Конструирование и изучение топогенеза гибридных белков на основе цитохрома P450scc (CYP11A1) в гетерологических системах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Миненко, Андрей Николаевич

• Миненко, Андрей Николаевич
• кандидат химических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат химических наук Миненко, Андрей Николаевич

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Основы импорта белков в митохондрии.

1.2 Транслоказа внешней мембраны (ТОМ - комплекс).

1.2.1 Рецепторы ТОМ-комтекса.

1.2.2 Центральный транспортный канал.

1.3 SA М компл тс.

1.4 Импорт небольших белков межмембранного пространства.

1.5 Транслоказа встраивания (TIM22-комплекс).

1.6 Транслоказа переноса (Т1М23-комплекс).

1.6.1 РАМ—комплекс.

1.7 Встраивание предшественников во внутреннюю мембрану.

1.8 Митохондриалъная прогрессирующая пептидаза.

1.9 Сигналы митохондриалъного импорта.

1.10 Общая характеристика цитохрома CYP11A1.

1.11 Механизм действия холестеринмонооксигеназной/лиазиой системы.

1.12 Топогепез и топология CYP11A1 в мембране.

1.13 Взаимодействие CYP11A1 с адренодоксином.

1.14 Узнавание субстрата и канал доступа.

1.15 Активный центр CYP11А1.

1.16 Импорт CYP11А1 в гетерологические митохондрии.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Материалы.

2.1.1 Реактивы и ферменты.

2.1.2 Использованные клеточные штаммы и нпазмиды.

2.2 Методы.

2.2.1 Методы работы с ДНК.

2.2.2 Выделение ДНК.

2.2.3 Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК.

2.2.4 Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК (мини - щелочной метод).

2.2.5 Рестриктный анализ.

2.2.6 Препаративная рестрикция плазмидной ДНК.

2.2.7 Выделение фрагментов ДНК из агарозпого геля.

2.2.8 Модификация концевых участков ДНК.

2.2.9 Проведение полимеразной цепной реакции.

2.2.10 Лигирование.

2.2.11 Секвенирование.

2.2.12 Методы работы с клетками Е. coli.

2.2.13 Условия роста штаммов Е. coli.

2.2.14 Экспрессия рекомбинантных белков в клетках Е. coli.

2.2.15 Трансформация клеток Е. coli с применением CaCli.

2.2.16 Трансформация клеток Е. coli методом электропорации.

2.2.17 Фракционирование клеток Е. coli с использованием French Press.

2.2.18 Получение спектров рекомбинантных белков.

2.2.19 Методы работы с клетками S. cerevisiae.

2.2.20 Условия роста штаммов S. cerevisiae.

2.2.21 Трансформация клеток S. cerevisiae.

2.2.22 Выделение митохондрий из дрожжевых клеток.

2.2.23 Определение содержания белка по Лоури.

2.2.24 Электрофорез по Лэммли.

2.2.25 Иммуноблоттииг.

2.2.26 Щелочная экстракция митохондриальных белков.

2.2.27 Озвучивание митохондий в KCL.

2.2.28 Получение митопластов.

2.2.29 Обработка митохондрий и митопластов протеиназой К.

2.2.30 Трипсинолиз.

2.2.31 Определение ферментативной активности рекомбинантных белков.

2.3 Конструирование плазмид для экспресии гибридных белков AAC-mCYPllAl, Bcsl(I-83)-mCYPl !А 1 и DLD(l-72)-mCYPllAl в дроэ/сжевых клетках.

2.4 Конструирование плазмиды pYeDP/preAd-mCYP 11А1 для экспресии гибридного белка preAd-mCYP 11А1 в дрожэюевых клетках.

2.5 Конструирование плазмид для экспресии гибридных белков ASu9(67 -112)mCYPllAl и AAC-mCYPl 1А1 в бактериальных клетках.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.6 Постановка задачи.

2.7 Экспрессия гибридных белков.

2.8 Определение виутримитохондриалъной локализации гибридных белков.

2.8.1 Карбонатная экстракция мипгохондриачьных белков.

2.8.2 Определение внутримитохондриальной локализации гибридных белков.

2.9 Каталитическая активность гибридных белков в митохондриях.

2.10 Характеристика CYP11А1 домена в составе гибрида АА C-mCYPl 1А1.

2.11 Экспрессия гибридных белков в бактериальных клетках.

2.12 Экспрессия гибридных белковpreAd-mCYPllAl и CoxIV(I-25)-mCYPlJAJ в штаммах YPH499 и YPH499рат17А.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Конструирование и изучение топогенеза гибридных белков на основе цитохрома P450scc (CYP11A1) в гетерологических системах»

В течение последних десятилетий достигнуты значительные успехи в изучении топогенеза митохондриальных белков, синтезируемых как в цитозоле, так и в самих органеллах. Детально изучен транслокационный аппарат митохондрий (белковые транслоконы ТОМ, ТТМ23, TIM22), механизмы прохождения импортируемых полипептидных цепей через митохондриальные мембраны. Установлены общие принципы импорта белковых предшественников в митохондрии, их распределение по субмитохондриальным компартментам (хотя и для достаточно ограниченного числа традиционных белков-моделей). Вместе с тем. в топогенезе митохондриальных белков остается множество проблем, решение которых требует дополнительных исследований. В частности, это касается механизмов встраивания белков в митохондриальные мембраны и, особенно, во внутреннюю мембрану, в которой сосредоточены компоненты, отвечающие за эксклюзивные функции митохондрий. Особый интерес представляет включение в митохондриальные мембраны белков, не имеющих отчетливо выраженных топогенных сигналов. К числу таких белков относится цитохром P450scc (CYP11A1). который содержится во внутренней мембране митохондрий стероидогенных органов и отвечает, в сопряжении с адренодоксином и NADPH: адренодоксин-оксидоредукгазой, за ключевую стадию синтеза всех стероидных гормонов млекопитающих (превращение холестерина в прегненолон). Особенностью CYP11A1 как субстрата для импорта является так же то, что он является гемпротеином и, следовательно, в процессе своего топогенеза должен связывать гем.

