Получение пространственной структуры сфингозин-1-фосфатного рецептора S1P5 для поиска селективных антагонистов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Ляпина Елизавета Алексеевна

• Ляпина Елизавета Алексеевна
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Ляпина Елизавета Алексеевна

Содержание

Введение

Актуальность работы

Актуальность определения пространственных структур рецепторов семейства ОРСЯ

Актуальность исследования сфингозин-1-фосфатных рецепторов

Цель и задачи работы

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

Объём и структура диссертации

Обзор литературы

Рецепторы и лиганды

О-белки и рецепторы, сопряжённые с О-белком

Родопсин-подобные рецепторы

Структурные исследования липидных ОРСЯ

Особенности лиганд-связывающего кармана липидных рецепторов

Структурные исследования 81РЯ

Сфингозин-1-фосфатные рецепторы и их сигнальные пути

Биосинтез и утилизация сфингозин-1-фосфата

Открытие рецептора сфингозин-1-фосфата 81Рб

Пути передачи сигнала с помощью 81Р5

Экспрессия 81Рз в органах человека и крысы

81Рз в нервной системе

81Рз в иммунной системе

Болезни, ассоциированные с 81Р5

Виртуальный скрининг на основе структуры

Рентгеноструктурный анализ с помощью рентгеновского лазера на свободных электронах (РЛСЭ)

Кристаллизация белков

Экспрессия и очистка мембранных белков

Валидация структуры с помощью функциональных тестов

Материалы и методы

Материалы

Методы

Приготовление компетентных клеток

Получение генетических конструкций

Трансформация БИ10Бас

Выделение бакмиды

Трансфекция

Получение вируса Р1

Титрование вируса

Получение биомассы 8©, экспрессирующей целевой мембранный белок

Определение полной и поверхностной экспрессии белка в 8£9

Выделение белка

Аналитическая эксклюзионная хроматография

Определение термостабильности белка

8Б8-гель-электрофорез белка

Предкристаллизационная подготовка белка

Кристаллизация

Дифракционные измерения и решение структуры

Функциональные тесты влияния мутаций 81Р5 на передачу сигнала через О;

Результаты и обсуждение

Поиск оптимальной генетической конструкции

Тестирование белков-партнёров

Оптимизация концентрации NaCl при очистке белка

Тестирование точечных мутаций

Оптимизация положения BRIL

Тестирование наилучших точечных мутаций с оптимальным положением BRIL

Анализ степени очистки белка и гликозилирования

Тестирование лигандов

Кристаллизационные испытания

Дифракционные испытания

Анализ кристаллографических данных

Структура S1P5 в комплексе с ONO-5430608

Активационные мотивы и сайт связывания натрия

Лиганд-связывающий карман

Функциональные тесты для валидации структуры

Механизм активации и особенности обратного агонизма S1P5

Встречающиеся в организме человека мутации S1P5

Заключение

Основные выводы работы

Опубликованные работы по теме диссертации

Статьи в журналах, индексируемые Scopus, Web of Science:

Личный вклад соискателя

Апробация работы

Тезисы и сборники трудов международных конференций по теме диссертации:

Тезисы и сборники трудов всероссийских конференций

Благодарности

Список используемых сокращений

Библиографический список используемой литературы

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение пространственной структуры сфингозин-1-фосфатного рецептора S1P5 для поиска селективных антагонистов»

Актуальность работы

Актуальность определения пространственных структур рецепторов семейства GPCR

Рецепторы, сопряжённые с G-белком (GPCRs), представляют собой самое крупное (более 800 членов) семейство мембранных белков [1]. Они являются частью своеобразной панели управления клеткой, поскольку, реагируя на определённые химические соединения или физические стимулы, они запускают каскады биохимических и физиологических реакций в клетках. Соединения, запускающие или модулирующие эти реакции при взаимодействии с рецепторами, в биохимии и фармакологии называются лигандами. Основным действующим веществом многих лекарств (около 30% одобренных препаратов) являются лиганды GPCR [2], которые изменяют параметры динамики процессов и влияют на состояние как отдельных клеток, так и тканей и органов. Перспективность фармакологических исследований рецепторов, сопряжённых с G-белком обусловлена высокой долей представителей данного семейства мембранных белков среди мишеней лекарственных препаратов.

Разработка лекарств - трудоёмкий и ресурсозатратный процесс. Снижение стоимости этой разработки возможно осуществить с помощью компьютерного дизайна лекарственных средств. Это достигается с помощью виртуального скрининга на основе структур белка и лиганда, оценивающего силу нековалентного взаимодействия между белком-мишенью и кандидатом в лекарства, что позволяет сократить количество соединений для экспериментов in vitro [3].

Актуальность исследования сфингозин-1-фосфатных рецепторов

Поражения иммунной и нервной системы человека, такие как рассеянный склероз, все чаще выявляются у пациентов [4]. Поэтому актуализируется задача разработки лекарств, способных замедлить или остановить развитие болезни, а также восстановить нормальное функционирование человеческого организма. В данной области перспективным является исследование сфингозин-1-фосфатных рецепторов пятого типа (SIP5), которые экспрессируются преимущественно в клетках иммунной и нервной систем [5]. Одним из медикаментозных методов лечения такого аутоиммунного

заболевания нервной системы, как рассеянный склероз, является введение в организм агонистов рецепторов 81Р1 и 81Р5 [6]. Однако существующие лекарственные средства зачастую одновременно активизируют и другие сфингозин-1-фосфатные рецепторы, что приводит к нежелательным побочным эффектам [7, 8]. Поэтому задача поиска альтернативных лигандов, способных избирательно и целевым образом взаимодействовать с рецепторами 81Р1 и 81Р5, является актуальной для современной фармакологии.

Цель и задачи работы

Целью настоящей работы является получение и описание пространственной структуры рецептора 81Р5 человека с помощью рентгеноструктурного анализа, что в дальнейшем позволит рационально создавать модуляторы, нацеленные на этот рецептор.

Для реализации цели работы были поставлены следующие задачи:

• Получение генетических конструкций 81Р5, включающих модификации, необходимые для получения белка, подходящего для структурных и биофизических исследований с точки зрения гомогенности, стабильности и способности образовывать кристаллизационные контакты.

• Оптимизация уровня экспрессии полученных конструкций в бакуловирусной системе экспрессии в клетках насекомых £/9.

• Отбор конструкций по выходу полученного белка, термостабильности и мономерности очищенного препарата белка.

• Получение очищенного и стабилизированного препарата рецептора 81Р5 для структурных исследований.

• Кристаллизация белка методом нанолитровой кристаллизации в липидной кубической фазе.

• Оптимизация кристаллизационных условий.

• Определение пространственной структуры 81Р5 методом рентгеноструктурного анализа и её описание.

• Проведение структурно-функционального анализа молекулярного механизма работы рецептора.

Научная новизна

В настоящей работе впервые оптимизирована экспрессия сфингозин-1-фосфатного рецептора пятого типа. Показана зависимость мономерности и термостабильности рецептора 81Р5 от аминокислотной последовательности и положения белка-партнёра. Впервые определено влияние 12 высокоаффинных лигандов на термостабильность 81Р5. Определены условия кристаллизации, получена и проанализирована пространственная структура рецептора 81Р5 в комплексе с обратным агонистом. Впервые описаны структурные основания селективности лигандов рецепторов 81Р, а также механизм обратного агонизма для этих рецепторов.

Теоретическая и практическая значимость

Определённая в этом исследовании структура 81Р5 в комплексе с обратным агонистом 0К0-5430608 демонстрирует механизм обратного агонизма для 81Р-рецепторов через косвенное блокирование двойного микропереключателя Ь336 — (номера остатков, показанные верхними индексами, соответствуют номенклатуре Баллестерос-Вайнштейн [9]: первой цифрой указывается номер трансмембранной альфа-спирали, а после точки указывается номер остатка относительно наиболее консервативного, имеющего номер 50; петли также могут иметь нумерованные остатки, для этого перед точкой указываются две цифры, соответствующие номерам спиралей, которые соединяет петля), что позволяет осуществить рациональную разработку обратных агонистов для 81Р-рецепторов. Также с помощью этой структуры был обнаружен аллостерический подкарман, вариабельный в различных 81РЯ. Таргетирование этого подкармана облегчает рациональный дизайн селективных модуляторов 81РЯ и 81Р5, в частности.

Положения, выносимые на защиту

1. Генетическая конструкция на основе гена 8!РЯ5 и термостабилизированного апоцитохрома Ъ562ШЬ (81Р5-ВШЬ) обеспечивает высокую экспрессию и получение очищенного белка, обладающего достаточной для кристаллизации гомогенностью и термостабильностью.

