Субстрат-специфические ингибиторы ферментативных систем перекисного окисления липидов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Журавлев Александр Михайлович

• Журавлев Александр Михайлович
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Журавлев Александр Михайлович

Список сокращений

1. Введение

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Степень разработанности темы

1.3. Научная новизна

1.4. Теоретическая и практическая значимость

1.5. Методология и методы исследования

1.6. Основные положения, выносимые на защиту

1.7. Публикации

1.8. Степень достоверности и апробация работы

1.9. Личный вклад автора

1.10. Структура и объем диссертации

2. Литературный обзор

2.1. Вступление

2.2. Биологическая функция изоферментов ALOX12 и ALOX15 млекопитающих

2.3. Общая структура изоферментов ALOX12 и ALOX15 млекопитающих и их конформационная гетерогенность

2.3.1. Кристаллическая структура и состав ЛЬОХ15 кролика

2.3.2. Кристаллическая структура ЛЬОХ12 человека тромбоцитарного типа

2.3.3. Кристаллическая структура каталитического домена ЛЬОХ15 свиньи (12-липоксигеназы)

2.3.4. Кристаллическая структура ЛЬОХ15В человека

2.4. Межмономерное взаимодействие у ALOX млекопитающих и в их комплексах

2.4.1. Межмолекулярные контакты у ЛЬОХ млекопитающих в кристаллах и растворе

2.4.2. Внутримолекулярные контакты в ЛЬОХ млекопитающих

2.5. Механизм ЛЬОХ катализа и позиционная специфичность

2.6. Изоформ специфические ингибиторы ЛЬОХ

2.7. Аллостерические эффекторы в ЛЬОХ-катализе

2.8. Внутри- и межмолекулярная связь мономеров ЛЬОХ и аллостерическая регуляция

2.9. Заключение

3. Анализ и обсуждение результатов

3.1. Каталитическая функция ALOX15 может регулироваться на уровне кооперативного эффекта мономеров в составе переходного комплекса

3.1а. Структурная энзимология ALOX15 и конформационная гетерогенность

3.1а.1 Исследования изоферментов АЬОХ15 с использованием N-PAGE электрофореза

3.1а.2. Структурные исследования конформационной гетерогенности ALOX15 кролика с помощью сайт направленного мутагенеза и физико-химических методов анализа

3.1а.3. Влияние точечных мутаций, локализованных в межмономерном интерфейсе димера, на ферментативные свойства ALOX15 кролика

3.1а.4. Докинг и МО-моделирование

3.1а.4.1. MD-моделирование структурных изменений ALOX15 кролика, вызванных точечной мутацией Тгр 18Ш1и

3.1а.4.2. Докинг и МО-моделирование процесса связывания AA и LA с ферментом

3.1а.4.3. Анализ предкаталитических структур

3.1а.5. Конформационная гетерогенность и кооперативной эффект мономеров ALOX15 кролика в липоксигеназной реакции

3.1б. Функциональная роль а18 спирали в аллостерической регуляции ALOX15 млекопитающих

3.16.1. Вклад Gln596 в кинетические параметры и специфичность продуктов ферментативной реакции ALOX15

3.16.2. Влияние рН и соли на специфичность продуктов ALOX15 кролика и человека диких типов и их мутантов

3.16.3. Влияние мутации Gln596Ala на образование вторичных продуктов окисления

3.16.4. Влияние мутаций Gln596 на аллостерические свойства ALOX15

3.16.5. Температурная зависимость вторичной и третичной структурной динамики ALOX15 кролика дикого типа и ее мутантов Gln596Ala/Leu

3.1б.6 Докинг и MD-моделирование комплексов фермент-субстрат для оценки взаимодействия Gln596

3.1б.7. Вклад Gln596 в специфичность реакции, каталитические и аллостерические свойства ALOX15

3.2. Химический синтез и исследование субстрат-специфических ингибиторов ALOX15

3.2.1. Разработка лидерного соединения и изучение взаимосвязи структура-активность (limitedSAR)

3.2.2. Химический синтез

3.2.2.1. Химический синтез модифицированных аналогов RS7 - (Е)-3-(5-( перфторфенокси)пент-1-ин-1-ил)фенил-акриловых кислот

3.2.2.2. Химический синтез ингибиторов ALOX15 на основе индолов

3.2.2.3. Химический синтез ингибиторов на основе имидазола

3.2.3. Ингибирующая активность

3.2.3.1. Ингибирующая активность модифицированных аналогов RS7 - (Е)-3-(5-( перфторфенокси)пент-1-ин-1-ил)фенил-акриловых кислот

3.2.3.2. Ингибирующая активность ингибиторов ЛЬОХ15 на основе индолов

3.2.3.3. Ингибирующая активность ингибиторов на основе имидазола

3.2.4. Субстрат-селективное ингибирование линолеатоксигеназной активности ЛЬОХ15 в присутствии липосом

3.3. Изучение механизмов аллостерической регуляции на основе полученных соединений

3.3.1. Механизм ингибирования ALOX15

3.3.2. Влияние ингибиторов на соотношение метаболитов ЛЬОХ15

3.3.3. Влияние мутации Leu183Glu+Leu192Glu на субстрат-селективное ингибирование ALOX15

3.3.4. Докинг и MD-моделирование

3.3.4.1. Докинг и MD-моделирование комплексов фермент ALOX15 - ингибитор (21а, 21б) - субстрат

3.3.4.2. Докинг и MD-моделирование комплексов фермент ALOX15 - ингибитор (21б и 3)

3.3.4.3. Оценка влияния аллостерических ингибиторов на связывание ЬЛ и ЛЛ при помощи МО-моделирования

4. Экспериментальная часть

4.1. Биохимия

4.1.1 Материалы

4.1.2 Методы

4.1.2.1. Сайт-направленный мутагенез

4.1.2.2. Экспрессия ферментных препаратов ALOX15

4.1.2.2.1. Экспрессия ЛЬОХ15 кролика

4.1.2.2.2. Экспрессия ЛЬОХ15 человека

4.1.2.2.3. Экспрессия ALOX15 мыши

4.1.2.3. Очистка ферментных препаратов ЛЬОХ15

4.1.2.4. Липосомальные препараты

4.1.2.5. Анализ активности ферментных препаратов ALOX15

4.1.2.5.1. Кинетика ЛЬОХ15 (очищенный фермент)

4.1.2.5.2. Активность ЛЬОХ15 в присутствии ингибиторов (очищенный фермент)

4.1.2.5.3. Активность ЛЬОХ15 в присутствии ингибиторов (супернатанты бактериального лизата)

4.1.2.5.4. Клеточная активность ЛЬОХ15 в присутствии ингибиторов

4.1.2.5.5. Продукты ALOX15

4.1.2.6. N-PAGE

4.1.2.7. Обратимость ингибирования

4.1.2.8. Устойчивость ингибитора в условиях каталитической реакции

4.1.2.9. Оценка гидродинамических радиусов для ALOX15 дикого типа и ее мутантов

4.1.2.10. Измерения динамической флуоресценции

4.1.2.11. Измерения СО

4.2. Химия

4.2.1. Материалы

4.2.2. Методы получения

4.2.2.1. Модифицированные аналоги RS7 - (Е)-3-(5-( перфторфенокси)пент-1-ин-1-ил)фенил-акриловые кислоты

4.2.2.2. Ингибиторы ALOX15 на основе индолов

4.2.2.3. Ингибиторы на основе имидазола

4.3. Докинг и MD-моделирование

4.3.1. Молекулярный докинг

4.3.2. Мутагенез 1п $Шео

4.3.3. Моделирование молекулярной динамики

5. Выводы

6. Список литературы

7. Приложения

Список сокращений

8(S),15(S)-DiHETE - 8(5)Д5(5)-дигидрокси-5^9Е,П^13Е-эйкозатетраеновая кислота 9-oxo-ODE - 9-оксо-10£',127-октадекаеновая кислота

9(S)-H(p)ODE - (9^,10Е,122)-9-гидро(перо)ксиоктадека-10,12-диеновая кислота 12(S)-H(p)ETE - (5Z,8Z,10E,12S,14Z)- 12-гидро(перо)ксиейкоза-5,8,10,14-тетраеновая кислота

13-oxo-ODE - 13-оксо-97,11Е-октадекаеновая кислота

13(S)-H(p)ODE - (9^ПЕД35)-13-гидро(перо)ксиоктадека-9Д1-диеновая кислота 13S,14S-epoxy-DHA - 13(^),14(^)-эпокси-47,77,9Е,11Е,167,197-докозагексаеновая кислота

14(S)-HDPA - (7Z,10Z,12E,14S,16Z,19Z)- 14-гидроксидокоза-7,10,12,16,19-пентаеновая кислота

15-oxo-HETE - 15-оксо-5Z,8Z,ПZД3E-эйкозатетpаеновая кислота

15(S)-H(p)ETE - (5Z,8Z,11 Z,13E,15S)-15 -гидро(перо)ксиэйкоза-5,8,11,13 -тетраеновая кислота

AA - арахидоновая кислота

AKBA - 3-O-ацетил-П-кето-P-босвеллиевая кислота ALOX - Липоксигеназа

ALOX12 - 12-липоксигеназа тромбоцитов человека ALOX15 - 15-липоксигеназа млекопитающих ALOX15B - 15-липоксигеназа человека II типа BzCl - бензоилхлорид (англ. Benzoyl chloride) CD - круговой дихроизм

CSI - хлоросульфонил изоцианат (англ. ChloroSulfonyl Isocyanate)

CSS - оценка значимости комплексообразования (англ. Complex formation Significance Score)

DHA - докозагексаеновая кислота

ETYA - 5,8,11,14-эйкозатетраиновая кислота

GPCR - рецептор сопряженный с G-белком (англ. G-Protein-Coupled Receptors)

HCMV - цитомегаловирус человека, или герпесвирус человека 5 типа (англ. Human

cytomegalovirus)

HDX-MS - масс-спектрометрия водородно-дейтериевого обмена

HX - Гепоксилины

Hx - изомеры гепоксилинов

IC50 - полумаксимальная ингибирующая концентрация LA - линолевая кислота LXs - липоксины

MAP-киназа - митоген-активируемая протеинкиназа

N-PAGE - Электрофорез в полиакриламидном геле в не денатурирующих условиях (англ.

