Свободные биологически активные формы тестостерона как наиболее адекватные маркеры для оценки андрогенного статуса тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, кандидат биологических наук Малышева, Наталья Михайловна

• Малышева, Наталья Михайловна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Малышева, Наталья Михайловна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Биосинтез, метаболизм и регуляция секреции тестостерона.

1.2. Роль транспортных белков в формировании биологически активного пула тестостерона.

1.3. Биологическая функция тестостерона.

1.4. Тестостерон - ассоциированная патология на различных этапах развития мужского организма.

1.5. Современные методы определения тестостерона, проблемы и перспективы их решения.

Глава 2. Материалы и методы.

Глава 3. Результаты исследования

3.1. Сравнительный анализ различных методов определения общего тестостерона в сыворотке крови.

3.2. Определение свободной формы тестостерона в слюне.

3.3. Сравнительный анализ LIA и ELISA технологий для определения свободной формы тестостерона в слюне в широком диапазоне концентраций.

3.4. Определение свободной формы тестостерона в сыворотке крови методом люминесцентного иммуноанализа с предварительной ультрафильтрацией.

Глава 4. Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Свободные биологически активные формы тестостерона как наиболее адекватные маркеры для оценки андрогенного статуса»

Актуальность темы исследования. Проблемы, связанные с нарушениями физиологических механизмов регуляции функции репродуктивной системы у мужчин в различные периоды онтогенеза занимают одно из важных мест в современной биологии и медицине. Развитие и поддержание репродуктивной функции у мужчин определяется физиологической динамикой секреции тестостерона с формированием востребованного уровня циркулирующих форм тестостерона в крови. Нарушение этого сложного многофакторного процесса приводит к развитию целого ряда патологий в репродуктивном здоровье человека, лабораторная диагностика которых в первую очередь определяется адекватностью и доступностью методов. определения главного мужского гормона -тестостерона (Т).

Тестостерон является ключевым элементом системы гипотоламус-гипофиз-гонады. Физиологическая роль его у мужчин хорошо известна и заключается, прежде всего, в формировании мужского фенотипа и обеспечении сперматогенеза. Оценка андрогенного статуса необходима при широком спектре клинических симптомов и патологических состояний, например, таких как тестикулярная недостаточность, бесплодие, сексуальная дисфункция, гипогонадизм различного генеза и др. Мониторинг за уровнем Т необходим при проведении антиандрогенной терапии определенных форм дисгормонального рака, а также при проведении заместительной терапии препаратами производными Т. Точное количественное определение Т необходимо для диагностики широко распространенного возрастного андрогенного дефицита. У детей при замедленном или ускоренном половом созревании, нарушении деятельности надпочечников, тестикулярных и овариальных нарушениях. У женщин показаниями к определению тестостерона являются гирсутизм, тестикулярная феминизация, аменорея, бесплодие, андроген секретирующие опухоли^ яичников и надпочечников, синдром поликистозных яичников, андрогенная недостаточность.

Тестостерон циркулирует в крови в комплексе со специфическим глобулином (СССГ) — 35-75% (Кд - 20 сек.) и неспецифическим белком альбумином — 25-65% (Кд - 1 сек), который имеет низкую аффинность, но большую емкость за счет его высокой концентрации в крови. И только 1-2% тестостерона циркулирует в крови в свободном виде. Свободный, тестостерон и связанный с альбумином тестостероном обозначают как биологически активную форму гормона. Обычно содержание общего тестостерона в сыворотке здоровых мужчин колеблется в. пределах физиологической нормы (12-30 нмоль/л) и коррелирует с концентрацией СССГ. Свободный тестостерон и связанный с альбумином тестостероном обозначают как биологически активную форму гормона, обеспечивающую его биологические ' эффекты. Однако даже в физиологических условиях концентрация СССГ широко варьирует в зависимости от диеты, ИМТ, концентрации инсулина и -возраста. А при патофизиологических состояниях, таких как острый и хронический стресс, психосоматические патологии, гипогонадизм и т.д., уровень СССГ, а также альбумина и их соотношение нарушается, что неизбежно влияет на содержание биологически доступного Т.

В начале 2007 года опубликовано официальное заявление международной ассоциации эндокринологов о недопустимости использования прямых не экстракционных методов для определения общего тестостерона в диапазоне низких концентраций (об.Т < 10 нмоль/л), поскольку это ведет к ошибкам в диагностике с последующим назначением неправильного лечения.

Именно поэтому наличие адекватных аналитических методов определения св.Т, обеспечило бы наиболее оптимальную диагностику андрогенного статуса организма как у мужчин, так и у женщин и детей, особенно до периода полового созревания.

Цель настоящей^ работы: оценка адекватности определения? общего тестостерона крови различными методами- иммуноанализа, разработка' современного высокочувствительного метода определения в слюне и сыворотке крови свободной формы тестостерона как маркера для оценки андрогенного статуса; и доказательства надежности его применения при различных физиологических и патофизиологических условиях у детей, подростков и взрослых мужчин:,

Для^достижения этой .цели поставлены следующие задачи:

1. Провести .сравнительный анализ; современных методов определения общего тестостерона в сыворотке крови и выбрать наиболее надежный.

2. Адаптировать метод: определения, свободной формы тестостерона в; слюнной жидкостиj стандартизировать методику сбора слюны и определить, диапазон физиологических, колебаний уровня свободного тестостерона у детей, подростков и взрослых мужчин; ' :

3. Разработать методические подходы для определения- свободной формы тестостерона в- сыворотке методом люминесцентного иммуноанализа с предварительной ультрафильтрацией и определить диапазон физиологических колебаний свободного тестостерона в сыворотке.

