Трансгенез PVYntn-CP геном белка оболочки Y вируса картофеля для создания вирусоустойчивых растений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Сташевски, Зенон

• Сташевски, Зенон
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Сташевски, Зенон

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Вирусы растений. Y-вирус картофеля.

1.1.1. Систематическое положение YBK.

1.1.2. Штаммы YBK.

1.1.3. Строение YBK.

1.1.4. Геном YBK.

1.1.5. Белки YBK.

1.1.6. Размножение YBK.

1.1.7. Передвижение YBK по инфицированному растению.

Л. 1.8. Взаимодействие между вирусами.

1.2. Вирусные болезни растений табака N. tabacum L. и картофеля

S. tuberosum L.

1.2.1. Заражение растений.

1.2.2. Симптомы и патогенез.

1.3. Устойчивость растений к вирусам.

1.3.1. Вертикальная устойчивость растений к вирусам.

1.3.2. Наследование вертикальной устойчивости к вирусам.

1.3.3. Механизмы проявления вертикальной устойчивости растений к вирусам.

1.3.4. Горизонтальная устойчивость растений к вирусам.

1.3.5. Механизмы проявления горизонтальной устойчивости растений к вирусам.

1.4. Создание трансгенных растений, устойчивых к вирусным болезням.

1.4.1. Вирусоустойчивость трансгенных растений, опосредованная геном белка оболочки вируса.

1.4.2. Вирусоустойчивость трансгенных растений, опосредованная геном транспортного белка вируса.

1.4.3. Вирусоустойчивость трансгенных растений, опосредованная геном вирусной репликазы.

1.4.4. Механизм проявления патоген-опосредованной вирусоустойчивости 52 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Вирусные штаммы и вектор для генетической трансформации.

2.2. Растительный материал.

2.2.1. Растения картофеля Solatium tuberosum L.

2.2.2. Растения табака Nicotiana tabacum L.

2.3. Питательные среды.

2.4 Трансформация и регенерация растений.

2.4.1. Трансформация и регенерация растений картофеля.

2.4.2. Трансформация и регенерация растений табака.

2.5. Молекулярные методы.

2.5.1. ПЦР анализ и Саузерн-блоттинг анализ.

2.5.2. Нозерн-блоттинг анализ.

2.5.3. Дот-блот анализ.

2.6. Иммунологические методы.

2.6.1. Р1ммуноблотинг (вестерн-блотгинг анализ).

2.6.2. Иммуноферментный анализ.

2.7. Фитопатологические методы исследования.

2.7.1. Определение вирусоустойчивости трансгенных растений методом механической инокуляции.

2.7.2. Определение вирусоустойчивости трансгенных растений картофеля методом прививки.

2.7.3. Определение вирусоустойчивости трансгенных растений в полевых условиях.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Получение микроклубней картофеля в условиях асептической культуры

3.2. Подбор эксплантов для трансформации^.

3.3. Трансформация и регенерация растений.

3.3.1. Трансформация и регенерация растений картофеля S. tuberosum L.

3.3.2. Трансформация и регенерация растений табака N. tabacum L.

3.4. Анализ интеграции PVYwm-CP гена в геном растений табака

N. tabacum L. и картофеля S. tuberosum L.

3.5. Изучение экспрессии PVYWN-CP гена.

3.5.1 Нозерн-блоттинг анализ экспрессии PVY ' -CP гена в трансгенных растениях табака и картофеля.

3.5.2 Вестерн-блотгинг анализ экспрессии PVT ' -CP гена в трансгенных растениях табака.

3.5.3. Вестерн-блотгинг анализ экспрессии PVYVTN-CP гена в трансгенных растениях картофеля.

3.5.4. Изучение стабильности экспрессии PVYNM-CP гена в трансгенных растениях табака и картофеля.

3.6. Определение вирусоустойчивости трансгенных растений табака

N. tabacum L.

3.6.1. Определение вирусоустойчивости с помощью механической инокуляции в тепличных условиях.

3.6.2. Определение вирусоустойчивости в полевых условиях.

3.7. Определение вирусоустойчивости трансгенных растений картофеля

S. tuberosumh.

3.7.1. Определение вирусоустойчивости с помощью механической инокуляции в тепличных условиях.

3.7.2. Определение вирусоустойчивости в полевых условиях.

3.7.3. Определение вирусоустойчивости с помощью прививки на инфицированные YBKwm растения.

3.8. Изучение химического состава клубней и хозяйственно-ценных свойств трансгенных растений картофеля.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Получение микроклубней картофеля в условиях асептической культуры

4.2. Трансформация и регенерация растений картофеля S. tuberosum L.

4.3. Трансформация и регенерация растений табака N. tabacum L.

4.4. Экспрессия PVYvm-CP гена в трансгенных растениях табака и картофеля

4.5. Вирусоустойчивость трансгенных растений табака и картофеля.

4.5.1. Фенотипическое проявление патоген-опосредованной вирусоустойчивости трансгенных растений.

4.5.2. Зависимость степени патоген-опосредованной вирусоустойчивости от уровня экспрессии CP в трансгенных растениях табака и картофеля.

4.5.3. Штаммоспецифичность вирусоустойчивости трансгенных растений, опосредованной РУУут-CP геном YBKwm.

4.5.4. Механизм патоген-опосредованной вирусоустойчивости трансгенных растений.

4.5.5. Патоген-опосредованное подавление супрессии РНК-интерференции в вирусоустойчивых трансгенных растениях.

4.6. Практическое значение патоген-опосредованной вирусоустойчивости трансгенных растений.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Трансгенез PVYntn-CP геном белка оболочки Y вируса картофеля для создания вирусоустойчивых растений»

Актуальность проблемы. Вирусные болезни растений вызывают большие потери урожая экономически важных сельскохозяйственных культур во всем мире [Росс, 1989; Иванюк с соавт., 2005].

Из 30-и с лишним вирусов, которыми поражаются растения табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solarium tuberosum L., Y-вирус картофеля (YBK) в настоящее время является наиболее экономически значимым. YBK, впервые описанный Смитом в 1931 году [Smith, 1931], до сих пор является наиболее опасным патогеном картофеля. При высадке инфицированных YBK семенных клубней картофеля снижение урожайности культуры составляет от 30 до 85%, а в некоторых случаях достигает 100%, по сравнению с урожайностью свободного от вирусов семенного материала [Шпаар, 2004; Иванюк с соавт., 2005]. YBKW и другие некротические штаммы этого вируса вызывают системный некроз растений табака, что частично или полностью уничтожет его посадки [Kollar et al., 1993]. Штаммы YBKWN и YBKYN~m'8a вызывают некрозы на клубнях, ухудшая товарный вид и пищевую ценность картофеля [Вайдеманн с соавт., 1999; Иванюк с соавт., 2005]. В результате экспансии некротических штаммов YBK многие хорошо известные сорта табака и картофеля потеряли свою привлекательность для сельскохозяйственного производства [Horvath et al., 1999; Zagorska et al., 2000; Basky, 2002].

Семеноводство картофеля на безвирусной основе, позволяющее получать свободный от вирусов посадочный материал, является сложным и дорогостоящим мероприятием. Схема защиты от перезаражения растений чаще всего строится на многократном применении инсектицидов для уничтожения переносчиков вирусов — крылатых тлей [Solomon-Blackburn et al., 2001b; Zamalieva et al., 2007]. Интенсивное применение химических средств защиты - не только дорогостоящее, но и небезопасное для окружающей среды и людей мероприятие.

Такие эпидемиологические особенности YBK, как способность к переносу разными видами крылатых тлей, а также появление все новых штаммов фитопатогена затрудняют его диагностику, селекцию на устойчивость и борьбу с вирусом. Успехами селекции последних лет доказана возможность выведения вирусоустойчивых сортов картофеля. Источниками устойчивости служат примитивные дикие виды и культурные сорта картофеля, несущие гены устойчивости [Росс, 1989; Solomon-Blackburn et al., 2001а]. Методы классической селекции имеют ряд ограничений, главным из которых является длительность создания вирусоустойчивых сортов. Новые возможности в создании устойчивых к вирусам сортов картофеля открываются в связи с разработкой способов получения трансгенных растений. Для создания трансгенной вирусоустойчивости используются разные фрагменты генома самого вируса. Среди всех функциональных последовательностей вируса для трансформации растений наиболее широко используется ген белка оболочки вируса. В 1986 году было обнаружено- появление устойчивости растений табака к вирусу табачной мозаики при внедрении в растение гена белка оболочки этого вируса [Powell-Abel et al., 1986]. Впоследствии подобная устойчивость была получена в отношении вирусов различных таксономических групп у наиболее распространенных сортов табака и картофеля [James, 1998; Solomon-Blackburn et al., 2001b].

