Поиск эффективных мишеней РНК-интерференции в транскриптах ВИЧ-1 и разработка нового метода создания кассетных генетических конструкций, экспрессирующих несколько siPHK тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Алембеков, Ильдар Русланович

• Алембеков, Ильдар Русланович
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Алембеков, Ильдар Русланович

1.1 Актуальность проблемы..................................................................................................6

1.2 Цель и задачи исследования............................................................................................7

1.3 Научная новизна результатов исследования.................................................................8

1.4 Практическая ценность....................................................................................................9

1.5 Апробация работы............................................................................................................9

1.6 Структура и объем работы..............................................................................................9

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

2.1 РНК интерференция.......................................................................................................10

2.1.1 Современные представления о механизме РНК-интерференции..................................10

2.1.2 Малые и длинные некодирующие РНК...........................................................................13

2.1.3 Биогенез малых РНК..........................................................................................................1 8

2.1.4 Сборка комплекса РНК-сайленсинга...............................................................................22

2.1.5 Расщепление мРНК-мишени и трансляционная репрессия...........................................27

2.1.6 Регуляция РНК-интерференции........................................................................................29

2.2. Биология ВИЧ-1............................................................................................................30

2.2.1 Строение ВИЧ-1.................................................................................................................30

2.2.2 Жизненный цикл ВИЧ-1....................................................................................................32

2.3 Использование РНК интерференции в терапии СПИДа............................................40

2.3.1. Основные принципы разрабатываемой генотерапии с использованием генетических конструкций, запускающих РНК-интерференцию..........................................40

2.3.2 Поиск мишеней в геноме ВИЧ-1 для РНК интерференции...........................................42

2.3.3 Доставка генетических конструкций в организм............................................................43

2.3.4 Неспецифические эффекты терапии с использованием РНК-интерференции............46

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 48

3.1 Биологические материалы.............................................................................................48

3.1.1. Используемые векторы.....................................................................................................48

3.1.2. Олигонуклеотиды..............................................................................................................50

3.1.3. Культуры клеток...............................................................................................................51

3.2. Создание генетических конструкций..........................................................................52

3.2.1. Вставки для экспересии отдельных з1РНК и вставки-домены......................................52

3.2.2. Кассетные вставки............................................................................................................52

3.2.3. Клонирование....................................................................................................................55

3.3. Испытание созданных конструкций в невирусной системе.....................................60

3.3.1. Очистка и нормализация препаратов плазмидной ДНК...............................................60

3.3.2. Трансфекция......................................................................................................................60

3.3.3. Измерение люминесценции люцифераз.........................................................................61

3.4 Выделение тотальной РНК............................................................................................63

3.5 Детекция з!РНК методом защиты от РНКазы.............................................................63

3.4.1. Приготовление меченной РНК........................................................................................64

3.4.3 Детекция э^НК..................................................................................................................64

3.6 Детекция активации интерферон-зависимого ответа методом ОТ-ПЦР..................65

3.6.1 Синтез кДНК......................................................................................................................65

3.6.2 Праймер-специфичная амплификация.............................................................................66

3.7. Испытание генетических конструкций в пссвдолентивирусной системе...............66

3.7.1. Получение рекомбинантных псевдолентивирусов и подавление их продукции интерферирующими РНК...........................................................................................................66

3.7.2. Определение вирусного титра и эффективности ингибирования продукции лентивирусов с помощью анти-ВИЧ з11ША.............................................................................67

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 68

4.1 Выбор мишеней РНК-интерференции в геноме ВИЧ-1.............................................68

4.2 Эффективность РНК-интерференции, вызываемой генетической конструкцией, зависит от силы промотора........................................................................................................71

4.3 Генетические конструкции, экспрессирующие удлинённые шпильки, запускают более эффективную РНК-интерференцию...............................................................................74

4.4 Новый метод создания кассетных генетических конструкций с использованием олигонуклеотидов, не образующих шпильки..........................................................................78

4.5 Испытание кассетных генетических конструкций, экспрессирующих несколько з!РНК, в невирусной системе.....................................................................................................82

4.6 Испытание генетических конструкций, экспрессирующих Б1РНК, в псевдолентивирус-клеточной системе......................................................................................88

4.6.1 Расположение и структура сайтов-мишеней для анти-ВИЧ siPHK в последовательностях транскриптов системы лентивирусной экспрессии in vitro...............89

4.6.2 Подавление продукции псевдолентивирусов в клетках линии НЕК-293Т путем коэкспрессии siPHK, направленных против разных мишеней в лентивируспом геноме ....90

4.7 Генетические конструкции, экспрессирующие siPHK, не вызывают активации неспецифического интерферон-зависимого ответа.................................................................96

4.7.1 Анализ возможной активации интерферонового пути...................................................97

4.7.2 Гены, использованные в детекции активации интерферонового пути.........................97

4.7.3 Вариабельность неспецифического интерферонового ответа.......................................98

ВЫВОДЫ 100

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 101

Список сокращений

дцРНК - двуцепочечные РНК ;

ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека тип1;

СПИД — синдром приобретенного иммунодефицита;

п. н. — пар нуклсотидов;

т. п. н. — тысяч пар нуклеотидов;

н. - нуклеотидов;

т. н. - тысяч нуклеотидов;

rpm - оборотов в минуту (revolutions per minute); ПААГ — полиакриламидный гель;

RISC - эффекторный комплекс РНК сайлепсинга (RNA interference silencing complex); dsRBP - белки, связывающие двуцепочечную РНК (double strand RNA binding protein,); RITS - Эффекторный комплекс транскрипционного генного РНК сайлснсинга (RNA interference transcriptional gene silencing complex); РзРП - РНК-зависимая РНК полимераза;

siPHK - малые интерферирующие РНК (small interfering RNA, siRNA); miPHK - микро РНК (microRNA, miRNA);

piPHK - PI IK взаимодейстующие с piwi (PlWI-interacting RNA, piRNA); endo-siPHK - эндогенные siPHK;

tasiPIIK - транс-действующие siPHK (trans-acting siPHK); snoPHK - малые нуклеолярные PIIK (small nucleolar RNA); DCLs - Dicer-подобные белки (Dicer Like proteins); ADAR — аденозиндеаминаза ;

shRNA - короткие шпилечные РНК (short hairpin RNA); pol III - Полимераза III; pol II — Полимераза II; ПЭГ — полиэтиленгликоль;

PKR - дцРНК-зависимая Ser/Thr-протеин киназа R (Protein Kinase R);

ИСГ - интерферон-стимулируемые гены ;

ППТ - полипуриновый тракт;

цППТ- центральный полипуриновый тракт;

1 Общая характеристика работы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Поиск эффективных мишеней РНК-интерференции в транскриптах ВИЧ-1 и разработка нового метода создания кассетных генетических конструкций, экспрессирующих несколько siPHK»

1.1 Актуальность проблемы

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является причиной неизлечимого и опасного заболевания (СПИДа), в настоящее время имеющего во многих странах мира статус эпидемии. На начало 2013 года по оценкам ВОЗ число инфицированных людей по всему миру превышало 35 миллионов человек и имеет многолетнюю устойчивую тенденцию к росту. Инфекция, вызываемая ВИЧ неизлечима, но, несмотря на это, в странах с доступом к современным лечениям пациенты имеют хорошее ожидание продолжительности и качества жизни. Ухудшающуюся эпидемиологическую ситуацию омрачают многократные безуспешные попытки создать вакцину от ВИЧ.

Для лечения СПИДа в мире зарегистрировано около пятидесяти антиретровирусных препаратов. По механизму действия и особенностям химического строения они разделяются на пять групп: пуклеозидные и ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, ингибиторы протеазы, ингибиторы слияния/проникновения, ингибиторы интегразы. На сегодняшний день наиболее эффективно лечение с использованием комбинации нескольких препаратов, - высокоактивная антиретровирусная терапия (ВАРТ). ВАРТ позволяет остановить прогрессию ВИЧ инфекции, уменьшить смертность, увеличить продолжительность жизни больного. К сожалению, из-за зачастую высокой стоимости, большая часть пациентов из 35,3 миллионов по всему миру (2012 год) не имеют доступ к современной антирстровирусной терапии. Кроме того, из-за возникновения резистентности ВИЧ к антиретровирусному препарату и индивидуальной непереносимости, приходится выбирать новую комбинацию препаратов, способную предотвратить размножение мутировавшего вируса. Распространение резистентных вариантов ВИЧ сужает арсенал эффективных препаратов, и толкает на затратные поиски и изучение новых антиретровирусных препаратов, к которым чувствительны резистентные варианты.

Благодаря успехам в изучении механизмов регуляции экспрессии генов, достигнутых в последние пятнадцать лет, появилась возможность создания нового класса лекарственных средств против ВИЧ, использующих РНК-интерференцию. Феномен РНК-интерференции заключается в избирательном подавлении экспрессии гена с помощью коротких интерферирующих РНК (siPHK), которые комплементарны транскриптам гена-мишени (Fire, 1998; Elbashir ct al., 2001). В сравнении с нокаутом, РНК-интерференция быстрый и более экономичный инструмент обратной генетики (reverse genetics),

ускоривший функциональное изучение секвенированных геномов, позволяющий проводить полногеномные скрининги, анализ биохимических путей и отдельных генов (Cullen and Arndt, 2005; Aagard and Rossi, 2007). Показана принципиальная возможность использовать РНК-интерфернцию в лечении вирусных, онкологических и генетических заболеваний (Aagard and Rossi, 2007; Gavrilov and Saltzman, 2012). Препараты, использующие РНК-интерференцию, уже проходят клинические исследования. Обещающие результаты в лабораторных условиях показана эффективность РНК-интерференции против смертельного вируса Эбола, для которого пока не существует специфического лечения (Geisbert et al., 2010).

РНК-интерференция в качестве лечения ВИЧ-инфекции имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционной терапией. При лечении с помощью РНК-интерференции можно использовать несколько siPHK, направленных против разных мишеней (Anderson et al., 2003). При использовании высоко консервативных мишеней это замедлит возникновение резистентных форм (ter Brake, 2006). При возникновении резистентных форм вируса, имеющих мутации в мишени, последовательность siPHK к этой мишени может быть с лёгкостью изменена, что восстановит эффективность специфической РНК-интерференции. В качестве мишени может быть использована и мРНК гена человека CCR5, белковый продукт которого важен в развитии ВИЧ-инфекции, и, насколько известно, не имеет какой либо значимой физиологической функции.

1.2 Цель и задачи исследования

Цель диссертации — выявить новые мишени в транскриптах ВИЧ-1 субтипа А, которые будут поражаться биологически активными siPHK, а также создать и испытать генетические конструкции, экспрессирующие одну или несколько siPHK, эффективно поражающие эти мишени в вирусных РНК и в мРНК гена CCR5.

Для достижения цели исследования необходимо было решить следующие задачи:

1. Выбрать критерии отбора и провести отбор мишеней siPHK в трапскриптах вируса и в мРНК гена CCR5.

2. Создать генетические конструкции, экспрессирующие одиночные siPHK, направленные на мишени в транскриптах вируса и в мРНК гена CCR5 человека.