4.: Провести сравнительный анализ современных методов определения свободной формы тестостерона в слюне: и сыворотке крови.

5. Оценить возможности LIA и" ELISA технологий для определения свободной формы тестостерона в слюне в зависимости от используемого диапазона-концентраций.

Научная новизна. В представленной работе впервые проведена комплексная сравнительная: оценка современных методов иммуноанализа общего и свободного тестостерона у мужчин в различных биологических жидкостях.

Впервые в России адаптирован и обосновано введен в рутинную практику метод определения свободной формы тестостерона в слюнной жидкости на моделях различных физиологических и патофизиологических состояний репродуктивной системы.

Установлено, что использование количественных параметров общего и расчетного Т имеет существенные ограничения для оценки андрогенного статуса у детей в период препубертата (до 10 лет). В то же время определение содержания св. Т в слюне является дополнительным к клинической симптоматике и важным биохимическим маркером для диагностики возможных нарушений андрогенного гомеостаза.

Впервые разработан оригинальный тандем для определения свободного тестостерона в сыворотке мужчин. Разделение свободной и связанной с белками фракции тестостерона с помощью технологии ультрафильтрации на специальных фильтрах Amicon Ultra - 4 (30 кДа) в комбинации с измерением его уровня в ультрафильтрате высокочувствительным методом люминесцентного иммуноанализа (LIA, IBL), который обеспечивает адекватное определение тестостерона у мужчин в широком диапазоне концентраций.

Практическая значимость. С введением в практику очень чувствительной и специфичной LIA-технологии, концентрация тестостерона в слюне и ультрафильтрате может быть широко использована в качестве объективного гормонального маркера диагностики различных форм андрогенного дисбаланса у детей, подростков и взрослых мужчин. Определение свободного тестостерона LIA-методом может служить методом выбора для целого ряда научных исследований, мониторинга и лечения гонадальных дисфункций, включая изучение фармакокинетики производных тестостерона при заместительной терапии. Выявление неадекватно используемых методов иммуноанализа, применение которых приводит к завышению результатов определения Т, позволяет избежать возможных диагностических ошибок.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты определения уровня общего тестостерона прямыми неизотопными методами и автоматизированными системами широко варьируют в одних и тех же образцах сыворотки, особенно в диапазоне низких концентраций.

2. Концентрация свободного тестостерона в слюне у мужчин, определенная методом усиленной хемилюминесценции, отражает уровень свободного, несвязанного с белками, тестостерона в крови.

3. Показатель свободного тестостерона в ультрафильтрате является дополнительным к клинической диагностике чувствительным маркером выявления андрогенного дефицита.

4. Единого идеального маркера и метода определения андрогенного статуса не существует, поэтому, в зависимости от поставленной перед исследователем задачи, необходимо правильно выбрать адекватный показатель, а также чувствительный и специфичный метода его определения.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены в виде докладов на 8-ом Международном Конгрессе Андрологии (Сеул, июнь 2005), Международной Конференции «Балтийский форум» (Санкт-Петербург, июнь 2008), в виде тезисов на 9-ом Международном Конгрессе Андрологии (Барселона, Испания, март 2009), на 8-ом Европейском Конгрессе по Менопаузе (ЕМАБ) (Лондон, май 2009). По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 2 - в зарубежной печати.

Диссертация апробирована на межотделенческой конференции ФГУ Эндокринологический научный центр (апрель 2009).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 8 отечественных и 170 зарубежных источников. Работа содержит 17 таблиц, 20 рисунков.

Заключение диссертации по теме «Физиология», Малышева, Наталья Михайловна

ВЫВОДЫ

1. Использование прямых неизотопных методов и автоматизированных систем иммуноанализа для определения уровня общего тестостерона в крови является критическим при измерении данного маркера в диапазоне низких концентраций (< 8-10 нмоль/л).

2. Концентрация тестостерона в слюне у мужчин, определенная методом усиленной хемилюминесценции' отражает уровень свободного, несвязанного с белками, тестостерона в крови. Физиологический диапазон его содержания в утренние часы составлял 270-544 пмоль/л со снижением в вечернее время на 20-30 %.

3. Использование параметра уровня общего и расчетного Т неприемлемо для диагностики у детей препубертатного этапа развития. Содержание св. Т в слюне является оптимальным биохимическим маркером для оценки андрогенного статуса у детей на всех стадиях пубертатного развития, включая стадию препубертата.

4. Концентрация свободного тестостерона в ультрафильтрате является более чувствительным маркером выявления андрогенного дефицита по сравнению с расчетным методом и методом его определения в слюне. Физиологический диапазон его колебаний в сыворотке крови взрослых мужчин составляет 110-368 пмоль/л.

5. При определении свободного тестостерона в слюне у здоровых мужчин возможно использование как LIA, так и ELISA технологии, однако, для диагностики андрогенного дефицита необходимо использовать LIA метод, также как и для определения свободного тестостерона в слюне у детей и подростков.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные результаты показывают важность выбора адекватного маркера уровня тестостерона для диагностики андрогенного статуса и надежного метода определения его содержания.

2. Высокая чувствительность и специфичность LIA метода в сочетании с неинвазивностью и простотой получения слюны позволяет рекомендовать его для широкого использования в диагностической практике, включая динамический мониторинг различных состояний, изучение фармакокинетики производных тестостерона при заместительной терапии.

