Кинетические особенности реакций, катализируемых холинэстеразами, под действием лигандов различной природы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Мухаметгалиева Алия Рафиковна

• Мухаметгалиева Алия Рафиковна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Мухаметгалиева Алия Рафиковна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Научная новизна полученных результатов

Методология и методы исследования

Достоверность результатов

Теоретическая и практическая значимость работы

Основные положения, выносимые на защиту

Апробация работы и публикации

Место выполнения работы и личный вклад автора

Связь работы с научными программами

Публикация результатов исследования

Структура и объем диссертации

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Семейство холинэстераз

1.1.1 Структура и функции ацетилхолинэстеразы

1.1.2 Структура и функции бутирилхолинэстеразы

1.2 Сравнительная характеристика строения активных центров холинэстераз человека

1.3 Механизм гидролиза ацетилхолина ацетилхолинэстеразой человека

1.4 Субстраты холинэстераз

1.5 Типы ингибиторов холинэстераз

1.5.1 Типы ингибирования

1.6 Анализ реакций кинетики холинэстераз

1.6.1 Константа специфичности

1.6.2 Гистерезисное поведение холинэстераз in vitro

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Оборудование исследования

2.2. Объекты исследований in vitro

2.3 Реактивы и растворы

2.4 Методы определение холинэстеразной активности in vitro

2.4.1 Метод Эллмана

2.4.2 Титрование активных центров холинэстераз человека эхотиофатом

2.4.3 Ультрачувствительный метод анализа кинетики реакций холинэстераз с флуорогенным зондом

2.5 Стационарная кинетика реакций, катализируемая ацетил- и

бутирилхолинэстеразами

2.5.1 Расчёт каталитических констант заряженных и незаряженных субстратов холинэстераз

2.6 Двухсубстратная кинетика холинэстераз

2.6.1 Конкурирующие субстраты полного гидролиза как способ определения значений каталитических констант

2.6.2 Стационарная кинетика конкурирующих субстратов для определения типа ингибирования ферментов

2.7 Статистический анализ кинетики

2.8 Анализ молекулярных структур холинэстераз in silico

2.8.1 Уточнение структуры ацетил- и бутирилхолинэстеразы

2.8.2 Молекулярный докинг

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Определение концентрации активных центров ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы при титровании эхотиофатом

3.2 Экспериментальное подтверждение метода конкурирующих субстратов для вычисления каталитических констант 2 эндогенных и 10 синтетических лигандов холинэстераз

3.2.1 Сигмоидальный характер кривых прогресса двух конкурирующих

субстратов в одной ферментативной реакции

3.2.2 Гиперболический характер кривых прогресса двух конкурирующих субстратов в одной ферментативной реакции

3.2.2.1 Кривые прогресса гиперболической формы субстратов в двухсубстратных системах при условии R ~

3.2.2.2 Кривые прогресса гиперболической формы субстратов в двухсубстратных системах при условии R «

3.2.2.3 Гидролиз субстрата 3-(ацетамидо)-Ы, N, N-триметиланилида в присутствии конкурентного ингибитора

3.3 Флуорометрический метод измерения активности холинэстераз как способ оптимизации условий реакции c целью таргетной селекции субстратов/ингибиторов

3.4 Изучение аллостерических взаимодействий субстратов холинэстераз методом анализа двухсубстратной кинетики

3.5 Эксперименты in silico

3.5.1 Предсказание структур ацетил- и бутирилхолинэстеразы человека по гомологии

3.5.2 Молекулярный докинг

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение

Приложение

2.1 Стационарная кинетика для определения каталитических констант ацетилтиохолина и бутирилтиохолина

2.2 Стационарная кинетика для определения каталитических констант

фенилацетата

Приложение

3.1 Определение константы Михаэлиса (Кв или КД линейной аппроксимацией из соотношения Уо / V;

3.2 Расчёт константы Михаэлиса о-нитротрифторацетанилида для

бутирилхолинэстеразы человека при конкуренции с фенилацетатом

Приложение

4.1 Линии прогресса сигмоидальной формы при R»1

4.2 Линии прогресса гиперболической формы при R~1

4.3 Линии прогресса гиперболической формы при R«1

4.4 Линии прогресса гиперболической формы при конкуренции субстрата 3-(ацетамидо)-К К, К-триметиланилида с обратимыми ингибиторами

Приложение

Приложение

Приложение

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТМА 3-(ацетамидо)-К К, К-триметиланилид

АТХ Ацетилтиохолин

АХ Ацетилхолин

АХЭ Ацетилхолинэстераза

БА Болезнь Альцгеймера

БзТХ Бензоилтиохолин

БзХ Бензоилхолин

БОВ Боевые отравляющие вещества

БСА Бычий сыворотчный альбумин

БТХ Бутирилтиохолин

БХ Бутирилхолин

БХЭ Бутирилхолинэстераза

ДМСО Диметилсульфоксид

ДТНБ 5,5' -дитиобис-2-нитробензойная кислота

КАС Каталитический активный сайт

МЕ Международные единицы

НМИА К-метилиндоксиацетат

о-НФА о-нитротрифторацетанилид

ПАС Периферический анионный сайт

ТМА Тетраметиламмоний

ТНБ 5-тио-2-нитробензойная кислота

ФА Фенилацетат

ФОС Фосфорорганические соединения

ХЭ Холинэстеразы

ЦНС Центральная нервная система

А-форма Ассиметричные формы холинэстераз

(А4, А8, А12)

ColQ Коллагеноподобная хвостовая субъединица

асимметричной холинэстеразы

G-форма Глобулярные формы холинэстераз

(G1, G2, G4)

ИАХЭ Ацетилхолинэстераза человека

hБХЭ Бутирилхолинэстераза человека

PRiMA Полипролиновый белок

RMSD Среднеквадратичное отклонение атомов

аминокислотных остатков RMSF Среднеквадратичная флуктуация атомов

аминокислотных остатков

Условные обозначения

[E0] Концентрация активных центров фермента

[I] Концентрация ингибитора

[S] Концентрация субстрата

E Фермент

EI Комплекс фермент-ингибитор

ES Ферментно-субстратный комплекс

I Ингибитор

S Субстрат

£ Коэффициент экстинкции

Субстрат B Нехромогенный субстрат (субстрат, не детектируемый в ходе анализа, «невидимый» субстрат)

Субстрат А Репортерный субстрат (субстрат, по которому детектируется реакция, «видимый» субстрат)

Каталитические константы

kcat Константа специфичности субстрата Км

R Отношение констант специфичности субстратов

b Константа эффективности гидролиза субстрата

bi Константа эффективности ингибитора

kcat Число оборотов фермента

Ki Константа ингибирования

Kip Константа диссоциации четвертичного комплекса

IpESI

KM Константа Михаэлиса

KMapp Кажущая константа Михаэлиса

Kss Константа диссоциации тройного комплекса SES

Vmax Максимальная скорость

Vmax' Кажущая максимальная скорость

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Кинетические особенности реакций, катализируемых холинэстеразами, под действием лигандов различной природы»

Актуальность темы исследования

Холинэстеразы (ХЭ) катализируют распад ацетилхолина (АХ), который является нейромедиатором, осуществляющим передачу импульса в синапсах центральной нервной системы и нервно-мышечных соединений. В семейство ХЭ входят два близкородственных фермента: ацетилхолинэстераза (АХЭ) и бутирилхолинэстераза (БХЭ), которые локализованы в разных компартментах организма и отличаются строением активных центров, что предопределяет разные механизмы регуляции холинэстеразных реакций. Физиологической функцией АХЭ является гидролиз АХ, в то время как БХЭ выполняет физиологическую роль только в условиях необратимого ингибирования АХЭ, гидролизуя избыток АХ для защиты холинергической системы.

Многие патологии, включая болезнь Альцгеймера и миастенический синдром, характеризуются уменьшением количества АХ в синаптическом пространстве и поэтому ингибиторы ХЭ используют для паллиативного лечения нейродегенеративных заболеваний [Petrov et al., 2018; Zueva et al., 2019; Du et al., 2022; Zhang et al., 2022]. В связи с этим большой интерес вызывают исследования, направленные на выявление механизмов ингибирования ферментативной активности АХЭ и БХЭ [Masson, Lushchekina, 2016; Rosenberry et al., 2017], при этом изучение ферментативной кинетики остается основным подходом, используемым при анализе активности ХЭ.

Изучение каталитического поведения ХЭ осложнено для тех субстратов/ингибиторов, для которых нет чувствительного биохимического метода их детекции, включая АХ, продукты гидролиза которого не определяются оптическими методами. Другие методы кинетического анализа, включая газометрический (метод Варбурга) или потенциометрический (рН-метрия) не всегда пригодны для детекции таких

продуктов гидролиза из-за низкой чувствительности. Для решения данной проблемы М. Голичником и П. Массоном недавно был разработан новый теоретический подход - «метод конкурирующих субстратов полного гидролиза», основанный на математическом анализе кинетических кривых хромогенного субстрата-репортера в присутствии нехромогенных субстратов/ингибиторов ^оНсшк, Masson, 2019], с помощью которого можно определять истинные кинетические параметры нехромогенных конкурентов.

Таким образом, дальнейшее применение вышеуказанного метода требует его верификации путем определения каталитических констант и кинетических параметров субстратов и ингибиторов ХЭ с помощью спектрофотометрии. Диссертационное исследование посвящено решению этой проблемы, а также созданию новой методологии для высокочувствительного измерения активности ХЭ, что открывает широкие перспективы для ее использования в современных биосенсорных и микрофлюидных технологиях для решения прикладных и фундаментальных задач медицины и биологии.

Целью работы является характеристика механизмов холинэстеразных реакций в условиях конкуренции субстратов и низкой ферментативной активности.

В соответствии с целью решались следующие задачи:

1) Подтвердить теорию «полного гидролиза конкурирующих субстратов», определив истинные кинетические характеристики гидролиза пар конкурирующих субстратов и пар субстрат-ингибитор в ацетил- и бутирилхолинэстеразных реакциях.

2) Разработать чувствительный метод для количественного измерения ферментативной активности холинэстераз в отношении ацетилтиохолина и бутирилтиохолина.

3) Определить параметры аллостерической регуляции холинэстераз парами конкурирующих субстратов в зависимости от их концентрации и заряда.

4) Методом молекулярного докинга провести анализ взаимодействия ацетилхолина и холина с каталитическими активными сайтами холинэстераз.

Научная новизна полученных результатов

Методом «конкурирующих субстратов полного гидролиза», разработанным по теории проф. М. Голичника и П. Массона (2019), получены истинные значения кинетических констант, описывающие вероятную каталитическую ситуацию in vivo для АХЭ и БХЭ человека. Впервые определена константа Михаэлиса для плохо растворимого в воде субстрата о-нитротрифторацетанилида (Км=6,75 мМ), параметры которого невозможно определить при стационарной кинетике.

С помощью разработанного нами метода с использованием флуорогенного зонда Calbiochem IV (метиловый эфир 3-(7-гидрокси-2-оксо-2Н-хромен-3-илкарбамоил) акриловой кислоты) получены каталитические параметры для ацетитиохолина и бутирилтиохолина, определённые при низких концентрациях АХЭ и БХЭ человека, соответственно.

Показаны различия в связывании ацетилтиохолина и ацетилхолина с активными сайтами АХЭ и БХЭ в качестве субстратов-конкурентов. Ацетилтиохолин или ацетилхолин в высоких концентрациях действует как бесконкурентный ингибитор АХЭ и бесконкурентный активатор БХЭ.