3. Создать невирусную систему для количественной оценки эффективности РНК-интерференции, запускаемой генетическими конструкциями.

4. Разработать надежный метод создания кассетных генетических конструкций, которые одновременно экспрессируют три з1РНК, атакующие мишени в геноме ВИЧ-1 и в мРНК гена-рецептора ССЯ5, необходимого для внедрения вируса в клетки хозяина.

5. Выяснить зависимость эффективности РНК-интерференции от силы используемого в конструкциях промотора и от длины шпильки РНК.

6. Провести испытание эффективности РНК-интерференции, запускаемой генетическими конструкциями, и молекулярный анализ РНК, доказывающий образование молекул 81РНК при введении конструкций в клетки человека.

1.3 Научная новизна результатов исследования

Получены новые данные изучения искусственно вызываемой РНК-интерференции. Созданы генетические конструкции, кодирующие новые биологически активные 31РНК, направленные на мишени в вирусе и в мРНК гена ССЯ5 человека. Для количественной оценки эффективности РНК-интерференции, запускаемой генетическими конструкциями, была разработана и испытана невирусная система. В ходе исследования мы столкнулись с трудностями при создании кассетных генетических конструкций, содержащих несколько палиндромов и экспрессирующих несколько з1РПК. Проблема связана с образованием нескольких стабильных шпилек в исходных олигонуклеотидах. Поэтому был предложен и апробирован новый удобный и быстрый метод для создания кассетных генетических конструкций, экспрессирующих несколько з1РНК. Обнаружено, что экспрессия созданных генетических конструкций приводит к эффективной атаке выбранных мишеней. При молекулярном анализе препаратов РНК обнаружены молекулы з1РНК, имеющие длину в 21 нуклеотид. Ранее считалось, что даже небольшие количества двуспиральиой РНК могут вызывать мощную РНК-интерференцию и что 27-нуклеотидные шпильки РНК усиливают РНК-интерференцию в десятки раз. Нам удалось показать, что для эффективной РНК-интерференции в клетках человека необходимо достаточно большое количество экспрессируемой РНК, т.к. сила РНК-интерференции зависит от силы промотора, использованного при создании конструкции. Кроме того, наши данные свидетельствуют о том, что 27-нуклеотидные шпильки РНК лишь ненамного усиливают РНК-интерференцию. Обнаружено, что созданные генетические конструкции, экспрессирующие 19-27-нуклеотидные шпильки РНК, не вызывают неспецифический интерферон-подобный ответ.

1.4 Практическая ценность

Генотерапия с помощью РНК-интерференции является одной из наиболее перспективных стратегий лечения вирусных инфекций и других заболеваний. В данной работе мы выявили новые эффективные мишени РНК-интерференции в ВИЧ-1, которые могут быть важны для разработки технологии генотерапии СПИДа. Результаты данной работы могут использоваться для разработки технологии генотерапии и других вирусных инфекций, а также для других ее задач. Метод быстрого создания кассетных генетических конструкций является универсальным и может использоваться как в фундаментальных исследованиях для создания составных генетических конструкций, так и для целей генотерапии с помощью РНК-интерференции, использующей наборы з1РНК. Важными с практической точки зрения являются и полученные в данной работе результаты сравнения эффективности РНК-интерференции, которая запускается короткими и длинными шпильками РНК, а также вывод о важности выбора промотора при создании генетических конструкций.

1.5 Апробация работы

Данная работа апробирована на лабораторном семинаре в Лаборатории эпигенетических механизмов регуляции экспрессии генов ИМБ РАН им. В. А. Энгельгардта. Результаты работы были представлены: на 14-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2010); на трёх итоговых конференциях приоритетного направления "Живые системы" ФЦП "Исследования и разработка по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса на 2007-2012 годы" (Москва 2007, 2008).

1.6 Структура и объем работы

Диссертация изложена на 126 страницах, содержит 18 рисунков и 7 таблиц, состоит из вводной части, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения и выводов. Список литературы включает 277 литературных источников.

2. Обзор литературы 2.1 РНК интерференция

2.1.1 Современные представления о механизме РНК-интерференции.

Явление РНК-интерференции впервые было обнаружено в экспериментах, проведенных на нематоде Caenorhabditis elegans. Было обнаружено, что РНК-интерференция представляет собой эволюционно консервативный механизм регуляции экспрессии генов (Fire et al., 1998; Reinhart et al., 2000).

РНК-интерференция - это механизм посттранскрипционного генного сайленсинга, в котором про помощи малых некодируюгцих РНК (small interfering RNAs, si РНК) происходит расщепление комплементарной им РНК-мишени. В результате экспрессия гена-мишени подавляется.

РНК-интерференция широко распространена как среди животных, так и среди растении и контролирует процессы роста и дифференциации тканей, формирования гетерохроматина, а также деления клеток (Wilson and Doudna, 2013). Кроме того данный процесс также служит естественной защитой от вирусов и мобильных элементов (Tijsterman et al., 2002).

Рассмотрим подробнее механизм РНК-интерференции (см. Рис.1). Основную роль в данном процессе играют siPHK, которые по принципу комплементарное™ распознают соответствующие мРПК-мишени. Первоначально предполагалось, что РНК-интерференция необходима только для защиты от экспрессии вирусов и мобильных элементов, однако сейчас понятно, что данный механизм в целом необходим для регуляции экспрессии генов, для направленного сайленсинга.

(RPR)

dsRNA

siRNAs

— miRNA

'RITS' effector complex RISC'

genome dna TIT ТТГ

RNA

\

DNA/histone methylation

TGS

5' —

mRNA degradation

RNAi/PTGS

-Ш- 3' mRNA

heterochromatin virus resistance

transgene silencing, transposon control

translation block

development

Рис.1 Обобщенная схема РНК-интерференции (Matzke and Matzke, 2004).

Индуктором РНК интерференции, является присутствие в клетке длинных двуцепочечных РНК. Анализ образующихся в ходе РНК интерференции РНК показал, что они содержат фосфатные группы на 5'-конце. Фосфорилирование осуществляется ферментами из семейства рибонуклеаз III. Рибонуклеазы, участвующие в РНК-интерференции делятся на три класса в соответствии с их доменной структурой. Так, бактериальные РНКазы III, которые могут использоваться для получения siPHK in vitro, содержат каталитический домен и домен, отвечающий за связывание с двуцепочечной РНК; семейство эндонуклеаз Drosha содержит два каталитических домена. Третье семейство эндонуклеаз также содержат два каталитических домена, дополнительные хеликазный домен и PAZ домен.

Белок Dicer относится к третьему семейству рибонуклеаз. РНК-интерференция начинается с расщепления в цитоплазме клеток данным белком длинных двуцепочечных РНК на короткие, от 21 до 25 н. длинной, РНК дуплексы (Zamore et al., 2000). При этом основной структурной особенностью полученных РНК дуплексов является выступающие З'-концы, длиной от 1 до 3 н., а также фосфорилированные 5'-концы. Подобная структура РНК-дуплексов необходима для их дальнейшего распознавания белками Argonaute. Белки

Argonaute, связываясь с PIIK дуплексами, инициируют их расщепление на зрелые одноцепочечные некодирующие РНК. Кроме того белки группы Argonaute запускают сборку оффекторного комплекса РНК сайленсинга (RNA interference silencing complex, RISC).

На втором этапе, данные РНК присоединяются к РНК-белковому комплексу RISC. При этом сборка комплекса RISC, расплетание дуплекса и выбор ведущей цепи происходят одновременно. Минимальный состав эффекторного комплекса состоит из белка Dicer, белков семейства Argonaute, а также белков, связывающих двуцепочечную PI-IK (double strand RNA binding protein, dsRBP) (MacRae ct al., 2008). В результате действия данного комплекса одноцепочечные некодирующие РНК связываются с комплементарной им мРНК, и в дальнейшем происходит разрезание белками семейства Argonaute, входящими в комплекс RISC, мРНК-мишени. Кроме того, siPIIK могут также участвовать в сборке еще одного белкового комплекса, RITS (RNA interference transcriptional silencing complex), который участвует в транскрипционном сайленсинге соответствующего гена, за счет изменения эпигенетического состояния хроматина, вызывая появление специфических гистоновых модификаций, таких как ПЗК9те в промоторной области гена-мишени. Также комплекс RITS у некоторых организмов может взаимодействовать еще с одним комплексом, RDRC, содержащем PIIK-зависимую РНК полимеразу (РзРП) для процессинга дополнительных siPHK, необходимых для транскрипционного сайленсинга (Creamer and Partrigc, 2011).

Кроме того, помимо посттранскрипционного и транскрипционного сайленсинга siPI IK в комплексе с РНК-связывающими белками могут вызывать деаденплирование РНК-мишени, либо ингибирование экспрессии на уровне трансляции. В результате, в ходе РНК-интерференции экспрессия гена-мишени резко подавляется, при этом эффективность данного процесса обеспечивается комплемептарностыо мРНК-мишени и концентрацией молекул siPHK.

Одним из наиболее необычных аспектов РНК интерференции является ее способность к распространению по всему организму. Так было показано, что у C.elegans РНК-интерференция затрагивает все клетки организма, даже при введении минимальных количеств двуцепочечной РНК (Fire ct al., 1998). Особенно ярко феномен системного сайленсинга наблюдается у растений (Palauqui et al., 1997). Распространение РНК-интерференции от одной клетки к другой требует, во-первых, системы передачи молекул от клетки к клетке, а во-вторых специального механизма амплификации РНК-сигнала. Данный феномен был назван транзитивной РНК-интерференцией. Недавно было показано, что транзитивная РНК-интерференция передает процесс сайленсинга по всему

12

организму или гену. Так, например, у С.elegance введение в клетку транскршггов комплиментарных З'-области РНК мишени, запускало не только расщепление всей мРНК, но также и продукцию новых siPHK, комплементарных не только исходной области, а также вышележащим областям, прилегающим к району, против которого вводились РНК. Если получаемые РНК были комплементарны к другим мРНК в клетке, то эти мРНК также разрушались (Sijen et al., 2001). Таким образом, происходит лавинообразное накопление различных наборов siPHK. Для протекания подобного процесса необходимо наличие ферментов, способных к синтезу РНК на РНК-матрице. У растений и у нематоды С.elegance эту функцию выполняет РНК-зависимая РНК полимераза (Schicbel et al., 1998). Кроме того активность РзРП была также обнаружена в эмбриональных экстрактах дрозофилы, хотя феномен транзитивной РНК-интерференции у мух еще не обнаружен. В ходе множества экспериментов было показано, что РзРП не участвует в процессе РНК-интерференции у эмбрионов дрозофилы, однако, возможно, что этот фермент может запускать РНК-интерференцию через синтез двуцепочечной РНК на основе транскршггов трансгенов (Lipardi et al., 2001). У растений процесс транзитивной РНК-иптерферспции в пределах одного гена распространяется не только в направлении 3' — 5' но также и в направлении 5' — 3' (Fabian et al., 2002). У человека и других млекопитающих феномен транзитивной РНК-интерференции не обнаружен. Кроме того, пока не обнаружено также присутствие в клетках млекопитающих и РзРП (Dillin, 2003).