3. Для выявления различных форм андрогенных нарушений у мужчин рекомендуется определять уровень свободного тестостерона в сыворотке, используя LIA метод с предварительной ультрафильтрацией.

4. Оценку андрогенного статуса у детей в период препубертата рекомендуется проводить по уровню свободного тестостерона в слюне.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Малышева, Наталья Михайловна, 2009 год

1. Гончаров Н.П. и др. Характеристика стероидогенеза у обезьян при стрессе; зависимость от пола и возраста. // Вестник акад.мед.наук СССР. 1987. - № 10. - стр.88-94.

2. Гончаров Н.П., Кация Г.В., Колесникова Г.С. и др. Сравнительный анализ определения тестостерона в сыворотке крови различными методами. // Пробл.эндокрин. 2005. — т.51. - №6. - стр.31-37.

3. Гормональный анализ в диагностике болезней эндокринных желез. / под ред. Гончарова Н.П. М., 2009.

4. Дегидроэпиандростерон: свойства, метаболизм, биологическое значение. / Гончаров Н.П., Кация Г.В., Нижник А.Н. М., 2004.

5. Кация Г.В. Эндокринная функция тестикул у павианов гамадрилов при хроническом психоэмоциональном стрессе. // Бюл.эксп.биол.мед. -1984. т.97. - №3. - стр.285-287.

6. Урусова М.Е., Головаченко В.А., Гитель Е.П. и др. Сравнение наборов реагентов четырех фирм-производителей по качеству определения аналитов и относительной диагностической ценности. // Коммерческая биотехнология. — 2003. №6. - стр. 1-14.

7. Физиология эндокринной системы. / под ред. Дж. Гриффина, С Охеды. -М., 2008.

8. Элементы эндокринной регуляции. / под ред. Смирнова А.Н. М., 2006.

9. Abbaticchio G., de Fini М., Giagulli V.A. et al. Circannual rhythms in reproductive functions of human males, correlations among hormones and hormone-dependent parameters. // Andrologia. — 1987. Vol.19. - P.353-361.

10. Abbott D.H., Padmanabhan V., Dumesic D.A. Contributions of androgen and estrogen to fetal programming of ovarian dysfunction. // Reprod.Biol.Endocrinol. 2006. - Vol.4. - P.17.

11. Albrecht S., Zimmermann T., Brandi H. et al. Chemiluminescence at the turn of the millennium from annual fair curiosity to indispensable tool of laboratory diagnostics. // J.Lab.Med. - 1997. - Vol.21. - P. 191-204

12. Arregger A.L., Contreras L.N., Tumilasci O.R. et al. Salivary testosterone: a reliable approach to the diagnosis of male hypogonadism. // Clin.Endocrinol.- 2007. Vol.67. - N5. - P.656-662.

13. Bachmann G., Bancroft J., Braunstein G. et al. Female androgen insufficiency: the Princeton consensus statement on definition, classification, and assessment. // Fertil.Steril. 2002. - Vol.77. - P:660-665.

14. Badr F.M., Bartke A., Dalterio S., Bulger W. Suppression of testosterone production by ethyl alcohol. Possible mode of action. // Steroids. 1977. — Vol.30.-P.647-655.

15. Baker H.W.G., Burger H.G., de Krester M.D., and Hudson B.: Relative incidence of etiological disorders in male infertility. // In: Male Reproductive Dysfunction, RJ. Santen and R.S. Swerdloff, eds., Marcel Dekker, New York. 1986. - P.341-372.

16. Bhasin S., Storer T., Berman N. et al. The effects of supraphysiologic doses of testosterone on muscle size and strength in normal men. // N.Engl. J.Med.- 1996.-Vol.335.-P.l-7.

17. Bolour S., Braustein G. Testosterone therapy in women: a rewiew. // Int.Impot.Res. 2005. - Vol.17. - N5. - P.399-408.

18. Boots L.R., Potter S., Potter D. et al. Measurement of total serum testosterone levels using commercially available kits: high degree of between-kit variability. // Fertil.Steril. 1998. - Vol.69. - P.286-292.

19. Brambilla D.J., O'Donnel A.B., Matsumoto A.M., McKinlay J.B. Lack of seasonal variation in serum sex hormone levels in middle-aged to older men in the Boston area. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 2007. - Vol.92. - P.4224-4229.

20. Broadbent J.L. Salivary testosterone: is it an indicator of free testosterone concentration in plasma.// NZ.L.Med.Lab.Science. 2002. - Vol.56. -P.85-89.

21. Burger H.G. et al. Serum gonadotropin, sex steroids and immunoreactive inhibin in the first two years of life. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 1991. -Vol.72.-P.682-686.

22. Butler G.E. et al. Salivary testosterone levels and the progress of puberty in the normal boy. // Clin.Endocrinol. 1989. - Vol.30. - P.587-596.

23. Cameron D.R., Braunstein G.D. Androgen replacement therapy in women. // Fertil.Steril. 2004. - Vol.82. - P.273-289.

24. Carruthers M., Trinick T.R., Wheeler M.J. The validity of androgen assays. // Aging Male. 2007. - V.10. - N3. - P. 165-172.

25. Carruthers M. The paradox dividing testosterone deficiency symptoms and androgen assays: a closer look at the cellular and molecular mechanisms of androgen action. // J.Sex.Med. 2008. - Vol.5. - P.998-1012.

