Структурные исследования человеческого цистеинил-лейкотриенового рецептора второго типа для создания новых лекарственных препаратов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Гусач Анастасия Юрьевна

• Гусач Анастасия Юрьевна
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Гусач Анастасия Юрьевна

Сокращения и аббревиатуры

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность нахождения структурной информации для человеческого CysLT2 рецептора для создания новых антагонистов

Основные цели и задачи исследования

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

Объем и структура диссертации

1. ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Основные фазы создания нового лекарства:

1.2. Методы поиска новых лекарств:

1.2.1. Фенотипический подход и подход с использованием конкретного белка-мишени

1.2.2. Полифармакология и комбинированные подходы

1.3. Рациональная разработка лекарств c использованием белка-мишени (target-based): начальные этапы

1.3.1. Выбор биологической мишени и ее валидация:

1.3.2. Скрининг кандидатов в лекарства и выбор хитов:

1.3.3. Выбор хитов

1.3.4. Улучшение хитов и выбор лидирующих соединений (стадия hit-to-lead)

1.3.5. Оптимизация лидирующих соединений (lead optimization)

1.4. Роль структурной биологии в создании лекарств

1.5. Рентгеновская кристаллография в создании лекарств:

1.6. Серийная рентгеновская кристаллография и использование лазеров на свободных электронах (XFEL) для сложных мишеней драг-дизайна

1.7. Рецепторы, сопряженные с G-белком как мишени лекарств

1.7.1. Введение

1.7.2. Активация клеточного ответа

1.7.3. Модуляция активности GPCR и классификация лигандов

1.7.4. Терапевтическая важность

1.8. Получение структур GPCR методом рентгеновской кристаллографии и их использование в процессе рационального поиска лекарств

1.8.1. Другие методы структурных исследований рецепторов, сопряженных с G-

белком

1.9. СуБЬТ2 рецептор класса ОРСЯ как мишень лекарств

1.9.1. Лейкотриены

1.9.2. Лейкотриеновые рецепторы

1.9.3. Характеризация человеческого СувЬТ2 рецептора

1.9.4. Экспрессия СуБЬТ2Я в организме

1.9.5. Сигнальные каскады СуБЬТ2 рецептора

1.9.6. Полиморфизмы и мутации СуБЬТ2 рецептора и их роль в патологиях

1.9.7. Опосредованное взаимодействие с другими рецепторами

1.9.8. Роль цистеиниловых лейкотриенов и СуБЬТ2 рецептора в развитии заболеваний

1.10. Поиск лигандов цистеинил лейкотриеновых рецепторов без информации об их структуре: антиастматические препараты

1.10.1. Медленно-реагирующая субстанция анафилаксии как средство скрининга

1.10.2. Постановка экспериментов с синтетическими лейкотриенами и единичными рецепторами

1.10.3. Общие подходы к разработке первых антагонистов действия цистеиниловых лейкотриенов

1.10.4. Создание антагонистов цистеинил лейкотриеновых рецепторов зафирлукаста, монтелукаста и пранлукаста

1.10.5. Создание двойных СуБЬТ1/СуБЬТ2 лигандов

2. ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.2. Методы

2.2.1. Создание праймеров

2.2.2. Полимеразная цепная реакция

2.2.3. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле

2.2.4. Выделение и очистка ДНК из агарозного геля

2.2.5. Определение концентрации ДНК или белка в растворе, оптической плотности клеток на длине волны 600 nm с помощью спектрофотометра IMPLEN

2.2.6. Выделение плазмидной ДНК клеток Exoli

2.2.7. Рестрикция

2.2.8. Рестрикция DpnI

2.2.9. Лигирование

2.2.10. Секвенирование ДНК

2.2.11. Трансформация

2.2.12. Выделение бакмиды

2.2.13. Трансфекция клеток насекомых Sf9

2.2.14. Культивирование клеток Sf9

2.2.15. Определение процентной доли живых клеток Sf9 и их концентрации

2.2.16. Определение жизнеспособности клеток Sf9

2.2.17. Определение заражающего титра вируса

2.2.18. Характеризация вируса определением процента GP64-положительных клеток

2.2.19. Инфицирование Sf9 вирусом и наработка белка и вируса

2.2.20. Определение уровня поверхностной экспрессии белка в клетках Spodoptera frugiperda Sf9 методом проточной цитометрии

2.2.21. Солюбилизация белка GPCR

2.2.22. Очистка белка

2.2.23. Денатурирующий электрофорез белков в ДСН-ПААГ

2.2.24. Вестерн-Блоттинг и дот-блоттинг

2.2.25. Анализ термостабильности белка методом дифференциальной сканирующей флуориметрии

2.2.26. Анализ монодисперсности белка методом гель-фильтрации

2.2.27. Кристаллизация белка в липидной кубической фазе

2.2.28. Исследования диффузии белка в липидной кубической фазе методом FRAP

2.2.29. Извлечение кристаллов из липидной кубической фазы

2.2.30. Измерения дифракции кристаллов методом рентгеновской дифракции

2.2.31. Обработка данных дифракции

2.2.32. Функциональные тесты в клетках млекопитающих HEK293

2.2.33. Определение поверхностной экспрессии в клетках млекопитающих HEK293 методом ELISA

3. ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Дизайн первого раунда конструкций

3.2. Выбор системы экспрессии

3.3. Создание первого раунда генно-инженерных конструкций

3.4. Подбор условий экспрессии рецептора в клетках насекомых Sf9

3.5. Подбор условий солюбилизации и очистки белка

3.6. Сравнительный анализ первичных конструкций

3.7. Создание и скрининг конструкций с различными партнерными белками

3.8. Экспрессия и очистка конструкций с точечными мутациями

3.9. Оптимизация экспрессии конструкций с точечными мутациями

3.10. Комбинирование точечных мутаций (по 2, 3 и 4)

3.11. Сравнительный анализ стабильности белка в присутствии различных лигандов

3.12. Анализ диффузии в липидной кубической фазе конструкций, полученных в 3 раунде оптимизации

3.13. Повышение выхода белка за счет варьирования длины N-конца

3.14. Кристаллизация рецептора в комплексе с лигандом L в липидной кубической фазе

3.15. Оптимизация кристаллов

3.16. Кристаллизация рецептора в комплексе с лигандами O и S

3.17. Получение данных дифракции и уточнение структур

3.18. Общие свойства структуры CysLT2 рецептора в комплексе с антагонистами:

3.19. Создание мутантов для функциональных тестов в клетках млекопитающих

3.20. Анализ положения аминокислот, находящихся в консервативных позициях и сравнение CysLT1R и CysLT2R

3.21. Анализ лиганд-связывающего кармана

3.22. Анализ селективности рецепторов CysLT1R и CysLT2R к различных синтетическим антагонистам

3.23. Структурный анализ встречающихся в природе полиморфизмов CysLT2 рецептора и мутаций, приводящих к различным заболеваниям

ГЛАВА 4. ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ РАБОТЫ

ОПУБЛИКОВАННЫЕ РАБОТЫ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

БЛАГОДАРНОСТИ

Сокращения и аббревиатуры

7AAD - 7-амино актиномицин D

ADME - "absorption, distribution, metabolism, and excretion", поглощение, распределение, метаболизм и выведение - ключевые свойства которые тестируют для всех разрабатываемых лекарств

ATRA - all-trans retinoic acid, полностью транс-ретиноевая кислота, третионин BLT - дигидрокси-лейкотриен

BRIL - термостабилизированный цитохром b562 RIL CHS - холестерил хемисукцинат СysLT - цистеиниловые лейкотриены

CysLT1R, CysLT2R - цистеинил лейкотриеновые рецепторы 1 и 2, соответственно DDM- n-Dodecyl P-D-maltoside, детергент n-додецил бета D-мальтозид FDA - Food and Drug Administration, управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США

E.coli - Escherichia СвИ. Популярная система бактериальной экспрессии

GPCR - G-Protein Coupled Receptor, рецептор, сопряженный с G-белком

G-protein, G-белок - гуанозин нуклеотид-связывающий белок

Ig - иммуноглобулин

IP1 - Инозитол монофосфат

IP3 - Инозитол-1,4,5-трифосфат

iPS - induced pluripotent stem cells, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки IUPHAR - International Union of Basic and Clinical Pharmacology, международный союз фундаментальной и клинической фармакологии

LTA4, LTB4, LTC4, LTD4, LTE4, LTF4, LTG4 -лейкотриены A4, B4, C4, D4, E4, F4, G4, соответственно

ORF - open reading frame, открытая рамка считывания PDD - phenotypic drug discovery PGH2 - простогландин H2

RPM - revolutions per minute, оборотов в минуту

SBDD - structure-based drug design, создание лекарств, с использованием структурной информации

SAR - structure-activity relationship, соотношение структура-свойство

SNP - single nucleotide polimorphysm, ОНП, однонуклеотидный полиморфизм

SNV - single nucleotide variant, однонуклеотидная замена

TEMED (ТЕМЕД) - N,N,N',N' - тетраметилэтилендиамин

XFEL - X-Ray Free Electron Laser, рентгеновский лазер на свободных электронах

АТФ - аденозинтрифосфат

ГДФ - гуанозиндифосфат

ГТФ - гуанозинтрифосфат

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДСН - додецилсульфат натрия

ДСН ПААГ - додецилсульфат натриевый полиакриламидный гель

ДСФ - дифференциальная сканирующая флуориметрия

ИПТГ - изопропил-Р-О-тиогалактопиранозид

ЛКФ - липидная кубическая фаза

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

НПВС - нестероидные противовоспалительные средства

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурные исследования человеческого цистеинил-лейкотриенового рецептора второго типа для создания новых лекарственных препаратов»

ВВЕДЕНИЕ

Создание лекарств часто ассоциируется с состязанием больших игроков - фармацевтических компаний, располагающих огромными ресурсами и закрытыми технологиями. Это подкрепляется данными о миллиардных затратах на выведение на рынок препаратов, неизбежных при современных требованиях к их безопасности и стандартах клинических испытаний. При этом история большинства лекарств обычно начинается с экспериментов ученых в лабораториях, с эмпирических наблюдений, построения и валидации моделей болезней. Как и в начале 20 века в примере с Флемингом и пенициллином, до сих пор большинство идей для новых препаратов приходят из академической среды.