2.1.2 Малые и длинные некодирующие РНК

В течение долгого времени считалось, что основной функцией РНК является посредничество в переносе генетической информации от ДНК к белку. Однако при этом, в ходе экспериментов по глубокому секвенированию генома человека оказалось, что он содержит всего лишь около 21 тыс. белок-кодирующих генов — что схоже с количеством белок-кодирующих генов у нематоды С. elegance (Lander et al., 2001). В ходе дальнейших экспериментов по изучению транскриптома в рамках проекта ENCODE было обнаружено что в геноме человека кодируются десятки тысяч некодирующих РНК, и возможно, что данная «темная материя» генома играет важную роль в обеспечении функционирования всего организма (Djcbali et al., 2012; Frazer, 2012; Stamatoyannopoulos, 2012). Также была предложена гипотеза «первазивной» транскрипции, предполагающая, что весь геном транскрибируется (Clark et al., 2011). Однако биологические функции некодирующих РНК были обнаружены гораздо раньше, при открытии их роли в обеспечении генного

сайленсинга (Fire et ab, 1998). В настоящее время выделяют два основных вида некодирующих РНК исходя из их размера:

• Малые некодирующие РНК

• Длинные некодирующие РНК

Малые некодирующие РНК, длиной от 20 до 30 нуклеотидов, являются центральным компонентом PIIK-интерференции и родственных ей механизмов - процессов, которые регулируют экспрессию генов у большого числа различных организмов, от почкующихся дрожжей до человека (Ambros, 2004; Cogoni and Macino, 1997; Fire et al., 1998; Hamilton and Baulcombe, 1999). Малые некодирующие РНК, могут быть объединены в три основных группы, на основании их длины, типа биогенеза и эффекторных белков, участвующих в их биогенезе и функции. Так выделяют:

• малые интерферирующие РНК (short interfering RNA, .siUNA)

• микро РНК (micro RNA, miRNA)

• РНК взаимодейстуюгцие с piwi (PIWI-interacting RNA, piRNA)

Эти молекулы играют ключевую роль в регуляции генной экспрессией, управляя процессом распознавания таргетной РНК на основании комплементарности последовательности малой РНК. Кроме того, помимо этих трех основных классов малых некодирующих РНК выделяют также:

• Ассоциированные с промотором некодирующие РНК (PASR)

• Ассоциированные с терминатором некодирующие РНК (TASR)

• Первичные малые РНК (priRNA)

Далее мы подробно рассмотрим основные типы малых некодирующих РНК, участвующих в генном сайленсинге.

Малые интерферирующие РНК (siPHK)

Малые интерферирующие РНК - это класс малых РНК, основной функцией которых является обеспечение генного сайленсинга с помощью механизма РНК-интерференции. Последовательность siPHK полностью комплементарна РНК-мишени, при этом длина этих некодирующих РНК варьирует от 20 до 25 н, а максимум приходится на 21 н. (Kaikonnen et al., 2011).

Выделяют два типа малых интерферирующих РНК: экзогенные, т.е. поступающие в клетку извне, и эндогенные. К экзогенным siPHK относят РНК вирусов, а также любые искусственные siPHK, вводимые в клетку (Whilson and Doudna, 2013). Эндогенные siPHK формируются как правило из транспозонов, которые могут синтезироваться как со

смысловой так и с ангисмысловой цепи, из последовательностей, содержащих комплементарные участки, которые в последствии образуют длинные шпилечные структуры. Впервые эндогенные siPIIK (endo-siPHK) были обнаружены у растений (Vazquez et al., 2004) и нематоды С. elegance, а позже были обнаружены у Drosophila и у млекопитающих. Такое широкое распространение endo-siPIIK среди различных организмов свидетельствует об их важности для большинства эукариот. 11омимо процессов направленного сайленсинга с помощью РНК интерференции endo-siPIIK также участвуют в формировании гетерохроматина, через специфические модификации гистонов и метилирование ДНК (Peragine et al., 2004; Vazquez et al., 2004; Williams et al., 2005). Endo-siPHK у дрозофилы, были впервые идентифицированы с помощью глубокого секвенирования малых РНК, выделенных из половых и соматических клеток. Было показано, что их действие направлено в основном против экспрессии ретротранспозонов, длинных РНК транскриптов, имеющих двуцепочечные РНК структуры, а также против некоторых мРНК (Czech et al., 2008; Ghildiyal et al., 2008; Kawamura et al., 2008). У млекопитающих endo-siPHK направлены против единственного транспозона L1, относящегося к классу LINE (Long interspersed nuclear element). В ходе транскрипции с обеих цепей этого элемента формируется двуцепочечная РНК, которая затем процессируется в siPHK (Yang and Kazazian, 2006). Также endo-siPHK были обнаружены в ооцитах мыши. Эти endo-siPIIK синтезируются с последовательностей транспозонов, а также в результате гибридизации РНК ген-псевдогсн. Эти РНК также имеют длину 21-22 п., и требуют наличия Dicer'a и AG02 для биогенеза (Watanabe et al., 2008).

Рассмотрим подробнее некоторые типы endo-siPHK:

Транс-действующие короткие интерферирующие РНК

Эти малые РНК, длиной 21 и. Они используют эндогенный трапскрипт-мишень как матрицу для РНК-зависимой РНК полимеразы, которая конвертирует его в двуцепочечную РНК. Далее из этого транскрипта при участии белков DCL4 и AG07 генерируются новые tasiPHK (trans-acting siPHK).

У животных, в том числе и у человека, РНК зависимая РНК полимераза отсутствует, и поэтому они лишены такого типа siPHK. TasiPHK распространены в основном среди растений, и подавляют экспрессию посредством посттранскрнпционого генного сайленсинга (Vazquez et al., 2004). TasiPHK схожи с miPIIK не только по размеру, но и по выполняемым функциям. Так, в отличие от остальных siPHK, tasiPHK могут связываться с не полностью комплиментарной РНК-мишеныо. Кроме того, они транскрибируются в геноме, образуя полиаденилированный двуцепочечный предшественник (Williams et al., 2005). Также было показано, что первичные микро-РНК транскрипты могут

15

рекрутировать PI-IK-зависимую РНК полимеразу, которая впоследствии генерирует новые tasiPHK (Peragine et al., 2004). Подобный механизм образования tasiPHK является примером РНК регуляции других малых РНК.Так например miPI-IK miR-390 может индуцировать работу РзРП на первичнеых транскриптах, и конвертировать их в длинные двуцепочечные РНК.

Ассоциированные с повторами короткие интерферирующие РНК

Длина данных транскриптов варьирует от 24 до 26 и. Данные транскрипты являются продуктом работы DCL3 на двуцепочечпых транскриптов, происходящих в результате неконтролируемой транскрипции с локусов, содержащих ретротранспозоны. Эти локусы обычно сильно метилированы для предотвращения нежелательной транскрипции в подобных областях генома. Как и tasiPHK используют РзРП для генерации новых rasi-RNA. Этот тип РНК играет важную роль в гаметогенезе у мух, червей и некоторых млекопитающих за счет изменения состояния хроматина. Также эти РНК важны для сайленсинга вирусных транскриптов, за счет рекрутирования модифицирующих гистоны белков^ЬПБОп and Doudna, 2013).

Микро РНК

miPHK - это обширный класс эндогенных некодирующих РНК, длиной 21-25 н., которые обеспечивают генный сайленсинг на посттранскрипционном уровне. miPHK являются очень распространенным типом некодирующих РНК. Так области генома, кодирующие miPHK, затрагивают около 1% всех генов у человека (Lai et al. 2003; Lim et al., 2003a, 2003b). У человека известно более 700 различных miPHK (Griffiths-Jones et al., 2008).

Основным отличием miPHK от siPHK является отсутствие полной комплементарности мРНК-мишени. Как правило, miPHK, содержат в своей последовательности небольшой консервативный участок - район ядра miPIIK (seed region), ответственный за взаимодействие с таргетной молекулой РНК. За счет неполной комплементарности, miPHK могут взаимодействовать с множеством различных мишеней. Кроме того, несколько miPHK могут связываться с одной и той же молекулой мРНК. Таким образом, степень сайленсинга той или иной мРНК зависит от количества определенных miPHK, их комбинации. Такое кооперативное действие miPIIK, обеспечивает тонкую настройку экспрессии генов в клетке (Bushati and Cohen, 2007).

Транскрипты, содержащие miPIIK, имеют структуры, характерные для мРНК, и синтезируются полимеразой II (pol II) (Cai et al, 2004; Lee et al., 2004). Кроме того,

16

эндогенные транскрипты, которые содержат комплементарные или почти комплементарные инвертированные повторы длиной 20-50 могут гибридизоваться сами на себя, формируя двуцепочечные РНК-шпильки, также процессирующиеся в microRNA. Некоторые miPHK созревают из других типов РНК, таких как тРНК, snoPHK (small nucleolar RNA) или особой некодирующей РНК x-ncRNA (x-noncoding RNA). Некоторые из этих РНК из-за недостаточной изученности не отнесены однозначно к miPIIK, хотя и имеют некоторые ключевые признаки miPHK (Babiarz et al., 2008; Haussecker et al., 2010; Ender et al., 2008).

Последовательности, кодирующие miPHK, могут располагаться в экзонах, нитронах, в некодирующих частях гена, а также в межгенных областях генома. Как правило, miPHK, обнаруживаемые в экзонах, располагаются в некодирующих генах, дающих мРНК-подобный транскрипт. Кроме того, в базе экспрессируемых последовательностей (EST, expressed sequence tag) обнаружены последовательности miPIIK, находящиеся в составе уже силайсированной и полиаденилировапиой белок-кодирующей мРНК (Smallieiser, 2003). Однако больше половины всех miPIIK-кодирующих локусов расположены в нитронах предсказанных или экспериментально подтвержденных генов (Rodriguez ct al., 2004; Kim and Kim, 2007). В случае интронных miPHK, их транскрипция происходит в составе пре-мРНК, а для созревания может дополнительно требоваться сплайсинг (Aravin et al., 2003; Ambros et al., 2003). Последовательности, кодирующие интронные miPHK, зачастую имеют одинаковую ориентацию с геном-«хозяином», и в таком случае, вероятно, транскрибируются в составе ripe-мРНК с промотора гена-«хозяина» (Aravin et al., 2003). Также известны miPHK (подкласс SO miRNAs, splice site overlapping microRNA), располагающиеся на границе экзон-интрон белок-кодирующего гена и участвующие в одном из типов альтернативного сплайсинга (exon skipping). Вырезание miPHK происходит вместе с одним сайтом сплайсинга. После этого, система сплайсинга удаляет два интрона и экзон между ними, создавая при этом альтернативную мРНК без одного экзона (Melamed et al., 2013; Mattioli et ai., 2013).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Алембеков, Ильдар Русланович, 2014 год

Список литературы

Aagaard L. and Rossi J. J. 2007. RNAi therapeutics: principles, prospects and challenges. Adv. Drug. Deliv. Rev., 59(2-3), 75-86.