Изучение топогенеза митохондриального цнтохрома CYP11А1, который в силу отсутствия характерных топогенных сигналов не может встраиваться в мембрану ни по одному из охарактеризованных к настоящему моменту молекулярных механизмов, должно способствовать расширению современных представлений о митохондриальном белковом импорте.

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Основы импорта белков в митохондрии.

Митохондрии составляют приблизительно 20% массы эукариотической клетки и содержат, в зависимости от вида организмов, от 500 до 2000 различных белков, распределенных между четырьмя компартментами: внешняя мембрана, межмембранное пространство, внутренняя мембрана и матрикс [1]. В дрожжах только восемь, а у человека только 13 митохондриальных белков кодируется в геноме органеллы и синтезируется в матриксе. Более 98% митохондриальных белков кодируется ядерными генами и синтезируются как белковые предшественники на цитоплазматических рибосомах.

Различают два основных класса предшественников, принципиально отличающихся по типу используемых сигналов импорта в митохондрию [2J. К первом классу относят предшественники матриксных белков, содержащих на N-конце отщепляемую аминокислотную препоследовательность. Большинство представителей второго класса белков - многочисленные переносчики метаболитов, локализованные во внутренней мембране митохондрии и содержащие от трех до шести гидрофобных доменов [3].

N-концевая препоследовательность предшественников первого класса состоит из 10 - 80 аминокислотных остатков, которые протеолитически удаляются в матриксе. Препоследовательность содержит положительно заряженные гидрофобные и гидроксилированные аминокислотные остатки. Характерной чертой препоследовательности является способность образовывать амфифильную а-спираль, которая представляет' собой положительно заряженную поверхность с одной стороны и гидрофобную поверхность с другой стороны [4, 5].

Кроме этих основных классов, существуют несколько специфических типов предшественников для белков внешней и внутренней мембран и белков межмембранного пространства.

Основой для специфического распознавания и переноса предшественников через внешнюю мембрану митохондрий является комплекс мембранных белков ТОМ. Транслоказа внешней мембраны - ТОМ комплекс (от англ. translocase of outer membrane), включает в себя белки-рецепторы и центральный транспортный канал

GIP (от англ. general import pore), через который проходят предшественники всех типов (рис.1) [6].

Рис.1. Основные пути импорта белков в митохондрии.

В дальнейшем предшественники, которые состоят из /3-листов и имеют бочкообразную третичную структуру, встраиваются во внешнюю мембрану, как было недавно обнаружено [7], посредством SAM-комплекса (от англ. sorting and assembly machinery). Для импорта некоторых белков, имеющих специфические цистеиновые мотивы, необходимы белки Mia40 и Ervl [8].

Внутренняя мембрана содержит два транслокационных комплекса - TIM23 и Т1М22-комплексы (от англ. translocase of inner membrane). TIM22 - посредник во встраивании во внутреннюю мембрану гидрофобных белков-переносчиков метаболитов [9], TIM23 транспортирует предшественники с отщепляемой препоследовательностью. При этом предшественники переносятся в матрикс митохондрий при взаимодействии комплексов TIM23 и РАМ (от англ. presequence translocase-associated motor) [10], либо включаются в процессе транслокации во внутреннюю мембрану, если комплекс РАМ диссоциирован от TIM23 [4]. Как правило, в последнем случае импортируемые белки содержат трансмембранный домен, расположенный вблизи от сигнальной препоследовательности.

Необходимо отметить, что белки-предшественники транспортируются в митохондрию только в песвернутой, либо частично свернутой конформации. Подобные состояния поддерживаются с помощью шаперонов цитоплазмы и шапероноподобных белков митохондрии, связывающихся с предшественниками [5]. Связывание с шаперонами также препятствует агрегации предшественников, содержащих гидрофобные домены, в водной среде цитозоля и межмембранного пространства. Кроме того, шапероны способствуют распознаванию предшественников мембранными рецепторами митохондрии.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Миненко, Андрей Николаевич

3 выводы.

1. Сконструированы плазмиды для экспрессии в дрожжах гибридных белков AAC-mCYPl 1А1, Bcsl(l-83)-mCYPl 1А1, DLD(l-72)-mCYPl 1А1 и preAd-mCYPllAl.

2. Показано, что AAC-mCYPl 1A1, Bcsl(l-83)-mCYPllAl, CoxIV(l-25)-mCYPllAl, DLD( 1 -72)-mCYP 11A1, Su9(l-112)-mCYPl 1A1 и preAd-mCYPl 1A1 эффективно импортируются в митохондрии в дрожжевых клетках, при этом белки AAC-mCYPl 1А1, Bcsl(l-83)-mCYPllAl. CoxIV(l-25)-mCYPl 1А1, DLD(l-72)-mCYPllAl и Su9(l-112)-mCYPl 1A1 проявляют энзиматическую активность в реакции отщепления боковой цепи молекулы холестерина с образованием прегненолона.

3. Установлено, что использование сигналов котранслокациопного встраивания для импорта цитохрома mCYPl 1А1 в дрожжевые митохондрии приводит к более эффективному формированию холофермента, чем использование сигналов ре-экспорта. Для гибрида CoxIV(l-25)-mCYPl 1А1 показано, что формирование холофермента происходит более эффективно в митохондриях, дефицитных по компоненту РАМ-коплекса Рат17, чем в митохондриях контрольного штамма.

4. Встраивание mCYPl 1А1 в мембрану является необходимой стадией для образования каталитически активного белка.