Методология и методы исследования

Экспериментальные исследования ферментативного анализа in vitro проводили с помощью одно- и двухсубстратной стационарной кинетики и двухсубстратной кинетики полного гидролиза методами спектрофлуоримет-рии. Кинетические константы субстратов и ингибиторов рассчитывали согласно формулам описанные в главе «Материалы и методы исследования».

Для исследований части т silico использовали методы молекулярной динамики и молекулярного докинга.

Достоверность результатов

Достоверность полученных результатов в диссертационной работе

подтверждается использованием современных методов исследования, большим объемом экспериментальных данных, воспроизводимостью

экспериментов и результатов, статистической обработкой полученных данных с помощью программы OriginPro 9.0 и с использованием языка программирования R в среде разработки Rstudio.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты представляют интерес для высокопроизводительного скрининга веществ - потенциальных ингибиторов холинэстераз. Новый метод с использованием высокочувствительного флуорогенного зонда для определения ферментативной активности холинэстераз может применяться для микроанализа образцов в клинических и судебных лабораториях, а также в научных целях для широкого скрининга библиотек ингибиторов холинэстераз, мутантных форм ферментов и гидролаз, субстратами которых являются тиоэфиры.

Метод конкурирующих субстратов полного гидролиза, разработанный по теории проф. М. Голичника и П. Массона (2019), позволяет определять как кинетические константы, так и аллостерические эффекты лигандов холинэстераз и может использоваться для поиска новых природных и синтетических соединений, представляющих фармакологический интерес.

Определение параметров по гидролизу конкурирующих субстратов пары субстрат-ингибитор и расчет истинных кинетических параметров применимы и для других ферментов, поэтому могут быть использованы в учебном курсе современной энзимологии для биохимиков, химиков и фармакологов.

Основные положения, выносимые на защиту

1) Двухкомпонентная система субстратов и/или ингибиторов хо-линэстераз как основа теории метода конкурирующих субстратов полного гидролиза позволяет определить истинные кинетические параметры субстратов. Тиоэфиры и оксоэфиры являются субстратами ХЭ, в том числе бесконкурентными ингибиторами и бесконкурентными активаторами ферментов в зависимости от концентрации.

2) Чувствительный метод на основе взаимодействия продукта гидролиза тиосубстрата с флуорогенным зондом Calbiochem IV является современным инструментарием для оценки ферментативной активности хо-линэстераз с концентрацией активных центров менее 10-11 М.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертационной работы представлены на 12 международных и российских конференциях, таких как III Международная школа-конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2018), Зимняя молодежная школа ПИЯФ по биофизике и молекулярной биологии (Санкт-Петербург, 2018), Научная конференция грантодержателей РНФ «Современные тенденции в химии, биологии, медицине. От молекулы к лекарству» (Казань, 2018), 12-ая Международная конференция «Биокатализ: Фундаментальные основы и применение (Санкт-Петербург, 2019), Школа-конференция для молодых ученых «Супрамолекулярные стратегии в химии, биологии и медицине: фундаментальные проблемы и перспективы» (Казань, 2019), 23-я, 24-я, 25-я Международная Пущинская школа-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2019, 2020, 2022), II Объединенный научный форум: VI Съезд биохимиков России (Сочи, 2019), Международная конференция Vth International conference «Actual scientific & technical issues of chemical safety» (ASTICS) (Казань, 2020), I Школа молодых ученых «Химия и технология биологически активных веществ для медицины и фармации»

(Москва, 2021), III Всероссийская научная конференция с международным участием «Современные проблемы биохимии, генетики и биотехнологии» (Уфа, 2021).

Место выполнения работы и личный вклад автора

Диссертационная работа выполнена на кафедре биохимии, биотехнологии и фармакологии и в научно-исследовательской лаборатории «Нейрофармакология» Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет». Автором диссертации совместно с научным руководителем разработаны главные направления научного исследования, сформулирована цель, поставлены задачи исследовательской работы. Экспериментальные исследования in vitro, статистическая обработка и анализ полученных данных были выполнены диссертантом лично. Экспериментальные исследования in silico проведены в нераздельном соавторстве с аспирантом КФУ Козловой Анастасией Сергеевной. Обсуждение и подготовка статей к публикации (написание и редактирование) проводилось совместно с научным руководителем и соавторами.

Связь работы с научными программами

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РНФ 17-1401097 (2017-2019) «Кинетические особенности реакций, катализируемых холинэстеразами: физиологическая, токсикологическая и

фармакологическая значимость гистерезиса» (исполнитель), РФФИ 19-3490120 «Аспиранты» (2019-2021) «Дизайн противосудорожных препаратов -новые подходы» (исполнитель), РНФ 20-14-00155 (2020-2022) «Холинэстеразы, как активные компоненты нанореакторов для детоксикации фосфорорганических соединений. Взаимодействия с новыми лекарственными препаратами» (исполнитель).

Публикация результатов исследования

По материалам диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 4 научные статьи в журналах, индексируемых в Web of Science и Scopus.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, обсуждения результатов, выводов, приложений и списка цитируемой литературы. Текст изложен на 178 страницах, проиллюстрирован 84 рисунками, включает 12 таблиц, список литературы содержит 153 библиографических источников.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Семейство холинэстераз

Семейство ХЭ представлено двумя ферментами: ацетил- и бутирилхолинэстеразой. Ацетилхолинэстераза (АХЭ) имеет систематическое название ацетилхолин-ацетилгидролаза (КФ 3.1.1.7). АХЭ в основном локализована в мембране межнейрональных синапсов, концевых двигательных пластин скелетных мышц, ганглий вегетативной нервной системы, но также встречается в потовых железах, в лимфатической системе, на эритроцитах и в эмбриональных тканях [Wessler, Kirkpatrick, 2008]. Бутирилхолинэстераза (БХЭ) или ацилхолин-ацилгидролаза (КФ 3.1.1.8) синтезируется в гепатоцитах печени, откуда секретируется в кровоток, поэтому БХЭ преимущественно локализована в крови [Lockridge, 2015]. БХЭ также встречается в глиальных клетках центральной нервной системы (ЦНС) и в шванновских клетках нервно-мышечных соединений и также представлена во всех тканях человека [Girard et al., 2007].

ХЭ - относят к сериновым гидролазам из-за наличия серина в каталитическом активном центре [Lockridge, 1990]. Каталитическая реакция протекают через стадию образования ацил-фермента через серин, с последующей регенерацией фермента при помощи воды. ХЭ имеют самое высокое число оборотов среди сериновых гидролаз, которые используют ту же самую каталитическую триаду [Silman, Sussman, 2008].

Филогенетический анализ показывает, что ген ХЭ появился у трехслойных животных (Triploblastica) вместе с холинэргической системой сотни миллионов лет назад, первым представителем являются плоские черви (Platyhelminthes). У организмов могут присутствовать два гена ХЭ (АХЭ и БХЭ), в некоторых случаях один ген был утерян (только АХЭ или только БХЭ), например, у настоящих мух (Cyclorrhapha) и у карповых рыб (Cyprinids) или гены представлены в дупликате (несколько генов для АХЭ и БХЭ), например, у нематод (Nematoda), у тетрадона (Tetraodon) и фугу

(Fugu), у шпорцевой лягушки (Xenopus) [Pezzementi, Chatonnet, 2010]. У низших групп обнаруживаются гены лишь одного из ферментов, например, у круглоротых и бесчерепных обнаружена лишь АХЭ, это свидетельствует о том, что скорее всего БХЭ возникла эволюционно позднее путем дупликации и мутации гена АХЭ [Pope, Brimijoin, 2018].

Исследование трёхмерных структур ХЭ началось с 1990-х годов, первые эксперименты проводились на АХЭ электрического ската -калифорнийский гнюс (Torpedo californica). Структура АХЭ эволюционно консервативна и содержит общие области с другими сериновыми гидролазами (БХЭ, карбоксиэстераза, липаза). Структура ХЭ представляет собой структуру а/в-гидролаз: она свернута в a-спираль, которая связана с углистом, содержащий каталитический домен (Рисунок 1).

аС

ctD

аЕ

Рисунок 1 - Схема структуры а/-гидролаз. 8 нитей, которые образуют а-спирали (обозначены цилиндрами) и Р-листы (обозначены стрелками). Сферами показаны участки аминокислотных остатков, являющиеся каталитическим центром [Lord et al., 2013]

Каталитический домен представлен тремя аминокислотными остатками, поэтому этот участок называют каталитической триадой:

нуклеофильная аминокислота (у млекопитающих — это остаток серина), элемент кислотно-основного катализа (остаток гистидина) и кислота (в ХЭ это глутамат) [Pohanka, 2011].

1.1.1 Структура и функции ацетилхолинэстеразы

Структура АХЭ у разных животных схожа. Активный центр АХЭ представлен в виде узкой полости, глубина которой 20 Á у Torpedo californica [Silman, Sussman, 2008], 17,9 Á у Homo sapiens [Xu et al., 2018]. Внутреннюю полость активного сайта АХЭ составляют остатки ароматических аминокислот. На дне полости находится Ser-His-Glu каталитический центр. Схематично активную полость АХЭ разделяют на 2 сайта: каталитический и периферийный (Рисунок 2).

J КАС Q ПАС

Рисунок 2 - Схема строения активной полости АХЭ Torpedo californica, где КАС - каталитический активный сайт, ПАС - периферический анионный сайт [Silman, Sussman, 2008]

Вокруг входа в канал активного центра располагается периферический

анионный сайт (ПАС), который имеет конформационную гибкость из-за

наличия омега (Ü) петли. ^-петля связывает ПАС с каталитическим

активным сайтом (КАС), что может влиять на аллостерическое поведение

18

[De Boer et al., 2021]. ПАС является мишенью для многих токсинов и лекарств. Например, в-амилоид, взаимодействуя с ПАС АХЭ, приводит к образованию амилоидных бляшек и к последующему повреждению нейронов [Pohanka, 2011]. При связывании некоторых модуляторов с ПАС фермент может изменять свою конформацию и как следствие активность.

Домены АХЭ между собой удерживаются дисульфидными связями и полипролиновым пептидом. На рисунке 3 изображен рекомбинантный димер человеческой АХЭ (МХЭ), субъединицы которого удерживаются вместе четырёхспиральным пучком, состоящим из двух спиралей каждой субъединицы. Такое строение АХЭ практически идентично у нескольких организмов: Torpedo californica, Homo sapiens, Drosophila melanogaster, Mus musculus [Dvir et al., 2011].

Рисунок 3 - Трёхмерная структура димера hAX3 в комплексе с донепезилом, который показан черным цветом, 2 субъединицы А и B окрашены разным цветом, зеленым цветом показаны N-гликолизированные участки. Стрелки изображают вход в ущелье активного центра [Cheung et al., 2012]

Молекулярные формы АХЭ подразделяются на ассиметричные (А) и глобулярные (G). А-форма обнаруживается в нервно-мышечных соединениях позвоночных и в тканях электрических органов рыб Electrophorus electricus, Torpedo californica и Torpedo marmorata. В формах A один, два или три тетрамера каталитических субъединиц - A4, A8 и A12, соответственно -прикреплены к коллагеновому хвосту, который закрепляет их на базальной пластинке в области синаптической щели. Формы G представляют собой мономеры, димеры или тетрамеры - G1, G2 и G4, соответственно - и могут быть как мембраносвязанными, так и водорастворимыми [Silman, 2021].