2. Оптимизированный протокол экспрессии и очистки химерной конструкции 81Р5-ВШЬ позволяет получить белок с достаточными для кристаллизации выходом (0,5 мг/л), гомогенностью и термостабильностью.

3. Метод ко-кристаллизации химерной конструкции SIPs-BRIL с обратным агонистом ONO-5430608 продуцирует кристаллы, пригодные для проведения структурных исследований с помощью серийной фемтосекундной кристаллографии на рентгеновском лазере на свободных электронах (РЛСЭ).

4. Получена структура высокого разрешения человеческого рецептора SIP5 в комплексе с обратным агонистом ONO-5430608 с использованием серийной фемтосекундной кристаллографии на РЛСЭ.

5. Проведён анализ взаимодействий аминокислотных остатков лиганд-связывающего кармана SIP5 с лигандом, демонстрирующий структурный базис селективности и обратного агонизма S1PR.

Степень достоверности и апробация результатов

Приведённые экспериментальные данные проверялись общепринятыми статистическими критериями, а также проводились повторные эксперименты для подтверждения воспроизводимости.

Структура комплекса SIP5 с ONO-5430608, полученная в ходе исследовательской работы, была депонирована в банк данных трёхмерных структур белков и нуклеиновых кислот Protein Data Bank (PDB) под идентификатором 7YXA.

По итогам диссертационной работы опубликованы 3 статьи в рецензируемых журналах, индексируемых базами данных Web of Sciences, Scopus и RSCI, включая статью в журнале Nature Communications, где исполнитель данной работы является первым автором. Основные материалы диссертации докладывались на 4 международных конференциях: 42nd FEBS Congress, 10-14 сентября 2017, Иерусалим, Израиль; 43rd FEBS Congress, 7-12 июля 2018, Прага, Чехия; Биомембраны'18, 1-5 октября 2018, Долгопрудный, Россия; 13-я Международная мультиконференция «Биоинформатика Геномной Регуляции и Структурной/Системной Биологии» - BGRS/SB-2022, 4-8 июля 2022, Новосибирск, Россия и 5 всероссийских конференциях: 60-я Всероссийская научная конференция МФТИ, Долгопрудный, 20-26 ноября 2017; 63-я Всероссийская научная конференция МФТИ, Долгопрудный, 23-29 ноября 2020; 64-я Всероссийская конференция МФТИ, 21 ноября - 3 декабря 2021, Долгопрудный; 25-ая Пущинская школа-конференция молодых учёных с международным участием «Биология - наука XXI века», 18-22 апреля 2022, Пущино; III Объединённый научный форум, включающий VII

Съезд биохимиков России, X Российский симпозиум «Белки и пептиды» и VII Съезд физиологов (Сочи, Дагомыс, 3-7 октября 2022).

Объём и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список использованной литературы. Работа изложена на 123 страницах машинописного текста и включает 48 рисунков и 9 таблиц. Библиографический указатель содержит 204 источника.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Рецепторы и лиганды

Клеточный ответ на различные стимулы определяется присутствием рецепторов -белков, которые специализируются на связывании определённых сигнальных молекул. Рецепторы можно разделить на 4 основных типа: лиганд-активируемые ионные каналы, рецепторы, сопряжённые с О-белком, рецепторы, сопряжённые с ферментом, и внутриклеточные рецепторы (рис. 1) [10].

Рис. 1. Типы рецепторов (перерисовано из [10]). А: лиганд-активируемые ионные каналы: при связывании лиганда конформация канала изменяется таким образом, чтобы он мог пропускать ионы. Б: рецепторы, сопряжённые с ферментом: при связывании сигнальной молекулы фермент активируется и становится способным превращать субстрат в продукт. В: рецепторы, сопряжённые с О-белком: после связывания лиганда конформация рецептора позволяет связывать и активировать О-белок. Г: внутриклеточные рецепторы: сигнальная молекула проходит сквозь мембрану, связывается с рецептором, активирует его, и он регулирует

транскрипцию.

Сигнальные молекулы называют лигандами, так как они связываются (лат. "^апёш" - «связываемый») с рецепторами. Существуют различные типы лигандов рецепторов: агонисты, антагонисты, обратные агонисты. Агонист представляет собой молекулу, способную связываться и функционально активировать рецептор-мишень. Антагонист представляет собой молекулу, которая связывается с мишенью и препятствует связыванию других молекул (например, агонистов). Антагонисты не влияют на рецепторную активность. Обратный агонист представляет собой соединение, которое связывает и предотвращает активность конститутивного рецептора в отсутствие агониста. Частичный агонист - это молекула, которая связывается с мишенью, но не обладает способностью полностью активировать рецептор [11], а суперагонистом является соединение, активирующее рецептор в большей степени, чем эндогенный агонист [12].

Также лиганды различаются по сайту связывания: ортостерические, которые связываются в активном центре; и аллостерические, которые связываются в другом месте на поверхности белка [13]. В зависимости от влияния аллостерических лигандов на активацию рецептора, различают положительные, отрицательные и нейтральные аллостерические модуляторы [14].

G-белки и рецепторы, сопряжённые с G-белком

Одним из крупнейших суперсемейств мембранных рецепторов являются рецепторы, сопряжённые с G-белком, насчитывающие более 800 членов [15]. Они реагируют на широкий круг сигнальных молекул: белки, пептиды, жирные кислоты и многие другие. Но несмотря на это, они имеют общую топологию с N-концом на внешней стороне мембраны, семью трансмембранными спиралями, тремя внеклеточными и тремя внутриклеточными петлями, а также С-концом на внутренней стороне мембраны, содержащим восьмую спираль (рис. 2) [16].

N-конец ECL1 ECL2 ECL3

Рис. 2. Схема строения ОРСЯ: семь трансмембранных спиралей (ТМ1-7), три внеклеточные (ЕСЫ-3) и три внутриклеточные (1СЫ-3) петли, восьмая С-концевая спираль (Н8).

На основании сходства первичной структуры и подобия функций, выделяют 6 классов ОРСЯ, 4 из которых присутствуют в организме человека: класс А (родопсин-подобные), класс В (секретин-подобные рецепторы, также включающие рецепторы адгезии), класс С (метаботропные глутаматные рецепторы) и класс Б (рецепторы Й1221ед/ТА82); два других класса включают классы Б (рецепторы феромонов спаривания грибов) и Е (рецепторы цАМФ) [17]. Отличительной чертой родопсин-подобных рецепторов (класс А) является наличие мотивов Б[Е]ЯУ и ОТХХУ [18], а также расположение сайта связывания эндогенного лиганда в области 7ТМ [19]. В случае секретин-подобных рецепторов (класс В) лиганд распознается как внеклеточным доменом, так и 7ТМ. Для ОРСЯ класса С лиганд-связывающий карман находится во внеклеточном домене, включающем в себя модуль Венериной мухоловки. В случае ОРСЯ

класса F рецепторы SMO и FZD обладают внеклеточным доменом (ECD), который состоит из богатого цистеином домена (CRD) и линкерного домена (hinge domain, HD

[19]).

Когда агонист связывается с GPCR, рецептор претерпевает конформационные изменения, что позволяет рецептору активировать гетеротримерный G-белок. Эти G-белки прикрепляются к цитоплазматической поверхности плазматической мембраны, функционально сопрягая рецептор с ферментами или ионными каналами [20].

G-белки являются гетеро-тримерами, они состоят из a-, ß- и у-субъединиц, стабилизированных в неактивном состоянии молекулой ГДФ. При взаимодействии с активированным рецептором происходят конформационные перестройки в приводящие к обмену ГДФ на ГТФ и распаду на Ga и Gßy. В зависимости от a-субъединицы, различают четыре семейства G-белков: Gs, Gq, Gi, G12/13. Gas и Gai регулируют производство цАМФ в клетке, при этом Gas является стимулирующей субъединицей, а Gai - ингибирующей. Gaq активирует фосфолипазу C-ß и инициирует сигнальный путь инозитолфосфолипида. Gal2 активирует малую ГТФазу Rho или Ras, влияя на цитоскелет [21]. В свою очередь, активированный Gßy комплекс регулирует ионные каналы, киназы и другие эффекторы [22].

Родопсин-подобные рецепторы

Родопсин-подобные рецепторы, или рецепторы класса A, связывают различные классы соединений, поэтому можно разделить их на следующие семейства: аминергические рецепторы, пептидные рецепторы, белковые рецепторы, липидные рецепторы, мелатониновые рецепторы, нуклеотидные рецепторы, стероидные рецепторы, рецепторы аликарбоновых кислот, сенсорные рецепторы, орфанные рецепторы. Однако все они имеют общие черты механизма активации (рис. 3) [23].