5. Для создания штамма трансгенных дрожжей способных осуществлять первую стадию синтеза стероидных гормонов наиболее перспективными представляются гибридные белки AAC-mCYPl 1А1 и Bcsl(l-83)-mCYPl 1А1.

2.13 Заключение.

Анализ аминокислотной последовательности CYP11A1 показывает отсутствие протяженных гидрофобных участков, которые могут выполнять роль топогенных сигналов для встраивания во внутреннюю мембрану в процессе транслокации или после импорта в матрикс. Тем не менее, изучение его топологии в митохондриях коры надпочечников млекопитающих показало, что белок связан с внутренними мембранами таким образом, что не экстрагируется карбонатом натрия, что предполагает его включение в липидной бислой [58].

В настоящее время предполагается, что взаимодействие CYP11A1 с мембранной осуществляется посредством аминокислотных остатков в составе петли между F и G спиралями - F-G петли, которая обеспечивает включение полипентидной цепи в лппидный бислой без его полного пересечения [62, 74].

При гетерологической экспрессии в митохондриях дрожжей предшественник CYP11A1 лишь частично процессировался и малоэффективно встраивался в митохондриальную мембрану. В основном белок проскальзывал в матрикс, где подвергался деградации или агрегировал [95, 96, 98]. Поэтому для импорта цитохрома в митохондрии использовали различные адресующие последовательности дрожжевых белков, которые теоретически могли бы способствовать более эффективному встраиванию CYP11A1 в мембрану дрожжевых митохондрий.

Было показано, что сконструированные в рамках данной работы белки ААС-mCYPllAl, Bcsl(l-83)-mCYPl 1 Al, DLD(l-72)-mCYPllAl и pAd-mCYPl 1А1, a также белки CoxIV(l-25)-mCYPllAl, Su9(l-112)-mCYPl 1 Al и mCYPllAl при экспрессии в дрожжевых клетках импортируются в митохондрии (рис.21, 26).

Гибридные белки с трансмембранными доменами в составе адресующих сигналов- AAC-mCYP 11 Al, Bcsl(l-83)-mCYPllAl, DLD(l-72)-mCYPl 1А1 и Su9(l-112)-mCYPl 1A1 - встраиваются во внутреннюю мембрану и обеспечивают предсказанную локализацию mCYPllAl-домена относительно внутренней митохондриальной мембраны.

Карбонатная экстракция митопластов, содержащих гибридный белок ААС-mCYPllAl после обработки протеиназой К (процедура приводящая к освобождению домена mCYPllAl от ААС) показала, что по крайней мере в данном конкретном случае добавление последовательности с трансмембранными доменами способствовало включению собственно CYP11A1 в мембрану (рис. 28). Домен CYP11A1 в данном случае не экстрагировался карбонатом натрия так же как цитохром в своей природном окружении. Кроме того домен CYP11A1 в составе гибридного белка AAC-mCYPl 1А1 правильно сворачивается, образуя в результате ограниченного трипсинолиза фрагменты характерные для нативного цитохрома.

Напротив, при использовании для импорта цитохрома в митохондрии предшественника растворимого матриксного белка preAd, включения гибрида во внутреннюю мембрану не происходит — гибрид после щелочной экстракции был обнаружен исключительно во фракции растворимых белков (рис.22, Б). Однако Ad-mCYPl 1 Al не экстрагируется из мембран при обработке митохондрий ультразвуком в высокой концентрации соли, что указывает на прочное взаимодействие гибрида с мембранной, наиболее вероятно, посредством CYP11A1 домена. Поведение Ad-mCYPllAl в экспериментах по фракционированию аналогично поведению в подобных экспериментах другого митохондриального белка Tim44, который ассоциирован с внутренней мембраной [122]. Принимая во внимание то, что гибрид preAd-mCYPllAl процессируется матриксной пептидазой (МРР) и результаты экспериментов по ограниченному прогеолизу, можно сделать вывод, что гибрид preAd-mCYPl 1 Al ассоциирован с внутренней мембраной со стороны матрикса. Таким образом, когда CYP11А1 импортируется в митохондрии с помощью предшественника матриксного белка (гибрид preAd-mCYPllAl), который, очевидно, является субстратом для TIM23/PAM суперкомплекса, правильное включение CYP11A1 домена в мембрану не происходит.

Сравнение ферментативных активностей гибридных белков измеренных на митохондриальных фракциях при добавлении Ad и AdR показало, что гибриды, содержащие сигнал остановки транслокации в мембране, а именно AAC-mCYPl 1 Al. Bcsl(l-83)-mCYPllAl и DLD(l-72)-mCYPl 1А1 обладали большей активностью в реакции отщепления боковой цепи холестерина, чем гибридный белок с сигналом реэкспорта Su9( 1-112)-mCYP 11А1.

Гибрид Ad-mCYPllAl не проявлял ферментативную активность во фракции митохондрий. Напротив, при экспрессии Ad-mCYPl 1 Al в клетках E.coli значительная часть гибридных молекул встраивается в мембраны и проявляет активность [109]. Полученные данные подтверждают предложение о том, что стадия полного переноса белковой последовательности CYP11A1 в матрикс не является необходимой в процессе его топогенеза, а скорее наоборот, для созревания холо-формы важно постоянное взаимодействие полипептидной цепи с мембраной. По-видимому, постоянное взаимодействие с мембраной важно для созревания белка, то есть присоединения гема, сворачивания и включения в мембрану. В эукариотических клетках последняя стадия синтеза гема осуществляется ферментом феррохелатазой, расположенной во внутренней мембране митохондрий. Учитывая, природную локализацию цитохрома CYP11A1 (встроен во внутреннюю мембрану и его акшвный центр направлен в матрикс), можно сделать вывод о том, что включение гема в апо-цитохром происходит во внутренней мембране.