26. Chada M. et al. Inhibin B, follicle stimulating hormone, luteinizing hormone and testosterone during childhood and puberty in males: changes in serum concentrations in relation to age stage of puberty. // Physiol.Res. -2003.-Vol.52.-P.45-51.

27. Chahal H., Drake W. The endocrine system and aging. // J.Pathol. 2007. -Vol.211. -N3.-P.173-180.

28. Chiu S.K., Collier C.P., Clark A.F., Wynn-Edwards K.E. Salivary Cortisol on ROCHE Elecsys immunoassay system: pilot biological variation studies. // Clin.Biochem. 2003. - Vol.36. - P.211-214.

29. Choi H.H., Gray P.B., Storer T.W. et al. Effects of testosterone replacement in human immunodeficiency virus-infected women with weight loss. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 2005. -V. 90. - P. 1531-1541.

30. Christiansen K. Behavioural effects of androgen in men and women. // J.Endocrinol. 2001. - Vol.170. - N1. - P.39-48.

31. Clark B.R., Engvall E. Enzyme-immunoassaay. // CRC Pres. 1983.

32. Corradi G., Szathmari M. Serum and salivary testosterone levels in erectile dysfunction. // Orv.Hetil. 1998. - V.139. - N54. - P.2021-2024. •

33. Cunha G.R., Cooke P.S., Kurita T. Role of stromal-epithelial interactions in hormonal responses. // Arch.Histol.Cytol. 2004. - Vol.67. - N5. - P.417-434.

34. Dabbs Jr J.M. Age and seasonal variation in serum testosterone concentration among men. // Chronobiol.Int. 1990. - Vol.7. - P.245-249.

35. Dabbs J.M. Salivary testosterone measurements: reliability across hours, days and weeks. // Physiology & Behaviour. 1991. - Vol.49. - P.815-817.

36. Dabbs J.M., Campbell B.C., Gladue B.A., et al. Reliability of salivary testosterone measurements: a multicenter evaluation. // Clin.Chem. 1995. -Vol.41. - P.1581-1584.

37. Daly W., Seegers C.A., Rubin D.A. et al. Relationship between stress hormones and testosterone with prolonged endurance exercise. // Eur.J.Appl.Physiol. 2005. - V. 93. - P. 375-380.

38. Davison S., Bell R., Donath S. et al. Androgen levels in adult females: changes with age, menopause and oophorectomy. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 2005. - Vol.90. - P.3847-3853.

39. Diver M.J., Imtiaz K.E., Ahmad A.M. et al. Diurnal rhythms of serum total, free and bioavailable testosterone and of SHBG in middle-aged men compared with those in young men. // Clin.Endocrinol.(Oxf). — 2003. -Vol.58. -P.710-717.

40. Diver M.J. Laboratory measurement of testosterone. // Front.Horm.Res. -2009.-Vol.37. -P.21-31.

41. Dorgan J.F., Fears T.R., McMahon R.P. et al. Measurement of steroid sex hormones in serum: a comparison of radioimmunoassay and mass spectrometry. // Steroids. 2002. - Vol.67. - P.151-158.

42. DPC Technicfl services department. Immulite/immulite, 1000 total testosterone — manufactures instruction. // PILKTW-7, Los Angeles, USA,2005.

43. Dufau M., Catt K., Tsurahara T. et al. Radioimmunoassay of plasma testosterone. // Clin.Chem.Acta. 1972. - Vol.37. - P.109-116.

44. Edwards D.A., Wetzel K., Wyner D.R. Intercollegiate soccer: saliva Cortisol and testosterone are elevated during competition, and testosterone is related to status and social connectedness with teammates. // Physiol.behave.2006. Vol.87. - P.135-143.

45. Ehrmann D.A. Polycystic ovary syndrome. // N.Engl J.Med. 2005. -Vol.352. -P.1223-1236.

46. Ekins R. The free hormone hypothesis and measurement of free hormones. // Clin.Chem. 1992. - Vol.38. - N7. - P. 1289-1293.

47. Ellison P.T., Bribiescas R.G., Bentley GR et al. Population variation in age-related decline in male salivary testosterone. // Hum.Reprod. 2002. — Vol.17.-P.3251-3253.

48. El-Migdadi F., Nusier M., BashirN. Seasonal pattern of leuteinizing, follicle-stimulating hormone, testosterone and progesterone in adult population of both sexes in the Jordan Valley. // Endocr.Res. 2000. -Vol.26.-P.41-48.

49. Elmlinger M.W., Kuhnel W., Wormstall H. et al. Reference interval for testosterone, androstenedione and SHBG levels in healthy females and males from birth until old age. // Clin.Lab. 2005. - Vol.51. - N11-12. -P.625-632.

50. Elwan O., Abdallah M., Issa I. et al. Hormonal changes in cerebral infsrction in the young and elderly. // J.Neurol.Sci. 1990. - Vol.98. -P.235-243.

51. Feldman H.A., Longcope C., Derby C.A. et al. Age trends in the level of serum testosterone and other hormones in middle-aged men: Longitudinal results from the Massachusetts male aging study. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 2002. - Vol.87. - P.589-598.

52. Fugua J.S., Sher E.S., Migeon C.J. et al. Assay of plasma testosterone during the first six months of life: importance of chromatographic purification of steroids. // Clin.Chem. 1995. - Vol.41. - P.l 146-1149.

53. Fuller S.J., Tan R.S., Martins R.N. Androgens in the etiology of Alzheimer's disease in aging men and possible therapeutic interventions. // J.Alzheimer's.Disease. -2007. Vol.12. - P. 129-142.