Идентификация мишени будущего лекарства и установление механизма действия кандидатов в лекарства - наименее финансово затратные шаги в долгом процессе [1]. Тем не менее, часто именно они определяют успех кандидата на более поздних стадиях [1]. Только малая доля кандидатов проходит все стадии, и цена ошибки растет на каждом этапе. К тому же даже при относительно небольшой стоимости валидации одной мишени, умножение этой стоимости на их количество может вызвать у компаний большие затраты на стадиях исследования и разработки. Любые способы сокращения этих затрат имеют огромное практическое значение, к примеру, обращение к опубликованным результатам научных групп о белках-мишенях и использование новых научных методов для поиска малых молекул и их скрининга.

Рентгеновская кристаллография белков, возникшая в 20 веке - один из таких методов, появившийся на стыке физики и биологии. Развитие биологических методик клонирования, экспрессии белков и кристаллизации позволило получать кристаллы достаточного размера, а развитие физики ускорителей, технических характеристик детекторов и методов доставки образцов - снимать данные дифракции и строить модели биологических молекул [2].

С появлением возможности использовать структурную информацию о мишенях для поиска новых кандидатов в лекарства методами докинга и виртуального скрининга, многие фармацевтические компании стали отдавать предпочтение компьютерным методам поиска кандидатов в лекарства на первых этапах драг-дизайна [3,4]. Это существенно сокращает затраты на лабораторные эксперименты и расширяет количество веществ, доступ-

ных для рассмотрения. Для более точного виртуального скрининга как раз и нужны структуры высокого разрешения, получаемые методом рентгеновской дифракции. За более чем полувековую историю белковой кристаллографии разработано большое количество методов кристаллизации и получены структуры очень многих белков, особенно это касается водорастворимых ферментов, сигнальных, структурных белков. Мембранные же белки, особенно клеточные рецепторы, должное время были и остаются самыми сложными мишенями для кристаллизации в силу их низкой стабильности, конформационной подвижности и ам-фифильной природы [5].

Самым большим семейством мембранных белков в организме человека являются рецепторы, сопряженные с G-белком [6]. Активируясь внешними сигнальными молекулами, такими как различные гормоны, феромоны, липиды, нейромедиаторы и другие, они передают информацию о события связывания внутрь клетки путем активации сигнальных каскадов реакций. Сбои в работе сигнальных систем GPCR приводят к многочисленным патологиям [7].

Из-за своей исключительной роли в организме, а также способности малых молекул влиять на вызываемый ими клеточный ответ, GPCR оказались очень удачными кандидатами в мишени для терапии. Почти 40% всех лекарств направлены на представителей этого класса рецепторов [7]. Тем более долгожданными были их структуры высокого разрешения для использования в качестве основы виртуального скрининга кандидатов в лекарства. Но даже после публикации в 2000 году первой структуры бычьего родопсина [8], значительный технический прогресс потребовался для разработки методов стабилизации и кристаллизации GPCR. Использование партнерных белков-драйверов кристаллизации и ли-пидной кубической фазы в качестве носителя для кристаллизации было прорывом во всей области и вылилось в структуру в2-адренергического рецептора в 2007 году [9]. Каждый последующий год количество структур росло и сейчас их уже насчитывается более 300, представляющих около 70 уникальных рецепторов (https: //gpcrdb.org/structure/statistics).

Актуальность нахождения структурной информации для человеческого CysLT2 рецептора для создания новых антагонистов

На середину 2019 года структуры высокого разрешения получены менее, чем для 10% от всех человеческих ОРСЯ, и все еще не удается построить достоверную модель ли-ганд-связывающего кармана для каждого нового из них по гомологии, поэтому задача нахождения новых структур этого класса рецепторов была и остается очень актуальной [10].

На начальном этапе структурных исследований ОРСЯ внимание ученых было сфокусировано на хорошо изученных фармакологами мишенях с большим количеством уже существующих лигандов и лекарств. Затем фокус стал смешаться в сторону малоизученных рецепторов с перспективами создания новых синтетических лигандов. Особенно актуальны структуры недавно открытых рецепторов, для которых показана их роль в болезнях, но не существует лекарств, ориентированных на них [11].

Одним из таких рецепторов является цистеинил лейкотриеновый рецептор второго типа (СувЬТ2Я), впервые клонированный в 2000 году [12]. СуБЬТ2Я вместе с ближайшим гомологом СуБЬТ^ отвечают за взаимодействие с цистеиниловыми лейкотриенами ЬТС4, ЬТБ4 и ЬТБ4 - липидными медиаторами воспаления, производными арахидоновой кислоты [13].

СуБЬТ^ имеет несколько селективных антагонистов - зафирлукаст, пранлукаст и монтелукаст, которые были одобрены в качестве антиастматических препаратов [14]. Однако оказывается, что часть пациентов не реагирует на эту терапию [15]. У двух подтипов рецепторов наблюдаются различные профили экспрессии, распределение в тканях и чувствительность к эндогенным лигандам [16,17]. Вместе с этим гетеродимери-зация и перекрестная регуляция, а также распространенность ассоциированных с астмой полиморфизмов в CysLT2R предполагают различную роль для каждого из подтипов СуБ-ЬТЯ в физиологии и патологии [ 18-20]. На основании модели астмы у животных, вызванной воздействием ЬТС4, было предложено, что СуБЬТ2Я-селективные или двойные Су8ЬТ1Я/Су8ЬТ2Я антагонисты могут улучшить лечение тяжелых случаев астмы [21]. Кроме того, избирательное ингибирование CysLT2R, преимущественно экспрессируемого в сердечно-сосудистой и мозговой тканях, показало позитивный эффект при ишемических

состояниях и острых повреждениях головного мозга [22]. Разработка более эффективных методов лечения астмы и связанных с ней заболеваний затрудняется отсутствием специальных знаний о селективности и функциональных механизмах CysLTR, что требует структурных данных высокого разрешения.

Основные цели и задачи исследования

Первоначальной и основной целью данной диссертационной работы было установление пространственной структуры высокого разрешения человеческого цистеинил лей-котриенового рецептора второго типа. Эта работа вместе с работой по исследованию CysLT1 рецептора является первым примером полного структурного исследования GPCR рецептора от клонирования и до анализа структуры как в нашей лаборатории, так и в России. Поэтому параллельно стояла задача отладки всех стадий процесса и методов, никогда до этого не используемых в научной группе, таких как оптимизация экспрессии в клеточной линии насекомых, подбор условий солюбилизации и очистки белка, оптимизация кристаллизационных условий, разработка алгоритма предсказания стабилизирующих мутаций, скрининга лигандов, снятия данных дифракции методом слияния частичных наборов данных для получения структур максимального разрешения. После получения структур стало ясно, что задача расширилась до составления модели взаимодействия лигандов с цистеинил лейкотриеновыми рецепторами, подтвержденной большим количеством данных функциональных тестов in vivo и in vitro. Особый интерес появился к аспектам, связанным с созданием лекарств, ориентированных на данный рецептор, поэтому большая часть литературного обзора посвящена процессу драг-дизайна. Опубликованные в 2016 году данные [23] об участии мутантного рецептора в патогенезе увеальной меланомы вылились в задачу объяснения эффекта этой мутации из структуры, далее идея была расширена все известные из литературы болезнетворные мутации.