Экспрессия белка ASu9(67-112)-mCYPllAl в бактериальных клетках -модельной системе не имеющей митохондрий - показала, что сигнал Su9(67—112) не оказывает заметного влияния на проявление mCYPl 1А1 -доменом активности. Таким образом, невысокая активность гибрида Su9(l-112)-mCYPllAl в митохондриях обусловлена, скорее всего, механизмом встраивания гибридного белка. В свою очередь, активности гибридных белков AAC-mCYPllAl, Bcsl(l-83)-mCYPl 1А1 и DLD(1—72)-mCYPllAl встраивающихся по котранслокационному механизму в митохондриях выше, чем у гибрида Su9(l-112)-mCYPllAl, даже несмотря на то, что N-концевые сигнальные довески этих белков, возможно, оказывают снижающее влияние на активность mCYPl 1А1-домена.

Сравнивая удельные активности белков не имеющих сигнальных довесков в митохондриях - зрелого mCYPl 1А1 и процессированной формы CoxIV(l-25)-mCYPllAl - мы видим, что активность CoxIV(l-25)-mCYPl 1А1 ниже. Это можно объяснить тем, что отщепляемый сигнал Сох(1-25) обеспечивает вынужденный импорт цитохрома в матрикс, где, как было показано ранее в нашей лаборатории [98], белок агрегирует и лишь небольшая его часть встраивается в мембрану.

Можно предположить, что при импорте в митохондрии стероидогенных тканей млекопитающих CYP11A1 распознается как субстрат для TIM23 комплекса свободного от РАМ, что обеспечивает его включение в мембрану. Эндогенным сигналом для встраивания посредством TIM23 может быть встраивание гема в апо-CYP11A1 в мембране. С другой стороны, современные взгляды на взаимодействие CYP11A1 с мембранной подразумевают, что основная часть белка экспонирована в матрикс, что позволяет предположить, что РАМ комплекс все-таки участвует в переносе полипепгидной цепи через внутреннюю мембрану, однако, вероятно, менее эффективно митохондриях етероидогенных тканей, что позволяет полипептидной цепи CYP11А1 взаимодействовать с мембраной в процессе переноса.

Действительно, для гибрида CoxIV(l-25)-mCYPl 1А1 показано, что при его импорте в митохондрии, дефицитные по компоненту РАМ-комплекса (Раш17), происходит более эффективное формирование холофермента, по всей видимости, за счет встраивания белка в мембрану в процессе транслокации.

В митохондриях млекопитающих Tim44 в основном обнаружен в матриксе [121], что вероятно означает, что шаперон mtHsp70 не связан с комплексом TIM23, и в этой системе, по всей видимости, главным образом реализуется модель пассивного импорта полипептидных цепей. То есть модель, согласно которой основной движущей силой импорта в матрикс является разность потенциалов мембраны, а mtHsp70 только связывается с полипептидными цепями белков, предотвращая их обратное движение [23]. Кроме того, в основе механизма удерживания в мембране может лежать сниженная дыхательная активность митохондрий, в которых проходит стероидогенез [100]. В результате низкое содержание АТФ в матриксе должно приводить к уменьшению активности mtHsp70 по протаскиванию белка в матрикс митохондрий.

В целом полученные данные указывают на то, что встраивание цитохрома CYP11A1 в природной системе происходит котранслокационно, то есть в процессе переноса его полипептидной цепи через мембрану.

Одной из задач данной работы был также выбор гибридного белка, активного в реакции отщепления боковой цепи холестерина, для создания штаммов микроорганизмов способных осуществлять первую стадию синтеза стероидных гормонов.

В рамках решения данной задачи была проведена проверка возможности функционального сопряжения цитохрома CYP11A1 млекопитающих в составе гибридных белков с вероятными редокс-партнерами дрожжей штамма S. cerevisiae 2805 (гомологом адренодоксина млекопитающих - ферредоксином Yahl [123], и гомологом адренодоксинредуктазы — бел оком Arhlp [124]), которая показала, что электронно-транспортная цепь дрожжевых митохондрий не может поддерживать функционирование CYP11A1. Соответственно, при создании дрожжевых трансгенных штаммов в них также должны быть экспрессированы белки-партнеры цитохрома - Ad и AdR. Основным критерием при выборе гибридных белков для создания трансгенного штамма была высокая ферментативная активность. Кроме того, гибридные белки не должны быть агрегированы, поскольку штаммы в этом случае могут быть не устойчивы в течение продолжительного времени культвирования. Так, ранее в нашей лаборатории [95], было показано, что экспрессия гибридного белка CoxIV(l-25)-mCYPllAl в дрожжах приводит к инактивации дыхательной цепи митохондрий (скорость клеточного дыхания снижается на 30-40%). Высокую активность имеет зрелый белок mCYPllAl, экспрессированный в клетках дрожжей, однако его локализация в митохондриях не ясна, и можно предполагать, что определенная часть белковых молекул агрегирована в матриксе. Кроме того, по имеющимся данным, mCYPllAl при экспрессии в дрожжах обнаруживается не только в митохондриях, но и в цитоплазматической мембране и мембранах ЭПР [125], что также может оказывать неблагоприятное воздействие на жизнеспособность клеток. Таким образом, для создания штамма трансгенных дрожжей способных осуществлять первую стадию синтеза стероидных гормонов наиболее перспективными представляются гибридные белки AAC-mCYPllAl и Bcsl(l -83)-mCYPllAl.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Миненко, Андрей Николаевич, 2008 год

1. М. Bohnert, N. Pfanner, М. van der Laan, A dynamic machinery for import of mitochondrial precursor proteins, FEBS Lett 581 (2007) 2802-2810.

2. N. Bolender, A. Sickmann, R. Wagner, C. Meisinger, N. Pfanner, Multiple pathways for sorting mitochondrial precursor proteins, EMBO Rep 9 (2008) 4249.