На основании вышесказанного особую актуальность приобретает создание устойчивых к вирусам трансгенных растений табака и* картофеля, несущих ген белка оболочки особо опасного некротического штамма YBK. Оценка эффективности регенерации растений табака и картофеля, трансформированных с помощью Agrobacterium tumefaciens, будет иметь большое теоретическое и практическое значение для повышения эффективности генетической трансформации экономически важных сельскохозяйственных культур. Изучение вирусоустойчивости трансгенных растений позволит углубить понимание механизмов взаимоотношения в системе растение-вирус, что в свою очередь поможет в разработке новых подходов защиты от опасных фитопатогенов. Создание и комплексный анализ трансгенных растений с новыми биологическими свойствами имеет важное значение для биохимии, молекулярной биологии растений, а также для использования таких растений в сельскохозяйственном производстве. Культивирование вирусоустойчивых растений имеет большое значение в локальном и глобальном масштабах для сохранения биоразнообразия сортов сельскохозяйственных культур, обладающих уникальными свойствами, но исчезнувших с производства в связи с распространением опасных фитопатогенов. Прямое практическое значение будет иметь повышение вирусоустойчивости перспективных сортов табака и картофеля, и тем самым восстановление их привлекательности для сельскохозяйственного производства.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось создание устойчивых к вирусам трансгенных растений табака Nicotiana

JT\T tabacum L. и картофеля Solanum tuberosum L., несущих PVY 1 -CP ген белка оболочки штамма кольцеобразного некроза клубней Y-вируса картофеля.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Оценить эффективность регенерации растений из разных видов эксплантов табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solanum tuberosum L. для использования в генетической модификации растений с помощью агробактериальной трансформации.

2. Провести генетическую трансформацию растений табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solanum tuberosum L. PVYNTN-CP геном белка оболочки штамма кольцеобразного некроза клубней Y-вируса картофеля. ууу

3. Показать интеграцию и экспресию PVY -CP гена в канамицин-устойчивых регенерантах табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solanum tuberosum L.

4. Выявить устойчивые к вирусам трансгенные растения табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solarium tuberosum L., несущие ген PVYNTN-СР.

5. Выявить и охарактеризовать тип устойчивости трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solatium tuberosum L., несущих ген PVYS1^-CP.

Научная новизна. Генная конструкция pGAYHCP, содержащая ген PVYSIN-CP, клонированный из венгерского изолята штамма YBKNTN кольцеобразного некроза клубней, впервые была использована для генетической трансформации растений картофеля S. tuberosum L. Растения сортов картофеля S. tuberosum L. Минденеш и Самодий кифли, и сортов табака N. tabacum L. Вирджин Д, Стамм С2 и Хевеши 11 были впервые вовлечены в эксперимент по созданию генетически модифицированных растений. Была показана эффективность использования дисков микроклубней картофеля сортов Минденеш и Самодий кифли для трансформации с помощью Agrobacterium tumefaciens.

Впервые получены трансгенные растения табака и картофеля, несущие ген pyyNTN'ср YBKWN. Проведены комплексные молекулярно-биохимические исследования полученных трансгенных растений табака и картофеля. Установлен разный уровень экспрессии CP гена в независимых линиях трансгенных растений табака и картофеля.

Проведены комплексные (лабораторные и полевые) исследования вирусоустойчивости трансгенных растений, несущих PVYSTN-CP ген YBFCVTlV, к двум штаммам YBK (YBK°/C, YBKWN), принадлежащим к разным серотипам. Впервые показано проявление патоген-опосредованной крайней вирусоустойчивости у трансгенных растений, полученных при генетической трансформации растений табака сортов Вирджин Д, Стамм С2 и Хевеши 11, и картофеля сортов Минденеш и Самодий кифли генной конструкцией, vr7"*vr Y7'V содержащей руу -СР ген YBK". Результаты настоящей работы свидетельствуют о сохранении хозяйственно-ценных признаков исходных сортов у вновь созданных трансгенных линий. Показано существенное повышение урожайности и качества получаемой продукции у созданных растений трансгеных линий табака и картофеля.

Практическая значимость. Перспективы внедрения результатов работы определяются двумя аспектами: экономической значимостью картофеля и огромной вредоносностью YBK. В мировом масштабе картофель занимает 4-ое место по объемам производства. Во многих странах он составляет основу продовольственной безопасности. Картофель — универсальная сельскохозяйственная культура, также служит сырьем для пищевого и промышленного производства. В связи с этим снижение опасности системных последствий распространения болезней, вызываемых YBK, реально уменьшит негативное влияние на экономику стран -производителей картофеля. Полученные трансгенные растения табака и картофеля, обладающие крайней устойчивостью к YBK, Moiyr быть использованы в виде новых сортов в сельскохозяйственном производстве и вовлечены в селекционные программы по созданию вирусоустойчивых сортов табака и картофеля методами традиционной селекции. В целом, проведенная работа служит наглядным примером сохранения биоразнообразия сортов сельскохозяйственных культур, обладающих уникальными свойствами, но исчезнувших с полей из-за с распространения опасных фитопатогенов.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования: Работа проводилась в соответствии с «Программой фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации» на 2001-2005 гг. и тематическим планом НИР КГУ (№ гос. регистрации 01.2.006.09683 «Механизмы регуляции функциональной активности клетки») Авторские исследования, в рамках которых были созданы трансгенные растения, получили персональную поддержку программ UNESCO/BETCEN и Program Biotechnology 2000, Центра сельскохозяйственной биотехнологии, г.

Гёдёлё, Венгрия. Полевые испытания вирусоустойчивости полученных трансгенных растений, проведенные на базе Института селекции картофеля, г. Кестхей, Венгрия (лицензия на испытания генетически модифицированных организмов № 54.570/3/2000), были подержаны персональным грантом фонда ALF, № LT97560.

Положения, выносимые на защиту:

1. Наиболее эффективно регенерация трансгенных растений, выявленных по признаку канамицин-устойчивости, трех сортов табака (Вирджин Д, Стамм С2, Хевеши 11) происходит из срезов листовых пластинок, а у двух сортов картофеля (Минденеш, Самодий кифли) из дисков микроклубней.

2. Трансгенные растения табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solatium tuberosum L. содержат PVY CP ген и синтезируют белок оболочки штамма кольцеобразного некроза клубней Y-вируса картофеля.

3. Трансгенные растения двух сортов картофеля Solanum tuberosum L. и трех сортов табака Nicotiana tabacum L., несущие PWNTNCP -ген белка оболочки штамма кольцеобразного некроза клубней Y-вируса картофеля обладают устойчивостью к двум штаммам (YBK°/C и YBKvm) Y -вируса картофеля.

4. Восемь независимых линий трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solanum tuberosum L., несущие- PVYn™CP-ген белка оболочки штамма кольцеобразного некроза клубней. Y-вируса картофеля, обладают крайней устойчивостью* к двум штаммам и YBKwn) Y-вируса картофеля.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Итоговой отчетной конференции Института ботаники " Institute of Botany annual report" (Вильнюс, 1998), I Всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям (Санкт-Петербург, 2002), XIII Международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005), Международной научнопрактической конференции «Актуальные вопросы защиты картофеля, плодовых и овощных культур от болезней, вредителей и сорняков» (Минск, 2005), 10-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2006), Международном конгрессе «Картофелеводство России: актуальные проблемы науки и практики» (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Повышение эффективности растениеводства и животноводства - путь к рентабельному производству» (Казань, 2008), 17-ой конференции Европейской Ассоциации по исследованиям картофеля (Брашов, 2008), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых (Казань, 2008), XIV Международной конференции, посвященной 20-летию партнерства между Казанским государственным университетом и Гиссенским университетом им Ю. Либиха Российско-германской международной конференции «Развитие междисциплинарных исследований: перспективные направления и вклад DAAD» (Казань, 2009), а также на итоговых научных конференциях ГНУ ТатНИИСХ (2001-2008) и научных семинарах кафедры микробиологии Казанского государственного университета (2008, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 24 научные работы.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, включает 20 таблиц, 16 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 237 источников, из них 219 на иностранном языке.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Сташевски, Зенон

выводы

1. Установлено, что наиболее эффективно регенерация трансгенных растений, выявленных по признаку канамицин-устойчивости, трех сортов табака Nicotiana tabacum L. (Вирджин Д, Стамм С2, Хевеши 11) происходит из срезов листовых пластинок, а у двух сортов картофеля Solanum tuberosum L. (Минденеш, Самодий кифли) из дисков микроклубней.

