Связывание РНК in vitro серпинами растений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Толстыко Евгений Александрович

• Толстыко Евгений Александрович
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Толстыко Евгений Александрович

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Флоэмный транспорт РНК в растениях

1.1.1 Структура и функции флоэмы

1.1.2 Флоэмный транспорт белков и РНК

1.1.3 PTS в составе РН^ Транспорт мРНК и тРНК

1.1.4 Фрагменты тРНК во флоэме

1.1.5 Транспорт коротких некодирующих РНК

1.1.6 Транспорт предшественников микроРНК

1.1.7 Прочие виды РНК во флоэме

1.1.8 Роль трёхмерной структуры РНК

1.2 РНК-связывающие белки флоэмы

1.2.1 РНК-связывающие структуры белков

1.2.2 СтКБР50 и CmPP16

1.2.3 Флоэмный лектин PP2

1.2.4 РБКР1

1.2.5 Особенности флоэмы тыквенных и поиск новых флоэмных белков

1.3 Серпины

1.3.1 Структурное суперсемейство серпинов

1.3.2 Механизм ингибирования протеиназы

1.3.3 Регуляция активности серпинов

1.3.4 Полимеризация серпинов

1.3.5 Неингибиторные функции серпинов и неингибиторные серпины

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Растительный материал

2.2 Работа с бактериальными культурами

2.3 Получение компетентных клеток

2.4 Выделение препаратов РНК и получение кДНК

2.5 Амплификация фрагментов ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)

2.6 Методика молекулярного клонирования

2.7 Генетические конструкции

2.8 Подготовка РНК-субстратов для связывания с белком

2.9 Наработка и выделение рекомбинантных белков

2.10 Электрофорез в агарозном геле

2.11 Электрофорез белков в полиакриламидном геле

2.12 Подготовка агробактерий и анализ внутриклеточной локализации СтРБ1

2.13 Анализ РНК-связывающих свойств белков методом сдвига в агарозном геле

2.14 Анализ селективности связывания тРНК белком

2.15 Микротермофорез

2.16 Выделение РНК-связывающих белков из сока флоэмы

2.17 Биоинформатический анализ и ПО

Глава 3. Результаты

3.1 Аффинное выделение и идентификация флоэмных РНК-связывающих белков

3.2 Способность CmPS1 и CmPP12 к связыванию РНК

3.3 Связывание СтРБ1 с различными субстратами

3.4 Взаимодействие СтРБ1 с растительной тРНК

3.5 Связывание CmPS1 с вирусными тРНК-подобными структурами

3.6 Конкурентное ингибирование гепарином связывания СтРБ1 с тРНК

3.7 Способность к связыванию РНК у человеческого антитромбина-111

3.8 Способность к связыванию РНК у серпина А. ^аНапа

3.9 Оценка снизу величины константы диссоциации серпина А. ^аНапа

3.10 Роль Ы-концевого домена СтРБ1 в связывании РНК

3.11 Селективность связывания тРНК СтРБ1

3.12 Связывание pre-miR390 белком CmPS1

3.13 Субклеточная локализация СтРБ1

Глава 4. Обсуждение

Выводы

Список литературы

Список сокращений

AGO-1 - Argonaute

ASSVdpl - Apple scar skin viroid

AtCK-1 - Arabidopsis thaliana choline kinase

AtMC1 - Arabidopsis thaliana metacaspase

AtMC9 - Arabidopsis thaliana metacaspase

AtSerpin1 - Arabidopsis thaliana serpin

BMV - Brome mosaic virus

CC - Companion cells

CmPP16 - Cucurbita maxima phloem protein

CmPS1 - Cucurbita maxima phloem serpin

CmPSRPK1 - Cucurbita maxima phloem small RNA binding protein kinase

CTP - Cytidine triphosphate

DCL-1 - Dicer-like

DCL-2 - Dicer-like

dsRBM - double stranded RNA binding motif

EDTA - Ethylenediaminetetraacetic acid

EFP - Extrafascial phloem

eIF5A - eucaryotic initiation factor 5A

FP - Fascial phloem

GFP - Green fluorescent protein

GO/GC - Gate open/Gate closed

hnRNPA1 - heterogenius nuclear ribonucleoprotein A1

HsAT-III - Homo sapiens antithrombin-III

HSC70 - Heat shock cognate protein

HSP47 - Heat shock protein

HSVd - Hop stunt viroid

IPTG - Isopropyl ß-. d-1-thiogalactopyranoside

KH - K homology

LB - Lysogeny broth

LEI - Leukocyte Elastase Inhibitor

MENT - Myeloid and Erythroid Nuclear Termination stage-specific protein

MP - Movement protein

NCAP - Non-cell-autonomous protein

NGS - New generation sequencing

PAI-1 - Plasminogen activator inhibitor

PP1 - Phloem protein

PP2 - Phloem protein

PSRP1 - Phloem small RNA binding protein

PSTVd - Potato spindle tuber viroid

PTB - Polypirimidine tract binding

PTS - Phloem transport signal

PUM-HD - Pumilio homology domain

RBP50 - RNA binding protein

RCL - Reactive center loop

RCNMV - Red clover necrotic mosaic virus

RD-21 - responsive to desiccation

RRM - RNA recognition motif

RT - Room temperature

SDS - sodium dodecyl sulfate

SE - Sieve elements

SEL - Size exclusion limit

siRNA - small interfering RNA

TCTP - Translationally controlled tumor protein

TF-IIIA - Transcription factor IIIA

TLS - tRNA-like structure

TMV - Tobacco mosaic virus

TYMV - Turnip yellow mosaic virus

UTR - Untranslated region

ПААГ - Полиакриламидный гель

РНП - Рибонуклеопротеид

ТСГ - Тироксин-связывающий глобулин

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Связывание РНК in vitro серпинами растений»

Актуальность проблемы

Понимание механизмов флоэмного транспорта различных классов РНК является одним из ключевых вопросов изучения регуляции роста и развития растений, их ответа на различные биотические и абиотические стрессы, а также изучения распространения вирусной инфекции. Поскольку считается, что РНК попадают во флоэму и находятся в ней в составе рибонуклеопротеидных комплексов [1,2], одним из основных направлений изучения флоэмного транспорта РНК в растениях является поиск, выявление и характеризация таких комплексов и отдельных белков, их составляющих, а также выявление специфичности таких транспортных комплексов или отдельных белков по отношению к транспортируемой РНК. Степень проработанности темы

К моменту написания данной работы в достаточной мере были охарактеризованы два флоэмных рибонуклеопротеидных комплекса, обнаруженных во флоэме Cucurbita maxima. Это многокомпонентный комплекс на основе белка CmRBP50 [3], ответственный за перенос ряда мРНК с полипиримидиновым трактом в своём составе, а также комплекс, включающий белок PSRP1, участвующий в транспорте коротких некодирующих РНК [4]. Очевидно, однако, что набор транспортируемых за счёт данных комплексов транскриптов является достаточно ограниченным, в то время как благодаря транскриптомным исследованиям известно о наличии во флоэме практически всех основных типов РНК [1,2]. Следовательно, состав комплексов, ответственных за попадание во флоэму и транспорт большей части присутствующих во флоэме РНК, ещё предстоит определить. Кроме того, известно несколько отдельных флоэмных белков, для которых показана способность связывать РНК (CmPP2, CmLec17, CmPP16, CmeIF5A), однако функциональное значение данного свойства этих белков ещё не установлено.

Цель данной работы - поиск и идентификация предполагаемых РНК-связывающих белков флоэмы C. maxima, а также экспериментальное подтверждение и анализ их способности к взаимодействию с нуклеиновыми кислотами. Задачи работы:

1. Аффинная очистка РНК-связывающих белков из флоэмного экссудата C. maxima

2. Идентификация и клонирование последовательностей, кодирующих выявленные РНК-связывающие белки

3. Получение рекомбинантных белков и экспериментальное подтверждение их способности взаимодействовать с РНК

4. Исследование характера и эффективности взаимодействия белков с РНК-субстратами различных типов

5. Проверка потенциальной способности заимодействовать с РНК у ортологов выявленных РНК-связывающих белков из других организмов

6. Поиск участков, ответственных за взаимодействие с РНК Научная новизна

В данной работе выявлена неизвестная ранее способность взаимодействовать с РНК у флоэмного серпина C. maxima (CmPSl) и его ортолога из A. thaliana (AtSerpin1), и таким образом впервые показано наличие способности связывать РНК у белков из суперсемейства серпинов. Впервые охарактеризована субстратная специфичность связывания РНК белком CmPSl и показано эффективное взаимодействие CmPSl с тРНК. Получены данные о субклеточной локализации CmPSl в клетках N. benthamiana. Научная значимость

Результаты данной работы имеют фундаментальное значение и позволяют пересмотреть функциональную роль флоэмных серпинов растений, предположить их возможное участие в регуляторных путях, связанных с фрагментацией тРНК, а также новый способ регуляции ингибиторной активности серпинов. Кроме того, отсутствие структурного сходства CmPSl с какими-либо известными РНК-

7

связывающими доменами белков вкупе с его подтверждённой способностью к РНК-связыванию создают основу для будущих исследований нового типа РНК -связывающего белкового домена. Личный вклад автора

Диссертационная работа основана на собственных данных, полученных соискателем в период с 2016 по 2021 гг. Соискатель проводил анализ имеющейся литературы, проводил эксперименты, обработку и интерпретацию полученных данных, принимал участие в подготовке статей к публикации, а также написал диссертационную работу. Методология и методы исследования

Исследования выполнены с использованием современных методов молекулярной биологии и генетической инженерии в системах in vitro и in vivo. В ходе работы был создан ряд конструкций для получения рекомбинантных белков или использования в качестве матриц для транскрипции in vitro, с помощью чего, в свою очередь, были получены РНК-субстраты и биотинилированнный РНК-зонд для хроматографического выделения РНК-связывающих белков из флоэмы C. maxima. Выявление и анализ РНК-связывающей способности белков проводились с помощью экспериментов по связыванию in vitro и сдвигу в геле. Данные о субклеточной локализации CmPS1 в клетках N. benthamiana были получены с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

Масс-спектрометрический анализ был выполнен М.В. Серебряковой.