Рис. 3. Механизм активации родопсин-подобных рецепторов (адаптировано - перевод из [23] согласно лицензии CC BY 4.0). Узлами показаны структурно эквивалентные остатки GPCR, цветами показаны мотивы и микропереключатели (CWxP, PIF, натриевый сайт, NPxxY, DRY), рёбрами показаны контакты. В слое 1 происходит консервативная стадия инициации сигнала, включающая конформационные изменения контактов остатков в глубине лиганд-связывающего кармана, и кармана Na+. В слое 2 открывается гидрофобный замок. В слое 3 перепаковываются остатки активационных мотивов (6.37, Y7.53), а в слое 4 изменяется положение остатка R3.50 и

остатков, контактирующих с G-белком.

Первым шагом связывание агониста вызывает изменение конформаций микропереключателя 6.48 и P-I-F-мотива (3.40, 5.51, 6.44 и 6.48) и №+-кармана (2.50, 3.39, 7.45 и 7.49). В частности, переупаковка внутриспирального контакта между остатками в 6.48 и 6.44 вместе с переключением остатка 3.40 на 6.48 и остатка 5.51 на 6.44 сжимает интерфейс TM3-5-6 в первом слое. Эта реорганизация инициализирует вращение цитоплазматического конца TM6. Разрушение кармана Na+ приводит к более плотной

переупаковке четырёх остатков (2.50, 3.39, 7.45 и 7.49), инициируя движение ТМ7 к ТМ3. Далее, ближе к внутриклеточной стороне, два остатка (6.40 и 6.41) переключают свои контакты с остатка 3.43 и вместо этого образуют новые контакты с остатками в 5.58 и 5.55, соответственно. Остатки 3.43, 6.40 и 6.41, как правило, гидрофобны, их также называют гидрофобным замком. Его открытие разреживает упаковку спиралей ТМ3-6, что позволяет цитоплазматическому концу шестой спирали двигаться наружу, что необходимо для активации. Кроме того, 7.49 образует контакты с остатком в 3.43, облегчая движение ТМ7 к ТМ3.

Вторым шагом 7.53 утрачивает свои межспиральные контакты с остатками 1.53 и 8.50, образуя новые контакты с остатками 3.43, 3.46 и 3.50, которые были плотно упакованы с остатками в ТМ6. Таким образом, переключение контактов остатка 7.53 усиливает упаковку ТМ3-ТМ7, в то время как упаковка ТМ3-ТМ6 дополнительно ослабляется при движении наружу ТМ6.

Третьим шагом снимаются ограничения на Я3 50, включая более консервативные, локальные внутриспиральные контакты с Б3 49 и менее консервативный ионный замок с Б6 30, и Я3 50 освобождается. Примечательно, что переключение контактов между Я350 и остатком 6.37 важны для высвобождения Я3 50, который разрывает оставшиеся контакты между ТМ3 и ТМ6 в цитоплазматическом конце и стимулирует наружное движение ТМ6. Переключённые контакты Я350 и другие положения контакта О-белка (3.53, 3.54, 5.61 и 6.33) делают рецептор способным связывать О-белок.

Структурные исследования липидных СРОК

Выделяют несколько групп липидных рецепторов: рецепторы свободных жирных кислот, лейкотриеновые рецепторы, лизофосфолипидные (сфингозин-1-фосфатные рецепторы и рецепторы лизофосфатидной кислоты), каннабиноидные рецепторы, орфанные рецепторы ОРЯ18, ОРЯ55 и ОРЯ119, рецептор фактора активации тромбоцитов, простаноидные рецепторы [24]. В таблице 1 показано наличие представителей каждого семейства, для которых получена пространственная структура.

Таблица 1. Семейства липидных рецепторов и их представители, для которых определена структура [26-61].

Надсемейство рецепторов Семейство рецепторов Структуры рецепторов

Рецепторы свободных жирных кислот Рецепторы свободных жирных кислот (ББА) FFÂ1 [25, 26, 27]

Лейкотриеновые рецепторы Рецепторы лейкотриена В4 BLT1 [28, 29, 30]

Цистеинил-лейкотриеновые рецепторы CysLT1 [31], CysLT2 [32]

Рецептор ОХЕ —

Лизофосфолипидные рецепторы Сфингозин-1-фосфатные рецепторы S1P1 [33, 34, 35, 36], S1P2 [37], S1P3 [38, 39], S1P5 [34, 40]

Рецепторы лизофосфатидной кислоты LPÂ1 [41, 36], LPÂ6 [42]

Каннабиноидные рецепторы Каннабиноидные рецепторы (СВ) CB1 [43, 44, 45, 46, 47, 48], CB2 [49, 50, 47]

GPR18, GPR55, GPR119 ОРЯ18, ОРЯ55, ОРЯ119 GPR119 [51]

Рецептор фактора активации тромбоцитов Рецептор фактора активации тромбоцитов (РАБ) PÂF [52]

Простаноидные рецепторы Рецепторы простагландина Б2 DP2 [53, 54]

Рецепторы простагландина Е2 EP2 [55], EP3 [56, 57], EP4 [58, 59]

Рецептор простагландина Б2а —

Рецептор простациклина —

Рецептор тромбоксана TP [60]

Все липидные ОРСЯ класса А обладают обычной топологией ОРСЯ, имея семь трансмембранных спиралей, К-конец на внешней стороне мембраны и С-конец на

внутренней. Как правило, лиганд-связывающий карман липидного рецептора является амфипатическим в силу амфипатичности самого эндогенного лиганда (рис. 4).

Рис. 4. Эндогенные агонисты липидных рецепторов. На оранжевом фоне показаны агонисты рецепторов жирных кислот FFA1-4, на красном - рецепторов лизофосфатидной кислоты LPAi-6, на фиолетовом - сфингозин-1-фосфатных рецепторов SIP1-5, на коричневом - фактор активации тромбоцитов - агонист PAFR, на зелёном - лейкотриены: B4 - агонист BLT1-2, C4, D4 и E4 -агонисты CysLT1-2, на синем фоне - каннабиноидных рецепторов CB1-2, на розовом -

простаноидных рецепторов.

Наиболее близкими между собой с точки зрения первичной структуры являются семейства каннабиноидных рецепторов и EDG-рецепторов, включающих в себя рецепторы сфингозин-1-фосфата S1P1-5 и рецепторы лизофосфатидной кислоты LPA1-3 (рис. 5). S1PR [37, 38, 34, 33], LPA1 [41] и CB2 [49] отличает N-концевая спираль, накрывающая внеклеточную сторону рецептора. CB1 [43] обладает довольно длинным N-концом, который был обрезан для структурных исследований и смоделирован в полученной структуре лишь частично. Вход лиганда осуществляется либо с внеклеточной стороны (как у LPA1), либо между TM1 и TM7 (S1P1, CB1), либо между TM4 и TM5 (CysLT1-2), в случае CB2 вход не определён.

Рис. 5. Дерево гомологии липидных рецепторов с известной структурой [61]. Розовым показаны простаноидные рецепторы, зелёным - рецепторы лейкотриенов, фиолетовым - сфингозин-1-

фосфата, красным - лизофосфадиной кислоты, синим - каннабиноидные рецепторы, коричневым - рецептор фактора активации тромбоцитов, оранжевым - рецепторы жирных

кислот.

Особенности лиганд-связывающего кармана липидных рецепторов

Рассмотрим лиганд-связывающие карманы каннабиноидных рецепторов и ЕБО-рецепторов как наиболее близких к 81Р5. В случае ЬРА1 (РБВ 1Б 4236 [41]), в верхней части полярной области связывающего кармана карбоновая кислота антагониста 0К0-9780307 взаимодействует через полярные и ионные связи с остатками Н40, К39 и У34, которые все расположены на К-концевой кэппирующей спирали и петле, соединяющей К-концевую спираль и ТМ1 (ЕСЬ0). В семействе ЕБО К-концевые тирозин и лизин в составе кэппирующей спирали высоко консервативны, однако Н40 уникален для ЬРА1, и его протонирование может быть важным для взаимодействий с высоким

сродством с карбоновой кислотой ONO-9780307. Хотя для окончательных выводов требуется экспериментальное подтверждение, расчёты энергии связи между LPAi дикого типа с протонированным H40 и 0N0-9780307 по сравнению с мутацией H40A in silico показали более чем 1 ккал/моль разницы в сродстве связывания [41], подтверждая гипотезу, что эта позиция может быть частично ответственной за наблюдаемую селективность антагонистов этого класса в отношении LPA1 по сравнению с LPA2 и LPA3.