Adelson M., Pacchia A. L., Kaul M., Rando R. ¥., Ron Y„ Peltz S. W„ Dougherty .1. P. 2003. Toward the Development of a Virus-Cell-Based Assay for the Discovery of Novel Compounds Against Human Immunodeficiency Virus Type 1. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47, 501-508.

Akinc A. et al. 2008. A combinatorial library of lipid-like materials for delivery of RNAi therapeutics. Nature Biotechnol., 26, 561—569.

Alabi C., Vegas, A., Anderson, D. 2012. Attacking the genome: emerging siRNA nanocarriers from concept to clinic. Curr. Opin. Pharmacol., 12, 427-433.

Alexis F., Pridgen E., Molnar L. K., Farokhzad O. C. 2008. Factors affccting the clearancc and biodistribution of polymeric nanoparticles. Mol. Pharm., 5, 505-515.

Allers K, Htitter G, Hofmann J, Loddenkemper C, Rieger K, Thiel E, Schneider T. 2011. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5A32/A32 stem cell transplantation. Blood, 117(10), 2791-9.

Ambros V. (2004) The functions of animal microRNAs. Nature, 431(7006), 350-5.

Ambros V., Bartel B., Bartel D. P., Burge C. B., Carrington J. C„ Chen X., Dreyfuss G., Eddy S. R., Griffiths-Jones S., Marshall M., Matzke M., Ruvkun G., Tuschl T. 2003. A uniform system for microRNA annotation. RNA, 9(3), 277-9.

Ameres S. L., Martinez J., Schroeder R. 2007. Molecular basis for target RNA recognition and cleavage by human RISC. Cell, 130, 101-112.

Anderson A. F., Qingsi Z., Hua X., Jianfeng B. 2003. China's floating population and the potential for HIV transmission: A social-behavioral perspective. AIDS Care., 15, 177-1 85.

Anderson J. and Akkina R. 2007. Complete Knockdown of CCR5 by lentiviral vector-expressed siRNAs and protection of transgenic macrophages against HIV-1 infection. Gene Therapy, 14(14), 1287-1297.

Aravin A. A., Hannon G. J., Brennecke J. 2007. The Piwi-piRNA pathway provides an adaptive defense in the transposon arms race. Science, 318, 761-764

Aravin A., Gaidatzis D., Pfeffer S., Lagos-Quintana M., Landgraf P., lovino N., Morris P., Brownstein M. J., Kuramochi-Miyagawa S., Nakano T. et al. 2006. A novel class of small RNAs bind to MILI protein in mouse testes. Nature, 442, 203-207.

Aravin A.A., Lagos-Quintana M., Yalcin A., Zavolan M., Marks D., Snyder B., Gaasterland T., Meyer J, Tuschl T. (2003) The small RNA profile during Drosophila melanogaster development. Dev Cell., 5(2), 337-50.

Babiarz J. E., Ruby J. G., Wang Y., Bartel D. P., Bielloch R. 2008. Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs .Genes Dev., 22(20), 2773-85.

Bandyopadhyay S. K., Leonard G. T. Jr, Bandyopadhyay T„ Stark G. R„ Sen G. C. 1995. Transcriptional Induction by Double-stranded RNA Is Mediated by Interferon-stimulated Response Elements without Activation of Interferon-stimulated Gene Factor 3../ Biol Chetn. 270(33), 19624-9.

Bao Y. et al. 2013. Effect of PEGylation on biodistribution and gene silencing of siRNA/lipid nanoparticle complexes. Pharm. Res., 30, 342-351.

Bazile D. el al. 1995. Stealth Me.PEG-PLA nanoparticles avoid uptake by the mononuclear phagocytes system. J. Pharm. Sei., 84, 493-498.

Behm-Ansmant I., Rehwinkel J., Doerks T., Stark A., Bork P., and Izaurralde E. 2006. mRNA degradation by miRNAs and GW182 requires both CCR4:NOT deadenylase and DCP1:DCP2 decapping complexes. Genes Dev., 20, 1885-1898.

Belliveau N. M. et al. 2012 Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Mol. Ther. Nucleic Acids, 1, e37.

Bellocq N. C., Pun S. H., Jensen G. S., Davis M. E. 2003. Transferrin-eontaining, eyclodextrin polymer-based particles for tumor-targeted gene delivery. Bioconj. Chem., 14, 1122-1132.

Berger E. A., Murphy P. M., Farber J. M. 1999. Chemokine receptors as HIV-1 coreceptors: roles in viral entry, tropism, and disease. Annu Rev Immunol. 17, 657-700.

Blevins T., Rajeswaran R., Shivaprasad P. V. et al. 2006. Four plant Dicers mediate viral small RNA biogenesis and DNA virus induced silencing. Nucleic Acids Res. 34(21), 623346.

Boden D. et al. 2007. Overcoming HIV-1 resistance to RNA interference. Frontiers in Bioscience. 12, 3104-3116.

Boden D., Pusch O., Lee F., Tucker L., Ramratnam B. 2003. Human immunodeficiency virus type 1 escape from RNA interference. J Virol., 77(21), 11531-5.

Boden D., Pusch O., Lee F., Tucker L., Shank P. R., Ramratnam B. 2003. Promoter choice affects the potency of HIV-1 specific RNA interference. Nucleic Acids Res. 31(17), 5033-8.

Bohnsack, M. T., Czaplinski, K., Gorlich, D. 2004. Exportin 5 is a RanGTP-dependent dsRNA-binding protein that mediates nuclear export of pre-miRNAs. RNA, 10, 185-191.

Bohula E. A., Salisbury A. J., Sohail M., Playford M. P. et al. 2003. The efficacy of small interfering RNAs targeted to the type 1 insulin-like growth factor receptor (IGF1R) is influenced by secondary structure in the IGF 1R transcript. J Biol. Chem., 278(18), 15991-7.

Bolhassani A. 2011. Potential efficacy of cell-penetrating peptides for nucleic acid and drug delivery in cancer. Biochim. Biophys. Acta., 1816, 232-246.

Bour S., Geleziunas R., Wainberg M. A. (1995) The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) CD4 receptor and its central role in promotion of HIV-1 infection. Microbiol Rev. 59(1), 63-93.

Brake O. ter, Konstantinova P., Ceylan M., Berkhout B. 2006. Silencing of HIV-1 with RNA Interference: A Multiple shRNA Approach. Mol. Therapy. 14, 883- 892.

Brennecke J., Malone C. D., Aravin A. A., Sachidanandam R., Stark A., Hannon G. J. 2008 An epigenetic role for maternally inherited piRNAs in transposon silencing. Science, 322, 1387-1392

Bridge A. J., Pebernard S., Ducraux A., Nicoulaz A. L., Iggo R. 2003. Induction of an interferon response by RNAi vectors in mammalian cells. Nat Genet. 34(3), 263-4.

Brummelkamp T. R., Bernards R., Agami R. 2002. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science, 296(5567), 550-3.

Burnett J. C., Rossi, J. J., Tiemann, K. 2011. Current progress of siRNA/shRNA therapeutics in clinical trials. Biotechnol. J., 6, 1130-1146.

Bushati N. and Cohen S. M. 2007. microRNA functions. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol., 23, 175-205.

Cai X., Hagedorn C. H., Cullen B. R. 2004. Human microRNAs arc processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA, 10(12), 1957-66.

Cairns C. A. and White R. J. 1998. p53 is a general repressor of RNA polymerase III transcription. EMBO J. 17(11), 3112-23.

Caplcn N. J., Parrish S., Imani F., Fire A., Morgan R. A. 2001. Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems. Proc Natl AcadSci USA. 98(17), 9742-7.

Carmell M. A., Xuan Z., Zhang M. Q., Hannon G. J. 2002. The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem-cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev., 16,2733-2742.

Carthew R. W. and Sontheimer E. J. 2009. Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell, 136(4), 642- 55

Castanotto, D. and J. J. Rossi. 2009. The promises and pitfalls of RNA-interference-based therapeutics. Nature. 457(7228), 426-433.

Caudy A. A., Myers M., Hannon G. J., Hammond S. M. 2002. Fragile X-related protein and VIG associate with the RNA interference machinery. Genes Dev., 16, 2491-2496.

Caudy, A. A. el al. 2003. A micrococcal nuclease homologue in RNAi effector complexes. Nature, 425,411-414.

Chan D. C., Fass D., Berger J. M., Kim P. S. 1997. Core structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein. Cell. 89(2), 263-273.

Chang L.-J., Gay E. E. 2001. The Molecular Genetics of Lentiviral Vectors - Current and Future Perspectives. Current Gene Therapy. 1, 237-251.

Chen K. and Gao C. 2013. TALENs: Customizable molecular DNA scissors for genome engineering of plants. J. Genet. Genomics, 40, 271—279.

Chen H., Wei S. Q., Engelman A. 1999. Multiple integrase functions are required to form the native structure of the human immunodeficiency virus type I intasome. J Biol Chem. 74(24), 17358-17364.

Chendrimada T. P., Gregory R. 1., Kumaraswamy E., Norman J., Cooch N., Nishikura K., Shiekhattar R. 2005. TRBP recruits the Dicer complex to Ago2 for microRNA processing and gene silencing. Nature, 436, 740-744.

Clark M. B., Amaral P. P., Schlesinger F. J., Dinger M. E., Taft R. J., Rinn J. L., Ponting C.P., et al. 2011.The reality of pervasive transcription. PLoS Biol., 9(7), el 000625

Coburn G. A. and Cullen B. R. Potent and Specific Inhibition of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Replication by RNA Interference. 2002. J. Virol. 76, 9225-9231.

Cogoni C. and Macino G. 1997. Isolation of quel ling-defective (qde) mutants impaired in posttranscriptional transgene-induced gene silencing in Neurospora crassa. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 94(19), 10233-8.

Cook H. A., Koppetsch B. S., Wu J., Theurkauf W. E. 2004. The Drosophila SDE3 homolog armilage is required for oskar mRNA silencing and embryonic axis specification. Cell, 116, 817-829.

Creamer K. M. and Partridge J. F. 2011. RITS-connecting transcription, RNA interference, and heterochromatin assembly in fission yeast. Wiley. Interdiscip. Rev. RNA., 2(5). 632-46

Cullen L. M. and Arndt G. M. 2005. Genome-wide screening for gene function using RNAi in mammalian cells. Immunol. Cell. Biol., 83(3), 217-23

Czech B. et al. 2008. An endogenous small interfering RNA pathway in Drosophila. Nature, 453,798-802.

Das A. T., Brummelkamp T. R., Westerhout E. M., Vink M., Madiredjo M., Bernards R., Berkhout B. 2004. Human Immunodeficiency Virus Type 1 Escapes from RNA Interference-Mediated Inhibition. J. Virol. 78, 2601-2605.

Das P. 2004. Infectious disease surveillance update. Lancet. Infect. Dis. 4(11), 657.