Микротермофорез проводился совместно с Петербургским институтом ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра «Курчатовский институт».

Секвенирование плазмид для проверки генетических конструкций было выполнено в ЦКП «Геном».

Секвенирование (NGS) тРНК для анализа селективности связывания было выполнено в ЗАО «Геноаналитика».

Положения, выносимые на защиту

1. Впервые обнаружено, что флоэмные серпины CmPSl и AtSerpinl обладают способностью связывать in vitro РНК, имеющие выраженную вторичную структуру.

2. Оба белка обладают высоким сродством к молекулам тРНК и формируют с ними специфический комплекс.

3. Обнаружено высокоаффинное связывание предшественника растительной микро-РНК (pre-miR390) белком CmPSl

4. Образование специфических комплексов с pre-miR390 белком CmPSl зависит от наличия неспаренных нуклеотидных остатков в составе РНК-дуплекса лиганда, что объясняет природу высокого сродства изученных серпинов к несовершенным дуплексам РНК, к которым относится и тРНК.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность экспериментов подтверждается их воспроизводимостью в нескольких повторностях, использованием контролей, а также хорошей согласуемостью различных экспериментов между собой и с литературными данными. По теме диссертационной работы опубликовано 3 статьи в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных для защиты в диссертационном совете МГУ по специальности 03.0l.03 - молекулярная биология.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 96 страницах, содержит 2 таблицы и 16 рисунков и состоит из следующих разделов: список сокращений, введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, и список литературы.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Флоэмный транспорт РНК в растениях

1.1.1 Структура и функции флоэмы

В отличие от водорослей, высшие растения имеют хорошо развитую сосудистую систему. Считается, что её приобретение является эволюционной адаптацией к заселению суши древними растениями, поскольку в отсутствии достаточно эффективной системы внутриорганизменного транспорта надземные части растений стали бы испытывать недостаток в воде и минеральных веществах, а подземные - в углекислом газе и продуктах фотосинтеза [5]. Предшествующее эволюционное приобретение у харовых водорослей - поры-плазмодесмы, объединяющие отдельные клетки растений в симпласт и делающие возможным ограниченный обмен веществами между соседними клетками, не достаточно для того, чтобы обеспечить необходимую скорость транспорта продуктов фотосинтеза на дальние дистанции, вследствие чего, по оценкам, размер наземного растения в отсутствии специализированной сосудистой системы не мог бы превышать нескольких миллиметров [5,6]. Высшие растения имеют два типа сосудов: ксилему и флоэму. Ксилема состоит из неживых клеток и предназначена для восходящего транспорта воды и растворённых в ней минеральных веществ от корней к надземным частям растения. Флоэма же, напротив, состоит из живых клеток и обеспечивает двусторонний транспорт сахаров и прочих продуктов фотосинтеза в части растений, где фотосинтез не происходит, такие как запасающие ткани, цветы, плоды, подземные части растения и прочие. Проводящая ткань флоэмы содержит в своём составе одни из наиболее дифференцированных клеток растений, лишенные ядра (энуклеированные) и сильно удлинённые ситовидные элементы (Sieve Elements/SE), которые и играют основную роль в транспорте, непосредственно образуя проводящий канал [7,8]. Их особенностью, благодаря которой они и получили своё название, являются ситовидные поля (или межклеточные

ситовидные пластинки у покрытосеменных растений), являющихся скоплением специализированных каналов в клеточной стенке и соединяющих соседние клетки SE в сосуды флоэмы, называемые ситовидными трубками. Эти каналы значительно превышают диаметр обычных плазмодесм, за счёт чего приобретается необходимая для функционирования пропускная способность. По оценкам, диаметр типичной плазмодесмы составляет 30-50 нм [9,10], тогда как размер канала ситовидной поры у растений рода Cucurbita может превышать 10 мкм [9,11], превосходя размер канала обычных плазмодесм более чем в 200 раз. Важно отметить, что, в отличие от кровеносной системы животных, флоэмный канал содержит в себе не внеклеточную, а внутриклеточную среду, позволяющую транспортироваться не только низкомолекулярным веществам, но и биологическим макромолекулам (белкам, нуклеиновым кислотам и различным их комплексам) напрямую, без трансмембранного переноса или образования транспортных мембранных везикул. Благодаря этому флоэма также способна осуществлять перенос различных типов сигналов, как низкомолекулярных веществ, включая фитогормоны, так и различных белков и нуклеиновых кислот.

1.1.2 Флоэмный транспорт белков и РНК

В силу особенностей своей терминальной дифференцировки, ситовидные элементы не имеют ядра, а наличествующие в них белки и РНК попадают туда через специфические плазмодесмы между ситовидными элементами и примыкающими к ним клетками-спутницами (Companion Cells/CC), либо будучи синтезированными самими клетками-спутницами, либо попадая в них из прочих флоэмных клеток через плазмодесмы. Плазмодесмы высших растений имеют сложную структуру, и их пропускная способность, которая характеризуется величиной SEL (Size exclusion limit) [12-14], может регулироваться. Считается, что в «закрытом» состоянии плазмодесмы имеют минимальный SEL, который составляет 800 Да [13,14], и способны пропускать лишь низкомолекулярные метаболиты. При этом, ряд белков (т.н. Non-cell-autonomous proteins, NCAPs) способен к «открытию» плазмодесм и перемещению через них.

Было предложено два базовых механизма этого процесса. Первый из них, т.н. «Gate open/Gate closed» (GO/GC), заключается в том, что различные регуляторные факторы (т.н. GO-факторы), взаимодействуя с плазмодесмами, временно увеличивают SEL до ~40кДа, что делает возможным перемещение белков путём простой диффузии. Транслокация белков (т.н. GO-NCAP) по такому механизму не требует от них наличия каких-либо специфических структурных мотивов в своём составе и лимитируется лишь молекулярной массой соответствующего белка. Это хорошо иллюстрируется экспериментами, показавшими высокую способность к межклеточной диффузии у GFP, но не у его искусственных мультимеров 2xGFP и 3xGFP [15,16]. Второй механизм, т.н. «Selective NCAP pathway» предполагает включение транслоцируемого белка в состав комплекса, который непосредственно взаимодействует с плазмодесмами и вызывает временное увеличение SEL до необходимого размера, сопряжённое с самой транслокацией в соседнюю клетку. В отличие от GO/GC -механизма, способность к транспорту каждого NCAP в данном случае определяется индивидуально его молекулярными характеристиками [13].

Понимание флоэмного транспорта РНК на сегодняшний день базируется на

представлении о том, что РНК попадают во флоэму и транспортируются по

ситовидным трубкам в составе комплексов с белками [1,2]. Такие воззрения

возникли, в основном, на базе исследований дальнего транспорта различных

вирусов растений, которые имеют в своём геноме гены одного или нескольких

транспортных белков (Movement protein/MP), которые способны связывать

вирусную РНК, а также осуществлять её транспорт через плазмодесмы [17,18].

Позднее, из флоэмного экссудата тыквы с помощью иммунопреципитации

удалось выделить комплекс РНК с эндогенным белком RBP50 [3], хотя наличие у

растений эндогенных паралогов вирусных транспортных белков было известно и

ранее [19]. Примечательно, что CmPP16 был иммунопреципитирован с помощью

поликлональных антител к транспортному белку вируса некротической мозаики

красного клевера (Red clover necrotic mosaic virus/RCNMV) [19]. Тем не менее, на

данный момент информации об этих комплексах имеется весьма мало, и на

12

сегодняшний день нельзя достоверно судить как о белковом составе комплексов, так и о том, ко всем ли классам РНК применима концепция флоэмного транспорта в составе специфических комплексов с белками.

I.1.3 PTS в составе РНК. Транспорт мРНК и тРНК

В настоящий момент принято считать, что предназначенные для транспорта по флоэме РНК должны иметь в своём составе специфические сигнальные элементы, т.н. «phloem transport signals/PTS» [1,2]. Одним из таких элементов, известных на сегодняшний день, является полипиримидиновый тракт. Показано, что во флоэме тыквы он может быть связан белком CmRBP50, который, в свою очередь, формирует комплекс с рядом других флоэмных белков тыквы, включая heat shock cognate protein 70 (HSC70), эукариотический фактор инициации трансляции 5A (eIF5A), уже упомянутый выше CmPP16 и Translationally controlled tumor protein (TCTP) [3,20]. Вполне возможно, что именно такой многокомпонентный белковый комплекс и отвечает за дальний транспорт РНК, имеющих с полипиримидиновый тракт. Было показано, что наличие полипиримидинового тракта необходимо для флоэмного транспорта мРНК CmPP16, TCTP, GA-INSENSITIVE и StBEL5 [20-23]. Однако на сегодняшний день неизвестно, насколько велика доля транскриптов с полипиримидиновым трактом среди всех транспортируемых по флоэме РНК. В ходе экспериментов по ко-иммунопреципитации комплексов с CmRBP50 из флоэмного экссудата тыквы удалось определить лишь шесть таких мРНК: PP16-1, GAIP, SCARECROW-LIKE (SCL14P), SHOOT MERISTEMLESS (STMP), ETHYLENE RESPONSE FACTOR (ERFP), Myb (MybP) [3]. В то же время, анализ флоэмного сока привитых растений A. thaliana выявил 2006 флоэмных РНК с поли-А-хвостом, способных к перемещению по флоэме [24]. Проведённый на основе этих данных целенаправленный биоинформатический анализ выявил, что приблизительно

