Особенности внутриклеточного транспорта и биологическая активность рицина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Хапчаев, Шамиль Юсуфович

• Хапчаев, Шамиль Юсуфович
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Хапчаев, Шамиль Юсуфович

1 Список сокращений.

2 Введение.

3 Обзор литературы.

3.1 Ингибиторы синтеза белка.

3.1.1 Высокомолекулярные ингибиторы синтеза белка.

3.1.1.1 Рицин.

3.1.1.2 Вискумин.

3.1.1.3 Внутриклеточный транспорт белковых токсинов.

3.1.1.4 Транслокация токсинов.

3.1.2 Низкомолекулярные ингибиторы синтеза белка.

3.1.2.1 Циклогексимид.

3.1.2.2 Различные пути гибели клетки.

3.1.3 Действие РИБ2, отличное от ингибирования синтеза белка.

4 Материалы и методы.

4.1 Материалы.

4.2 Клеточные линии.

4.3 Очистка моноклональных антител.

4.4 Проведение электрофореза.

4.5 Системы ТИФА.

4.5.1 Твердофазный иммуноферментный анализ для определения реакции антител с биотинилированными антигенами.

4.5.2 Сэндвич-ТИФА для выявления свободной каталитической субъединицы рицина.

4.5.3 Определение концентрации И.60 и И.ТА в лизатах клеток, предобработанных Я60.

4.6 Биотинилирование белков.

4.7 Получение конъюгатов белков с флуорохромами.

4.8 Оценка цитотоксических свойств ИСБ.

4.8.1 МТТ-тест.

4.8.2 БЯВ-тест.

4.9 Приготовление 4,5% параформальдегида.

4.10 Анализ митогенной активности ИСБ.

4.11 Инкапсуляция вискумина в полилактидную матрицу.

4.12 Исследование кинетики выхода вискумина из полилактидной матрицы.

4.13 Анализ количества вискумина, высвободившегося при деградации полилактида

4.14 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.

5 Результаты и обсуждение.

5.1 Выявление свободной ЯТА в клетках, предобработанных рицином.

5.1.1 Тест-система для выявления свободной КТА в клетке.

5.1.2 Определение свободной каталитической субъедипицы рицина в клетках, предобработанных Я60.

5.1.3 Накопление свободной ЯТА в клетках, предобработанных рицином.

5.1.4 Характеризация компартмента, содержащего свободную ЯТА.

5.1.4.1 Совместное распределение ЯТА с рицином.

5.1.4.2 Совместное распределение ИТ А с эндоплазматическим ретикулумом

5.1.4.3 Совместное распределение с аппаратом Гольджи.

5.1.5 Объём компартмента, содержащего рицин.

5.2 Влияния РИБ, непосредственно не связанные с ингибированием синтеза белка

5.2.1 Митогенное действие рибосом-инактивирующих белков 2 типа.

Подбор митостатика и его концентраций.

5.2.1.1 Влияние времени инкубации с митостатиком на митотический и апоптогический индексы.

5.2.1.2 Митогенная активность ингибиторов синтеза белка.

5.3 Апоптотические изменения под действием токсинов.

5.3.1 Выявление экспозиции фосфатидилсерина во внешнем слое плазматической мембраны с помощью Аппехт V.

5.3.2 Анализ фрагментации ДНК.

5.3.2.1 Анализ деградации ДНК с помощью электрофоретического разделения в агарозном геле.

5.3.2.2 Количественный анализ фрагментации ДНК методом проточной цитофлуориметрии.

5.3.3 Анализ фрагментации ядер.

5.4 Инкапсуляция вискумина в полилактидную матрицу.

6 Выводы.

7 Благодарности.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Особенности внутриклеточного транспорта и биологическая активность рицина»

Многие процессы в клетке определяются взаимодействиями различных молекул как внутри неё, так и на поверхности. На клеточной мембране имеется большое количество различных рецепторов. Лектины специфически взаимодействуют с гликопротеинами мембраны и могут активировать рецепторы клеточной поверхности.Результатом такой активации, в частности, может быть запуск как пролиферации, так и гибель клетки.Известно, что рибосом-инактивирующие белки 2 типа (РИБ2) состоят из двух субъединиц, одна из которых обладает лектиновоГ! активностью и играет ключевую роль в связывании токсина с клеткой. Наиболее полно изучены представители РИБ2 рицин (R60) и вискумин (МЫ). Оба эти токсина имеют сходную структуру, но различаются по ряду характеристик, в частности, по строению галактозосвязывающих центров. Имеющиеся различия приводят к неодинаковому внутриклеточному пути транспорта этих белков [Moisenovich М. et al., 2002]. Обязательным общим этапом интернализации обоих токсинов является попадание в ранний эндосомальный компартмент, дальнейшая транспортировка из которого зависит от того, с каким рецептором произошло связывание. Из ранних эндосом большая часть токсина возвращается к клеточной поверхности, откуда снова попадает в клетку. Таким образом, происходит постоянное движение токсина у клеточной мембраны [Moisenovich М. et al., 2004].Минорная часть интернализовавшихся молекул РИБ2 через аппарат Гольджи (АГ) транспортируется в эидоплазматический ретикулум (ЭР) и далее попадает в цитозоль, где инактивирует рибосомы [Wesche J. el al., 1999]. В пользу такой теории свидетельствуют следующие данные: • введение в RTA сигнальной последовательности KDEL, адресующей белки в ЭР, усиливает цитотоксичность химерной молекулы fZhan J. et al., 1998]; • блокировка везикулярного транспорта с использованием брефелдина А приводит к приобретению клетками устойчивости к рицину [Bilge A. et al., 1995]. • мутантные клетки, в которых заблокирован ретроградный транспорт, также не чувствительны к рицину [Cosson P. and Letourneur P., 1994; Simpson J.С. et al., 1995a].При этом клетки, мутантные по ГТФазам, и клетки, обработанные блокатором везикулярного транспорта, остаются чувствительными к дифтерийному токсину, способному создавать поры в мембранах и транспортироваться в щпозоль, минуя ЭР [Simpson J.C. ct al., 1996].Устойчивость гибридом, продуцирующих антитела против эпитопов RTA. экранированных в нативном токсине, показывает необходимость разделения субъединиц токсинов для транслокации в цитозоль [Tonevitsky A.G. et al., 1995; Малюченко Н.В. и др., 2003; Бенедиктова О.Л. и др., 2005]. Считается, что высвободившаяся R.TA транспортирутся из ЭР, используя существующий путь экспорта дефектных эндогенных белков [Rapak A. et al., 1997].Все вышеизложенное не исключает возможности транслокации свободной RTA на более ранних этапах внутриклеточного транспорта в количествах, достаточных для остановки синтеза белка. Выход А-цени из ранних эндосом может быть обусловлен несколькими причинами. Так, высокий уровень содержания ненасыщенных лип идо в и малое количество сфинголипидов и холестерола приводит к тому, что мембраны эндосомального компартмента оказываются чрезвычайно гибкими и подвижными [Kobayashi Т. et al., 1998; Hussain М.М., 2000]. Повышенная лабильность мембран и их постоянный рециклинг у клеточной поверхности повышает вероятность трансмембранного переноса токсина. Увеличение эффекта возможно также за счет повышенного содержания в данных мембранах трнглицеридов, к которым обнаружена липолитическая активность рицина [Lombard S. ct al., 2001]. Концентрация рицина в ранних эпдосомах, по нашим оценкам, составляет до 10" М. Это может привести к значительному нарушению целостности мембран, что, в свою очередь, возможно, инициирует транслокацию А-цепи в цитоплазму.Таким образом, выявление компартментов, в которых присутствует свободная RTA, может внести существенные изменения в современные представления о транспорт токсинов и может быть использовано при синтезе иммунотоксинов на основе РИБ2.Изучение путей транспорта РИБ2 в клетке привело к открытию ряда их особенностей, которые непосредственно не связаны с ингибированием синтеза белка.Такие свойства как митогенная или липолитическая активность присущи высокомолекулярному токсину и не наблюдаются при воздействии низкомолекулярных ингибиторов синтеза белка [Morlon-Guyot J. et al., 2003]. Данные свойства могут объяснить природу более высокой токсичности РИБ2 по сравнению с низкомолекулярпыми ингибиторами.Целью работы было исследование роли эндосомального компартмепта в транспорте РИБ2 па примере рицина и вискумина, а также возможности восстановления межсубъединичной дисульфидной связи в данном компартменте.Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Разработать тест-систему для выявления свободной R.TA внутри клетки.Используя эту тест-систему, изучить динамику накопления R.TA в клетке.Определить ассоциацию А-цепи с клеточными органеллами.2. Определить концентрацию токсина в эндосомальном компартменте и выявить в нем наличие молекул свободной RTA.3. Изучить действия РИБ, непосредственно не связанные с остановкой синтеза белка. Подобрать методы обнаружения митотической активности клеток и повреждений эндосомных мембран под действием РИБ.