Native-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)

OPP - 4-(2-оксапентадека-4-ин)фенилпропановая кислота

OS - олеилсульфат

PBS - натрий-фосфатный буфер (англ. Phosphate-Buffered Saline

PFP-Na - 2,3,4,5,6-пентафторфенолят натрия (англ. sodium 2,3,4,5,6-PentaFluoroPhenolate ) PISA - белки, интерфейсы, структуры и комплексы (англ. Proteins, Interfaces, Structures and Assemblies)

PLAT - а-токсин полицистин-1-липоксигеназа (англ. Polycystin-1-Lipoxygenase a-Toxin) PPAR-y - ядерный рецептор активируемый пероксисомным пролифератором гамма (англ. Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma)

RMSD - среднеквадратичное отклонение (англ. Root Mean Square Deviation) RS7 - RS75091 - (2£)-3-(2-окт-1-ин-1-илфенил)акриловая кислота SAR - взаимосвязь структуры и активности (англ. Structure-Activity Relationship) SAXS - малоугловое рентгеновское рассеяние (англ. Small Angle X-ray Scattering) sc - боковая цепь (англ. side chain)

SDS-PAGE - Электрофорез в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях с добавлением додецилсульфата натрия (англ. Sodium Dodecyl Sulfate -PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)

WT - дикий тип (англ. Wild-Type) ДМСО - ДиМетилСульфОксид ДМФА - N^-ДиМетилФормАмид ИК - Инфракрасная Спектроскопия крио-ЭМ - криоЭлектронная Микроскопия

НФ-ВЭЖХ - Нормально-Фазовая Высокоэффективная Жидкостная Хроматография ОФ-ВЭЖХ - Обращенно-Фазовая Высокоэффективная Жидкостная Хроматография ПНЖК - ПолиНенасыщенные Жирные Кислоты ПФК - ПолиФосфорная Кислота

ПЭ - Петролейный Эфир ТГФ - ТетраГидроФуран

ХФ-ВЭЖХ - Хирально-Фазовая Высокоэффективная Жидкостная Хроматография ЭА - ЭтилАцетат

ЯМР - Ядерный Магнитный Резонанс

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Субстрат-специфические ингибиторы ферментативных систем перекисного окисления липидов»

1. Введение 1.1. Актуальность проблемы

Липоксигеназы (ALOX) млекопитающих образуют семейство железосодержащих ферментов перекисного окисления липидов, которые вовлечены в процессы дифференцировки клеток [1-3], патогенез воспалительных и анафилактических заболеваний [4-8], атерогенез [9,10], ферроптоз [11,12], процессы возникновения резистентности к инсулину и воспалительные процессы в жировой ткани, которые являются ключевыми элементами ожирения [13-15]. У человека обнаружено шесть функциональных генов LOX (ALOX15, ALOX15B, ALOX12, ALOX12B, ALOX5, ALOXE3), экспрессия которых приводит к образованию различных изоформ ALOX. Эти ферменты способны окислять не только свободные ПНЖК, но и сложные липид-белковые комплексы, такие как биомембраны и липопротеины [16]. В частности, ALOX15 может напрямую окислять полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) в составе липидов клеточных мембран.

В патофизиологических состояниях основными субстратами ALOX15 являются свободные линолевая (ЬЛ) и арахидоновая (ЛЛ) кислоты. Одной из потенциальных мишеней липидных медиаторов является ядерный рецептор активируемый пероксисомным пролифератором гамма (PPAR-y), который играет ключевую роль в патогенезе онкологических заболеваний, воспалительных процессов и метаболических нарушений, таких как диабет и ожирение [17]. Также сообщалось о противовоспалительной роли таких метаболитов [18]. При различных типах рака и в различных моделях воспаления ALOX15 и ее метаболиты ПНЖК проявляют двойную функциональность [19]. Например, производные LA могут проявлять противоопухолевую активность в клетках глиобластомы [20]. Так, липоксигеназный метаболит (97,11Е,13^)-13-гидропероксиоктадека-9,11-диеновая кислота (13(^)-HpODE), производное LA, может оказывать туморогенное действие. Хотя роль АЪОХ в прогрессии онкологических заболеваний определяется типом ткани и экспрессируемой формой изофермента, повышенные уровни 13 (^-НрООЕ в плазме крови были обнаружены у пациентов с раком молочной железы. Этот продукт подавляет активность ядерных рецепторов PPAR-y и стимулирует рост опухоли при раке предстательной железы посредством митоген-активируемой протеинкиназы (MAP-киназы) [21]. Более того, 13(^)-НрООЕ вызывает окислительный стресс и апоптоз. Напротив, образующаяся из AA (57,87,117,13Е,15^)-15-гидропероксиэйкоза-5,8,11,13-тетраеновая кислота (15(^)-НрЕТЕ), активирует PPAR-y, снижает активность MAP-киназы и вызывает апоптоз. 15(5)-

НрЕТЕ в процессе межклеточного метаболизма превращается в липидные медиаторы такие как липоксины (LXs), которые посредством комбинированного действия различных изоформ ЛЬОХ проявляют сильные противовоспалительные свойства [22] и способствуют эффероцитозу, а также обладают антиапоптотической/нейропротекторной активностью [23]. Было обнаружено, что 15-НЕТЕ и 13-НООЕ являются новыми патогенными эффекторами врожденной инфекции цитомегаловируса человека (HCMV) [24].

Подобное про- и противовоспалительное (разнонаправленное) действие продуктов окисления ПНЖК под действием ЛЬОХ15 сделало этот фермент одной из основных мишеней для проведения фармакологических исследований. Исследования последних лет показали, что некоторые эндогенные лиганды ЛЬОХ15, такие как (57,87,10£,12£,142)-12-гидро(перо)ксиейкоза-5,8,10,14-тетраеновая кислота (12(5)-Н(р)ЕТЕ), 13(5)-Н(р)ООЕ, и др., могут влиять на кинетику ферментативной реакции по аллостерическому механизму, смещая баланс метаболизма ЬЛ и ЛЛ в пользу образования противовоспалительных медиаторов. Подобная функциональная особенность ЛЬОХ15 открывает перспективы для поиска новых таргетных модуляторов (субстрат-селективных ингибиторов), которые позволят более точно настроить биосинтез противовоспалительнх липидных медиаторов, продуктов липоксигеназного окисления ПНЖК, без полной инактивации фермента. Отсутствие систематических исследований в области поиска и создания субстрат-специфических ингибиторов ЛЬОХ делает данную работу актуальной.

Данная работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре химии и технологии биологически активных соединений, медицинской и органической химии имени Н.А. Преображенского института тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова, МИРЭА -Российского технологического университета. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ: 19-54-12002 ННИО_а и грантов Министерства науки и высшего образования Российской Федерации FSFZ-2020-0019 и FSFZ-2023-0004.

1.2. Степень разработанности темы

На протяжении ряда десятилетий были предприняты многочисленные попытки поиска селективных изоформ-специфических ингибиторов ЛЬОХ15, структуры которых содержат преимущественно азотсодержащие гетероциклы. К ним относятся производные оксадиазола или оксазола [25], сульфонамиды и сульфамиды пиразола [26], сульфонамиды имидазола [27], производные индолов [28-31], а также сульфонамиды триптамина [32]. К сожалению, ни один из

представленных ингибиторов не нашел медицинского применения в следствие неоднозначной (двойственной) патофизиологической роли продуктов окисления ПНЖК. Кроме того, несмотря на более чем тридцатилетнюю историю исследований ALOX15, механизм аллостерической регуляции этой группы ферментов остается недостаточно изученным по сегодняшний день. За небольшим исключением имеющихся в литературе данных систематические исследования в области поиска и создания аллостерических субстрат-специфических ингибиторов ALOX отсутствуют.

Цель работы состояла в поиске соединений, способных модулировать ферментативную активность ALOX15 в пользу образования противовоспалительных липидных медиаторов. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Показать, что каталитическая функция ALOX15 может регулироваться на уровне кооперативного эффекта ее мономеров в составе переходного комплекса;

2. Выявить структуру общего ядра фармакофора, обеспечивающего субстрат-специфическое ингибирование фермента, синтезировать потенциальные ингибиторы ALOX15;

3. Изучить взаимосвязь структура-активность и механизмы действия полученных ингибиторов.

1.3. Научная новизна

С помощью исследования в области сайт-направленного мутагенеза в сочетании с эксклюзионной хроматографией и электрофорезом было показано, что конформационная гетерогенность является неотъемлемым свойством каталитического домена ALOX15. Выявлены основные структурные детерминанты а2 и а18 спиралей (Trp181 и His 585), отвечающие за кооперативный эффект мономеров фермента в переходном димере ALOX15. Показано, что Gln596 (а18), участвующий в поддержании структурной целостности молекулы белка, также вносит вклад в межмономерные взаимодействия между спиралями а2 и а18 фермента, обеспечивая тонкую настройку его каталитической функции.

Показано, что углеводородный остов 2(£)-3-фенилакриловой кислоты не может быть использован для создания субстрат-специфических ингибиторов ALOX15. Проведено исследование в ряду структура-активность для соединений на основе индола и имидазола. Впервые показано, что по сравнению с соединениями на основе имидазола, новые ^-замещенные производные 5-(1#-индол-2-ил)-2-метоксианилинов обладают более высокой специфичностью при ингибировании LA-оксигеназной активности ALOX15, чем производные имидазола.

Показано, что наиболее перспективные ^-замещенные 5-(1#-индол-2-ил)-2-метоксианилины могут селективно ингибировать линолеатоксигеназную активность ALOX15 со значениями ГС50 в нижнем двузначном наномолярном диапазоне, в том числе и на клеточном уровне. Выявлено, что присутствие CHзO-группы в пара положении 2-арильного заместителя индола является неотъемлемым структурным элементом молекулы фармакофора, обеспечивающим субстратную селективность ингибитора.

1.4. Теоретическая и практическая значимость

Показано, что кооперативный эффект молекул фермента ALOX15 в переходном димере лежит в основе аллостерической регуляции ALOX15 и реализуется на уровне «коммуникации» мономеров посредством совместного интерфейса, образованного а2 и а18 спиралями. Выявлена структура ядра фармакофора, которая может быть использована для создания таргетных модуляторов (субстрат-селективных ингибиторов), вызывающих разнонаправленную регуляцию каталитической активности ALOX15 по отношению к LA и AA. Разработанные малостадийные методы синтеза лидерных соединений основаны на использовании коммерчески доступных продуктов и могут быть масштабированы. Обозначены перспективы для создания инновационных лекарственных препаратов или их прототипов для лечения ряда социально-значимых заболеваний человека в основе действия которых лежит регулировка баланса биосинтеза про- и противовоспалительных липидных медиаторов.

1.5. Методология и методы исследования

В ходе выполнения диссертационной работы разработаны подходы к получению новых ингибиторов ALOX15 на основе фенилакриловой кислоты, индола и имидазола. В их синтезе использовались современные методы органической и биоорганической химии. Для подтверждения структуры и чистоты полученных соединений был применен комплекс физико-химических методов анализа, который включал в себя: УФ-, ИК- и ЯМР-спектроскопию; элементный анализ; а также масс-спектрометрию и масс-спектрометрию высокого разрешения. Для проведения исследований ферментных препаратов ALOX15 использовались классические методы биохимии и методы статистического анализа.

1.6. Основные положения, выносимые на защиту

1. Показано, что каталитическая функция ALOX15 регулируется на уровне кооперативного эффекта мономеров фермента в составе переходного комплекса;

2. Выявлена структура ядра фармакофора, обеспечивающая субстрат-специфическое ингибирование фермента и синтезирован ряд потенциальных ингибиторов ALOX15;

3. Проведено изучение взаимосвязи структура-активность и изучены механизмы действия полученных ингибиторов.

1.7. Публикации

По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, включая 5 статьей в научных журналах, входящих в Перечень ВАК и в международные базы цитирования Scopus и Web of Science, 12 тезисов докладов.