II.4% данных мобильных мРНК имеет в своём составе тРНК-подобную структуру (tRNA-like structure, TLS) [25,26]. Интерес к потенциальной роли TLS в транспорте эндогенных РНК связан в том числе и с тем, что в ситовидных

элементах не происходят процессы трансляции, но при этом присутствуют тРНК [27]. Правда, остаётся возможность случайного попадания во флоэму тРНК из-за её относительно малого размера; при этом в пользу обратного говорят данные о том, что отдельные выявленные тРНК (Изолейциновая) отсутствуют во флоэме, в то время как некоторые другие (Метиониновая, Аспарагиновая, Глициновая) наоборот, присутствуют в большом количестве [27,28], что может предполагать функциональное значение наличия тРНК во флоэме. Изначально, TLS были обнаружены в составе геномных РНК вирусов растений, а затем достаточно подробно были изучены, в частности, для вируса табачной мозаики (BTM/TMV) [1,29] и вируса мозаики костра (BMK/BMV) [1,30]. Показано, что они являются «истинными» тРНК-подобными структурами, поскольку TLS ВТМ может быть аминоацилирована гистидином [31,32], а TLS ВМК - тирозином [32]. Также для этих вирусов была показана функциональная роль TLS в репликации вирусной РНК [1,33]. Помимо ВТМ и ВМК, TLS со способностью подвергаться аминоацилированию обнаружена в 3'нетранслируемой области геномных РНК ещё как минимум у 25 вирусов растений [33]. Среди эндогенных TLS-содержащих транскриптов растений хорошо известна мРНК AtCK-1 (A. thaliana choline kinase 1), для которой была показана значимость TLS в ее составе для флоэмного транспорта [24,25]. Это говорит о том, что TLS могут включать в себя PTS, либо сами по себе являться одним из альтернативных вариантов PTS. Опыты по слиянию TLS и её делеционных вариантов с 3'UTR репортерных генов GUS или DMC1 приводили к возникновению способности таких транскриптов к дальнему транспорту [1]. Примечательно, что использование варианта TLS на основе последовательности изолейциновой тРНК (которая не была обнаружена во флоэме), не привело к появлению дальнего транспорта транскриптов GUS [1]. Таким образом, мотив TLS представляется необходимым и достаточным для переноса ряда мРНК по флоэме.

1.1.4 Фрагменты тРНК во флоэме

Помимо TLS-содержащих мРНК и собственно тРНК, во флоэме также были обнаружены фрагменты тРНК [27], которые, как предполагается, могут участвовать в регуляции, но их регуляторная роль в растениях на сегодняшний день недостаточно хорошо изучена. Показано, однако, что фрагментация тРНК в различных эукариотических организмах, в том числе и в растениях, может происходить в ответ на окислительный стресс [34]. Также, у других организмов было показано, что фрагментация тРНК активируется в ответ на различные другие стрессы и приводит к появлению как половинок тРНК, образующихся путём разрезания зрелой тРНК по антикодоновой петле ангиогенином у высших эукариот [35-38], либо с помощью РНКазы Rny-1 у дрожжей [35,36,39], так и к появлению фрагментов других размеров. Вариантов последних достаточно много, поскольку разрезание может многократно осуществляться различными ферментами, происходить в различных точках (зачастую, в районах D- или TyC-петель [35,39]), а подвергаться фрагментации могут как зрелые, так и пре-тРНК. Далее эти фрагменты могут быть связаны с регуляторными путями сайленсинга за счёт отвлечения на себя ключевых ферментов системы РНК-интерференции. Показано, что у дрозофилы такие фрагменты, накопленные в большом количестве, эффективно конкурируют с вирусными двуцепочечными РНК за DCL-2, что фактически приводят к конкурентному ингибированию его активности в расщеплении двуцепочечных РНК и подавлении противовирусной защиты [40]. Кроме того, в клетках человека было показано, что такие фрагменты тРНК могут быть загружены в белки из семейства Argonaute и принимать участие в процессах РНК-интерференции подобно истинным малым интерферирующим РНК (small interfering RNA, siRNA) или микроРНК, либо конкурировать с последними, негативно регулируя их активность [41,42]. Позднее, комплексы AGO-1 с фрагментами тРНК были обнаружены и у растений (A. thaliana) с помощью иммунопреципитации этого белка и последующего секвенирования ко-иммунопреципитированных РНК [43,44].

1.1.5 Транспорт коротких некодирующих РНК

Во флоэмном экссудате также было обнаружено большое количество

микро-РНК и практически все варианты siRNA растений [1,4,20,45,46]. Транспорт

таких РНК по флоэме хорошо иллюстрируется опытами с прививкой трансгенных

растений и распространением сайленсинга репортерных генов из подвоя в

привой. Первый опыт такого рода был основан на сайленсинге нитрат-редуктазы

NIA в подвое, который приводил к появлению видимого хлороза на листьях

привоя [1,47]. Чуть позже не менее наглядно распространение сайленсинга было

визуализировано с помощью временной экспрессии генетической конструкции,

вызывающей сайленсинг мРНК erGFP в трансгенных растениях [1,48].

Предположительно, короткие интерферирующие РНК, как и другие типы

транскриптов, продуцируются в клетках спутницах, или соседствующих с ними

клетках, а затем попадают в ситовидные элементы через плазмодесмы, где

транспортируются за счёт движения флоэмного сока, после чего выгружаются из

флоэмы. Этот процесс также легко визуализируется опытами с сайленсингом

репортерных генов, поскольку при распространении сайленсинга по растению

расположение областей сайленсинга совпадает с ухором жилок, составляющих

сосудистую систему листа [1]. Примечательно, что сигнал siRNA не проникал в

замыкающие клетки устьиц, поскольку те не имеют функциональных плазмодесм

[1]. Сходным образом, опыты на мутантных растениях A. thaliana показали, что

снижение пропускной способности плазмодесм приводит к ослаблению

способности микроРНК принимать участие в регуляции дифференцировки клеток

[49]. Некоторые из регуляторных функций транспортируемых флоэмой

микроРНК удалось идентифицировать. Например, miR399 продуцируется в

листьях A. thaliana в ответ на нехватку неорганического фосфора (Pi) и

транспортируются в корни, где подавляет экспрессию гена PHO2, что в свою

очередь, приводит к стимуляции накопления Pi [50,51]. Аналогичным образом,

экспрессия miR395 в листьях является ответом на нехватку сульфатов, а её

мишенями являются гены APS и AST68, чьи продукты участвуют в пути

метаболизма сульфатов, и подавление их экспрессии приводит к накоплению

16

сульфатов [45,52]. Также способность транспортироваться по флоэме показана для miR156 и miR172 картофеля (S. Tuberosum), где они принимают участие в регуляции клубнеобразования [53,54]. Следует заметить, что остается неизвестным состав белкового комплекса, обеспечивающего транспортировку микро- и малых интерферирующих РНК по флоэме, поскольку на сегодняшний день ни одно из протеомных исследований флоэмы не привело к обнаружению белков-аргонавтов, за исключением одной работы, где ортолог AGO-1 был обнаружен во флоэмном протеоме тыквы [55].

1.1.6 Транспорт предшественников микроРНК

Недавние исследования позволяют говорить о наличие во флоэме не только зрелых микроРНК, но и их предшественников. В частности, с помощью биоинформатического анализа во флоэмном транскриптоме Cucurbita maxima были обнаружены предшественники 11 микроРНК (при-микроРНК) [56]. Результаты анализа частично были подтверждены детекцией во флоэмном соке нескольких из этих последовательностей с помощью обратной транскрипции и ПЦР. Кроме того, опыт с межвидовой прививкой (привой Cucumis melo на подвой Cucurbita maxima) показал способность pri-miR319a тыквы транспортироваться в привой. Таким образом, наличие как минимум одной при-микроРНК во флоэме можно считать достоверно подтвержденным, поскольку анализ привоя исключает контаминацию флоэмного экссудата содержимым окружающих тканей. Также показана возможность специфического фрагмента C. maxima pri-miR390a, который включает в себя шпилечную структуру с последовательностью зрелой микроРНК, придавать способность искусственно сконструированной РНК транспортироваться по флоэме [57]. Все эти данные говорят о наличии способности попадать в ситовидные элементы и транспортироваться по флоэме как минимум у определённого набора предшественников микроРНК растений.

Предшественники микроРНК у растений синтезируются и процессируются в ядре, откуда выходят в цитоплазму уже зрелые микроРНК в комплексе с белком AGO-1 для участия в регуляции метаболизма цитоплазматических РНК [58,59].

Тем не менее, представляется вполне возможным существование какого-либо неизвестного на данный момент механизма, за счёт которого некоторое количество предшественников определённых микроРНК может избегать процессинга и выходить из ядра в интактном виде, чтобы впоследствии попадать в ситовидные элементы. Процессинг предшественников микроРНК осуществляется, в первую очередь, за счёт действия DCL-1 и является достаточно сложным процессом, с возможностями регуляции как в сторону повышения, так и понижения эффективности этого процесса [59,60]. Помимо возможности регуляторного ингибирования DCL-1 в ходе ответа на какие-либо физиологические стимулы, также представляется возможным действие гипотетических белков, способных защищать транскрипт от его действия.