3. C. Sirrenberg, M.F. Bauer, B. Guiard, W. Neupert, M. Brunner, Import of carrier proteins into the mitochondrial inner membrane mediated by Tim22, Nature 384 (1996) 582-585.

4. M. van der Laan, M. Rissier, P. Rehling, Mitochondrial preprotein translocases as dynamic molecular machines, FEMS Yeast Res 6 (2006) 849-861.

5. N. Pfanner, N. Wiedemann, Mitochondrial protein import: two membranes, three translocases, Curr Opin Cell Biol 14 (2002) 400-411.

6. P. Rehling, K. Brandner, N. Pfanner, Mitochondrial import and the twin-pore translocase, Nat Rev Mol Cell Biol 5 (2004) 519-530.

7. N. Pfanner, N. Wiedemann, C. Meisinger, T. Lithgow, Assembling the mitochondrial outer membrane, Nat Struct Mol Biol 11 (2004) 1044-1048.

8. P. Rehling, N. Pfanner, C. Meisinger, Insertion of hydrophobic membrane proteins into the inner mitochondrial membrane—a guided tour, J Mol Biol 326 (2003) 639-657.

9. W. Neupert, J.M. Herrmann, Translocation of proteins into mitochondria, Annu Rev Biochem 76 (2007) 723-749.

10. Y. Abe, Т. Shodai, Т. Muto, К. Mihara, H. Torii, S. Nishikawa, T. Endo, D. Kohda, Structural basis of presequence recognition by the mitochondrial protein import receptor Tom20, Cell 100 (2000) 551-560.

11. N. Pfanner, A. Chacinska, The mitochondrial import machinery: preprotcin-conducting channels with binding sites for presequences. Biochim Biophys Acta 1592 (2002) 15-24.

12. K. Ilill, K. Model, M.T. Ryan, K. Dietmeier, F. Martin, R. Wagner, N. Pfanner, Tom40 forms the hydrophilic channel of the mitochondrial import pore for preproteins see comment., Nature 395 (1998) 516-521.

13. N. Wiedemann, N. Pfanner, M.T. Ryan, The three modules of ADP/ATP carrier cooperate in receptor recruitment and translocation into mitochondria, EMBO J 20 (2001)951-960.

14. M. Kurz, H. Martin, J. Rassow, N. Pfanner, M.T. Ryan, Biogenesis of Tim proteins of the mitochondrial carrier import pathway: differential targeting mechanisms and crossing over with the main import pathway. Mol Biol Cell 10 (1999) 2461-2474.

15. S.J. Habib, T. Waizenegger, A. Niewienda, S.A. Paschen, W. Neupert, D. Rapaport, The N-terminal domain of Tob55 has a receptor-like function in the biogenesis of mitochondrial beta-barrel proteins, J Cell Biol 176 (2007) 77-88.

16. S.A. Paschen, W. Neupert, D. Rapaport, Biogenesis of beta-barrel membrane proteins of mitochondria, Trends Biochem Sci 30 (2005) 575-582.

17. C.T. Webb, M.A. Gorman, M. Lazarou, M.T. Ryan, J.M. Gulbis, Crystal structure of the mitochondrial chaperone TIM9.10 reveals a six-bladed alpha-propeller, Mol Cell 21 (2006) 123-133.

18. N. Mesecke, N. Terziyska, С. Kozany, F. Baumann, W. Neupert, K. Hell, J.M. Herrmann, A disulfide relay system in the intermembrane space of mitochondria that mediates protein import, Cell 121 (2005) 1059-1069.

19. M. Rissler, N. Wiedemann, S. Pfannschmidt, K. Gabriel, B. Guiard, N. Pfanner, A. Chacinska, The essential mitochondrial protein Ervl cooperates with Mia40 in biogenesis of intermembrane space proteins, J Mol Biol 353 (2005) 485-492.

20. S.A. Paschen, U. Rothbauer, K. Kaldi, M.F. Bauer, W. Neupert, M. Brunncr, The role of the TIM8-13 complex in the import of Tim23 into mitochondria, EMBO J 19(2000) 6392-6400.

21. N. Pfanner. A. Geissler, Versatility of the mitochondrial protein import machinery, Nat Rev Mol Cell Biol 2 (2001) 339-349.

22. F. Мою, C. Sirrenberg, H.C. Schneider, W. Neupert, M. Brunner, The TIM17.23 preprotein translocase of mitochondria: composition and function in protein transport into the matrix, EMBO J 18 (1999) 3667-3675.

23. M.F. Bauer, C. Sirrenberg, W. Neupert, M. Brunner, Role of Tim23 as voltage sensor and presequence rcceptor in protein import into mitochondria, Cell 87 (1996) 33-41.

24. M. Meinecke, R. Wagner, P. Kovermann, B. Guiard. D.U. Mick, D.P. Hutu, W. Voos, K.N. Truscott, A. Chacinska, N. Pfanner, P. Rehling, Tim50 maintains thepermeability barrier of the mitochondrial inner membrane, Science 312 (2006) 1523-1526.

25. M. van der Laan, N. Wiedemann, D.U. Mick, B. Guiard, P. Rehling, N. Pfanner. Л role for Tim21 in membrane-potential-dependent preprotein sorting in mitochondria, CurrBiol 16 (2006) 2271-2276.

26. C. Voisine, E.A. Craig, N. Zufall, O. von Ahsen, N. Pfanner, W. Voos, The protein import motor of mitochondria: unfolding and trapping of preproteins are distinct and separable functions of matrix Hsp70, Cell 97 (1999) 565-574.

27. P.D. D'Silva, B. Schilke, W. Walter, A. Andrew, E.A. Craig, J protein cochaperone of the mitochondrial inner membrane required for protein import into the mitochondrial matrix, Proc Natl Acad Sci U S A 100 (2003) 1383913844.

