phospholipids in protein translocation across the bacterial cytoplasmic membrane. -FEBS Lett., 1989, v.257, p.203-207.

116. Newitt, J.A., Ulbrandt, N.D., and Bernstein, H.D. The structure of multiple polypeptide domains determines the signal recognition particle targeting requirement of Escherichia coli inner membrane proteins. J Bacterid., 1999, v.181, p.4561-4567.

117. Nielsen, H., Engelbrecht, J., von Heijne, G., and Brunak, S. Defining a similarity threshold for a functional protein sequence pattern: the signal peptide cleavage site. Proteins, 1996, 24, 165-177

118. Nishiyama K., Kabuyama Y., Akimaru J., Matsuyama S., Tokuda H., Mizushima S. SecY is an indispensable component of the proteinsecretory machinery of Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, 1991, v. 1065, p.89-98.

119. Nishiyama K., Mizushima S., Tokuda H. A novel membrane protein involved in protein translocation across the cytoplasmic membrane of Escherichia coli. БМВО J., 1993, v. 12, p.3409-3415.

120. Nishiyama K., Hanada M., Tokuda J. Disruption of the gene encoding pi 2 (SecG) reveals the direct involvement and important function of SecG in the protein translocation of Escherichia coli at low temperature. EMBO J., 1994, v.13, p.3272-3277.

121. Nishiyama K., Suzuki Т., Tokuda H. Inversion of the membrane topology of SecG coupled with SecA-dependent preprotein translocation. Cell, 1996, v.85, p.71-81.

122. Niviere, V., Wong, S. L., and Voordouw. Site-directed mutagenesis of the hydrogenase signal peptide consensus box prevents export of a beta-lactamase fusion protein. G. J. Gen. Microbiol., 1992,138, 2173-2183

123. Novak P., Dev I.K. Degradation of a signal peptide by protease VI and oligopeptidase A. J. Bacteriol., 1988, v. 170, p.5067-5075.

124. Or E, Navon A, Rapoport T. Dissociation of the dimeric SecA ATPase during protein translocation across the bacterial membrane. EMBO J., 2002, v.21, p.4470-4479.

125. Osborne R.S., Silhavy T.J. PrlA suppressor mutations cluster in regions corresponding to three distinct topological domains. EMBO J., 1993, v. 12, p.3391-3398.

126. Paetzel, M., Dalbey, R.E., and Strynadka, N.C. Crystal structure of a bacterial signal peptidase in complex with a (3-lactam inhibitor Nature, 1998,v. 396, p. 186-190.

127. Palva, I., Sarvas, M., Lehtovaara, P., Sibakov, M., and Kaariainen, L. Secretion of Escherichia coli ^-lactamase from Bacillus subtilis by the aid of alpha-amylase signal sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, v.79, р.5582-5586.

128. Palzkill Т., Le Q., Wong A., Botstein D. Selection of functional signal peptide cleavage sites from a library of random sequences. J. Bacteriol., 1994, v.176, N3, p.563-568.

129. Perlman D., Halvorson H.O. A putative signal peptidase recognition site and sequence in eukaryotic and prokaryotic signal peptides. J. Mol. Biol, 1983, v. 167, p.391-409.

130. Phillips G.J., Silhavy T.J. The Escherichia coli ffh gene is necessary for viability and efficient protein export. Nature (London), 1992, v.359, p.744-746.

131. Pogliano J.A., Beckwith J. SecD and SecF facilitate protein export in Escherichia coli. EMBO J., 1994b, v. 13, p.554-561.

132. Pogliano K.J., Beckwith J. Genetic and molecular characterization of the Escherichia coli secD operon and its products. J. Bacteriol., 1994a, v.176, p.804-814.

133. Powers Т., Walter P. Co-translational protein targeting catalyzed by the Escherichia coli signal recognition particle and its receptor. EMBO J., 1997, v. 16, p.4880-4886.

134. Pugsley, A.P. The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria. Microbiol. Rev., 1993, v.57, p.50-108

135. Randall L.L. Translocation of domains of nascent periplasmic proteins across the cytoplasmic membrane is independent of elongation. Cell, 1983, v.33, p.231-240.

136. Rapoport, T.A., Jungnickel, В., and Kutay, U. Protein transport across the eukaryotic endoplasmatic reticulum and bacterial inner membranes. Annu. Rev. Biochem., 1996, v.65, p.271-303.

137. Rosenblatt M., Beadutte N.V., Fasman G.D. Conformational studies of the synthetic precursor-specific region of preproparathyroid hormone. -Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, v.77, p.3983-3987.

138. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989, v. 1-3, 16261. P

139. San Millan J.L., Boyd D., Dalbey R., Wickner W., Beckwith J. Use of phoA fusions to study the topology of the Escherichia coli inner membrane protein leader peptidase. J. Bacteriol., 1989, v. 171, p.5536-5541.

140. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-termination inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, v.74, p.5463-5467.

141. Schatz P.J., Riggs P.D., Jacq A., Fath M.J., Beckwith J. The secE gene encodes an integral membrane protein required for protein export in Escherichia coli. Genes Dev., 1989, v.3, p. 1035-1044.

142. Schatz P. J., Beckwith J. Genetic analysis of protein export in Escherichia coli.-Ашт. Rev. Genet., 1990, v.24, p.215-248.