1.1.7 Прочие виды РНК во флоэме

Существуют также и недавно полученные сведения о наличии во флоэме рРНК. Этот факт, вместе с данными о присутствии во флоэме определённых тРНК, а также рибосомных белков и факторов трансляции [1,61], и даже отдельных фрагментов рибосом [62], заставляет предполагать возможность трансляции во флоэме. Тем не менее, ранние эксперименты с использованием меченых аминокислот показали, что в ситовидных элементах нет как минимум синтеза белка de novo [1,63,64]. Мало того, показано, что сама среда флоэмы является ингибирующей по отношению к трансляции, а добавление небольшого количества флоэмного экссудата к реакционной смеси для трансляции in vitro приводит к её остановке [27]. В числе прочего, за это могут быть ответственны уже упомянутые ранее фрагменты тРНК, для которых была показана способность ингибировать трансляцию в клетках млекопитающих [1]. Эти данные, вкупе с отсутствием во флоэме некоторых видов тРНК, позволяют заключить, что процессы трансляции в ситовидных элементах всё же не происходят, а вопрос о функциональной роли рибосомных РНК во флоэме остаётся открытым.

Особый интерес вызывает транспорт вироидов по флоэме, поскольку, в отличие от вирусов, вироиды не кодируют белки, а значит, вынуждены

использовать механизмы транспорта эндогенных РНК растений. Вироиды - это небольшие инфекционные агенты, способные к системному заражению растений и представляющие собой кольцевую РНК длиной ~250-450 нуклеотидов со специфической вторичной структурой, характеризующейся высокой плотностью комплементарных пар азотистых оснований [65]. Согласно данным моделирования, представители одного из двух описанных на сегодняшний день семейств вироидов (Pospiviroidae) образуют палочкообразные структуры, тогда как представители другого семейства (Avsunviroidae) образуют более сложные (Y-подобные) структуры с тремя или большим числом ветвей [66,67]. Недавнее исследование in vivo вторичной структуры одного из самых хорошо изученных вироидов, вироида веретеновидности клубней картофеля (Potato spindle tuber viroid, PSTVd), показало её достаточно высокую степень соответствия с предсказанной [68]. По причине отсутствия собственных белков и необходимости использовать клеточные механизмы метаболизма РНК в ходе своего жизненного цикла для репликации, внутри- и межклеточного транспорта, вироиды несут в себе набор различных сигналов для взаимодействия с соответствующими клеточными факторами [2]. В частности, у PSTVd был найден PTS, представляющий собой участок дуплекса длиной 11 пар оснований с выпетливанием двух неспаренных нуклеотидов (U43/C318), которые всё же взаимодействуют между собой через молекулу воды, образуя с ней водородные связи. Показано, что внесение мутаций с появлением Уотсон-Криковской пары приводит к неспособности такого вироида к дальнему транспорту [69]. Помимо этого, была показана необходимость наличия двух неканонических G:U пар (U27:G335 и G156:U205) для попадания во флоэму N. benthamiana [70]. Также, важно отметить, что мутирование этих элементов не лишало вироид способности проникать в соседние клетки через плазмодесмы [69,70], что говорит, во-первых, о специфике механизма перехода между CC и SE, а во-вторых, о наличии различных сигналов для ближнего и дальнего транспорта в составе вироида, и, вероятно, других мобильных РНК. Мало того, предполагается, что отдельный сигнал нужен даже для перехода между различными типами тканей [71], а в ряде

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Толстыко Евгений Александрович, 2022 год

Список литературы

1. Kehr J., Kragler F. Long distance RNA movement // New Phytol. Blackwell Publishing Ltd, 2018. Vol. 218, № 1. P. 29-40.

2. Tolstyko E.A. et al. Phloem transport of structured RNAs: A widening repertoire of trafficking signals and protein factors // Plant Sci. 2020. Vol. 299. P. 110602.

3. Ham B.K. et al. A polypyrimidine tract binding protein, pumpkin RBP50, forms the basis of a phloem-mobile ribonudeoprotein complex // Plant Cell. 2009. Vol. 21, № 1. P. 197-215.

4. Yoo B.C. et al. A systematic small RNA signaling system in plants // Plant Cell. 2004. Vol. 16, № 8. P. 1979-2000.

5. Lucas W.J. et al. The Plant Vascular System: Evolution, Development and Functions // Journal of Integrative Plant Biology. John Wiley & Sons, Ltd, 2013. Vol. 55, № 4. P. 294-388.

6. Fisher D.B., Wang Ning. Sucrose concentration gradients along the post-phloem transport pathway in the maternal tissues of developing wheat grains // Plant Physiol. American Society of Plant Biologists, 1995. Vol. 109, № 2. P. 587-592.

7. Liesche J., Patrick J. An update on phloem transport: a simple bulk flow under complex regulation // F1000Research. F1000 ( Faculty of 1000 Ltd), 2017. Vol. 6. P. 2096.

8. De Rybel B. et al. Plant vascular development: From early specification to differentiation // Nature Reviews Molecular Cell Biology. Nature Publishing Group, 2016. Vol. 17, № 1. P. 30-40.

9. Kalmbach L., Helariutta Y. Sieve plate pores in the phloem and the unknowns of their formation // Plants. MDPI AG, 2019. Vol. 8, № 2.

10. Ehlers K., Kollmann R. Primary and secondary plasmodesmata: Structure, origin, and functioning: Review article // Protoplasma. 2001. Vol. 216, № 1-2. P. 1-30.

11. Esau K., Cheadle V.I. Size of Pores and Their Contents in Sieve Elements of Dicotyledons // Proc. Natl. Acad. Sci. National Academy of Sciences, 1959. Vol. 45, № 2. P. 156-162.

12. Heinlein M. Plasmodesmata: Dynamic regulation and role in macromolecular cell-to-cell signaling // Curr. Opin. Plant Biol. 2002. Vol. 5, № 6. P. 543-552.

13. Lucas W.J., Lee J.Y. Plasmodesmata as a supracellular control network in plants // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2004. Vol. 5, № 9. P. 712-726.

14. Oparka K.J. et al. Simple, but not branched, plasmodesmata allow the nonspecific trafficking of proteins in developing tobacco leaves // Cell. Cell Press, 1999. Vol. 97, № 6. P. 743-754.

15. Marzec M., Kurczynska E. Importance of symplasmic communication in cell differentiation // Plant Signal. Behav. Landes Bioscience, 2014. Vol. 9, № 1. P. e27931.

16. Kim I., Zambryski P.C. Cell-to-cell communication via plasmodesmata during Arabidopsis embryogenesis // Current Opinion in Plant Biology. 2005. Vol. 8, № 6. P. 593-599.

17. Lucas W.J. Plant viral movement proteins: Agents for cell-to-cell trafficking of viral genomes // Virology. 2006. Vol. 344, № 1. P. 169-184.

18. Heinlein M. Plasmodesmata: Channels for viruses on the move // Methods Mol. Biol. Humana Press Inc., 2015. Vol. 1217. P. 25-52.

19. Xoconostle-Cazares B. et al. Plant paralog to viral movement protein that potentiates transport of mRNA into the phloem // Science (80-. ). 1999. Vol. 283, № 5398. P. 94-98.

20. Ham B.-K., Lucas W.J. Phloem-Mobile RNAs as Systemic Signaling Agents // Annu. Rev. Plant Biol. Annual Reviews, 2017. Vol. 68, № 1. P. 173-195.

21. Cho S.K. et al. Polypyrimidine tract-binding proteins of potato mediate tuberization through an interaction with StBEL5 RNA // J. Exp. Bot. 2015. Vol. 66, № 21. P. 6835-6847.

22. Huang N.C., Yu T.S. The sequences of Arabidopsis GA-INSENSITIVE RNA constitute the motifs that are necessary and sufficient for RNA long-distance trafficking // Plant J. 2009. Vol. 59, № 6. P. 921929.

23. Kondhare K.R. et al. Conservation of polypyrimidine tract binding proteins and their putative target RNAs in several storage root crops // BMC Genomics. BioMed Central Ltd., 2018. Vol. 19, № 1. P. 124.

24. Thieme C.J. et al. Endogenous Arabidopsis messenger RNAs transported to distant tissues // Nat. Plants. Palgrave Macmillan Ltd., 2015. Vol. 1, № 4. P. 15025.

25. Zhang W. et al. TRNA-related sequences trigger systemic mRNA transport in plants // Plant Cell. American Society of Plant Biologists, 2016. Vol. 28, № 6. P. 1237-1249.

26. Guan D. et al. PlaMoM: A comprehensive database compiles plant mobile macromolecules // Nucleic Acids Res. 2017. Vol. 45, № D1. P. D1021-D1028.

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

Zhang S., Sun L., Kragler F. The phloem-delivered RNA pool contains small noncoding RNAs and interferes with translation1[W][OA] // Plant Physiol. 2009. Vol. 150, № 1. P. 378-387. Kragler F. RNA in the phloem: A crisis or a return on investment? // Plant Science. 2010. Vol. 178, № 2. P.99-104.

Gallie D.R. et al. Functional analysis of the tobacco mosaic virus tRNA-like structure in cytoplasmic gene regulation // Nucleic Acids Res. 1991. Vol. 19, № 18. P. 5031-5036.

Rietveld K., Pleij C.W., Bosch L. Three-dimensional models of the tRNA-like 3' termini of some plant viral RNAs. // EMBO J. Wiley, 1983. Vol. 2, № 7. P. 1079-1085.

Carriquiry E., Litvak S. Further studies on the enzymatic aminoacylation of TMV-RNA by histidine // FEBS Lett. 1974. Vol. 38, № 3. P. 287-291.

Kohl R.J., Hall T.C. Aminoacylation of RNA from several viruses: amino acid specificity and differential activity of plant, yeast and bacterial synthetases // J. Gen. Virol. 1974. Vol. 25, № 2. P. 257261.

Dreher T.W. Viral tRNAs and tRNA-like structures // Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2010. Vol. 1, № 3. P. 402-414.