2. Впервые получено 116 линий канамицин-устойчивых регенерантов табака Nicotiana tabacum L. сортов Вирджин Д, Стамм С2, Хевеши 11 и 41 линия канамицин-устойчивых регенерантов картофеля Solanum tuberosum L. сортов Минденеш и Самодий кифли, свидетельствующих об успешной генетической трансформации растений табака и картофеля PVTWN-CP геном белка оболочки штамма кольцеобразного некроза клубней Y-вируса картофеля.

3. Методом ПЦР показана интеграция PVYWN-CP гена в 114 (98%) из 116 независимых линий канамицин-устойчивых регенерантов табака Nicotiana tabacum L. и в 39 (95%) из 41 независимых линий канамицин-устойчивых регенерантов картофеля Solanum tuberosum L., потдверждающая высокую эффективность генетической конструкции и метода генетической трансформации.

4. Методами нозерн-блоттинг гибридизации и вестерн-блоттинг угу гибридизации показана экспрессия PVY '-CP гена в 89 (78 %) из 114 независимых линий трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. и в 35 (90%) из 39 независимых линий трансгенных растений картофеля Solanum tuberosum L.

5. Установлен полиморфизм трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solanum tuberosum L., несущих ген PVYntn-CP по признаку вирусоустойчивости и механизму проявления признака, позволивший провести отбор трансгенных линий, обладающих крайней степенью защиты от патогена.

6. Выявлено 5 (4%) из 114 линий трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. и 3 (8%) из 39 линий трансгенных растений картофеля Solanum tuberosum L., несущих ген PVY*™-CP, обладающих крайней устойчивостью к двум штамам (YBK°/C и YBKNTN) Y-вируса картофеля, пригодных для использования в сельскохозяйственном производстве.

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю проф. О.Н. Ильинской за поддержку и внимательное отношение к работе; проф. Э. Балашу и доктору Л. Попковичу (Центр Сельскохозяйственной Биотехнологии, Гёдёлё, Венгрия) за научно-методическое сопровождение работы; доктору X Шандору (Институт селекции картофеля, Кестхей, Венгрия) за техническое сопровождение полевых испытаний; проф. К. Цеминису и доктору Ю. Просцявичюсу (Институт Ботаники, Вильнюс, Литва) за организационно-финансовую поддержку проекта.

Заключение

Биологические особенности клеточных паразитов растений,, каковыми являются вирусы, определяют их массовое распространение и высокую вредоносность, а также исключительно сложную систему защиты от данных фитопатогенов. За последние 30 лет достигнуты значительные- успехи в изучении организации генома-,и пептидной структуры фитовирусов,. а также биохимических и молекулярных механизмов взаимодействия вирусов и растений-хозяев. Активно ведется поиск генов, определяющих естественную вирусоустойчивость растений, и изучение закономерностей их фенотипического проявления. Сочетание знаний об эпидемиологии вирусов и механизмах естественной устойчивости растений легло в основу системы семеноводства картофеля на безвирусной основе, позволяющей в определенной степени ограничивать вредоносность вирусов. Следует подчеркнуть, что темпы распространения новых, более вредоносных вирусов или штаммов уже известных вирусов, опережают результаты исследований, направленных на разработку эффективных подходов защиты растений, методами классической селекции. Перспективным подходом, позволяющим оперативно реагировать на динамично меняющуюся эпидемиологическую обстановку, является использование генно-инженерных методов при создании вирусоустойчивых растений. Для получения трансгенных вирусоустойчивых растений используются различные гены самого патогена. Анализ данных литературы свидетельствует о перспективности использования феномена патоген-опосредованной вирусоустойчивости для получения трансгенных растений с новыми экономически значимыми биологическими свойствами. Результаты экспериментов по трансгенезу растений генами вирусов позволяют предполагать существование нескольких возможных механизмов устойчивости к патогену (белок-опосредованный и РНК-опосредованный). Следует отметить, что зачастую каждый эксперимент по трансгенезу является уникальным и тем самым расширяет понимание ключевых механизмов проявления вирусоустойчивости. Обобщение приведенных данных литературы позволяет нам обоснованно считать, что патоген-опосредованная, вирусоустойчивость, определяемая геном CP вируса, является эффективным подходом к конструированию трансгенных растений, обладающих стабильным проявлением признака вирусоустойчивости. В связи с вышеизложенным основное внимание в работе уделено созданию и исследованию трансгенных растений экономически важных культур картофеля и табака, несущих PVYNTN-CP ген устойчивых к одному из наиболее опасных фитопатогенов — YBK.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Вирусные штаммы и вектор для генетической трансформации

Для создания генной конструкции был использован Венгерский изолят PVY-H некротического штамма вызывающий образование кольцевых некрозов на клубнях картофеля [Beczner et al., 1984]. Использованная для агробактериальной трансформации генная конструкция pGAYHCP была создана ранее Коллар с соавторами [Kollar et al., 1993], в у J. у wmw результате клонирования PVY 1 -CP гена белка оболочки YBK ' [Thole et al., 1993] в вектор pGA482 [An et al., 1986] для трансформации растений. Генная

JT\I конструкция pGAYHCP содержит ген под контролем промотора PcaMv 35S вируса мозаики цветной капусты и селективный маркерный ген NTP II для растений, обуславливающий устойчивость к антибиотику канамицину, в пределах Т-ДНК области (рисунок 3). Трансформацию растений табака и картофеля проводили с использованием Gram- С58С1 (Rif) штамма Agrobacterium tumefaciens [Zambryski et al., 1983].

Для вирусологического анализа использовали растворы очищенных вирусных частиц двух штаммов

YBKn™ (изолят D-10) и YBK°/C (изолят Ка

49) [Wolf et al., 2000].

Рисунок 3 - Схема Т-ДНК вектора для экспрессии PVYwm-CP гена в растениях. LB и RB - левая и правая границы Т-ДНК, соответственно; Рсаму 35S rr\T

35S промотор вируса мозаики цветной капусты; PVY 1 -CP — ген белка оболочки pvyntn

Tnos - терминатор гена нопалинсинтазы A. tumefaciens, Pnos - промотор гена нопалинсинтазы A. tumefaciens, NTP II - ген неомицин-фосфотрансферазы II, селективный маркерный ген для растений.

2.2. Растительный материал

2.2.1. Растения картофеля Solanum tuberosum L.

Растения картофеля Solanum tuberosum L. двух сортов венгерской селекции Минденеш (М) и Самодий кифли (SK) были использованы для создания трансгенных растений. Оба сорта характеризуются низкой уудГ устойчивостью к ybk 1. При заражении растений данных сортов штаммом ybkwtn на клубнях образуются некротические кольца. Асептические, безвирусные растения вышеуказанных сортов были получены из Института селекции картофеля (г. Кестхей, Венгрия), ^трансформированные растения картофеля выращивали на питательной среде МСК (таблица 6). Микроклубни получали в асептической культуре на микрочеренках растений картофеля, высаженных на питательной среде МСИК (таблица 6) [Borque et al., 1987]. Колбы (100 мл) с микрочеренками инкубировали при +19°С в темноте.

2.2.2. Растения табака Nicotiana tabacum L.

Растения табака Nicotiana tabacum L., использованные для создания трансгенных растений, были представлены германским сортом Вирджин Д (VD), германским гибридом Стамм С2 (SC) и венгерским сортом Хевеши 11 (НИ). Растения вышеперечисленных сортов и гибрида являются неустойчивыми к YBK°C и YBKwn. Их семена были получены из селекционно-семеноводческой компании Agrotab Breeding and Seed Production Ltd. (г. Дебрецен, Венгрия). Для генетической трансформации использовали в асептической культуре выращенные растения табака. Для этого семена стерилизовали и высевали на искусственную питательную среду МСТ (таблица 7). Стерилизацию семян проводили по следующей методике: 1 минута в 70 % растворе спирта (2 капли TWIN 20), 13 минут в 50% раствор ШРО (содержит NaCIO) (2 капли TWIN 20), 3 раза по 1 минуте в стерильной воде.

2.3. Питательные среды

Питательные среды для культивирования бактерий. A. tumefaciens культивировали в жидкой питательной среде LB (на 1000 мл дистиллированной воды: триптон - 10 г, дрожжевой экстракт - 5 г, NaCl - 10 г, рН 7,0 ). Для приготовления агаризованной питательной среды в LB добавляли 15 г бактериологического агара [Bertani, 1951].