Davis M. E. 2009. The first targeted delivery of siRNA in humans via a self-assembling, cyclodextrin polymer-based nanoparticle: from concept to clinic. Mol. Pharm., 6, 659-668

Dean M., Carrington M., Winkler C., et al. (1996) Genetic restriction of IIIV-1 infection and progression to AIDS by a deletion allele of the CKR5 structural gene. Hemophilia Growth and Development Study, Multicenter AIDS Cohort Study, Multicenter Hemophilia Cohort Study, San Francisco City Cohort, ALIVE Study. Science. 273(5283): 1856-1862.

Deblandre G. A., Marinx O. P., Evans S. S., Majjaj S., Leo O., Caput D., Huez G. A., Wathelet M. G. 1995. Expression cloning of an interferon-inducible 17-kDa membrane protein implicated in the control of cell growth. J Biol Chem. 270(40), 23860-6.

Deleris A., Gallego-Bartolome J., Bao J., Kasschau K. D., Carrington J. C., Voinnet O. (2006) Hierarchial action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense. Science, 303(5783), 68-71.

Der S. D., Yang Y. L., Weissmann C., Williams B. R. 1997. A double-stranded RNA-activated protein kinase-dependent pathway mediating stress-induced apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94(7), 3279-83.

Dillin A. 2003. The specifics of small interfering RNA specificity. Proc. Natl. Acad. Sei. U S A., 100(11), 6289-91.

Djebali S., Davis C. A., Merkel A., Dobin A., Lassmann T., Mortazavi A., Tanzer A., Lagarde J., Lin W., Schlesinger F., et al., 2012. Landscape of transcription in human cells. Nature, 489(7414), 101-8.

Doehle B. P., Qin Y., Macara I. G., Cullcn B. R. 2005. Ovcrexpression of cxportin 5 enhances RNA interference mediated by short hairpin RNAs and microRNAs. RNA, 11, 220226.

Eije K. von, Brake O. ter, Berkhout B. 2009. Stringent Testing Identifies Highly Potent and Escape-Proof anti-HIV Short Hairpin RNAs../. Gene Therapy. 11, 459-467.

Elbashir S. M., Harborth J., Lendeckel W., Yalcin A., Weber K., Tuschl T. 2001a. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411(6836), 494-8.

Elbashir S. M., Lendeckel W., Tuschl T. 2001b. RNA interference is mediated by 21 and 22 nt RNAs. Genes Dev., 15, 188-200.

Ender C., Krek A., Friedlánder M.R., Beitzinger M., Weinmann L., Chen W., Pfeffer S., Rajewsky N, Meister G. 2008. A human snoRNA with microRNA-like functions. Mol. Cell., 32(4), 519-528.

Endres M. J., Clapham P. R„ Marsh M., el al. (1996) CD4-independent infection by IIIV-2 is mediated by fusin/CXCR4. Cell. 87(4), 745-756.

Eulalio A., Huntzinger E., Izaurralde E. 2008. GW1 82 interaction with Argonaute is essential for miRNA-mediated translational repression and mRNA decay. Nat. Struct. Mol. Biol, 15, 346-353

Fabián E. V., Jones L., Baulcombe D. C. 2002. Spreading of RNA targeting and DNA methylation in RNA silencing requires transcription of the target gene and a putative RNA-dependent RNA polymerase. Plant Cell., 14(4), 857-67.

Fire A., Xu S., Montgomery M. K., Kostas S. A., Driver S. E., Mello C. C. 1998.. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 391(6669), 806-811.

Forstemann K., Horwich M. D., Wee L., Tomari Y., Zamore P. D. 2007. Drosophila microRNAs are sorted into functionally distinct argonaute complexes after production by dicer-1. Cell, 130(2), 287-97.

Frazer K. A. 2012. Decoding the human genome. Genome Res., 22(9), 1599-601.

Freed E. O. 1998. HIV-1 gag proteins: diverse functions in the virus life cycle. Virology, 251(1), 1-15.

Gallay P., Hope T.J., Chin D., Trono D. (1997) HIV-1 infection of non-dividing cells through recognition of integrase by the importin/karyopherin pathway. Proc. Natl. Acad. Sci., 94(18), 9825-9830.

Gao Y., Lobritz M., Roth J., Abreha M., Nelson K., Nankya I., Moore-Dudley D., Abraha A., Gerson S., Arts E. 2008. Targets of Small Interfering RNA Restriction during Human Immunodeficiency Virus Type 1 Replication. J. Virol. 82, 2938-2951.

Gavrilov K. and Saltzman W. M. 2012. Therapeutic siRNA: principles, challenges, and strategies. Yale J. Biol. Med., 85(2), 187-200.

Geisbert T. W., Lee A. C., Robbins M., Geisbert J. B. et al. 2010. Postexposure protection of non-human primates against a lethal Ebola virus challenge with RNA interference: a proof-of-concept study. Lancet, 375(9729), 1896-905

Ghildiyal M., Seitz H., Horwich M. D., Li C., Du T., Lee S., Xu J., Kittler E. L., Zapp M. L., Weng Z., Zamore P. D. 2008. Endogenous siRNAs derived from transposons and mRNAs in Drosophila somatic cells. Science, 320(5879), 1077-81.

Gitlin L, Karelsky S, Andino R. 2002. Short interfering RNA confers intracellular antiviral immunity in human cells. Nature, 418(6896), 430-4.

Gitlin, L. and Andino, R. 2003. Nucleic acid-based immune system: the antiviral potential of mammalian RNA silencing. J. Virol., 77, 7159-7165.

Gonzalez H., Hwang S. J., Davis M. E. 1999. New class of polymers for the delivery of macromolecular therapeutics. Bioconj. Chem., 10, 1068-1074.

Gottwein E., Corcoran D.L., Mukherjee N., Skalsky R.L., Hafner M., Nusbaum J.D., Shamulailatpam P., Love C.L., Dave S.S., Tuschl T., Ohler U., Cullen B.R. 2011. Viral microRNA targetome of KSHV-infected primary effusion lymphoma cell lines. Cell Host Microbe, 10(5), 515-26.

Gregory R. I. et al. 2004. The Microprocessor complex mediates the genesis of microRNAs. Nature, 432, 235-240.

Griffiths-Jones S., Saini H. K., van Dongen S., Enright A. J. 2008. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res., 36(Database issue), D154-8.

Grimm D., Streetz K. L., Jopling C. L., Storm T. A., Pandey K., Davis C. R., Marion P., Salazar F., Kay M. A. 2006. Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature. 441, 537-541

Grishok A., Pasquinelli A. E., Conte D., Li, N., Parrish S., Ha I., Baillie D. L., Fire A., Ruvkun G., and Mello C. C. 2001. Genes and mechanisms related to RNA interference regulate expression of the small temporal RNAs that control C. elegans developmental timing.Cell, 106, 23-34

Gunnery S., Ma Y., Mathews M.B. 1999. Termination sequence requirements vary among genes transcribed by RNA polymerase III. Mol Biol., 286(3), 745-57.

Guo Y., Rumschlag-Booms E., Wang J., Xiao H., Yu J., Wang J., Guo L., Gao G. F., Cao Y., Caffrey M., Rong L. 2009. Analysis of Hemagglutinin-Mediated Entry Tropism of II5N1 Avian Influenza. Virology J. 6, 1-13.

Hamilton A. J., Baulcombe D. C. 1999 A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science, 286(5441), 950-2.

Hammond S. M., Boettcher S., Caudy A. A., Kobayashi R. & Ilannon Ci. J. 2001. Argonaute2, a link between genetic and biochemical analyses of RNAi. Science, 293, 11461150.

Han J. et al. 2006. Molecular basis for the recognition of primary microRNAs by the Drosha-DGCR8 complex. Cell, 125, 887-901.

Han J. et al. 2009. Posttranscriptional crossregulation between Drosha and DGCR8. Cell, 136, 75-84.

Han, J. et al. 2004 The Drosha-DGCR8 complex in primary microRNA processing. Genes Dev., 18, 3016-3027.

Haque S. J., Williams B. R. 1998. Signal transduction in the interferon system. Semin. Oncol. 25(1 Suppl 1), 14-22.

Haussecker D., Huang Y., Lau A., Parameswaran P., Fire A.Z., Kay M.A. (2010) Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA, 16(4), 673-95.

Hernandez N. 2001. Small nuclear RNA genes: a model system to study fundamental mechanisms of transcription. J Biol Chem. 276(29), 26733-6.

Hillman M. C. Jr., Knight E. Jr, Blomstrom D. C. 1987. A membrane protein from IFN-beta-treated Daudi cells causes a cessation in cell growth. Biochem Biophys Res Commun. 148(1), 140-7.

Hovnanian A., Rebouillat D., Mattel M. G., Levy E. R., Marié I., Monaco A. P., Hovanessian A. G. 1998. The human 2',5'-oligoadenylate synthetase locus is composed of three distinct genes clustered on chromosome 12q24.2 encoding the 100-, 69-, and 40-kDa forms. Genomics. 52(3), 267-77.

Hoxie J. A., Alpers J. D., Rackowski J. L., Huebner K., Haggarty B. S., Cedarbaum A. J., Reed J. C. 1986. Alterations in T4 (CD4) protein and mRNA synthesis in cells infected with HIV. Science. 234(4780), 1123-1127.

Hsu M., Zhang J., Flint M., Logvinoff C., Cheng-Mayer C., Rice C. M., McKeating J. A. 2003. Hepatitis C Virus Glycoproteins Mediate pII-Dependent Cell Entry of Pseudotyped Retroviral Particles. PNAS. 100, 7271- 7276.

Hutvâgner G. and Zamore P. D. 2002. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science, 297, 2056-2060.

Iwasaki S., Kawamata T., Tomari Y. 2009. Drosophila argonaute 1 and argonaute2 employ distinct mechanisms for translational repression. Mol. Cell, 34, 58-67.

Jackson A. L., Bartz S. R., Schelter J., Kobayashi S. V., Burchard J., Mao M., Li B., Cavet G., Linsley P. S. 2003. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat. Biotechnol., 21, 635-637.

Jacque J. M., Triques K., Stevenson M. Modulation of HIV-1 Replication by RNA. 2002. Nature. 418, 435-438.

Janowski B. A., Huffman K. E., Schwartz J. C., Ram R., Nordsell R., Shames D. S., Minna J. D., Corey D. R. 2006. Involvement of AGOl and AG02 in mammalian transcriptional silencing. Nat. Struct. Mol. Biol., 9, 787-92.

Jarad G. & Miner, J. H. 2009. Update on the glomerular filtration barrier. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens., 18, 226-232.

Jin, P. et al. 2004. Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway. Nature Neurosci., 7, 113-117.

Jopling C. L., Yi M., Lancaster A. M., Lemon S. M., Sarnow P. 2005. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific MicroRNA. Science, 309, 1577-1581.

Kaikkonen M. U., Lam M. T., Glass C. K. 2011. Non-coding RNAs as regulators of gene expression and epigenetics. Cardiovasc Res., 90(3), 430-40.

Kanasty R, Dorkin JR, Vegas A, Anderson D. 2013. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nat Mater., 12(11), 967-77.

Kawamata T., Seitz H., Tomari Y. 2009. Structural determinants of miRNAs for RISC loading and slicer-independent unwinding. Nat. Struct. Mol. Biol., 16, 953-960.