Экспрессия АХЭ регулируется тканеспецифическим развитием, фермент локализуется на внеклеточной поверхности нерва и мышцы. Этот процесс описывается тремя стадиями: сплайсинг, олигомеризация каталитических субъединиц и ассоциация с некаталитическими субъединицами. В результате альтернативного сплайсинга фермент существует в нескольких формах, различающихся только своим С-концом: H, T и S, последние встречаются только у змей семейства Elapidae [Legay, 2000]. Субъединицы H существуют только в виде амфифильных димеров, соединенных межсубъединичной дисульфидной связью (Рисунок 4). Субъединицы T могут иметь различную олигомеризацию, мономеры и различные олигомерные формы (димеры или тетрамеры) и гетероолигомеры. Субъединицы T могут включать в себя субъединицы коллагена (ColQ) и гидрофобные субъединицы. У форм с коллагеновыми хвостами один, два или три тетрамера АХЭт прикреплены к трем коллагеновым нитям [Cousin et al., 1998; Dvir et al., 2011].

Рисунок 4 - Структура форм АХЭ у позвоночных [Legay, 2000]

Мономерные субъединицы всех этих форм содержат идентичные аминокислотные последовательности и обладают одинаковой каталитической активностью. В структуре установлен домен в С-концевой области мономера фермента, который содержит остатки пролина, формирующие тетрамер. Мономерные субъединицы гликолизированы по трём или четырём аминокислотным остаткам N-концевого полипептида. Мономерные субъединицы фермента обладают молекулярной массой 70 - 80 кДа у млекопитающих и 100 - 110 кДа у птиц [Taylor et al., 2009]. Наличие в обеих ХЭ двух общих сайтов гликозилирования, объясняет тот факт, что антитела к данным эпитопам, полученные к АХЭ, не распознают подобные эпитопы к БХЭ [Lockridge et al., 1987].

Сборка тетрамера происходит путем присоединения двух димеров. Четвертичная структура фермента образуется при помощи дисульфидных связей и полипролин-богатого пептида [Larson et al., 2014]. Соединение нескольких тетрамеров АХЭ с помощью коллагенсодержащей субъединицы даёт более сложную гетероолигомерную структуру. Такие комплексы обладают необходимой гидрофобностью для прикрепления к внешней клеточной мембране. Ассоциированные с мембраной гетеромерные виды, соединенные с нерастворимым белком, являются преобладающей формой в головном мозге, в то время как коллаген содержащие гетеромеры локализованы в базальной пластинке нервно-мышечного соединения [Legay, 2000].

У млекопитающих субъединица H в основном находится связанная с гликофосфатидилинозитолом на поверхности кроветворных клеток, а субъединица T экспрессируется холинергическими нервными клетками и скелетными мышцами. АХЭ в холинергических синапсах позвоночных образована четырьмя субъединицами T, которые связанны либо с ColQ, либо с трансмембранным якорным белком, богатым пролином (PRiMA). На всю долю АХЭ в ЦНС, в формате заякоренной тетрамерной формы приходится 70-90% фермента [Jiang, Gao, 2019].

Физиологической функцией АХЭ является быстрый гидролиз ацетилхолина (АХ) в синаптической щели, что осуществляет передачу нервного ответа от клетки к клетке. АХ - нейромедиатор, который накапливается в синаптических пузырьках и высвобождается в синаптическое пространство при сигнале потенциала действия. АХ при связывании с рецепторами приводит к деполяризации мембраны и возникновении потенциала действия второй клетки, таким образом происходит распространения нервного импульса. Для прекращения действия нейромедиатора АХЭ катализирует реакцию распада (Рисунок 5) АХ на

холин и уксусную кислоту с очень высокой скоростью = 1,6-108 М-1с-1),

что обеспечивает готовность к следующему циклу возбуждения [Quinn, 1987]. Продукты гидролиза захватываются пресинаптической клеткой и используются повторно, для синтеза медиатора.

Рисунок 5 - Реакция гидролиза ацетилхолина ИАХЭ

Нефизиологическими функциями АХЭ являются рост и формирование синапсов. Временная экспрессия АХЭ в головном мозге во время эмбриогенеза предполагает, что АХЭ может участвовать в регуляции роста нейритов [Soreq, Seidman, 2001], также АХЭ экспрессируется в тех тканях, которые не связаны с холинергической системой. АХЭ участвует в контроле распространения и дифференциации кровяных клеток в организме [Lev-Lehman et al., 1997]. АХЭ, как эритроцитарный антиген (ТТ), определяет группу крови. Точечные мутации в АХЭ приводят к полиморфизму антигена (ТТ1 и ТТ2), что играет важную роль при переливании крови [Masson et al., 1994].

1.1.2 Структура и функции бутирилхолинэстеразы

АХЭ и БХЭ человека имеют 65% гомологию в последовательностях, похожую третичную и четвертичную структуру и общее строение активного сайта [Ortiz et al., 2016]. Но несмотря на это, ферменты кодируются разными генами, располагающихся на различных хромосомах (АХЭ: 7q22; БХЭ: 3q26), и обладают отличительными субстратными предпочтениями [Batool et al., 2022]. Ген, кодирующий БХЭ, имеет около 75 полиморфизмов, 54 из которых влияют на каталитическую активность [Варфоломеев и др., 2016].

БХЭ - это глобулярный водорастворимый белок, который может состоять из несколько идентичных доменов, в плазме крови человека он представлен в тетрамерной форме массой 340 кДа (Рисунок 6). Как и АХЭ, у

23

позвоночных БХЭ существует в нескольких молекулярных формах: 01, 02 и 04, которые находятся в основном в растворимых формах. Мембраносвязанные формы БХЭ связаны с коллагеновыми фибриллярными структурами или с белком РШМА [БагуевИ et al., 2003].

Рисунок 6 - Трёхмерная структура тетрамера ЖХЭ: А - вид сверху (полипролиновый пептид обозначен жёлтым кругом); Б - вид сбоку [Boyko et.al, 2019]

Сложная структурная организация БХЭ не влияет на каталитические свойства, а локально увеличивает количество активных центров, так как каждый мономер содержит один активный сайт [Lockridge et al., 1987]. При действии протеаз тетрамерная форма БХЭ переходит в димерную, а из димерной - в мономерную [Boyko, 2019]. Домен тетрамеризации человеческой БХЭ (ЯБХЭ) образован четырьмя С-концевыми амфифильными спиралями в виде сверхспиральной сборки вокруг центрального полипролина [Bernardi et al., 2017]. Домены БХЭ, как и у АХЭ, стабилизированы при помощи дисульфидных связей и полипролин-богатым пептидом, состоящим из 17 аминокислотных остатков и размером около 3 кДа [Larson et al., 2014]. Как и АХЭ, БХЭ представляет собой гликопротеин, БХЭ гликозилируется по девяти аспарагиновым остаткам [Darvesh et al., 2003].

Физиологическая роль БХЭ по настоящий день чётко не установлена, так как люди, не имеющие ген БХЭ из-за генетической изменчивости, здоровы [Manoharan et al., 2007]. Тем не менее, БХЭ крови участвует в деградации лекарственных веществ и ядовитых соединений, и имеет токсикологическую и фармакологическую значимость. Например, БХЭ плазмы крови гидролизует аспирин до салициловой кислоты [Zhou et al., 2013], у людей, не имеющих БХЭ, преобладают симптомы передозировки при лечении некоторыми анестетиками и миорелаксантами (такими как сукцинилхолин и мивакуриум), что сопровождаются длительным параличом мышц [Zhu et al., 2020]. БХЭ человека также вводиться в виде самостоятельного биофармацевтического препарата для защиты АХЭ при отравлении фосфорорганическими пестицидами [Reed et al., 2017]. Экзогенная БХЭ не вызывает никаких иммуногенных, токсических или поведенческих эффектов, что позволяет использовать её как самостоятельное средство.

В 1996-1997 годах было показано, что БХЭ плазмы крови защищает животных от отравления кокаином, но скорость гидролиза кокаина была

низкой =0,28 мкМ-1-мин-1) [Lynch et al., 1997]. Благодаря данным, Км

основанным на молекулярном моделировании, и мутагенезу, получены мутантные формы БХЭ, у которых каталитические активности были выше в несколько раз, а конъюгированная с альбумином мутантная форма фермента снимала симптомы отравления кокаином у крыс [Brimijoin et al., 2008]. Поэтому рекомбинантный мутант БХЭ, который быстро инактивирует кокаин, разрабатывается как средство лечения, помогающее вылечить кокаиновых наркоманов [Lockridge, 2015].

БХЭ способна гидролизовать АХ в организме, если АХЭ по какой-либо причине недоступна, об этом свидетельствуют эксперименты на мышах. В опыте использовали линии нокаутных мышей по гену АХЭ, но с нормальным уровнем БХЭ. Мыши доживали до зрелого возраста, что свидетельствует о

прекращении передачи нервного импульса за счет гидролиза АХ БХЭ-ой и погибали при воздействии ингибитора БХЭ [Duysen et al., 2007].

В здоровом человеческом мозге активность АХЭ составляет 80%, но по мере развития некоторых нейродегенеративных заболеваний, в частности, болезни Альцгеймера (БА) активность БХЭ может в несколько раз превышать активность АХЭ [Jiang, Gao, 2019].

В исследованиях на мышах также продемонстрирована связь между БХЭ и возникновения ожирения. БХЭ гидролизует гормон голода - грелин. Мыши, которые были лишены гена БХЭ были подвержены ожирению, и имели высокий уровень агрессии [Brimijoin et al., 2016]. Кинетические исследования, где грелин выступает в качестве субстрата БХЭ, показывает хорошую вероятность этой взаимосвязи (Км=0,5наноМ, значение близкого к физиологическому). Однако другие ферменты, такие как карбоксилэстераза, лизофосфолипаза 1, содержащиеся в плазме крови могут также восполнять эту функцию [Schopfer et al., 2015].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Мухаметгалиева Алия Рафиковна, 2022 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алебян, Г. П. Гидролиз дихолиновых эфиров дикарбоновых кислот под действием бутирилхолинэстеразы / Алебян Г. П., Григорян Н. А. Мнджоян О. Л., Самокиш В. А. // Биоорганическая химия. - 1977. -Т.3. № 9. - C. 1266-1272.

2. Бресткин, А. П. S-алкиниловые эфиры тиокислот фосфора как ингибиторы холинэстераз и перспективные физиологически активные вещества / Бресткин А. П., Вихрева Л. А., Годовиков Н. Н., Жуковский Ю. Г., Кабачник М. И., Моралев С. Н., Розенгарт В. И., Шерстобитов О. Е. // Усп. хим. - 1991. - Т. 60, № 8. - С. 885-902.

3. Варфоломеев С. Д. Молекулярный полиморфизм ферментов человека

- основа индивидуальной чувствительности к лекарствам. Суперкомпьютерное моделирование как метод анализа структурных изменений белка и его каталитической активности / С.Д. Варфоломеев, С.В. Лу-щекина, А.В. Немухин, А.М. Кулакова, Е.Д. Коц, Г.Ф. Махаева, Э. Де-лакур, О. Локридж, П. Массон // Изв. АН. Сер. хим. - 2016. - №6. -№1592.

4. Еременко, А. В. Планарные тиол-чувствительные сенсорные элементы для определения активности бутирилхолинэстеразы и анализа ее ингибиторов / А.В. Еременко, Т.А. Прокопкина, В.Э. Касаткин, Т.А. Осипова, И.Н. Курочкин // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. - 2014.

- Т. 55. № 3. - С.174-179.

5. Козлова, А. С. Программный конвейер для предсказания и анализа структуры комплекса рецептор - лиганд / Козлова А. С., Мухаметгали-ева А.Р., Фаттахова А.Н., Акберова Н.И. // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Физ.-матем. науки. - 2022. - Т.164. № 1. - С. 122-136.

6. Кабачник, М. И. Гидрофобные области активной поверхности холинэстераз / М. И. Кабачник, А. А. Абдувахабов, И. И. Агабекова, А. П. Бресткин, Р. И. Волкова, Н. Н. Годовиков, Е. И. Годына,

С. С. Михайлов, М. Я. Михельсон, В. И. Розенгарт, Е. В. Розенгарт, Р. В. Ситкевич // Усп. хим. - 1970. - Т. 39, № 6. - С. 1050-1073.