Питательные среды для культивирования растений. За основу питательной среды для выращивания растений табака и картофеля была взята питательная среда Мурасиге и Скуга (МС) (таблица 5) [Murashige et al., 1962]. рН готового раствора солей доводили до 5,7. Добавляли сахарозу, дополнительные компоненты и агар. После автоклавирования в слегка остывшую питательную среду добавляли термочувствительные компоненты.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Сташевски, Зенон, 2009 год

1. Амбросов, А. Л. Вирусные болезни картофеля и меры борьбы с ними. Текст. / А.Л. Амбросов. Мн: Ураджай, 1975. - С. 89.

2. Блоцкая, Ж. Б. Вирусные, вироидные и фитоплазменные болезни картофеля Текст. / Ж. В. Блоцкая. Мн.: Белпринт, 2000. - 119с.

3. Вайдеманн, X. Л. Новый опасный штамм вируса Y картофеля в Европе Текст. / X. Л. Вайдеманн, Д. Шпаар, Ж. В. Блоцкая // Изв. Акад. Аграрных наук Респ. Беларусь. 1999. - Т. 1. - С. 48-51.

4. Дрейпер, Дж. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство Текст. : [пер. с англ.] / под ред. Дж. Дрейпер, Р. Скотт, Ф. Армитидж, Р. Уолден. М. : Мир, 1991.-408 с.

5. Дьяков, Ю. Т. Общая и молекулярная фитопатология Текст. / Ю. Т. Дьяков, О. Л. Озерецковская, В. Г. Джавахия, С. Ф. Багирова. М.: Общество фитопатологов, 2001. - 302 с.

6. Замалиева, Ф. Ф. Система семеноводства картофеля на оздоровленной основе в республике Татарстан Текст. / Ф.Ф. Замалиева, Г.Ф. Сафиуллина, P.P. Назмиева, 3. Сташевски, 3.3. Салихова // Вестник защиты растений. -2006.-№1.-С. 50-55.

7. Зыкин, А. Г. Тли переносчики вирусов картофеля Текст. / А.Г. Зыкин. -Л.: Колос, 1970.-71 с.

8. Зыкин, А. Г. Вирусные болезни картофеля Текст. / АТ\ Зыкин. Л.: Колос, 1976 - 77 с.

9. Ивановский, Д: Uber die Mosaikkrankheit der Tabakpflanze Текст. 7 Д. Ивановский, // Bull. Acad. Imp. Sci. St. Petersburg. 1892. - V. III. - P. 35-65.

10. Иванюк, В. Г. Защита картофеля, от болезней, вредителей и сорняков Текст. / В. Г. Иванюк, С. А. Банадысев, Г. К. Журомский. Мн.: Белпринт, 2005. - 696с. - ISBN 985-459-060-7.

11. Карамова, Н. С. Мутагенное действие экстрактов растений картофеля S. tuberosum L., обработанных пестицидами Текст. / Н.С. Карамова, 3.

12. Сташевски, А. П. Денисова // Ученые записки Казанского университета Сер. Естеств. Науки. 2009. - Т. 151. кн. 1. С. 155-163.

13. Мэтьюз, P. Вирусы растений Текст. : [пер. с англ.] / Р. Мэтьюз. М. : Мир, 1973. - 600 с. - Перевод изд.: Plant Virology / R. Е. F. Matthews. - New York and London: Academic Press, 1970.

14. Росс, X. Селекция картофеля. Проблемы и перспективы Текст. : [пер. с англ.] / X. Росс. М.: ВО "Агропромиздат", 1989. - 183 с. - Перевод изд.: Potato Breeding - Problems and Perspectives / H. Ross. — Berlin and Hamburg: Verlag Paul Parey, 1986.

15. Шпаар, Д., Картофель: Выращивание уборка, хранение Текст. / под ред. Д. Шпаар, А. Быкин, Д. Дрегер и др. Торжок: ООО «Вариант», 2004. -466 с.

16. Шуберт, Й. К проблеме диагностики штаммов Y-вируса картофеля (PVY) Текст. / Й. Шуберт, Ф. Рубенштайн, М. Хрцановска, Д. Шпаар // Вестник защиты растений. — 2004. Т. 3. — С. 3-10.

17. An, G. Transformation of tobacco, tomato, potato, and Arabidopsis thaliana using a binary Ti vector system Text. / G. An, B. D. Watson, С. C. Chiang // Plant Physiology. 1986.-V. 81.-P. 301-305.

18. Atreya, C. D. A point mutation in the coat protein abolishes aphid transmaissibility of a potyvirus Text. / C.D. Atreya, B. Raccah, T.P. Pirone // Virology.^ 1990.-V. 178.-P. 161-165.

19. Bantounas, I. RNA interference and the use of small interfering RNA to study gene function in mammalian systems Text. /1. Bantounas, L. A. Phylactou, J. B. Uney // J. Mol. Endocrinology. 2004. - V. 33. - P. 545-557.

20. Barker, H. Expression of genes for resistance to potato virus Y-potato plants and protoplasts Text. / H. Barker, B. D. Harrison // Ann. Appl. Biol. 1984. - V. 105.-P. 531-545.

21. Barker, H. The development of resistance to luteoviruses mediated by host genes and pathogen-derived transgenes Text. / H. Barker and P. M. Waterhouse //

22. The Luteoviridae / Eds. H. G. Smith, H. Barker. Wallingford: CAB International, 1999.-P.-139-163.

23. Barnett, O. W. A summary of potyvirus taxonomy and definitions Text. / O. W. Barnett // Potyvirus Taxonomy. New York : 1992. - P. 435-444.

24. Bartels, R. Symptoms bildung von viren der Kartoffel-Y-Gruppe, auf A6 Blatten P. R. Text. / R. Bartels // Potato Res. 1970. - V. 13 - P. 119-128.

25. Basky, Z. The relationship between aphid dynamics and two prominent potato viruses (PVY and PLRV) in seed potatoes in Hungary Text. / Z. Basky // Crop Protection. 2002. - V. 21. - P. 823-827.

26. Baulcombe, D. Replicase-mediated resistance, a novel type of virus resistance in transgenic plants Text. / D. Baulcombe // Trends Microbiol. — 1994. -P. 60-63.

27. Baur, E. Zur Aetiologie der infectiosen Panachierung Text. / E. Baur // Ber. Deut. Botan. Ges. 1904. - V. 22. - P. 453-460.

28. Beachy, R. N. Mechanisms and applications of pathogen-derived resistance in transgenic plants Text. / R. N. Beachy // Current Opinion in Biotechnology. -1997.-V. 8.-P. 215-220.

29. Beczner, L. Studies on the etiology of tuber necrotic ringspot disease in potato Text. / L. Beczner, J. Horvath, I. Romhanyi, H. Forster // Potato Res. -1984.-V. 27. -P: 339-352.

30. Beekman, A. G. B. Breeding for resistance Text. / A. G. B. Beekman // Viruses of potatoes and seed-potato production / Eds. J. A. de Bokx, J. P. H. van der Want. Wageningen: PUDOC, 1987. - P. 162-170.

31. Beijrinck M. W. Over een contagium vivum fluidum als oorzaak van de vlekziekte der tabaksbladen Text. / M. Beijrinck // Afdel. Wis-Natuurk. 1898. -V. 7.-P. 229-235.

32. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli Text. / G. Bertani, // J. Bacteriol. 1951. - V. 62. - P. 293-300.

33. Bonness, M. S. Pokeweed antiviral protein inactivates pokeweed ribosomes; implications for the antiviral mechanism Text. / M. S. Bonness, M. P. Ready, J. D. Irvin, T. J. Mabry // The Plant Journal. 1994. - V. 5. - P. 173-183.

34. Borque, J. E. Use of an in vitro tuberization system to study tuber protein gene expression Text. / J. E. Borque, J. C. Miller, W. D. Park // In Vitro Cellular and Development Biology. 1987. - V. 23. - P. 381-386.

35. Braun, C. J. Expression of amino-terminal portions of full length viral replicase genes in transgenic plants confers resistance to potato virus X infection Text. / C. J Braun, C. L. Hemenway // Plant Cell. 1992. - V 4. - P. 735-744.

36. Brigneti, G. Molecular mapping of the potato virus Y resistance gene Ryst0 in potato Text. / G. Brigneti, J. Garsia-Mas, D. C. Baulcombe // Theor. Appl. Genet. 1997.-V. 94.-P. 198-203.