54. Garde A.H., Hansen A.M. Long-term stability of salivary Cortisol. // Scand.J.Clin.Lab.Invest. 2005. - Vol.65. - P.433-436.

55. Gnessi L., Fabbri A., Spera G. Gonadal peptides as mediators of development and functional control of the testis: An integrated system with hormones and local environment. // Endocr.Rev. 1997. - Vol.18. - P.541-609.

56. Goncharov N., Katsya G., Dobracheva A. et al. Serum testosterone measurement in men: evalution of modern immunoassay technologies. // Aging Male. 2005. - V.8. - N3-4. - P. 194-202.

57. Gordon M.K., Peloso E., Auker A., Dozier M. Effect of flavored beverage crystals on salivary Cortisol enzymeimmunoreactive assay measurements. // Dev.Psychobiol. 2005. - Vol.47. - P. 189-195.

58. Granger D.A. et al. Salivary testosterone determination in studies of child health and development. // Hormones and Behaviour. 1999. - Vol.35. -P. 18-27.

59. Granger D.A., Shirtcliff E.A., Booth A. et al. The "trouble" with salivary testosterone. // Psychoneuroendocrinology. — 2004. Vol.29. - P. 12291240.

60. Griffin J.E., Wilson J.D. Disorders of the testes and male reproductive tract. // In: Williams Textbook of Endocrinology, 10th ed., P.R. Larsen, H.M. Kronenberg, S. Melmed, and K.S. Polonsky, eds. Saunders, Philadelphia, 2003. P.709-769.

61. Groschl M., Rauh M. Influence of commercial collection devices for saliva on the reliability of salivary steroids analysis. // Steroids 2006. Vol.71. -N13-14. -P.1097-1100.

62. Guo T., Taylor R.L., Singh R.J., Soldin S.J. et al. Simultaneous determination of 12 steroids by isotope dilution liquid chromatography-photospray ionization tandem mass spectrometry. // Clin.Chemica.Acta. -2006.-Vol.372.-P.76-82.

63. Hamallainen E.K., Adlercreutz H., Puska P., Pietinen P. Decrease of serum total and free testosterone during a low-fat high-fibre diet. // J.Steroid.Biochem. 1983. - Vol.18. - P.369-370.

64. Hammond G.L., Nikser J.A., Jones L.A., Sitteri R.K. Estimation of the percentage of free steroids in undiluted serum by centrifugal ultrafiltration -dialysis. // J.Biol.Chem. 1980. - Vol.255. - P.5023-5026.

65. Hammond G.L., Langley M.S. Identification and measurement of sex hormone binding globulin (SHBG) and corticosteroid binding globulin (CBG) in human saliva. // Acta.Endocrinol.(Copenh). 1986. - Vol.112. -P.603-608.

66. Hayes F.J., Seminara S.B., and Crowley W.F. Jr. Hypogonadotropic hypogonadism. // Endocrinol.Metab.Clin.North.Am. 1998. - Vol.27. -P.739-763.

67. Heikkonen E., Vlikahri R., Roine R. et al. The combine effect of alcohol and physical exercise on serum testosterone, luteinzing hormone and Cortisol in males. // Alcohol.Clin.Exp.Res. 1996. - V.20. - P.711-716.

68. Hemmula I., Dakubu S., Mukkala V.M. et al. Europium as a label in time-resolved immunofluorometric assays. // Analyt.Biochemistry. 1984. -Vol.137.-P.335-343.

69. Herold D.A., Fitzgerald R.L. Immunoassays for testosterone in women: better than a guess? // Clin.Chem. 2003. - Vol.49. - P.1250-1251.

70. Hogervorst E., Williams J., Budge M. et al. Serum total testosterone is lower in men with Alzheimer's disease. // Neuroendocrinol.Lett. — 2001. -Vol.22. -P.163-168.

71. Hubert W. Psychotropic effects of testosterone. // In: Nieschlag E, Behre H.M., eds. Testosterone, Springer Verlag, Berlin, 1990. P.51-71.

72. Hughes I.A. Minireview: sex differentiation. // Endocrinology 2001. -Vol.142.-P.3281-3287.

73. Jeibmann A., Zahedi S., Simoni M. et al. Glucagon like peptide-1 reduces the pulsatile component of testosterone secretion in healthy males. // Eur.J.Clin.Invest. 2005. - Vol.35. - P. 565-572.

74. Jockenhovel F., Haase S., Hoerman R. et al. // J.Clin.Ligand Assay. 1996. -Vol.19.-P.138-144.

75. Jones R.D., Hugh Jones T., Channer K.S. The influence of testosterone upon vascular reactivity. // Eur.J.Endocrinol. 2004. - Vol. 151. - N1. -P.29-37.

76. Kahn S.M. et al. Sex hormone-binding globulin is synthesized in target cells. // J.Endocrinol. 2002. - Vol.175. - P. 113-120.

77. Kalfas S., Rundegren J. Biological qualities of saliva sterilized by filtration or ethylene oxide treatment. // Oral.Microbiol.Immuno. 1991. - Vol.6. -P.182-186.

78. Kaufman J.M., VermulenA. Androgens in male senescence. // In: Nieschlag E, Behre HM, eds. Testosterone: Action, deficiency, substitution. Berlin, Springer Verlag, 1998. -P.437-471.

79. Kirkpatrick S.W., Campbell P.S., Wharry R.E., Robinson S.L. Salivary testosterone in children with and without learning disabilities. // Physiol.Behav. 1993. - Vol.53. - P.583-586.