1.8. Степень достоверности и апробация работы

Достоверность полученных результатов обеспечивается использованием хорошо отработанных методик эксперимента, применением современных физико-химических и биологических методов анализа. Все результаты биологических исследований были воспроизведены в нескольких независимых экспериментах, включающих в себя повторности и соответствующие контроли. Для подтверждения структур были использованы физико-химические методы анализа (ЯМР, масс-спектрометрия высокого разрешения). Экспрессия и выделение ферментных препаратов ALOX15, а также большинство представленных в диссертации биохимических исследований, в том числе исследования биологических свойств полученных соединений in vitro проводились в соответствии с общепринятыми методическими рекомендациями и протоколами. Научные положения и выводы диссертационной работы полностью обоснованы, достоверны и соответствуют полученным экспериментальным данным.

Результаты работы были представлены на следующих российских и международных конференциях: XXI Менделеевский съезд по общей и прикладной химии (Санкт-Петербург, 2019); 5-я и 8-я Междисциплинарные конференции «Молекулярные и биологические аспекты химии, фармацевтики и фармакологии» «МОБИ-ХимФарма2019» и «МОБИ-ХимФарма2023»

(Судак, 2019; Санкт-Петербург, 2023); 45th FEBS Congress «FEBS2021» (Ljubljana, 2021); 5-я Российская конференция по медицинской химии с международным участием «МедХим-Россия 2021» (Волгоград, 2022); Lipids 2021 (Moscow, 2021); XXXIV Международная зимняя молодёжная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2022); 8th European workshop on lipid mediators (Stockholm, 2022); Всероссийская научная конференция «Современные проблемы органической химии», посвященная 115-летию со дня рождения академика Н.Н. Ворожцова (Новосибирск, 2022); IX и X Международные конференции молодых ученых: вирусологов, биотехнологов, биофизиков, молекулярных биологов и биоинформатиков «OpenBio-2022» и «OpenBio-2023» (Новосибирск, 2022; Новосибирск, 2023); Всероссийская конференция с международным участием «Идеи и наследие А.Е. Фаворского в органической химии» (Санкт-Петербург, 2023).

1.9. Личный вклад автора

Диссертантом проанализирована актуальная литература по теме исследования, выполнена экспрессия и выделение ферментных препаратов ALOX15, проведено большинство представленных в диссертации биохимических исследований, осуществлен синтез и изучены физико-химические характеристики целевых и промежуточных соединений, проведены исследования полумаксимальной ингибирующей активности полученных ингибиторов, а также анализ и интерпретация данных исследований in silico. Автор участвовал в постановке задач, анализе результатов и формулировании выводов работы, а также в подготовке научных публикаций по теме диссертации.

1.10. Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы (177 ссылок на литературные источники) и приложения. Работа изложена на 175 страницах печатного текста и содержит 62 рисунка, 5 схем, 17 таблиц, 9 приложений.

2. Литературный обзор 2.1. Вступление

ALOX млекопитающих образует семейство ферментов перекисного окисления липидов, которые метаболизируют ПНЖК в биоактивные гормоны, обычно называемые эйкозаноидами [33-35]. Завершение проекта "Геном человека" выявило существование шести функциональных генов ЛЬОХ (ЛЬОХ5, ЛЬОХ15, ЛЬОХ15В, ЛЬОХ12, ЛЬОХ12В, ЛЬОХЕ3), которые кодируют шесть различных ЛЬОХ-изоферментов, несколько дисфункциональных псевдогенов и один антисмысловой ген ЛЬОХ12 (ЛLOX12-AS1), биологическая значимость которых на данный момент остается не изучена [36]. Соответствующие изоферменты ЛЬОХ представляют биологический интерес из-за их участия в физиологическом гомеостазе и в патогенезе различных заболеваний [33,37].

Несмотря на многолетние комплексные исследования функциональных характеристик различных изоформ ЛЬОХ человека, структура ЛЬОХ15 кролика ретикулоцитарного типа [38,39], которая была первой из изоформ ЛЬОХ млекопитающих полученной в виде кристалла, долгое время считалась хорошей моделью для изучения гомологии ортологов ЛЬОХ15 других видов, в том числе и ЛЬОХ15 человека. Современные достижения в структурной биологии ЛЬОХ позволили получить рентгеновские координаты структуры ЛЬОХ5 человека (PDB ГО 3O8Y) [40], а также его комплексов с природными соединениями (PDB ГО 6NCF и 6N2W) [41], комплекса каталитического домена для ЛЬОХ15 свиньи с ингибитором (12-ЬОХ лейкоцитарного типа (старая номенклатура); PDB ГО 3RDE) [42], структуру ЛЬОХ15В человека с детергентом (PDB ГО 4NRE) [43] и комплекса петлевого мутанта ЛЬОХ15В с ингибитором на основе имидазола (PDB ГО 7LAF) [44]. Недавно был получен большой объем структурных данных для различных олигомерных форм ALOX12 человека тромбоцитарного типа (PDB ГО от 8GHB до 8GHE) с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) [45].

Различные изоформы ЛЬОХ млекопитающих классифицируются по типу позиционной специфичности положения окисления ЛЛ. У человека экспрессируются две изоформы ЛЬОХ15 и ЛЬОХ15В [46]. Они на 38% идентичны по аминокислотной последовательности, однако их клеточная локализация значительно отличается [47]. ЛЬОХ15 окисляет АА с образованием смеси продуктов 15-HpETE (окисление по ^5 положению ЛЛ) и 12-HpETE (окисление по С12 положению ЛЛ), тогда как ЛЬОХ15В в основном окисляет ЛЛ до 15-НрЕТЕ. Основным ферментативным продуктом окисления АА ЛЬОХ12 человека тромбоцитарного типа и 12-LOX

свиньи лейкоцитарного типа является 12-НрЕТЕ. Хромосомная локализация, выравнивание аминокислотных последовательностей и сравнение ферментативных свойств позволяют предположить, что 12^0Х свиньи лейкоцитарного типа (ALOX15 свиньи) и ALOX15 кролика ретикулоцитарного типа, несмотря на различия в специфичности реакции, представляют собой функциональный эквивалент ALOX15 человека, тогда как ALOX12 тромбоцитарного типа принадлежит к другому семейству генов.

В течение многих лет считалось, что ALOXs млекопитающих функционируют как мономеры с единственным активным субстрат-связывающем сайтом, но последние данные выявили аллостерические аспекты, свидетельствующие о более сложных механизмах, вовлеченных в каталитические процессы липоксигеназной реакции ALOXs.

2.2. Биологическая функция изоферментов ALOX12 и ALOX15 млекопитающих

15-Липоксигеназы млекопитающих (ALOX15) — это ферменты перекисного окисления липидов, которые на высоком уровне экспрессируются в ретикулоцитах. Они участвуют в процессах дифференцировки клеток [1-3], атерогенезе [9,10], ферроптозе [11,12], процессах возникновения резистентности к инсулину и воспалении жировой ткани [13-15]. Эти ферменты способны окислять не только свободные ПНЖК, но и сложные липидно-белковые комплексы, такие как биомембраны и липопротеины [16]. В целом, ортологи ALOX15 млекопитающих проявляют двойную позиционную специфичность, поскольку они окисляют AA как до 15-НрЕТЕ, так и до 12-HpETE в соотношении 95:5 у рекомбинантной ALOX15 кролика, 92:8 у нативной ALOX15 кролика и 90:10 у рекомбинантной ALOX15 человека [48-57]. Метаболиты свободных ПНЖК, полученные окислением различных субстратов под действием ALOX15, ранее были идентифицированы как лиганды PPAR-y, обладающие выраженной антипролиферативной активностью [17]. Также сообщалось о противовоспалительной роли таких метаболитов [18]. Однако при различных типах рака, а также в различных моделях воспаления, ALOX15 и ее метаболиты ПНЖК проявляют двойную функциональность. Например, метаболиты LA, могут оказывать противоопухолевое действие на клетки глиобластомы [20]. 13(£)-HODE, основной метаболит окисления LA ALOX15, вызывает подавление PPAR-y и стимулирует рост опухолевых клеток при раке предстательной железы посредством активации MAP-киназного пути [21]. (9£,10£,122)-9-гидроксиоктадека-10,12-диеновая кислота (9(S)-HODE) может способствовать развитию восприятия боли, атеросклероза и заболеваний, связанных с окислительным стрессом, а также является маркером данных

заболеваний. 9-оксо-10£,127- и 13-оксо-97,11£- октадекаеновые кислоты (9-oxo-ODE и 13-oxo-ODE) способствуют развитию воспалительной реакции в патогенезе атеросклероза, болезни Альцгеймера, стеатогепатита и других патологических заболеваний, а также выступают в качестве биомаркеров. Таким образом метаболиты LA по большей части обладают провоспалительной, т.е. отрицательной, биоактивностью. Напротив, метаболиты AA, например, 15(5)-Н(р)ЕТЕ, напрямую связываются и активируют PPAR-y, тем самым ингибируя рост клеточных линий рака простаты человека и снижают активность MAP-киназы. LXs - являются представителями противовоспалительных агентов с пролонгирующим действием. 8(5),15(5)-дигидрокси-57,9£,117,13£-эйкозатетраеновая кислота (8(5),15(5)-ОШЕТЕ) ингибирует агрегацию тромбоцитов человека, тогда как 15-оксо-5Z,8Z,11Z,13E-эйкозатетраеновая кислота (15-oxo-HETE) ингибирует рост культивируемых эндотелиальных клеток пупочной вены человека и различных линий раковых клеток. Гепоксилины (HX) A3 и В3, а также их тригидроксильные метаболиты: триоксилин A3 и В3 обладают противовоспалительным и сосудорасширяющим действием, они способствуют усилению болевого восприятия, обращают окислительный стресс в клетках и стимулируют секрецию инсулина, а их изомеры -способствуют регуляции воспалительных реакций и секреции инсулина. Таким образом по большей части метаболиты AA обладают сильной противовоспалительной биоактивностью. В частности 15-НЕТЕ, основной метаболит окисления АA под действием ALOX15, и 13-HODE были признаны новыми патогенными эффекторами врожденной инфекции HCMV [24].

Было обнаружено, что 12-липоксигеназа тромбоцитов человека (ALOX12) экспрессируется в больших объемах в различных опухолевых тканях, включая рак предстательной железы, колоректальный рак, рак молочной железы и рак легких [58-60]. Она также экспрессируется в тромбоцитах [61], и ее активация приводит к образованию 12(5)-HpETE. В отличие от ALOX15, ALOX12 человека обладает низкой реакционной способностью по отношению к молекулам ПНЖК, входящих в фосфолипидный бислой клеточных мембран. Было высказано предположение, что 12(5)-НЕТЕ активирует NADPH-оксидазу с образованием активных форм кислорода [62]. Есть данные, которые свидетельствуют, что 12(5)-HETE связывается с GPR31, орфанным рецептором сопряженным с G-белком (GPCR), вызывая протромботический эффект [63]. Исследования, в которых ингибировалось образование 12(5)-НЕТЕ, показали снижение роста тромбов. Также было высказано предположение, что 12-HETE приводит к образованию тромбина, зависящего от тканевого фактора, вследствие его этерификации в мембране [64,65]. Кроме того, трансгенные мыши с дефицитом ALOX12 не были способны к нормальной агрегации тромбоцитов [66].