37. Broadbent, L. The epidemiology of tomato mosaic. VII. The effect of TMV on tomato fruit yield and quality under glass Text. / L. Broadbent // Ann. Appl. Biol. 1964. - V. 54. - P. 209-224.

38. Brown, C. R. Selection for resistance to PVX and PVY in tetraploid potato populations Text. / C.R. Brown, E. N. Fernandez-Northcote // Am. Pot. J. 1981. -V. 58. - P. 536-537.

39. Burton, W. G. The Potato 3rd ed. Text. / W. G. Burton. Singapore : Longman Technical and Scientific, 1989. - 742 p.

40. Carrington, J. C. A viral cleavage site cassette : identification of amino acid sequences required for tobacco etch virus polyprotein processing Text. / J. C. Carrington, W. G. Dougherty // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - V. 85. - P. 3391-3395.

41. Carrington, J. C. A second proteinase encoded by plant potyvirus Text. / J.

42. C. Carrington, S. M. Сагу, T. D. Parks, W.G. Dougherty // EMDO J. 1989a. - V. 8.-P. 365-370.

43. Carrington, J. C. Autocatalytic processing of the potyvirus helpercomponent proteinase in Escherichia coli and in vitro Text. / J. C. Carrington, D.

44. D. Fried, Т. C. Sanders // J. Virology. 1989b. - V. 63. - P. 4459-4463.

45. Chapman, S. N. Potato virus X as a vector for gene expression in plants Text. / S. N. Chapman, T. A. Kavanagh, D. C. Baulcombe // Plant J. 1992. - V. 2.-P. 549-557.

46. АН, Т. Maoka, К. T. Natsuaki // Virus Genes. 2007a. - V. 35. - P. 359-367.

47. Chikh Ali, M. The occurrence and characterization of new recombinantiisolates of PVY displaying shared'properties of PVYNW and PVYN™ Text. / M. Chikh Ali, T. Maoka, К. T. Natsuaki // J. Phytopathology. 2007b. - V. 155. - P. 409-415.

48. Chikh Ali, M. Whole Genome Sequence and Characterization of a Novel Isolate of PVY Inducing Tuber Necrotic Ringspot in Potato and Leaf Mosaic in

49. Tobacco Text. / M. Chikh Ali, T. Maoka, К. T. Natsuaki // J. Phytopathology. -2008.-V. 156.-P. 413-418.

50. Chrzanowska, M. Nowe izolaty wirusa Y zagrazajace ziemniakom w Polsce Text. / M. Chrzanowska // Hodowla Roslin I Nasiennictwo. 1987. - T. 5-6. - S. 8-11.

51. Chrzanowska, M. New isolates of necrotic strain of Potato virus Y СPVYn) found recently in Poland Text. / M. Chrzanowska // Potato Research. 1991. - V. 34.-P. 179-182.

52. Clark, M. F. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses Text. / M. F. Clark, A.N. Adams // J. Gen. Virol. 1977. - V. 34. - P. 475-483.

53. Cockerham, G. Genetical study on resistance to potato viruses X and Y Text. / G. Cockerham // Heredity. 1970. - V. 25 - P. 309-348.

54. Commoner, B. Linear biosynthesis of tobacco mosaic vims. Development and test of a model Text. / B. Commoner // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. 1962. -V. 48.-P. 2076-2083.

55. De Bokx, J. A. Potato virus Y Text. / J. A. De Bokx, H. Huttinga // Descriptions of Plant Viruses, no. 242; eds. B. D. Harrison, A. F. Murant. -Wellesbourne: Commonwealth Mycological Institute, Kew and Association of Applied Biologists, 1981. P. 27-33.

56. Delhey, R. Zur Natur der extremen Virusresistenz bei der Kartoffel I. Das X-Virus Text. / R. Delhey'// Phytopath. 1974. - Z. 80. - P. 97-119.

57. Delhey, R. Zur Natur der extremen Virusresistenz bei der Kartoffel I. Das Y-Virus Text. / R. Delhey // Phytopath. 1975. - V. 80. - P. 97-119.

58. Donnelly, D. Potato microtuber production and performance: A review Text. / D. Donnelly, W. K. Coleman // Am. J. Potato Res. 2003. - V. 80. - P. 103-115.

59. Dougherty, W. G. Expression and function of polyviral gene products Text. / W. G. Dougherty, J. C. Carrington // Annu. Rev. Phytopathology 1988. - V. 26. -P. 123-143.

60. Edwardson, J.R. Some properties of the potato virus Y-group Text. / J.R.Edwardson // Fla. Ageic. Exp. Stn. Monogr. 1974. - Ser. 4. - 225 p.

61. Ellis, P. Production of monoclonal antibodies for detection and identification of strains of potato virus Y Text. / P. Ellis, R. Stace-Smith, G. Bowler, D. J. Mackenzie // Canadian J. Plant Pathol.- 1996. V.l 8. - P. 64-70.

62. Feher, A. Expression of 9. PVX coat protein gene under the control of extensin-gene promoter confers virus resistance on transgenic potato plants Text. / A. Feher, G. K. Skryabin, , E. Balazs [et al.] // Plant Cell Report. 1992. - V. 11. -P. 48-52.

63. Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans Text. / A. Fire, S. Xu, , M.K. Montgomery, S.A. Kostas, S.E. Driver, C.C. Mello // Nature/ 1998. - V. 391. - P. 806-811.

64. Freankel-Conrat, H. Reconstitution of active tobacco mosaic virus from its inactive protein and nucleic acid components Text. / H. Freankel-Conrat, R. C. Williams // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 1955. - V. 41. - P. 690-698.

65. Garcia, J. A. Proteolytic activyti of the plum box potyvirus NIa-protein in Escherichia coli Text. / J. A. Garcia, J. L. Riechmann, S. Lain // Virology. -1989a. V. 170. - P. 362-369.

66. Garcia, J. A. Artificial cleavage site recognized by plum box potyvirus protease in Escherichia coli Text. / J. A. Garcia, J. L. Riechmann, S. Lain // J. Virology. 1989b. -V. 170. - P. 2457-2460.

67. Garcia, J. A. Proteolytic activyti of the plum, box potyvirus NIa-protein on excess nftur'al and artificial subctrates in Escherichia coli Text. / J. A. Garcia, J. L. Riechmann, M. T. Martin, S. Lain // FEBS Lett. 1989c. - V. 257. - P. 269273.

68. Garcia, J. A. Mutational analysis of the plum pox potyvirus polyprotein processing by the NIa protease in Escherichia coli Text. / J. A. Garcia, S. Lain, M. T. Cervera, J. L. Riechmann, M. T. Martin // J. Gen. Virology. 1990. - V. 71. -P. 2773-2779.

69. Gibson, R. W. The resistance of three Solanum species to Myzus persicae, Macrosiphum euphorbiae and Aulacortbum solani (Aphididae: Homoprotera) Text. / R. W. Gibson // Annual Applied Biology. 1971. - V. 68. - P. 245-251.

70. Gibson, R. W. The development of mature plant resistance in four potato cultivars against aphid-inoculated potato virus Y° and YN Text. / R. W. Gibson // Potato Res. 1991. - V. 34. - P. 205-210.

71. Gibson, R. W. Wild potato repels aphids by release of aphid alarm pheromones Text. / R. W. Gibson, J. A. Pickett // Nature. 1983. - V. 302. - P. 608-609.

72. Golemboski, D. B. Plants transformed with tobacco mosaic virus nonstructural gene sequence are resistant to the virus Text. / D. B. Golemboski, G. P. Lomonosoff, M. Zaitlin // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1990. - V. 87. - P. 6311-6315.

73. Gonsales, D. Coat-protein-mediated protection: analysis of transgenic plants for resistance in a variety of crops Text. / D. Gonsalves, J.L. Slightom, // Semin. Virol. 1993. - V. 4. - P. 397-405.

74. Goodwin, J. Genetic and biochemical dissection of transgenic RNA-mediated virus resistance Text. / J. Goodwin, K. Chapman, S. Swaney, T. D. Parks, E. A. Wersman, W. G. Dougherty // Plant Cell. 1996. - V. 8. - P. 95-105.

75. Govier, D.A. A virus-induced component in plant needed when aphids acquire potato virus Y from purified preparations Text. / D.A. Govier, B. Kassanis // Virology. 1974. - V. 61. - P. 420-426.

76. Graham^ M. W. The search for the perfect potato Text. / M. W.- Graham, P. Keese, P. M. Waterhouse // Today's Life Sci. 1995. - V. 7. - P. 34-41.