4. Сопоставить динамику накопления токсинов в клетке с этапами её интоксикации.Научная новизна работы. На основе полученных моноклональиых антител создана уникальная тест-система для определения свободной R.TA внутри клетки.Установлено, что период, через который в клетке выявляется свободная RTA, согласуется со временем остановки синтеза белка в предобработанных цельным токсином клетках и составляет =4 часа. Показан широкий спектр действия РИБ2 на клетку-мишень: снижение её устойчивости к физическим воздействиям, таким как центрифугирование и изменение рН среды; разрушение актиповых филаментов; запуск апоптоза.Практическая значимость. Исследования механизмов взаимодействия рицина с клеткой и, особенно, механизмов транслокации токсина в цитозоль позволят повысить эффективность фармакологических препаратов, получаемых на основе токсинов; существенно снизить или полностью исключить побочные эффекты, возникающие при их применении; значительно расширить область их применения в клинической практике, в том числе за счёт нанотехнологий. Разработанный метод инкапсуляции РИБ2 в полилактидпую матрицу может быть использован для создания лекарственных препаратов пролонгированного цитотоксического действия.3 Обзор литературы 3.1 Ингибиторы синтеза белка 3.1.1 Высокомолекулярные ингибиторы синтеза белка Многие растения синтезируют и накапливают в семенах, зелёных частях и коре токсические белки, относящиеся к семейству белков, ннактивнрующнх рибосомы (РИБ). Биологические эффекты этих белков известны с давних времен вследствие высокой токсичности семян клещевины (Ricimis communis) и растения Abrusprecalorius, листьев омелы {Viscum album) и коры бузины (Samhucus лул). а также активности таких растений как Trichosanthes kirillowii и Momordica charunla, приводящей к абортам у млекопитающих. В 1888 году X. Стиллмарк идентифицировал токсическую основу семян клещевины - белок, названный рицином. С тех пор найдено и охарактеризовано множество белков, структурно и функционально сходных с рицином.Термин «рибосом-нпактивирующий белок» (Ribosome Inactivating Protein) введён до того, как были изучены структура и ферментативные свойства РИБ для обозначения белков, которые инактивируют рибосомы животных. После выяснения способа действия РИБ на рибосомы, это название применяется исключительно для Nгликозидаз.На основании строения рибосом-инактивиругащие белки могут быть разделены на три группы - РИБ1-3 [Peumans W.J. et al., 2001].1. РИБ первого типа (РИБ1) состоят из одной субъединицы с молекулярной массой 25-30 кДа, проявляющей N-гликозидазную активность [Barbicri L. el al., 1993].РИБ1 были обнаружены у множества однодольных и двудольных растений.Сейчас известно около 140 видов различных РИБ1 [Girbes Т. et al., 2004].Наиболее известные РИБ1 - бриодин из Bryonia dioica, гелонин из Gelonium multiflorum, момордин и бета-моморхарин из растения Momordica charantia и сапорин из Saponaria officinalis.2. РИБ второго типа (РИБ2) представляют собой гетеродимерные гликопротеины с молекулярной массой около 60 кДа, состоящие из двух субъединиц, соединённых дисульфидной связью. А-субъединица является ферментом N-гликозидазой, а Всубъединица проявляет лектиновые свойства и взаимодействует с углеводными остатками на поверхности клеток-мишеней. За счёт углеводсвязывающей субъединицы РИБ2, в отличие от РИБ1, цитотоксичны [Stirpc F., 2004]. Найдено около 40 видов РИБ2, из них наиболее известны РИБ2 - рицин из семян клещевины Ricinus communis, абрин из семян растения Abnts precatorius, токсические лектины МЫ (вискумин), MLII и MLIII из зелёных частей омелы Viscum album [Olsnes S. et al., 1974; Franz H. et al., 1981; Stirpe F. et al.. 1985; Girbes T. et al., 1993; Van Damme E.J. et al., 1996; Kaku H. et al., 1996; Van Damme E.J. et al., 1997]. Рентгеноструктурный анализ (PCA) рицина, абрина, вискумина и агглютинина рицина выявил структурное сходство этих белков [Rutenber Е. and Robertus J.D., 1991; Tahirov Т.Н. el al., 1995; Sweeney E.C. et al., 1998; Krauspenhaar R. et al., 1999]. Для некоторых растений, в частности, двух видов из рода Sambucus. Cinnamomum camphora и Iris hollcmdica отмечено одновременное присутствие РИБ1 и РИБ2 [Girbes Т. et al., 2004].3. Определение РИБЗ ввёл в 2001 году Пеуманс с соавторами [Peumans W.J. et al., 2001] для белков с молекулярной массой 60 к Да, состоящих из N-концевого гликозидазного домена, сходного с А-субъединицей РИБ2, и ковалентно связанного с ним С-концевым доменом с неизвестной функцией. РИБЗ найдены только у двух видов зерновых растений: кукурузы Zea mays и ячменя Hordcum vulgare [Walsh Т.A. et al., 1991].4. Циторес с соавторами предложил ввести определение РИБ четвёртого типа для тетрамерных токсинов, состоящих из двух типов полипептидных цепей: двух каталитически активных А-субъединиц и двух углеводсвязывающих Всубъединиц [Chores L. et al., 1993]. По строению молекула РИБ4 напоминает сдвоенную молекулу РИБ2. Данные белки были обнаружены в растениях Abrusprecatorius, Ricinus communis, Viscum album и Momordica charanta и названы агглютининами за способность агглютинировать эритроциты млекопитающих [Stirpe F. et al., 1992]. Однако, до сих пор РИБ4 относят то к отдельной группе, то вносят в состав РИБ2.3.1.1.1 Рицин Рицин (R60) входит в группу рибосом-инактивирующих белков второго типа (РИБ2). Это гетеродимерный белок, состоящий из двух субъедипиц (каталитической A, RTA и лектиновой - В, RTB), соединённых одной дисульфидпой связью (см.1 1 Рисунок 1). Токсичность данного белка обусловлена N-гликозидазной активностью Лсубъединиц по отношению к 28S рибосомальной РНК эукариот. приводящей к необратимой потере рибосомой сродства к фактору элонгации II. Ото вызывает остановку синтеза белка и гибель эукариотической клетки. В-субъсдиницы связываются с гликозилированными рецепторами на клеточной поверхности, что необходимо для эндоцитоза токсина. Ондоцитированные белки транспортируются от поверхности клетки в цитоплазму к их рибосомальной мишени.Рисунок 1, Структура рицина На рисунке видно 3 домена. Синий и фиолетовый домены входят в состав связывающей, а коричневый - каталитической субъединиц рицина. Зелёные стрелки - ос-спирали, жёлтые стрелки - R-слои. Модель построена с помощью программного обеспечения Cn3D v.4.1 на основе структуры молекулы рицина из протеомной базы данных национального центра биотехнологической информации [NCBI Entrez's Structure Database - 25 18].Структура рицина изучена подробнее структур других РИБ2. Принимая во внимание гомологию аминокислотной последовательности РИБ2. данные рентгеноструктурного анализа рицина часто используются для определения структуры других РИБ2 методом молекулярного замещения.3.1.1.1.1 Структура связывающей субъединицы рицина Связывающая В-субъединица рицина (RTB) представляет собой гликопротеин с молекулярной массой около 31 кДа и состоит из 262 аминокислотных остатков, которые образуют два отдельно свёрнутых домена сферической формы диаметром 30 А (см. Рисунок 2). Каждый из доменов состоит из четырех субдоменов: X, а, В и у [Montfort W. et al., 1987; Bai Y. et al., 2009J. Субдомены a, p и у гомологичны (20%) между собой и имеют сходную конфигурацию. Они содержат около 40 аминокислотных остатков и образуют структуру «трилистника». Субдомены X образованы первыми 16 аминокислотными остатками каждого домена (1-16 и 135-150 соответственно). Структура связывающей субъединицы рицина стабилизирована сетью гидрофобных взаимодействий между азотистыми основаниями субдоменов, а также четырьмя дисульфидными связями, образованными Cys20-Cys39 и Cysl 51 -Cys 164 (внутри a-субдоменов) и Cys63-Cys80 и Cysl90-Cys207 внутри (Ь-субдоменов. Ещё одна, пятая, дисульфидная связь в молекуле рицина образована Cys4 В-субъединицы и Cys259 А-субъединицы. В каждом домене В-субъединицы имеется галактозосвязывающий участок. Определены критически важные для взаимодействия с галактозой аминокислоты в двух сайтах связывания сахара [Wales R. et al., 1991].Между доменами В-субъединицы рицина наблюдается выраженная гомология (32%) аминокислотных остатков [Villafranca J.E. and Robertus J.D., 1981].Рисунок 2. Третичная структура RTB RTB состоит из двух гомологичных на 32% доменов. В их состав входят только Р-слои [NCB1 Entrez's Structure Database - 2518].В-субъединица R60 содержит два хорошо охарактеризованных аналогично устроенных углеводсвязывающих центра. Первый локализован в субдомене 1а, второй - в субдомене 2у [Rutenber Е. et al.. 1991]. Имеются также свидетельства существования третьего, неидентичного двум первым, углеводсвязывающего центра, расположенного в 1 (3 субдомене [Frankel A. et al., 1996b; Steeves R.M. ct al.. 1 999].Первый и второй галактозосвязывающие центры представляют собой неглубокие карманы на поверхности белка; дно кармана образовано консервативным трипептидом, включающим 24-26 а.о. в первом сайте и 236-238 а.о. - во втором. В верхней части кармана расположена ароматическая боковая группа Тгр37 (в первом сайте) и Тгр248 (во втором). Положение молекулы галактозы фиксировано сетью водородных связей с боковыми группами нескольких полярных аминокислотных остатков, локализованных в углеводсвязывающих сайтах, и гидрофобным взаимодействием с боковой группой соответствующего аминокислотного остатка Тгр.Консервативные а.о. Asp22 в первом сайте и а.о. Asp234 во втором являются ключевыми для первичного взаимодействия с сахарами. Атом OD1 этих остатков образует водородную связь с СЗ-гидроксилом связываемого сахара. При этом положение боковой группы Asp фиксируется водородной связью. Атом OD2 - с NE2 консервативного амида GIn47 в первом углеводсвязывающем сайте и Gln256 - во втором. Каждый СЗ-гидроксил галактозы также формирует сильные водородные связи с атомами ND2 Asp46 в первом сайте и Asp255 - во втором. В сайте 2 аналогом Gln35 является Пе246 и образует гидрофобный контакт с атомом С6 сахара. Сеть водородных связей в первом углеводсвязывающем сайте более сложная, чем в сайте 2, в котором NE2 Gln35 образует раздвоенную водородную связь с С4- и Сб-гидроксилами.Вторичная структура лектиновой субъединицы токсина характеризуется отсутствием ос-спиральных участков и наличием (3-складок и неупорядоченных цепей.Расстояние между двумя галактозосвязывающими участками рицина (70 А) не позволяет одной молекуле рицина одновременно взаимодействовать с двумя концевыми остатками галактозы одного олигосахарида.Согласно данным сайт-специфического мутагенеза, рекомбинантные RTB, несущие замены в субдоменах 1а и 2у, сохраняли лектиповую активность. В ю время как В-цепь рицина, которая имела замены в субдомснах 1а, 1)3, 2у по аминокислотам, участвующим в стекинг-взаимодействиях, Trp37—>Ser, Tyr248—>His, Tyr78—>His, теряла способность связываться с галактозидами, находящимися как в составе асиалофетуииа, так и на поверхности клетки [Frankel A. et al., 1996а; Frankel A. et al., 1996b]. При изучении биологической активности in vitro и in vivo гетеродимеров, содержащих мутантпую RTB, показано, что при вышеуказанных заменах происходит значительное снижение токсичности химерных белков. Величина LD.so в экспериментах на клеточной линии лейкемии человека HUT102 составила 5*10" М, в экспериментах in vivo LD50 составила 10 MKg/мышь. Тогда как эти показатели для рицина составили 4*10" "М и 75 иг/мышь соответственно [Fu Т. et al., 1996]. Однако, в субдомене 1В отсутствуют остатки, эквивалентные Asp22 и Asp46 ( la) Asp234 и Asp255 (2у), которые образуют водородные связи с гидроксильными группами при атомах СЗ и С4 галактозы. Возможно, возникновение комплекса с галактозой обусловлено полярными взаимодействиями боковых радикалов аминокислот с ОН-группами при атомах С2 и С4, и, таким образом, нельзя ожидать, что аминокислоты, занимающие аналогичное положение в пространстве, будут консервативны как для сайта 1В, так и для хорошо изученных сайтов la и 2у.3.1.1.1.1.1 Связывание токсинов с клеткой Любая клетка является потенциальной мишенью для растительных РИБ2, так как имеет на поверхности концевые остатки галактозы, поэтому эти белки действуют неизбирательно. Количество рецепторов для разных токсинов на поверхности клеток отличается. Например, на мембране клеток Не1а имеется 3*107 рецепторов для рицина и абрина и только 2* 10s - для вискумина [Тоневицкий А.Г. et al., 1995]. При изучении взаимодействия рицина с клетками-мишенями выяснилось, что на поверхности клеток различных популяций существуют как низкоаффинные, так и высокоаффипные рецепторы [Leonard J.E. et al., 1988; Decastel M. et al., 1989]. Кроме того, на эндотелиальных клетках печени и макрофагах показано, что рицин связывается не только с рецепторами, содержащими концевые остатки галактозы, но и с поверхностными маннозными рецепторами через остатки маннозы олигосахаридов, входящих в состав рицина. Это обеспечивает альтернативный путь поступления токсина в клетку [Simmons В.М. et al., 1986; Magnusson S. et al., 1991].Рицин связывается с концевой галактозой поверхностных гликопротеинов и/или гликолипидов клеток. Токсин связывает простые сахара, такие как галактоза и лактоза.Бензигер и Фиете в 1979 году показали, что константа связывания рицина с концевой галактозой в составе олигосахаридов в 1000 раз превышает константу связывания с отдельной молекулой галактозы или лактозы [Baenziger J.U. and Fietc D., 1979]. Рицин не взаимодействует с олигосахаридами, содержащими концевой Nацетилгалактозамин. Сиаловая кислота, присоединенная к галактозе в положении а2—>6, в 2-4 раза снижает константу связывания рицина с Gal. Наибольшая константа связывания рицина с сахаром (14,4* 106 М"1) наблюдается при взаимодействии с олнгосахаридом, содержащим три остатка галактозы.Галактозидсвязывающую активность рицина изучали методом рентгеноструктурного анализа, используя разветвлённый олигосахарид с двумя концевыми остатками галактозы [Rutenber Е. and Robertus J.D., 1991]. Расстояние между двумя галатзосвязывагощими участками рицина (70 А) не позволяет одной молекуле рицина одновременно связывать два концевых остатка галактозы одного олигосахарида. Однако концевые остатки Gal олигосахарида связывают две молекулы рицина. Таким образом, разветвленные рецепторы могут взаимодействовать с разными молекулами рицина без стерических затруднений.Большинство галактозо-содержащих олигосахаридов клеточной поверхности имеют структуру, очень схожую с той, которой обладают углеводные цени фетуина.Олигосахариды белка асиалофетуина взаимодействуют с рицином, причем константа 7 1 аффинности превосходит 10 М" . [Steeves R.M. et al., 1999] предполагают, что для лиганда подобной структуры характерны многоточечные взаимодействия с поверхностью всего углеводсвязывающего субдомепа, а не только с самим «карманом». Возможно, ото и объясняет 1000-крагное увеличение константы аффинности при связывании олигосахаридов.Было показано, что рицин способен связывать N-ацетилгалактозамин, но чолько в сайте 2. Рутенберг с соавторами отмечали, что N-ацетильная группа галатозамина и остаток Asp44 могли бы создать стерические напряжения в сайте 1 [Rutenber Е. and Robertus J.D., 1991], тогда как в сайте 2 N-ацетильная группа экспонирована в водную фазу [Baenziger J.U. and Fiete D., 1979].3.1.1.1.2 Структура каталитической субъединицы рицина Каталитическая субъединица R60 представляет собой глобулярный гликопротеин с двумя сайтами гликозилирования. Существуют две, в разной степени гликозилированные, формы Л-субъедипиц рицина, которые выявляются с помощью SDS-PAGE-злектрофореза в виде двух полос, соответствующих примерно 29 кДа [Hegde R. and Podder S.K., 1998]. Структура RTA сформирована тремя доменами: первый включает 1-1 17, второй - 1 18-210 и третий - 21 1-267 аминокислотные остатки.