Kawamata T., Tomari Y. 2010. Making RISC. Trends Biochem. Sci., 35(7), 368-76.

Kawamura Y. et al. 2008. Drosophila endogenous small RNAs bind to Argonaute 2 in somatic cells, Nature, 453. 793-797.

Kennedy S., Wang D., Ruvkun G. 2004. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature, 427, 645-649.

Kesharwani P., Gajbhiye V., Jain N. K. 2012. A review of nanocarriers for the delivery of small interfering RNA. Biomaterials, 33(29), 7138-50.

Khvorova A., Reynolds A., Jayasena S. D. 2003. Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. Cell, 115(2), 209-16.

Kim D. H., Behlke M. A., Rose S. D., Chang M. S., Choi S., Rossi J. J. 2005. Synthetic dsRNA Dicer substrates enhance RNAi potency and efficacy. Nat Biotechnol. 23(2), 222-6..

Kim V. N., Han J. and Siomi M. C. 2009. Biogenesis of small RNAs in animals. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 10, 126-139

Kim Y. K. and Kim, V. N. Processing of intronic microRNAs. EMBOJ. 26, 775-783 2007.

Knight S. W. and Bass B. L. 2002. The role of RNA editing by ADARs in RNAi. Mol. Cell, 10, 809-817.

Kobinger G. P., Weiner D. J., Yu Q. C., Wilson J. M. 2001. Filovirus Pseudotyped Lentiviral Vector Can Efficiently and Stably Transduce Airway Epithelia in vivo. Nat. Biolechnol. 19, 225-230.

Kochs G., Haener M., Aebi U., Haller O. 2002. Self-assembly of human MxA GTPasc into highly ordered dynamin-like oligomers. J Biol Chem. 277(16), 14172-6.

Kolli S. et al. 2013. pH-Triggered nanoparticle mediated delivery of siRNA to liver cells in vitro and in vivo. Bioconj. Chem., 24, 314—332.

Konstantinova P, ter Brake O, Haasnoot J, de Haan P, Berkhout B. 2007. Trans-inhibition of HIV-1 by a long hairpin RNA expressed within the viral genome. Retrovirology., 4, 15-19

Kretschmer-Kazemi Far R, Sczakiel G. 2003. The activity of siRNA in mammalian cells is related to structural target accessibility: a comparison with antisense oligonucleotides. Nucleic Acids. Res., 31(15), 4417-24.

Kumar M. and Carmichael G. G. 1998. Antisense RNA: Function and Fate of Duplex RNA in Cells of Higher Eukaryotes. Microbiol Mol Biol Rev. 62(4), 1415-1434.

Kwong P. D„ Wyatt R., Robinson J., Sweet R. W., Sodroski J., Hendrickson W. A. (1998) Structure of an HIV gpl20 envelope glycoprotein in complex with the CD4 receptor and a neutralizing human antibody. Nature. 393(6686), 648-59.

Ladewig E., Okamura K., Flynt A. S., Westholm J. O., Lai E. C. 2012. Discovery of hundreds of mirtrons in mouse and human small RNA data. Genome Res., 22(9). 1634-45.

Lai E. C., Tomancak P., Williams R.W. Rubin, G.M. 2003. Computational identification of Drosophila microRNA genes. Genome Biol., 4, R42-R42.20.

Lander E. S., Linton L. M., Birren B., Nusbaum C., Zody M.C., Baldwin J., Devon K., Dewar K., Doyle M., FitzHugh W. et aL, 2001. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature, 409, 860-921.

Lau P.W., Potter C.S., Carragher B., MacRae I.J. 2009. Structure of the human Dicer-TRBP complex by electron microscopy. Structure, 17, 1326-1332.

Lee N. S., Dohjima T„ Bauer G., Li H., Li M. J., Ehsani A., Salvaterra P., Rossi J. 2002. Expression of Small Interfering RNAs Targeted against HIV-1 rev Transcripts in Human Cells. Nature Biotechnol. 20, 500- 505.

Lee Y. S., Nakahara K., Pham J. W., Kim K., He Z., Sontheimer E. J., Carthew R. W. 2004. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways. Cell, 117,69-81.

Lee Y., Ahn C., Han J., Choi H., Kim J., Yim J., Lee J., Provost P., Rädmark O., Kim S., Kim V. N. 2003. The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing. Nature, 425, 415-419.

Lee, Y., Jeon, K., Lee, J. T., Kim, S., Kim, V. N. 2002. MicroRNA maturation: stepwise processing and subcellular localization. EMBOJ., 21, 4663^1670.

Leung A. K., Calabrese J. M., Sharp P. A. 2006. Quantitative analysis of Argonaute protein reveals microRNA-dependent localization to stress granules. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 103, 18125-18130.

Leuschner P. J., Ameres S. L., Kueng S., Martinez J. 2006. Cleavage of the siRNA passenger strand during RISC assembly in human cells. EMBO Rep., 7, 314-320.

Lewis B. P., Bürge C. B., and Bartel D. P. 2005. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell, 120, 1520.

Lewis B. P., Shih 1. H., Jones-Rhoades M. W„ Bartel D. P.„ Bürge C. B. 2003. Prediction of mammalian microRNA targets. Cell, 115, 787-798.

Li H., Li W. X., Ding S. W. 2002. Induction and suppression of RNA silencing by an animal virus. Science, 296, 1319-1321.

Li M. J., Bauer G., Michienzi A., Yee J. K., Lee N. S., Kim J., Li S., Castanotto D., Zaia J., Rossi J. J. 2003. Inhibition of HIV-1 infection by lentiviral vectors expressing Pol Ill-promoted anti-HIV RNAs. Mol Ther. 8, 196-206.

Lim L. P., Glasner M. E., Yekta S., Bürge C. B., and Bartel D. P. 2003a. Vertebrate microRNA genes. Science, 299, 1540.

Lim L. P., Lau N. C., Weinstein E. G., Abdelhakim A., Yekta S., Rhoades M. W., Bürge C. B., and Bartel, D. P. 2003b. The micro-RNAs of Caenorhabdilis elegans. Genes & Dev., 17, 991-1008.

Lin S.-L., Joseph D. M., Ying S.-Y. 2006. Intronic MicroRNA (miRNA). J Biomed Biotechnol., 2006(4), 26818.

Lingel A., Simon B., Izaurralde E., Sattler M. 2004. Nucleic acid 3_-end recognition by the Argonaute2 PAZ domain. Nature Struct. Mol. Biol., 11, 576-577.

Lipardi C., Wei Q., Paterson B. M. 2001. RNAi as random degradative PCR: siRNA primers convert mRNA into dsRNAs that are degraded to generate new siRNAs. Cell, 107(3). 297307.

Liu J., Carmell M. A., Rivas F. V., Marsden C. G„ Thomson J. M., Song J. J., Hammond S. M., Joshua-Tor L., Hannon G. J. 2004. Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science, 305(5689): 1437-41.

Liu J., Valencia-Sanchez M. A., Hannon G. J., and Parker R. 2005. MicroRNA-dependcnt localization of targeted mRNAs to mammalian P-bodies. Nat. Cell Biol., 7, 719-723

Liu Y„ Ye X., Jiang F., Liang C., Chen D., Peng J., Kinch L.N., Grishin N.V., Liu Q. 2009. C3PO, an endoribonuclease that promotes RNAi by facilitating RISC, activation. Science, 325(5941), 750-3.

Liu Y. P., Haasnoot J., Berkhout B. 2008. Design of extended short hairpin RNAs for HIV-1 inhibition. Nucleic Acids Res., 35(17), 5683-93.

Lund E., Guttingen S., Calado A., Dahlberg J. E., Kutay U. 2004. Nuclear export of microRNA precursors. Science, 303, 95-98.

Ma J. B., Ye K., Patel D. J. 2004. Structural basis for overhang-specific small interfering RNA recognition by the PAZ domain. Nature, 429, 318-322.

MacRae I. J., Ma E., Zhou M., Robinson C. V., Doudna J. A. 2008. In vitro reconstitution of the human RISC-loading complex. Proc Natl Acad Sci USA., 105, 512-517.

Maczuga P., Lubelski J., van Logtenstein R., Borel F., Blits B., Fakkert E., Costessi A., Butler D., van Deventer S., Petry H., Koornnecf A., Konstantinova P. 2012. Embedding siRNA sequences targeting apolipoprotein B100 in shRNA and miRNA scaffolds results in differential processing and in vivo efficacy. Mo I Ther., 21(1), 217-27.

Malek A. et al. 2009. In vivo pharmacokinetics, tissue distribution and underlying mechanisms of various PEI(-PEG)/siRNA complexes. Toxicol. Appl. Pharmacol., 236, 97108.

Manche L, Green S. R, Schmedt C, Mathews M. B. 1992. Interactions between double-stranded RNA regulators and the protein kinase DAI. Mol Cell Biol., 11, 5238-48.

Maniataki E, Mourelatos Z. (2005) A human, ATP-independent, RISC assembly machine fueled by pre-miRNA. Genes Dev., 19(24), 2979-90.

Martinez J. and Tuschl, T. 2004. RISC is a 5_ phosphomonoester-producing RNA endonuclease. Genes Dev., 18, 975-980.

Martinez J., Patkaniowska A., Urlaub H., Luhrmann R., Tuschl T. 2002. Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. Cell, 110, 563-574.

Matranga C., Tomari Y., Shin C., Bartel D. P., Zamore P. D. 2005. Passenger-strand cleavage facilitates assembly of siRNA into Ago2-containing RNAi enzyme complexes. Cell, 123, 607-620.

Mattioli C., Pianigiani G., Pagani F. 2013. A competitive regulatory mechanism discriminates between juxtaposed splice sites and pri-miRNA structures. Nucleic Acids Res., 41(18), 8680-91.

Matzke M. A., Matzke A. J. 2004. Planting the seeds of a new paradigm. PLoS Biol., 2(5). el33.

Mcister G. and Tuschl T. 2004. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature, 431(7006), 343-349.

Meister G. 2013. Argonaute proteins: functional insights and emerging roles. Nature Reviews Genetics, 14, 447-459.

Meister G. et al. 2004. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Mol. Cell, 15, 185-197.

Melamed Z., Levy A., Ashwal-Fluss R., Lev-Maor G., Mekahel K., Atias N.. Gilad S., Sharan R., Levy C., Kadener S., Ast G. 2013. Alternative splicing regulates biogenesis of miRNAs located across exon-intron junctions. Mol Cell., 50(6), 869-81.

Mishra S., Webster P., Davis M. E. 2004. PEGylation significantly affects cellular uptake and intracellular trafficking of non-viral gene delivery particles. Eur. J. Cell Biol., 83, 97111.

Miyoshi K., Tsukumo H., Nagami T., Siomi H., Siomi M.C. 2005. Slicer function of Drosophila Argonautes and its involvement in RISC formation. Genes Dev., 19, 2837-2848.

Mochizuki H., Schwartz J. P., Tanaka K., Brady R. O., Reiser J. 1998. High-Titer Human Immunodeficiency Virus Type 1-Based Vector Systems for Gene Delivery into Nondividing Cells. J. Virol. 72, 8873-8883.