Thompson D.M. et al. tRNA cleavage is a conserved response to oxidative stress in eukaryotes // Rna. 2008. Vol. 14, № 10. P. 2095-2103.

Keam S.P., Hutvagner G. Trna-derived fragments (Trfs): Emerging new roles for an ancient RNA in the

regulation of gene expression // Life. MDPI AG, 2015. Vol. 5, № 4. P. 1638-1651.

Kumar P., Kuscu C., Dutta A. Biogenesis and Function of Transfer RNA-Related Fragments (tRFs) //

Trends in Biochemical Sciences. Elsevier Ltd, 2016. Vol. 41, № 8. P. 679-689.

Fu H. et al. Stress induces tRNA cleavage by angiogenin in mammalian cells // FEBS Lett. 2009. Vol.

583, № 2. P. 437-442.

Yamasaki S. et al. Angiogenin cleaves tRNA and promotes stress-induced translational repression // J. Cell Biol. 2009. Vol. 185, № 1. P. 35-42.

Thompson D.M., Parker R. The RNase Rny1p cleaves tRNAs and promotes cell death during oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae // J. Cell Biol. 2009. Vol. 185, № 1. P. 43-50. Durdevic Z. et al. The RNA methyltransferase dnmt2 is required for efficient dicer-2-dependent siRNA pathway activity in Drosophila // Cell Rep. 2013. Vol. 4, № 5. P. 931-937.

Haussecker D. et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing // Rna. 2010. Vol. 16, № 4. P. 673-695.

Kuscu C. et al. tRNA fragments (tRFs) guide Ago to regulate gene expression post-transcriptionally in a Dicer-independent manner // Rna. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2018. Vol. 24, № 8. P. 10931105.

Loss-Morais G., Waterhouse P.M., Margis R. Description of plant tRNA-derived RNA fragments (tRFs) associated with argonaute and identification of their putative targets // Biology Direct. 2013. Vol. 8, № 1. Martinez G., Choudury S.G., Slotkin R.K. TRNA-derived small RNAs target transposable element transcripts // Nucleic Acids Res. 2017. Vol. 45, № 9. P. 5142-5152.

Buhtz A. et al. Phloem small RNAs, nutrient stress responses, and systemic mobility // BMC Plant Biol. BioMed Central Ltd., 2010. Vol. 10, № 1. P. 64.

Pant B.D. et al. Identification of nutrient-responsive Arabidopsis and rapeseed microRNAs by comprehensive real-time polymerase chain reaction profiling and small RNA sequencing // Plant Physiol. 2009. Vol. 150, № 3. P. 1541-1555.

Palauqui J.C. et al. Systemic acquired silencing: Transgene-specific post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions // EMBO J. John Wiley & Sons, Ltd, 1997. Vol. 16, № 15. P. 4738-4745.

Mlotshwa S. et al. RNA silencing and the mobile silencing signal // Plant Cell. 2002. Vol. 14, № SUPPL. Carlsbecker A. et al. Cell signalling by microRNA165/6 directs gene dose-dependent root cell fate // Nature. 2010. Vol. 465, № 7296. P. 316-321.

Lin S.I. et al. Regulatory network of microRNA399 and PHO2 by systemic signaling // Plant Physiol. American Society of Plant Biologists, 2008. Vol. 147, № 2. P. 732-746. Pant B.D. et al. MicroRNA399 is a long-distance signal for the regulation of plant phosphate homeostasis // Plant J. 2008. Vol. 53, № 5. P. 731-738.

Liang G., Yang F., Yu D. MicroRNA395 mediates regulation of sulfate accumulation and allocation in Arabidopsis thaliana // Plant J. 2010. Vol. 62, № 6. P. 1046-1057.

Bhogale S. et al. MicroRNA156: A potential graft-transmissible microrna that modulates plant architecture and tuberization in Solanum tuberosum ssp. andigena // Plant Physiol. 2014. Vol. 164, № 2.

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

P. 1011-1027.

Martin A. et al. Graft-transmissible induction of potato tuberization by the microRNA miR172 // Development. 2009. Vol. 136, № 17. P. 2873-2881.

Lin M.K. et al. Analysis of the pumpkin phloem proteome provides insights into angiosperm sieve tube function // Mol. Cell. Proteomics. 2009. Vol. 8, № 2. P. 343-356.

Tolstyko E., Lezzhov A., Solovyev A. Identification of miRNA precursors in the phloem of Cucurbita maxima // PeerJ. 2019. Vol. 7, № 12. P. e8269.

Lezzhov A.A. et al. RNA phloem transport mediated by pre-miRNA and viral tRNA-like structures // Plant Sci. Elsevier Ireland Ltd, 2019. Vol. 284. P. 99-107.

Bologna N.G. et al. Nucleo-cytosolic Shuttling of ARGONAUTE1 Prompts a Revised Model of the Plant MicroRNA Pathway // Mol. Cell. Cell Press, 2018. Vol. 69, № 4. P. 709-719.e5. Wang J., Mei J., Ren G. Plant microRNAs: Biogenesis, homeostasis, and degradation // Frontiers in Plant Science. Frontiers Media S.A., 2019. Vol. 10. P. 360.

Zhang S., Liu Y., Yu B. New insights into pri-miRNA processing and accumulation in plants // Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. Blackwell Publishing Ltd, 2015. Vol. 6, № 5. P. 533-545. Giavalisco P. et al. Towards the proteome of Brassica napus phloem sap // Proteomics. 2006. Vol. 6, № 3. P. 896-909.

Ostendorp A. et al. Functional analysis of Brassica napus phloem protein and ribonucleoprotein complexes // New Phytol. Blackwell Publishing Ltd, 2017. Vol. 214, № 3. P. 1188-1197. Nuske J., Eschrich W. Synthesis of P-protein in mature phloem of Cucurbita maxima // Planta. SpringerVerlag, 1976. Vol. 132, № 2. P. 109-118.

Fisher D.B., Wu Y., Ku M.S.B. Turnover of soluble proteins in the wheat sieve tube // Plant Physiol. American Society of Plant Biologists, 1992. Vol. 100, № 3. P. 1433-1441.

Katsarou K. et al. Infectious long non-coding RNAs // Biochimie. Elsevier B.V., 2015. Vol. 117. P. 3747.

Ding B. Viroids: Self-replicating, mobile, and fast-evolving noncoding regulatory RNAs // Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. Wiley Interdiscip Rev RNA, 2010. Vol. 1, № 3. P. 362-375. Adkar-Purushothama C.R., Perreault J.P. Current overview on viroid-host interactions // Wiley Interdiscip. Rev. RNA. Blackwell Publishing Ltd, 2020. Vol. 11, № 2.

Lopez-Carrasco A., Flores R. Dissecting the secondary structure of the circular RNA of a nuclear viroid in vivo: A "naked" rod-like conformation similar but not identical to that observed in vitro // RNA Biol. Taylor and Francis Inc., 2017. Vol. 14, № 8. P. 1046-1054.

Zhong X. et al. Tertiary structure and function of an RNA motif required for plant vascular entry to initiate systemic trafficking // EMBO J. 2007. Vol. 26, № 16. P. 3836-3846.

Wu J. et al. Functional analysis reveals G/U pairs critical for replication and trafficking of an infectious non-coding viroid RNA // Nucleic Acids Res. 2020. Vol. 48, № 6. P. 3134-3155. Ding B., Itaya A. Viroid: A useful model for studying the basic principles of infection and RNA biology // Mol. Plant-Microbe Interact. 2007. Vol. 20, № 1. P. 7-20.

Qi Y. et al. Direct role of a viroid RNA motif in mediating directional RNA trafficking accross a specific cellular boundary // Plant Cell. American Society of Plant Biologists, 2004. Vol. 16, № 7. P. 1741-1752. Takeda R. et al. Allelic RNA motifs in regulating systemic trafficking of potato spindle tuber viroid // Viruses. MDPI AG, 2018. Vol. 10, № 4.

Wu J. et al. A three-dimensional RNA motif mediates directional trafficking of Potato spindle tuber viroid from epidermal to palisade mesophyll cells in Nicotiana benthamiana // PLoS Pathog. Public Library of Science, 2019. Vol. 15, № 10. P. e1008147.

Owens R.A. et al. RNA structural features responsible for potato spindle tuber viroid pathogenicity // Virology. Academic Press Inc., 1996. Vol. 222, № 1. P. 144-158.

Liu N. et al. N6-methyladenosine alters RNA structure to regulate binding of a low-complexity protein // Nucleic Acids Res. 2017. Vol. 45, № 10. P. 6051-6063.

Yang L. et al. m5C Methylation Guides Systemic Transport of Messenger RNA over Graft Junctions in Plants // Curr. Biol. Cell Press, 2019. Vol. 29, № 15. P. 2465-2476.e5.

Miller J., McLachlan A.D., Klug A. Repetitive zinc-binding domains in the protein transcription factor IIIA from Xenopus oocytes. // EMBO J. Wiley, 1985. Vol. 4, № 6. P. 1609-1614. Klug A., Rhodes D. Zinc fingers: A novel protein fold for nucleic acid recognition // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1987. Vol. 52. P. 473-482.

Lachenmann M.J. et al. Solvation and the hidden thermodynamics of a zinc finger probed by nonstandard repair of a protein crevice // Protein Sci. Wiley, 2009. Vol. 13, № 12. P. 3115-3126.

81. Low L.Y. et al. Metal-dependent folding and stability of nuclear hormone receptor DNA-binding domains // J. Mol. Biol. Academic Press, 2002. Vol. 319, № 1. P. 87-106.

82. Krishna S.S., Majumdar I., Grishin N. V. Structural classification of zinc fingers: survey and summary. // Nucleic Acids Res. 2003. Vol. 31, № 2. P. 532-550.