Первый домен содержит пять (3-складчатых участков и две а-спнрали. второй - только 5 гх-спиралей, а третий - одну а-спираль, осуществляя взаимодействие с двумя другими доменами и с В-субъединицей (Рисунок 3) [Rutenber Е. and Robertas J.D., 1991]. Каталитическая субъединица рицина не имеет внутренних дисульфидных связей и её третичная структура стабилизируется сетью полярных и гидрофобных взаимодействий [Bai Y. et al., 2009].А-субъединица R60, как и других РИБ2, это N-гликозидаза, субстратом которой являются рибосомальпые 28S РНК эукариот. Они осуществляют вьпцеплепие аденина. входящего в состав полностью консервативного тетрануклеотида GAGA, расположенного в петле или стеблевой части 28S РНК [Endo Y. et а!.. 1987; Gluck A. et al., 1994]. Распознавание А-субъединицей консервативного тетрапептида GAGA, повидимому, зависит от его коиформации в рибосоме. Так, для выщспления аденина из очищенной 28S рибосомальной РНК или 20-35-члснных синтетических олигонуклеотидов, включающих сайты депуринизации а-сарцина-рицина, требуются более высокие концентрации RTA, чем для депуринизации нативной рибосомы [Endo Y. et al., 1988]. Кроме того, несмотря на консервативность сайта депуринизации, чувствительность рибосом разного происхождения к RTA заметно различается: растительные намного устойчивее к RTA, чем рибосомы клеток млекопитающих и дрожжей, а рибосомы прокариот- полностью резистентны [Lord J.M. et al., 1991].Представление о механизме ферментативного катализа, осуществляемого Асубъединицей, основано на данных рентгеноструктурного анализа рицина и комплекса рекомбинантной А-субъединицы рицина с аналогами субстрата адепил-(3'-5')гуанозином и формицин монофосфатом, а также сведений о ферментативной активности мутантных форм А-субъединицы [Monzingo А.Г. and Robertus J.D., 1992].Данная модель построена по аналогии с детально охарактеризованным механизмом расщепления АМФ-нуклеозидазой связи между аденином и рибозой в АМФ. Рисунок 3. Структура каталитической субъединицы рицина Маленькие шарики — аминокислотные остатки, зелёные стрелки - сиспирали, жёлтые стрелки - р-слои. Модель построена с помощью программного обеспечения Cn3D v.4.1 на основе структуры молекулы рицина из протеомной базы данных национального центра биотехнологической информации [NCBI Entrez's Structure Database - 25 18].Согласно модели, предложенной в 1992 году, консервативные Glul77 и Argl80 непосредственно участвуют в депуринизации [Monzingo A.F. and Robertus J.D., 1992]. ArgI80 протонирует N3 атомом адснозина, образуя водородную связь, что облегчает разрыв гликозидиой связи N9-C1. Gki 177 поляризует молекулу воды, локализованную в активном центре. Затем происходит реакция нуклеофильного замещения: атом кислорода поляризованной воды атакует связь N9-C1 и замещает атом N9 адснозина, протон воды переходит к N9 атому аденозина.Результаты, полученные с помощью сайт-специфического мутагенеза RTA, свидетельствуют, что в случае замены Glu 177—>А1а роль Glul77 может выполнять Glu208, также локализованный в кармане активного центра, хотя такой мутант в 5 раз менее активен, чем белок дикого типа, а замена Glu208— >Asp не влияет на ферментативную активность R.TA. Двойной мутант Glu 177—>А1а Glu208— >Asp практически не активен [Frankel A. et al., 1990]. Участие положительно заряженной боковой группы Argl80 в ферментативном катализе показана на мутантной RTA, в которой Argl80 заменён на Lys или на His [Frankel A. et al., 1990]. Ферментативная активность мутанта Argl 80—>Lys была только в 4 раза ниже, а мутанта Argl 80—s-His - в 1000 раз ниже активности нативной RTA.Инвариантные ароматические аминокислотные остатки Туг80 и Туг 123 участвуют в связывании субстрата [Ready М.Р. et al., 1991]. В комплексе рекомбинантпой А-субъединицы рицина с адепш^З'-б^-гуанозином и формиципмонофосфатом нурпновое кольцо субстрата фиксируется между ароматическими кольцами Туг80 и Туг 123 с помощью стекинг-взаимодействия. При этом плоскость пуринового кольца практически параллельна ароматическому кольцу Туг80.Положение Туг80 в комплексе отличается от его положения в свободной Асубъединице поворотом, для которого необходим разрыв водородной связи с Glyl21.Замена инвариантных Туг80 и Туг123 на ароматический Phe снижала ферментативную активность RTA в 15 и в 7 раз соответственно. В то время как их замена на Ser снижала активность мутантов в 160 и 70 раз соответственно [Ready М.Р. et al., 1991].Инвариантный Туг21 принимает участие в формировании структуры активного центра, образуя водородную связь с атомом кислорода Mctl74. В данном сайте спираль Е образует изгиб, в результате чего ключевые для ферментативного катализа аминокислотные остатки G1 u177 и ArgI80 оказываются на поверхности кармана активного центра.Кроме описанных инвариантных аминокислотных остатков А-субъединицы РИБ2 содержат другие высококонсервативные аминокислотные остатки, например Asn78, Argl34, Glnl73, Glu208 и Asn209, функция которых пока не известна. Возможно, они также участвуют в формировании и стабилизации структуры активного центра или связывании каталитической субъединицы с субстратом.3.1.1.1.3 Межсубъсдиничные взаимодействия в молекуле рицина Каталитическая и лектиновая субъединицы рицина соединяются дисульфиднон связью, образуемой 259 в А-субъединицах и 4 в В-субъединицах остатками цистеина [Montfort W. et al., 1987; Weston S.A. et al., 1994]. Показано, что область контакта между А- и В-субъединицами рицина равна 1600 Л, что составляет примерно 14% от общей поверхности каждой субъединицы [Katzin B.J. et al., 1991]. А- и В-субъедипицы рицина, кроме ковалентной S-S-связи. удерживаются вместе сетью полярных, гидрофобных и стеккинг-взаимодействий боковых групп аминокислотных остатков в зоне контакта [Krauspenhaar R. et al., 1999].После разделения субъединиц экспонируются скрытые в нативном токсине гидрофобные участки субъединиц. Свободная RTA способна взаимодействовать с липидными мембранами за счёт гидрофобного участка, экранированного в нативном токсине [Utsumi Т. et al., 1989; Ramalingam T.S. et al., 1994; Simpson J . С et al., 1995c].Возможно, погружение RTA в мембрану инициирует процесс её транслокации в цитоплазму, однако, не исключено, что встроенная в мембрану RTA может транспортироваться к месту транслокации за счёт рециркуляции мембран.Предполагается, что встроившись в мембрану, RTA приобретает копформацию «расплавленная глобула» и после завершения трансмембранного переноса в цитоплазме происходит восстановление глобулярной структуры RTA. сопровождающееся перегруппировками в субстратсвязывающем сайте, необходимыми и для активации фермента [Argent R.H. et al., 2000; Zhang H. ct al., 2009J.3.1.1.2 Вискумин В листьях и побегах омелы содержатся три вида РИБ2, очень схожих между собой. Токсические лсктины омелы МЫ (вискумин), MLI1 и ML1II являются основными белками в водных экстрактах из омелы, которые давно используются при терапии онкологических заболеваний [Franz Н. et al., 1981]. Наибольшее распространение имеет вискумин.Молекула вискумина, как и другие РИБ2, состоит из двух субъединиц.Молекула ML1 имеет размеры порядка 120А х 80А х 70А. В то время как А21 субъединица состоит из а- и (3-элементов вторичной структуры, в В-субъединице обнаруживаются только [3-тяжи (Рисунок 4). Было отмечено, что третичная структура вискумина демонстрирует значительное сходство со структурой молекулы рицина. описанной с разрешением 2.8А [Montfort W. et al.. 1987]. При наложении углеродных Са-скелетов этих молекул обнаруживается практически полное их совпадение [EschenburgS. etal., 1998].Рисунок 4. Трёхмерная модель молекулы вискумина (MLI) А-субъединица представлена двумя доменами (синий и фиолетовый), состоящими из а-спиралей и Р-слоев. в В-субъединице. также состоящей из двух доменов, обнаруживаются только (3-слои. Показаны также олигосахариды. Модель построена с помощью программного обеспечения Cn3D v.4.1 на основе структуры молекулы рицина из протеомной базы данных национального центра биотехнологической информации [NCBI Entrez's Structure Database - 23554].10-11% молекулярного веса вискумина составляют углеводы, которые по структуре сходны с олигосахаридами других растительных токсинов [Franz Н. et al., 1981]. Вискумин содержит глюкозу, галактозу, маннозу, N-ацетилглюкозамин, Nацетилгалактозамин, N-ацетилманнозамин, фукозу и ксилозу.3.1.1.2.1 Строение В-субъединицы вискумина Углеводсвязывающая В-еубъединица вискумина состоит из 264 аминокислотных остатков. Шесть из семи цистеинов образуют три дисульфидпые связи внутри В-субъединицы, а один связан с цистсином А-субъсдиницы: Cys64Cys81, Cysl52-Cysl65 и Cysl92-Cys209. В аминокислотной последовательности Всубъединицы вискумина идентифицировано три потенциальных сайта гликозилирования в положениях 61, 96 и 136, в которых находятся остатки аспарагнна.Однако, исследования степени гликозилирования В-субъединицы МЫ говорят о наличии только двух гликановых частей в молекуле [Eschenburg S. et al., 1998].Уточненная структура кристалла МЫ в комплексе с галактозой была описана с разрешением 3,0 A [Niwa Н. et al., 2003]. В-субъединица МЫ состоит из двух гомологичных глобулярных доменов. Каждый домен диаметром около 30 А составлен тремя субдоменами (а, р\ у) и содержит углсводсвязывающий сайт. Линксрпьтс участки, обозначаемые Х\ и Х2. соединяют А- и В-субъединицы токсина и два лектиновых домена соответственно [Krauspenhaar R. et al., 1999]. Хотя предполагается, что субдомены а, (3 и у произошли от общего галактозевязывающего пептида, только субдомены a l и у2 сохранили способность связывать углеводный остаток [Villafranca J.E. and Robertus J.D., 1981]. Данные функциональные субдомены различаются между собой по аффинности к связываемому углеводу (субдомен a l является низкоаффинным) из-за различия в аминокислотных последовательностях [Krauspenhaar R. et al., 1999].Рисунок 5. Строение углеводсвязывающих сайтов В-субъединицы вискумина А - N-концевой сайт, Б - С-концевой сайт. Показаны элементы вторичной структуры и связанная галактоза (синяя сетчатая поверхность) [Palmer R.A. and Niwa Н., 2003].В-субьединица вискумина специфически связывается с гликолипидами и/или гликопротеидами, содержащими терминальную галактозу [Ziska P. and Franz Н.. 1981].С помощью моно-. ди- и олигосахаридов показано, что вискумин обладает высокой аффинностью к терминальной галактозе, связанной по альфа- или бета- положению, и слабо взаимодействует с 1М-ацетилгалактозамином [Franz Н., 1986; Wu A.M. el al., 1992].3.1.1.2.2 Строение А-субъединицы вискумина Аминокислотная последовательность А-субъединицы вискумина (MLA) включает 254 остатка [Huguet S.M. et al.. 1996]. Единственный остаток цистеина Cys247 участвует в образовании дисульфидной связи с Cys5 В-субъединицы.Внутренние дисульсуфидные связи в MLA отсутствуют. В аминокислотной последовательности А-субъединицы вискумина идентифицирован один потенциальный сайт гликозилирования в позиции Asn I 12 в составе триплета аминокислот Asn-X-Ser/Thr. Исследования степени гликозилирования А-субъединицы МЫ подтвердили, что белок содержит один гликановый остаток.В составе А-субъединицы впскумина можно выделить три домена. Домен I включает 110 N-копцевых аминокислот и состоит из одного спирального участка и шести р-тяжей, домен II (111-203 аминокислотные остатки) составлен четырьмя спиральными участками, домен III (204-254 аминокислотные остатки) содержит один спиральный участок и два антипаралелльных [3-тяжа и взаимодействует как с двумя другими доменами, так и с В-субъединицей [Krauspenhaar R. et al., 1999].Данные РСА свидетельствуют, что в построении каталитического аденинсвязывающсго центра впскумина участвуют все три домена. При сравнении аминокислотных последовательностей А-субъсдиниц различных РМБ2 - впскумина. рицина и абрина - были обнаружены абсолютно консервативные аминокислотные остатки, составляющие активный центр молекул. В А-субъединице впскумина это остатки Туг76, Туг 115, Glul65, ArgI68 и Trpl99 [Huguet S.M. et al., 1996].Аминокислоты Asn74, Argl26, Gin 162 и Glul97, формирующие окружение активного центра, участвуют в поддержании его структуры [Katzin B.J. et al., 1991].3.1.1.2.3 Взаимодействие между субъедшшцами виску мина Единичная дисульфидная связь соединяет Cys247 А-субъединицы и Cys5 Всубъединицы нативного гетеродимера впскумина. Помимо неё для стабилизации ассоциированных субъединиц существует большое количество нековалентных взаимодействий. В таблице показаны полярные, гидрофобные и ароматические взаимодействия между аминокислотными остатками субъединиц.Во взаимодействии субъединиц впскумина со стороны А-субъединицы в основном участвуют а.о. С-концевого участка, а со стороны В-субъединицы аминокислоты линкерных участков W и XI, а также С-концевые а.о.3.1.1.3 Внутриклеточный транспорт белковых токсинов Для достижения своей цитоплазматической мишени токсины проходят несколько ступеней внутриклеточного транспорта [Lord J.M. et al., 2003].Интернализация токсинов внутрь клетки осуществляется посредством рецепторопосредованного эндоцитоза. В этом процессе принимают участие как клеточные рецепторы, содержащие галактозу, так и рецепторы, связывающие концевую маннозу олигосахаридов [Simmons В.М. et al., 1986; Magnusson S. ct al., 1991; Rutenber E. and Robertus J.D., 1991].Для некоторых токсинов место и механизм транслокации известны, для других всё ещё остаётся под вопросом. Для многих РИБ2, в частное!и, рицина и вискумина, место транслокации пока не установлено. Возможно, они используют системы ретро[ранслокации для выхода из эндоплазматического ретикулума в цитоплазму [Hazes В. and Read R.J., 1997; Sandvig К. and Van Deurs В., 2000].3.1.1.3.1 Интернетизация токсинов в клетку-мишень Большинство белков, связывающихся с рецепторами на поверхности клетки, эндоцитируются с помощью клатрин-зависимого механизма [Mellman 1., 1996], но есть и рецепторы, интернализующиеся клатрин-независимыми способами: макропиноцитоз, фагоцитоз и захват внеклеточного материала, опосредованный липидпыми рафтами и кавеолами [Johannes L. and Lamaze С , 2002].Взаимодействие токсина с клетками начинается со связывания с рецепторами на поверхности клетки. Основным способом связывания РИБ2 являс1ся взаимодействие В-субъединпцы с галактозосодержащими рецепторами благодаря её лектиновой активности [Lord J.M. et al., 2005]. На клетках млекопитающих имеется огромное количество рецепторов, с которыми могут связываться токсины. Так, было подсчитано, что для рицина число соответствующих рецепторов колеблется от 2 до 80 млн. на клетку, а для вискумина почти в 2 раза меньше [Barbieri L. et al., 1993]. Среди этого количества обязательно найдутся рецепторы, которые в норме попадают внутрь клетки, используя различные механизмы как клатрин-зависимого, так и клатриннезависимого эндоцитоза [Montesano L. et al., 1982; Sandvig К. and Olsnes S., 1982a; Sandvig K. and Olsnes S., 1982b].Это предположение подтверждается большим количеством фактов: интернализация рицина продолжается при нарушении формирования клатринокаймленных везикул и блокировании клатрин-зависимого эндоцитоза [Simpson J.С. et al., 1995а; Sandvig К. and Van Deurs В., 1996].