Карман полярного связывания продолжается на TM3, где R124328 и Q125329 образуют ионные и полярные взаимодействия с карбоновой кислотой и хиральной гидроксильной группой 0N0-9780307, соответственно. Из TM7 E293735 стабилизирует положение K39, но не взаимодействует напрямую с лигандом (рис. 6А). Поверхность связующего кармана, образованная TM3 и TM5, представляет собой значительно усиленную полярную среду по сравнению с S1P1, состоящим из D1293 33 на TM3 и W2 1 05 43 на TM5, который предоставляет свой индольный азот для взаимодействия водородных связей с лигандами-антагонистами (рис. 6) [41].

Рис. 6. Лиганд-связывающий карман LPAi (воспроизведено и адаптировано путём перевода на русский язык из [41] согласно разрешению (лицензии) издательства "Elsevier"). А: Связывание ONO-9780307 в кармане LPAi (PDB ID 4Z36). Полярные взаимодействия показаны пунктирными желтыми линиями. Индановый карман связывания образован Gly274651 и Leu275652, которые показаны сферами. Области для улучшения связывания лиганда обозначены красным текстом, а красные сферы указывают положения для дополнительных полярных

взаимодействий.

Б: Форма кармана для связывания LPAi более сферическая (сплошная поверхность) по сравнению с более вытянутым карманом для связывания S1Pi (синяя сетчатая поверхность,

PDB ID 3V2Y).

Расположение К192328 в СВ1 уникально по сравнению с его эквивалентным остатком Я3 28 в ЬРЛ1 и 81Рь В ЬРЛ1 и 81Р^ Я3 28 указывает в связывающий карман, образуя сильное взаимодействие с фосфатной головной группой лигандов; он стабилизируется отрицательно заряженным или полярным остатком 3.29 ^125 в ЬРЛ1 и Е121 в 81Р1). Однако в СВ1 остатки и лиганд возле Ь193329 гидрофобны, поэтому для положительно заряженного К192328 энергетически выгодно быть ориентированным в сторону от связывающего кармана. Фактически К192328 функционирует как стабилизирующий якорь, образуя солевой мостик вместо непосредственного взаимодействия с лигандом как Я3 28 в ЬРЛ1 и 81Р1. Другим важным отличием эндогенных лигандов СВ1 (анандамид, 2-ЛО), ЬРЛ1 (ЬРЛ) и 81Р1 (81Р) является головная группа. «Головы» лигандов ЬРЛ1 и 81Р1 представляют собой отрицательно заряженные фосфатные группы, тогда как «головы» лигандов СВ1 являются нейтральными. Фактически фосфорилирование головной группы СВ1-лигандов анандамида и 2-ЛО трансформирует их в лиганды ЬРЛ1 (рис. 7) [43].

Рис. 7. Лиганд-связывающий карман рецептора CBi (воспроизведено и адаптировано путём перевода на русский язык из [43] согласно разрешению (лицензии) издательства "Elsevier"). А:

Ключевые остатки CBi для связывания AM6538 (PDB ID 5TGZ). Лиганд AM6538 (зеленые углероды) и аминокислотные остатки CBi (бирюзовые углероды), участвующие в связывании лиганда, показаны в виде палочек. Рецептор показан серым. Б: Форма кармана связывания лиганда. AM6538 (зеленые углероды) и ML056 (коричневые углероды) показаны в виде

стержней.

В: Схематическое изображение взаимодействия между CBi и AM6538. Кольцо 2,4-дихлорфенила в красном овале обозначено как «рука 1»; фенильное кольцо, замещенное 4-алифатической цепью, выделенное синим, обозначено как «рука 2»; пиперидин-1-илкарбамоил,

обведённый зелёным - «рука 3». Нитратная группа, которая не наблюдалась в электронной плотности, показана серым цветом. Г: Карта электронной плотности |Fo|-|Fc|, рассчитанная на основе уточненной структуры комплекса CBi-AM6538, очерченная на уровне 3о.

Взаимодействия между AMi0257 и CB2 в основном гидрофобные и ароматические, состоящие из остатков из ECL2, а также спиралей TM2, TM3, TM5 и TM6. Ядро пиразольного кольца AMi0257 находится среди спиралей TM2, TM3 и TM7, образуя п-п-взаимодействия с Phei83ECL2 и гидрофобные взаимодействия с Phe8 72 57 и Valii33 32. Бензольное кольцо («рука i») направлено вниз и одновременно участвует в п-п-

взаимодействиях с РИе1173-36 и Тгр258648. 5-гидроксипентильная цепь («рука 2») проходит между спиралями ТМ3 и ТМ5, образуя гидрофобные взаимодействия с ТЬг114333, Phe183ECL2, 11е186ЕСЬ2 и Тгр194 5 43, тогда как концевая гидроксигруппа в алкильной цепи участвует в локальной сети водородных связей, образованной молекулой воды и карбокси-кислородом 8ег165 4 57. Адамантильная группа («рука 3») распространяется к спиралям ТМ2 и ТМ3, устанавливая обширные гидрофобные взаимодействия с Phe872.57, Phe912.61, Phe942.64, №895265 и Phe183ECL2 (рис. 8) [49].

Рис. 8. Лиганд-связывающий карман рецептора CB2 (воспроизведено и адаптировано путём перевода на русский язык из [49] согласно разрешению (лицензии) издательства "Elsevier"). А: Скаффолд лиганда AM10257 - «три руки». Бензольное кольцо, 5-гидроксипентильная группа и адамантильная группа в красных, синих и зеленых квадратах называются «рука 1», «рука 2» и «рука 3» соответственно. Также показаны ключевые остатки, которые образуют связывающие

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ляпина Елизавета Алексеевна, 2023 год

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Dorsam, R. T. & Gutkind, J. S. G-protein-coupled receptors and cancer. Nature Reviews Cancer, v. 7, p. 79-94, 2007.

2. Latorraca, N. R., Venkatakrishnan, A. J. & Dror, R. O. GPCR Dynamics: Structures in Motion. Chemical Reviews, v. 117, p. 139-155, January 2017.

3. Maia, E. H. B. et al. Structure-Based Virtual Screening: From Classical to Artificial Intelligence. Frontiers in Chemistry, v. 8, p. 343, 2020.

4. Nelson, L. M. et al. A new way to estimate neurologic disease prevalence in the United States: Illustrated with MS. Neurology, v. 92, p. 469-480, March 2019.

5. Im, D. S. et al. Characterization of a novel sphingosine 1-phosphate receptor, Edg-8. Journal of Biological Chemistry, v. 275, p. 14281-14286, May 2000.

6. Ziemssen, T. et al. Gaining First Insights on Secondary Progressive Multiple Sclerosis Patients Treated With Siponimod in Clinical Routine: Protocol of the Noninterventional Study AMASIA. JMIR Research Protocols, v. 9, p. e19598, July 2020.

7. Kappos, L et al. Siponimod versus placebo in secondary progressive multiple sclerosis (EXPAND): a double-blind, randomised, phase 3 study. Lancet, v. 391, p. 1263-1273, March 2018.

8. Rafiee Zadeh, A et al. Mechanism and adverse effects of multiple sclerosis drugs: a review article. Part 1. International Journal of Physiology, Pathophysiology and Pharmacology, v. 11, p. 95-104, 2019.

9. Ballesteros, J. A. & Weinstein, H. Integrated methods for the construction of three-dimensional models and computational probing of structure-function relations in G protein-coupled receptors. / Methods in Neurosciences, Elsevier, 1995, p. 366-428.

10. Purves, D. Neuroscience, Sinauer Associates, p. 773.

11. Zhu, B. T. Mechanistic explanation for the unique pharmacologic properties of receptor partial agonists. Biomedicine & Pharmacotherapy, v. 59, pp. 76-89, 2005.

12. Carlier, P. R. et al. Discovery of non-Zwitterionic GABAA receptor full agonists and a superagonist. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, v. 12, pp. 1985-1988, 2002.

13.Nussinov, R. & Tsai, C.-J. The Different Ways through Which Specificity Works in Orthosteric and Allosteric Drugs. Current Pharmaceutical Design, v. 18, p. 1311-1316, March 2012.

14.Digby, G. J., Conn P. J. & Lindsley, C. W. Orthosteric- and allosteric-induced ligand-directed trafficking at GPCRs. Current opinion in drug discovery & development, v. 13, №5, p. 587-594, September 2010.

15.Foord, S. M. et al. International Union of Pharmacology. XLVI. G protein-coupled receptor list. Pharmacol Rev. 2005 Jun; v. 57 №2, p.279-88. June 2005

16.Denard, B. et al Regulating G protein-coupled receptors by topological inversion. Elife, v. 8, p. e40234, March 2019.

17.Do, H.N. et al. Unique features of different classes of G-protein-coupled receptors revealed from sequence coevolutionary and structural analysis. Proteins, v. 90, №2, p. 601-614, 2022.