143. Schiebel E., Driessen A.J.M., Hartl F.U., Wickner W. A|uH+ and ATP function at different steps of the catalytic cycle of preprotein translocase. -Cell, 1991, v.64, p.927-939.

144. Schneider G., Rohlk S., Wrede P. Analysis of cleavage-site patterns in protein precursor sequences with a percepton-type neural network. -Biochem. Biophys. Res. Commun., 1993, 194, p.951-959.

145. Simon S.M., Blobel G. Signal peptides open protein-conducting chanels in Escherichia coli. Cell, 1992, v.69, p.677-684.

146. Sowadzki, J.M., Handschumacher, M.D., Murthy, H.M.K., Foster, B.A. and Wyckoff, H.W. Refined structure of alkaline phosphatase from Escherichia coli at 2.8 A resolution. J. Mol. Biol., 1985, v. 186, p.417-433.

147. Stader J., Gansheroff L.J., Silhavy T.J. New suppressors of signal-sequence mutations, prlG, are linked tightly to the secE gene of. Genes Dev., 1989, v.3, p. 1045-1052.

148. Takahara M., Sagai H., Inouye S., Inouye M. Secretion of humansuperoxide dismutase in Escherichia coli. Bio Technology, 1988, v.6, p. 195-198.

149. Tani K., Shiozuka K., Tokuda H., Mizushima S. In vitro analysis of the process of translocation of proOmpA across the Escherichia coli cytoplasmic membrane. J. Biol. Chem., 1989, v.264, p. 18582-18588.

150. Tanji Y., Gennity J., Pollitt S., Inouye M. Effect of OmpA signal peptide mutations on OmpA secretion, synthesis, and assembly. J. Bacteriol., 1991, v. 173, p. 1997-2005.

151. Teschke C.M., Kim J., Song Т., Park S„ Park C., Randall L.L. Mutations that affect the folding of ribose-binding protein selected as suppressors of a defect in export in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1991, v.266, p. 11789-11796.

152. Topping T.B., Randall L.L. Determination of the binding frame within a physiological ligand for the chaperone SecB. Protein Sci., 1994, v.3, p.730-736.

153. Torriani A.-M. Influence of inorganic phosphate in the formation of phosphatase by Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, 1960, v.38, p.460-466.

154. Torriani A.-M. Alkaline phosphatase from Escherichia coli. In: Procedures in nucleic acid research (Cantoni, G.L. and Davis, R., Eds.), Harper and Row, Publishers, New York, 1966, p.224-234.

155. Uchida K., Mori H., Mizushima S. Stepwise movement of preproteins in the process of translocation across the cytoplasmic membrane of Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1995, v.270, p.30862-30868.

156. Walter, P., and G. Blobel. Purification of membrane-associated protein complex required for protein translocation across the endoplasmatic reticulum. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, v.77, p.7112-7116.

157. Watanabe M., Blobel G. Site specific antibodies against the PrlA (SecY) protein of Escherichia coli inhibit protein export by interfering with plasma membrane binding of preproteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989a, v.86, p.1895-1899.

158. Watanabe M., Blobel G. Cytosolic factor purified from Escherichia coli is necessary and sufficient for the export of a protein and is a homotetramer of SecB. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989b, v.86, p.2728-2732.

159. Wickner W. Assembly of proteins into biological membranes: membrane trigger hypothesis. Ann. Rev. Biochem., 1979, v.48, p.23-45.

160. Wickner W., Driessen A.J.M., Hartl F.-U. The enzymology of protein translocation across the Escherichia coli plasma membrane. Annu. Rev. Biochem., 1991, v.60, p. 101-124.

161. Wickner W., Leonard M. R. Escherichia coli preprotein translocase. J. Biol. Chem., 1996, v.271, p.29514-29516.

162. Wolfe P.B., Wickner W., Goodman J.M. Sequence of the leader peptidase gene of Escherichia coli and the orientation of leader peptidase in the bacterial envelope. J. Biol. Chem., 1983, v.258, p. 12073-12080.

163. Yahr, T.L. and Wickner, W.T. Evaluating the oligomeric state of SecYEG in preprotein translocase. EMBO J., 2000, v. 19, p.4393-4401.

164. Yamagata H., Daishima K., Mizushima S. Cloning and expression of a gene coding for the prolipoprotein signal peptidase of Escherichia coli. -FEBS Lett., 1983, v. 158, p.301-304.

165. Yamane K., Mizushima S. Introduction of basic amino acid residues after the signal peptide inhibits protein translocation across the cytoplasmic membrane of Escherichia coli. J.Biol. Chem., 1988, v.263, p.19690-19696.

166. Zwizinski C., Wickner W. Purification and characterization of leader (signal) peptidase from Escherichia coli. J. Biol.Chem. 1980, v.255, p.7973-7977.1091. БЛАГОДАРНОСТИ

167. Выражаю искреннюю признательность и благодарность за руководство и постоянное содействие в работе своему научному руководителю профессору Марине Артемьевне Несмеяновой.

168. Благодарю чл.-корр. РАН Игоря Степановича Кулаева за постоянное внимание, ценные советы и интерес к работе.

169. Благодарю всех сотрудников лаборатории секреции белков у бактерий ИБФМ РАН за внимание и поддержку в работе.