Научная новизна

В работе впервые отработана экспрессия человеческого цистеинил лейкотриено-вого рецептора в клетках насекомых Sf9, исследованы и оптимизированы условия экспрессии. Для стабилизации белка и потенциального создания кристаллизационных контактов

созданы химерные конструкции с различными партнерными белками - драйверами кристаллизации. Произведена экспрессия в Sf9 и далее очистка и скрининг всех вариантов. Охарактеризованы биофизические свойства: стабильность, гомогенность, термостабильность. Впервые показан эффект увеличения выхода белка в несколько раз при укорачивании N-концевой последовательности CysLT2R без потери функциональности. Различными методами были предложены несколько десятков стабилизирующих мутаций, не описанных в литературе. Их экспериментально подтвержденный эффект позволил комбинированием нескольких мутаций добиться существенного увеличения термостабильности рецептора. Впервые протестированы более 20 высоко аффинных лигандов, специально синтезированных соавторами, проведено сравнение с коммерчески доступными селективными лиган-дами. Охарактеризован и ранжирован их стабилизирующий эффект для очищенного препарата белка. Сочетание лучшей конструкции с лучшими из новых синтезированных лиган-дов позволило добиться сначала хорошей диффузии в липидной кубической фазе, а зачем и роста кристаллов. Получение 4 структур высокого разрешения в комплексе с 3 неспецифичными антагонистами CysLTi/CysLT2 рецепторов позволило пролить свет на вопрос о специфичности связывания лигандов и описать структурные особенности CysLT2 рецептора и его лиганд-связывающего кармана. Впервые установлены структурные особенности замен аминокислот, вызванных однонуклеотидными полиморфизмами. Кристаллическая структура CysLT2R также помогла в понимании влияния мутаций рецептора, вызывающих злокачественные образования и склонность к болезням.

Теоретическая и практическая значимость

Уникальный пример быстрой трансляции результатов научных исследований в практическое применение - это созданный в 2014 году GPCR консорциум (http://gpcrconsortium.org/). Он объединил усилия нескольких научно-исследовательских групп-лидеров в структурной биологии GPCR и фармацевтических компаний. Компании-члены консорциума номинировали несколько наиболее актуальных для фармацевтической индустрии мишеней и предоставляли ученым закрытые наработки в области лигандов для повышения успеха кокристаллизации.

В 2016 году в качестве мишени консорциума компанией Ono Pharmaceutical был номинирован человеческий цистеинил лейкотриеновый рецептор второго типа. Наработки

в области экспрессии и стабилизации цистеинил лейкотриеновых рецепторов нашей группы и в том числе автора диссертации позволили МФТИ вступить в GPCR консорциум. Автором работы были получены высокоаффинные лиганды от компании Ono Pharmaceutical, которые помогли стабилизировать рецептор и получить ряд кокристаллических структур. Также на основании полученных структур нашей группой были проанализированы данные компании и объяснены тренды в селективности между двумя подтипами цистеинил лейкотриеновых рецепторов, чего не удавалось до этого. Несомненно, структуры послужат для дальнейшего улучшения существующих кандидатов в лекарства и помогут создать первые препараты, нацеленные на CysLT2 рецептор.

Положения, выносимые на защиту

1. Найдены генно-инженерные модификации человеческого цистеинил лейкотриено-вого рецептора второго типа, увеличивающие стабильность белка, уровень экспрессии и температуру денатурации.

2. Способ экспрессии рекомбинантного человеческого цистеинил лейкотриенового рецептора второго типа, обеспечивающий высокий выход гомогенного белка при его очистке.

3. Способ очистки CysLT2 рецептора, обеспечивающий достаточную для кристаллизации стабильность и монодисперсность.

4. Условия кристаллизации химерной конструкции человеческого CysLT2 рецептора с партерным белком BRIL, обрезанными N и C-концами и тремя стабилизирующими точечными мутациями.

5. Четыре структуры высокого разрешения человеческого CysLT2 рецептора в комплексе с неселективными CysLT1/CysLT2 антагонистами.

6. Структурный анализ взаимодействий аминокислот лиганд-связывающего кармана CysLT2R c вышеописанными антагонистами и сравнение со структурой CysLT1R.

Степень достоверности и апробация результатов

Все данные литературного обзора опираются на публикации в ведущих мировых рецензируемых журналах, индексируемые базами данных Web of Sciences, Scopus и РИНЦ, либо общепринятые университетские учебники и книги по фармакологии, кристаллографии

и медицинской химии. Приведенные экспериментальные данные проверялись общепринятыми статистическими критериями и проводились повторные эксперименты для подтверждения воспроизводимости. Структуры высокого разрешения уточнялись согласно стандартам, принятым мировым сообществом белковых кристаллографов. Промежуточные результаты работы были представлены на 27 международных научных конференциях, в том числе в виде 5 устных докладов автора диссертации. Результаты анализа структур опубликованы в 2 статьях в журнале Science Advances и Nature Communications, а обзор новейших методов структурной биологии в создании лекарств - в журнале Expert Opinion on Drug Discovery.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, трех глав, разделенных на подглавы, и заключения.

Первая глава - литературный обзор, призванный посвятить читателя в алгоритм создания новых лекарств с уклоном в использование биофизических методов на всех этапах процесса. Акцент этой части обзора - на применение рентгеновской кристаллографии для драг-дизайна, основанного на структуре. Такой подход успешно используется для актуальных мишеней фармацевтики, таких как, например, рецепторы, сопряженные с G-белком. Для этого класса белков описана актуальность их исследований, фармакологические аспекты и механизм активации. Один из представителей этого класса мембранных белков -объект диссертации - человеческий цистеинил лейкотриеновый рецептор второго типа. Для него приведены известные из литературы данные о функциях в организме и роли в патологии заболеваний. Резюмированы результаты фармацевтических компаний по поиску кандидатов в лекарства без знания его структуры.

Вторая глава - описание экспериментальных методов, материалов и оборудования, использованных в работе. Приведены протоколы с пояснениями для методов клонирования, экспрессии рецептора в клеточной линии насекомых Sf9, очистки и характеризации различных вариантов рецептора. Описаны методики тестирования диффузии рецептора в липидной кубической фазе (ЛКФ) и кристаллизации, отбора кристаллов, их извлечения из ЛКФ, а также снятия дифракционных данных.

Третья глава - изложение результатов, выносимых на защиту, начиная с создания генно-инженерных конструкций белка интереса и до анализа его структур высокого разрешения в комплексе с лигандами-кандидатами в лекарства.

Заключение - выводы работы и библиографический список цитируемой литературы

1. ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫМ ОБЗОР

1.1. Основные фазы создания нового лекарства:

Общее количество оригинальных лекарств, одобренных управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (англ. Food and Drug Administration, FDA) составило 2387 на конец 2018 года [24]. Каждый год это число растет на несколько десятков новых наименований (например, в 2018 году было одобрено 62 новых препарата [25]). Такой, на первый взгляд, незначительный прирост объясняется чрезвычайной трудоемкостью и огромной стоимостью проведения полного цикла - он занимает в среднем 10-12 лет и обходится компаниям в сумму около 1 млрд долларов [26]. Упрощенная схема с примерными оценками времени и стоимости показана на рисунке 1.

Рисунок 1 Основные фазы разработки нового лекарства. Адаптировано из [203]

Тем не менее, процесс разработки почти каждого нового препарата начинается в научно-исследовательской лаборатории с изучения молекулярных механизмов или феноти-пических изменений, лежащих в основе возникновения болезни. Все биофизические методы для поиска и оптимизации кандидата лежат на стыке наук о живом и физики. Дальнейший литературный обзор, касающийся создания лекарств, сфокусирован на применении рентгеноструктурного анализа на начальных фазах создания уникальных препаратов.

1.2. Методы поиска новых лекарств:

1.2.1. Фенотипический подход и подход с использованием конкретного белка-

мишени

Эмпирические методы поиска лекарственных препаратов, применяемые людьми с давних времен, к 20 веку оформились в фенотипический метод поиска лекарств (phenotypic drug discovery, PDD). В его основе - количественное измерение реакции модельной клетки, ткани, органа или животного на воздействие предполагаемым препаратом зачастую без понимания молекулярных механизмов действия и знания конкретных белковых мишеней.

Пример - коммерческий выпуск ацетилсалициловой кислоты или аспирина, ингибитора циклооксигеназы, который начался в 19 веке, задолго до открытия самого фермента, на который она нацелена [27].

Концепция конкретных мишеней лекарств была предложена в конце19 века Полем Эрлихом с его идеей «хеморецепторов», ответственных за взаимодействие клетки с окружающими ее химическими веществами [1]. К концу 20 века, с появлением возможности изолировать гены единичных белков и изучать их как совместно, так и вне клеточной системы, первым по популярности стал target-based метод поиска новых лекарств (TDD). Это идентификация связки «болезнь - белковая мишень болезни» и поиск веществ для селективного воздействия на эту, как правило, белковую мишень.

Идеальный пример успешного использования такого подхода - создание противо-лейкозного препарата иматиниб (imatinib mesylate или Gleevec/Glivec). Селективно воздействуя на абнормальный гибридный белок с постоянной активностью - тирозинкиназу BCR-ABL, он подавляет пролиферацию раковых клеток и ведет к их апоптозу [28]. Препарат был разработан в кратчайшие сроки и запатентован компанией Novartis по ускоренной схеме [29].