18.Krishnan, A. et al. The origin of GPCRs: identification of mammalian like Rhodopsin, Adhesion, Glutamate and Frizzled GPCRs in fungi. PloS one, v. 7, №1, p. e29817, 2012.

19.Basith, S. et al. Exploring G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) Ligand Space via Cheminformatics Approaches: Impact on Rational Drug Design. Frontiers in Pharmacology, v. 9, p. 128, March 2018.

20. Molecular cell biology, W.H. Freeman, 2000, p. 1084.

21.Dhanasekaran, N. & Dermott, J. M. Signaling by the G12 class of G proteins. Cellular signalling, v. 8, p. 235-245, June 1996.

22. Clapham, D.E., Neer, E.J. G protein beta gamma subunits. Annual review of pharmacology and toxicology, v. 37, p. 167-203, 1997

23.Zhou, Q. et al Common activation mechanism of class A GPCRs. Elife, v. 8, p. e50279, December 2019.

24. Audet, M. & Stevens, R. C. Emerging structural biology of lipid G protein-coupled receptors. Protein Science, v. 28, p. 292-304, February 2019.

25. Srivastava, A. et al. High-resolution structure of the human GPR40 receptor bound to allosteric agonist TAK-875. Nature, v. 513, №7516, p. 124-127, September 2014.

26.Lu, J. et al. Structural basis for the cooperative allosteric activation of the free fatty acid receptor GPR40. Nature Structural & Molecular Biology, v. 24, p. 570-577, July 2017.

27.Ho, J. D. et al. Structural basis for GPR40 allosteric agonism and incretin stimulation. Nature communications, v. 9, p. 1645, April 2018.

28. N. Michaelian, N. et al. Structural insights on ligand recognition at the human leukotriene B4 receptor 1. Nature communications, v. 12, №1, p. 2971, May 2021.

29.Wang, N. et al. Structural basis of leukotriene B4 receptor 1 activation. Nature communications, v. 13, №1, p. 1156, March 2022.

30.Hori, T. et al. Na+-mimicking ligands stabilize the inactive state of leukotriene B4 receptor BLT1. Nature Chemical Biology, vol. 14, p. 262-269, March 2018.

31. Luginina, A. et al. Structure-based mechanism of cysteinyl leukotriene receptor inhibition by antiasthmatic drugs. Science advances, v. 5, p. eaax2518, October 2019.

32. Gusach, A. et al. Structural basis of ligand selectivity and disease mutations in cysteinyl leukotriene receptors. Nature Communications, v. 10, p. 5573, December 2019.

33.Hanson, M. A. et al. Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor. Science, v. 335, p. 851-855, February 2012.

34.Yuan, Y. et al. Structures of signaling complexes of lipid receptors S1PR1 and S1PR5 reveal mechanisms of activation and drug recognition. Cell Research, v. 31, p. 12631274, December 2021.

35.Xu, Z. et al. Structural basis of sphingosine-1-phosphate receptor 1 activation and biased agonism. Nature Chemical Biology, v. 18, p. 281-288, March 2022.

36.Liu, S. et al. Differential activation mechanisms of lipid GPCRs by lysophosphatidic acid and sphingosine 1-phosphate. Nature Communications, vol. 13, February 2022.

37.Chen, H. et al. Structure of S1PR2-heterotrimeric G13 signaling complex. Science advances, v. 8, №13, p. eabn0067, April 2022.

38.Maeda, S. et al Endogenous agonist-bound S1PR3 structure reveals determinants of G protein-subtype bias. Science Advances, v. 7, №24, p. eabf5325, June 2021.

39.Zhao, C. et al. Structural insights into sphingosine-1-phosphate recognition and ligand selectivity of S1PR3-Gi signaling complexes. Cell Research, v. 32, p. 218-221, February 2022.

40.Lyapina, E. et al. Structural basis for receptor selectivity and inverse agonism in S1P5 receptors. Nature communications, v. 13, №1, p. 4736, August 2022.

41.Chrencik, J. E. et al. Crystal Structure of Antagonist Bound Human Lysophosphatidic Acid Receptor 1. Cell, v. 161, p. 1633-1643, June 2015.

42. Taniguchi, R. et al. Structural insights into ligand recognition by the lysophosphatidic acid receptor LPA6. Nature, v. 548, №7667, p. 356-360, August 2017.

43.Hua, T. et al. Crystal Structure of the Human Cannabinoid Receptor CB1. Cell, v. 167, p. 750-762, October 2016.

44. Shao, Z. et al. High-resolution crystal structure of the human CBi cannabinoid receptor. Nature, v. 540, p. 602-606, December 2016.

45.Krishna Kumar, K. et al. Structure of a signaling cannabinoid receptor 1-G protein complex. Cell, v. 176, p. 448-458.e12, January 2019.

46. Shao, Z. et al. Structure of an allosteric modulator bound to the CBi cannabinoid receptor. Nature chemical biology, v. 15, №12, p. 1199-1205, December 2019.

47.Hua, T. et al. Activation and signaling mechanism revealed by cannabinoid receptor-Gi complex structures. Cell, vol. 180, p. 655-665.e18, February 2020.

48. Wang, X et al. A Genetically Encoded F-19 NMR Probe Reveals the Allosteric Modulation Mechanism of Cannabinoid Receptor 1. Journal of the American Chemical Society, vol. 143, p. 16320-16325, October 2021.

49.Li, X. et al. Crystal Structure of the Human Cannabinoid Receptor CB2. Cell, v. 176, p. 459-467, January 2019.

50. C. Xing, C. et al. Cryo-EM structure of the human cannabinoid receptor CB2-Gi signaling complex. Cell, v. 180, p. 645-654.e13, February 2020.

51.Xu, P. et al. Structural identification of lysophosphatidylcholines as activating ligands for orphan receptor GPR119. Nature structural & molecular biology, v. 29, №9, p.863-870, August 2022.

52.Cao, C. et al. Structural basis for signal recognition and transduction by platelet-activating-factor receptor. Nature structural & molecular biology, v. 25, №6, p. 488-495, June 2018.

53.Wang, L. et al. Structures of the Human PGD2 Receptor CRTH2 Reveal Novel Mechanisms for Ligand Recognition. Molecular cell, v. 72, №1, p. 48-59.e4, October 2018.

54.Liu, H et al. Molecular basis for lipid recognition by the prostaglandin D2 receptor CRTH2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 118, №32, p. e2102813118, August 2021.

55. Qu, C. et al. Ligand recognition, unconventional activation, and G protein coupling of the prostaglandin E2 receptor EP2 subtype. Science advances, v. 7, №14, eabf1268, April 2021.

56. Audet, M. et al. Crystal structure of misoprostol bound to the labor inducer prostaglandin E2 receptor. Nature chemical biology, v. 15, №1, p. 11-17, January 2019.

57.Morimoto, K. et al. Crystal structure of the endogenous agonist-bound prostanoid receptor EP3. Nature chemical biology, v. 15, №1, p. 8-10, January 2019.

58.Toyoda, Y. et al. Ligand binding to human prostaglandin E receptor EP4 at the lipid-bilayer interface. Nature chemical biology, v. 15, №1, p. 18-26, January 2019.

59. Nojima, S. et al. Cryo-EM Structure of the Prostaglandin E Receptor EP4 Coupled to G Protein. Structure, v. 29, №3, p. 252-260.e6, March 2021.

60.Fan, H. et al. Structural basis for ligand recognition of the human thromboxane A2 receptor. Nature chemical biology, v. 15, №1, p. 27-33, January 2019.

61. Pandy-Szekeres, G. et al. GPCRdb in 2018: adding GPCR structure models and ligands. Nucleic Acids Reseacrh, v. 46, pp. D440-D446, January 2018.

62. Mendelson, K, Evans, T. & Hla, T. Sphingosine 1-phosphate signalling. Development, v. 141, p. 5-9, January 2014.

63.Glickman, M. et al. Molecular cloning, tissue-specific expression, and chromosomal localization of a novel nerve growth factor-regulated G-protein- coupled receptor, nrg-1. Molecular and Cellular Neuroscience, v. 14, p. 141-152, August 1999.

64.Im, D. S. et al. Characterization of the human and mouse sphingosine 1-phosphate receptor, S1P5 (Edg-8): structure-activity relationship of sphingosine1-phosphate receptors. Biochemistry, v. 40, p. 14053-14060, November 2001.

65.Niedernberg, A. et al. Regulated and constitutive activation of specific signalling pathways by the human S1P5 receptor. British Journal of Pharmacology, v. 138, p. 481493, February 2003.

66.Inoue, A. et al. Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs. Cell, v. 177, p. 1933-1947, June 2019.