28. P.R. D'Silva, B. Schilke, W. Walter, E.A. Craig, Role of Paml6's degenerate J domain in protein import across the mitochondrial inner membrane, Proc Natl Acad Sci U S A 102 (2005) 12419-12424.

29. E.E. Rojo, B. Guiard, W. Neupert, R.A. Stuart, Sorting of D-lactate dehydrogenase to the inner membrane of mitochondria. Analysis of topogcnic signal and energetic requirements, J Biol Chem 273 (1998) 8040-8047.

30. J.M. Herrmann. W. Neupert, R.A. Stuart, Insertion into the mitochondrial inner membrane of a polytopic protein, the nuclear-encoded Oxalp, EMBO J 16 (1997) 2217-2226.

31. E.E. Rojo, B. Guiard, W. Neupert, R.A. Stuart, N-terminal tail export from the mitochondrial matrix. Adherence to the prokaryotic "positive-inside" rule of membrane protein topology, J Biol Chem 274 (1999) 19617-19622.

32. A.B. Taylor, B.S. Smith, S. Kitada, K. Kojima, H. Miyaura, Z. Otwinowski, A. Ito, J. Deisenhofer, Crystal structures of mitochondrial processing peptidase reveal the mode for specific cleavage of import signal sequences, Structure 9 (2001)615-625.

33. Y. Gavel, G. von Heijne, Cleavage-site motifs in mitochondrial targeting peptides, Protein Eng 4 (1990) 33-37.

34. J. Martin, K. Mahlke, N. Pfanner, Role of an energized inner membrane in mitochondrial protein import. Delta psi drives the movement of presequences, J Biol Chem 266 (1991) 18051-18057.

35. C.M. Lec. J. Sedman, W. Neupert, R.A. Stuart, The DNA helicase, Hmilp, is transported into mitochondria by a C-terminal cleavable targeting signal, J Biol Chem 274 (1999) 20937-20942.

36. B.S. Glick, A. Brandt, K. Cunningham, S. Muller, R.L. Hallberg, G. Schatz, Cytochromes cl and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism, Cell 69 (1992) 809-822.

37. K. Hahne, V. Haucke, L. Ramage, G. Schatz, Incomplete arrest in the outer membrane sorts NADH-cytochrome b5 reductase to two different submitochondrial compartments, Cell 79 (1994) 829-839.

38. C. Knox, E. Sass, W. Neupert, O. Pines, Import into mitochondria, folding and retrograde movement of fumarase in yeast, J Biol Chem 273 (1998) 25587-25593.

39. О. Hechter, G. Pincus, Genesis of the adrenocortical secretion, Physiol Rev 34 (1954)459-496.

40. A.V. Grinberg, F. Hannemann, B. Schiffler, J. Muller, U. Heinemann, R. Bernhardt, Adrenodoxin: structure, stability, and electron transfer properties, Proteins 40 (2000) 590-612.

41. D. Werck-Reichhart, R. Feyereisen, Cytochromes P450: a success story. Genome Biol 1 (2000) REV1EWS3003.

42. M. Newcomb, P.H. Toy, Hypersensitive radical probes and the mechanisms of cytochrome P450-catalyzed hydroxylation reactions, Acc Chem Res 33 (2000) 449-455.

43. T. Omura, R. Sato, The Carbon Monoxide-Binding Pigment of Liver Microsomes. I. Evidence for Its Hemoprotein Nature, J Biol Chem 239 (1964) 2370-2378.

44. I. Schlichting, J. Berendzen, K. Chu, A.M. Stock, S.A. Maves, D.E. Benson. R.M. Sweet, D. Ringe, G.A. Petsko, S.G. Sligar, The catalytic pathway of cytochrome p450cam at atomic resolution, Science 287 (2000) 1615-1622.

45. A. Di Cerbo, A. Biason-Lauber, M. Savino, M.R. Piemontese, A. Di Giorgio, M. Perona, A. Savoia, Combined 17alpha-Hydroxylase/17,20-lyase deficiency caused by Phe93Cys mutation in the CYP17 gene, J Clin Endocrinol Metab 87 (2002) 898-905.

46. T. Omura, A. Ito, Biosynthesis and intracellular sorting of mitochondrial forms of cytochrome P450, Methods Enzymol 206 (1991) 75-81.

47. P.F. Churchill, Т. Kimura, Topological studies of cytochromes P-450scc and P-45011 beta in bovine adrenocortical inner mitochondrial membranes. Effects of controlled tryptic digestion, J Biol Chem 254 (1979) 10443-10448.

48. J.J. Huang, Т. Kimura, Studies on adrenal steroid hydroxylases. Oxidation-reduction properties of adrenal iron-sulfur protein (adrenodoxin), Biochemistry 12 (1973) 406-409.

49. W.J. Ou, A. Ito, K. Morohashi, Y. Fujii-Kuriyama, T. Omura, Processing-independent in vitro translocation of cytochrome P-450(SCC) precursor across mitochondrial membranes, J Biochem 100 (1986) 1287-1296.

50. H. Blum, J.S. Leigh, J.C. Salerno, T. Ohnishi, The orientation of bovine adrenal cortex cytochrome P-450 in submitochondrial particle multilayers, Arch Biochem Biophys 187(1978) 153-157.

51. H. Kamin, C. Batie, J.D. Lambeth, J. Lancaster, L. Graham, J.C. Salerno, Paramagnetic probes of multicomponent electron-transfer systems, Biochem Soc Trans 13 (1985)615-618.

52. S.A. Usanov, A.A. Chernogolov, V.L. Chashchin. Is cytochrome P-450scc a transmembrane protein?, FEBS Lett 275 (1990) 33-35.