15-липоксигеназа человека II типа (ALOX15B) была впервые описана в 1997 году. Она экспрессируется в коже, предстательной железе, легких и роговице человека [46]. Этот фермент также на высоком уровне экспрессируется в макрофагах человека [67,68]. В отличие от ALOX15, ALOX15B окисляет AA исключительно с образованием 15(S)-HpETE [46]. Хотя биологическая функция ALOX15B остается предметом обсуждения и многочисленных дискуссий, она присутствует во множестве тканей, следовательно ее экспрессия и активность могут влиять на многие клеточные сигнальные пути [68]. Предполагается, что в макрофагах человека роль ALOX15B заключается в регуляции гомеостаза холестерина [69]. Было показано, что ингибирование ALOX15B снижает концентрацию молекул цитокинов и хемокинов, а экспрессия ALOX15B связана с развитием атеросклероза [70]. Описана явная роль ALOX15B в качестве опухолевого ингибитора при раке предстательной и молочной железы [71,72], но экспрессия ALOX15B при колоректальном раке приводит к неблагоприятным прогнозам [73].

2.3. Общая структура изоферментов ALOX12 и ALOX15 млекопитающих и их

конформационная гетерогенность

2.3.1. Кристаллическая структура и состав ALOX15 кролика

Кристаллический комплекс ALOX15 кролика - ингибитор (разрешение: 2,40 А) [39] содержит две белковые молекулы в асимметричном звене, каждая из которых содержит 662 аминокислотных остатка. В этой димерной структуре (PDB ID 2P0M) один мономер (мономер Б) содержит ингибитор (2£)-3-(2-окт-1-ин-1-илфенил)акриловую кислоту (RS7) в предполагаемом субстрат-связывающем кармане, тогда как другой мономер не связан c лигандом (мономер A). Мономер Б с ингибитором RS7 принимает закрытую конформацию, в которой доступ к субстрат-связывающему карману блокируется а2-спиралью. Мономер А, не содержащий лигандов, принимает открытую конформацию, в которой вход в субстрат-связывающий карман открыт, но карман неглубокий, а спираль а2 располагается почти по всей длине каталитического домена. Два мономера связаны псевдодвойной осью в R 3 2 симметрии [39]. Граница раздела димеров (Рисунок 1Аа), образованная двумя а2-спиралями, образована исключительно гидрофобными взаимодействиями. Архитектура мономеров ALOX15 имеет двухдоменную структуру, состоящую из N-концевого а-токсин полицистин-1-липоксигеназного (PLAT) домена и C-концевго а-спирального каталитического домена.

РОВНОЕ

Рисунок 1. Структуры различных АЬОХ млекопитающих. А) Структура АЬОХ15 кролика (PDB ID 2P0M); а) представление общей структуры димера; б) наложение кристаллических структур мономера А (серого) и связанного с лигандом мономера Б (оранжевого). Б) Структура АЬОХ12 человека (PDB ГО 8HGC); а) представление общей структуры димера; б) наложение кристаллических структур мономера А (серого) и мономера Б (оранжевого). В) Структура каталитического домена АЬОХ15 свиньи (PDB ГО 3RDE); а) представление общей структуры тетрамера в кристаллах; б) фолдинг каталитического домена ALOX15 свиньи (голубой); в) наложение кристаллических структур ALOX15 кролика (PDB ГО 2Р0М, мономер А, серый) и каталитического домена ALOX15 свиньи (PDB ГО ЗЯСЕ, голубой). Г) Структура АЬОХ15В человека (PDB ГО 4NRE) [43]; а) представление общей структуры гексамера; б) фолдинг ALOX15B человека (розовый); в) наложение кристаллических структур ALOX15 кролика (PDB ГО 2Р0М, мономер А, серый) и ALOX15B человека (PDB ГО 4ШЕ, розовый).

За исключением а2 и а18 спиралей, пространственное расположение других вторичных структурных элементов двух мономеров А и Б ALOX15 кролика (Рисунок 1Аб). В мономере Б, который содержит лиганд, спираль а18 слегка смещена по сравнению с мономером А, не содержащим лиганд. С другой стороны, более существенные различия наблюдаются в области а2 спирали, так в мономере Б она смещена более сильно, примерно на 12 А, по сравнению с мономером А (Рисунок 1Аб) [39].

Как показали измерения малоуглового рентгеновского рассеяния (SAXS), в растворе ALOX15 кролика может присутствовать в мономерной и димерной формах и подвергается обратимой димеризации [74]. В отличие от ALOX5 человека, который образует ковалентно связанные димеры [75], у ALOX15 кролика отсутствует какая-либо ковалентная связь между мономерами. Степень димеризации ALOX15 кролика зависит от концентрации белка, температуры, рН, ионной силы и наличия или отсутствия лигандов в активном центре фермента [74,76]. Расчеты свободной энергии при димеризации ALOX15 кролика показали, что среди возможных димеров ALOX15 (A+A, A+Б, Б+Б) комбинация A+Б термодинамически наиболее стабильна [74].

2.3.2. Кристаллическая структура ALOX12 человека тромбоцитарного типа

В отличие от структуры ALOX15 кролика, крио-ЭМ высокого разрешения ALOX12 человека (белок, состоящий из 663 аминокислот) позволила обнаружить различные олигомерные формы фермента - от мономерной до гексамерной. Структурная архитектура мономерной ALOX12 типична для ALOX с N-концевым PLAT-доменом и а-спиральным каталитическим доменом. Структурное сопоставление с другими изоферментами ALOX выявило высокую степень структурного подобия [45]. Так структура мономера ALOX12 во всех олигомерных формах была идентичной, за исключением димера ALOX12. Подобно рентгеновской структуре ALOX15 кролика, отдельные мономеры в димере ALOX12 не эквивалентны и ни один из них не содержит лиганда. Мономеры расположены относительно друг друга «голова к ногам», причем большинство контактов осуществляется посредством гидрофобных взаимодействий между а2-спиралями (Рисунок 1Ба). Хотя ALOX12 человека гомологична ALOX15 кролика только на 61,5%, аналогично ALOX15 кролика в димере, его мономеры принимают либо «открытую» (как это наблюдается в ALOX^-мономере, тетрамере и гексамере), либо «закрытую» конформации, чему в основном способствует значительное смещение а2-спирали и соответствующие перегруппировки соседних петель (Рисунок 1Бб), однако эти конформации несколько отличаются по сравнению со структурной перестройкой в мономере Б ALOX15 кролика (Рисунок 1Аб). В открытой конформации а2-спираль образует длинную спираль, которая находится на краю активного центра. В закрытой конформации а2-спираль поворачивается на 23°, блокируя вход в активный центр, уменьшая его внутренний объем. Изменение конформации а2-спирали также приводит к повороту двух мономеров относительно друг друга на 30°. Эти данные свидетельствуют о том, что конформационная гетерогенность также может быть неотъемлемым

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Журавлев Александр Михайлович, 2024 год

6. Список литературы

1. Cyrus T. et al. Disruption of the 12/15-lipoxygenase gene diminishes atherosclerosis in apo E-deficient mice // J. Clin. Invest. 1999. Vol. 103, № 11. P. 1597-1604.

2. Pidgeon G.P. et al. Lipoxygenase metabolism: Roles in tumor progression and survival // Cancer Metastasis Rev. Cancer Metastasis Rev, 2007. Vol. 26, № 3-4. P. 503-524.

3. £imen I., Tun9ay S., Banerjee S. 15-Lipoxygenase-1 expression suppresses the invasive properties of colorectal carcinoma cell lines HCT-116 and HT-29 // Cancer Sci. Cancer Sci, 2009. Vol. 100, № 12. P. 2283-2291.

4. Serhan C.N., Petasis N.A. Resolvins and protectins in inflammation resolution // Chem. Rev. 2011. Vol. 111, № 10. P. 5922-5943.

5. Yoo S., Lim J., Hwang S. Resolvins: Endogenously-Generated Potent Painkilling Substances and their Therapeutic Perspectives // Curr. Neuropharmacol. 2013. Vol. 11, № 6. P. 664-676.

6. Ivanov I., Kuhn H., Heydeck D. Structural and functional biology of arachidonic acid 15-lipoxygenase-1 (ALOX15) // Gene. Elsevier, 2015. Vol. 573, № 1. P. 1-32.

7. Pace S. et al. Androgen-mediated sex bias impairs efficiency of leukotriene biosynthesis inhibitors in males // J. Clin. Invest. 2017. Vol. 127, № 8. P. 3167-3176.

8. Larsen J.S. et al. Leukotriene-Receptor Antagonists and 5-Lipoxygenase Inhibitors in Asthma // http://dx.doi.org/10.1177/106002809302700718. SAGE PublicationsSage CA: Los Angeles, CA, 1993. Vol. 27, № 7-8. P. 898-903.

9. Mochizuki N., Kwon Y.G. 15-Lipoxygenase-1 in the vasculature: Expanding roles in angiogenesis // Circ. Res. Circ Res, 2008. Vol. 102, № 2. P. 143-145.

10. Zhao L. et al. Lipoxygenase and prostaglandin G/H synthase cascades in cardiovascular disease // Expert Rev. Clin. Immunol. Expert Rev Clin Immunol, 2006. Vol. 2, № 4. P. 649-658.

11. Kapralov A.A. et al. Redox lipid reprogramming commands susceptibility of macrophages and microglia to ferroptotic death // Nat. Chem. Biol. Nat Chem Biol, 2020. Vol. 16, № 3. P. 278290.

12. Kagan V.E. et al. Oxidized arachidonic and adrenic PEs navigate cells to ferroptosis // Nat. Chem. Biol. 2016 131. Nature Publishing Group, 2016. Vol. 13, № 1. P. 81-90.

13. de Luca C., Olefsky J.M. Inflammation and insulin resistance // FEBS Lett. John Wiley & Sons, Ltd, 2008. Vol. 582, № 1. P. 97-105.

14. Sears D.D. et al. 12/15-Lipoxygenase is equired for the early onset of high fat diet-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance in mice // PLoS One. PLoS One, 2009. Vol.

4, № 9.

15. Lieb D.C. et al. Adipose Tissue 12/15 Lipoxygenase Pathway in Human Obesity and Diabetes // J. Clin. Endocrinol. Metab. Oxford Academic, 2014. Vol. 99, № 9. P. E1713-E1720.

16. Brinckmann R. et al. Membrane translocation of 15-lipoxygenase in hematopoietic cells is calcium-dependent and activates the oxygenase activity of the enzyme // Blood. 1998. Vol. 91, № 1. P. 64-74.

17. Vangaveti V. et al. 9- and 13-HODE regulate fatty acid binding protein-4 in human macrophages, but does not involve HODE/GPR132 axis in PPAR-y regulation of FABP4 // Ther. Adv. Endocrinol. Metab. SAGE Publications Ltd, 2018. Vol. 9, № 5. P. 137-150.

18. Daynes R.A., Jones D.C. Emerging roles of PPARS in inflammation and immunity // Nat. Rev. Immunol. 2002 210. Nature Publishing Group, 2002. Vol. 2, № 10. P. 748-759.

19. Ackermann J.A. et al. The double-edged role of 12/15-lipoxygenase during inflammation and immunity // Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Biol. Lipids. Elsevier, 2017. Vol. 1862, № 4. P. 371-381.