80. Kivlighan K.T., Granger D.A., Schwartz E.B. et al. Quantifying blood leakage into the oral mucosa and its effects on the measurement of Cortisol, dehydroepiandrosterone, and testosterone in saliva. // Horm.Behav. 2004. - Vol.46. -P.39-46.

81. Kivlighan K.T., Granger D.A., Booth A. Gender differences in testosterone and Cortisol response to competition. // Psychoneuroendocrinolgy. 2005. -Vol.30.-P.58-71.

82. Klee G.G., Heser D.W. Techniques to measure testosterone in the elderly. // Mayo.Clin.Proc. 2000. - Vol.75. - P. 19-25.

83. Kuhn C.M. Anabolic steroids. // Recent.Prog.Horm.Res. 2002. - Vol.57. -P.411-434.

84. Kushnir M., Rockwood A.L., Roberts W.L. et al. Performance characteristics of a novel tandem mass spectrometry assay for serum testosterone. // Clin.Chem. 2006. - Vol.52. - P. 120-128.

85. Lac G., Lac N., Robert A. Steroid assays in saliva: a method to detect plasmatic contaminations. // Arch.Int.Physiol.Biochem.Biophys. 1993. -Vol.101.-N5.-P.257-262.

86. Landman A.D., Sanford L.M., Howland B.E. et al. Testosterone in human saliva. // Experientia. 1976. - Vol.32. - P.940-941.

87. Laughlin G.A., Barrett-Connor E., Kritz-Silverstein D., von Miihlen D. Hysterectomy, oophorectomy and endogenous sex hormone levels in older women: the Rancho Bernardo study. // J.Clin.Endocrinol.Metab. — 2000. -Vol.85. -P.645-651.

88. Lewis J.G. Steroid Analysis in saliva: an overview. // Clin.Biochem.Rev. -2006. Vol.27. - N3. - P. 139-146.

89. Liang T. Androgens and skin: 5a-reductase activity in skin and androgen dependent skin disorders. In: Bhasin S, Gabelnick H.L., Spieler J.M. et al. Pharmacology, biology, and clinical applications of androgens. // John Wiley, New York, 1996. P.247-256.

90. Liu P.Y., Death A.K., Handelsman DJ. Androgens and cardiovascular disease. // Endocr.Rev. 2003. - Vol.24. - N3. -P.313-340.

91. Longcope C., Feldman H.A., McKinlay J.B., Araujo A.B. Diet and sex hormone-binding globulin. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 2000. - Vol.85. -P.293-296.

92. Lunenfeld B. Endocrinology of aging male. // Minerva.Ginecol. 2006. -Vol.58. - N2.- P. 153-170.

93. Maes M., Mommen K., Hendrickx D. et al. Components of biological variation, including seasonality, in blood concentrations of TSH, TT3, FT4, PRL, Cortisol and testosterone in healthy volunteers. // Clin.Endocrinol.(Oxf). 1997. - Vol.46. -P.587-598.

94. Main K., Smith I.M., Skakkebaek N.E. A possible role for reproductive hormones in newborn boys: progressive hypogonadism without the postnatal testosterone peak. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 2000. - Vol.85. - P.4905-4907.

95. Male hypogonadism. / Jockenhövel Fr. Auflage - Bremen: UNI-MED., 2004.

96. Maso F., Lac G., Filaire E. et al. Salivary testosterone and Cortisol in rugby players: correlation with psychological overtraining items. // Br.J.Sports.Med. 2004. - Vol.38. - P.260-263.

97. Matsumoto A.M., Bremner W.J. Editorial: Serum testosterone assays — accuracy matters. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 2004. - Vol.89. - P.520-524.

98. McPhaul M.J. Molecular defects of the androgen receptor. // Recent.Prog.Horm.Res. 2002. - Vol.57. P. 181-194.

99. Meulenberg E.P., Hofman J.A. The effect of pre-treatment of saliva on steroid hormone concentrations. // J.Clin.Chem.Clin.Biochem. 1990. — Vol.28.-P.923-928.

100. Miller K., Sesmilo G., Schiller A. et al. Androgen deficiency in women with hypopituitarism. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 2001. - Vol.86. - P.561-567.

101. Mohr B.A., Guay A.T., O'Donnell A.B., McKinlay J.B., Normal, bound and nonbound testosterone levels in normally ageing men: Results from the Massachusetts Male Aging Study. // Clin.Endocrinol.(Oxf). 2005. -Vol.62.-P.64-73.

102. Mooradian A.D., Morley J.E., Korenman S.G. Biological actions of androgens. // Endocr.Rev. 1987. - Vol.8. - P. 1-27.

103. Morelius E., Nelson N, Theodorsson E. Saliva collection using cotton buds with wooden sticks: a note of caution. // Scand.J.Clin.Lab.Invest. -2006.-Vol.66.-P.15-18.

104. Morrison J.A., deGroot I., Edwards B.K. et al. Plasma cholesterol and triglyceride levels in 6775 school children, ages 6-17. // Metabolism. 1977. -Vol.26.-P.1199-1211.

105. Morrison J.A., Laskarzewski P.M., Rauh J.L. Lipids, lipoproteins, and sexual maturation during adolescence: the Princeton Maturation Study. // Metabolism. 1979. - Vol.28. - P.641-649.

106. Muller M.J. Salivary testosterone and simple reaction time parameters. // Neuropsychobiology. 1994. - Vol.30. -P.50-55.