Morlando M. el al. 2008. Primary microRNA transcripts are processed co-transcriptionally. Nature Struct. Mol. Biol., 15, 902-909.

Mourelatos, Z. et al. 2002. miRNPs: a novel class of ribonucleoproteins containing numerous microRNAs. Genes Dev., 16, 720-728.

Naeye B. et al. 2013. In vivo disassembly of IV administered siRNA matrix nanoparticles at the renal filtration barrier. Biomalerials, 34, 2350-2358.

Nikolenko G., Palmer S., Mandarelli F., Mcllors J., Coffin J., Pathak V. 2005. Mechanism for Nucleoside-Analog Abrogation of HIV-1 Replication: Balance between RNAse H Activity and Nucleotide Excision. PNAS. 102(6), 2093-2098.

Nishikura, K. 2006. Editor meets silencer: crosstalk between RNA editing and RNA interference. Nature Rev. Mol. Cell Biol, 1, 919-931.

Nykanen A., Haley B., Zamore P. D. 2001. ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell., 107(3), 309-21.

Okamura K., Ishizuka A., Siomi H., Siomi M. C. 2004. Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev., 18, 1655-1666.

Orioli A., Pascali C., Pagano A., Teichmann M., Dieci G. 2012, RNA polymerase III transcription control elements: themes and variations. Gene, 493(2), 185-94.

Paddison P. J., Caudy A. A., Bernstein E., Hannon G. J., Conklin D. S. 2002. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev., 16(8), 948-58.

Palauqui J. C., Elmayan T., Pollien J. M., Vaucheret H. 1997. Systemic acquired silencing: transgene-speciflc post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silcnced stocks to non-silenced scions. EMBOJ., 16(15), 4738-45.

Parker J. S., Roe S. M., Barlord D. 2004. Crystal structure of a PIWI protein suggests mechanisms for siRNA recognition and slicer activity. EMBOJ., 23(24), 4727-37.

Parker J. S, Roe S. M., Barford D. 2005. Structural insights into mRNA recognition from a PIWI domain-siRNA guide complex. Nature, 434, 663-666.

Parry C. M., Kohli A., Boinett C. J., Towers G. J., McCormick A. L., Pillay D. 2009. Gag Determinants of Fitness and Drug Susceptibility in Protease Inhibitor-Resistant Human Immunodeficiency Virus Type 1. J. Virol. 83, 9094—9101.

Patil M.L. 2008. Surface-modified and internally cationic polyamidoamine dendrimers for efficient siRNA delivery. Bioconjug. Chem., 19(1396), e403.

Pebernard S. and Iggo R. D. 2004. Determinants of interferon-stimulated gene induction by RNAi vectors. Differentiation. 72(2-3), 103-11.

Pei Y. and TuschI T. 2006. On the art of identifying effective and specific siRNAs. Nat Methods, 3(9), 670-6.

Pélisson A., Sarot E., Payen-Groschêne G., Bucheton A. 2007. A Novel Repeat-Associated Small Interfering RNA-Mediated Silencing Pathway Downregulates Complementary Sense gypsy Transcripts in Somatic Cells of the Drosophila Ovary../ Virol., 81(4), 1951-1960.

Peragine A., Yoshikawa M., Wu G., Albrecht II. L., Poethig R. S. 2004. SGS3 and SGS2/SDE1/RDR6 are required for juvenile development and the production of trans-acting siRNAs in Arabidopsis. Genes Dev., 18(19), 2368-79.

Persengiev S. P., Zhu X., Green M. R. 2004. Nonspecific, concentration-dependent stimulation and repression of mammalian gene expression by small interfering RNAs (siRNAs). RNA, 10(1), 12-8.

Petri L., Ferreira M., Moraes M. L. 2011. Toward preserving the structure of the antigenic peptide pi 7-1 from the HIV-1 pi7 protein in nanostructured films. J. Nanosci. Nanotechnol., 11(8), 6705-9.

Petros R. A. and DeSimone J. M. 2010. Strategies in the design of nanoparticles for therapeutic applications. Nature Rev. Drug Discovery, 9, 615-627.

Pham, J. W., Pellino, J. L., Lee, Y. S., Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. 2004. A Dicers-dependent 80S complex cleaves targeted mRNAs during RNAi in Drosophila. Cell, 117, 8394.

Piatt E. J., Durnin J. P., Kabat D. 2005. Kinetic Factors Control Efficiencies of Cell Entry, Efficacies of Entry Inhibitors, and Mechanisms of Adaptation of LIuman Immunodeficiency Virus. J. Virol. 79, 4347-4356.

Pratt A. J. and MacRae I. G 2009. The RNA-induced Silencing Complex: A Versatile Gene-silencing Machine. J. Biol. Chem., 284(27/ 17897-901.

Preall J. B., He Z., Gorra J. M., Sontheimer E. J. 2006. Short interfering RNA strand selection is independent of dsRNA processing polarity during RNAi in Drosophila. Curr Biol., 16(5), 530-5.

Quinonez R, Sutton R. Lentiviral Vectors for Gene Delivery into Cells. 2002. DNA & Cell Biology. 12, 937-951.

Rand T. A., Petersen S., Du F., Wang X. 2005. Argonaute2 cleaves the anti-guide strand of siRNA during RISC activation. Cell, 123, 621-629.

Reinhart B. J., Slack F. J., Basson M., Pasquinelli A. E., Bettinger J. C.„ Rougvie A. E., Horvitz H. R., Ruvkun G. 2000. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature, 403(6772), 901- 906.

Rey D. A., Batt C. A., Miller J. C. 2006. Carbon nanotubes in biomedical applications. Nanotech. Law. Busi., 3(263), e92.

Reynolds A., Leake D., Boese Q., Scaringe S., Marshall W. S., Khvorova A. 2004. Rational siRNA design for RNA interference. Nat. Biotechnol., 22, 326 - 333.

Rivas F. V., ToliaN. H., Song J. J., Aragon J. P., Liu J., Hannon G. J., Joshua-Tor L. 2005. Purified Argonaute2 and an siRNA form recombinant human RISC. Nat. Struct. Mol. Biol., 12, 340-349.

Rodriguez M. S„ Dargemont C., Stutz F. (2004) Nuclear export of RNA. Biol Cell., 96(8), 639-55.

Roignant J. Y. et al. 2003. Absence of transitive and systemic pathways allows cell-specific and isoformspecific RNAi in Drosophila. RNA, 9, 299-308.

Romberg B., Hennink, W. E. & Storm, G. 2008. Sheddable coatings for long-circulating nanoparticles. Pharm. Res. 25, 55-71.

Rossi J. J. 2006. RNAi as a Treatment for HIV-1 Infection. Biotechniques. 40, 25-29.

Ruby J. G., Jan C. H, Bartel D. P. 2007. Intronic microRNA precursors that bypass Drosha processing. Nature, 448(7149), 83-6.

Saito K., Sakaguchi Y., Suzuki T., Suzuki T., Siomi H. and Siomi M. C. 2007. Pimet, the Drosophila homolog of HEN1, mediates 2'-0-methylation of Piwi-interacting RNAs at their 3' ends. Genes Dev., 21, 1603 -1608.

Salvati A. et al. 2013. Transferrin-functionalized nanoparticles lose their targeting capabilities when a biomolecule corona adsorbs on the surface. Nature Nanotech. 8, 137143.

Sashital D. and Doudna J. A. 2010. Structural Insights into RNA Interference. Curr. Opin. Struct. Biol., 20(1), 90-97.

Sato Y. et al. 2008. Resolution of liver cirrhosis using vitamin A-coupled liposomes to deliver siRNA against a collagen-specific chaperone. Nature Biotechnol26, 431-442.

Sato Y. et al. 2012. A pH-sensitive cationic lipid facilitates the delivery of liposomal siRNA and gene silencing activity in vitro and in vivo. J. Control. Release, 163, 267-276.

Scacheri P. C., Rozenblatt-Rosen O., Caplen N. J., Wolfsberg T. G., Umayam L., Lee .T. C., Hughes C. M., Shanmugam K. S., Bhattacharjee A., Meyerson M., Collins F. S. 2004. Short interfering RNAs can induce unexpected and divergent changes in the levels of untargeted proteins in mammalian cells. Proc Natl Acad Sei USA. 101(7), 1892-7.

Scherer L. J., Frank R., Rossi J. J. 2007. Optimization and characterization of tRNA-shRNA expression constructs. Nucleic Acids Res., 35(8), 2620-8.

Schiebel W., Pelissier T., Riedel L., Thalmeir S., Schiebel R., Kempe D., Lottspeich F., Sänger H. L., Wassenegger M. 1998. Isolation of an RNA-directed RNA polymerase-specific cDNA clone from tomato. Plant Cell, 10(12), 2087-101.

Schwarz D. S., Hutvägner G., Du T., Xu Z., Aronin N., Zamore P. D. 2003a. Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell, 115, 199-208.

Schwarz D. S., Hutvägner G., Haley B., Zamore P. D. 2002b. Evidence that siRNAs function as guides, not primers, in the Drosophila and human RNAi pathways. Mol. CelL 10, 537548.

Schwarz D. S., Hutvägner G., Du T., Xu Z., Aronin N., Zamore P. D. 2003. Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell, 115(2), 199-207

Semple S. C. et al. 2010. Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nature Biotechnol., 28, 172-176.

Shao Z., Raible F., Mollaaghababa R., Guyon J. R., Wu C. T., Bender W., Kingston R. E. 1999. Stabilization of chromatin structure by PRC1, a Polycomb complex. Cell, 98(1), 37-46.

Shim M. S. and Kwon, Y. J. 2012. Stimuli-responsive polymers and nanomaterials for gene delivery and imaging applications. Adv. Drug Deliv. Rev., 64, 1046-1059.

Sijen T., Fleenor J., Simmer F., Thijsscn K. L., Parrish S., Timmons L., Plasterk R. H., Fire A. 2001. On the role of RNA amplification in dsRNA-triggered gene silencing. Cell, 107, 465-476.

Singha K., Namgung R., Kim W. J. 2011. Polymers in small-interfering RNA delivery. Nucleic Acid Therapeut., 21, 133-147.

Siomi M. C., Sato K., Pezic D., Aravin A. A. 2011. PlWI-interacting small RNAs: the vanguard of genome defence. Nature Rev. Mol. Cell Biol., 12, 246-258.

Sledz C. A., Holko M., de Veer M. J, Silverman R. H., Williams B. R. 2003. Activation of the interferon system by short-interfering RNAs. Nat Cell Biol. 5(9), 834-9.

Sledz C. A., Williams B. R. 2004. RNA interference and double-stranded-RNA-activated pathways. Biochem. Soc. Trans., 32(6), 952-6.

Smalheiser N. R. 2003. EST analyses predict the existence of a population of chimeric microRNA precursor-mRNA transcripts expressed in normal human and mouse tissues. Genome Biol., 4(7), 403.

Song J. J., Smith S. K., Hannon G. J., Joshua-Tor L. 2004. Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science', 305(5689), 1434-7.