20. Souza F. da C., Ferreira M.T., Colquhoun A. Influence of Lipoxygenase Inhibition on Glioblastoma Cell Biology // Int. J. Mol. Sci. 2020, Vol. 21, Page 8395. Multidisciplinary Digital Publishing Institute, 2020. Vol. 21, № 21. P. 8395.

21. Hsi L.C., Wilson L.C., Eling T.E. Opposing Effects of 15-Lipoxygenase-1 and -2 Metabolites on MAPK Signaling in Prostate // J. Biol. Chem. Elsevier BV, 2002. Vol. 277, № 43. P. 4054940556.

22. Spite M., Serhan C.N. Novel Lipid Mediators Promote Resolution of Acute Inflammation // Circ. Res. Lippincott Williams & WilkinsHagerstown, MD, 2010. Vol. 107, № 10. P. 11701184.

23. Sekheri M. et al. 15-Epi-LXA4 and 17-epi-RvD1 restore TLR9-mediated impaired neutrophil phagocytosis and accelerate resolution of lung inflammation // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. National Academy of Sciences, 2020. Vol. 117, № 14. P. 7971-7980.

24. Leghmar K. et al. Cytomegalovirus Infection Triggers the Secretion of the PPARy Agonists 15-Hydroxyeicosatetraenoic Acid (15-HETE) and 13-Hydroxyoctadecadienoic Acid (13-HODE) in Human Cytotrophoblasts and Placental Cultures // PLoS One. Public Library of Science, 2015. Vol. 10, № 7. P. e0132627.

25. Rai G. et al. Potent and selective inhibitors of human reticulocyte 12/15-lipoxygenase as anti-stroke therapies // J. Med. Chem. American Chemical Society, 2014. Vol. 57, № 10. P. 40354048.

26. Ngu K. et al. Pyrazole-based sulfonamide and sulfamides as potent inhibitors of mammalian 15-

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

lipoxygenase // Bioorganic Med. Chem. Lett. Elsevier Ltd, 2011. Vol. 21, № 14. P. 4141-4145.

Weinstein D.S. et al. Discovery of selective imidazole-based inhibitors of mammalian 15-

lipoxygenase: Highly potent against human enzyme within a cellular environment // Bioorganic

Med. Chem. Lett. Pergamon, 2007. Vol. 17, № 18. P. 5115-5120.

Sendobry S.M. et al. Attenuation of diet-induced atherosclerosis in rabbits with a highly

selective 15-lipoxygenase inhibitor lacking significant antioxidant properties // Br. J.

Pharmacol. John Wiley & Sons, Ltd, 1997. Vol. 120, № 7. P. 1199-1206.

Barvian N.C. et al. 1,2,4-Trisubstituted Benzenes As Inhibitors of 15-Lipoxygenase. Patent WO

2001096298 A2, 20 December, 2021.

Connor D.T.; et al. Indole and benzimidazole 15-lipoxygenase inhibitors. 2004. Eleftheriadis N. et al. Rational Development of a Potent 15-Lipoxygenase-1 Inhibitor with in Vitro and ex Vivo Anti-inflammatory Properties // J. Med. Chem. American Chemical Society, 2015. Vol. 58, № 19. P. 7850-7862.

Weinstein D.S. et al. Tryptamine and homotryptamine-based sulfonamides as potent and selective inhibitors of 15-lipoxygenase // Bioorganic Med. Chem. Lett. Pergamon, 2005. Vol. 15, № 5. P. 1435-1440.

Kuhn H., Banthiya S., Van Leyen K. Mammalian lipoxygenases and their biological relevance // Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Biol. Lipids. NIH Public Access, 2015. Vol. 1851, № 4. P. 308-330.

Brash A.R. Lipoxygenases: Occurrence, functions, catalysis, and acquisition of substrate // Journal of Biological Chemistry. 1999. Vol. 274, № 34. P. 23679-23682. Haeggstrom J.Z., Funk C.D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: Biochemistry, biology, and roles in disease // Chem. Rev. Chem Rev, 2011. Vol. 111, № 10. P. 5866-5896. Kuhn H. et al. The evolutionary hypothesis of reaction specificity of mammalian ALOX15 orthologs // Prog. Lipid Res. Pergamon, 2018. Vol. 72. P. 55-74.

Singh N.K., Rao G.N. Emerging role of 12/15-Lipoxygenase (ALOX15) in human pathologies // Prog. Lipid Res. Pergamon, 2019. Vol. 73. P. 28-45.

Gillmor S.A. et al. The structure of mammalian 15-lipoxygenase reveals similarity to the lipases and the determinants of substrate specificity // Nat. Struct. Biol. Nature Publishing Group, 1997. Vol. 4, № 12. P. 1003-1009.

Choi J. et al. Conformational flexibility in mammalian 15S-lipoxygenase: Reinterpretation of the crystallographic data // Proteins Struct. Funct. Genet. John Wiley & Sons, Ltd, 2008. Vol. 70, № 3. P. 1023-1032.

Gilbert N.C. et al. The structure of human 5-lipoxygenase // Science (80-. ). 2011. Vol. 331, №

6014. P. 217-219.

41. Gilbert N.C. et al. Structural and mechanistic insights into 5-lipoxygenase inhibition by natural products // Nat. Chem. Biol. Nat Chem Biol, 2020. Vol. 16, № 7. P. 783-790.

42. Xu S. et al. Crystal structure of 12-Lipoxygenase catalytic-domain-inhibitor complex identifies a substrate-binding channel for catalysis // Structure. Structure, 2012. Vol. 20, № 9. P. 14901497.

43. Kobe M.J. et al. The structure of human 15-lipoxygenase-2 with a substrate mimic // J. Biol. Chem. 2014. Vol. 289, № 12. P. 8562-8569.

44. Tsai W.C. et al. Kinetic and structural investigations of novel inhibitors of human epithelial 15-lipoxygenase-2 // Bioorganic Med. Chem. Bioorg Med Chem, 2021. Vol. 46.

45. Mobbs J.I. et al. Cryo-EM structures of human arachidonate 12S-lipoxygenase bound to endogenous and exogenous inhibitors // Blood. Cold Spring Harbor Laboratory, 2023. Vol. 142, № 14. P.1233-1242.

46. Brash A.R., Boeglin W.E., Chang M.S. Discovery of a second 15S-lipoxygenase in humans // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. National Academy of Sciences, 1997. Vol. 94, № 12. P. 61486152.

47. Funk C.D. et al. Lipoxygenase genes and their targeted disruption // Prostaglandins Other Lipid Mediat. Prostaglandins Other Lipid Mediat, 2002. Vol. 68-69. P. 303-312.

48. Sigal E. et al. Molecular cloning and primary structure of human 15-lipoxygenase // Biochem. Biophys. Res. Commun. Academic Press, 1988. Vol. 157, № 2. P. 457-464.

49. Kühn H., Sprecher H., Brash A.R. On singular or dual positional specificity of lipoxygenases: The number of chiral products varies with alignment of methylene groups at the active site of the enzyme // J. Biol. Chem. Elsevier, 1990. Vol. 265, № 27. P. 16300-16305.

50. Ivanov I. et al. Tight association of N-terminal and catalytic subunits of rabbit 12/15-lipoxygenase is important for protein stability and catalytic activity // Biochim. Biophys. Acta -Mol. Cell Biol. Lipids. Elsevier, 2011. Vol. 1811, № 12. P. 1001-1010.

51. Freire-Moar J. et al. Cloning and characterization of a murine macrophage lipoxygenase // Biochim. Biophys. Acta - Lipids Lipid Metab. Elsevier, 1995. Vol. 1254, № 1. P. 112-116.

52. Bryant R.W. et al. Positional specificity of a reticulocyte lipoxygenase. Conversion of arachidonic acid to 15-S-hydroperoxy-eicosatetraenoic acid. // J. Biol. Chem. 1982. Vol. 257, № 11. P. 6050-6055.

53. Kühn H. et al. Overexpression, purification and characterization of human recombinant 15-lipoxygenase // Biochim. Biophys. Acta (BBA)/Lipids Lipid Metab. 1993. Vol. 1169, № 1. P. 80-89.

54. Adel S. et al. Leukotriene signaling in the extinct human subspecies Homo denisovan and Homo neanderthalensis. Structural and functional comparison with Homo sapiens // Arch. Biochem. Biophys. 2015. Vol. 565. P. 17-24.

55. De Marzo N. et al. Cloning and expression of an airway epithelial 12-lipoxygenase // Am. J. Physiol. - Lung Cell. Mol. Physiol. 1992. Vol. 262, № 2 6-2. P. 1-1.

56. Yokoyama C. et al. Arachidonate 12-lipoxygenase purified from porcine leukocytes by immunoaffinity chromatography and its reactivity with hydroperoxyeicosatetraenoic acids. // J. Biol. Chem. Elsevier, 1986. Vol. 261, № 35. P. 16714-16721.

57. WATANABE T. et al. Molecular cloning of a 12-lipoxygenase cDNA from rat brain // Eur. J. Biochem. John Wiley & Sons, Ltd, 1993. Vol. 212, № 2. P. 605-612.

58. Catalano A., Procopio A. New aspects on the role of lipoxygenases in cancer progression // Histol. Histopathol. Histol Histopathol, 2005. Vol. 20, № 3. P. 969-975.

59. Pidgeon G.P. et al. Overexpression of platelet-type 12-lipoxygenase promotes tumor cell survival by enhancing alpha(v)beta(3) and alpha(v)beta(5) integrin expression. // Circulation. American Heart Association, 2003. Vol. 110, № 17. P. 2701-2707.

60. Nie D. et al. Platelet-type 12-lipoxygenase in a human prostate carcinoma stimulates angiogenesis and tumor growth // Cancer Res. 1998. Vol. 58, № 18. P. 4047-4051.

61. Yeung J., Li W., Holinstat M. Platelet signaling and disease: Targeted therapy for thrombosis and other related diseases // Pharmacol. Rev. Pharmacol Rev, 2018. Vol. 70, № 3. P. 526-548.

62. Nardi M. et al. Complement-independent Ab-induced peroxide lysis of platelets requires 12-lipoxygenase and a platelet NADPH oxidase pathway // J. Clin. Invest. J Clin Invest, 2004. Vol. 113, № 7. P. 973-980.

63. Guo Y. et al. Identification of the orphan G protein-coupled receptor GPR31 as a receptor for 12-(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid // J. Biol. Chem. J Biol Chem, 2011. Vol. 286, № 39. P. 33832-33840.

64. Thomas C.P. et al. Phospholipid-esterified eicosanoids are generated in agonist-activated human platelets and enhance tissue factor-dependent thrombin generation // J. Biol. Chem. J Biol Chem, 2010. Vol. 285, № 10. P. 6891-6903.

65. O'Donnell V.B., Murphy R.C., Watson S.P. Platelet lipidomics: Modern day perspective on lipid discovery and characterization in platelets // Circ. Res. Circ Res, 2014. Vol. 114, № 7. P. 1185-1203.

66. Yeung J. et al. Platelet 12-LOX is essential for FcyRIIa-mediated platelet activation // Blood. Blood, 2014. Vol. 124, № 14. P. 2271-2279.

67. Wuest S.J.A. et al. Expression and regulation of 12/15-lipoxygenases in human primary

macrophages // Atherosclerosis. Atherosclerosis, 2012. Vol. 225, № 1. P. 121-127.