107. Obminski Z. Changes in the free (unbound) fraction of testosterone in serum in vitro as affected by pH and temperature. // Exp.ClinJEndocrinol.Diabetes. 1998. - Vol.106. -P.85-88.

108. Olino S., Christian L., Attardi B. Role of testosterone in normal female function. //Nat.New.Biol. 1973. - Vol.243. - P. 119-120.

109. Ohzeki T., Mandella B., Gubelin-De Campo C., Zachmann M. Salivary testosterone concentrations in prepubertal and pubertal males: comparison with total and free plasma testosterone. // Horm.Res. 1991. - Vol.36. — P.235-237.

110. Okun M.S., McDonald W.M., DeLong M.R. Refractory nonmotor symptoms in male patients with Parkinson disease due to testosterone deficiency: A common unrecognized comorbidity. // Arch.Neurol. — 2002. — Vol.59. -P.807-811.

111. Ostatnikova D., Pastor K., Putz Z. et al. Salivary testosterone levels in preadolescent children. // BMC Pediatrics. 2002. - Vol.3. - N2. - 5.

112. Pardridge W.M. Transport of protein-bound hormones into tissues in vivo. // Endocr.Rev. 1981. - Vol.2. - P. 103-123.

113. Pardridge W.M. Serum bioavailability of sex steroid hormones. // Clin.Endocrinol.Metab. 1986. - Vol.15. - P. 259-278.

114. Passelerque P. et al. Saliva Cortisol, testosterone and T/C ratio variations during a wrestling competition and during the post-competitive recovery period. //IntJ.Sports.Med. 1999. - Vol.20. -P.109-113.

115. Perry 3rd H.M., Miller D.K., Patrick P., Morley J.E. Testosterone and leptin in older African-American men: relationship to age, strength, function, and season. // Metabolism. 2000. - Vol.49. - P. 1085-1091.

116. Plymate S.R., Tenover J.S., Bremner W.J: Circadian variation in testosterone, sex hormone-binding globulin, and calculated non-sex hormone-binding globulin bound testosterone in healthy young and elderly men. // J.Androl. 1989. - Vol.10. - P.366-371.

117. Raff H., Homar P.J., Skoner D.P. New enzyme immunoassay for salivary Cortisol. // Clin.Chem. 2003. - Vol.49. -P.203-204.

118. Ray R., Novotny N:M., Crisostomo P.R. et al. Sex steroid and stem cell function. // Mol.Med. 2008. - Vol.14. - N7-8. -P.493-501.

119. Rilling J.K., Worthman C.M., Campbell B.C. et al. Ratios of plasma and salivary testosterone throughout puberty: production versus bioavailability. // Steroids. 1996. - Vol.61. -P.374-378.

120. Rosario E.R., Pike C.J. Androgen regulation of P-amyloid protein and risk of Alzheimer's disease. // Brain.Res.Rev. 2008. - Vol.57. - N2. - P.444-453.

121. Rosner W. Plasma steroid-binding proteins. // Endocrinol.Metab.Clin.North.Am. 1991. - Vol.20. - P.697-720.

122. Rosner W. Errors in the measurement of plasma free testosterone. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 1997. - Vol.82. -P.2014-2015.

123. Rosner W., Auchus R., Azziz R. et al. POSITION STATEMENT: Utility, limitations and pitfalls in measuring testosterone: An Endocrine Society position statement. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 2007. - Vol.92. - P.405-413.

124. Sarkova T., Eriksson C.J. Testosterone increases in men after a low dose of alcohol. I I Alcohol.Clin.Exp.Res. 2003. - P.682-685.

125. Sartorius G., Ly L.P., Sikaris K. et al. Predictive accuracy and sources of variability in calculated free testosterone estimates. // Ann.Clin.Biochem. -2009. Vol.46. - N2. - P.137-143.

126. Scerbo A.S., Kolko D.J: Salivary testosterone and Cortisol in disruptive children: relationship to aggressive, hyperactive, and internalizing behaviors. // J.Am.Acad.Child.Adolesc.Psychiatry. 1994. - Vol.33. - P. 1174-1184.

127. Siekman L. Determination of steroid hormones by the use of isotope dilution—mass spectrometry: a definitive method in clinical chemistry. // J.Steroid.Biochem. 1979. - Vol.11. - P.117-123

128. Sikaris K., McLachlan R.I., Kazlauskas R. et al. Reproductive hormone reference intervals for healthy fertile young men: evaluation of automated platform assays. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 2005. - Vol.90. - N11. -P.5928-5936.

129. Simpson E.R. Aromatization of androgens in women: current concepts and findings. // Fertil.Steril. 2002. - Vol.77. - N4. - P.6-10.

130. Sparrow D., Bosse R., Rowe J.W. The influence of age, alcohol consumption, and body build on gonadal function in men. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 1980. - Vol.51. -P.508-512.

131. Stanworth R.D., Jones T.H. Testosterone for the aging male; current evidence and recommended practice. // Clin.Interv.Aging. — 2008. — Vol.3. -N1. -P.25-44.

132. Stewart P.M., Whorwood C.B., Mason L. Type 2 11 P-hydroxy steroid dehydrogenase in fetal and adult life. // J.Steroid.Biochem.Mol.Bio. 1995. -Vol.55. -P.465-471.

133. Strazdins L., Meyerkort S., Brent V. Et al. Impact of saliva collection methods on slgA and Cortisol assays and acceptability to participants. // J.Immunol.Methods. 2005. - Vol.307. - P. 167-171.