77. Gunasinghe, U. B. Association of potato Y gene products with chloroplasts in tobaccoText. / U. B. Gunasinghe, P. H. Berger // Mol. PI. Microbe Interact. -1991.-V. 4.-P. 452-457.

78. Halford, N.G. Prospects for genetically modified crops Text. / N.G. Halford // Annals of Applied Biology. 2004. - V. 145. - P. 17-24.

79. Hamilton, A. J. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants Text. / A. J. Hamilton, D. C. Baulcombe // Science. 1999. -V. 286.-P. 950-952.

80. Hari, V. The RNA of tobacco etch virus : further characterization and detection of protein linked to RNA Text. / V. Hari // Virology. 1981. - V. 112. -P. 391-399.

81. Hari, V. The RNA of tobacco etch virus contains poly (A) Text. / V. Hari, A. Siegel, C. Rozek, W.E. Timberlake // Virology. 1979. - V. 92. - P. 568-571.

82. Harrison, H. Virus structure Text. / H. Harrison, D. C. Wiley, J. J. Skehel // Fields Virology ; B. N. Fields, D. N. Knipe, P.M. Howley. N. Y. : Lippincott-Raven, 1996.-P. 59-100.

83. Hay, J.M. Nucleotide sequence of the coat proteine gene of the necrotic strain of potato virus Y from New Zealand Text. / J.M. Hay, A.P. Fellowes, G.M. Timmerman // Archives of Virology. 1989. - V.107. - V. 111-122.

84. Hellmann, G.M. In vitro analysis of tobacco vein mottling virus NIa cistron: evidence for a vims- encoded protease Text. / G.M. Hellmann, J. G. Shaw, R.E. Rhoads // Virology. 1988. - V.163. - V. 554-562.

85. Hemenway, С. Analysis of the mechanism of protection in transgenic plants expressing the potato virus X coat protein or its antisense RNA Text. / C. Hemenway, R. F. Fang, W. K. Kaniewski, N. H. Chua, N. E. Turner // EMBO J. -1988. V.7. - V. 1273-1280.

86. Hiebert, E. Characterization of some proteins assotiated with viruses in the potato Y group Text. / E. Hiebert,'J. G: McDonald // Virology. 1973. - V. 56. -P. 349-361.

87. Hinostroza-Orihuela, A. M. Some characteristics of infectious RNA from potato virus Y Text. / A. M. Hinostroza-Orihuela // Virology. 1975. - V. 67. -P. 276-278.

88. HoIIings, M. Potyviruses Text. / M. Hollings, A. A. Brunt // Handbook of

89. Plant Virus Infections : Comparative Diagnosis ; eds. E. Kurstac. Amsterdam:

90. Elsevier/North Holland, 1981. P. 731-807.

91. Horsch, R. B. Leaf disc transformation Text. / R. B. Horsch, J. Fry, N. Hoffman, J. Neidermeyer, S. G. Rogers, Rr. T. Fraley // Plant Molecular Biology Manual. 1988: -V. 5. - P. 1-9.

92. Horvath, S. Virological problems of potato production in Hungary Text. / S. Horvath, I. Wolf // Abstracts of the 14th Conference of the European Association of Potato Research, 1999. P. 383-384.

93. Jarret, R. L. Effects on medium components on shoot formation from cultured tuber discs of potato Text. / R. L. Janet, P. M. Hasegawa, H. T. Erickson // J. Amer. Soc. Hort. Sci. 1980. - V. 105. - P. 238-242.

94. Johnson, R. Specifity in gene-for-gene interactions between plants and pathogens Text. / R. Johnson, D.R. Knott // Plant Pathology. 1992. - V. 41. - P. 1-4.

95. Jones, R. A. C. The ecology of viruses infecting wild and cultivated potatoes in the Andean region of South America Text. / R. A. C. Jones // Pests, Pathogens and Vegetation / Eds. J. M. Thresh London : Pitman Books, 1981. - P. - 87-107.

96. Jones, R. A. C. Strain group specific and virus specific hypersensitive reactions to infection with potyviruses in potato Text. / R. A. C. Jones // Ann.

97. Appl. Biol. 1990. -V. 3. - P. 93-105.

98. Jozsa, R. Potato Virus Y Coat Protein Gene Induced Resistance in Valuable Potato Cultivars Text. / R. Jozsa, Z. Stasevski, I. Wolf, S. Horvath, E. Balazs // Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica. 2002a. - V. 37. - P. 1-7.

99. Jozsa, R. High level of field resistance of transgenic tobaccos induced by integrated potato virus Y coat protein gene Text. / R. Jozsa, Z. Stasevski, E. Balazs // Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica. 2002b. - V. 37. -P. 311-316.

100. Kashiwazaki, S. Nucleotide sequence of the capsid protein gene of barley yellow mosaic virus Text. / S. Kashiwazaki, Y. Hayano, Y. Minobe, T. Omura, H. Hibino, T. Tsuchizaki //Journal of Gen Virology. 1989. -V. 70. - P. 3105-3023.

101. Kawchuk, L. M. Sense and antisense RNA-mediated resistance to potato leafroll virus in Russet Burbank potato plants Text. / L. M. Kawchuk, R. R. Martin, J. Macpherson // J. Mol. Pl.-Microbe Interact. 1991. - V. 4. - P. 247-253.

102. Kerlan, C. Variability of Potato virus Y in Potato crops in Frace Text. / C. Kerlan, M. Tribodet, L. Glais, M. Guillet // J. Phytopathol. 1999. - V. 147. - P. 643-651.

103. Kerr, A. A reply to R. Johnson and D.R. Knott Text. / A. Kerr // Plant Pathology. 1992. - V. 41. - P. 4.

104. Kikuta, Y. Shoot-bud formation and plantlet regeneration in potato tuber tissue cultured in vitro Text. / Y. Kikuta, Y. Okazawa // J. Fac. Agric. Hokkaido Univ.-1982.-V. 61.-P. 166-179.

105. Knorr, D. A. point mutation in the tobacco mosaic virus capsid protein gene induces hypersensitivity to Nicotiana sylvestris Text. / D. A. Knorr and W. O. Dawson//Proc. Natl. acad. Sci. USA- 1988.-V. 85. -P. 170-174.

106. Kollar, A. Efficient pathogen-derived resistance induced by integrated potato virus Y coat protein gene in tobacco Text. / A. Kollar, V. Thole, T. Dalmay, P. Salamon, E. Balazs // Biochimie. 1993. - V. 75. - P. 623-629.

107. Lain, S. The complete nucleotide sequence of plum pox potyvirus RNA Text. / S. Lain, J.L. Riechmann, E. Mendex, J.A. Garcia // Vims Research. -1989.-V. V. 13.-P. 157-172.

108. Lain, S. RNA helicase: a novel activity associated with a protein encoded by a positive strand RNA virus Text. / S. Lain, J.L. Riechmann, J.A. Garcia // Nucleic Acids Reseach. 1990. - V. 18. - P. 7003-7006.

109. Lam, S. L. Shoot formation in potato tuber discs in tissue culture Text. / S. L. Lam // American Potato Journal. 1975. - V. 52. - P.103-106.

110. Lehmann, P. Structure and evolution of plant disease resistance genes Text. / P. Lehmann // J. Appl. Genet. 2002. - V. 43. - P. 403-414.

111. Leiser, R. M. Reinigung und einige Eigenschaften des Kartoffel-YVirus. Text. / R. M. Leiser, J. Richter // Arch. Phytopathology. 1978. - V. 14. - P. 337-350.

112. Le Romancer, M. Biological characterisation of various geographical isolates of potato virus Y inducing superficial necrosis on potato tubers Text. / M. Le Romancer, C. Kerlan, M. Nedellec // Plant. Pathol. 1994. - V. 43. - P. 138-144.

113. Li, H. Strong host resistance targeted against a viral suppressor of the plant gene silencing defence mechanism Text. / H. Li, A. P. Lucy, H. Guo, W. Li, L. Ji, S. Wong, S. Wong, S. Ding// The EMBO Journal.- 1999. V. 18: - P. 26832691.

114. Longstaff, M. Extreme resistance to potato virus X infection in plants expressing a modified component of the putative viral replicase Text. / M.1.ngstaff, G. Brigneti, F. Boccard, S. Chapman, D. Baulcombe // EMBO J. -1993.-V. 12.-P. 379-386.

115. Makkouk, К. M. Characterization of potato Virus Y Strains Isolated from Pepper Text. / К. M. Makkouk, D. J. Gumpf// Phytopathology. 1974. - V. 64. -P. 1115-1119.