68. Snodgrass R.G., Brüne B. Regulation and Functions of 15-Lipoxygenases in Human Macrophages // Front. Pharmacol. Frontiers Media SA, 2019. Vol. 10.

69. Benatzy Y. et al. ALOX15B controls macrophage cholesterol homeostasis via lipid peroxidation, ERK1/2 and SREBP2 // Redox Biol. Redox Biol, 2024. Vol. 72.

70. Wuest S.J.A. et al. Association of polymorphisms in the ALOX15B gene with coronary artery disease // Clin. Biochem. Clin Biochem, 2014. Vol. 47, № 6. P. 349-355.

71. Suraneni M. V. et al. Transgenic expression of 15-lipoxygenase 2 (15-LOX2) in mouse prostate leads to hyperplasia and cell senescence // Oncogene. Oncogene, 2010. Vol. 29, № 30. P. 42614275.

72. Wu Z.H. et al. The role of ferroptosis in breast cancer patients: a comprehensive analysis // Cell death Discov. Cell Death Discov, 2021. Vol. 7, № 1.

73. Yuan Y. et al. Development and Clinical Validation of a Novel 4-Gene Prognostic Signature Predicting Survival in Colorectal Cancer // Front. Oncol. Front Oncol, 2020. Vol. 10.

74. Shang W. et al. Probing dimerization and structural flexibility of Mammalian lipoxygenases by small-angle X-ray scattering // J. Mol. Biol. Academic Press, 2011. Vol. 409, № 4. P. 654-668.

75. Häfner A.K. et al. Dimerization of human 5-lipoxygenase // Biol. Chem. Biol Chem, 2011. Vol. 392, № 12. P. 1097-1111.

76. Ivanov I. et al. Ligand-induced formation of transient dimers of mammalian 12/15-lipoxygenase: A key to allosteric behavior of this class of enzymes? // Proteins Struct. Funct. Bioinforma. John Wiley & Sons, Ltd, 2012. Vol. 80, № 3. P. 703-712.

77. Aleem A.M. et al. Human platelet 12-lipoxygenase, new findings about its activity, membrane binding and low-resolution structure // J. Mol. Biol. J Mol Biol, 2008. Vol. 376, № 1. P. 193209.

78. Krissinel E., Henrick K. Inference of macromolecular assemblies from crystalline state // J. Mol. Biol. J Mol Biol, 2007. Vol. 372, № 3. P. 774-797.

79. PDBe < PISA < EMBL-EBI [Electronic resource]. URL: https://www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/cgi-bin/piserver (accessed: 13.02.2024).

80. Tsai W.C. et al. Mutagenesis, Hydrogen-Deuterium Exchange, and Molecular Docking Investigations Establish the Dimeric Interface of Human Platelet-Type 12-Lipoxygenase // Biochemistry. Biochemistry, 2021. Vol. 60, № 10. P. 802-812.

81. Droege K.D. et al. Structural Dynamics of 15-Lipoxygenase-2 via Hydrogen-Deuterium Exchange // Biochemistry. Biochemistry, 2017. Vol. 56, № 38. P. 5065-5074.

82. Ivanov I. et al. Molecular enzymology of lipoxygenases // Archives of Biochemistry and

Biophysics. 2010. Vol. 503, № 2. P. 161-174.

83. Hammel M. et al. Structural flexibility of the N-terminal ß-barrel domain of 15-Lipoxygenase-1 probed by small angle x-ray scattering. Functional consequences for activity regulation and membrane binding // J. Mol. Biol. Academic Press, 2004. Vol. 343, № 4. P. 917-929.

84. Hammel M. Validation of macromolecular flexibility in solution by small-angle X-ray scattering (SAXS) // Eur. Biophys. J. Eur Biophys J, 2012. Vol. 41, № 10. P. 789-799.

85. Kuban R.J. et al. The iron ligand sphere geometry of mammalian 15-lipoxygenases // Biochem. J. Biochem J, 1998. Vol. 332 ( Pt 1), № Pt 1. P. 237-242.

86. Klinman J.P., Offenbacher A.R., Hu S. Origins of Enzyme Catalysis: Experimental Findings for C-H Activation, New Models, and Their Relevance to Prevailing Theoretical Constructs // J. Am. Chem. Soc. J Am Chem Soc, 2017. Vol. 139, № 51. P. 18409-18427.

87. Lehnert N., Solomon E.I. Density-functional investigation on the mechanism of H-atom abstraction by lipoxygenase // J. Biol. Inorg. Chem. 2003. Vol. 8, № 3. P. 294-305.

88. Offenbacher A.R., Holman T.R. Fatty acid allosteric regulation of C-H activation in plant and animal lipoxygenases // Molecules. MDPI AG, 2020. Vol. 25, № 15.

89. Samuelsson B. et al. Leukotrienes and lipoxins: Structures, biosynthesis, and biological effects // Science (80-. ). 1987. Vol. 237, № 4819. P. 1171-1176.

90. Toledo L. et al. Insights into the mechanism of binding of arachidonic acid to mammalian 15-lipoxygenases // J. Phys. Chem. B. 2010. Vol. 114, № 20. P. 7037-7046.

91. Di Venere A. et al. Role of Arg403 for thermostability and catalytic activity of rabbit 12/15-lipoxygenase // Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Biol. Lipids. Elsevier, 2013. Vol. 1831, № 6. P. 1079-1088.

92. Kozlov N. et al. Functional characterization of novel ALOX15 orthologs representing key steps in mammalian evolution supports the Evolutionary Hypothesis of reaction specificity // Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Biol. Lipids. Elsevier, 2019. Vol. 1864, № 3. P. 372-385.

93. Sloane D.L. et al. A primary determinant for lipoxygenase positional specificity // Nature. 1991. Vol. 354, № 6349. P. 149-152.

94. Sloane D.L. et al. Conversion of human 15-lipoxygenase to an efficient 12-lipoxygenase: The side-chain geometry of amino acids 417 and 418 determine positional specificity // Protein Eng. Des. Sel. 1995. Vol. 8, № 3. P. 275-282.

95. Borngräber S. et al. Phenylalanine 353 is a primary determinant for the positional specificity of mammalian 15-lipoxygenases // J. Mol. Biol. 1996. Vol. 264, № 5. P. 1145-1153.

96. Borngräber S. et al. Shape and specificity in mammalian 15-lipoxygenase active site. The functional interplay of sequence determinants for the reaction specificity // J. Biol. Chem. 1999.

Vol. 274, № 52. P. 37345-37350.

97. Suzuki H. et al. Site-directed mutagenesis studies on the iron-binding domain and the determinant for the substrate oxygenation site of porcine leukocyte arachidonate 12-lipoxygenase // Biochim. Biophys. Acta. Biochim Biophys Acta, 1994. Vol. 1210, № 3. P. 308316.

98. Vogel R. et al. Applicability of the triad concept for the positional specificity of mammalian lipoxygenases // J. Biol. Chem. Elsevier, 2010. Vol. 285, № 8. P. 5369-5376.

99. Pekarova M. et al. Mutagenesis of triad determinants of rat Alox15 alters the specificity of fatty acid and phospholipid oxygenation // Arch. Biochem. Biophys. 2015. Vol. 571. P. 50-57.

100. Neau D.B. et al. Crystal structure of a lipoxygenase in complex with substrate: the arachidonic acid-binding site of 8R-lipoxygenase // J. Biol. Chem. J Biol Chem, 2014. Vol. 289, № 46. P. 31905-31913.

101. Coffa G., Brash A.R. A single active site residue directs oxygenation stereospecificity in lipoxygenases: stereocontrol is linked to the position of oxygenation // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. Vol. 101, № 44. P. 15579-15584.

102. Suardiaz R. et al. Regio- and stereospecificity in the oxygenation of arachidonic acid catalyzed by leu597 mutants of rabbit 15-Lipoxygenase: A QM/MM Study // ChemPhysChem. 2014. Vol. 15, № 11. P. 2303-2310.

103. Aleem A.M. et al. Probing the Electrostatic and Steric Requirements for Substrate Binding in Human Platelet-Type 12-Lipoxygenase // Biochemistry. Biochemistry, 2019. Vol. 58, № 6. P. 848-857.

104. Rai G. et al. Discovery of ML351, a Potent and Selective Inhibitor of Human 15-Lipoxygenase-1 // Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. National Center for Biotechnology Information (US), 2010.

105. Jameson J.B. et al. A high throughput screen identifies potent and selective inhibitors to human epithelial 15-lipoxygenase-2 // PLoS One. PLoS One, 2014. Vol. 9, № 8.

106. Kenyon V. et al. Discovery of potent and selective inhibitors of human platelet-type 12-lipoxygenase // J. Med. Chem. J Med Chem, 2011. Vol. 54, № 15. P. 5485-5497.

107. Luci D.K. et al. Synthesis and structure-activity relationship studies of 4-((2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino)benzenesulfonamide derivatives as potent and selective inhibitors of 12-lipoxygenase // J. Med. Chem. J Med Chem, 2014. Vol. 57, № 2. P. 495-506.

108. Wecksler A.T. et al. Substrate specificity changes for human reticulocyte and epithelial 15-lipoxygenases reveal allosteric product regulation // Biochemistry. American Chemical Society , 2008. Vol. 47, № 28. P. 7364-7375.

109. Wecksler A.T. et al. Mechanistic investigations of human reticulocyte 15- and platelet 12-lipoxygenases with arachidonic acid // Biochemistry. American Chemical Society, 2009. Vol. 48, № 26. P. 6259-6267.

110. Freedman C. et al. Biosynthesis of the Maresin Intermediate, 13S,14S-Epoxy-DHA, by Human 15-Lipoxygenase and 12-Lipoxygenase and Its Regulation through Negative Allosteric Modulators // Biochemistry. Biochemistry, 2020. Vol. 59, № 19. P. 1832-1844.

111. Mikulska-Ruminska K. et al. Characterization of Differential Dynamics, Specificity, and Allostery of Lipoxygenase Family Members // J. Chem. Inf. Model. American Chemical Society, 2019. Vol. 59, № 5. P. 2496-2508.

112. Mogul R., Johansen E., Holman T.R. Oleyl sulfate reveals allosteric inhibition of soybean lipoxygenase-1 and human 15-lipoxygenase // Biochemistry. Biochemistry, 2000. Vol. 39, № 16. P. 4801-4807.

113. Wecksler A.T. et al. Kinetic and structural investigations of the allosteric site in human epithelial 15-lipoxygenase-2 // Biochemistry. Biochemistry, 2009. Vol. 48, № 36. P. 87218730.

114. Meng H. et al. Discovery of Novel 15-Lipoxygenase Activators To Shift the Human Arachidonic Acid Metabolic Network toward Inflammation Resolution // J. Med. Chem. J Med Chem, 2016. Vol. 59, № 9. P. 4202-4209.

115. Meng H. et al. Molecular mechanism of 15-lipoxygenase allosteric activation and inhibition // Phys. Chem. Chem. Phys. 2018. Vol. 20, № 21. P. 14785-14795.