67.Niedernberg, A et al. Comparative analysis of human and rat S1P5 (edg8): differential expression profiles and sensitivities to antagonists. Biochemical pharmacology, v. 64, №8, p. 1243-1250, October 2002.

68.Preedy, V. R. Neuropathology of Drug Addictions and Substance Misuse Volume 1 Foundations of Understanding, Tobacco, Alcohol, Cannabinoids and Opioids, Elsevier Science & Technology Books, 2016, p. 1132.

69. Ohuchi, H. et al. Expression patterns of the lysophospholipid receptor genes during mouse early development. Developmental Dynamics, v. 237, p. 3280-3294, November 2008.

70.Gu, Z. Y. et al. [Application of CRISPR/Cas9 Gene Editing Technique to Establish S1PR5 Gene Knockout Mice]. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi, v. 24, p. 11551162, August 2016.

71.Eckes, T. et al. Sphingosine 1-Phosphate Receptor 5 (S1P5) Knockout Ameliorates Adenine-Induced Nephropathy. International journal of molecular sciences, v. 23, №7, p. 3952, 2022.

72.Toman, R. E. & Spiegel, S. Lysophospholipid receptors in the nervous system. Neurochemical Research, v. 27, p. 619-627, August 2002.

73.Rao, T. S. et al. Pharmacological characterization of lysophospholipid receptor signal transduction pathways in rat cerebrocortical astrocytes. Brain Research, v. 990, p. 182194, November 2003.

74.Rao, T. S. et al. Growth factor pre-treatment differentially regulates phosphoinositide turnover downstream of lysophospholipid receptor and metabotropic glutamate receptors in cultured rat cerebrocortical astrocytes. International Journal of Developmental Neuroscience, v. 22, p. 131-135, May 2004.

75.Tham, C. S. et al. Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression. International Journal of Developmental Neuroscience, v. 21, p. 431-443, December 2003.

76.Yu, N. et al. Characterization of lysophosphatidic acid and sphingosine-1-phosphate-mediated signal transduction in rat cortical oligodendrocytes. Glia, v. 45, p. 17-27, January 2004.

77.J. Harada, J. et al. Sphingosine-1-phosphate induces proliferation and morphological changes of neural progenitor cells. Journal of Neurochemistry, v. 88, p. 1026-1039, February 2004.

78.Jaillard, C. et al. Edg8/S1P5: an oligodendroglial receptor with dual function on process retraction and cell survival. Journal of Neuroscience, v. 25, p. 1459-1469, February 2005.

79.Novgorodov, A. S. et al. Activation of sphingosine-1-phosphate receptor S1P5 inhibits oligodendrocyte progenitor migration. The FASEB Journal, v. 21, p. 1503-1514, January 2007.

80.Kveberg, L. et al. Sphingosine 1 phosphate induces the chemotaxis of human natural killer cells. Role for heterotrimeric G proteins and phosphoinositide 3 kinases. European Journal of Immunology, v. 32, p. 1856-1864, July 2002.

81.Walzer, T. et al. Natural killer cell trafficking in vivo requires a dedicated sphingosine 1-phosphate receptor. Nature Immunology, v. 8, p. 1337-1344, December 2007.

82.Drouillard, A. et al. S1PR5 is essential for human natural killer cell migration toward sphingosine-1 phosphate. Journal of Allergy and Clinical Immunology, v. 141, p. 22652268, June 2018.

83.Jenne, C. N. et al. T-bet-dependent S1P5 expression in NK cells promotes egress from lymph nodes and bone marrow. Journal of Experimental Medicine, v. 206, p. 2469-2481, October 2009.

84.Mayol, K. et al. Sequential desensitization of CXCR4 and S1P5 controls natural killer cell trafficking. Blood, v. 118, p. 4863-4871, November 2011.

85.Zhang, J., Dunk, C. E., & Lye, S. J. Sphingosine signalling regulates decidual NK cell angiogenic phenotype and trophoblast migration. Human Reproduction, v. 28, p. 30263037, November 2013.

86.Marquardt, N. et al. Unique transcriptional and protein-expression signature in human lung tissue-resident NK cells. Nature Communications, v. 10, p. 3841, August 2019.

87. Oz-Arslan, D. et al. IL-6 and IL-8 release is mediated via multiple signaling pathways after stimulating dendritic cells with lysophospholipids. Journal of Leukocyte Biology, v. 80, p. 287-297, August 2006.

88. Debien, E. et al. S1PR5 is pivotal for the homeostasis of patrolling monocytes. European Journal of Immunology, v. 43, p. 1667-1675, June 2013.

89.Peyrin-Biroulet, L. et al. Modulation of sphingosine-1-phosphate in inflammatory bowel disease. Autoimmunity Reviews, v. 16, p. 495-503, May 2017.

90.Al-Shamma, H. et al. The Selective Sphingosine 1-Phosphate Receptor Modulator Etrasimod Regulates Lymphocyte Trafficking and Alleviates Experimental Colitis. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, v. 369, p. 311-317, June 2019.

91.Shukla, T. & Sands, B. E. Novel Non-Biologic Targets for Inflammatory Bowel Disease. Current Gastroenterology Reports, v. 21, p. 22, April 2019.

92.Ma, C. et al. Innovations in Oral Therapies for Inflammatory Bowel Disease. Drugs, v. 79, p. 1321-1335, August 2019.

93.Misselwitz, B. et al. Emerging Treatment Options in Inflammatory Bowel Disease: Janus Kinases, Stem Cells, and More. Digestion, v. 101 Suppl 1, p. 69-82, 2020.

94.Wallin, M. T. et al. The prevalence of MS in the United States: A population-based estimate using health claims data. Neurology, v. 92, p. e1029-e1040, March 2019.

95. ФГБНУ Научный центр неврологии, Электронная база данных пациентов с демиелинизирующими заболеваниями. [В Интернете]. https://rosmed.info/project?id=52. [Дата обращения: 12 августа 2022].

96.Foster, C. A. et al. FTY720 rescue therapy in the dark agouti rat model of experimental autoimmune encephalomyelitis: expression of central nervous system genes and reversal of blood-brain-barrier damage. Brain Pathology, v. 19, p. 254-266, April 2009.

97.Yamamoto, R. et al. ASP4058, a novel agonist for sphingosine 1-phosphate receptors 1 and 5, ameliorates rodent experimental autoimmune encephalomyelitis with a favorable safety profile. PLoS One, v. 9, p. e110819, 2014.

98.Musella, A. et al. Central Modulation of Selective Sphingosine-1-Phosphate Receptor 1 Ameliorates Experimental Multiple Sclerosis. Cells, v. 9, №5, p. 1290. May 2020.

99.Walsh, S. FDA approves first oral drug to reduce MS relapses. 22 September 2010. web.archive.org/web/20170214051915/https://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/Pr essAnnouncements/ucm226755.htm [В Интернете].

100. Brinkmann, V. et al. The immune modulator FTY720 targets sphingosine 1-phosphate receptors. Journal of Biological Chemistry, v. 277, p. 21453-21457, June 2002.

101. Sobel, K. et al. FTY720 Phosphate Activates Sphingosine-1-Phosphate Receptor 2 and Selectively Couples to Ga12/13/Rho/ROCK to Induce Myofibroblast Contraction. Molecular Pharmacology, v. 87, p. 916-927, June 2015.

102. Brown, B. et al. Analysis of cardiac monitoring and safety data in patients initiating fingolimod treatment in the home or in clinic. BMC Neurology, v. 19, p. 287, November 2019.

103. Gergely, P. The selective sphingosine 1-phosphate receptor modulator BAF312 redirects lymphocyte distribution and has species-specific effects on heart rate. British Journal of Pharmacology, v. 167, p. 1035-1047, November 2012.

104. Goodman, A. D. et al. Siponimod in the treatment of multiple sclerosis. Expert Opinion on Investigational Drugs, v. 28, p. 1051-1057, December 2019.

105. Schmidt, K. G. et al. Sphingosine-1-Phosphate Receptor 5 Modulates Early-Stage Processes during Fibrogenesis in a Mouse Model of Systemic Sclerosis: A Pilot Study. Frontiers in Immunology, v. 8, p. 1242, 2017.

106. Perl, A. Pathogenic mechanisms in systemic lupus erythematosus. Autoimmunity, v. 43, p. 1-6, February 2010.

107. Taylor Meadows, K. R. et al. Ozanimod (RPC1063), a selective S1PR1 and S1PR5 modulator, reduces chronic inflammation and alleviates kidney pathology in murine systemic lupus erythematosus. PLoS One, v. 13, p. e0193236, 2018.

108. Wang, C. et al. Systemic distribution, subcellular localization and differential expression of sphingosine-1-phosphate receptors in benign and malignant human tissues. Experimental and Molecular Pathology, v. 97, p. 259-265, October 2014.