7. Курдюков, И.Д. «Эстеразный статус» организма при воздействии токсических веществ и фармпрепаратов / Курдюков И.Д., Шмурак В.И., Надеев А.Д., Войтенко Н.Г., Прокофьева Д.С., Гончаров Н.В. // Токсикологический вестник. - 2012. - Т.6. № 117. - С. 6-12.

8. Лущекина, С. В. Холинэстеразы человека. Суперкомпьютерные вычисления в исследовании механизма действия и роли молекулярного полиморфизма белковой молекулы / С. В. Лущекина, Б. Л. Григоренко, А. В. Немухин, С. Д. Варфоломеев // «Постгеномные исследования и технологии» под ред. члена-корреспондента РАН С. Д. Варфоломеева. Изд. МГУ Москва. - 2011. - С. 15-102.

9. Лягин, И. В. Ферментные биосенсоры для определения пестицидов / Лягин И. В., Ефременко Е.Ф., Варфоломеев С. Д. // Усп. хим. - 2017. -Т. 86, №4. - С. 339-355.

10.Массон, П. Кинетические особенности реакций, катализируемые хо-линэстеразами / Массон П. // Бихимия. - 2012. - Т. 77, № 10. - С. 13831400.

11. Массон, П. Каталитические «биоловушки» против токсических эфи-ров, альтернативный подход для профилактики и лечения отравлений / Массон П., Рошу Д. // Acta naturae. - 2009. - №1 - С. 68-78.

12.Махаева, Г. Ф. Ингибиторы холинэстераз и карбоксилэстераз как фармакологические агенты / Г. Ф. Махаева, Е. В. Рудакова, Н. В. Ковалева, С. В. Лущекина, Н. П. Болтнева, А. Н. Прошин, Е. В. Щегольков, Я. В. Бургарт, В. И. Салоутинв // Изв. АН. Сер. хим. - 2019. - №5. - С. 967-984.

13. Моралев, С. Н. «Каталитическая машина» холинэстераз разных животных устроена одинаково / С. Н. Моралев, Е. В. Розенгарт, А. А. Суворов // Докл. акад. н. - 2001. - Т.381, №1. - С.123-125.

14. Розенгарт, Е. В. К механизму непродуктивного связывания субстратов холинэстераз / Розенгарт Е. В., Басова Н. Е., Суворов А. А. // Докл. акад. н. - 2009. - Т. 429, № 3. - С 411-415.

15. Allard, J. L. Strategies for developing a recombinant butyrylcholinesterase medical countermeasure for Organophosphorus poisoning / Allard J.L., Shields K.A., Munro T.P., Lua L.H.L. // Chem Biol Interact. - 2022. -V.363. - № 109996.

16. Akimov, M. G. Arachidonoylcholine and Other Unsaturated Long-Chain Acylcholines Are Endogenous Modulators of the Acetylcholine Signaling System / Akimov, M. G. Kudryavtsev D. S., Kryukova E. V., Fomina-Ageeva E. V., Zakharov S. S., Gretskaya N. M. et al. // Biomolecules. -2020. - V. 10. № 2. - № 283.

17. Amend, N. A case report of cholinesterase inhibitor poisoning: cholines-terase activities and analytical methods for diagnosis and clinical decision making / Amend N., Langgartner J., Siegert M., Kranawetvogl T., Koller M., John H. et al. // Arch Toxicol. - 2020. - V. 94. № 6. - P. 2239-2247.

18. Augustinsson, K. B. Determination of activity of cholinesterases/ Au-gustinsson K. B. // Methods Biochem Anal. - 1971. - Suppl. Vol. - P. 217273.

19. Badiou, A. Hysteresis of insect acetylcholinesterase / Badiou A., Froment M. T., Fournier D., Masson P., Belzunces L. P. // Chem Biol Interact. -2008. V.175. № 1-3. - P. 410-412.

20. Batool, S. In Silico and Ex Vivo Analyses of the Inhibitory Action of the Alzheimer Drug Posiphen and Primary Metabolites with Human Acetyl-and Butyrylcholinesterase Enzymes / Batool S., Furqan T., Hasan Mahmood M. S., Tweedie D., Kamal M. A., Greig N. H. // ACS Pharmacol. Transl. Sci. - 2022. - V.5. № 2. - P. 70-79.

21. Benkert, P. QMEAN: A comprehensive scoring function for model quality assessment / Benkert P., Tosatto S. C. E., Schomburg D. // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. - 2008. - V.71. № 1. - P. 261-277.

22. Bernardi, A. Structural analysis of human glycoprotein butyrylcholines-terase using atomistic molecular dynamics: The importance of glycosylation site ASN241 / Bernardi A., Kirschner K. N., Faller R. // PLOS ONE. -2017. - V.12. № 11. - № e0187994.

23. Boyko, K. M. 3D structure of the natural tetrameric form of human butyr-ylcholinesterase as revealed by cryoEM, SAXS and MD / Boyko, K. M., Baymukhametov, T. N., Chesnokov, Y. M., Hons, M., Lushchekina, S. V., Konarev, P. V., Lipkin, A. V., Vasiliev, A. L., Masson, P., Popov, V. O., Kovalchuk, M. V. // Biochimie. - 2019. - V.156. - P.196-205.

24. Brestkin, A. P. Cholinesterase Catalysis / Brestkin A. P., Rozengart E. V. // Nature. - 1965. - V. 205. № 4969. - P. 388-389.

25. Brimijoin, S. Physiological roles for butyrylcholinesterase: A BChE-ghrelin axis / Brimijoin S., Chen V. P., Pang Y.-P., Geng L., Gao Y. // Chemico-Biological Interactions. - 2016. - V.259. - P. 271-275.

26. Brimijoin, S. A cocaine hydrolase engineered from human butyrylcholin-esterase selectively blocks cocaine toxicity and reinstatement of drug seeking in rats / Brimijoin S., Gao Y., Anker J. J., Gliddon L. A., Lafleur D., Shah R., et al. // Neuropsychopharmacology. - 2008. - V.33. № 11. - P. 2715-2725.

v _

27. Cadez, T. Assessment of four organophosphorus pesticides as inhibitors of human acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase / Cadez T., Kolic D., Sinko G., Kovarik Z. // Sci Rep. - 2021. - V.11. № 1. - № 21486.

V _

28. Cadez, T. Advancements in recombinant technology for production of butyrylcholinesterase, a bioscavenger of nerve agent / Cadez T., Kovarik Z. // Periodicum biologorum. - 2020. - V. 121-122, № 1-2. - P. 55-63.

29. Capoferri, D. Compagnone D. Affinity Sensing Strategies for the Detection of Pesticides in Food / Capoferri D., Delia Pelle F., Del Carlo M., Compagnone D. // Foods. - 2018. - V.7. № 9. - № 148.

30. Chai, P. R. Toxic chemical weapons of assassination and warfare: nerve agents VX and sarin / Chai P. R., Boyer E. W., Al-Nahhas H., Erickson T. B. // Toxicol Commun. - 2017. - V.1. № 1. - P. 21-23.

31. Cheung, J. Structures of Human Acetylcholinesterase in Complex with Pharmacologically Important Ligands / Cheung J., Rudolph M. J., Bursht-eyn F., Cassidy M. S., Gary E. N., Love J. [et al.] // J. Med. Chem. - 2012. - V.55. № 22. - P. 10282-10286.

32. Colletier, J. P. Structural insights into substrate traffic and inhibition in acetylcholinesterase/ Colletier J. P., Fournier D., Greenblatt H. M., Stojan J., Sussman J. L., Zaccai G., et al. // The EMBO Journal. - 2006. - V.25. № 12. - P. 2746-2756.

33. Cornish-Bowden, A. A simple graphical method for determining the inhibition constants of mixed, uncompetitive and non-competitive inhibitors (Short Communication) / Cornish-Bowden, A. // Biochem J. - 1974. -V.137. № 1. - P. 143-144.

34. Cousin, X. Identification of a Novel Type of Alternatively Spliced Exon from the Acetylcholinesterase Gene of Bungarus fasciatus: molecular forms of acetylcholinesterase in the snake liver and muscle / Cousin X., Bon S., Massoulie J., Bon C. // Journal of Biological Chemistry. - 1998. - V.273. № 16. - P. 9812-9820.

35. Darvesh, S. Neurobiology of butyrylcholinesterase / Darvesh S., Hopkins D. A., Geula C. // Nat Rev Neurosci. - 2003. - V.4. № 2. - P. 131-138.

36. Darvesh, S. On the active site for hydrolysis of aryl amides and choline esters by human cholinesterases / Darvesh S., Mcdonald R., Darvesh K., Ma-taija D., Mothana S., Cook H. E. [et al.] // Bioorganic & medicinal chemistry. - 2006. - V.14. №13. - P. 4586-4599.

37.Davies, R. O. The action of normal and atypical cholinesterase of human serum upon a series of esters of choline / Davies R. O., Marton A. V., Ka-low W. // Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. - 1960. -V38. - P. 545-551.

38. De Boer, D. A Comprehensive Review of Cholinesterase Modeling and Simulation / De Boer D., Nguyen N., Mao J., Moore J., Sorin E. J. // Bio-molecules. - 2021. - V.11. № 4. - № 580.

39. Digiacomo, M. Synthesis and pharmacological evaluation of multifunctional tacrine derivatives against several disease pathways of AD / Digia-como M., Chen Z., Wang S., Lapucci A., Macchia M., Yang X., et al. // Bioorg Med Chem Lett. - 2015. - V. 25. № 4. - P. 807-810.

40. Dingova, D. Optimal detection of cholinesterase activity in biological samples: Modifications to the standard Ellman's assay / Dingova D., Leroy J., Check A., Garaj V., Krejci E., Hrabovska A. // Analytical Biochemistry. - 2014. - V.462. - P. 67-75.

41. Doctor, B. P. Bioscavengers for the protection of humans against organo-phosphate toxicity / Doctor B. P., Saxena A. // Chemico-Biological Interactions. - 2005. - V.157-158. - P. 167-171.

42. Du, C. N-Benzyl Benzamide Derivatives as Selective Sub-Nanomolar Bu-tyrylcholinesterase Inhibitors for Possible Treatment in Advanced Alzheimer's Disease / Du C., Wang L., Guan Q., Yang, H., Chen, T., Liu Y. [et al.] // J Med Chem. - 2022. - V. 65. № 16. - P. 11365-11387.

43. Duysen, E. G. Sensitivity of butyrylcholinesterase knockout mice to (-)-huperzine A and donepezil suggests humans with butyrylcholinesterase deficiency may not tolerate these Alzheimer's disease drugs and indicates butyrylcholinesterase function in neurotransmission / Duysen E. G., Li B., Darvesh S., Lockridge O. // Toxicology. - 2007. - V.233. № 1. - P. 60-69.

44. Dvir, H. Acetylcholinesterase: From 3D Structure to Function / Dvir H., Silman I., Harel M., Rosenberry T. L., Sussman J. L. // Chemico-Biological Interactions. - 2011. -V.187. - P. 10-22.

45. Eddleston, M. Novel Clinical Toxicology and Pharmacology of Organo-phosphorus Insecticide Self-Poisoning / Eddleston M. // Annu Rev Pharmacol Toxicol. - 2019. - V. 59. - P. 341-360.

46. Eisenthal, R. Catalytic efficiency and kcat/KM: a useful comparator? / Eisenthal R., Danson M. J., Hough D. W. // Trends in Biotechnology. - 2007. - V. 25. № 6. - P. 247-249.