116. Van Hoorebeke C. et al. Reevaluation of a Bicyclic Pyrazoline as a Selective 15-Lipoxygenase V-Type Activator Possessing Fatty Acid Specificity // ACS omega. ACS Omega, 2022. Vol. 7, № 47. P. 43169-43179.

117. Börner F. et al. Allosteric Activation of 15-Lipoxygenase-1 by Boswellic Acid Induces the Lipid Mediator Class Switch to Promote Resolution of Inflammation // Adv. Sci. (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Ger. Adv Sci (Weinh), 2023. Vol. 10, № 6.

118. Andersson E. et al. Interaction of human 15-lipoxygenase-1 with phosphatidylinositol bisphosphates results in increased enzyme activity // Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Biol. Lipids. Elsevier, 2006. Vol. 1761, № 12. P. 1498-1505.

119. Walther M., Wiesner R., Kuhn H. Investigations into calcium-dependent membrane association of 15-lipoxygenase-1: Mechanistic roles of surface-exposed hydrophobic amino acids and calcium // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279, № 5. P. 3717-3725.

120. Di Venere A. et al. Probing conformational changes in lipoxygenases upon membrane binding: Fine-tuning by the active site inhibitor ETYA // Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Biol.

Lipids. Elsevier, 2014. Vol. 1841, № 1. P. 1-10.

121. Cruz A. et al. A role of Gln596 in fine-tuning mammalian ALOX15 specificity, protein stability and allosteric properties // Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Biol. Lipids. Elsevier B.V, 2020. Vol. 1865, № 7. P. 158680.

122. Saura P. et al. Unraveling how enzymes can use bulky residues to drive site-selective c-h activation: The case of mammalian lipoxygenases catalyzing arachidonic acid oxidation // ACS Catal. American Chemical Society, 2014. Vol. 4, № 12. P. 4351-4363.

123. Adel S. et al. Evolutionary alteration of ALOX15 specificity optimizes the biosynthesis of antiinflammatory and proresolving lipoxins // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. Proc Natl Acad Sci U S A, 2016. Vol. 113, № 30. P. E4266-E4275.

124. Park J.H., Lee J.W., Park H. Computational prediction of solvation free energies of amino acids with genetic algorithm // Bull. Korean Chem. Soc. Korean Chemical Society, 2010. Vol. 31, № 5. P. 1247-1251.

125. Kühn H., Heydeck D., Sprecher H. On the mechanistic reasons for the dual positional specificity of the reticulocyte lipoxygenase // Biochim. Biophys. Acta (BBA)/Lipids Lipid Metab. Elsevier, 1991. Vol. 1081, № 2. P. 129-134.

126. Bryan R.W. et al. Leukotriene formation by a purified reticulocyte lipoxygenase enzyme. Conversion of arachidonic acid and 15-hydroperoxyeicosatetraenoic acid to 14,15-leukotriene A4 // J. Biol. Chem. Elsevier, 1985. Vol. 260, № 6. P. 3548-3555.

127. Ivanov I. et al. Dual role of oxygen during lipoxygenase reactions // FEBS J. John Wiley & Sons, Ltd, 2005. Vol. 272, № 10. P. 2523-2535.

128. Micsonai A. et al. Accurate secondary structure prediction and fold recognition for circular dichroism spectroscopy // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. Proc Natl Acad Sci U S A, 2015. Vol. 112, № 24. P. E3095-E3103.

129. Micsonai A. et al. BeStSel: A web server for accurate protein secondary structure prediction and fold recognition from the circular dichroism spectra // Nucleic Acids Res. Oxford Academic, 2018. Vol. 46, № W1. P. W315-W322.

130. Mei G. et al. Structural properties of plant and mammalian lipoxygenases. Temperature-dependent conformational alterations and membrane binding ability // Biochemistry. American Chemical Society, 2008. Vol. 47, № 35. P. 9234-9242.

131. Di Venere A. et al. Structure-to-function relationship of mini-lipoxygenase, a 60-kDa fragment of soybean lipoxygenase-1 with lower stability but higher enzymatic activity // J. Biol. Chem. Elsevier, 2003. Vol. 278, № 20. P. 18281-18288.

132. Ivanov I. et al. Conformational heterogeneity and cooperative effects of mammalian ALOX15 //

Int. J. Mol. Sci. Multidisciplinary Digital Publishing Institute, 2021. Vol. 22, № 6. P. 3285.

133. Golovanov A. et al. N-Substituted 5-(1 H-Indol-2-yl)-2-methoxyanilines Are Allosteric Inhibitors of the Linoleate Oxygenase Activity of Selected Mammalian ALOX15 Orthologs: Mechanism of Action // J. Med. Chem. American Chemical Society, 2022. Vol. 65, № 3. P. 1979-1995.

134. Vasquez-Martinez Y. et al. Structure-activity relationship studies of flavonoids as potent inhibitors of human platelet 12-hLO, reticulocyte 15-hLO-1, and prostate epithelial 15-hLO-2 // Bioorg. Med. Chem. Pergamon, 2007. Vol. 15, № 23. P. 7408-7425.

135. Mascayano C. et al. Enzymatic Studies of Isoflavonoids as Selective and Potent Inhibitors of Human Leukocyte 5-Lipo-Oxygenase // Chem. Biol. Drug Des. John Wiley & Sons, Ltd, 2015. Vol. 86, № 1. P. 114-121.

136. Iranshahi M. et al. Synthesis and SAR studies of mono O-prenylated coumarins as potent 15-lipoxygenase inhibitors // Eur. J. Med. Chem. Elsevier Masson, 2012. Vol. 57. P. 134-142.

137. Jabbari A. et al. O-prenylated 3-carboxycoumarins as a novel class of 15-LOX-1 inhibitors // PLoS One. Public Library of Science, 2017. Vol. 12, № 2. P. e0171789.

138. Sonogashira K. Development of Pd-Cu catalyzed cross-coupling of terminal acetylenes with sp2-carbon halides // J. Organomet. Chem. Elsevier, 2002. Vol. 653, № 1-2. P. 46-49.

139. Novel Compounds // Chem. Eng. News Arch. 2006. Vol. 84, № 13. P. 31.

140. Hundertmark T. et al. Pd(PhCN)2Cl2/P(t-Bu)3: A versatile catalyst for Sonogashira reactions of aryl bromides at room temperature // Org. Lett. American Chemical Society, 2000. Vol. 2, № 12. P.1729-1731.

141. Chinchilla R., Najera C. The Sonogashira reaction: A booming methodology in synthetic organic chemistry // Chem. Rev. American Chemical Society, 2007. Vol. 107, № 3. P. 874-922.

142. Thorand S., Krause N. Improved procedures for the palladium-catalyzed coupling of terminal alkynes with aryl bromides (Sonogashira coupling) // J. Org. Chem. American Chemical Society , 1998. Vol. 63, № 23. P. 8551-8553.

143. Ohzu Y. et al. Syntheses and structures of bowl-shaped triarylphosphines and their palladium(II) complexes // J. Organomet. Chem. Elsevier, 2005. Vol. 690, № 18. P. 4175-4183.

144. Gaikwad R. et al. 2-Phenylindole derivatives as anticancer agents: synthesis and screening against murine melanoma, human lung and breast cancer cell lines // Synth. Commun. Taylor & Francis, 2019. Vol. 49, № 17. P. 2258-2269.

145. Aksenov A. V. et al. Benzimidazoles and benzoxazoles via the nucleophilic addition of anilines to nitroalkanes // Org. Biomol. Chem. The Royal Society of Chemistry, 2015. Vol. 13, № 14. P. 4289-4295.

146. de Fillain C., Nanthavong S., Le J. 2-Phenyl-indole derivatives and process for preparing the same. 1975.

147. Nguyen T.B., Ermolenko L., Al-Mourabit A. Selective autoxidation of benzylamines: Application to the synthesis of some nitrogen heterocycles // Green Chem. The Royal Society of Chemistry, 2013. Vol. 15, № 10. P. 2713-2717.

148. Bahrami K., Khodaei M.M., Kavianinia I. A simple and efficient one-pot synthesis of 2-substituted benzimidazoles // Synthesis (Stuttg). © Georg Thieme Verlag Stuttgart • New York, 2007. Vol. 2007, № 4. P. 547-550.

149. Xiao T. et al. Copper-catalyzed synthesis of benzazoles via aerobic oxidative condensation of o-amino/mercaptan/hydroxyanilines with benzylamines // RSC Adv. The Royal Society of Chemistry, 2013. Vol. 3, № 36. P. 15592-15595.

150. Chen G.-F. et al. Synthesis of 2-Substituted Benzimidazoles Catalyzed by FeCl3/Al2O3 Under Ultrasonic Irradiation // Lett. Org. Chem. Bentham Science Publishers Ltd., 2011. Vol. 8, № 7. P. 464-469.

151. ) METHODS OF TREATING AND Publication Classification PREVENTING BONE LOSS.

152. Luci D. et al. Discovery of ML355, a Potent and Selective Inhibitor of Human 12-Lipoxygenase // Probe Reports from NIH Mol. Libr. Progr. 2010.

153. Burrall B.A. et al. Enzymatic properties of the 15-lipoxygenase of human cultured keratinocytes // J. Invest. Dermatol. J Invest Dermatol, 1988. Vol. 91, № 4. P. 294-297.

154. McGovern S.L. et al. A common mechanism underlying promiscuous inhibitors from virtual and high-throughput screening // J. Med. Chem. American Chemical Society , 2002. Vol. 45, № 8. P. 1712-1722.

155. Claesson H.E. et al. Hodgkin Reed-Sternberg cells express 15-lipoxygenase-1 and are putative producers of eoxins in vivo: Novel insight into the inflammatory features of classical Hodgkin lymphoma // FEBS J. John Wiley & Sons, Ltd, 2008. Vol. 275, № 16. P. 4222-4234.

156. Dainese E. et al. Structural stability of soybean lipoxygenase-1 in solution as probed by small angle x-ray scattering // J. Mol. Biol. Academic Press, 2005. Vol. 349, № 1. P. 143-152.

157. Jones G. et al. Development and validation of a genetic algorithm for flexible docking // J. Mol. Biol. Academic Press, 1997. Vol. 267, № 3. P. 727-748.

158. Anandakrishnan R., Aguilar B., Onufriev A. V. H++ 3.0: automating pK prediction and the preparation of biomolecular structures for atomistic molecular modeling and simulations // Nucleic Acids Res. Oxford Academic, 2012. Vol. 40, № W1. P. W537-W541.

159. Gordon J.C. et al. H++: a server for estimating p Ka s and adding missing hydrogens to macromolecules // Nucleic Acids Res. Oxford Academic, 2005. Vol. 33, № suppl_2. P. W368-

W371.

160. Pettersen E.F. et al. UCSF Chimera—A visualization system for exploratory research and analysis // J. Comput. Chem. John Wiley & Sons, Ltd, 2004. Vol. 25, № 13. P. 1605-1612.

161. Case Ross C Walker D.A., Darden Junmei Wang Robert Duke T.E. Amber 2018 Reference Manual Principal contributors to the current codes.

162. Maier J.A. et al. ff14SB: Improving the Accuracy of Protein Side Chain and Backbone Parameters from ff99SB // J. Chem. Theory Comput. American Chemical Society, 2015. Vol. 11, № 8. P. 3696-3713.