83. Hanas J.S., Larabee J.L., Hocker J.R. Zinc Finger Interactions with Metals and Other Small Molecules // Zinc Finger Proteins. Springer US, 2007. P. 39-46.

84. Hall T.M.T. Multiple modes of RNA recognition by zinc finger proteins // Curr. Opin. Struct. Biol. Elsevier Current Trends, 2005. Vol. 15, № 3 SPEC. ISS. P. 367-373.

85. Brown R.S. Zinc finger proteins: getting a grip on RNA // Curr. Opin. Struct. Biol. Elsevier Current Trends, 2005. Vol. 15, № 1. P. 94-98.

86. Gamsjaeger R. et al. Sticky fingers: zinc-fingers as protein-recognition motifs // Trends in Biochemical Sciences. 2007. Vol. 32, № 2. P. 63-70.

87. Matthews J.M., Sunde M. Zinc fingers - Folds for many occasions // IUBMB Life. 2002. Vol. 54, № 6. P.351-355.

88. Picard B., Wegnez M. Isolation of a 7S particle from Xenopus laevis oocytes: A 5S RNA-protein complex // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1979. Vol. 76, № 1. P. 241-245.

89. Pelham H.R.B., Brown D.D. A specific transcription factor that can bind either the 5S RNA gene or 5S RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. National Academy of Sciences, 1980. Vol. 77, № 7 II. P. 41704174.

90. Guddat U., Bakken A.H., Pieler T. Protein-mediated nuclear export of RNA: 5S rRNA containing small RNPs in xenopus oocytes // Cell. 1990. Vol. 60, № 4. P. 619-628.

91. Hudson B.P. et al. Recognition of the mRNA AU-rich element by the zinc finger domain of TIS11d // Nat. Struct. Mol. Biol. 2004. Vol. 11, № 3. P. 257-264.

92. De Guzman R.N. et al. Structure of the HIV-1 nucleocapsid protein bound to the SL3 y-RNA recognition element // Science (80-. ). American Association for the Advancement of Science, 1998. Vol. 279, № 5349.P.384-388.

93. Dreyfuss G., Swanson M.S., Pinol-Roma S. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein particles and the pathway of mRNA formation // Trends Biochem. Sci. 1988. Vol. 13, № 3. P. 86-91.

94. Maris C., Dominguez C., Allain F.H.T. The RNA recognition motif, a plastic RNA-binding platform to regulate post-transcriptional gene expression // FEBS J. John Wiley & Sons, Ltd, 2005. Vol. 272, № 9. P. 2118-2131.

95. Adam S.A. et al. mRNA polyadenylate-binding protein: gene isolation and sequencing and identification of a ribonucleoprotein consensus sequence. // Mol. Cell. Biol. American Society for Microbiology, 1986. Vol. 6, № 8. P. 2932-2943.

96. Swanson M.S. et al. Primary structure of human nuclear ribonucleoprotein particle C proteins: conservation of sequence and domain structures in heterogeneous nuclear RNA, mRNA, and pre-rRNA-binding proteins. // Mol. Cell. Biol. American Society for Microbiology, 1987. Vol. 7, № 5. P. 17311739.

97. Ding J. et al. Crystal structure of the two-RRM domain of hnRNP A1 (UP1) complexed with single-stranded telomeric DNA // Genes Dev. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999. Vol. 13, № 9. P. 1102-1115.

98. Birney E., Kumar S., Krainer A.R. Analysis of the RNA-recognition motif and RS and RGG domains: Conservation in metazoan pre-mRNA splicing factors // Nucleic Acids Res. 1993. Vol. 21, № 25. P. 5803-5816.

99. Allers J., Shamoo Y. Structure-based analysis of protein-RNA interactions using the program ENTANGLE // J. Mol. Biol. Academic Press, 2001. Vol. 311, № 1. P. 75-86.

100. Varani G., Nagai K. RNA recognition by RNP proteins during RNA processing // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. Annual Reviews 4139 El Camino Way, P.O. Box 10139, Palo Alto, CA 94303-0139, USA , 1998. Vol. 27, № 1. P. 407-445.

101. Valverde R., Edwards L., Regan L. Structure and function of KH domains // FEBS J. John Wiley & Sons, Ltd, 2008. Vol. 275, № 11. P. 2712-2726.

102. Grishin N. V. KH domain: one motif, two folds // Nucleic Acids Res. Oxford University Press (OUP), 2001. Vol. 29, № 3. P. 638-643.

103. Beuth B. et al. Structure of a Mycobacterium tuberculosis NusA-RNA complex // EMBO J. 2005. Vol. 24, № 20. P. 3576-3587.

104. Lewis H.A. et al. Sequence-specific RNA binding by a Nova KH domain: Implications for paraneoplastic disease and the fragile X syndrome // Cell. Cell Press, 2000. Vol. 100, № 3. P. 323-332.

105

106

107

108

109

110

111

112

113

114

115

116

117

118

119

120

121

122

123

124

125

126

127

128

129

Liu Z. et al. Structural basis for recognition of the intron branch site RNA by splicing factor 1 // Science (80-. ). 2001. Vol. 294, № 5544. P. 1098-1102.

Braddock D.T. et al. Molecular basis of sequence-specific single-stranded DNA recognition by KH domains: Solution structure of a complex between hnRNP K KH3 and single-stranded DNA // EMBO J. 2002. Vol. 21, № 13. P. 3476-3485.

Stefl R., Skrisovska L., Allain F.H.T. RNA sequence- and shape-dependent recognition by proteins in the ribonucleoprotein particle // EMBO Reports. European Molecular Biology Organization, 2005. Vol. 6, № 1. P. 33-38.

Doyle M., Jantsch M.F. New and old roles of the double-stranded RNA-binding domain // J. Struct. Biol. Academic Press, 2002. Vol. 140, № 1-3. P. 147-153.

SAUNDERS L.R., BARBER G.N. The dsRNA binding protein family: critical roles, diverse cellular functions // FASEB J. Wiley, 2003. Vol. 17, № 9. P. 961-983.

Ryter J.M., Schultz S.C. Molecular basis of double-stranded RNA-protein interactions: Structure of a dsRNA-binding domain complexed with dsRNA // EMBO J. John Wiley & Sons, Ltd, 1998. Vol. 17, № 24. P.7505-7513.

Ramos A. et al. RNA recognition by a Staufen double-stranded RNA-binding domain // EMBO J. 2000. Vol. 19, № 5. P. 997-1009.

Stefl R. et al. The Solution Structure of the ADAR2 dsRBM-RNA Complex Reveals a Sequence-

Specific Readout of the Minor Groove // Cell. 2010. Vol. 143, № 2. P. 225-237.

Chang K.Y., Ramos A. The double-stranded RNA-binding motif, a versatile macromolecular docking

platform // FEBS J. John Wiley & Sons, Ltd, 2005. Vol. 272, № 9. P. 2109-2117.

Qiu C. et al. Distinct RNA-binding modules in a single PUF protein cooperate to determine RNA

specificity // Nucleic Acids Res. 2019. Vol. 47, № 16. P. 8770-8784.

Zamore P.D., Williamson J.R., Lehmann R. The Pumilio protein binds RNA through a conserved domain that defines a new class of RNA-binding proteins // Rna. 1997. Vol. 3, № 12. P. 1421-1433. Miller M.T., Higgin J.J., Tanaka Hall T.M. Basis of altered RNA-binding specificity by PUF proteins revealed by crystal structures of yeast Puf4p // Nat. Struct. Mol. Biol. 2008. Vol. 15, № 4. P. 397-402. Wang X., Zamore P.D., Tanaka Hall T.M. Crystal structure of a Pumilio homology domain // Mol. Cell. 2001. Vol. 7, № 4. P. 855-865.

Wang Y. et al. Structural basis for specific recognition of multiple mRNA targets by a PUF regulatory protein // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009. Vol. 106, № 48. P. 20186-20191. Cheong C.G., Tanaka Hall T.M. Engineering RNA sequence specificity of Pumilio repeats // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006. Vol. 103, № 37. P. 13635-13639.

Hall T.M.T. Expanding the RNA-recognition code of PUF proteins // Nature Structural and Molecular Biology. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 21, № 8. P. 653-655.

Campbell Z.T., Valley C.T., Wickens M. A protein-RNA specificity code enables targeted activation of an endogenous human transcript // Nat. Struct. Mol. Biol. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 21, № 8. P.732-738.

Li P., Ham B.K., Lucas W.J. CmRBP50 protein phosphorylation is essential for assembly of a stable phloem-mobile high-affinity ribonucleoprotein complex // J. Biol. Chem. American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2011. Vol. 286, № 26. P. 23142-23149. Oberstrass F.C. et al. Structural biology - Structure of PTB bound to RNA: Specific binding and implications for splicing regulation // Science (80-. ). 2005. Vol. 309, № 5743. P. 2054-2057. Auweter S.D., Oberstrass F.C., Allain F.H.T. Solving the Structure of PTB in Complex with Pyrimidine Tracts: An NMR Study of Protein-RNA Complexes of Weak Affinitiesf // J. Mol. Biol. Academic Press, 2007. Vol. 367, № 1. P. 174-186.

Wright K.M., Oparka K.J. The ER within plasmodesmata // Plant Cell Monographs. Springer, Berlin, Heidelberg, 2006. Vol. 4. P. 279-308.

Iyer L.M. et al. Quoderat demonstrandum? The mystery of experimental validation of apparently erroneous computational analyses of protein sequences. // Genome Biol. BioMed Central, 2001. Vol. 2, № 12. P. research0051.1.