53. M.J. Headlam, M.C. Wilce, R.C. Tuckey, The F-G loop region of cytochrome P450scc (CYP11A1) interacts with the phospholipid membrane, Biochim Biophys Acta 1617 (2003) 96-108.

54. D. Schwarz, V. Kruger, A.A. Chernogolov, S.A. Usanov, A. Stier, Rotation of cytochrome P450SCC (CYP11A1) in proteoliposomes studied by delayed fluorescence depolarization, Biochem Biophys Res Commun 195 (1993) 889-896.

55. D. Schwarz, W. Richter, V. Kruger, A. Chernogolov, S. Usanov, A. Stier, Direct visualization of a cardiolipin-dependent cytochrome P450scc-induced vesicle aggregation, J Struct Biol 113 (1994) 207-215.

56. R.C. Tuckey, H. Kamin, Kinetics of the incorporation of adrenal cytochrome P-450scc into phosphatidylcholine vesicles, J Biol Chem 257 (1982) 2887-2893.

57. D.W. Seybert, J.R. Lancaster, Jr., J.D. Lambeth, H. Kamin, Participation of the membrane in the side chain cleavage of cholesterol. Reconstitution of cytochrome P-450scc into phospholipid vesicles, J Biol Chem 254 (1979) 12088-12098.

58. J.D. Lambeth, D.W. Seybert, H. Kamin, Phospholipid vesicle-reconstituted cytochrome P-450SCC. Mutually facilitated binding of cholesterol and adrenodoxin, J Biol Chem 255 (1980) 138-143.

59. D. Schwarz, P. Kisselev, W. Pfeil, S. Pisch, U. Bornscheuer, R.D. Schmid, Evidence that nonbilayer phase propensity of the membrane is important for the side chain cleavage activity of cytochrome P450SCC, Biochemistry 36 (1997) 14262-14270.

60. К. Kusano, М. Sakaguchi, N. Kagavva, M.R. Waterman, T. Omura, Microsomal p450s use specific proline-rich sequences for efficient folding, but not for maintenance of the folded structure, J Biochem 129 (2001) 259-269.

61. K. Kusano, N. Kagawa, M. Sakaguchi, T. Omura, M.R. Waterman, Importance of a proline-rich sequence in the amino-terminal region for correct folding of mitochondrial and soluble microbial p450s, J Biochem 129 (2001) 271-277.

62. K.H. Storbeck, P. Swart, A.C. Swart, Cytochrome P450 side-chain cleavage: insights gained from homology modeling, Mol Cell Endocrinol 265-266 (2007) 65-70.

63. I.A. Pikuleva, Putative F-G loop is involved in association with the membrane in P450scc (P450 11A1), Mol Cell Endocrinol 215 (2004) 161-164.

64. V. Sivozhelezov, C. Nicolini, Homology modeling of cytochrome P450scc and the mutations for optimal amperometric sensor, J Theor Biol 234 (2005) 479-485.

65. K.H. Storbeck, P. Swart, S. Graham, A.C. Swart, The influence of the amino acid substitution I98K on the catalytic activity of baboon cytochrome P450 side-chain cleavage (CYP11A1), Endocr Res 30 (2004) 761-767.

66. S.E. Graham, J.A. Peterson, How similar are P450s and what can their differences teach us?, Arch Biochem Biophys 369 (1999) 24-29.

67. P.A. Williams, J. Cosme, V. Sridhar, E.F. Johnson, D.E. McRee, Mammalian microsomal cytochrome P450 mono oxygenase: structural adaptations for membrane binding and functional diversity, Mol Cell 5 (2000) 121-131.

68. N.V. Strushkevich, T.N. Azeva, G.I. Lepesheva, S.A. Usanov, Role of positively charged residues lys267, lys270, and arg411 of cytochrome p450scc (CYP11A1) in interaction with adrenodoxin, Biochemistry (Mosc) 70 (2005) 664-671.

69. M. Tsujita, Y. Ichikawa, Substrate-binding region of cytochrome P-450SCC (P-450 XIA1). Identification and primary structure of the cholesterol binding region in cytochrome P-450SCC, Biochim Biophys Acta 1161 (1993) 124-130.

70. D.F. Lewis, P. Lee-Robichaud, Molecular modelling of steroidogenic cytochromes P450 from families CYP11, CYP17, CYP19 and CYP21 based on the CYP102 crystal structure, J Steroid Biochem Mol Biol 66 (1998) 217-233.

71. S. Graham-Lorence, J.A. Peterson, P450s: structural similarities and functional differences, FASEB J 10 (1996) 206-214.

72. E.F. Johnson, The 2002 Bernard B. Brodie Award lecture: deciphering substrate recognition by drug-metabolizing cytochromes P450, Drug Metab Dispos 31 (2003) 1532-1540.

73. S.T. Woods, J. Sadleir, T. Downs, T. Triantopoulos, M.J. Headlam, R.C. Tuckey, Expression of catalytically active human cytochrome p450scc in Escherichia coli and mutagenesis of isoleucine-462, Arch Biochem Biophys 353 (1998) 109-115.

74. S. Nagano, T.L. Poulos, Crystallographic study on the dioxygen complex of wild-type and mutant cytochrome P450cam. Implications for the dioxygen activation mechanism, J Biol Chem 280 (2005) 31659-31663.

75. M.F. Matocha, M.R. Waterman, Discriminator}' processing of the precursor forms of cytochrome P-450scc and adrenodoxin by adrenocortical and heart mitochondria, J Biol Chem 259 (1984) 8672-8678.

76. V.N. Luzikov, L.A. Novikova, J. Whelan, M. Hugosson, E. Glaser, Import of the mammalian cytochrome P450 (see) precursor into plant mitochondria, Biochem Biophys Res Commun 199 (1994) 33-36.