47. Ellman, G. L. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity / Ellman G. L., Courtney K. D., Andres V., Featherstone R. M. // Biochemical Pharmacology. - 1961. - V.7. № 2. - P. 88-95.

48. Estevez, J. Interactions of human butyrylcholinesterase with phenyl-valerate and acetylthiocholine as substrates and inhibitors: kinetic and molecular modeling approaches / J. Estevez, F. Rodrigues de Souza, M. Romo, I. Mangas, T.C. Costa Franca, E. Vilanova // Arch. Toxicol. - 2019. - V.93, № 5. - P.1281-1296.

49. Estevez, J. Interactions of human acetylcholinesterase with phenyl valerate and acetylthiocholine: Thiocholine as an enhancer of phenyl valerate esterase activity / Estevez J., Terol M., Sogorb M.A., Vilanova E. // Chem Biol Interact. - 2022. - V.351. - №109764.

50. Frieden, C. Slow Transitions and Hysteretic Behavior in Enzymes / Frieden C. // Annu. Rev. Biochem. - 1979. - V. 48. № 1. - P. 471-489.

51. Girard, E. Butyrylcholinesterase and the control of synaptic responses in acetylcholinesterase knockout mice / Girard E., Bernard V., Minic J., Cha-tonnet A., Krejci E., Molgo J. // Life Sciences. - 2007. - V.80. № 24. - P. 2380-2385.

52. Golicnik, M. Time-course of enzyme-catalyzed competing substrate degradation for michaelian behavior and for enzymes showing activa-

tion/inhibition by excess substrate / Golicnik M., Masson P. // Chemico-Biological Interactions. - 2019. - V.309. - № 108704.

53. György, H. Introduction to Practical Biochemistry / György, H., Jozsef K., Mihaly K., Andras M. C., Laszlo N., Gabor P. [et al.] // Eötvös Lorand University. Hungary. - 2013. - 211 p.

54. Haigh, J. R. Protection of red blood cell acetylcholinesterase by oral hu-perzine A against ex vivo soman exposure: next generation prophylaxis and sequestering of acetylcholinesterase over butyrylcholinesterase / Haigh J. R., Johnston S. R., Peppernay A., Mattern P. J., Garcia G. E., Doctor B. P. [et al.] // Chem Biol Interact. - 2008. - V.175. № 1-3. - P. 380-386.

55. Harel, M. Quaternary ligand binding to aromatic residues in the active-site gorge of acetylcholinesterase / Harel M., Schalk I., Ehret-Sabatier L., Bouet F., Goeldner M., Hirth C. [et al.] // PNAS. - 1993. - V.90. № 19. - P. 9031-9035.

56. Harel, M. Conversion of acetylcholinesterase to butyrylcholinesterase: modeling and mutagenesis/ Harel M., Sussman J. L., Krejci E., Bon S., Chanal P., Massoulie J. [et al.] // PNAS. - 1992. - V. 89. № 22. - P. 1082710831.

57. Hosea, N. A. Specificity and Orientation of Trigonal Carboxyl Esters and Tetrahedral Alkylphosphonyl Esters in Cholinesterases / Hosea N. A., Ber-man H. A., Taylor P. // Biochemistry. - 1995. - V.34. № 36. - P. 1152811536.

58. Hrabovska, A. Rat butyrylcholinesterase-catalysed hydrolysis of N-alkyl homologues of benzoylcholine/ Hrabovska A., Debouzy J.-C., Froment M.-T., Devinsky F., Paulikova I., Masson P. // The FEBS Journal. - 2006. -V.273. № 6. - P.1185-1197.

59. Huang, J. CHARMM36 all-atom additive protein force field: Validation based on comparison to NMR data / Huang J., MacKerell A. D. // Journal of Computational Chemistry. - 2013. - V.34. № 25. - P. 2135-2145.

60. Humphrey, W. VMD: Visual molecular dynamics / Humphrey W., Dalke A., Schulten K. // Journal of Molecular Graphics. - 1996. - V. 14. № 1. - P. 33-38.

61. Ilyushin, D. G. Recombinant Human Butyrylcholinesterase As a New-Age Bioscavenger Drug: Development of the Expression System / Ilyushin D.

G., Haertley O. M., Bobik T. V., [et al.] // Acta Naturae. - 2013. - V.5. № 1. - P. 73-84.

62. Ivanov, I. P. A simplified equation allowing the determination of kinetic constants of «invisible» substrates / Ivanov I. P., Miteva H. J., Yomtova V. M. // Anal Biochem. - 2003. - V.323. № 2. - P. 247-248.

63. Iverson, F. Binding constants for tetramethylammonium ion determined with irreversible inhibitors of acetylcholinesterase / Iverson F. // Can J Biochem. - 1976. - V. 54. № 10. - P. 918-920.

64. Jiang, Y. Pharmacophore-based drug design for the identification of novel butyrylcholinesterase inhibitors against Alzheimer's disease / Jiang Y., Gao

H. // Phytomedicine. - 2019. - V.54. - P. 278-290.

65. John, H. Fatal sarin poisoning in Syria 2013: forensic verification within an international laboratory network / John H., Schans M. J. van der, Koller M., Spruit H. E. T., Worek F., Thiermann H., [et al.] // Forensic Toxicol. -2018. - V.36. № 1. - P. 61-71.

66. Johnson, J. L. Unmasking Tandem Site Interaction in Human Acetylcholinesterase. Substrate Activation with a Cationic Acetanilide Substrate / Johnson J. L., Cusack B., Davies M. P., Fauq A., Rosenberry T. L. // Biochemistry. - 2003. - V.42. № 18. - P. 5438-5452.

67. Johnson, K. A. New standards for collecting and fitting steady state kinetic data / Johnson K. A. // Beilstein J Org Chem. - 2019. - V.15. - P. 16-29.

68. Kalyabina, V. P. Pesticides: formulants, distribution pathways and effects on human health - a review / Kalyabina V. P., Esimbekova E. N., Kopylova K. V., Kratasyuk V. A. // Toxicol Rep. - 2021. - V.8. - P. 1179-1192.

69. Katoh, K. MAFFT Multiple Sequence Alignment Software Version 7: Improvements in Performance and Usability/ Katoh K., Standley D. M. // Molecular Biology and Evolution. - 2013. - V. 30. № 4. - P. 772-780.

70. Kim, D. E. Protein structure prediction and analysis using the Robetta server / Kim D. E., Chivian D., Baker D. // Nucleic Acids Res. - 2004. -V.32. № Web Server issue. - P. 526-531.

71. Kinchen, J. M. Long-Chain Acylcholines Link Butyrylcholinesterase to Regulation of Non-neuronal Cholinergic Signaling / Kinchen J. M., Mohney R. P., Pappan K. L. // J. Proteome Res. - 2022. - V.21. № 3. - P. 599-611.

72. Koshland, D. E. The Application and Usefulness of the Ratio kcat/KM / Koshland D. E. // Bioorganic Chemistry. - 2002. - V.30. № 3. - P. 211-213.

73. Kumar, A. DMSO: A Mixed-Competitive Inhibitor of Human Acetylcholinesterase / Kumar A., Darreh-Shori T. // ACS Chem. Neurosci. - 2017. -V.8. № 12. - P. 2618-2625.

74. Lan, J. S. Design, synthesis and evaluation of novel cinnamic acid derivatives bearing N-benzyl pyridinium moiety as multifunctional cholinesterase inhibitors for Alzheimer's disease / Lan J.-S., Hou J.-W., Liu Y., Ding Y., Zhang Y., Li L., [et al.] // J Enzyme Inhib Med Chem. - 2017. - V.32. № 1. - P. 776-788.

75. Larson, M. A. Polyproline promotes tetramerization of recombinant human butyrylcholinesterase / Larson M. A., Lockridge O., Hinrichs S. H. // Biochemical Journal. - 2014. - V.462. № 2. - P. 329-335.

76. Legay, C. Why so many forms of acetylcholinesterase? / Legay C // Mi-crosc Res Tech. - 2000. - V.49. № 1. - P. 56-72.

77. Leuzinger, W. The number of catalytic sites in acetylcholinesterase / Leuzinger W. // Biochem J. - 1971. - V.123. № 2. - P. 139-141.

78. Lev-Lehman, E. Immature human megakaryocytes produce nuclear-associated acetylcholinesterase / Lev-Lehman E., Deutsch V., Eldor A., Soreq H. // Blood. - 1997. - V.89. № 10. - P. 3644-3653.

79. Lockridge, O. Genetic variants of human serum cholinesterase influence metabolism of the muscle relaxant succinylcholine / Lockridge O. // Pharmacology & Therapeutics. - 1990. - V.47. № 1. - P. 35-60.

80. Lockridge, O. Review of human butyrylcholinesterase structure, function, genetic variants, history of use in the clinic, and potential therapeutic uses / Lockridge, O. // Pharmacology & Therapeutics. - 2015. - V.148. - P. 34-46.

81. Lockridge, O. Location of disulfide bonds within the sequence of human serum cholinesterase. / Lockridge O., Adkins S., Du B. N. L. // Journal of Biological Chemistry. - 1987. - V. 262. № 27. - P.12945-12952.

82. Lord, C. C. Mammalian alpha beta hydrolase domain (ABHD) proteins: Lipid metabolizing enzymes at the interface of cell signaling and energy metabolism/ Lord C. C., Thomas G., Brown J. M. // Biochim Biophys Acta. -2013. - V. 1831. № 4. - P. 792-802.

83. Lushchekina, S.V. Masson P. Slow-binding inhibitors of acetylcholines-terase of medical interest / Lushchekina S.V., Masson P. // Neuropharma-cology. - 2020. - V. 177. - № 108236.

84. Lynch, T. J. Cocaine detoxification by human plasma butyrylcholinesterase /. Lynch T. J., Mattes C. E., Singh A., Bradley R. M., Brady R. O., Dretchen K. L. // Toxicol Appl Pharmacol. - 1997. - V. 145. № 2. - P. 363371.

85. Manoharan, I. A medical health report on individuals with silent butyrylcholinesterase in the Vysya community of India / Manoharan I., Boopathy R., Darvesh S., Lockridge O. // Clinica Chimica Acta. - 2007. - V. 378. № 1. - P. 128-135.

86. Masson, P. Mutation His322Asn in human acetylcholinesterase does not alter electrophoretic and catalytic properties of the erythrocyte enzyme / Masson P., Froment M. T., Sorenson R. C., Bartels C. F., Lockridge O // Blood. - 1994. - V. 83. № 10. - P. 3003-3005.

87. Masson, P. Asp70 in the Peripheral Anionic Site of Human Butyrylcholin-esterase / Masson P., Froment M.-T., Bartels C. F., Lockridge O. // European Journal of Biochemistry. -1996. -V. 235. № 1-2. - P. 36-48.

88. Masson, P. Kinetic analysis of butyrylcholinesterase-catalyzed hydrolysis of acetanilides/ Masson P., Froment M. T., Gillon E., Nachon F., Darvesh S., Schopfer L. M. // Biochim Biophys Acta. - 2007a. - V. 1774. № 9. - P. 1139-1147.

89. Masson, P. Hydrolysis oxo- and thio-esters by hyman butyrylcholinester-ase / Masson P., Froment M. T., Gillon E., Nachon F., Lockridge O., Schopfer L. M. // Biochim Biophys Acta. - 2007b. - V. 1774. № 1. - P. 1634.

90. Masson, P. Damped oscillatory hysteretic behaviour of butyrylcholinester-ase with benzoylcholine as substrate: Oscillations in butyrylcholinesterase hysteresis / Masson P., Goldstein B. N., Debouzy J.-C., Froment M.-T., Lockridge O., Schopfer L. M. // European Journal of Biochemistry. - 2004. - V. 271. № 1. - P. 220-234.