1.2.2. Полифармакология и комбинированные подходы

Ставя на первое место сродство к одному белку-мишени, почти неизбежно ученые

сталкиваются с возникновением побочных действий лекарств из-за нежелательных взаимодействий с другими белками. Модель парного взаимодействия мишень-лиганд - зачастую слишком редуцированный вариант реальной картины с компенсаторными механизмами и

сложными сетями взаимодействий, этим может быть обусловлен большой процент лекарств, не прошедших клинические испытания [30]. Парадигма «одна мишень - один ли-ганд» меняется на «один лиганд - несколько мишеней», называемую полифармакологией.

В последние годы также вернулся интерес к фенотипическому подходу поиска хитов (то есть потенциальных лекарств), но уже с условием последующего установления белковой мишени и молекулярного механизма действия [31]. Возвращению PDD способствуют новые разработки системного скрининга (например, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, iPS), редактирования генома (например, CRISPR-Cas)[31].

Анализ запатентованных и одобренных FDA препаратов в последние годы показывает, что большая часть «первых в своем классе» лекарств получены фенотипическим скринингом, а последующих «лучших в своем классе» - методами рационального дизайна с фокусом на мишень [32]. Поэтому оба подхода стараются использовать последовательно согласно со схемой на рисунке 2:

Рисунок 2 Последовательное развитие лекарства от постановки медицинской проблемы до best-in-class препарата. Адаптировано из [32].

1.3. Рациональная разработка лекарств c использованием белка-мишени (target-based): начальные этапы

Рисунок 3 Типичная последовательность шагов в парадигме разработки лекарств с использованием белка-мишени (target-based).

Запуск программы по разработке нового лекарственного средства всегда начинается с определения заболевания или состояния, для которого либо нет методов терапии, либо существующие препараты по каким-то признакам неприемлемы [1]. В парадигме TDD далее научные исследования предлагают конкретную мишень либо биохимический путь, на который предполагается воздействовать для достижения терапевтического эффекта [3]. Полученную мишень тщательно валидируют, затем сканируют библиотеки соединений для проверки связывания с мишенью и активации биологического ответа. Те из кандидатов, которые показали активность выше пороговой по отношению к мишени, отправляются на следующий шаг и называются хитами. Хорошее связывание с мишенью и активация клеточных событий - необходимо для лекарства, но не менее важно отсутствие токсичности, биодоступность, время выведения и другие параметры, которые учитывает медицинская химия при оптимизации хитов до лидирующих соединений (лидов). Соединения удовлетворяющие всем требованиям, становятся кандидатами в лекарства и проходят через доклинические испытания на животных и три стадии клинических испытаний на добровольцах [1].

На рисунке 3 приведен краткий обзор первых стадий вплоть до доклинических испытаний.

1.3.1. Выбор биологической мишени и ее валидация:

Частота заболевания, актуальность создания эффективной терапии, потенциальная

возможность разработки лекарства - одни из главных факторов, определяющих интерес фармацевтических компаний к поиску биологических мишеней препаратов [1].

Для выбора конкретных, чаще всего белковых, мишеней выполняется анализ научных статей и патентов и выявляются корреляции между заболеваниями или состояниями, требующими терапии, и данными геномики, протеомики, уровней экспрессии мРНК и белков, фенотипического скрининга и других методов [3]. Например, если высокая частота заболевания связана с мутацией в гене определенного белка, это может быть косвенным свидетельством участия этого белка в регуляции задействованного в болезни биохимического пути.

Основные семейства Доли малых молекул,

белковых мишеней лекарств направленных на белковые мишени

■ GPCR

П Ионные каналы

□ Киназы

□ Ядерные рец-рь

□ Остальные

Рисунок 4 Распределение лекарств и их мишеней по семействам генов (слева) и распределение по доле лекарств, нацеленных на эти семейства (справа). Адаптировано из

[33]

От правильного выбора мишени во многом зависит эффективность лекарства, поэтому мишени основательно валидируются после выбора. Множество методов in vivo и in vitro используются для валидации, от подробнее можно ознакомиться, например, в [3,34].

30%

33%

1.3.2. Скрининг кандидатов в лекарства и выбор хитов:

В большинстве случаев кандидаты в лекарства - небольшие молекулы, получаемые методами химического синтеза. Также это могут быть очищенные препараты природного происхождения, антитела [35]

Даже если рассматривать только малые молекулы, возможные варианты - это, по разным оценкам, от 1020 до 1060 веществ [36,37]. Это пространство дальше нужно сужать до количеств, поддающихся методам скрининга. Не каждая молекула в принципе может быть орально биодоступным лекарством (а это почти всегда предпочтительный способ приема), даже если она активирует клеточный ответ и обладает высоким сродством к мишени. Эмпирический набор физико-химических критериев, которыми должны обладать потенциальные орально-активные лекарства был сформулирован Кристофером Липински ("правило пяти" Липинского) [38]]:

• Молекулярный вес меньше 500 Да

• Меньше 5 доноров водородной связи

• Липофильность logP меньше 5 (logP коэффициент распределения вещества на границе октанол-вода)

• В сумме не более 10 атомов акцепторов водородной связи

Считается, что лекарство для орального применения допускает не больше одного отклонения от правил, но на начальных этапах скринингах допускается и больше. Существуют специальные библиотеки соединений - либо уже синтезированные, либо потенциально доступные для синтеза, обычно используемые на начальных этапах скрининга хитов [3,34]. Большинство соединений из таких библиотек обычно удовлетворяют "правилу пяти".

Все методы скрининга грубо можно разделить на экспериментальные и виртуальные. Часто они являются комплементарными и используются последовательно. Из-за высокой стоимости экспериментальных методов на начальных этапах стараются применять методы in silico, чтобы таким образом исключить большую часть библиотеки из реального in vivo или in vitro скрининга.

Подходы in silico в скрининге можно разделить на два типа:

• основанные на структуре лиганда (ligand-based drug design)

• основанные на структуре мишени (structure-based drug design).

1.3.2.1. Разработка лекарств, основанная на структуре лиганда (ligand-based

drug design)

Методами машинного обучения и математической статистики часто возможно in silico оценить свойства химических соединений и предсказать их биологическую активность. Такой подход называют поиском количественных соотношений структура-свойство (Quantitative Structure-Activity Relationship, QSAR). Такой подход лучше применим уже на стадии оптимизации соединения, нежели для первичного поиска. Для того, чтобы как-то сравнивать разные химические структуры применяют молекулярные дескрипторы, то есть каждой структуре ставится в соответствие какой-то числовой параметр, основываясь на одном или нескольких физико-химических свойствах. [39] Задача этим сводится к математической классификации дескрипторов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Гусач Анастасия Юрьевна, 2020 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Blass B.E. Basic Principles of Drug Discovery and Development // Basic Principles of Drug Discovery and Development. 2015.

2. Wlodawer A. Protein Crystallography. 2017. Vol. 1607. 627-641 p.

3. Hughes J.P. et al. Principles of early drug discovery // Br. J. Pharmacol. 2011. Vol. 162, № 6. P. 1239-1249.

4. Alex A.A., Millan D.S. Chapter 5. Contribution of Structure-Based Drug Design to the Discovery of Marketed drugs. 2011. № 13. P. 108-163.

5. Caffrey M. Membrane protein crystallization // J. Struct. Biol. 2003.

6. Nelson D.L., Cox M.M. Lehniger principles of biochemistry. 5 th Editi. New York: W. H. Freeman and company, 2008. 153, 358-359, 816-819 p.

7. Hauser A.S. et al. Trends in GPCR drug discovery: New agents, targets and indications // Nat. Rev. Drug Discov. Nature Publishing Group, 2017. Vol. 16, № 12. P. 829-842.

8. Palczewski K. et al. Crystal Structure of Rhodopsin: A G Protein-Coupled Receptor // Sci. (New York, NY). 2000. Vol. 289, № 5480. P. 739-745.

9. Cherezov V. et al. High-resolution crystal structure of an engineered human ß2-adrenergic G protein-coupled receptor // Science (80-. ). 2007. Vol. 318, № 5854. P. 1258-1265.

10. Thal D.M. et al. Recent advances in the determination of G protein-coupled receptor structures // Curr. Opin. Struct. Biol. Elsevier Ltd, 2018. Vol. 51. P. 28-34.

11. Cooke R.M. et al. Structures of G protein-coupled receptors reveal new opportunities for drug discovery // Drug Discov. Today. Elsevier Ltd, 2015. Vol. 20, № 11. P. 1355-1364.

12. Heise C.E. et al. Characterization of the human cysteinyl leukotriene 2 receptor. // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, № 39. P. 30531-30536.

13. Back M. et al. International Union of Basic and Clinical Pharmacology . LXXXIV : Leukotriene Receptor Nomenclature , Distribution , and Pathophysiological Functions // Pharmacol. Rev. 2011. Vol. 63, № 3. P. 539-584.