Stamatoyannopoulos J.A. 2012. What does our genome encode? Genome Res.. 22(9). 160211

Stark G. R., Kerr I. M., Williams B. R., Silverman R. H., Schreiber R. D. 1998. How cells respond to interferons. Annu. Rev. Biochem. 67, 227-264.

Stein P., Svoboda P., Anger M. & Schultz R. M. 2003. RNAi: mammalian oocytes do it without RNAdependent RNA polymerase. RNA, 9, 187-192.

Sun G., Rossi J.J. 2012. MicroRNAs and their potential involvement in HIV infection. Trends Pharmacol Sei., 32(11), 675—681.

Tahbaz N., Kolb F. A., Zhang H., Jaronczyk K., Filipowicz W., Hobman T. C. 2004. Characterization of the interactions between mammalian PAZ PIWI domain proteins and Dicer. EMBO Rep., 5, 189-194.

Takahashi H., Sinoda, K., Hatta, I. 1996. Effects of cholesterol on the lamellar and the inverted hexagonal phases of dielaidoylphosphatidylethanolamine. Biochim. Biophys. Acta, 1289,209-216.

Tchurikov N. A., Kretova O. V. 2007. Suffix-specific RNAi leads silencing of F element in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 2(5), e476.

Tchurikov N.A. and Kretova O.V. 2007. Suffix-specific RNAi leads to silencing of F element in Drosophila melanogaster. PLoS ONE, 2(5), e476.

Tchurikov, N.A., O.V. Kretova. 2011. Both piRNA and siRNA pathways are silencing transcripts of the Suffix element in the Drosophila melanogaster germline and somatic cells. PLoS ONE. 6(7), e21882.

Telesnitsky A., Goff S. P. In: Coffin J. M., Hughes S. H., Varmus H. E., editors. Reverse Transcriptase and the Generation of Retroviral DNA. Retroviruses. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1997.

Tcmin. 1993. Retrovirus variation and reverse transcription: abnormal strand transfers result in retrovirus genetic variation. PNAS. 90(15): 6900-6903.

Tijsterman M., Ketting R. F., & Plasterk R. H. 2002. The genetics of RNA silencing. Annu Rev Genet, 36,489-519.

ToliaN.H., Joshua-Tor L. 2007. Sheer and the argonautes. Nat. Chem. Biol., 3, 36-43.

Tomari Y, Matranga C, Haley B, Martinez N, Zamore PD. 2004. A protein sensor for siRNA asymmetry. Science, 306(5700), 1377-80.

Tonkin L. A. and Bass B. L. 2003. Mutations in RNAi rescue aberrant chemotaxis of ADAR mutants. Science, 302, 1725.

Uguen P., Murphy S. 2004. 3'-Box-dependent processing of human prc-Ul snRNA requires a combination of RNA and protein co-factors. Nucleic Acids Res. 32(10), 2987-94.

Vagin V. V., Sigova A., Li C., Seitz H., Gvozdev V., Zamore P. D. 2006. A distinct small RNA pathway silences selfish genetic elements in the germline. Science 313, 320—324.

Vargason J. M., Szittya G., Burgyan J. & Hall T. M. 2003. Size selective recognition of siRNA by an RNA silencing suppressor. Cell, 115, 799-811.

Vasudevan S., and Steitz J. A. 2007. AU-rich-element-mediated upregulation of translation by FXR1 and Argonaute 2. Cell, 128, 1105-1118.

Vazquez F., Vaucheret FT., Rajagopalan R., Lepers C., Gasciolli V., Mallory A.C., Hilbert J.L., Bartcl D.P., Crete P. 2004. Endogenous trans-acting siRNAs regulate the accumulation of Arabidopsis mRNAs. Mol Cell, 16(1), 69-79.

Verdel A., Jia S., Gerber S., Sugiyama T., Gygi S., Grewal S. I., and Moazed D. 2004. RNAi-mediated targeting of heterochromatin by the RITS complex. Science, 303, 672-676.

Virtanen J. A., Ruonala, M., Vauhkonen, M. & Somerharju, P. 1995. Lateral organization of liquid-crystalline cholesterol-dimyristoylphosphatidylcholine bilayers. Evidence for domains with hexagonal and centered rectangular cholesterol superlattices. Biochemistry, 34. 1156811581.

Voinnet, O. 2001. RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends Genet., 17, 449-459.

Wang A. Z., Langer R., Farokhzad O. C. 2012. Nanoparticle delivery of cancer drugs. Annu. Rev. Med., 63, 185-198.

Wang H. W„ Noland C., Siridechadilok B., Taylor D. W., Ma E., Felderer K., Doudna J. A., Nogales E. 2009a. Structural insights into RNA processing by the human RISC-loading complex. Nat. Struct. Mol. Biol., 16(1 1), 1148-53.

Wang Y, Juranek S, Li H, Sheng G, Wardle GS, et al. 2009b. Nucleation, propagation and cleavage of target RNAs in Ago silencing complexes. Nature, 461(7265), 754-761.

Wang Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R. & Blelloch, R. 2007. DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal. Nature Genet.. 39, 380-385.

Wassenegger M. & Pelissier T. 1998. A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol.Biol., 37, 349-362.

Watanabe T., Totoki Y., Toyoda A., Kaneda M., Kuramochi-Miyagawa S., Obata Y., Chiba H., Kohara Y., Kono T., Nakano T., Surani M. A., Sakaki Y., Sasaki H. 2008. Endogenous siRNAs from naturally formed dsRNAs regulate transcripts in mouse oocytes. Nature, 453(7194), 539-43.

Waterhouse P. M., Wang M. & Finnegan E. J. 2001. Role of short RNAs in gene silencing. Trends. Plant Sei., 6, 297-301.

Weissenborn W., Calder L. J., Dessen A., Laue T., Skehel J. J., Wiley D. C. 1997. Assembly of a rod-shaped chimera of a trimeric GCN4 zipper and the HIV-1 gp41 ectodomain expressed in Escherichia coli. PN AS. 94(12), 6065-6069.

Wesoly J., Szweykowska-Kulinska Z., Bluyssen II. A. 2007. STAT activation and differential complex formation dictate selectivity of interferon responses. Acta Biochim Pol. 54(1), 27-38.

Westerhout E. M., Brake, O., Berkhout, B. 2006. The Virion-Associated Incoming HIV-1 RNA Genome Is not Targeted by RNA Interference. Retrovirology. 3(57), 1-9.

Wilkinson D. 1997. Cofactors provide the entry keys. HIV-1. C.urr. Biol, 6(9), 1051-1053.

Williams B.R. 1999. PKR: A sentinel kinase for cellular stress. Oncogene, 18, 6112-6120.

Wilson R. C. and Doudna J. A. 2013. Molecular mechanisms of RNA interference. Annu. Rev. Biophys., 42,217-39.

Wolfrum C., Shi S., Jayaprakash K. N., Jayaraman M„ Wang G., Pandey R. K., Rajeev K. G., Nakayama T., Charrise K., Ndungo E. M., Zimmermann T., Koteliansky V., Manoharan M., Stoffel M. 2007. Mechanisms and optimization of in vivo delivery of lipophilic siRNAs. Nature Biotechnol. 25, 1149-1157.

Xia H., Mao Q., Paulson H. L., Davidson B. L. 2002. siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo. Nat Biotechnol., 20(10),1006-10.

Xie Z., Allen E., Wilken A., Carrington J.C. 2005. Dicer-like 4 functions in trans-acting small interfering RNA biogenesis and vegetative phase change in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci USA., 102(36), 12984- 12989.

Xu , Xue-Ming, Min-Hyuk Yoo, B. A. Carlson, V. N. Gladyshev, D. L. Hatfield. 2009. Simultaneous knockdown of the expression of two genes using multiple shRNAs and subsequent knock-in of their expression. Nat Protoc. 4(9), 1338-1348.

Xu Y. & Szoka, F. C. 1996. Mechanism of DNA release from cationic liposome/DNA complexes used in cell transfcction. Biochemistry, 35, 5616-5623.

Yang N, Kazazian HH Jr. 2006. LI retrotransposition is suppressed by endogenously encoded small interfering RNAs in human cultured cells. Nat. Struct. Mol. Biol., 13(9), 76371.

Ye K., Malinina L. & Patel D. J. 2003. Recognition of small interfering RNA by a viral suppressor of RNA silencing. Nature, 426, 874—878.

Yigit E., Batista P. J., Bei Y., Pang K. M., Chen C. C., ToliaN. H., Joshua-Tor L., Mitani S., Simard M. J., and Mello C. C. 2006. Analysis of the C. elegans Argonaute family reveals that distinct Argonautes act sequentially during RNAi. Cell, 127, 747-757.

Yin PL, and Lin H. 2007. An epigenetic activation role of Piwi and a Piwi-associated piRNA in Drosophila melanogaster. Nature, 450, 304—308.

Yu B., Zhao X., Lee L. J., Lee R. J. 2009. Targeted delivery systems for oligonucleotide therapeutics. AAPSJ., 11, 195-203.

Yuan Y. R., Pei Y., Chen H. Y., Tuschl T„ Patel D. J. 2006. A potential protcin-RNA recognition event along the RISC-loading pathway from the structure of A. aeolicus Argonaute with externally bound siRNA. Structure, 14, 1557-1565.

Zamore P.D., Tuschl T., Sharp P.A., Bartel D.P. 2000. RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell, 101(1), 25-33.

Zeng Y. and Cullen, B. R. 2005. Efficient processing of primary microRNA hairpins by Drosha requires flanking nonstructured RNA sequences. J. Biol. Chem., 280, 27595-27603.

Zennou V., Petit C., Guetard D., Nerhbass U., Montagnier L., Charneau P. (2000) HIV-1 genome nuclear import is mediated by a central DNA flap. Cell. 101(2), 173-85.

Zhou J., Yuan X., Dismuke D., Forshey В. M., Lindquist C., Lee K.-H., Aiken C., Chen C.-H. 2004. Small-Molecule inhibition of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Replication by Specific Targeting of the Final Step of Virion Maturation. J. Virol. 78, 922-929.

Zuckerman J. E., Choi, С. H. J., Han, H., Davis, M. E. 2012. Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane. Proc. Nail Acad. Sci. USA, 109,3137-3142.

Чересиз С. В., Григорьев И., Семенова Е. А., Пустыльняк В. О., Власов В. В., Покровский А. Г. 2010. Псевдовирусная система для оценки активности противовирусных соединений с использованием различных культур клеток-мишеней. Докл. Академии Наук. 435(1), 1-5.

Чуриков Н. А., Кретова О. В. 2003. РНК-интерференция регулируется в развитии: анализ экспрессии суффикса — короткого ретроэлемента в геноме дрозофилы. Генетика. 39, 300-304.

Чуриков Н. А., Кретова О. В., Гашникова Н. М., Покровский А. Г. Генетическая конструкция на основе векторной плазмиды pEGFP-N 1, продуцирующая siPHK — ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа (ее варианты). Патент России № 2324738. 2008. Бюл. 18.

Чуриков II.А., Кретова О.В. 2003. РНК-интерференция регулируется в развитии. Генетика, 39, 300-304.