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Хапчаев, Шамиль Юсуфович

6 Выводы

1. Разработана тест-система на основе панели моноклональных антител против рицина, позволяющая выявлять изолированную А-цепь рицина (ЯТА) внутри клетки.

2. Показано, что совместное распределение нативиого токсина и его свободной А-субъединицы па начальных этапах интоксикации клетки не превышает 10%, а через 18-20 часов достигает практически 80%.

3. При комплексном использовании иммунохимических методов и конфокальной микроскопии установлено, что концентрация токсина в ранних эндосомах может составлять не менее 1,3 1 * 10"7 М/л, а в отдельных везикулах достигает величины 10"5 М/л.

4. Показано, что свободная ЯТА не колокализуется с маркёрами эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи, лизосом, клеточного ядра и митохондрий.

5. В предварительно обработанных цельным токсином клетках линий ЗТЗ, С6, А431 А-субъединица рицина выявляется через 4 часа, что согласуется со временем остановки биосинтеза белка в этих клетках.

6. Обнаружено, что обработка клеток линий ЗТЗ, С6 и А431 низкими концентрациями (от 10~|8М до 10"'° М) рицина или вискумина усиливает пролиферацию клеток и через 5 суток увеличивает долю делящихся клеток в два-четыре раза.

7. Включение токсинов в полилактидную матрицу методом «сухой» сверхкритической флюидной инкапсуляции позволяет получать лекарственные препараты пролонгированного действия. Показано, что эта процедура не влияет на иммунохимические и цитотоксические свойства вискумина.

7 Благодарности

Выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю Мойсеновичу Михаилу Михайловичу за постоянную и неоценимую помощь в проведении данной работы.

Я искренне признателен моему научному консультанту профессору Егоровой Светлане Григорьевне за помощь и участие в обсуждении полученных данных.

Сердечно благодарю своих коллег A.A. Рамонову, А.Ю. Архипову, к.б.н. O.A. Бенедиктову, к.б.н. К.Н. Новикова за советы и помощь в проведении ряда экспериментов.

Выражаю признательность всем сотрудникам кафедры физиологии микроорганизмов за доброжелательность и создание в коллективе дружеской атмосферы.

Благодарю своих родных за веру, терпение и помощь, оказанную при подготовке работы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Хапчаев, Шамиль Юсуфович, 2009 год

1. NCBI Entrez's Structure Database Электронный ресурс. / National Library of Medicine: 2003 Режим доступа:http://www.nc bi.nlm.nih.^ov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?Liid= 1 QQL.