134. Svartberg J., Jorde R., Sundsford J. et al. Seasonal variation of testosterone and waist to hip ratio in men: the Troms study. // J.Clin.Endocrinol.Metab. -2003. Vol.88. - P.3099-3104.

135. Swinkels L.M., Van Hoof H.J., Ross H.A. et al. Low ratio of androstendione to testosterone in plasma and saliva of hirsute women. // Glin.Chem.- 1992.- Vol.38. -P.1819-1823.

136. Taieb J., Mathian B., Millot F. et al. Testosterone measurement by 10 immunoassays and by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry in sera from 116 men, women and children. // Clin.Chem. -2003. Vol.49. - P. 13 81 -1395.

137. Travison T.G. et al. A population-level decline in serum testosterone levels in American men. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 2007. - Vol.92. - P. 196202.

138. Umehara T., Kumamoto Y., Mikuma N. et al. Salivary testosterone in normal boys at puberty. // Nippon.Naibunpi.Gakkai.Zasshi. 1991. -Vol.67.-P.230-238.

139. Urban R.J., Bodenburg Y.H., Gilkison C. et al. Testosterone administration to elderly men increases skeletal muscle strength and protein synthesis. // Am.J.Physiol. 1995. - Vol.269. - P.820-826.

140. Van Aken M.O., Romijn J.A., Miltenburg J.A., Lentjes E.G. Automated measurement of salivary Cortisol. // Clin.Chem. 2003. - Vol.49. - P. 14081409.

141. Vermeulen A., Kaufman J.M. Aging of the hypothalamo-pituitary-testicular axis in men. // Horm.Res. 1995. - Vol.43. - N1-3. - P.25-28.

142. Vermeulen A., Kaufman J.M., Giagulli V.A. Influence of some biological indexes on sex hormone-binding globulin and androgens levels in aging or obese males. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 1996. - Vol.81. -P.1821-1826.

143. Vermeulen A., Verdonc K.L., Kaufman J.M. A critical evaluation of sample methods for the estimation of free testosterone in serum. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 1999. - Vol.84. - P.3666-3672.

144. Vermeulen A., Kaufman J.M. Diagnosis of hipogonadism in the aging male: // Aging male. 2002. - Vol.5. - P. 170-176.

145. Vialard-Miguel J., Belaidi N., Lembeye L., Corcuff J.B. Lemon juice alters Cortisol in saliva. // Clin.Endocrinol. 2005. - Vol.63. - P.478-479.

146. Vining R.F., McGinley R.A., Symons R.G. Hormones in saliva: mode of entry and consequent implication for clinical interpretation. // Clin.Chem. -1983. Vol.29. - P.1752-1756.

147. Vining R.F., McGinley R.A. The measurement of hormones in saliva: possibilities and pitfalls. // J.Steroid.Biochem. 1987. - Vol.27. - P.81-94.

148. Wall J.R., Jarrett R.J., Zimmet P.Z. et al. Fall in plasma testosterone levels in normal vale subjects in response to an oral glucose load. // Lancet.1973.-Vol.1.-P.967-968.

149. Walters K.A., Allan C.M., Handelsman D.J. Androgen actions and the ovary. // Biol.Reprod. 2008. - Vol.78. - P.380-389.

150. Wang C., Yonatt G., O'Connor S. et al. A simple radioimmunoassay for plasma-testosterone plus 5alpha-dihydrotestosterone. // J.SteroidJBiochem.1974.-Vol.5.-P.551-555.

151. Wang C., Catlin D.H., Demers L.M. et al. Measurement of total serum testosterone in adult men: comparison of current laboratory methods versus liquid chromatography tandem mass spectrometry. // J.Clin.Endocrinol.Metab. - 2004. - Vol.89. - P.534-543.

152. Ware V.C. The role of androgens in follicular development in the ovary. I. A quantitative analysis of oocyte ovulation. // J.Exp.Zool. — 1982. — Vol.222. -P.155-167.

153. Weiner C.L., Primeau M., Ehrmann D.A. Androgens and mood dysfunction in women: comparison of women with polycystic ovarian syndrome to healthy controls. // Psychosomatic.Med. 2004. - Vol.66. -P.356-362.

154. Wheeler M.J., D'Souza A., Matadeen Ji et al. Ciba Corning ACS: 180 testosterone assay evaluated. // Clin.Chem. 1996. -Vol.42. - P.1445-1449.

155. Wheeler M.J. Factors that affect the interpretation of testosterone results. // CPD.Clin.Biochem. 2003. - Vol.5. - P.86-90.

156. Whembolua G.L., Granger D.A., Singer S. et al. Bacteria in the oral mucosa and its effects on the measurement of Cortisol, dehydroepiandrosterone, and testosterone in saliva. // Horm.Behav. 2006. - Vol.49.-P.478-483.

157. Wilson J.D. The role of 5-alpha-reduction in steroid hormone physiology. // Reprod.Fertil.Dev. Vol.13. - P.673-678.

158. Yavus B., Ozakayar N., Halil M. et al. Free testosterone levels and implications on clinical outcomes in elderly men. // Aging.Clin.Exp.Res. -2008. Vol.20. - N3. - P.201-206.

159. Zhan Sh. Critical review of development, validation and transfer for high through put bioanalytical LC-MS/ MS methods. // Current.Pharmaceutical.Analysis. 2005. - Vol.1. - P.3-14.

160. Zitzmann M. Effects of testosterone replacement and its pharmacogenetics on physical performance and metabolism. // Asian.J.Androl. 2008. -Vol.10.-N3.-P.364-372.