Pointing C.P., Parker P.J. Extending the C2 domain family: C2s in PKCs S, e,n,9, phospholipases, GAPs, and perforin // Protein Sci. John Wiley & Sons, Ltd, 2008. Vol. 5, № 1. P. 162-166. Aoki K. et al. Destination-selective long-distance movement of phloem proteins // Plant Cell. American Society of Plant Biologists, 2005. Vol. 17, № 6. P. 1801-1814.

Dinant S. et al. Diversity of the superfamily of phloem lectins (Phloem protein 2) in angiosperms // Plant Physiol. American Society of Plant Biologists, 2003. Vol. 131, № 1. P. 114-128.

130

131

132

133

134

135

136

137

138

139

140

141

142

143

144

145

146

147

148

149

150

151

152

Read S.M., Northcote D.H. Chemical and immunological similarities between the phloem proteins of three genera of the Cucurbitaceae // Planta. Springer-Verlag, 1983. Vol. 158, № 2. P. 119-127. Gómez G., Pallás V. Identification of an in vitro ribonucleoprotein complex between a viroid RNA and a phloem protein from cucumber plants // Mol. Plant-Microbe Interact. American Phytopathological Society, 2001. Vol. 14, № 7. P. 910-913.

Owens R.A., Blackburn M., Ding B. Possible involvement of the phloem lectin in long-distance viroid movement // Mol. Plant-Microbe Interact. American Phytopathological Society, 2001. Vol. 14, № 7. P. 905-909.

Gomez G., Pallas V. A Long-Distance Translocatable Phloem Protein from Cucumber Forms a Ribonucleoprotein Complex In Vivo with Hop Stunt Viroid RNA // J. Virol. 2004. Vol. 78, № 18. P. 10104-10110.

Walia Y. et al. Apple scar skin viroid naked RNA is actively transmitted by the whitefly trialeurodes vaporariorum // RNA Biol. Taylor and Francis Inc., 2015. Vol. 12, № 10. P. 1131-1138. Golecki B., Schulz A., Thompson G.A. Translocation of structural P proteins in the phloem // Plant Cell. American Society of Plant Biologists, 1999. Vol. 11, № 1. P. 127-140.

Bostwick D.E. et al. Pumpkin phloem lectin genes are specifically expressed in companion cells // Plant Cell. 1992. Vol. 4, № 12. P. 1539-1548.

Dannenhoffer J.M. et al. Expression of the phloem lectin is developmentally linked to vascular differentiation in cucurbits // Planta. Springer, 1997. Vol. 201, № 4. P. 405-414. Balachandran S. et al. Phloem sap proteins from Cucurbita maxima and Ricinus communis have the capacity to traffic cell to cell through plasmodesmata // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. Vol. 94, № 25. P.14150-14155.

Fierro-Monti I., Mathews M.B. Proteins binding to duplexed RNA: One motif, multiple functions // Trends Biochem. Sci. 2000. Vol. 25, № 5. P. 241-246.

Pallas V., Gómez G. Phloem RNA-binding proteins as potential components of the long-distance RNA transport system // Frontiers in Plant Science. Frontiers Research Foundation, 2013. Vol. 4, № MAY. P. 130.

Gómez G., Torres H., Pallás V. Identification of translocatable RNA-binding phloem proteins from melon, potential components of the long-distance RNA transport system // Plant J. John Wiley & Sons, Ltd, 2005. Vol. 41, № 1. P. 107-116.

Yoo B.C., Lee J.Y., Lucas W.J. Analysis of the complexity of protein kinases within the phloem sieve tube system. Characterization of Cucurbita maxima calmodulin-like domain protein kinase 1 // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, № 18. P. 15325-15332.

Ham B.K. et al. Systemic delivery of siRNA in pumpkin by a plant PHLOEM SMALL RNA-BINDING PROTEIN 1 -ribonucleoprotein complex // Plant J. Blackwell Publishing Ltd, 2014. Vol. 80, № 4. P.

683-694.

Ruiz-Medrano R., Xoconostle-Cázares B., Lucas W.J. Phloem long-distance transport of CmNACP mRNA: Implications for supracellular regulation in plants // Development. 1999. Vol. 126, № 20. P. 4405-4419.

Ma Y. et al. Pumpkin eIF5A isoforms interact with components of the translational machinery in the cucurbit sieve tube system // Plant J. John Wiley & Sons, Ltd, 2010. Vol. 64, № 3. P. 536-550. Zhang B. et al. Divergent metabolome and proteome suggest functional independence of dual phloem transport systems in cucurbits // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. National Academy of Sciences, 2010. Vol. 107, № 30. P. 13532-13537.

Schick C. et al. Cross-class inhibition of the cysteine proteinases cathepsins K, L, and S by the serpin squamous cell carcinoma antigen 1: A kinetic analysis // Biochemistry. 1998. Vol. 37, № 15. P. 52585266.

Irving J.A. et al. Evidence that serpin architecture intrinsically supports papain-like cysteine protease inhibition: Engineering a1-antitrypsin to inhibit cathepsin proteases // Biochemistry. 2002. Vol. 41, № 15. P.4998-5004.

Ray C.A. et al. Viral inhibition of inflammation: Cowpox virus encodes an inhibitor of the interleukin-1ß converting enzyme // Cell. 1992. Vol. 69, № 4. P. 597-604.

Irving J.A. et al. Serpins in prokaryotes // Mol. Biol. Evol. Society for Molecular Biology and Evolution, 2002. Vol. 19, № 11. P. 1881-1890.

Irving J.A. et al. Phylogeny of the serpin superfamily: Implications of patterns of amino acid conservation for structure and function // Genome Res. 2000. Vol. 10, № 12. P. 1845-1864. Law R.H.P. et al. An overview of the serpin superfamily // Genome Biology. BioMed Central, 2006.

153

154

155

156

157

158

159

160

161

162

163

164

165

166

167

168

169

170

171

172

173

174

175

176

177

178

Vol. 7, № 5. P. 1-11.

Kumar A. Bayesian phylogeny analysis of vertebrate serpins illustrates evolutionary conservation of the intron and indels based six groups classification system fromlampreys for ~500 MY // PeerJ. PeerJ Inc., 2015. Vol. 2015, № 6. P. e1026.

Gettins P.G.W. Serpin Structure, Mechanism, and Function // Chem. Rev. American Chemical Society, 2002. Vol. 102, № 12. P. 4751-4804.

Gettins P.G.W., Patston P.A., Olson S.T. Serpins: Structure, Function and Biology // Mol. Biol. Intell. Unit. 1996. P. 202.

Rühlmann A. et al. Structure of the complex formed by bovine trypsin and bovine pancreatic trypsin inhibitor. Crystal structure determination and stereochemistry of the contact region // J. Mol. Biol. Academic Press, 1973. Vol. 77, № 3. P. 417-436.

Marijanovic E.M. et al. Reactive centre loop dynamics and serpin specificity // Sci. Rep. Nature Publishing Group, 2019. Vol. 9, № 1. P. 1-15.

Whisstock J.C., Bottomley S.P. Molecular gymnastics: serpin structure, folding and misfolding // Curr. Opin. Struct. Biol. Elsevier Current Trends, 2006. Vol. 16, № 6. P. 761-768. Petsko G.A., Ringe D. Protein Structure and Function. 2008.

Whisstock J.C. et al. Conformational changes in serpins: I. The native and cleaved conformations of a1-antitrypsin // J. Mol. Biol. Academic Press, 2000. Vol. 296, № 2. P. 685-699. Huntington J.A., Read R.J., Carrell R.W. Structure of a serpin-protease complex shows inhibition by deformation // Nature. 2000. Vol. 407, № 6806. P. 923-926.

Carrell R.W., Owen M.C. Plakalbumin, a1-Antitrypsin, antithrombin and the mechanism of inflammatory thrombosis // Nature. 1985. Vol. 317, № 6039. P. 730-732.

Dafforn T.R., Pike R.N., Bottomley S.P. Physical characterization of serpin conformations // Methods. Academic Press Inc., 2004. Vol. 32, № 2. P. 150-158.

Gettins P.G.W., Olson S.T. Inhibitory serpins. New insights into their folding, polymerization, regulation and clearance // Biochemical Journal. Portland Press Ltd, 2016. Vol. 473, № 15. P. 2273-2293. Elliott P.R. et al. Inhibitory conformation of the reactive loop of a1-antitrypsin // Nat. Struct. Biol. Nature Publishing Group, 1996. Vol. 3, № 8. P. 676-681.

Horvath A.J. et al. The murine orthologue of human antichymotrypsin: A structural paradigm for clade A3 serpins // J. Biol. Chem. American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2005. Vol. 280, № 52. P.43168-43178.

Jin L. et al. The anticoagulant activation of antithrombin by heparin // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.

National Academy of Sciences, 1997. Vol. 94, № 26. P. 14683-14688.

Whisstock J.C. et al. Conformational changes in serpins: II. The mechanism of activation of

antithrombin by heparin // J. Mol. Biol. Academic Press, 2000. Vol. 301, № 5. P. 1287-1305.

Maclean P.S., Tait R.C. Hereditary and acquired antithrombin deficiency: Epidemiology, pathogenesis

and treatment options // Drugs. Springer, 2007. Vol. 67, № 10. P. 1429-1440.

Rezaie A.R. Calcium enhances heparin catalysis of the antithrombin-factor Xa reaction by a template

mechanism: Evidence that calcium alleviates Gla domain antagonism of heparin binding to factor Xa // J.

Biol. Chem. 1998. Vol. 273, № 27. P. 16824-16827.

Li W. et al. Structure of the antithrombin-thrombin-heparin ternary complex reveals the antithrombotic mechanism of heparin // Nat. Struct. Mol. Biol. 2004. Vol. 11, № 9. P. 857-862. Maurin N. Heparinresistenz und antithrombinmangel // Medizinische Klinik. Springer, 2009. Vol. 104, № 6. P. 441-449.