2. NCBI Entrez's Structure Database Электронный ресурс. / National Library of Medicine: 1993 Режим доступа:http://www.ncbi.nlm. nih .go v/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=2A Al.

3. Бенедиктова, О.А., Попова, Е.Н., Егорова, С.Г., Демина, И.А. и Мойсенович, М.М. Выявление свободной А-цепи рицина в супернатантах клеток, предобработанных нативным токсином. / Биотехнология. 2005. -V.6, Р.83-89.

4. Гумеров, Ф.М., Сабирзянов, А.Н. и Гумерова, Г.И. Суб- п сверхкритические флюиды в процессах переработки полимеров. М. 2000.

5. Темяков, Д.Е., Агапов, И.И., Мойсенович, М.М., Прокофьев,

6. С.А., Малюченко, Н.В., Егорова, С.Г., Пфюллер, У., Зинке, X. и Тоневицкий, А.Г. Изучение гетерогенности каталических субъедипиц лектинов омелы белой с помощью моноклональных антител. / Молекулярная биология. 1997.- V.31, Р.536-541.

7. Хапчаев, Ш.Ю., Архипова, АЛО. и Мойсенович, М.М. Влияние ингибиторов синтеза белка на клетки линий ЗТЗ и А431. / Российский иммунологический журнал. 2008b. - V.2(11), Р.316.

8. Abraham, А.К. and Pihl, A. Effect of protein synthesis inhibitors on the fidelity of translation in eukaryotic systems. / Biochim.Biophys.Acta. 1983.- V.741, P.197-203.

9. Agapov, 1.1., Tonevitsky, A.G., Maluchenko, N.V., Moisenovich, M.M., Bulah, Y.S. and Kirpichnikov, M.P. Mistletoe lectin A-chain unfolds during the intracellular transport. / FEBS Lett. 1999a. - V.464, P.63-66.

10. Alessenko, A.V., Boikov, P.Y., Filippova, G.N., Khrenov, A.V., Loginov, A.S. and Makarieva, E.D. Mechanisms of cyclohcximide-induced apoptosis in liver cells. / FEBS Lett. 1997. - V.416, P. I 13-1 16.

11. Arcon-Vargas, D. and Ronai, Z. c-Jun-NH2 kinase (JNK) contributes to the regulation of c-Myc protein stability. / J Biol Chem. 2004. - V.279,1. P.5008-5016.

12. Argent, R.H., Parrott, A.M., Day, P.J., Roberts, L.M., Stockley, P.G., Lord, J.M. and Radford, S.E. Ribosome-mediated folding of partially unfolded ricin A-chain. / J.Biol.Chem. 2000. - V.275, P.9263-9269.

13. Argent, R.H., Roberts, L.M., Wales, R., Robertus, J.D. and Lord, J.M. Introduction of a disulfide bond into ricin A chain decreases the cytotoxicity of the ricin holotoxin. / J.Biol. Chem. 1994. - V.269, P.26705-267 1 0.

14. Baenziger, J.U. and Fiete, D. Structural determinants of Ricinus communis agglutinin and toxin specificity for oligosaccharides. / J.Biol.Chem. -1979. V.254, P.9795-9799.

15. Bai, Y., Monzingo, A.F. and Robertus, J.D. The X-ray structure of ricin A chain with a novel inhibitor. / Arch.Biochem.Biophys. 2009. - V.483, P.23-28.

16. Bakhshi, J., Weinstein, L., Poksay, K.S., Nishinaga, B., Bredesen, D.E. and Rao, R.V. Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program in mouse melanoma cells: effect of curcumin. / Apoptosis. 2008. -V.13, P.904-914.

17. Barbieri, L., Battel I i, M.G. and Stirpe, F. Ribosome-inactivating proteins from plants. / Biochim.Biophys.Acta. 1993. - V.1154, P.237-282.

18. Ban, M.Y. and Draper, R.K. Ricin intoxicates End4 mutants that have an aberrant Golgi complex. / J.Biol.Chem. 1993. - V.268, P-. 1 9939-1 9942.

19. Beaumelle, B., Alami, M. and Hopkins, C.R. ATP-dependent translocation of ricin across the membrane of purified endosomes. / J.Biol.Chem. 1993. - V.268, P.23661-23669.

20. Beaumelle, B., Taupiac, M.P., Lord, J.M. and Roberts, L.M. Ricin A chain can transport unfolded dihydrofolate reductase into the cytosol. / J.Biol.Chem. 1997. - V.272, P.22097-22 I 02.

21. Bharali, D.J., Mousa, S.A. and Thanavala, Y. Micro- and nanoparticle-based vaccines for hepatitis B. / Adv.Exp.Med.Biol. 2007. - V.601, P.4 I 5-42 I.

22. Bilge, A., Warner, C.V. and Press, O.W. Translocation of ricin A-ehain into proteoliposomes reconstituted from Golgi and endoplasmic reticulum. / J.Biol.Chem. 1995. - V.270, P.23720-23725.

23. Blom, W.M., de Bont, II.J., Meijcrman, I., Mulder, G.J. and Nagelkerke, J.F. Prevention of cycloheximide-induced apoptosis in hepatocytes by adenosine and by caspase inhibitors. / Biochem.Pharmacol. 1999. - V.58, P.1891-1898.

24. Borisy, G.G. and Taylor, E.W. The mechanism of action of colchicine. Colchicine binding to sea urchin eggs and the mitotic apparatus. I J Cell Biol. 1967. - V.34, P.535-548.

25. Broker, L.E., Kruyt, F.A.E. and Giaccone, G. Cell Death Independent of Caspases: A Review. / Clinical Cancer Research. — 2005. — V.ll, P.3155-3 162.

26. Cammue, B.P., Broekaert, W.F., Kellens, J.T., Raikhel, N.V. and Peumans, W.J. Stress-Induced Accumulation of Wheat Germ Agglutinin and Abscisic Acid in Roots of Wheat Seedlings. / Plant Physiol. 1 989. - V.91, P.1432-1435.

27. Cande, C., Cecconi, F., Dessen, P. and Kroemer, G. Apoptosis-inducing factor (AIF): key to the conserved caspase-independent pathways of cell death? / J Cell Sci. 2002. - V.115, P.4727-4734.

28. Canman, C.E. and Kastan, M.B. Signal transduction. Three paths to stress relief. / Nature. 1996. - V.384, P.213-214.

29. Carlini, C.R. and Grossi-de-Sa, M.F. Plant toxic proteins with insecticidal properties. A review on their potentialities as bioinsecticides. / Toxicon. 2002. - V.40, P. 15 15-1 539.

30. Catsicas, M., Pequignot. Y. and Clarke, P.G. Rapid onset of neuronal death induced by blockade of cither axoplasmic transport or action potentials in afferent fibers during brain development. I J Neurosci. 1992. - V.12, P.4642-4650.

31. Cavigelli, M., Li, W.W., Lin, A., Su, B., Yoshioka, K. and Karin, M. The tumor promoter arsenite stimulates AP-1 activity by inhibiting a JNK phosphatase. / EMBO J. 1 996. - V.15, P.6269-6279.

32. Chow, J.M. Huang, G.C., Lin, H.Y., Shen, S.C., Yang, L.Y. and Chen, Y.C. Cytotoxic effects of metal protoporphyrins in glioblastoma cells: Roles of albumin, reactive oxygen species, and heme oxygenase-1. / Toxicology Letters. 2008. - V.177, P.97-107.

33. Cosson, P. and Letourneur, F. Coatomer interaction with di-lysine endoplasmic reticulum retention motifs. / Science. 1994. - V.263, P. 1 629 -1 63 1.

34. De la Cruz, R.R., Pastor, A.M. and gado-Garcia, J.M. Effects of target depletion on adult mammalian central neurons: functional correlates. / Neuroscience. 1994. - V.58, P.81-97.

35. Debatin, K.M. Apoptosis pathways in cancer and cancer therapy. / Cancer Immunol.Immunother. 2004. - V.53, P. 153-1 59.

36. Decastel, M., Haentjens, G., Aubery, M. and Goussault, Y. Differential entry of ricin into malignant and normal rat hepatocytes. / Exp.Cell Res. 1989. - V.180, P.399-408.

37. Derijard, B., Hibi, M., Wu, I.H., Barrett, T., Su, B., Deng, T., Karin, M. and Davis, R.J. JNK1: a protein kinase stimulated by UV light and Ha-Ras that binds and phosphorylates the c-Jun activation domain. / Cell. 1994. - V.76, P.1025-1037.

38. Devary, Y., Gottlieb, R.A., Smeal, T. and Karin, M. The mammalian ultraviolet response is triggered by activation of Src tyrosine kinases. I Cell. -1992. V.71, P.1081-1091.

39. Elsasser-Beile, U., Ruhnau, T., Freudenberg, N., Wetterauer, U. and Mengs, U. Antitumoral effect of recombinant mistletoe lectin on chemically induced urinary bladder carcinogenesis in a rat model. / Cancer. 2001 . - V.91, P.998-1004.

40. Endo, Y. Mechanism of action of ricin and related toxins on the inactivation of eukaryotic ribosomcs. / Cancer Treat .Res. 1988. - V.37, P.75-89.

41. Endo, Y. and Tsurugi, K. RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain. Mechanism of action of the toxic lcctin ricin on eukaryotic ribosomes. / J.Biol.Chem. 1987. - V.262, P.8128-8130.

42. Endo, Y., Tsurugi, K. and Lambert, J.M. The site of action of six different ribosome-inactivating proteins from plants on eukaryotic ribosomcs: the RNA N-glycosidase activity of the proteins. / Biochem.Biophys.Res.Comnuin. -1988.- V.150, P.1032-1036.

43. Eschenburg, S., Krauspenhaar, R., Mikhailov, A., Stocva, S., Betzel, C. and Voellcr, W. Primary structure and molecular modeling of mistletoe lectin 1 from Viscum album. / Biochem.Biophys.Res.Commun. 1998. - V.247, P.367-372.

44. Faye, L., Greenwood, J.S. and Chrispeels, M.J. Urease in jack-bean (Canavalia ensiformis (L.) DC) seeds is a cytosolic protein. / Planta. 1986. -V.168, P.579-585.

45. Frankel, A., Tagge. E., Chandler, J., Burbage, C., Hancock, G., Vescly, J. and Willingham, M. Characterization of single site ricin toxin B chain mutants. / Bioconjug.Chem. 1996a. - V.7, P.30-37.

46. Frankel, A., Tagge, E., Chandler, J., Burbage, C. and Willingham, M. Double-site ricin B chain mutants retain galactose binding. / Protein Eng. -1996b. V.9, P.371-379.

47. Frankel, A., Welsh, P., Richardson, J. and Robertus, J.D. Role of arginine 180 and glutamic acid 177 of ricin toxin A chain in enzymatic inactivation of ribosomes. / Mol.Cell Biol. 1990. - V.10, P.6257-6263.