91. Masson, P. Role of Aspartate 70 and Tryptophan 82 in Binding of Suc-cinyldithiocholine to Human Butyrylcholinesterase / Masson P., Legrand P., Bartels C. F., Froment M.-T., Schopfer L. M., Lockridge O. // Biochemistry. - 1997. - V. 36. № 8. - P. 2266-2277.

92. Masson, P. Butyrylcholinesterase for protection from organophosphorus poisons: Catalytic complexities and hysteretic behavior / Masson P., Lockridge O. // Archives of Biochemistry and Biophysics. - 2010. - V. 494. № 2. - P. 107-120.

93. Masson, P. Slow-binding inhibition of cholinesterases, pharmacological and toxicological relevance / Masson P., Lushchekina S. V. // Arch Bio-chem Biophys. - 2016. - V. 593. - P. 60-68.

94. Masson, P. Cholinesterase reactivators and bioscavengers for pre- and post-exposure treatments of organophosphorus poisoning / Masson P., Na-chon F. // Journal of Neurochemistry. - 2017. - V. 142. № S2. - P. 26-40.

95. McGehee, D. S. Cholinesterase inhibition by potato glycoalkaloids slows mivacurium metabolism / McGehee D. S., Krasowski M. D., Fung D. L., Wilson B., Gronert G. A., Moss J.// Anesthesiology. - 2000. - V. 93. № 2. -P. 510-519.

96. Miao, Y. History and new developments of assays for cholinesterase activity and inhibition/ Miao Y., He N., Zhu J.-J. // Chem Rev. - 2010. - V. 110. № 9. - P. 5216-5234.

97. Moralev, S. N. Comparative Enzymology of Cholinesterases / Moralev, S. N. Rozengart E. V. // Internat'l University Line. USA. - 2007. - 522 p. -ISBN-10 0-9720774-2-1.

98. Morris, G. M. AutoDock4 and AutoDockTools4: Automated docking with selective receptor flexibility / Morris G. M., Huey R., Lindstrom W., Sanner M. F., Belew R. K., Goodsell D. S., [et al.] // Journal of Computational Chemistry. - 2009. - V. 30. № 16. - P. 2785-2791.

99. Mukhametgalieva, A. R. Time-course of human cholinesterases-catalyzed competing substrate kinetics / Mukhametgalieva A. R., Aglyamova A. R., Lushchekina S. V., Golicnik M., Masson P. // Chemico-Biological Interactions. - 2019. - V. 310. - № 108702.

100. Mukhametgalieva, A. R. Steady-state kinetic analysis of human cholinesterases over wide concentration ranges of competing substrates / Mukhametgalieva A. R., Lushchekina S. V., Aglyamova A. R., Masson P. // Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. - 2022. - V. 1870. № 1. - № 140733.

101. Mukhametgalieva, A. R. A new sensitive spectrofluorimetric method for measurement of activity and kinetic study of cholinesterases / Mukhametgalieva A. R., Zueva I. V., Aglyamova A. R., Lushchekina S. V.,

Masson P. // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Prote-omics. - 2020. - V. 1868. № 1. - № 140270.

102. Nakajima, K. Serum cholinesterase associated with COVID-19 pneumonia severity and mortality / Nakajima K., Abe T., Saji R., Ogawa F., Taniguchi H., Yamaguchi K., [et al.] // J Infect. - 2021. - V. 82. № 2. - P. 282-327.

103. Nicolet, Y. Crystal structure of human butyrylcholinesterase and of its complexes with substrate and products / Nicolet Y., Lockridge O., Mas-son P., Fontecilla-Camps J. C., Nachon F. // J Biol Chem. - 2003. - V. 278. № 42. - P. 41141-41147.

104. Novales, N. A. Comparing the effects of organic cosolvents on acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase activity / Novales N. A., Schwans J. P. // Anal Biochem. - 2022. - V. 654. - №114796.

105. Ortiz, J. E. Alkaloids from Hippeastrum argentinum and Their Cho-linesterase-Inhibitory Activities: An in Vitro and in Silico Study / Ortiz J.E., Pigni N.B., Andujar S.A., Roitman G., Suvire F.D., Enriz R.D., [et al.] // J Nat Prod. - 2016. - V.79. №5. - P.1241-1248.

106. Pashirova, T. N. Therapeutic nanoreactors for detoxification of xe-nobiotics: Concepts, challenges and biotechnological trends with special emphasis to organophosphate bioscavenging / Pashirova T. N., Bogdanov A., Masson P. // Chemico-Biological Interactions. - 2021. - V. 346. - № 109577.

107. Petrov, K.A. Schwann cells sense and control acetylcholine spillover at the neuromuscular junction by a7 nicotinic receptors and butyrylcholinesterase / Petrov, K.A., Girard E., Nikitashina A.D., Colasante C., Bernard V., Nurullin L., Leroy J., Samigullin D., Colak O., Nikolsky E., [et al.] // J. Neurosci. - 2014. - V. 34. №36. - P. 11870-11883.

108. Petrov, K.A. Autoregulation of Acetylcholine Release and Micro-Pharmacodynamic Mechanisms at Neuromuscular Junction: Selective Ace-

tylcholinesterase Inhibitors for Therapy of Myasthenic Syndromes / Petrov K.A., Nikolsky E.E., Masson P. // Front Pharmacol. - 2018. - V. 9. - № 766.

109. Pezzementi, L. Evolution of cholinesterases in the animal kingdom / Pezzementi L., Chatonnet A. // Chemico-Biological Interactions. - 2010. -V. 187. № 1. - P. 27-33.

110. Phillips, J. C. Scalable molecular dynamics with NAMD / Phillips J. C., Braun R., Wang W., Gumbart J., Tajkhorshid E., Villa E., [et al.] // J Comput Chem. -2005. - V. 26. № 16. - P. 1781-1802.

111. Pohanka, M. Cholinesterases, a target of pharmacology and toxicology / Pohanka M. // Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Re-pub. - 2011. - V. 155. № 3. - P. 219-223.

112. Pope, C. N. Cholinesterases and the fine line between poison and remedy/ Pope C. N., Brimijoin S. // Biochem Pharmacol. - 2018. - V. 153. -P. 205-216.

113. Primo-Parmo, S.L. Characterization of 12 silent alleles of the human butyrylcholinesterase (BCHE) gene/ Primo-Parmo S.L., Bartels C.F., Wiersema B., van der Spek A.F., Innis J.W., La Du B.N. // Am J Hum Genet. - 1996. - V.58. №1. - P. 52-64.

114. Purich, D. Enzyme Kinetics: Catalysis & Control: A Reference of Theory and Best-Practice Methods / Purich D. // Elsevier Inc. - 2010. - 892 p.

115. Qiao, Y. Response-Retaliation Behavior in Synthetic Protocell Communities/ Qiao Y., Li M., Qiu D., Mann S. // Angewandte Chemie. -2019. -V. 131. № 49. - P. 17922-17927.

116. Quinn, D. M. Acetylcholinesterase: enzyme structure, reaction dynamics, and virtual transition states/ Quinn D. M // Chem. Rev. - 1987. -V. 87. № 5. - P. 955-979.

117. Radic, Z. Shifts in Backbone Conformation of Acetylcholinesterases upon Binding of Covalent Inhibitors, Reversible Ligands and Substrates / Radic Z. // Crystals. - 2021. - V. 11. № 12. - № 1557.

118. Radic, Z. Three distinct domains in the cholinesterase molecule confer selectivity for acetyl- and butyrylcholinesterase inhibitors / Radic Z., Pickering N. A., Vellom D. C., Camp S., Taylor P. // Biochemistry. - 1993. V. 32. № 45. - P. 12074-12084.

119. Reed, B. A. Human butyrylcholinesterase efficacy against nerve agent exposure / Reed B. A., Sabourin C. L., Lenz D. E. // Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. - 2017. - V. 31. № 5. - № e21886.

120. Reiner, E. Competition between substrates for acetylcholinesterase and cholinesterase / Reiner E., Simeon V. // Biochimica et Biophysica Acta - Enzymology. - 1977. -V. 480. № 1. - P. 137-142.

121. Rosenberry, T. L. Strategies to Resolve the Catalytic Mechanism of Acetylcholinesterase / Rosenberry T. L. // J Mol Neurosci. - 2010. - V. 40. № 1. - P. 32-39.

122. Rosenberry, T. L. Comparison of the Binding of Reversible Inhibitors to Human Butyrylcholinesterase and Acetylcholinesterase: A Crystal-lographic, Kinetic and Calorimetric Study / Rosenberry T. L., Brazzolotto X., Macdonald I. R., Wandhammer M., Trovaslet-Leroy M., Darvesh S., [et al.] // Molecules. - 2017. - V. 22. № 12. - № 2098.

123. Roskoski, R. Michaelis-Menten Kinetics: Reference Module in Biomedical Sciences / Roskoski R. // Elsevier. -2015. - № 5143. - P. 1-12.

124. Saxena, A. Differences in active site gorge dimensions of cholinester-ases revealed by binding of inhibitors to human butyrylcholinesterase / A. Saxena, A. M. Redman, X. Jiang, O. Lockridge, B. P. Doctor // Biochemistry. - 1997. - V. 36. - № 14642.

125. Saxena, A. Characterization of Butyrylcholinesterase from Porcine Milk / Saxena A., Belinskaya T., Schopfer L. M., Lockridge O. // Arch Bio-chem Biophys. - 2018. - V. 652. - P. 38-49.

126. Schopfer, L. M. Pure human butyrylcholinesterase hydrolyzes oc-tanoyl ghrelin to desacyl ghrelin / Schopfer L. M., Lockridge O., Brimijoin S. // General and Comparative Endocrinology. - 2015. - V. 224. - P. 61-68.

127. Semenov, V.E. 6-Methyluracil Derivatives as Bifunctional Acetylcholinesterase Inhibitors for the Treatment of Alzheimer's Disease / Semenov V.E., Zueva I.V., Mukhamedyarov M.A., Lushchekina S.V., Khar-lamova A.D., Petukhova E.O., Mikhailov A.S., Podyachev S.N., Saifina L.F., Petrov K.A., et al. // ChemMedChem. - 2015. - V.10. №11. - P. 1863-1874.

128. Silman, I. The multiple biological roles of the cholinesterases / Sil-man I. // Progress in Biophysics and Molecular Biology. - 2021. - V. 162. -P. 41-56.

129. Silman, I. Acetylcholinesterase: How is structure related to function? / Silman I., Sussman J. L. // Chemico-Biological Interactions. - 2008. - V. 175. № 1-3. - P. 3-10.

130. Sinko, G. Limitation of the Ellman method: Cholinesterase activity measurement in the presence of oximes / Sinko G., Calic M., Bosak A., Ko-varik Z. // Analytical Biochemistry. - 2007. - V. 370. № 2. - P. 223-227.

131. Small, D. H. Non-classical actions of cholinesterases: role in cellular differentiation, tumorigenesis and Alzheimer's disease / Small D. H., Michaelson S., Sberna G. // Neurochem Int. - 1996. -V. 28. № 5-6. - P. 453-483.

132. Soreq, H. Acetylcholinesterase - new roles for an old actor / Soreq H., Seidman S. // Nat Rev Neurosci. - 2001. - V. 2. № 4. - P. 294-302.

133. Sussman, J. L. Atomic structure of acetylcholinesterase from Torpedo californica: a prototypic acetylcholine-binding protein / Sussman J. L.,

Harel M., Frolow F., Oefner C., Goldman A., Toker L., [et al.] // Science. -1991. - V. 253. № 5022. - P. 872-879.