Mottonen J. et al. Structural basis of latency in plasminogen activator inhibitor-1 // Nature. 1992. Vol. 355, № 6357. P. 270-273.

Mushunje A. et al. Latent antithrombin and its detection, formation and turnover in the circulation // J. Thromb. Haemost. John Wiley & Sons, Ltd, 2004. Vol. 2, № 12. P. 2170-2177. Huntington J.A., Sendall T.J., Yamasaki M. New insight into serpin polymerization and aggregation // Prion. 2009. Vol. 3, № 1. P. 12-14.

Anfinsen C.B. Principles that govern the folding of protein chains // Science. 1973. Vol. 181, № 4096. P. 223-230.

Im H., Ahn H.-Y., Yu M.-H. Bypassing the kinetic trap of serpin protein folding by loop extension // Protein Sci. Wiley, 2000. Vol. 9, № 8. P. 1497-1502.

Kim D., Yu M.H. Folding pathway of human a1-antitrypsin: Characterization of an intermediate that is active but prone to aggregation // Biochem. Biophys. Res. Commun. Academic Press Inc., 1996. Vol. 226, № 2. P. 378-384.

179

180

181

182

183

184

185

186

187

188

189

190

191

192

193

194

195

196

197

198

199

200

201

202

203

204

Devlin G.L. et al. Acid denaturation of a1-antitrypsin: Characterization of a novel mechanism of serpin polymerization // J. Mol. Biol. Academic Press, 2002. Vol. 324, № 4. P. 859-870. Tew D.J., Bottomley S.P. Probing the equilibrium denaturation of the serpin a1-antitrypsin with single tryptophan mutants; Evidence for structure in the urea unfolded state // J. Mol. Biol. Academic Press, 2001. Vol. 313, № 5. P. 1161-1169.

Yamasaki M. et al. Crystal structure of a stable dimer reveals the molecular basis of serpin polymerization // Nature. 2008. Vol. 455, № 7217. P. 1255-1258.

Yamasaki M. et al. Molecular basis of a 1-antitrypsin deficiency revealed by the structure of a domain-swapped trimer // EMBO Rep. 2011. Vol. 12, № 10. P. 1011-1017.

Chang W.-S.W. et al. Importance of the release of strand 1C to the polymerization mechanism of inhibitory serpins // Protein Sci. Wiley, 2008. Vol. 6, № 1. P. 89-98.

Belorgey D. et al. Protein misfolding and the serpinopathies. // Prion. Taylor & Francis, 2007. Vol. 1, № 1. P. 15-20.

Grigoryev S.A., Woodcock C.L. Chromatin structure in granulocytes. A link between tight compaction and accumulation of a heterochromatin-associated protein (MENT) // J. Biol. Chem. American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 1998. Vol. 273, № 5. P. 3082-3089.

Irving J.A. et al. Inhibitory activity of a heterochromatin-associated serpin (MENT) against papain-like cysteine proteinases affects chromatin structure and blocks cell proliferation // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, № 15. P. 13192-13201.

Grigoryev S., McGowan S. Isolation and characterization of the nuclear serpin MENT // Methods Enzymol. Academic Press, 2011. Vol. 501. P. 29-47.

Torriglia A. et al. L-DNase II, a Molecule That Links Proteases and Endonucleases in Apoptosis, Derives from the Ubiquitous Serpin Leukocyte Elastase Inhibitor // Mol. Cell. Biol. American Society for Microbiology, 1998. Vol. 18, № 6. P. 3612-3619.

Padron-Barthe L. et al. Conformational Modification of Serpins Transforms Leukocyte Elastase Inhibitor into an Endonuclease Involved in Apoptosis // Mol. Cell. Biol. American Society for Microbiology, 2007. Vol. 27, № 11. P. 4028-4036.

Klieber M.A. et al. Corticosteroid-binding Globulin, a Structural Basis for Steroid Transport and Proteinase-triggered Release // J. Biol. Chem. American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2007. Vol. 282, № 40. P. 29594-29603.

Zhou A. et al. Structural mechanism for the carriage and release of thyroxine in the blood // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. National Academy of Sciences, 2006. Vol. 103, № 36. P. 13321-13326. Mala J.G.S., Rose C. Interactions of heat shock protein 47 with collagen and the stress response: An unconventional chaperone model? // Life Sci. Pergamon, 2010. Vol. 87, № 19-22. P. 579-586. Huntington J.A., Stein P.E. Structure and properties of ovalbumin // J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. Elsevier, 2001. Vol. 756, № 1-2. P. 189-198.

Solovyev A.G. et al. Subcellular localization and self-interaction of plant-specific Nt-4/1 protein // Biochimie. Elsevier, 2013. Vol. 95, № 7. P. 1360-1370.

Atabekova A.K. et al. Phylogenetic and functional analyses of a plant protein related to human B-cell receptor-associated proteins // Biochimie. 2017. Vol. 132. P. 28-37.

Makarova S.S., Solovyev A.G., Morozov S.Y. RNA-binding properties of the plant protein Nt-4/1 // Biochem. Maik Nauka Publishing / Springer SBM, 2014. Vol. 79, № 7. P. 717-726. Tolstyko E.A. et al. Detection and in vitro studies of Cucurbita maxima phloem serpin-1 RNA-binding properties // Biochimie. 2020. Vol. 170. P. 118-127.

Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. Nature Publishing Group, 1970. Vol. 227, № 5259. P. 680-685.

M A. et al. Thermophoresis for characterizing biomolecular interaction // Methods. Methods, 2018. Vol. 146. P.107-119.

DS V. et al. How the initiating ribosome copes with ppGpp to translate mRNAs // PLoS Biol. PLoS Biol, 2020. Vol. 18, № 1.

Larkin M.A. et al. Clustal W and Clustal X version 2.0 // Bioinformatics. 2007. Vol. 23, № 21. P. 29472948.

Roy A., Kucukural A., Zhang Y. I-TASSER: A unified platform for automated protein structure and function prediction // Nat. Protoc. NIH Public Access, 2010. Vol. 5, № 4. P. 725-738. Lorenz R. et al. ViennaRNA Package 2.0 // Algorithms Mol. Biol. Algorithms Mol Biol, 2011. Vol. 6, № 1.

Kibbe W.A. OligoCalc: An online oligonucleotide properties calculator [Electronic resource] // Nucleic

Acids Research. 2007. Vol. 35, № SUPPL.2. P. W43-6. URL:

https://www.researchgate.net/publication/6377305_Kibbe_WA_OligoCalc_an_online_oligonucleotide_p roperties_calculator_Nucleic_Acids_Res_35_W43-W46 (accessed: 18.06.2020).

205. Gasteiger E. et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server // The Proteomics Protocols Handbook. Humana Press, 2005. P. 571-607.

206. Rueden C.T. et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data // BMC Bioinformatics. BioMed Central Ltd., 2017. Vol. 18, № 1.

207. Schindelin J. et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis // Nature Methods. 2012. Vol. 9, № 7. P. 676-682.

208. Toscano-Morales R. et al. Long distance movement of an Arabidopsis Translationally Controlled Tumor Protein (AtTCTP2) mRNA and protein in tobacco // Front. Plant Sci. Frontiers Media S.A., 2014. Vol. 5, № DEC. P. 705.

209. Yoo B.C. et al. Characterization of Cucurbita maxima phloem serphin-1 (CmPS-1). A developmentally regulated elastase inhibitor // J. Biol. Chem. American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2000. Vol. 275, № 45. P. 35122-35128.

210. Petersen M.L.C. et al. Cucurbit phloem serpins are graft-transmissible and appear to be resistant to turnover in the sieve element-companion cell complex [Electronic resource] // Journal of Experimental Botany. 2005. Vol. 56, № 422. P. 3111-3120. URL:

https://academic.oup.com/jxb/article/56/422/3111/749497 (accessed: 06.06.2020).

211. Brodersen P., Voinnet O. The diversity of RNA silencing pathways in plants // Trends in Genetics. Elsevier Current Trends, 2006. Vol. 22, № 5. P. 268-280.

212. Lampl N. et al. Arabidopsis AtSerpin1, crystal structure and in vivo interaction with its target protease RESPONSIVE to DESICCATION-21 (RD21) // J. Biol. Chem. J Biol Chem, 2010. Vol. 285, № 18. P. 13550-13560.

213. Morozov S.Y. et al. Plant 4/1 protein: Potential player in intracellular, cell-to-cell and long-distance signaling // Front. Plant Sci. Frontiers Research Foundation, 2014. Vol. 5, № FEB. P. 26.

214. Schaefer M. et al. RNA methylation by Dnmt2 protects transfer RNAs against stress-induced cleavage // Genes Dev. Genes Dev, 2010. Vol. 24, № 15. P. 1590-1595.

215. Blanco S. et al. Aberrant methylation of t RNA s links cellular stress to neuro-developmental disorders // EMBO J. EMBO, 2014. Vol. 33, № 18. P. 2020-2039.

216. Lampl N. et al. Set-point control of RD21 protease activity by AtSerpin1 controls cell death in Arabidopsis // Plant J. 2013. Vol. 74, № 3. P. 498-510.

217. Lema Asqui S. et al. AtSERPIN1 is an inhibitor of the metacaspase AtMC1-mediated cell death and autocatalytic processing in planta // New Phytol. 2018. Vol. 218, № 3. P. 1156-1166.

218. Vercammen D. et al. Serpin1 of Arabidopsis thaliana is a Suicide Inhibitor for Metacaspase 9 // J. Mol. Biol. Academic Press, 2006. Vol. 364, № 4. P. 625-636.