48. Frankel, A.E., Fu, T., Burbage, C., Chandler, J., Willingham, M.C. and Tagge, E.P. 1L2 fused to lectin-deficient ricin is toxic to human leukemia cells expressing the 1L2 receptor. I Leukemia. 1997a. - V.ll, P.22-30.

49. Franz, H. Mistletoe lectins and their A and B chains. / Oncology. -1986. V.43 Suppl 1, P.23-34.

50. Franz, H., Ziska, P. and Kindt, A. Isolation and properties of three lectins from mistletoe (Viscum album L.). / Biochem.J. 1 981. - V.195, P.481 -484.

51. Fujita, H., Morita, I. and Murota, S. A possible involvement of ion transporter in tumor necrosis factor alpha and cycloheximide-induced apoptosis of endothelial cells. / Mediators.Inflamm. 1999.-V.8, P.2 11-218.

52. Galcheva-Gargova, Z., Derijard, B., Wu, I.H. and Davis, R.J. An osmosensing signal transduction pathway in mammalian cells. / Science. 1994.- V.265, P.806-808.

53. Ginn, S.R. and Peterson, G.M. Studies related to the use of colchicine as a neurotoxin in the septohippocampal cholinergic system. / Brain Res. 1992. - V.590, P.144-152.

54. Girbes, T., Ferreras, J.M., Arias, F.J. and Stirpe, F. Description, distribution, activity and phylogenetic relationship of ribosome-inactivating proteins in plants, fungi and bacteria. / Mini.Rev.Med.Chem. 2004. - V.4, P.461-476.

55. Gluck, A., Endo, Y. and Wool, l.G. The ribosomal RNA identity elements for ricin and for alpha-sarcin: mutations in the putative CG pair that closes a GAGA tetraloop. / Nucleic Acids Res. 1994. - V.22, P.32 1-324.

56. Gong, J., Li, X. and Darzynkiewicz, Z. Different patterns of apoptosis of HL-60 cells induced by cycloheximide and camptothecin. / J.Cell Physiol. 1993. - V.157, P.263-270.

57. Goiiich, D., Hartmann, E., Prehn, S. and Rapoport, T.A. A protein of the endoplasmic reticulum involved early in polypeptide translocation. / Nature.- 1992. V.357, P.47-52.

58. Graves, R.A., Poole, D., Moiseyev, R., Bostanian, L.A. and Mandal, T.K. Encapsulation of indomethacin using coaxial ultrasonic atomizationfollowed by solvent evaporation. / Drug Dev.Ind.Pharm. — 2008. V.34, P.419-426.

59. Green, D.R. and Reed, J.C. Mitochondria and apoptosis. / Science. -1998. V.281, P.1309-1312.

60. Griesinger, C.B., Richards, C.D. and Ashmore, J.F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. / Eur.J Neurosci. -2004. V.20, P.41-50.

61. Griffith, L.G. Polymeric biomaterials. / Acta Materialia. 2000. -V.48, P.263-277.

62. Haas, S. and Kaina, B. c-Fos is involved in the cellular defence against the genotoxic effect of UV radiation. / Carcinogenesis. 1995. - V.16, P.985-991.

63. Hacker, G. The morphology of apoptosis. / Cell Tissue Res. 2000. - V.301, P.5-17.

64. Hansen, S.H., Sandvig, K. and Van Deurs B. Molecules internalized by elathrin-independent endocytosis are delivered to endosomes containing transferrin receptors. / J Cell Biol. 1993. - V.123, P.89-97.

65. Hartley, M.R. and Lord, J.M. Cytotoxic ribosome-inactivating lectins from plants. / Biochim.Biophys.Acta. 2004. - V.1701, P. 1-14.

66. Hasirci, V., Vrana, E., Zorlutuna, P., Ndreu, A., Yilgor, P., Basmanav, F.B. and Aydin, E. Nanobiomaterials: a review of the existing science and technology, and new approaches. I J.Biomater.Sci.Polym.Ed. 2006. - V.17, P.1241-1268.

67. Hatakeyama, T., Yamasaki, N. and Funatsu, G. Evidence for involvement of tryptophan residue in the low-affinity saccharide binding site of ricin D. / J.Biochem. (Tokyo). 1986. - V.99, P.1049-1056.

68. Hazes, B. and Read, R.J. Accumulating evidence suggests that several AB-toxins subvert the endoplasmic reticulum-associated proteindegradation pathway to enter target cells. / Biochemistry. 1997. - V.36, P.1 1051-1 1054.

69. Hegde, R. and Podder, S.K. Evolution of tetrameric lectin Ricinus communis agglutinin from two variant groups of ricin toxin dimers. / Eur.J.Biochem. 1998. - V.254, P.596-601.

70. Helmy, M., Lombard, S. and Pieroni, G. Ricin RCA60: evidence of its phospholipase activity. / Biochem.Biophys.Res.Commun. 1999. - V.258,1. P.252-255.

71. Heus, H.A. and Pardi, A. Structural features that give rise to the unusual stability of RNA hairpins containing GNRA loops. / Science. 1991. -V.253, P.191-194.

72. Hibi, M., Lin, A., Smeal, T., Minden, A. and Karin, M. Identification of an oncoprotein- and UV-responsive protein kinase that binds and potentiates the c-Jun activation domain. / Genes Dev. 1993. - V.7, P.2135-2148.

73. Horisberger, M. Colloidal gold : a cytochemical marker for light and fluorescent microscopy and for transmission and scanning electron microscopy. / Scan Electron Microsc. 1981,- P.9-3 1.

74. Hubbell, J.A. Bioactive biomaterials. / Curr.Opin.Biotechnol. -1999. V.10, P.123-129.

75. Hudson, T.H. and Grillo, F.G. Brefeldin-A enhancement of ricin A-chain immunotoxins and blockade of intact ricin, modeccin, and abrin. / J.Biol.Chem. 1991. - V.266, P. 1 85 86-1 8592.

76. Huguet, S.M., Stoeva, S., Schwamborn, C., Wilhelm, S., Stiefel, T. and Voelter, W. Complete amino acid sequence of the A chain of mistletoe lectin 1. / FEBS Lett. 1996. - V.399, P.153-157.

77. Hunziker-Basler, N., Zuzak, T.J., Eggenschwiler, J., Rist, L., Simoes-Wust, A.P. and Viviani, A. Prolonged cytotoxic effect of aqueous extracts from dried viscum album on bladder cancer cells. / Pharmazie. 2007. - V.62,1. P.237-238.

78. Hussain, M.M. A proposed model for the assembly of chylomicrons.

79. Atherosclerosis. 2000. - V.148, P.l-15.

80. Iordanov, M.S., Pribnow, D., Magun, J.L., Dinh, T.H., Pearson, J.A. and Magun, B.E. Ultraviolet radiation triggers the ribotoxic stress response in mammalian cells. / J.Biol.Chem. 1998. - V.273, P. 1 5794-1 5803.

81. Iversen, T.G., Skretting, G., Llorente, A., Nicoziani, P., van, D.B. and Sandvig, K. Endosome to Golgi transport of ricin is independent of clathrin and of the Rab9- and Rabl 1-GTPases. / Mol.Biol.Cell. 2001. - V.12, P.2099-2107.

82. Jacobson, M.D., Weil, M. and Raff, M.C. Programmed cell death in animal development. / Cell. 1997. - V.88, P.347-354.

83. Johannes, L. and Lamaze, C. Clathrin-dependent or not: is it still the question? / Traffic. 2002. - V.3, P.443-451.

84. Johnson, G.L. and Lapadat, R. Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases. / Science. 2002. -V.298, P.191 1-1912.

85. Kageyama, A., Kusano, I., Tamura, T., Oda, T. and Muramatsu, T. Comparison of the apoptosis-inducing abilities of various protein synthesis inhibitors in U937 cells. / Biosci.Biotechnol.Biochem. 2002. - V.66, P.835-839.

86. Katzin, B.J., Collins, E.J. and Robertus, J.D. Structure of ricin A-chain at 2.5 A. / Proteins. 1991. - V.10, P.25 1-259.

87. Kerr, R.O., Cardamone, J., Dalmasso, A.P. and Kaplan, M.E. Two mechanisms of erythrocyte destruction in penicillin-induced hemolytic anemia. / N.Engl.J Med. 1972. - V.287, P. 1322-1325.

88. Kerridge, D. The effect of actidione and other antifungal agents on nucleic acid and protein synthesis in Saccharomyces carlsbergcnsis. /

89. J.Gen.Microbiol. 1958. - V.19, P.497-506.

90. Kuroki, D.W., Bignami, G.S. and Wattenberg, E.V. Activation of stress-activator protein kinase/c-Jun N-terminal kinase by the non-TPA-type tumor promoter palytoxin. / Cancer Res. 1996. - V.56, P.637-644.

91. Kuwana, T., Mackey, M.R., Perkins, G., Ellisman, M.H., Latterich, M., Schneiter, R., Green, D.R. and Newmeyer, D.D. Bid, Bax, and lipids cooperate to form supramolecular openings in the outer mitochondrial membrane. / Cell. 2002. - V.lll, P.331-342.

92. Kyriakis, J.M., Banerjee, P., Nikolakaki, E., Dai, T., Rubie, E.A., Ahmad, M.F., Avruch, J. and Woodgett, J.R. The stress-activated protein kinase subfamily of c-Jun kinases. / Nature. 1 994. - V.369, P. 1 56-1 60.

93. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. / Nature. 1 970. - V.227, P.680-685.

94. Leonard, J.E., Grothaus, C.D. and Taetle, R. Ricin binding and protein synthesis inhibition in human hematopoietic cell lines. / Blood. 1988. -V.72, P.1357-1363.

95. Levine, B. and Klionsky, D.J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. / Dev.Cell. 2004. - V.6, P.463-477.

96. Lindenboim, L., Diamond, R., Rothenberg, E. and Stein, R. Apoptosis induced by serum deprivation of PC12 cells is not preceded by growth arrest and can occur at each phase of the cell cycle. / Cancer Res. 1995. - V.55, P.1242-1247.

97. Liu, Z.G., Baskaran, R., Lea-Chou, E.T., Wood, L.D., Chen, Y., Karin, M. and Wang, J.Y. Three distinct signalling responses by murine fibroblasts to genotoxic stress. / Nature. 1996. - V.384, P.273-276.

98. Lombard, S., Helmy, M.E. and Pieroni, G. Lipolytic activity of ricin from Ricinus sanguineus and Ricinus communis on neutral lipids. / Biochem.J. -2001. V.358, P.773-781.

99. Lord, J.M., Davey, J., Frigerio, L. and Roberts, L.M. Endoplasmic reticulum-associated protein degradation. / Semin.Cell Dev.Biol. 2000. - V.ll, P.159-164.

100. Lord, J.M., Hartley, M.R. and Roberts, L.M. Ribosome inactivating proteins of plants. / Semin.Cell Biol. 1991. - V.2, P.15-22.

101. Lord, J.M., Jolliffc, N.A., Marsden, C.J., Pateman, C.S., Smith, D.C., Spooner, R.A., Watson, P.D. and Roberts, L.M. Ricin. Mechanisms of cytotoxicity. / Toxicol.Rev. 2003. - V.22, P.53-64.