14. Yokomizo T., Nakamura M., Shimizu T. Leukotriene receptors as potential therapeutic

targets // J. Clin. Invest. 2018. Vol. 128, № 7. P. 2691-2701.

15. Miligkos M. et al. Leukotriene receptor antagonists versus placebo in the treatment of asthma in adults and adolescents: a systematic review and meta-analysis // Ann Intern Med. 2015. Vol. 164, № 10. P. 756-767.

16. Takasaki J. et al. The molecular characterization and tissue distribution of the human cysteinyl leukotriene CysLT(2) receptor. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. Vol. 274. P.316-322.

17. Capra V. Molecular and functional aspects of human cysteinyl leukotriene receptors // Pharmacol. Res. 2004.

18. Jiang Y. et al. CysLT2 receptors interact with CysLT1 receptors and down-modulate cysteinyl leukotriene dependent mitogenic responses of mast cells. // Blood. 2007. Vol. 110, № 9. P. 3263-3270.

19. Fukai H. et al. Association between a polymorphism in cysteinyl leukotriene receptor 2 on chromosome 13q14 and atopic asthma. // Pharmacogenetics. 2004. Vol. 14, № 10. P. 683690.

20. Pillai S.G. et al. A coding polymorphism in the CYSLT2 receptor with reduced affinity to LTD4 is associated with asthma. // Pharmacogenetics. 2004. Vol. 14, № 9. P. 627-633.

21. Yonetomi Y. et al. Leukotriene C4 induces bronchoconstriction and airway vascular hyperpermeability via the cysteinyl leukotriene receptor 2 in S-hexyl glutathione-treated guinea pigs // Eur. J. Pharmacol. 2015.

22. Shi Q.J. et al. HAMI 3379, a CysLT2R antagonist, dose- and time-dependently attenuates brain injury and inhibits microglial inflammation after focal cerebral ischemia in rats // Neuroscience. 2015. Vol. 291. P. 53-69.

23. Moore A.R. et al. Recurrent activating mutations of G-protein-coupled receptor CYSLTR2 in uveal melanoma. // Nat. Genet. 2016. Vol. 48, № 6. P. 675-680.

24. Zhong H. et al. A Comprehensive Map of FDA-Approved Pharmaceutical Products // Pharmaceutics. 2018. Vol. 10, № 4. P. 263.

25. Baedeker M., Ringel M., Schulze U. 2018 FDA approvals hit all time high — but average

value slips again // Nat. Rev. Drug Discov. 2019. Vol. 18, № 2. P. 90-90.

26. Mignani S. et al. Why and how have drug discovery strategies in pharma changed? What are the new mindsets? // Drug Discovery Today. 2016.

27. Le H., Charles-frederic D.S. L ' aspirine g travers les sikles z rappel historique. 2000. P. 8-17.

28. Ross J.S. et al. Targeted therapies for cancer 2004 // American Journal of Clinical Pathology. 2004.

29. Johnson J.R. et al. Approval summary: Imatinib mesylate capsules for treatment of adult patients with newly diagnosed Philadelphia chromosome-positive chronic myelogenous leukemia in chronic phase // Clinical Cancer Research. 2003.

30. Williams R. Discontinued drugs in 2012: oncology drugs // Expert Opin. Investig. Drugs. Informa UK, Ltd., 2013. Vol. 22, № 12. P. 1627-1644.

31. Moffat J.G., Rudolph J., Bailey D. Phenotypic screening in cancer drug discovery-past, present and future // Nat. Rev. Drug Discov. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 13, № 8. P. 588-602.

32. Swinney D.C. Phenotypic vs. Target-based drug discovery for first-in-class medicines // Clin. Pharmacol. Ther. 2013. Vol. 93, № 4. P. 299-301.

33. Santos R. et al. A comprehensive map of molecular drug targets // Nat. Publ. Gr. Nature Publishing Group, 2016. Vol. 16, № 1. P. 19-34.

34. Chen B., Butte A.J. Leveraging big data to transform target selection and drug discovery // Clin. Pharmacol. Ther. 2016. Vol. 99, № 3. P. 285-297.

35. Grilo A.L., Mantalaris A. The Increasingly Human and Profitable Monoclonal Antibody Market. // Trends Biotechnol. Elsevier Ltd, 2019. Vol. 37, № 1. P. 9-16.

36. Ertl P. Cheminformatics analysis of organic substituents: Identification of the most common substituents, calculation of substituent properties, and automatic identification of drug-like bioisosteric groups // J. Chem. Inf. Comput. Sci. 2003. Vol. 43, № 2. P. 374380.

37. Kirkpatrick P., Ellis C. Chemical space // Nature. 2004. Vol. 432, № December. P. 2004.

38. Franc I., Lipinski A., Feeney P.J. Lipinski 1997 Drug discovery.pdf. 1997. Vol. 23.

39. Danishuddin, Khan A.U. Descriptors and their selection methods in QSAR analysis: paradigm for drug design // Drug Discov. Today. Elsevier Ltd, 2016. Vol. 21, № 8. P. 1291-1302.

40. Wang Y. et al. Advance in Structural Bioinformatics // Adv. Struct. Bioinforma. 2015. Vol. 827. P. 71-82.

41. Li G. et al. High-throughput cytochrome P450 cocktail inhibition assay for assessing drug-drug and drug-botanical interactions // Drug Metab. Dispos. 2015. Vol. 43, № 11. P. 1670-1678.

42. Wang Y. et al. In silico ADME/T modelling for rational drug design // Q. Rev. Biophys. 2015. Vol. 48, № 4. P. 488-515.

43. Borshell N., Congreve M., Papp T. Valuation benefits of structure-enabled drug discovery // Nat Rev Drug Discov. 2011. Vol. 10, № March. P. 2011.

44. Crystallization M. et al. LCP-FRAP Assay for Pre-Screening Membrane Proteins for In & DESIGN 2008 // Cryst. Growth Des. 2008.

45. Kim C.U. et al. Influenza neuraminidase inhibitors possessing a novel hydrophobic interaction in the enzyme active site: Design, synthesis, and structural analysis of carbocyclic sialic acid analogues with potent anti-influenza activity // J. Am. Chem. Soc. American Chemical Society , 1997. Vol. 119, № 4. P. 681-690.

46. van Montfort R.L.M., Workman P. Structure-based design of molecular cancer therapeutics // Trends Biotechnol. Elsevier Current Trends, 2009. Vol. 27, № 5. P. 315328.

47. Ceska T. et al. Cryo-EM in drug discovery // Biochem Soc Trans. 2019. Vol. 47, № 1. P. 281-293.

48. Pellecchia M. et al. Perspectives on NMR in drug discovery: A technique comes of age // Nat. Rev. Drug Discov. 2008. Vol. 7, № 9. P. 738-745.

49. Frank J. Advances in the field of single-particle cryo-electron microscopy over the last decade // Nat. Protoc. 2017. Vol. 12, № 2. P. 209-212.

50. Deschamps J.R. The role of crystallography in drug design // Drug Addict. From Basic Res. to Ther. 2008. № February 2005. P. 343-355.

51. Khafizov K. et al. Trends in structural coverage of the protein universe and the impact of the Protein Structure Initiative // Proc. Natl. Acad. Sci. 2014.

52. Cavasotto C.N., Phatak S.S. Homology modeling in drug discovery: current trends and applications // Drug Discov. Today. 2009. Vol. 14, № 13-14. P. 676-683.

53. Nienaber V.L. et al. Discovering novel ligands for macromolecules using X-ray crystallographic screening // Nat. Biotechnol. 2000. Vol. 18, № 10 SUPPL. P. 1105-1108.

54. Davis B.J., Roughley S.D. Fragment-Based Lead Discovery // Annu. Rep. Med. Chem. 2017. Vol. 50, № August. P. 371-439.

55. Rondeau J.M., Schreuder H. Protein Crystallography and Drug Discovery // The Practice of Medicinal Chemistry: Fourth Edition. 2015.

56. Gavira J.A. Current trends in protein crystallization // Arch. Biochem. Biophys. 2016. Vol. 602. P. 3-11.

57. Cherezov V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases // Nat. Protoc. 2009.

58. Riekel C., Burghammer M., Schertler G. Protein crystallography microdiffraction // Curr. Opin. Struct. Biol. 2005. Vol. 15, № 5. P. 556-562.

59. Henderson R. Cryo-protection of protein crystals against radiation damage in electron and X-ray diffraction // Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 1990. Vol. 241, № 1300. P. 6-8.

60. Owen R.L., Rudino-Pinera E., Garman E.F. Experimental determination of the radiation dose limit for cryocooled protein crystals // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006. Vol. 103, № 13. P. 4912-4917.

61. Southworth-Davies R.J. et al. Observation of Decreased Radiation Damage at Higher Dose Rates in Room Temperature Protein Crystallography // Structure. 2007. Vol. 15, № 12. P. 1531-1541.

62. Mishin A. et al. An outlook on serial femtosecond crystallography application in drug discovery // Expert Opin. Drug Discov. Taylor & Francis, 2019. Vol. 14, № 0. P. 1-13.