134. Szegletes, T. Nonequilibrium analysis alters the mechanistic interpretation of inhibition of acetylcholinesterase by peripheral site ligands / Szegletes T., Mallender W. D., Rosenberry T. L. // Biochemistry. - 1998. -V. 37. № 12. - P. 4206-4216.

135. Taylor, P. Acetylcholinesterase // Encyclopedia of Neuroscience / Taylor P., Camp S., Radic Z. // L. R. Squire. Oxford: Academic Press. -2009. - P. 5-7.

136. Terekhov, S. S. Microfluidic droplet platform for ultrahigh-throughput single-cell screening of biodiversity / Terekhov S. S., Smirnov I. V., Stepanova A. V., Bobik T. V., Mokrushina Y. A., Ponomarenko N. A., [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2017. V. 114. № 10. - P. 2550-2555.

137. The UniProt Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase // Nucleic Acids Research. - 2017. - V. 45. № D1. - P. D158-D169.

138. Waley, S. G. The kinetics of slow-binding and slow, tight-binding inhibition: the effects of substrate depletion / Waley S. G. // Biochemical Journal. - 1993. - V. 294. № 1. - P. 195-200.

139. Wei, J.- C. Trace determination of carbamate pesticides in medicinal plants by a fluorescent technique / Wei J.- C., Wei B., Yang W., He C.- W., Su H.- X., Wan J.- B., [et al.] // Food and Chemical Toxicology. - 2018. -V. 119. - P. 430-437.

140. Wessler, I. Acetylcholine beyond neurons: the non-neuronal cholinergic system in humans / Wessler I., Kirkpatrick C. J. // Br J Pharmacol. -2008. - V. 154. № 8. - P. 1558-1571.

141. Whiteley, C. G. Enzyme kinetics: partial and complete uncompetitive inhibition / Whiteley C. G. // Biochemical Education. - 2000. - V. 28. № 3. - p. 144-147.

142. Wickham, H. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis: New York / Wickham H. // Springer-Verlag. - 2016. - 221 p.

143. Wilson, I. B. The active surface of the serum esterase / Wilson I. B. // Journal of Biological Chemistry. - 1954. - V. 208. № 1. - P. 123-132.

144. Worek, F. Determination of acetylcholinesterase activity by the Ellman assay: A versatile tool for in vitro research on medical counter-measures against organophosphate poisoning: Acetylcholinesterase assays for in vitro OP antidote research / Worek F., Eyer P., Thiermann H. // Drug Test. Analysis. - 2012. - V. 4. № 3-4. - P. 282-291.

145. Worek, F. Improved determination of acetylcholinesterase activity in human whole blood / Worek F., Mast U., Kiderlen D., Diepold C., Eyer P. // Clin Chim Acta. - 1999. - V. 288. № 1-2. - P. 73-90.

146. Xu, Y. L. Cholinesterases and Engineered Mutants for the Detection of Organophosphorus Pesticide Residues / Xu Y.- L., Li F.- Y., Ndikuryayo F., Yang W.- C., Wang H.- M. // Sensors (Basel). - 2018. - V. 18. № 12. -№ 4281.

147. Yi, L. A Highly Sensitive Fluorescence Probe for Fast Thiol-Quantification Assay of Glutathione Reductase / Yi L., Li H., Sun L., Liu L., Zhang C., Xi Z. // Angewandte Chemie International Edition. - 2009. -V. 48. № 22. - P. 4034-4037.

148. Yoshino, M. A graphical method for determining inhibition parameters for partial and complete inhibitors. / Yoshino M. // Biochem J. - 1987. - V.248. № 3. - P. 815-820.

149. Zhang, H. Recent advance on carbamate-based cholinesterase inhibitors as potential multifunctional agents against Alzheimer's disease / Zhang H., Wang Y., Wang Y., Li X., Wang S., Wang Z. // Eur J Med Chem. -2022. - V. 240. - №114606.

150. Zhang, Y. Role of the Catalytic Triad and Oxyanion Hole in Acetylcholinesterase Catalysis: An ab initio QM/MM Study/ Zhang Y., Kua J.,

McCammon J. A // J. Am. Chem. Soc. - 2002. - V.124. № 35. - P. 1057210577.

151. Zhou, G. Aspirin Hydrolysis in Plasma Is a Variable Function of Bu-tyrylcholinesterase and Platelet-activating Factor Acetylhydrolase 1b2 (PAFAH1b2) / Zhou G., Marathe G. K., Hartiala J., Hazen S. L., Allayee

H., Tang W. H. W., [et al.] // J Biol Chem. - 2013. - V.288. № 17. - P. 11940-11948.

152. Zhu, G.D. Genetic Testing for BCHE Variants Identifies Patients at Risk of Prolonged Neuromuscular Blockade in Response to Succinylcholine / Zhu G.D., Dawson E., Huskey A., Gordon R.J., Del Tredici A.L. // Phar-mgenomics Pers Med. - 2020. - V.30. №13. P. 405-414.

153. Zueva, I. New evidence for dual binding site inhibitors of acetylcholinesterase as improved drugs for treatment of Alzheimer's disease / Zueva

I., Dias J., Lushchekina S., Semenov V., Mukhamedyarov M., Pashirova T., Babaev V., Nachon F., Petrova N., Nurullin L., Zakharova L., Ilyin V., Masson P., Petrov K. // Neuropharmacology. - 2019. - V.155. - P.131-141.

Определение концентрации активных центров холинэстераз [Бо] На рисунке 1 представлен график зависимости активности ИАХЭ от концентрации эхотиофата (в %).

О.ООЕ+ООО 1.00Е-012 2.00Е-012 3.00Е-012 4.00Е-012 5.00Е-012

Концентрация эхотиофата (моль)

Рисунок 1 - Концентрация активных центров ИАХЭ в 1мл реакционной смеси (г2 = 0,995). Финальная концентрация стокового раствора с учетом разведения фермента равнялась 5-10"4 М

На рисунке 2 представлен график зависимости активности ИБХЭ от концентрации эхотиофата (в %).

Рисунок 2 - Концентрация активных центров ИБХЭ в 1мл реакционной смеси (г2 = 0,998). Финальная концентрация стокового раствора с учетом разведения фермента равнялась 1,4840"6 М

Приложение 2

2.1 Стационарная кинетика для определения каталитических констант ацетилтиохолина и бутирилтиохолина

Константы KM и b были определены путём стационарной кинетики для АТХ, катализируемого ИАХЭ, и БТХ, катализируемого ИБХЭ (Рисунок 1). Гидролиз субстратов проводился в 0,1М фосфатном буфере при 250С (при оптимальном значении pH). Константы для АТХ и БТХ были рассчитаны по уравнению Радича (5). Средние рассчитанные константы по трём повторным измерениям при содержании в кювете ИАХЭ [E0] = 1,1 • 10-9 M и ИБХЭ [E0] = 7,4-10-9 M (Рисунок 1) составили:

• Km (атх) = 0,191 ± 0,05 мМ, Kss= 1 ± 0,05 мМ, b atx = 0,3 ± 0,09;

• Km (бтх) = 0,021 ± 0,004 мМ, Kss= 1,3 ± 0,2 мМ, b бтх = 2,4 ± 0,4.

[Ацетиптиохопин|, (микроМ) [Бутирилтиохолин]. (микроМ)

Рисунок 1 - Гидролиз положительно заряженных субстратов: А гидролиз АТХ с ИАХЭ при рН - 8,0; Б - гидролиз БТХ с ИБХЭ при рН - 7,0

Полученные данные согласуются с источниками литературы [Johnson и др., 2003; Masson и др., 2007].

0.15

Концентрация активных центров /?БХЭ (М)

Рисунок 2 - Определение чувствительности метода Эллмана при гидролизе 1 мМ бутирилтиохолина (БТХ), катализируемый hБХЭ, г2=0,997. Эксперимент выполняли в 3 повторах

2.2 Стационарная кинетика для определения каталитических констант

фенилацетата

Из-за отсутствия в литературных данных значений константы КМ ФА для ИАХЭ и ИБХЭ при условиях 0,1М фосфатного буфера рН 7,00, 5% метанола была проведена кинетика устойчивого состояния. ФА нейтральный заряженный субстрат подчиняется модели Михаэлиса-Ментен (2). Средние рассчитанные константы по трём повторным измерениям при содержании в кювете ИАХЭ [Ео] = 110-9 М и ИБХЭ [Ео] = 5,95-10-7 М (Рисунок 2) составили:

• Для ИАХЭ Км (фа) = 1,6 ± 0,15 мМ, ко* (фа) = 78 000 ± 4000 мин-1;

• Для ИБХЭ Км (фа) = 4,36 ± 0,6 мМ, kcat (фа) = 21 000 ± 1000 мин-1.

Рисунок 3 - Гидролиз фенилацетата, катализируемого А - ИАХЭ, Б - ИБХЭ

3.1 Определение константы Михаэлиса (Кв или КА линейной аппроксимацией из соотношения V)) / Vi • Определение Кв

Числитель и знаменатель правой части исходного уравнения 16А

умножили на

Ка.

№

V,-

1+1^1 ( -^+1

Ш

«А

(1+Щ

Ка Кб (1+кА+кв)[А] [А] + 1+кв[А]

«А

'[А] _ _[А\

Для линеаризации перевернули дробь:

1+-^ +

Ка I КА[В]

Уо=^_[А] 1 КВ[А] VI

Ка

1 + [А]

Уо( кА\ КА — \1 + — ) = 1 + — + VI ( [А]) [Л]

Ка , КА[В] КВ[А]

Важно учитывать, что у = + поэтому КА должно быть известно.

Угол наклона прямой равен: наклон = . На рисунке 1 показан функциональный смысл уравнения линейной аппроксимации.

Рисунок 1- Схема вычисления Кв через линейную аппроксимацию

• Определение Ка

Для определения К а уравнение 17 разделили на сумму двух дробей с

одним знаменателем:

1+Щ+Ш

КА «В

Ш

«А

[В]

1+Ш Ш

Vо Кд Ко Кп

— =-— +---— = 1+---— = 1 +

V, . .[А] \ЛА] [А] 1 +

(17) [В]

= 1+-

[В]

1+^- 1+1Т = 1 +

1+И

к +ЩКв КВКА , [А]КВ

Кй + к,

[В]КА

КВКА + [А]КВ

Отсюда у = ^0, угол наклона прямой равен: наклон = к +щк при известном Кв можно определить КА и наоборот (Рисунок 2)

кА

(17.1) и

Рисунок 2 - Схема вычисления КА через линейную аппроксимацию

3.2 Расчёт константы Михаэлиса о-нитротрифторацетанилида для бутирилхолинэстеразы человека при конкуренции с фенилацетатом

Из-за отсутствия в литературе значения KM для субстрата о-НФА, мы определили Ко-НФА с помощью уравнения 16А и 17. По данным литературы Ко-НФА > 3 мМ [Masson & а1., 2007]. По кривым прогресса полного гидролиза 2 мМ о-НФА в присутствии различных концентраций ФА определили начальную скорость всех концентраций (Таблица 1).

Таблица 1 - Отношения скоростей для установления Kо-НФА

[Б] = ФА, мМ VI

(У0) 0 0,00157 1 1

0,25 0,00146 0,929936 1,075342

0,5 0,00138 0,878981 1,137681

1 0,00133 0,847134 1,180451

2 0,00116 0,738854 1,353448

3 0,00107 0,681529 1,46729

5 0,00082 0,522293 1,914634

Согласно уравнениям, для расчёта неизвестного КА необходимо знать КВ. КФА= 4,36 ± 0,6 мМ, определенная нами (см. Приложение 2.2). По нелинейной аппроксимации константа Kо-НФА = 6,75 ± 1,6 мМ, по линейной аппроксимации константа Kо-НФА = 6,05 ± 0,5 мМ (Рисунок 3).

|Ф»нипацегат|. мМ

Рисунок 3 - Определение значения Ко-НФА по кинетическим параметрам

ФА для ИБХЭ. А - по уравнению 16А, г2=0,98; Б - по уравнению 17, г2=0,985

г2—(

(коэффициент наклона = 0,17234)

4.1 Линии прогресса сигмоидальной формы при Я»!