102. Majoul, I., Ferrari, D. and Soling, II.D. Reduction of protein disulfide bonds in an oxidizing environment. The disulfide bridge of cholera toxin A-subunit is reduced in the endoplasmic reticulum. / FEBS Lell. 1997. -V.401, P.104-108.

103. Manders, E.M.M., Verbeek, F.J. and Aten, J.A. Measurement of collocalization of objects in dual-colour confocal images. I J.Microscopy. 1993. - V.169, P.375-382.

104. Martin, S.J., Lcnnon, S.V., Bonham, A.M. and Cotter, T.G. Induction of apoptosis (programmed cell death) in human leukemic HL-60 cells by inhibition of RNA or protein synthesis. / J.Immunol. 1 990. - V.145, P. 1 8591867.

105. McLaren, A.C. Alternative materials to acrylic bone cement for delivery of depot antibiotics in orthopaedic infections. / Clin.Orthop.Relal Res. -2004. P.101-106.

106. Mellman, I. Endocytosis and molecular sorting. / Annu.Rev. Cell Dev.Biol. 1996. - V.12, P.575-625.

107. Moisenovich, M., Tonevitsky, A., Agapov, I., Niwa, H., Schevve, H. and Bereiter-Hahn, J. Differences in endocytosis and intracellular sorting of ricin and viscumin in 3T3 cells. / Eur.J.Cell Biol. 2002. - V.81, P.529-538.

108. Moisenovich, M., Tonevitsky, A., Maljuchenko, N., Kozlovskaya,-N., Agapov, I., Volknandt, W. and Bereiter-Hahn, J. Endosomal ricin transport: involvement of Rab4- and Rab5-positive compartments. / Histochem.Cell Biol. -2004. V.121, P.429-439.

109. Montesano, L., Cawley, D. and Herschman, H.R. Disuccinimidyl suberate cross-linked ricin does not inhibit cell-free protein synthesis. / Biochem.Biophys.Res.Commun. 1982. - V.109, P.7-13.

110. Montfort, W., Villafranca, J.E., Monzingo, A.F., Ernst, S.R., Katzin, B., Rutenber, E., Xuong, N.H., Hamlin, R. and Robertus, J.D. The three-dimensional structure of ricin at 2.8 A. / J.Biol.Chem. 1 987. - V.262, P.5398-5403.

111. Monzingo, A.F. and Robertus, J.D. X-ray analysis of substrate analogs in the ricin A-chain active site. / J.Mol.Biol. 1 992. - V.227, P. 1 1361 145.

112. Morlon-Guyot, J., Helmy, M., Lombard-Frasca, S., Pignol, D., Pieroni, G. and Beaumelle, B. Identification of the ricin lipase site and implication in cytotoxicity. / J.Biol.Chem. 2003. - V.278, P. 17006-1701 1.

113. Mosmann, T. Rapid eolorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. /

114. J.Immunol.Methods. 1983. - V.65, P.55-63.

115. Moulin, A., Teissere, M., Bernard, C. and Pieroni, G. Lipases of the euphorbiaceae family: purification of a lipase from Euphorbia characias latex and structure-function relationships with the B chain of ricin. /

116. Proc.Natl. Acad.Sci. U.S.A. 1994. - V.91, P.l 1328-1 1332.

117. Murphy, K.M., Ranganathan, V., Farnsworth, M.L., Kavallaris, M. and Lock, R.B. Bcl-2 inhibits Bax translocation from cytosol to mitochondria during drug-induced apoptosis of human tumor cells. / Cell Death.Differ. 2000.- V.7, P.102-1 11.

118. Nakagawa, T. and Yuan, J. Cross-talk between two cysteine protease families. Activation of caspase-12 by calpain in apoptosis. / J Cell Biol. 2000.- V.150, P.887-894.

119. Nakagawa-Yagi, Y. Induction of apoplotic cell death in differentiating neuroblastoma SH-SY5Y cells by colchicine. / Biochem.Biophys.Res. Commun. 1994. - V.199, P.807-817.

120. Narayanan, S., Surendranath, K., Bora, N., Surolia, A. and Karande, A.A. Ribosome inactivating proteins and apoptosis. / FEBS Lett. 2005. - V.579, P.1324-1331.

121. Niwa, H., Tonevitsky, A.G., Agapov, 1.1., Saward, S., Pfuller, U. and Palmer, R.A. Crystal structure at 3 A of mistletoe lectin I, a dimeric type-II ribosome-inactivating protein, complexcd with galactose. / Eur.J.Biochem. -2003. V.270, P.2739-2749.

122. Nunez, G., Benedict, M.A., Hu, Y. and Inohara, N. Caspases: the proteases of the apoptotic pathway. / Oncogene. 1998. - V.17, P.3237-3245.

123. Obrig, T.G., Culp, W.J., McKeehan, W.L. and Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. / J.Biol.Chem. 1971. - V.246, P.174-181.

124. Okada, H. and Mak, T.W. Pathways of apoptotic and non-apoptotic death in tumour cells. / Nat.Rev.Cancer. 2004. - V.4, P.592-603.

125. Olivier, J.C. Drug transport to brain with targeted nanoparticles. / NeuroRx. 2005. - V.2, P. I 08-1 19.

126. Olsnes, S., Refsnes, K. and Pihl, A. Mechanism of action of the toxic lectins abrin and ricin. / Nature. 1974. - V.249, P.627-631.

127. Orlov, S.N., Thorin-Trescases, N., Kotelevtsev, S.V., Tremblay, J. and Hamet, P. Inversion of the intracellular Na+/K+ ratio blocks apoptosis in vascular smooth muscle at a site upstream of caspase-3. / J Biol Chem. 1 999. -V.274, P.16545-16552.

128. Padanilam, B.J. Cell death induced by acute renal injury: a perspective on the contributions of apoptosis and necrosis. / Am.J Physiol Renal Physiol. 2003. - V.284, P.F608-F627.

129. Palmer, R.A. and Niwa, H. X-ray crystallographic studies of protein-Iigand interactions. / Biochemical Society Transactions. 2003. - V.31, P.973-979.

130. Peumans, W.J., Hao, Q. and Van Damme, E.J. Ribosome-inactivating proteins from plants: more than RNA N-glycosidases? / FASEB J. 200 I. - V.15, P.1493-1506.

131. Ramalingam, T.S., Das, P.K. and Podder, S.K. Ricin-membrane interaction: membrane penetration depth by fluorescence quenching and resonance energy transfer. / Biochemistry. 1994. - V.33, P. 12247-12254.

132. Raman, M., Chen, W. and Cobb, M.H. Differential regulation and properties of MAPKs. / Oncogene. 2007. - V.26, P.3 100-31 12.

133. Rao, R.V., Ellerby, H.M. and Brcdesen, D.E. Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program. / Cell Death.Dijfer. 2004. - V.ll, P.372-380.

134. Rao, S.S. and Grollman, A.P. Cycloheximide resistance in yeast: a property of the 60s ribosomal subunit. / Biochem.Biophys.Res.Commtin. 1967. -V.29, P.696-704.

135. Rapak, A., Falnes, P.O. and Olsnes, S. Retrograde transport of mutant ricin to the endoplasmic reticulum with subsequent translocation to cytosol. / Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1997. - V.94, P.3783-3788.

136. Ready, M.P., Kim, Y. and Robertus, J.D. Site-directed mutagenesis of ricin A-chain and implications for the mechanism of action. / Proteins. — 1991.- V.10, P.270-278.

137. Reed, J.C. and Green, D.R. Remodeling for demolition: changes in mitochondrial ultrastructure during apoptosis. / Mol.Cell. 2002. - V.9, P. 1 -3.

138. Romisch, K. Peptide traffic across the ER membrane: TAPs and other conduits. / Trends Cell Biol. 1994. - V.4, P.311-314.

139. Rozengurt, E. and Heppel, L.A. Serum rapidly stimulates ouabain-sensitive 86-RB+ influx in quiescent 3T3 cells. / Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. — 1975. V.12, P.4492-4495.

140. Rudiger, H. and Gabius, H.J. Plant lectins: occurrence, biochemistry, functions and applications. / Glycoconj.J. 2001. - V.18, P.589-613.

141. Rutenbcr, E., Katzin, B.J., Ernst, S., Collins, E.J., Mlsna, D., Ready, M.P. and Robertus, J.D. Crystallographic refinement of ricin to 2.5 A. / Proteins.- 1991. V.10, P.240-250.

142. Rutenber, E. and Robertus, J.D. Structure of ricin B-chain at 2.5 A resolution. / Proteins. 1991. - V.10, P.260-269.

143. Sandvig, K., Garred, O., Holm, P.K. and Van Deurs B. Endocytosis and intracellular transport of protein toxins. / Biochem.Soc. Trans. 1993. - V.21 ( Pt 3), P.707-71 1.

144. Sandvig, K. and Olsnes, S. Entry of the toxic proteins abrin, modeccin, ricin, and diphtheria toxin into cells. I. Requirement for calcium. / J.Biol.Chem. 1982a. - V.257, P.7495-7503.

145. Sandvig, K. and Van Deurs, B. Entry of ricin and Shiga toxin into cells: molecular mechanisms and medical perspectives. / EMBO J. 2000. -V.19, P.5943-5950.

146. Sandvig, K. and Van Deurs, B. Endocytosis, intracellular transport, and cytotoxic action of Shiga toxin and ricin. / Physiol Rev. 1996. - V.76,1. P.949-966.

147. Sandvig, K. and Van Deurs, B. Delivery into cells: lessons learned from plant and bacterial toxins. / Gene Ther. 2005. - V.12, P.865-872.

148. Schmid, S.L. and Cullis, P.R. Membrane sorting. Endosome marker is fat not fiction. / Nature. 1998. - V.392, P.135-136.

149. Schneider, E.M. and Sievers, A. Concanavalin A binds to the endoplasmic reticulum and the starch grain surface of root statocytes. / Planta. -1981. V.152, P.177-180.

150. Schreiber, M., Baumann, B., Cotten, M., Angel, P. and Wagner, E.F. Fos is an essential component of the mammalian UV response. / EMBO J. 1 995. - V.14, P.5338-5349.

151. Shu, J., Hitomi, M. and Stacey, D. Activation of JNK/SAPK pathway is not directly inhibitory for cell cycle progression in N1H3T3 cells. / Oncogene. 1996. - V.13, P.2421-2430.

152. Sikriwal, D., Ghosh, P. and Batra, J.K. Ribosome inactivating protein saporin induces apoptosis through mitochondrial cascade, independent of translation inhibition. / Int.J Biochem.Cell Biol. 2008. - V.40, P.2880-2888.

153. Simmons, B.M., Stahl, P.D. and Russell, J.H. Mannose receptor-mediated uptake of ricin toxin and ricin A chain by macrophages. Multiple intracellular pathways for a chain translocation. / J.Biol.Chem. 1986. - V.261, P.7912-7920.