63. Johansson L.C. et al. A Bright Future for Serial Femtosecond Crystallography with XFELs // Trends in Biochemical Sciences. 2017.

64. Stauch B., Cherezov V. Serial Femtosecond Crystallography of G Protein-Coupled Receptors // Annu. Rev. Biophys. 2018. Vol. 47, № 1. P. 377-397.

65. Stauch B. et al. Structural basis of ligand recognition at the human MT1 melatonin receptor // Nature. Springer US, 2019. Vol. 569, № 7755. P. 284-288.

66. Johansson L.C. et al. XFEL structures of the human MT2 melatonin receptor reveal the basis of subtype selectivity // Nature. Springer US, 2019. Vol. 569, № 7755. P. 289-292.

67. Zhang H. et al. Structure of the full-length glucagon class B G-protein-coupled receptor // Nat. Publ. Gr. Nature Publishing Group, 2017. Vol. 546, № 7657. P. 259-264.

68. Zhang H. et al. Structural basis for selectivity and diversity in angiotensin II receptors // Nature. Nature Publishing Group, 2017. Vol. 544, № 7650. P. 327-332.

69. Zhang R., Xie X. Tools for GPCR drug discovery // Acta Pharmacol. Sin. Nature Publishing Group, 2012. Vol. 33, № 3. P. 372-384.

70. Ritter S.L., Hall R. a. Fine-tuning of GPCR activity by receptor-interacting proteins. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. Nature Publishing Group, 2009. Vol. 10, № 12. P. 819-830.

71. Gurevich V. V., Gurevich E. V. GPCR signaling regulation: The role of GRKs and arrestins // Front. Pharmacol. 2019. Vol. 10, № FEB. P. 1-11.

72. Tao Y.-X. Constitutive activation of G protein-coupled receptors and diseases: insights into mechanisms of activation and therapeutics. // Pharmacol. Ther. NIH Public Access, 2008. Vol. 120, № 2. P. 129-148.

73. Dong S.S., Goddard W.A., Abrol R. Conformational and Thermodynamic Landscape of GPCR Activation from Theory and Computation // Biophys. J. Biophysical Society, 2016. Vol. 110, № 12. P. 2618-2629.

74. Deupi X., Kobilka B.K. Energy Landscapes as a Tool to Integrate GPCR Structure, Dynamics, and Function // Physiology. 2010. Vol. 25, № 5. P. 293-303.

75. Insel P.A. et al. GPCRomics: An Approach to Discover GPCR Drug Targets // Trends Pharmacol. Sci. 2019.

76. Wacker D., Stevens R.C., Roth B.L. How Ligands Illuminate GPCR Molecular Pharmacology // Cell. 2017.

77. Roth B.L. Drugs and Valvular Heart Disease // N. Engl. J. Med. 2007. Vol. 356, № 1. P. 6-9.

78. Rothman R.B. et al. Evidence for possible involvement of 5-HT(2B) receptors in the cardiac valvulopathy associated with fenfluramine and other serotonergic medications // Circulation. 2000.

79. Cherezov V. et al. High-resolution crystal structure of an engineered human ß2-adrenergic G protein-coupled receptor // Science (80-. ). 2007.

80. Jaakola V.P. et al. The 2.6 angstrom crystal structure of a human A2A adenosine receptor bound to an antagonist // Science (80-. ). 2008.

81. Warne T. et al. Structure of a ß1-adrenergic G-protein-coupled receptor // Nature. 2008. Vol. 454, № 7203. P. 486-491.

82. Chien E.Y.T. et al. Structure of the human dopamine D3 receptor in complex with a D2/D3 selective antagonist. // Science. American Association for the Advancement of Science, 2010. Vol. 330, № 6007. P. 1091-1095.

83. Wu B. et al. Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists. // Science. American Association for the Advancement of Science, 2010. Vol. 330, № 6007. P. 1066-1071.

84. Hauser A.S. et al. Trends in GPCR drug discovery: New agents, targets and indications // Nat. Rev. Drug Discov. Nature Publishing Group, 2017. Vol. 16, № 12. P. 829-842.

85. Ishchenko A., Gati C., Cherezov V. ScienceDirect Structural biology of G protein-coupled receptors : new opportunities from XFELs and cryoEM. Elsevier Ltd, 2018. P. 44-52.

86. Garcia-Nafria J., Tate C.G. Cryo-EM structures of GPCRs coupled to G s , G i and G o // Mol. Cell. Endocrinol. Elsevier B.V., 2019. Vol. 488. P. 1-13.

87. Maeda S. et al. Structures of the M1 and M2 muscarinic acetylcholine receptor/G-protein complexes. 2019. Vol. 6, № May. P. 552-557.

88. Salmon J.A., Higgs G.A. Prostaglandins and leukotrienes as inflammatory mediators // Br.

Med. Bull. 1987. Vol. 43, № 2. P. 285-296.

89. Ribeiro J.D., Toro A.A.D.C., Baracat E.C.E. Antileukotrienes in the treatment of asthma and allergic rhinitis. // J. Pediatr. (Rio. J). 2006. Vol. 82, № SUPPL. 2 PG-S213-S221. P. S213-S221.

90. Powell W.S., Rokach J. The eosinophil chemoattractant 5-oxo-ETE and the OXE receptor // Prog. Lipid Res. Elsevier Ltd, 2013. Vol. 52, № 4. P. 651-665.

91. O'Flaherty J.T., Taylor J.S., Thomas M.J. Receptors for the 5-oxo class of eicosanoids in neutrophils // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273, № 49. P. 32535-32541.

92. Crooks S.., Stockley R.. Leukotriene B4 // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1998. Vol. 30, № 2. P. 173-178.

93. Borgeat P., Naccache P.H. Biosynthesis and biological activity of leukotriene B4 // Clin. Biochem. 1990. Vol. 23, № 5. P. 459-468.

94. Bäck M. et al. International Union of Basic and Clinical Pharmacology. Update on Leukotriene, Lipoxin and Oxoeicosanoid Receptors: IUPHAR Review 7. // British journal of pharmacology. 2014. 1 -60 p.

95. Back M. et al. International Union of Basic and Clinical Pharmacology . LXXXIV : Leukotriene Receptor Nomenclature , Distribution , and Pathophysiological Functions. 2011. Vol. 63, № 3. P. 539-584.

96. Fleisch J.H., Rinkema L.E., Baker S.R. Evidence for multiple leukotriene D4 receptors in smooth muscle // Life Sci. 1982.

97. Drazen J.M. et al. Comparative airway and vascular activities of leukotrienes C-1 and D in vivo and in vitro. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1980.

98. Buckner C.K. et al. Pharmacological evidence that human intralobar airways do not contain different receptors that mediate contractions to leukotriene C4 and leukotriene D4. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1986.

99. Labat C. et al. A second cysteinyl leukotriene receptor in human lung. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1992.

100. Lynch K.R. et al. Characterization of the human cysteinyl leukotriene CysLT 1 receptor.

1999. Vol. 399, № June. P. 789-793.

101. Sarau H.M. et al. Identification, Molecular Cloning, Expression, and Characterization of a Cysteinyl Leukotriene Receptor // Mol. Pharmacol. 2018.

102. Yokomizo T., Nakamura M., Shimizu T. Leukotriene receptors as potential therapeutic targets // J. Clin. Investig. Investig. 2018. Vol. 128(7), № July, 2. P. 2691-2701.

103. Bäck M. et al. Update on leukotriene, lipoxin and oxoeicosanoid receptors: IUPHAR Review 7 // Br. J. Pharmacol. 2014. Vol. 171, № 15. P. 3551-3574.

104. Suh D.H. et al. P2Y12 antagonist attenuates eosinophilic inflammation and airway hyperresponsiveness in a mouse model of asthma // J. Cell. Mol. Med. 2016.

105. Paruchuri S. et al. Leukotriene E4 activates peroxisome proliferator-activated receptor y and induces prostaglandin D2 generation by human mast cells // J. Biol. Chem. 2008.

106. Kanaoka Y., Maekawa A., Austen K.F. Identification of GPR99 protein as a potential third cysteinyl leukotriene receptor with a preference for leukotriene E4 ligand // J. Biol. Chem. 2013.

107. Bankova L.G. et al. Leukotriene E 4 elicits respiratory epithelial cell mucin release through the G-protein-coupled receptor, GPR99 // Proc. Natl. Acad. Sci. 2016.

108. Liu M., Yokomizo T. The role of leukotrienes in allergic diseases // Allergol. Int. Elsevier B.V, 1970. Vol. 64, № 1. P. 17-26.

109. Gauvreau G.M. et al. Expression of functional cysteinyl leukotriene receptors by human basophils. // J. Allergy Clin. Immunol. 2005. Vol. 116, № 1. P. 80-87.

110. Hasegawa S. et al. Functional expression of cysteinyl leukotriene receptors on human platelets. // Platelets. 2010. Vol. 21, № 4. P. 253-259.