77. A.S. Savelev, L.A. Novikova, V.L. Drutsa, L.V. Isaeva, A.A. Chernogolov, S.A. Usanov, V.N. Luzikov, Synthesis and some aspects of topogenesis of bovine cytochrome P450scc in yeast, Biochemistry (Mosc) 62 (1997) 779-786.

78. E.E. Rojo, R.A. Stuart, W. Neupert, Conservative sorting of FO-ATPase subunit 9: export from matrix requires delta pH across inner membrane and matrix ATP. EMBO J 14 (1995) 3445-3451.

79. I.E. Kovaleva, L.A. Novikova, P.A. Nazarov, S.I. Grivennikov, V.N. Luzikov, Effects of various N-terminal addressing signals on sorting and folding of mammalian CYP11A1 in yeast mitochondria, Eur J Biochem 270 (2003) 222229.

80. G. Cauet, D. Balbuena, T. Achstetter, B. Dumas, CYP11A1 stimulates the hydroxylase activity of CYP11B1 in mitochondria of recombinant yeast in vivo and in vitro, Eur J Biochem 268 (2001) 4054-4062.

81. N.R. Orme-Johnson, Distinctive properties of adrenal cortex mitochondria, Biochim Biophys Acta 1020 (1990) 213-231.

82. E. Amann. B. Ochs, K.J. Abel, Tightly regulated tac promoter vectors useful for the expression of unfused and fused proteins in Escherichia coli, Gene 69 (1988) 301-315.

83. C. Cullin, D. Pompon, Synthesis of functional mouse cytochromes P-450 PI and chimeric P-450 P3-1 in the yeast Saccharomyces cerevisiae, Gene 65 (1988) 203217.

84. Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэмбрук, Молекулярное клонирование, Мир. Москва 1984.

85. Д. Гловер, Клонирование ДНК, Мир, Москва 1988.

86. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. , Наука, Новосибирск 1990.

87. Н.С. Birnboim, J. Doly, A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA, Nucleic Acids Res 7 (1979) 1513-1523.

88. A. Wada, P.A. Mathew, H.J. Barnes, D. Sanders, R.W. Estabrook, M.R. Waterman, Expression of functional bovine cholesterol side chain cleavagecytochrome P450 (P450scc) in Escherichia coli, Arch Biochem Biophys 290 (1991)376-380.

89. P.A. Nazarov, V.L. Drutsa, W.L. Miller, V.M. Shkumatov, V.N. Luzikov, L.A. Novikova, Formation and functioning of fused cholesterol side-chain cleavage enzymes, DNA Cell Biol 22 (2003) 243-252.

90. A.A. Vinogradova, V.N. Luzikov, L.A. Novikova, Comparative study of topogenesis of cytochrome P450scc (CYP11A1) and its hybrids with adrenodoxin expressed in Escherichia coli cells, Biochemistry (Mosc) 72 (2007) 208-214.

91. M. Akiyoshi-Shibata, T. Sakaki, Y. Yabusaki, H. Murakami, H. Ohkawa, Expression of bovine adrenodoxin and NADPH-adrenodoxin reductase cDNAs in Saccharomyces cerevisiae, DNA Cell Biol 10 (1991) 613-621.

92. G. Daum, P.C. Bohni, G. Schatz, Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome с peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria, J Biol Chem 257 (1982) 13028-13033.

93. O.H. Lowry, N.T. Rosebrough, A.L. Farr, R.J. Randall, Protein measurement with the Folin phenol reagent, J Biol Chem 193 (1951) 265-275.

94. U.K. Laemmli, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227 (1970) 680-685.

95. H. Towbin, T. Staehclin, J. Gordon, Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications, Proc Natl Acad Sci U S A 76 (1979) 4350-4354.

96. A.N. Minenko, V.N. Luzikov, I.E. Kovaleva, Use of the Addressing Sequence of Yeast D-Lactate Dehydrogenase for Insertion of CYPllAlp into the Inner Membrane of Yeast Mitochondria, Biochemistry (Mosc) 71 (2006) 32-38.

97. H. Folsch, B. Guiard, W. Neupert, R.A. Stuart, Internal targeting signal of the BCS1 protein: a novel mechanism of import into mitochondria, EMBO J 15 (1996) 479-487.

98. T. Kumamoto, A. Ito, T. Omura, Characterization of a mitochondrial matrix protease catalyzing the processing of adrenodoxin precursor, J Biochem 100 (1986) 247-254.

99. N.J. Hoogenraad, L.A. Ward, M.T. Ryan, Import and assembly of proteins into mitochondria of mammalian cells, Biochim Biophys Acta 1592 (2002) 97-105.

100. M.H. Barros, F.G. Nobrega, YAH1 of Saccharomyces cerevisiae: a new essential gene that codes for a protein homologous to human adrenodoxin, Gene 233 (1999) 197-203.

101. T. Lacour, T. Achstetter, B. Dumas, Characterization of recombinant adrenodoxin reductase homologue (Arhlp) from yeast. Implication in in vitro cytochrome p4501 lbeta monooxygenase system, J Biol Chem 273 (1998) 23984-23992.

102. С. Duport, В. Schoepp, Е. Chatelain, R. Spagnoli, В. Dumas, D. Pompon, Critical role of the plasma membrane for expression of mammalian mitochondrial side chain cleavage activity in yeast, Eur J Biochem 270 (2003) 1502-1514.

103. S.A. Usanov, A.A. Chernogolov, V.L. Chashchin, Immunochemical study of cholesterol-hydroxylating cytochrome P-450. Topology of the peptide chain of the heme protein in the phospholipid membrane., Biokhimiia 54 (1989) 916-925.

104. H.A. Dailey, Terminal steps of haem biosynthesis, Biochem Soc Trans 30 (2002) 590-595.