154. Simpson, J.C., Dascher, C., Roberts, L.M., Lord, J.M. and Balch, W.E. Ricin cytotoxicity is sensitive to recycling between the endoplasmic reticulum and the Golgi complex. / J.Biol.Chem. 1995a. - V.270, P.20078-20083.

155. Simpson, J.C., Lord, J.M. and Roberts, L.M. Point mutations in the hydrophobic C-terminal region of ricin A chain indicate that Pro250 plays a key role in membrane translocation. / Eur.J.Biochem. 1995b. - V.232, P.458-463.

156. Simpson, J.C., Roberts, L.M. and Lord, J.M. Free ricin A chain reaches an early compartment of the secretory pathway before it enters the cytosol. / Exp.Cell Res. 1996. - V.229, P.447-451.

157. Simpson, J.C., Roberts, L.M. and Lord, J.M. Catalytic and cytotoxic activities of recombinant ricin A chain mutants with charged residues added at the carboxyl terminus. / Protein Expr.Purif. 1995c. - V.6, P.665-670.

158. Singh, B.J., Singh, J., Kamboj, S.S., Nijjar, K.K., Agrewala, J.N., Kumar, V., Kumar, A. and Saxena, A.K. Mitogenic and anti-proliferative activity of a lectin from the tubers of Voodoo lily (Sauromatum venosum). /

159. Biochim.Biophys.Acta. 2005. - V.1723, P. 163-1 74.

160. Skehan, P., Storeng, R., Scudiero, D., Monks, A., McMahon, J., Vistica, D., Warren, J.T., Bokesch, H., Kenney, S. and Boyd, M.R. New

161. Colorimetric Cytotoxicity Assay for Anticancer-Drug Screening. / JNCl Journal of the National Cancer Institute. 1990. - V.82, P. 1 107-1 1 12.

162. Spadoro-Tank, J.P. and Etzler, M.E. Heath Shock Enhances the Synthesis of a Lectin-Related Protein in Dolichos biflorus Cell Suspension Cultures. / Plant Physiol. 1988. - V.88, P.l 131-1 135.

163. Steeves, R.M., Denton, M.E., Barnard, F.C., Henry, A. and Lambert, J.M. Identification of three oligosaccharide binding sites in ricin. / Biochemistry. 1999. - V.38, P.l 1677-1 1685.

164. Stirpe, F. Ribosome-inactivating proteins. / Toxicon. 2004. - V.44, P.371-383.

165. Stirpe, F., Barbieri, L., Abbondanza, A., Falasca, A.I., Brown, A.N., Sandvig, K., Olsnes, S. and Pihl, A. Properties of volkensin, a toxic lectin from Adenia volkensii. / J.Biol. Chem. 1985. - V.260, P. 14589-14595.

166. Stirpe, F., Barbieri, L., Battelli, M.G., Soria, M. and Lappi, D.A. Ribosome-inactivating proteins from plants: present status and future prospects. / Biotechnology (N.Y.). 1992. - V.10, P.405-412.

167. Suzuki, Y., Takeda, M., Obara, N. and Suzuki, N. Colchicine-induced cell death and proliferation in the olfactory epithelium and vomeronasal organ of the mouse. / Anal.Embryol.(Berl). 1998. - V.198, P.43-51.

168. Sweeney, E.C., Tonevitsky, A.G., Palmer, R.A., Niwa, II., Pfueller, U., Eck, J., Lentzen, H., Agapov, I.I. and Kirpichnikov, M.P. Mistletoe lectin I forms a double trefoil structure. / FEBS Lett. 1998. - V.431, P.367-370.

169. Tahirov, T.H., Lu, T.H., Liaw, Y.C., Chen, Y.L. and Lin, J.Y. Crystal structure of abrin-a at 2.14 A. / J.Mol.Biol. 1995. - V.250, P.354-367.

170. Thies, A., Dautel, P., Meyer, A., Pfuller, U. and Schumacher, U. Low-dose mistletoe lectin-I reduces melanoma growth and spread in a scid mouse xenograft model. / Br. J.Cancer. 2008. - V.98, P. 106-1 12.

171. Todaro, G.J. and Green, H. Quantitative studies of the growth of mouse embryo cells in culture and their development into established lines. / J.Cell Biol. 1963. - V. 17, P.299-3 13.

172. Urech, K., Buessing, A., Thalmann, G., Schaefermeyer, H. and Heusser, P. Antiproliferative effects of mistletoe (Viscum album L.) extract in urinary bladder carcinoma cell lines. / Anticancer Res. 2006. - V.26, P.3049-3055.

173. Utsumi, T., Ide, A. and Funatsu, G. Ricin A-chain induces fusion of small unilamellar vesicles at neutral pH. / FEBS Lett. 1 989. - V.242, P.255-258.

174. Van Damme, E.J., Roy, S., Barre, A., Rouge, P., Van, L.F. and Peumans, W.J. The major elderberry (Sambucus nigra) fruit protein is a lectin derived from a truncated type 2 ribosome-inactivating protein. / Plant J. 1997. - V.12, P. 1251-1260.

175. Van Deurs, B., Sandvig, K., Petersen, O.W., Olsnes, S., Simons, K. and Griffiths, G. Estimation of the amount of internalized ricin that reaches the trans-Golgi network. I J.Cell Biol. 1988. - V.106, P.253-267.

176. Van Deurs, B., Tonnessen, T.I., Petersen, O.W., Sandvig, K. and Olsnes, S. Routing of internalized ricin and ricin conjugates to the Golgi complex. / J. Cell Biol. 1986. - V.102, P.37-47.

177. Vaux, D.L., Whitney, D. and Weissman, I.L. Activation of physiological cell death mechanisms by a necrosis-causing agent. / Microsc.Res. Tech. 1996. - V.34, P.259-266.

178. Vettor, M., Perugini, P., Scalia, S., Conti, B., Genta, I., Modena, T. and Pavanetto, F. Poly(D,L-lactide) nanoeneapsulation to reduce photoinactivation of a sunscreen agent. / Int.J.Cosmel.Sci. 2008. - V.30, P.2 1 9227.

179. Villafranca, J.E. and Robertus, J.D. Ricin B chain is a product of gene duplication. / J.Biol. Chem. 1981. - V.256, P.554-556.

180. Waetzig, V. and Herdegen, T. A single c-Jun N-terminal kinase isoform (JNK3-p54) is an effector in both neuronal differentiation and cell death. / J Biol Chem. 2003. - V.278, P.567-572.

181. Walchli, S., Skanland, S.S., Gregers, T.F., Lauvrak, S.U., Torgersen, M.L., Ying, ML, Kuroda, S., Maturana, A. and Sandvig, K. The Mitogen-activated protein kinase p38 links Shiga Toxin-dependent signaling and trafficking. /

182. Mo I. Bio I Cell. 2008. - V.19, P.95-104.

183. Wales, R., Richardson, P.T., Roberts, L.M., Woodland, H.R. and Lord, J.M. Mutational analysis of the galactose binding ability of recombinant ricin B chain. I J.Biol.Chem. 1991. - V.266, P. 1 9 1 72-1 9 1 79.

184. Wallace, W., Schaefer, L.H. and Swedlow, J.R. A workingperson's guide to deconvolution in light microscopy. / Biotechniques. 2001. - V.31,1. P.1076-8, 1080, 1082.

185. Waskicwicz, A.J. and Cooper, J.A. Mitogen and stress response pathways: MAP kinase cascades and phosphatase regulation in mammals and yeast. / Curr. Opin. Cell Biol. 1995. - V.7, P.798-805.

186. Wesche, J. Retrograde transport of ricin. / Int. J.Med.Microbiol. -2002. V.291, P.517-521.

187. Wesche, J., Rapak, A. and Olsnes, S. Dependence of ricin toxicity on translocation of the toxin A-chain from the endoplasmic reticulum to the cytosol. / J.Biol. Chem. 1999. - V.274, P.34443-34449.

188. Weston, S.A., Tucker, A.D., Thatcher, D.R., Derbyshire, D.J. and Pauptit, R.A. X-ray structure of recombinant ricin A-chain at 1.8 A resolution. / J.Mol.Biol. 1994. - V.244, P.4 10-422.

189. White, J.K., Stewart, A., Popoff, J.F., Wilson, S. and Blackwell, J.M. Incomplete glycosylation and defective intracellular targeting of mutant solute carrier family 1 1 member 1 (Slcl lal). / Biochem.J. 2004. - V.382, P.811-819.

190. Woese, C.R., Winker, S. and Gutell, R.R. Architecture of ribosomal RNA: constraints on the sequence of "tetra-loops". / Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1990. V.87, P.8467-8471.

191. Wool, I.G., Gluck, A. and Endo, Y. Ribotoxin recognition of ribosomal RNA and a proposal for the mechanism of translocation. / Trends Biochem.Sci. 1992. - V.17, P.266-269.

192. Wu, A.M., Chin, L.K., Franz, H., Pfuller, U. and Herp, A. Carbohydrate specificity of the receptor sites of mistletoe toxic lectin-1. / Biochim.Biophys.Acta. 1992. - V.1117, P.232-234.

193. Xia, Z., Dickens, M., Raingeaud, J., Davis, R.J. and Greenberg, M.E. Opposing effects of ERK and JNK-p38 MAP kinases on apoptosis. / Science. -1995. V.270, P.1326-1331.

194. Yi, X., Yin, X.M. and Dong, Z. Inhibition of Bid-induced Apoptosis by Bcl-2. tBid INSERTION, Bax TRANSLOCATION, AND Bax/Bak OLIGOMERIZATION SUPPRESSED. / Journal of Biological Chemistry. 2003. - V.278, P.16992-16999.

195. Youle, R.J. and Colombatti, M. Hybridoma cells containing intracellular anti-ricin antibodies show ricin meets secretory antibody before entering the cytosol. / J.Biol.Chem. 1987. - V.262, P.4676-4682.

196. Zhan, J., Stayton, P. and Press, O.W. Modification of ricin A chain, by addition of endoplasmic reticulum (K.DEL) or Golgi (YQRL) retention sequences, enhances its cytotoxicity and translocation. / Cancer1.munol.Immunother. 1998. - V.46, P.55-60.

197. Zhang, B., Ramonell, K., Somerville, S. and Stacey, G. Characterization of early, chitin-induced gene expression in Arabidopsis. / Mol.Plant Microbe Interact. 2002. - V.15, P.963-970.

198. Zhang, H., Zukowski, E., Balu, R. and Gregurick, S.K. A dynamics study of the A-chain of ricin by terahertz vibrational calculation and normal modes analysis. / J Mol.Graph.Model. 2009. - V.27, P.655-663.

199. Ziska, P. and Franz, H. Studies on the interaction of the mistletoe lectin I with carbohydrates. / Experientia. 1981. - V.37, P.219.

200. Zuzak, T.J., Rist, L., Eggenschwiler, J., Grotzer, M.A. and Viviani, A. Paediatric medulloblastoma cells are susceptible to Viscum album (Mistletoe) preparations. / Anticancer Res. 2006. - V.26, P.3485-3492.