116. Malnoe, P. Small-scale field tests with transgenic potato, cv. Bintje, to test resistance to primary and secondary infections with potato virus Y Text. / P. Malnoe, L. Farinelli, G. F. Collet, W. Reust // PI. Mol. Biol. 1994. - V. 25. - P. 963-975.

117. Maule, A. J. Source of natural resistance to plant viruses: status and prospects Text. / A. J. Maule, C. Caranta, M. I. Boulton // Molecular Plant Pathology. -2007.-V. 8.-P. 223-231.

118. Mayer, A. Ueber die Mosaikkrankheit des Tabaks Text. / A. Mayer // Landwirtsch. Versucht-Stationen. 1886. -V. 32. - P. 451-467.

119. McDonald; J. G. Host, range, symptomology and serology of isolates of Potato virus Y (PVY) that shared properties with both the PVYS and PVY° strain groups Text. / J. G. McDonald, R. P. Singh // Am Potato J. 1996a. - V. 73. - P. 309-315.

120. McDonald, J. G. Response of potato cultivars to North American isolates of pyyNTN Texf| / j G McDonald, R. P. Singh // Am Potato J. 1996b. - V. 73. - P. 317-323.

121. Missiou, A. Generation of transgenic plants highly resistant to potato virus Y (PVY) through RNA gene silencing Text. / A. Missiou, K. Kalantidis, A. Boutla, S. Tzortzakaki, M. Tabler, M. Tsagris // Molecular Breeding 2004. - V. 14. - P. 185-197.

122. Moghal, S. M. Towards a system for the identification and classification of potyviruses. I. Serology and amino acid composition of six distinct viruses Text. / S. M. Moghal, R. I. B. Francki // Virology. 1976. - V. 73. - P. 350-362.

123. Mouches, C. Turnip yellow mosaic virus RNA-replicase contains host and virus-coded subunits Text. / C. Mouches, T. Candresse, J. M. Bove // Virology. -1984.-V.134.-P. 78-79.

124. Mueller, E. Homology-dependent resistance, transgenic vims resistance in plants related to homology-dependent gene silencing Text. / E. Mueller, J. Gilbert, G. Davenport, G. Brigneti, D. C. Baulcombe // Plant J. 1995. - V. 7. - P. 1001-1013.

125. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures Text. / T.Murashige and F. Skoog // Physiol Plant. 1962. -V. 15.-P: 473-497.

126. Murphy, J. F. The VPg tobacco etch vims is the 49-kDa proteinase or the N-terminal 24-kDa part of proteinase Text. / J. F. Murphy, R. E. Rhoads, A. G. Hunt, J. G. Shaw // Virology. 1990. - V. 178. - P. 285-288.

127. Plant Viruses Online Potato Y potyvirus Electronic data. - 1996. -Режим доступа : http://image.fs.uidaho.edu/vide/descr652.html. — Дата доступа : 11.10.2001.

128. Ponz, F. Mechanisms of resistance to plant viruses Text. / F. Ponz and G. Bruening // Ann. Rev. Phytopathol. 1988. - V.24. - P. 355-381.

129. Powell-Abel, P. Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene Text. / P. Powell-Abel, R.S. Nelson, B. De [et al.] // Science. 1986. - V. 232. - P. 738-743.

130. Prins, M. Strategies for antiviral resistance in transgenic plants Text. / M. Prins, M. Laimer, E. Noris, J. Shubert, M. Wassenegger, M. Tepfer // Molecular Plant Pathology. 2008. - V. 9. - P. 73-83.

131. Ranalli, P. Microtubers Text. / P. Ranalli // Potato Research'. 2007. - V. 50i-P: 301-304.

132. Ranalli; P. Innovative propagation methods in seed tuber multiplication programs.Text. / P. Ranalli // Potato Research. 1997. - V. 40. - P. 439-453.

133. Rast, A. Th. B. Yield of glasshouse tomatoes as effected by strains of tobacco mosaic Text. / A. Th. B. Rast//Neth. J. PI. Path. 1967.-V. 73.-P. 147-156.

134. Reavy, B. Immunity to potato mop-top virus in Nicotiana benthamiana plants expressing the coat protein gene is effective against fungal inoculations of the vims

135. Text. / В. Reavy, M. Arif, S. Kashiwazaki et al.] // Mol. Pl.-Microbe Interact. -1995.-V. 8.-P. 286-291.

136. Register, J. C. Resistance to TMV in transgenic plants results from interference with an early event in infection Text. / J. C. Register, R. N. Beachy// Virology. 1988. - V. 166. - P. 524-532.

137. Riechmann, J. L. The genome-linked protein and 5'RNA sequence of plum pox virus Text. / J. L. Riechmann, S. Lain, J. A. Garcia // J. Gen. Virology. -1989.- V. 69.-P. 1509-1516.

138. Robaglia, С. M. Nucleotide sequence of potato virus Y (N strain) genomic RNA Text. / С. M. Robaglia, M. Durand-Tardif, G. Tronchet [et al.] // J. Gen. Virology. 1989. - V. 70. - P. 935-947.

139. Ross, H. Major and minor genes in breeding virus-resistant varieties Text. / H. Ross // Proc. Int. Congr. Research for the Potato in the Year 2000. Int. Pot. Center, Lima, 1983. P. 165-166.

140. Rubino, L. Biologically active cymbidium ringspot virus satellite RNA in transgenic plants suppresses accumulation of DI RNA, Text. / L. Rubino, J.C. Carrington, M. Russo // Virology. 1992. - V. 188. - P. 429-437.

141. Saladrigas, М. V. Potato gene X1 confers inoculum dependent resistance to potato virus X replication in protoplasts Text. / M. V. Saladrigas, M. F. Ceriani, A.C. Tozzini, A. I. Arese, H. E. Hopp // Plant Cell Physiology. 1990. - V. 31. -P. 749-755.

142. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual Text. / J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 2nd edition. Cold Spring Harbor, New York : Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. - p.432.

143. Seppaenen, P. Movement protein-derived resistance to triple gene block-containing plant viruses Text. / P. Seppaenen, R. Puska, J. Honkanen, L. G. Tyulkina, O. Fedorkin, S. Y. Morozov [et al.] // J. Gen. Virol. 1997. - V. 78. - P. 1241-1246.

144. Shah, D. M. Resistance to diseases and insects in transgenic plants; progress and applications to agriculture Text. / D. M. Shah, С. Т. M. Rommens, R. N. Beachy // Trends Biotechnol. 1995. - V.13.-P. 362 -368.

145. Shahabuddin, M. Mapping of the tobacco vein mottling virus VPg cistron Text. / M. Shahabuddin, // J.G. 1988. - V. 163. - P. 635-637.

146. Shukla, D. D. Coat protein of potyviruses. 3. Comparision of amino acid sequences of the coat protein of four Austrlian strains of sugareane mosaic virus Text./ D.D. Shukla, K.H. Gough, C.W. Ward // Achives of Virology. 1987. -V.96.-P. 59-74.

147. Shukla, D. D. Amino acid sequence homology of coat proteins as a basis for identification and classification of the potyvirus group Text. / D.D. Shukla, C.W. Ward // Journal of Genetic Virology/ 1988. - V.69. - P. 2703-2710.

148. Shukla, D. D. Structure of potyvirus coat proteins and application in the taxonomy of the potyvirus group Text. / D. D. Shukla, C. W. Ward // Adv. Virus Res. 1989a. - V.36. - P. 273-314.

149. Shukla, D. D. Identification and classification of potyviruses on basis of coat protein sequence data and serology Text. / D. D. Shukla, C. W. Ward // Arch. Virol. 1989b.-V.106.-P. 171-200.

150. Shukla, D. D. Structure and function of potivyrus genome with special reference to the coat protein coding region Text. / D. D. Shukla, M. J. Frenkel, C. W. Ward // Canadian J. Plant Pathology. 1991. - V. 13. - P. 178-191.

151. Siaw, M. F. E. Identification of protein covalently linked to the 5'-terminus of tobacco vein mottling virus RNA Text. / M. F. E. Siaw, M. Shahabuddin, S. Ballard [et al] // Virology. 1985. - V. 142. - P. 134-143.

152. Smith, R. E. New light on curly top of sugar beet Text. / R. E. Smith, P. A. Boncquet // Phytopathology. 1915. - V. 5. - P. 103-107.

153. Smith, К. M. Composite nature of some potato viruses of the mosaic group Text. / К. M. Smith // Nature. 1931. - V. 127. - P. 702.