111. Heise C.E. et al. Characterization of the Human Cysteinyl Leukotriene 2 Receptor // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, № 39. P. 30531-30536.

112. Takasaki J. et al. The molecular characterization and tissue distribution of the human cysteinyl leukotriene CysLT(2) receptor. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. Vol. 274, № 2. P. 316-322.

113. Corrigan C. et al. Expression of the cysteinyl leukotriene receptors cysLT 1 and cysLT 2

in aspirin-sensitive and aspirin-tolerant chronic rhinosinusitis // J. Allergy Clin. Immunol. 2005. Vol. 115, № 2. P. 316-322.

114. Nothacker H.-P. et al. Molecular Cloning and Characterization of a Second Human Cysteinyl Leukotriene Receptor: Discovery of a Subtype Selective Agonist // Mol. Pharmacol. 2000. Vol. 58, № 6. P. 1601-1608.

115. Kamohara M. et al. Functional characterization of cysteinyl leukotriene CysLT2 receptor on human coronary artery smooth muscle cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. Vol. 287, № 5. P. 1088-1092.

116. Carnini C. et al. Synthesis of cysteinyl leukotrienes in human endothelial cells: subcellular localization and autocrine signaling through the CysLT2 receptor. // FASEB J. 2011. Vol. 25, № 10. P. 3519-3528.

117. Lotzer K. et al. Differential Leukotriene Receptor Expression and Calcium Responses in Endothelial Cells and Macrophages Indicate 5-Lipoxygenase-Dependent Circuits of Inflammation and Atherogenesis // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2003. Vol. 23, № 8. P. 1-5.

118. Hu H. et al. Distribution of cysteinyl leukotriene receptor 2 in human traumatic brain injury and brain tumors // Acta Pharmacol. Sin. 2005. Vol. 26, № 6. P. 685-690.

119. James A.J., Sampson A.P. A tale of two CysLTs // Clin. Exp Allergy. 2001. Vol. 31, № 11. P. 1660-1664.

120. Nothacker H.P. et al. Molecular cloning and characterization of a second human cysteinyl leukotriene receptor: discovery of a subtype selective agonist. // Mol. Pharmacol. 2000. Vol. 58, № 6. P. 1601-1608.

121. Moller I. et al. Activating cysteinyl leukotriene receptor 2 (CYSLTR2) mutations in blue nevi. // Mod. Pathol. 2017. Vol. 30, № 3. P. 350-356.

122. Moore A.R. et al. Recurrent activating mutations of G-protein-coupled receptor CYSLTR2 in uveal melanoma // Nat. Genet. 2016. Vol. 48, № 6. P. 675-680.

123. Takasaki J. et al. The Molecular Characterization and Tissue Distribution of the Human Cysteinyl Leukotriene CysLT2 Receptor // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. Vol. 274, № 2. P. 316-322.

124. Magnusson C. et al. Cysteinyl leukotriene receptor expression pattern affects migration of breast cancer cells and survival of breast cancer patients. 2011. Vol. 22. P. 9-22.

125. Magnusson C. et al. Low expression of CysLT1R and high expression of CysLT2R mediate good prognosis in colorectal cancer // Eur. J. Cancer. 2010. Vol. 46, № 4. P. 826835.

126. Mellor E.A. et al. Expression of the type 2 receptor for cysteinyl leukotrienes (CysLT2R) by human mast cells: Functional distinction from CysLT1R // Proc. Natl. Acad. Sci. 2003. Vol. 100, № 20. P. 11589-11593.

127. Consortium* T. 1000 G.P. A global reference for human genetic variation. 2015. Vol. 40, № 4. P. 1291-1296.

128. Thompson M.D. et al. A cysteinyl leukotriene 2 receptor variant is associated with atopy in the population of Tristan da Cunha // Pharmacogenetics. 2003.

129. Singh A.D., Turell M.E., Topham A.K. Uveal melanoma: Trends in incidence, treatment, and survival // Ophthalmology. Elsevier Inc., 2011. Vol. 118, № 9. P. 1881-1885.

130. Hébert T.E., Bouvier M. Structural and functional aspects of G protein-coupled receptor oligomerization. 1998. Vol. 11. P. 1-11.

131. Augstein J. et al. Selective inhibitor of slow reacting substance of anaphylaxis // Nature New Biology. 1973.

132. Fischer J., Ganellin C.R., Rotella D.P. Analogue-based Drug Discovery III // Analogue-Based Drug Discovery III. 2012.

133. Wunder F. et al. Pharmacological characterization of the first potent and selective antagonist at the cysteinyl leukotriene 2 (CysLT 2) receptor // Br. J. Pharmacol. 2010. Vol. 160, № 2. P. 399-409.

134. Ni N.C. et al. A Selective Cysteinyl Leukotriene Receptor 2 Antagonist Blocks Myocardial Ischemia / Reperfusion Injury and Vascular Permeability in Mice □. 2011. Vol. 1. P. 768-778.

135. Sekioka T. et al. Expression of CysLT2 receptors in asthma lung, and their possible role in bronchoconstriction // Allergol. Int. Elsevier B.V, 2015. Vol. 64, № 4. P. 351-358.

136. Itadani S. et al. Discovery of Gemilukast (0N0-6950), a Dual CysLT 1 and CysLT 2 Antagonist As a Therapeutic Agent for Asthma // J. Med. Chem. 2015. Vol. 58, № 15. P. 6093-6113.

137. Itadani S. et al. Discovery of Highly Potent Dual CysLT 1 and CysLT 2 Antagonist // ACS Med. Chem. Lett. 2014. Vol. 5, № 11. P. 1230-1234.

138. Yonetomi Y. et al. Leukotriene C4 induces bronchoconstriction and airway vascular hyperpermeability via the cysteinyl leukotriene receptor 2 in S-hexyl glutathione-treated guinea pigs // Eur. J. Pharmacol. Elsevier, 2015. Vol. 754. P. 98-104.

139. Yonetomi Y. et al. Effects of 0N0-6950, a novel dual cysteinyl leukotriene 1 and 2 receptors antagonist, in a guinea pig model of asthma // Eur. J. Pharmacol. Elsevier, 2015. Vol. 765. P. 242-248.

140. Sekioka T. et al. CysLT2receptor activation is involved in LTC4-induced lung air-trapping in guinea pigs // Eur. J. Pharmacol. 2017. Vol. 794, № August 2016. P. 147-153.

141. Matsuda M. et al. Increased expression of CysLT2 receptors in the lung of asthmatic mice and role in allergic responses // Prostaglandins Leukot. Essent. Fat. Acids. 2018. Vol. 131. P. 24-31.

142. Wang M.-L. et al. Leukotriene D4 induces brain edema and enhances CysLT2 receptor-mediated aquaporin 4 expression. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. Vol. 350, № 2. P. 399-404.

143. Takase B. et al. Angiology Arachidonic Acid Metabolites in Acute Myocardial Infarction.

144. Jiang W. et al. Endothelial Cysteinyl Leukotriene 2 Receptor Expression Mediates Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury // Am. J. Pathol. American Society for Investigative Pathology, 2008. Vol. 172, № 3. P. 592-602.

145. Duah E. et al. Cysteinyl leukotrienes regulate endothelial cell inflammatory and proliferative signals through CysLT2 and CysLTi receptors. // Sci. Rep. 2013. Vol. 3. P. 3274.

146. Zhao C.Z. et al. Cysteinyl leukotriene receptor 2 is spatiotemporally involved in neuron injury, astrocytosis and microgliosis after focal cerebral ischemia in rats // Neuroscience. 2011. Vol. 189. P. 1-11.

147. Rakoff-nahoum S. Cancer Mechanisms Why Cancer and Inflammation ? // Yale J. Biol. Med. 2006. Vol. 79. P. 123-130.

148. Maiga A. et al. Transcriptome analysis of G protein-coupled receptors in distinct genetic subgroups of acute myeloid leukemia: Identification of potential disease-specific targets // Blood Cancer J. 2016. Vol. 6, № 6. P. 1-9.

149. American Cancer Society (ACS). Key Statistics for Colorectal Cancer [Electronic resource] // Cancer.org. 2018.

150. Bengtsson A.M. et al. The cysteinyl leukotriene 2 receptor contributes to all-trans retinoic acid...: EBSCOhost // BMC Cancer. 2013. P. 1-13.

151. Fischer J., And C.R.G., Rotella D.P. Analogue-based drug discovery. 2554.

152. Kellaway C.H., Trethewie E.R. THE LIBERATION OF A SLOW-REACTING SMOOTH MUSCLE-STIMULATING SUBSTANCE IN ANAPHYLAXIS // Q. J. Exp. Physiol. Cogn. Med. Sci. 1940.

153. Sheard P., Killingback P.G., Blair A.M.J.N. Antigen Induced Release of Histamine and SRS-A from Human Lung passively sensitized with Reaginic Serum // Nature. 1967. Vol. 213, № 5081. P. 1125-1126.

154. Dahlen S.E. et al. Leukotrienes are potent constrictors of human bronchi // Nature. 1980. Vol. 288, № 5790. P. 484-486.