163. Bayly C.I. et al. A well-behaved electrostatic potential based method using charge restraints for deriving atomic charges: The RESP model // J. Phys. Chem. American Chemical Society, 1993. Vol. 97, № 40. P. 10269-10280.

164. Li P., Merz K.M. MCPB.py: A Python Based Metal Center Parameter Builder // J. Chem. Inf. Model. American Chemical Society, 2016. Vol. 56, № 4. P. 599-604.

165. Seminario J. Calculation of intramolecular force fields from second-derivative tensors // Int. J. Quantum Chem. 1996.

166. Tosco P. A mechanistic hypothesis for the aspirin-induced switch in lipid mediator production by cyclooxygenase-2 // J. Am. Chem. Soc. American Chemical Society, 2013. Vol. 135, № 28. P. 10404-10410.

167. Ivanov I. et al. Mutations of Triad Determinants Changes the Substrate Alignment at the Catalytic Center of Human ALOX5 // ACS Chem. Biol. American Chemical Society, 2019. Vol. 14, № 12. P. 2768-2782.

168. Wang J. et al. Development and testing of a general amber force field // J. Comput. Chem. John Wiley & Sons, Ltd, 2004. Vol. 25, № 9. P. 1157-1174.

169. Guvench O., MacKerell A.D. Automated conformational energy fitting for force-field development // J. Mol. Model. Springer, 2008. Vol. 14, № 8. P. 667-679.

170. Jorgensen W.L. et al. Comparison of simple potential functions for simulating liquid water // J. Chem. Phys. AIP Publishing, 1983. Vol. 79, № 2. P. 926-935.

171. Le Grand S., Götz A.W., Walker R.C. SPFP: Speed without compromise—A mixed precision model for GPU accelerated molecular dynamics simulations // Comput. Phys. Commun. North-Holland, 2013. Vol. 184, № 2. P. 374-380.

172. Salomon-Ferrer R. et al. Routine microsecond molecular dynamics simulations with AMBER on GPUs. 2. Explicit solvent particle mesh ewald // J. Chem. Theory Comput. American Chemical Society, 2013. Vol. 9, № 9. P. 3878-3888.

173. Leach A.R. Molecular modelling : principles and applications. Longman, 1996. P. 595.

174. Berendsen H.J.C. et al. Molecular dynamics with coupling to an external bath // J. Chem. Phys. AIP Publishing, 1984. Vol. 81, № 8. P. 3684-3690.

175. Ryckaert J.P., Ciccotti G., Berendsen H.J.C. Numerical integration of the cartesian equations of motion of a system with constraints: molecular dynamics of n-alkanes // J. Comput. Phys. Academic Press, 1977. Vol. 23, № 3. P. 327-341.

176. Humphrey W., Dalke A., Schulten K. VMD: Visual molecular dynamics // J. Mol. Graph. Elsevier, 1996. Vol. 14, № 1. P. 33-38.

177. Xu Y. et al. CavityPlus: a web server for protein cavity detection with pharmacophore modelling, allosteric site identification and covalent ligand binding ability prediction // Nucleic Acids Res. Oxford Academic, 2018. Vol. 46, № W1. P. W374-W379.

7. Приложения

19в - ЬЛ

км (О) = 35,7 ± 2,2 с-1 Км (0) = 25,6 ± 3,5 мкМ

ксЛ (0,1) = 26,1 ± 1,7 с-1 Км (0,1) = 26,1 ± 3,7 мкМ

ка (1) = 9,7 ± 0,7 с-1 Км (1) = 26,2 ± 3,9 мкМ

>

20 -

10-

Без ингибитора ОД мкМ 19в 1 мкМ 19в

10

20 30

ЬА (мкМ)

40

50

21б - ЬЛ

кса(0) = 32,1 ± 3,5 с-1 Км (0) = 23,9 ± 4,5 мкМ

кс<к(0,02) = 18,2 ± 2,8 с-1 Км (0,02) = 24,7 ± 6,5 мкМ

М0,1) = 8,3 ± 1,6 с-1 Км (0,1) = 24,3 ± 7,9 мкМ

>

15-

10-

5 -

10

ЬА (мкМ)

0

0

0

Приложение 1 и 2. Ингибирование окисления ЬА АЬОХ15 кролика в присутствии 19в и

21б.

19в - AA

кш (0) = 21,9 ± 1,9 с-1 Км (0) = 13,2 ± 2,2 мкМ

ксЛ (5) = 12,3 ± 0,6 с-1 Км (5) = 7,7 ± 1,0 мкМ

ксЛ (25) = 5,1 ± 0,2 с-1 Км (25) = 3,8 ± 0,6 мкМ

>

1 5 п

10-

5-

Без ингибитора 5 мкМ 19в 25 мкМ 19в

10 15

АА (мкМ)

21Ь - AA

ксЛ (0) = 22,1 ± 1,4 с-1 Км (0) = 14,5 ± 1,2 мкМ

кш (1) = 10,2 ± 0,3 с-1 Км (1) = 6,9 ± 0,7 мкМ

кш (5) = 4,0 ± 0,2 с-1 Км (5) = 3,0 ± 0,6 мкМ

>

15

10

Без ингибитора 1 мкМ 21б 5 мкМ 216

10 20

АА (мкМ)

0

0

5

0

0

Приложение 3 и 4. Ингибирование окисления АА АЬОХ15 кролика в присутствии 19в и

21б.

21a - LA

кш (0) = 33,2 ± 2,1 с1 Km (0) = 22,5 ± 3,3 мкМ

ксЛ (2) =24,3 ± 1,4 с-1 Km (2) = 54,7 ±5,1 мкМ

ксЛ (5) = 20,6 ± 2,8 с-1 Km (5) = 76,7 ± 7,2 мкМ

21a - AA

>

ка (0) = 22,1 ± 1,4 с-1 Km (0) = 14,6± 1,9 мкМ

ксл (5) = 21,3 ± 3,7 с-1 Km (5) = 30,4 ± 8,4 мкМ

ксл (10) =13,4 ± 2,4 с-1 Km (10) = 41,7 ± 7,8 мкМ

>

20 -

1 0 -

Без ингибитора 2 мкМ 21a

5 мкМ 21a

10

20 30

LA (мкМ)

40

50

15-

10-

5-

Без ингибитора 5 мкМ 21a 10 мкМ 21a

10

AA (мкМ)

0

0

0

Приложение 5. Ингибирование окисления LA и AA ALOX15 кролика в присутствии 21а.

Д О

г*-

о

•тз

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Время (нс)

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Время (нс)

Приложение 6. Расстояния С11-ОН в комплексах АЬОХ15-21а(А)-ЬА(Б) (А) и АЬОХ15-21б(А)-ЬЛ(Б) (Б) по результатам МО-моделирования за 200 нс и 100 нс, соответственно. Каждые 10 пикосекунд снимался кадр.

)Н О

-3

С1

100

100

Время (нс) Время (нс)

Приложение 7. Расстояния С13-ОН в комплексах ЛЬОХ 15-21а(А)-ЛЛ(Б) (А) и ЛШХ15-21б(А)-ЛЛ(Б) (Б) по результатам МО-моделирования за 100 нс. Каждые 10 пикосекунд снимался кадр.

Приложение 8. Основные взаимодействия показательной структуры наиболее населенного кластера для соединения 21б

Был проведен кластерный анализ для определения наиболее характерных особенностей способа связывания соединения 21б с аллостерическими эффектами. Кластерный анализ был проведен на основе его МБ-моделирования с использованием ЯМБО 0,5 А для атомов основной цепи ингибиторов. Были получены четыре различных кластера, один из которых был значительно более населен (60,0 %).

Группа Тип взаимодействия Аминокислотные остатки Расстояние

А, КН Водородная связь Бе3+-ОН" ё(Ш-ОН) = 2.116 А

Б, СНзО Водородные связи 01и596 (боковая цепь КН2) Аг§403 (боковая цепь КН2) ё(О1-НБ22-ап596) = 3.534 А ё(О1-НН11-А^403) = 4.465 А

Б, СНзО Электростатические Аг§599 *

В, БО2 Водородная связь 01и596 (боковая цепь КН2) ё(О2-НБ21-ап596) = 2.059 А

Г, СО Водородная связь Ьеи408 (основная цепь КН) ё(О4-Н-Ьеи408) = 2.345 А

*В большей или меньшей степени вся боковая цепь А^599 электростатически взаимодействует с метокси группой соединения 21б, так что для характеристики этого взаимодействия можно использовать несколько расстояний.

Приложение 9. Основные взаимодействия показательной структуры наиболее населенного кластера для соединения 3

Был проведен кластерный анализ для определения наиболее характерных особенностей способа связывания соединения 3 с аллостерическими эффектами. Кластерный анализ был проведен на основе его МО-моделирования с использованием ЯМБО 0,5 А для атомов основной цепи ингибиторов. Были получены три различных кластера, один из которых был значительно более населен (84,4 %).

Группа

Тип

взаимодействия

Аминокислотные остатки

Расстояние

A

п-п

№8361 (боковая цепь) н1б366 (боковая цепь)

Б, КН

Водородная связь

Бе3+-ОН-

ё(Н1-ОИ) = 1.982 А

В, СНзО

Водородные связи

Лг§403 (боковая цепь КНз)

01и596 (боковая цепь КНз)

01и601 (боковая цепь КН и основная цепь КН)

ё(О1-НН12-Л^403) = 3.793 А ё(О1-НН22-Л^403) = 4.301 А ё(О1-НБ21-ап596) = 5.451 А ё(О1-НБ22-ап596) = 5.229 А ё(О1-НБ22-ап601) = 4.341 А ё(О1-Н-^п601) = 5.237 А

Г, КН

Водородная связь

Лг§403

d(N4-HH11-Лrg403) = 3.254 А

Д, БО2

Водородная связь

Ьеи408 (основная цепь КН) 01и596 (боковая цепь КНз)

d(O3-H-Leu408) = 3.421 А d(O2-HE21 -Gln596) = 3.731 А

При более детальном рассмотрении приложений 8 и 9 можно заметить, что оба соединения образуют Н-связь между КН-группой индольного/имидазольного фрагмента и ОН-группой координационной сферы Fe3+. Также наблюдалось образование Н-связей СНзО-группой с

боковыми цепями КНз-группы Ип596 и Лг§403 для обоих соединений, при этом соединение 3 образовывало еще две Н-связи с боковой КНз-группой и основной КН-группой 01и601, а вот соединение 21б вступало в электростатические взаимодействия с Лг§599, о чем также говорилось ранее. Соединение 3 создавало Н-связь между своей КН-сульфаниламидной группой с Лг§403. Помимо этого, сульфаниламидная группа взаимодействовала атомом кислорода с боковыми цепями КН^-группы Ип596 у обоих соединений, но соединение 3 вторым атомом кислорода той же группы образовывала Н-связь с основной КН-группой Ьеи408. При этом Ьеи408 образовывал Н-связь с карбонильной группой соединения 21б. А п-п электронные взаимодействия можно было наблюдать между пиридильным остатком соединения 3 и боковыми цепями Кб361 и Кб366. Таким образом молекулярные взаимодействия между обоими соединениями (21б и 3) и ферментом ЛЬОХ15 действительно отличаются друг от друга, хотя наблюдается много одинаковых взаимодействий.