154. Smith, К. M. Some notes on a suspected variant of Solanum virus 2 (potato virus 2) Text. / К. M. Smith, R. W. G. Dennis // Annal. Appl. Biol. 1940. - V. 27.-P. 65-70.

155. Smith, H. A. Transgenic potato vims Y resistance in potato: Evidence for RNA-mediated cellular responce Text. / H. A. Smith, H. Powers, S. L. Swaney, C. Brown, W. G. Dougherty // Phytopathology. 1995. - V. 85. - P. 864-870.

156. Smith, N. A. Total silencing be intron-spliced hairpin RNAs Text. / N. A. Smith, S. P. Sigh, M. B. Wang, P. A. Stoutjesdijk, A. G. Green, P. M. Waterhouse // Nature. 2000. - V. 407. - P. 319-320.

157. Solomon, R. M. Methods of screening for resistance to potato viruses X and Y Text. / R. M. Solomon // Abstract of 7th Triennial Conf. Eur. Ass. Pot. Res., Warsaw, 1978.-P. 134-135.

158. Solomon, R. M. Screening potato cvs. for major gene resistance to potato viruses X and Y Text. / R. M. Solomon // Ann. Appl. Biol. 1983. - V.102. - P. 134-135.

159. Solomon, R. A possible mechanism for exclusion of plant vimses from embryonic and meristem cultures Text. / R. Salomon // Research Virology. -1989.-V. 1989.-V. 140.-P. 453-460.

160. Solomon, R. The role of the N-terminus of potyvirus coat in aphid transmission Text. / R. Salomon, B. Raccah // Abstracts P83-7 of VIII International Congress of Virology, Berlin, 26-31 August 1990. P. 26-31.

161. Solomon-Blackburn, R. M. A review of host major-gene resistance to potato vimses X, Y, A and V in potato, genes, genetics and mapped locations Text. / R. M. Solomon-Blackbum, H. Barker // Heredity 2001a. - V.86. - P. 8-16.

162. Solomon-Blackburn, R. M. Breeding vims-resistant potatoes (,Solatium tuberosum): a review of traditional and molecular approaches Text. / R. M. Solomon-Blackburn, H. Barker // Heredity 2001b. - V.86. - P. 17-35.

163. Stace-Smith, R. Purification and composition of potato vims Y. Text. / R. Stace-Smith, J. H. Tremaine // Phytopathology. 1970. - V.60. - P. 1785-1793.

164. Stark, D. M. Protection against potyvirus infection in transgenic plants: Evidence for broad spectmm resistance Text. / D. M. Stark, R. N. Beachy // Bio/Technology. 1989. - V.7. - P. 1257-1262.

165. Stirpe, F. Dianthins, ribosome-damaging proteins with anti-viral properties from Dianthus caryophyllus L. (carnation) Text. /F. Stirpe, D. G. Williams, L. J. Onyon, R. F. Legg //Biochem. J. 1981. - V. 195. - P. 399-405.

166. Tacke, E. Genetic engineering of potato for broad-spectrum protection against virus infection Text. / E. Tacke, F. Salamini, W. Ronde // Nature Biotechnol. 1996. V. 14. - P. - 1597-1601.

167. Thole, V. Cloning and sequencing of potato virus Y (Hungarian isolate) genomic RNA Text. / V. Thole, T. Dalmay, J. Burgyan, E. Balazs // Gene.1993.-V. 123.-P. 149-156.

168. Thomas, P. E. Reduced field spread of potato leafroll virus in potatoes transformed with the potato leafroll virus coat protein gene Text. / P. E. Thomas, W. K. Kaniewski, E. C. Lawson // Plant Dis. 1997. - V. 81. - P. 1447-1453.л

169. Thornbury, D. W. Purification and characterization of potyvirus helper component Text. / D.W. Thornbury G.M. Hellmann, R.E. Rhoads, T.P. Prione // Virology. 1985. - V. 144. - P: 260-267.

170. Valkonen, J.P. T. Natural genes and mechanisms for resistance to viruses in cultivated and wild potato species (Solanum spp.) Text. / J. P. T. Valkonen // PI. Breed. 1994. - V. 112. - P. 1-16.

171. Valkonen, J. P. T. Resistance to Myzus persicae (Sulz.) in wild potatoes of the series Etuberosa Text. / J. P. T. Valkonen, G. Brigneti, E. Pehu // PI. Breed.1994.-V. 112.-P. 1-16.

172. Valvekeris, D. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana root explants by using kanamycin selection Text. / J. P. T. Valkonen, G. Brigneti, E. Pehu // PI. Breed. 1994. - V. 112. - P. 1-16.

173. Van.den Elzen, P. J. M. Virus and fungal resistance, from laboratory to field Text. / D. Valvekens, M. Van Montagu^ M." Van Lusebettens // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1988. - V. 85. - P. 5536-5540.

174. Van der Plank, J. E. Specific susceptibilityand species feeding in gene-for-gene systems Text. / J. E. Van der Plank // Adv. Plant Pathology. 1986. - V. 5. -P. 19-223.

175. Van der Plank, J. E. The two gene-for-gene hypotheses and a test to distinguish them Text. / J. E. Van der Plank // Plant Pathology. 1991. - V. 40. -P. 1-3.

176. Van der Vlugt, R. A. A. Evidence for sense RNA-mediated protection in tobacco plants transformed with viral coat protein cistron Text. / R. A. A. Van der Vlugt, R. K. Ruiter, R. Goldbach // Plant Molecular Biology. 1992. - V. 20. - P. 631-639.

177. Varma, A. Some observations on the structure of the filamentous particles of several plant viruses Text. / A. Varma, A. J. Gibbs, A. J. Woods, J. T. Finch // J. Gen. Virol. 1968. - V. 2. - P. 107-114.

178. Vaucheret, H. Transcriptional gene silencing in plants: targets, inducers and regulators Text. / H. Vaucheret, M. Fagard // Trends Genet. 2001. - V. 17. - P. 29-35.

179. Viruses of plants — Known susceptibilities in So/anaceae Electronic data. 1996. - Режим доступа : http://image.fs.uidaho.edu/vide/famlyl24.html. - Дата доступа: 11.10.2001.

180. Virus structure Electronic data. 1999. - Режим доступа : http://tulane.edu/~dmsander/WWW/224/Structure224.html. - Дата доступа : 10.10.2001.

181. Voinet, О. Induction and suppression of RNA silencing: insights of viral infections Text. / O. Voinet, Y. M. Pinto, D. C. Baulcombe // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - P. 14147.

182. Voinet, O. Induction and suppression of RNA silencing: insights of viral infections Text. / O. Voinet // Nature Rev. Genet. 2005. - V. 6. - P. 206-220.

183. Wang, M. В. A single copy of a virus-derived transgene encoding hairpin RNA gives immunity to barley yellow dwarf virus Text. / M. B. Wang, D. C. Abbot, P. M. Waterhouse // Mol. Plant. Pathology 2000. - V. 1. - P. 347-356.

184. Ward, C. W. Taxonomy of potyvimses current problems and some solutions Text. / C. W. Ward, D. D. Shukla // Intervirology. 1991. - V. 32. - P. 269-296.

185. Waterhouse, P. M. Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA Text. / P. M. Waterhouse, M. W. Graham, M. B. Wang // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. - V. 95. - P. 959-964.

186. Waterhouse, P. M. Role of short RNAs in gene silencing Text. / P. M. Waterhouse, M.B. Wang E. J. Finnegan // Trends Plant Sci. 2001. - V. 6. - P. 297-301.

187. Weidemann, H. L. Importance and control of potato virus YN (PVYN) in seed potato production Text. / H. L. Weidemann // Potato Research. 1988. - V. 31.-P. 85-94. - '

188. White, J. L. A simple method for detection of viral satellite RNAs in small plant tissue samples Text. / J.L. White, J. M. Kaper // J. Virol. Methods. 1989. -V. 23.-P. 83-94.

189. Yusibov, V. High-affinity RNA-binding domains of alfalfa mosaic virus coat protein are not required for coat protein-mediated resistance Text. / V. Yusibov, L. S. Loesch-Fries //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. -V. 92. - P. 1-5.

190. Zagorska, H. Reakcja na wirusy odmian ziemniaka znajdujacych sie w-krajowym Odmian w 2000 roku Text. / H. Zagorska, M. Ghrzanowska, J*. Pietrack // Biuletyn Instytutu Hodowli I Aklimatyzacji Roslin. 2000. - V. 215. - S. 293303.

191. Zambryski, P. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity Text. / P. Zambryski, H. Joos, C.Genetello // EMBO J. 1983. - V. 2. - P. 2143-2150.