109. Wang, F. et al S1PR5 regulates NK cell responses in preventing graft-versus-host disease while preserving graft-versus-tumour activity in a murine allogeneic haematopoietic stem cell transplantation model. Hematological Oncology, v. 38, p. 89102, February 2020.

110. Bell, A. et al. CpG island methylation profiling in human salivary gland adenoid cystic carcinoma. Cancer, v. 117, №13, p. 2898-2909, July 2011.

111. Matsushima-Nishiwaki, R. et al. Sphingosine 1-phosphate (S1P) reduces hepatocyte growth factor-induced migration of hepatocellular carcinoma cells via S1P receptor 2. PloS one, v. 13, №12, p. e0209050, 2018.

112. Palangi, A. et al. Differential expression of S1P receptor subtypes in human bladder transitional cell carcinoma. Clinical and Translational Oncology, v. 21, p. 12401249, September 2019.

113. Chang, C. L. et al. S1P(5) is required for sphingosine 1-phosphate-induced autophagy in human prostate cancer PC-3 cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology, v. 297, p. C451-458, August 2009.

114. Huang, Y. L. et al. Extrinsic sphingosine 1-phosphate activates S1P5 and induces autophagy through generating endoplasmic reticulum stress in human prostate cancer PC-3 cells. Cellular signalling, v. 26, p. 611-618, March 2014.

115. Young, N. & Van Brocklyn, J. R. Roles of sphingosine-1-phosphate (S1P) receptors in malignant behavior of glioma cells. Differential effects of S1P2 on cell

migration and invasiveness. Experimental Cell Research, v. 313, p. 1615-1627, May 2007.

116. Kothapalli, R., Kusmartseva, I. & Loughran, T. P. Characterization of a human sphingosine-1-phosphate receptor gene (S1P5) and its differential expression in LGL leukemia. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1579, p. 117-123, December 2002.

117. Shah, M. V. et al. Molecular profiling of LGL leukemia reveals role of sphingolipid signaling in survival of cytotoxic lymphocytes. Blood, v. 112, №3, p. 770781, August 2008.

118. Määttä, K. et al. Whole-exome sequencing of Finnish hereditary breast cancer families. European Journal of Human Genetics, v. 25, p. 85-93, January 2016.

119. Chokor, R., Lamy, S. & Annabi, B. Transcriptional targeting of sphingosine-1-phosphate receptor S1P2 by epigallocatechin-3-gallate prevents sphingosine-1-phosphate-mediated signaling in macrophage-differentiated HL-60 promyelomonocytic leukemia cells. OncoTargets and Therapy, v. 7, p. 667-677, 2014.

120. Martin, T. R. & Frevert, C. W. Innate immunity in the lungs. Proceedings of the American Thoracic Society, v. 2, p. 403-411, 2005.

121. Cordts, F. et al. Expression profile of the sphingosine kinase signalling system in the lung of patients with chronic obstructive pulmonary disease. Life Science, v. 89, p. 806-811, November 2011.

122. Barnawi, J. et al. Potential Link between the Sphingosine-1-Phosphate (S1P) System and Defective Alveolar Macrophage Phagocytic Function in Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD). PLoS One, v. 10, p. e0122771, 2015.

123. Barnawi, J. et al. Pro-phagocytic Effects of Thymoquinone on Cigarette Smoke-exposed Macrophages Occur by Modulation of the Sphingosine-1-phosphate Signalling System. COPD, v. 13, p. 653-661, October 2016.

124. Jolly, P. S. et al. The roles of sphingosine-1-phosphate in asthma. Molecular Immunology, v. 38, p. 1239-1245, September 2002.

125. Asle-Rousta, M. et al. Activation of sphingosine 1-phosphate receptor-1 by SEW2871 improves cognitive function in Alzheimer's disease model rats. EXCLI Journal, v. 12, p. 449-461, 2013.

126. Clausznitzer, D. et al. Quantitative Systems Pharmacology Model for Alzheimer Disease Indicates Targeting Sphingolipid Dysregulation as Potential Treatment Option. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology, v. 7, p. 759-770, November 2018.

127. Di Pardo, A. et al. Stimulation of S1PR5 with A-971432, a selective agonist, preserves blood-brain barrier integrity and exerts therapeutic effect in an animal model of Huntington's disease. Human Molecular Genetics, v. 27, p. 2490-2501, July 2018.

128. Glessner, J. T. et al. A genome-wide study reveals copy number variants exclusive to childhood obesity cases. American Journal of Human Genetics, v. 87, p. 661-666, November 2010.

129. Liu, W. et al. Sphingosine-1-phosphate receptor 2 mediates endothelial cells dysfunction by PI3K-Akt pathway under high glucose condition. European Journal of Pharmacology, v. 776, p. 19-25, April 2016.

130. Xu, C. B., Hansen-Schwartz, J. & Edvinsson, L. Sphingosine signaling and atherogenesis. Acta Pharmacologica Sinica, v. 25, p. 849-854, July 2004.

131. Van der Giet, M., Tolle, M. & Kleuser, B. Relevance and potential of sphingosine-1-phosphate in vascular inflammatory disease. Biological Chemistry, v. 389, p. 13811390, November 2008.

132. Sun, R. Z. et al. Rapamycin and FTY720 Alleviate Atherosclerosis by Cross Talk of Macrophage Polarization and Autophagy. BioMed Research International, v. 2018, p. 1010248, 2018.

133. Vestri, A. et al. Sphingosine 1-Phosphate Receptors: Do They Have a Therapeutic Potential in Cardiac Fibrosis? Frontiers in Pharmacology, v. 8, p. 296, 2017.

134. Wang, X. et al. FTY720 alleviates coxsackievirus B3-induced myocarditis and inhibits viral replication through regulating sphingosine 1-phosphate receptors and AKT/caspase-3 pathways. Journal of Cellular Physiology, v. 234, p. 18029-18040, August 2019.

135. Klebe, G. Virtual ligand screening: strategies, perspectives and limitations. Drug discovery today, v. 11, №13-14, pp. 580-94, 2006.

136. Mishin, A. et al. An outlook on using serial femtosecond crystallography in drug discovery. Expert opinion on drug discovery, v. 14, №9, pp. 933-945, 2019.

137. Wlodawer, A. et al. Protein crystallography for aspiring crystallographers or how to avoid pitfalls and traps in macromolecular structure determination. FEBS Journal, v. 280, p. 5705-5736, November 2013.

138. Lattman, E. E. Molecular structures from femtosecond x-ray pulses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 98, p. 6535-6536, June 2001.

139. Boutet, S. et al. High-resolution protein structure determination by serial femtosecond crystallography. Science, v. 337, p. 362-364, July 2012.

140. Spence, J. C., Weierstall, U. & Chapman, H. N. X-ray lasers for structural and dynamic biology. Reports on Progress in Physics, v. 75, p. 102601, October 2012.

141. Shneerson, V. L., Ourmazd, A. & Saldin, D. K. Crystallography without crystals. I. The common-line method for assembling a three-dimensional diffraction volume from single-particle scattering. Acta Crystallographica Section A, v. 64, p. 303-315, March 2008.

142. Barends, T. R. M. et al. Serial femtosecond crystallography. Nature Reviews Methods Primers, v. 2, p. 59, 2022.

143. DePonte, D. P. et al. Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams. Journal of Physics D: Applied Physics, v. 41, №19, p. 195505, 2008.

144. Sierra, R. G. et al. Nanoflow electrospinning serial femtosecond crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, v. 68, p. 1584-1587, October 2012.

145. Weierstall, U. et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature Communications, v. 5, p. 3309, 2014.

146. Liu, W. et al. Serial Femtosecond Crystallography of G Protein-Coupled Receptors. Science, v. 342, p. 1521-1524, December 2013.

147. McPherson, A. Protein Crystallization / Protein Crystallography. Methods in Molecular Biology, vol 1607, New York, NY, Humana Press, 2017, p. 17-50.

148. Moreno, A. Advanced Methods of Protein Crystallization / Protein Crystallography. Methods in Molecular Biology, vol 1607, New York, NY, Humana Press, 2017, p. 51-76.

149. Moraes, I. et al. Membrane protein structure determination - the next generation. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1838, p. 78-87, January 2014.

150. Pebay-Peyroula, E. et al. X-ray structure of bacteriorhodopsin at 2.5 angstroms from microcrystals grown in lipidic cubic phases. Science, v. 277, p. 1676-1681, September 1997.

151. Faham, S. et al. Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature. Protein Science, v. 14, p. 836-840, March 2005.