155. Lynch K.R. et al. Characterization of the human cysteinyl leukotriene CysLT1 receptor // Nature. 1999. Vol. 399, № 6738. P. 789-793.

156. Sarau H.M. et al. Identification, molecular cloning, expression, and characterization of a cysteinyl leukotriene receptor // Mol.Pharmacol. 1999. Vol. 56, № 0026-895X SB-IM. P. 657-663.

157. Itadani S. et al. Discovery of Highly Potent Dual CysLT1 and CysLT2 Antagonist // ACS Med. Chem. Lett. 2014. Vol. 5, № 11. P. 1230-1234.

158. Kim S.W. et al. Efficacy and Safety of Modified Pranlukast (Prakanon®) Compared with Pranlukast (Onon®): A Randomized, Open-Label, Crossover Study // Open Respir. Med. J. 2016. Vol. 10, № 1. P. 36-45.

159. Inoue H., Nojima H., 0kayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids // Gene. 1990. Vol. 96. P. 23-28.

160. Bac-to-Bac ® Baculovirus Expression System. № 10359.

161. Gueret V. et al. Rapid titration of adenoviral infectivity by flow cytometry in batch culture of infected HEK293 cells. // Cytotechnology. 2002. Vol. 38, № 1-3. P. 87-97.

162. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. P. 680-685.

163. Niesen F.H., Berglund H., Vedadi M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability // Nat. Protoc. 2007. Vol. 2, № 9. P. 2212-2221.

164. Caffrey M., Cherezov V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. // Nat. Protoc. 2009. Vol. 4, № 5. P. 706-731.

165. Li D. et al. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography // J. Vis. Exp. 2012. № e4001.

166. Bourenkov G.P., Popov A.N. A quantitative approach to data-collection strategies // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. International Union of Crystallography, 2006. Vol. 62, № 1. P. 58-64.

167. Murray J.W. et al. Parameters affecting the X-ray dose absorbed by macromolecular crystals // J. Synchrotron Radiat. 2005. Vol. 12, № 3. P. 268-275.

168. Paithankar K.S., Garman E.F. Know your dose: RADDOSE // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. International Union of Crystallography, 2010. Vol. 66, № 4. P. 381388.

169. Zander U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. International Union of Crystallography, 2015. Vol. 71, № 11. P. 23282343.

170. Gabadinho J. et al. MxCuBE: A synchrotron beamline control environment customized

for macromolecular crystallography experiments // J. Synchrotron Radiat. International Union of Crystallography, 2010. Vol. 17, № 5. P. 700-707.

171. Kabsch W., IUCr. XDS // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. International Union of Crystallography, 2010. Vol. 66, № 2. P. 125-132.

172. McCoy A.J. et al. Phaser crystallographic software // J. Appl. Crystallogr. International Union of Crystallography, 2007. Vol. 40, № 4. P. 658-674.

173. Snyder D.W., Bernstein P.R. Pharmacologic profile of chemically stable analogs of peptide leukotrienes // Eur. J. Pharmacol. 1987.

174. Adams P.D. et al. PHENIX : a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution // Acta Crystallogr. Sect. D Struct. Biol. 2010. Vol. 66. P. 213-221.

175. Emsley P. et al. Features and development of Coot // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. International Union of Crystallography, 2010. Vol. 66, № 4. P. 486-501.

176. Chun E. et al. Fusion partner toolchest for the stabilization and crystallization of G protein-coupled receptors. // Structure. Elsevier Ltd, 2012. Vol. 20, № 6. P. 967-976.

177. Wu B. et al. Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists // Science. American Association for the Advancement of Science, 2010. Vol. 330, № 6007. P. 1066-1071.

178. Ma L. et al. Structure of the CCR5 chemokine receptor - HIV entry inhibitor Maraviroc complex // Science (80-. ). 2013. Vol. 341, № 6152. P. 1387-1390.

179. Komives C. New Expression Systems for GPCRs. 2019.

180. Popov P. et al. Computational design of thermostabilizing point mutations for G proteincoupled receptors // Elife. 2018. Vol. 7. P. e34729.

181. Katritch V. et al. Allosteric sodium in class A GPCR signaling // Trends Biochem. Sci. 2015. Vol. 39, № 5. P. 233-244.

182. Roth C.B., Hanson M.A., Stevens R.C. Stabilization of the Human P2-Adrenergic Receptor TM4-TM3-TM5 Helix Interface by Mutagenesis of Glu1223.41, A Critical Residue in GPCR Structure // J. Mol. Biol. 2008. Vol. 376, № 5. P. 1305-1319.

183. White K.L. et al. Structural Connection between Activation Microswitch and Allosteric

Sodium Site in GPCR Signaling // Structure. Elsevier Ltd., 2018. Vol. 26, № 2. P. 259269.

184. Cherezov V. et al. Rastering strategy for screening and centring of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 p,m size X-ray synchrotron beam // J. R. Soc. Interface. 2009. Vol. 6, № SUPPL. 5. P. 587-597.

185. Weik M. et al. Specific chemical and structural damage to proteins produced by synchrotron radiation // Proc. Natl. Acad. Sci. 2002. Vol. 97, № 2. P. 623-628.

186. Luginina A. et al. Structure-based mechanism of cysteinyl leukotriene receptor inhibition by antiasthmatic drugs // Sci. Adv. 2019. Vol. 5, eaax251.

187. Gusach A. et al. Structural basis of ligand selectivity and disease mutations in cysteinyl leukotriene receptors // Nat. Commun. Springer US, 2019. Vol. 10, 5573.

188. Gusach A. et al. Structural Basis of Ligand Selectivity and Disease Mutations in Cysteinyl Leukotriene Receptors // Nat. Commun. 2019. Vol. 10:5573.

189. Luginina A. et al. Structure-based mechanism of cysteinyl leukotriene receptor inhibition by antiasthmatic drugs // Sci. Adv. 2019. Vol. 5, № 10.

190. Zhao S. et al. Universal activation mechanism of class A GPCRs // bioRxiv. 2019. P. 147.

191. Li B. et al. Random mutagenesis of the M3muscarinic acetylcholine receptor expressed in yeast: Identification of second-site mutations that restore function to a coupling-deficient mutant M3receptor // J. Biol. Chem. 2005.

192. Elgeti M. et al. Conserved Tyr2235.58 plays different roles in the activation and G-protein interaction of rhodopsin // J. Am. Chem. Soc. 2011.

193. Kruse A.C. et al. Activation and allosteric modulation of a muscarinic acetylcholine receptor // Nature. 2013. Vol. 504, № 7478. P. 101-106.

194. Magnus Bäck, Sven-Erik Dahlén, Jeffrey Drazen, Jilly F. Evans, G. Enrico Rovati, Charles N. Serhan, Takao Shimizu T.Y. Leukotriene receptors: CysLT2 receptor. Last modified on 27/03/2019. Accessed on 18/06/2019. IUPHAR/BPS Guide to PHARMACOLOGY,

http://www.guidetopharmacology.org/GRAC/ObjectDisplayForward?objectId=270. [Electronic resource].

195. Wheatley M. et al. Lifting the lid on GPCRs: The role of extracellular loops // Br. J. Pharmacol. 2012. Vol. 165, № 6. P. 1688-1703.

196. Itadani S. et al. Discovery of a potent, orally available dual CysLTl and CysLT2 antagonist with dicarboxylic acid // Bioorganic Med. Chem. 2015. Vol. 23, № 9. P. 20792097.

197. Itadani S. et al. Discovery of Gemilukast (ONO-6950), a Dual CysLT 1 and CysLT 2 Antagonist As a Therapeutic Agent for Asthma // J. Med. Chem. 2015. Vol. 58, № 15. P. 6093-6113.

198. Itadani S. et al. Discovery of a potent, orally available dual CysLT1 and CysLT2 antagonist with dicarboxylic acid // Bioorganic Med. Chem. 2015. Vol. 23, № 9. P. 20792097.

199. Thompson M.D. et al. A cysteinyl leukotriene 2 receptor variant is associated with atopy in the population of Tristan da Cunha // Pharmacogenetics. 2003. Vol. 13, № 10. P. 641649.

200. Yuan S. et al. Activation of G-protein-coupled receptors correlates with the formation of a continuous internal water pathway // Nat. Commun. 2014. Vol. 5. P. 4733.

201. Tao Y.X. Constitutive activation of G protein-coupled receptors and diseases: Insights into mechanisms of activation and therapeutics // Pharmacol. Ther. NIH Public Access, 2008. Vol. 120, № 2. P. 129-148.

202. Lek M. et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans // Nature. Nature Publishing Group, 2016. Vol. 536, № 7616. P. 285-291.

203. Чугунов А. Драг-дизайн: как в современном мире создаются новые лекарства [Electronic resource]. URL: https://biomolecula.ru/articles/drag-dizain-kak-v-sovremennom-mire-sozdaiutsia-novye-lekarstva#source-4.