Рисунок 1 - Анализ кинетики реакции гидролиза 0,025 мМ бензоилтиохолина (БзТХ), катализируемого ИБХЭ, в присутствии различных концентраций бензоилхолина (БзХ) в 0,1М фосфатном буфере рН 7,0 при 250С. Эксперимент выполняли в 5 повторах

Время(мин)

Рисунок 2 - Анализ кинетики реакции гидролиза 2 мМ

о-нитротрифторацетанилида (о-НФА), катализируемого ЯБХЭ, в присутствии

различных концентраций бутирилтиохолина (БТХ) в 0,06М Трис буфере рН

8,0 при 250С. Эксперимент выполняли в 3 повторах

161

Время (мин)

Рисунок 3 - Анализ кинетики реакции гидролиза 2мМ о-нитротрифторацетанилида (о-НФА), катализируемого ЯБХЭ, в присутствии различных концентраций бутирилхолина (БХ) в 0,06М Трис буфере рН 8,0 при 250С. Эксперимент выполняли в 3 повторах

Рисунок 4 - Определение значения Кбх и Кбтх по кинетическим параметрам репортерного субстрата при гидролизе 2 мМ о-нитротрифторацетанилида для ИБХЭ при различных концентрациях «невидимого» субстрата: для А - бутирилхолина, для Б - бутирилтиохолина, данные соответствуют конкуренции из рисунков 2 и 3

Рисунок 5 - Анализ кинетики реакции гидролиза 0,5 мМ 3-(ацетамидо)-Ы,К,К-триметиланилида (АТМА) в присутствии различных концентраций ацетилхолина (АХ) в 0,1М фосфатном буфере (рН 8,0 или 7,0) и 250С при низкой концентрации фермента: А - для МХЭ 1,67-10-8 М, Б - для ИБХЭ 0,640-8 М, соответственно. Каждый эксперимент выполняли в 3 повторах

4.2 Линии прогресса гиперболической формы при R~1

Рисунок 6 - Анализ кинетики реакции гидролиза 2 мМ о-нитротрифторацетанилида (о-НФА), катализируемого ИБХЭ, в присутствии различных концентраций фенилацетата (ФА) в 0,1М фосфатном буфере рН 7,0 при 250С, концентрация метанола 5%. Эксперимент выполняли в 3 повторах

Рисунок 7 - Анализ кинетики реакции гидролиза 0,25 мМ ацетилтиохолина (АТХ), катализируемого ИАХЭ, в присутствии различных концентраций ацетилхолина (АХ) в 0,1М фосфатном буфере рН 8,0 при 250С. Эксперимент выполняли в 3 повторах

4.3 Линии прогресса гиперболической формы при Я«1

Время (мин)

Рисунок 8 - Анализ кинетики реакции гидролиза 0,025 мМ бутирилтиохолина (БТХ), катализируемого ИБХЭ, в присутствии различных концентраций бутирилхолина (БХ) в 0,1М фосфатном буфере рН 7,0 при 250С. Эксперимент выполняли в 3 повторах

Время

Рисунок 9 - Анализ кинетики реакции гидролиза 0,025 мМ бензоилтиохолина (БзТХ), катализируемого ИБХЭ, в присутствии различных концентраций фенилацетата (ФА) в 0,1М фосфатном буфере рН 7,0 при 250С. Эксперимент выполняли в 6 повторах

[Фенилацетат].

Рисунок 10 - Определение значения КФА по кинетическим параметрам бензоилтиохолина в присутствии различных концентраций фенилацетата в двухсубстратной системе фенилацетат / безоилтиохолин при гидролизе 0,025мМ бензоилтиохолина под воздействием фермента ИБХЭ, г2=0,997. Данные соответствуют конкуренции из рисунка 9

4.4 Линии прогресса гиперболической формы при конкуренции субстрата 3-(ацетамидо)-Ы, К, К-триметиланилида с обратимыми

ингибиторами

1.0-

0 9-

0 8-

0.7-

0 6-

> 0.5-

—

> 0.4-

0.3-

0.2-

0 1-

0.0-

0 1 2 3 4 5

[Холин], мМ

Рисунок 11 - Определение значения К; холина по кинетическим параметрам репортерного субстрата при гидролизе 0,5 мМ 3-(ацетамидо)-Ы,К,К-триметиланилида в присутствии различных концентраций холина для ИБХЭ, г2=0,822; данные соответствуют конкуренции из Рисунка 33 Б главы 3.2.2.3 А Б

- 09-1-

Время (мин) Время (мин)

Рисунок 12 - Анализ кинетики реакции гидролиза 0,5 мМ 3-(ацетамидо)-К,К,К-триметиланилида (АТМА) в присутствии различных концентраций тетраметиламмония (ТМА) в 0,1М фосфатном буфере (рН 8,0 или 7,0) при 250С: А - для ИАХЭ, Б - для ИБХЭ, соответственно. Каждый эксперимент выполняли в 2 повторах

Рисунок 13 - Анализ кинетики реакции гидролиза 0,5 мМ 3-(ацетамидо)-Ы,К,К-триметиланилида (АТМА) в присутствии различных концентраций пропидия в 0,1М фосфатном буфере ( рН 8,0 или 7,0) при 250С: А - для ИАХЭ, Б - для ЯБХЭ, соответственно. Каждый эксперимент выполняли в 2 повторах

Рисунок 14 - Определение значения К; тетраметиламмония по кинетическим параметрам репортерного субстрата 3-(ацетамидо)-Ы,К,К-триметиланилида для: А - МХЭ, г2=0,826; Б - ИБХЭ, г2=0,978; данные соответствуют конкуренции из рисунка 12

(Пролидий), микроМ (Пропидий]. микроМ

Рисунок 15 - Определение значения К пропидия по кинетическим параметрам репортерного субстрата 3-(ацетамидо)-Ы,К,К-триметиланилида для: А - МХЭ, г2=0,982 Б - ЯБХЭ, г2= 0,948; данные соответствуют конкуренции из рисунка 13

Экспериментальное определение параметра Я Кривые прогресса были аппроксимированы сигмоидальной бимодальной функцией (функция ЫБовеЯевр в OrigmPro9), так как определение точек перегиба по второй производной было невозможным из-за шума. Функции для нахождения точек перегиба (ъ.р.) были выведены аналитически. При помощи вычисленных значений были рассчитаны значения поглощений при ъ.р. (Рисунок 1). Полученные значения (Таблица 1) были очень близки к максимумам первых производных необработанных экспериментальных данных, поэтому мы посчитали использование подгоночной функции надежным. Данные представлены для пары БХ / БзТХ, катализируемых ИБХЭ.

Время

Рисунок 1 - Определение оптической плотности по значениям ъ.р. согласно кривым прогресса гидролиза бензоилтиохолина (БзТХ), катализируемого ^БХЭ, в присутствии высоких концентраций бутирилхолина БХ в 0,1М фосфатном буфере рН 7,00 при 250С

Таблица 1 - Полученные параметры для определения константы Я пары бутирилхолин/бензоилтиохолин для уравнений 18 и 19

Концентрация бутирилхолина (мМ) Т ьр. (мин) ДТ 1.р. (т 1.р. - то) (мин) [Лир] [Ло] [Л0-Л;.р] ! ла1.Р. Ао

0,25 12,2 5,8 0,225 0,3625 0,1375 0,62

0,5 14,5 8,15 0,222 0,3625 0,1425 0,61

1 14,7 8,3 0,228 0,3625 0,1345 0,63

2 20,9 14,2 0,235 0,3625 0,1275 0,65

3 22,5 15,7 0,24 0,3625 0,1225 0,66

4 26,2 19,4 0,24 0,3625 0,1195 0,67

5 30,4 23,5 0,243 0,3625 0,1195 0,67

6 32,9 25,9 0,245 0,3625 0,1175 0,68

Рисунок 2 - Графики зависимости А - ъ.р.; Б - Дъ.р. от концентрации бутирилхолина, как конкурирующего субстрата ИБХЭ, при гидролизе 0,025мМ бензоилтиохолина. Были получены следующие значения линейной аппроксимации для Б: наклон=3,45, у-пересечение=5,74 (константа R=1,6)

Согласно данным из таблицы 1, зависимость точек перегиба от концентраций БХ линейна (Рисунок 2). Для определения Я использовали график зависимости Аъ.р. от концентрации слепого конкурирующего субстрата (Рисунок 2Б). По формуле 19, следует что:

наклон = — (19А)

х — пересечение =

у — пересечение =

(Я-1) 1

(19Б) (19В)

По логарифмическому уравнению (18) также рассчитали константу Я (Рисунок 3).

Рисунок 3 - Логарифмический график, определенный по уравнению 18 (Я=3,8)

Методы определения типа ингибирования

Рисунок 1 - Графические методы определения типа ингибирования и константы К! при гидролизе бутирилтиохолина в присутствии бутирилхолина, катализируемого ЯБХЭ. На графиках представлен конкурентный тип ингибирования. Параметр К! (БХ)=0,12 мМ, определенный по графику Диксона и Лайнуивера-Бёрка

Рисунок 2 - Графические методы определения типа ингибирования и константы К при гидролизе 3-(ацетамидо)-Ы,К,К-триметиланилида в присутствии холина, катализируемого МХЭ. На графиках представлен конкурентный тип ингибирования. Параметр К1(холина)=3,24 ± 0,4 мМ, определенный по графику Диксона и Лайнуивера-Бёрка

Рисунок 3 - Графические методы определения типа ингибирования и константы К при для гидролиза фенилацетата в присутствии низких концентраций ацетилхолина, катализируемых ИАХЭ (А, В) и ИБХЭ (Б, Г). На графиках представлен конкурентный тип ингибирования. Место пересечение аппроксимированных линий равняется значению К по модулю

150-

о

5 юо Ч

50-

1

8

10

[Ацетилтиохолин],

Рисунок 4 - График зависимости значений коэффициентов наклона, полученных из графика Лайниувера-Бёрка, от концентрации ацетилтиохолина. Функции аппрокисмироаны по уранению, описанного ниже, г2 =0,963

[Л2

^м

V,

шах

(1+№+

-)

^'^ф

а+Щ+ ^]2 )

Ф

Рисунок 5 - Установление константы Kip ацетилтиохолина по уравнению 25 (п 3.4) согласно линейной аппроксимации. А - для ИАХЭ, связывание с ПАС не происходит, поэтому Kip определить невозможно. Б -для ИБХЭ, линейная аппроксимация от 2 до 10 мМ ацетилтиохолина при Y=10,2 Kip составило 0,9 мМ (у-перехват=116, коэффициент наклона=12,6) г2=0,972

Рисунок 1 - Соединения, используемые в качестве лигандов АХЭ и БХЭ, при проведении молекулярного докинга

Рисунок 2 - Флуктуация атомов (RMSF) аминокислотных остатков модели для А - МХЭ, Б - ЯБХЭ

Рисунок 3 - Стабилизирующая молекулярная динамика (25 нс) для предсказанных структур АХЭ и БХЭ человека. На рисунке последовательно представлены: среднее квадратичное отклонение атомов модели (RMSD), количество аминокислотных остатков на карте Рамачандрана