152. Bertheleme, N et al. Unlocking the secrets of the gatekeeper: methods for stabilizing and crystallizing GPCRs. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1828, p. 25832591, November 2013.

153. Cherezov, V. Abola, E. & Stevens, R. C. Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets. Methods in Molecular Biology, v. 654, p. 141-168, 2010.

154. Chun E. et al Fusion partner toolchest for the stabilization and crystallization of G protein-coupled receptors. Structure, v. 20, p. 967-976, June 2012.

155. Jaeger, K. et al. Structural Basis for Allosteric Ligand Recognition in the Human CC Chemokine Receptor 7. Cell, v. 178, №5, pp. 1222-1230.e10, 2019.

156. Warne, T. et al. Molecular basis for high-affinity agonist binding in GPCRs. Science, v. 364, p. 775-778, May 2019.

157. Lin, S. H. & Guidotti, G. Purification of membrane proteins. Methods in Enzymology, v. 463, p. 619-629, 2009.

158. Palczewski, K. et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science, v. 289, p. 739-745, August 2000.

159. Perez, C. & Maier, T. Expression, Purification, and Structural Biology of Membrane Proteins, Springer, 2020.

160. Jastrzebska, B. et al. Expression of mammalian G protein-coupled receptors in Caenorhabditis elegans. Methods in Enzymology, v. 520, p. 239-256, 2013.

161. Zhang, L. et al. Expression of functional G protein-coupled receptors in photoreceptors of transgenic Xenopus laevis. Biochemistry, v. 44, p. 14509-14518, November 2005.

162. Berman, H. M. The Protein Data Bank. [В Интернете]. https://www.rcsb.org/ [Дата обращения 21 октября 2022 г.]

163. Milic, D. & Veprintsev, D. B. Large-scale production and protein engineering of G protein-coupled receptors for structural studies. Frontiers in pharmacology, v. 6, p. 66, 2015.

164. Gulamhussein, A. A. et al. A comparison of SMA (styrene maleic acid) and DIBMA (di-isobutylene maleic acid) for membrane protein purification. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes, v. 1862, p. 183281, July 2020.

165. Broecker, J., Eger, B. T., & Ernst, O. P. Crystallogenesis of Membrane Proteins Mediated by Polymer-Bounded Lipid Nanodiscs. Structure, v. 25, p. 384-392, February 2017.

166. Magnin, T. et al. A novel, generic and effective method for the rapid purification of G protein-coupled receptors. Protein Expression and Purification, v. 64, p. 1-7, March 2009.

167. Xie, G. et al. Preparation of an activated rhodopsin/transducin complex using a constitutively active mutant of rhodopsin. Biochemistry, v. 50, p. 10399-10407, November 2011.

168. Inoue, A. et al. TGFa shedding assay: an accurate and versatile method for detecting GPCR activation. Nature methods, v. 9, №10, p. 1021-1029, October 2012.

169. Yasi, E. A., Kruyer, N. S. & Peralta-Yahya, P. Advances in G protein-coupled receptor high-throughput screening. Current Opinion in Biotechnology, v. 64, p. 210217, August 2020.

170. Kim, N., Shin S. & Bae, S. W. cAMP Biosensors Based on Genetically Encoded Fluorescent/Luminescent Proteins. Biosensors, v. 11, p. 39, January 2021.

171. Hoare, S. R. J. & Hughes, T. E. Biosensor Assays for Measuring the Kinetics of G-Protein and Arrestin-Mediated Signaling in Live Cells. / Assay Guidance Manual, Markossian, S., Grossman, A., Brimacombe, K. et al., editors, Bethesda, MD, Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences, 2021, [Internet].

172. Newman, R. H., Fosbrink, M. D. & Zhang, J. Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells. Chemical reviews, v. 111, №5, p. 3614-3666, May 2011.

173. Alexandrov, A. I. et al. Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins. Structure, v. 16, №3, p. 351-359, March 2008.

174. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, v. 227, p. 680-685, August 1970.

175. Caffrey, M. & Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nature Protocols, v. 4, p. 706-731, April 2009.

176. Liu, W., Ishchenko, A. & Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature Protocols, v. 9, p. 2123-2134, August 2014.

177. Barty, A. et al. Cheetah: software for high-throughput reduction and analysis of serial femtosecond X-ray diffraction data. Journal of Applied Crystallography, v. 47, p. 1118-1131, June 2014.

178. White, T. A. Processing serial crystallography data with CrystFEL: a step-by-step guide. Acta Crystallographica Section D-Structural Biology, v. 75, №2, pp. 219-233, March 2019.

179. McCoy, A. J. et al. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography, v. 40, №4, p. 658-674, August 2007.

180. Emsley, P. et al. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography, v. 66, p. 486-501, April 2010.

181. Afonine, P. et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography, v. 68, №4, p. 352-67, March 2012.

182. Lovelace, J. J. & Borgstahl, G. E. O. Characterizing pathological imperfections in macromolecular crystals: lattice disorders and modulations. Crystallography Reviews, v. 26, pp. 3-50, 2020.

183. Wang, J. et al Correction of X-ray intensities from single crystals containing lattice-translocation defects. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, v. 61, p. 67-74, December 2004.

184. Diederichs, K. & Karplus, P. A. Better models by discarding data? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, v. 69, p. 1215-1222, June 2013.

185. Salahpour, A. et al. BRET biosensors to study GPCR biology, pharmacology, and signal transduction. Frontiers in endocrinology, v. 3, p. 105, 2012.

186. Invitrogen, Lipofectamine™ 3000 Reagent User Manual. [В Интернете]. assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/lipofectamine3000 protocol.pdf. [Дата обращения: 30 сентбря 2022].

187. Lonnerdal, B., Carlsson J. & Porath, J. Isolation of lactoferrin from human milk by metal-chelate affinity chromatography. FEBSLetters, v. 75, p. 89-92, March 1977.

188. Popov, P. et al. Computational design of thermostabilizing point mutations for G protein-coupled receptors. Elife, v. 7, p. e34729, 21 June 2018.

189. Watanabe, T., Kusumi, K. & Inagaki, Y. Tetrahydronaphthalene derivative. United States of America, Патент US20190031605, 31 January 2019.

190. Chen, V. B. et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography, v. 66, №Pt 1, p. 12-21, January 2010.

191. Hilger, D. The role of structural dynamics in GPCR-mediated signaling. FEBS Journal, v. 288, pp. 2461-2489, 2021.

192. Wingler, L. M. et al. Angiotensin and biased analogs induce structurally distinct active conformations within a GPCR. Science, v. 367, №6480, p. 888-892, February 2020.

193. Israeli, H. et al. Structure reveals the activation mechanism of the MC4 receptor to initiate satiation signaling. Science, v. 372, №6544, p. 808-814, May 2021.

194. Nygaard, R. et al. Ligand binding and micro-switches in 7TM receptor structures. Trends in pharmacological sciences, v. 30, №5, p. 249-259, May 2009.

195. Katritch, V. et al. Allosteric sodium in class A GPCR signaling. Trends in biochemical sciences, v. 39, №5, p. 233-244, May 2014.

196. Zarzycka, B. et al. Harnessing Ion-Binding Sites for GPCR Pharmacology. Pharmacological reviews, v. 71, №4, p. 571-595, October 2019.

197. Fujiwara, Y. et al. Identification of the hydrophobic ligand binding pocket of the S1P1 receptor. Journal of biological chemistry, v. 282, №4, p. 2374-2385, January 2007.

198. Karczewski, K. J. et al. The mutational constraint spectrum quantified from variation in 141,456 humans. Nature, v. 581, №7809, p. 434-443, May 2020.

199. Tate, J. G. et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic acids research, v. 47, №D1, p. D941-D947, January 2019.

200. Hornick, J. T. Analysis of naturally occurring genetic variants in the sphingosine-1-phosphate receptor family. PhD Thesis, University Park: The Pennsylvania State University, 2019.

201. Arakawa, M. et al. Structural and functional roles of small group-conserved amino acids present on helix-H7 in the 02-adrenergic receptor. Biochimica et biophysica acta, v. 1808, №4, p. 1170-1178, April 2011.

202. Steen, A. et al. Biased and constitutive signaling in the CC-chemokine receptor CCR5 by manipulating the interface between transmembrane helices 6 and 7. The Journal of biological chemistry, v. 288, №18, p. 12511-12521, May 2013.

203. Wang, J. et al. The structural study of mutation-induced inactivation of human muscarinic receptor M4. IUCrJ, v. 7, pt 2, p. 294-305, March 2020.

204. Bertalan, É. et al. Protein-water hydrogen-bond networks of G protein-coupled receptors: Graph-based analyses of static structures and molecular dynamics. Journal of structural biology, v. 212, №3, p. 107634, December 2020.