Однодоменные антитела ламы для блокирования активации рецептора ErbB3: разработка, структурно-функциональные исследования, перспективы применения в иммунотерапии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Елисеев Игорь Евгеньевич

• Елисеев Игорь Евгеньевич
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Елисеев Игорь Евгеньевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Рецепторы эпидермального фактора роста ЕгЬВ1-4:

EGFR/ErbB1, НЕЯ2/ЕгЬВ2, HER3/ErbB3, HER4/ErbB4

1.1.1 Лиганды рецепторов ЕгЬВ

1.1.2 Структура рецепторов ЕгЬВ

1.1.3 Механизм активации рецепторов ЕгЬВ

1.2 Функции рецепторов ЕгЬВ и их роль в норме и патологии

1.2.1 Функции рецепторов ЕгЬВ и их лигандов в норме

1.2.2 Рецепторы EGFR и НЕЯ2 как классические онкогены

1.3 Проблема резистентности опухолей к блокированию НЕЯ2

и роль рецептора ЕгЬВЗ в ее формировании

1.4 Фармакологическое блокирование рецепторов НЕЯ2 и ЕгЬВЗ

1.4.1 Моноклональные антитела к рецептору НЕЯ2

1.4.2 Моноклональные антитела к рецептору ЕгЬВ3

1.4.3 Иммуноконъюгаты с цитотоксическими лекарствами

1.4.4 Альтернативные подходы для блокирования ЕгЬВ3

1.5 Однодоменные антитела верблюдовых как альтернатива классическим IgG

1.5.1 Структура и свойства однодоменных антител

1.5.2 Использование технологий ДНК библиотек и фагового дисплея для отбора однодоменных антител

1.5.3 Системы для рекомбинантной экспрессии однодоменных антител

1.5.4 Области и форматы терапевтического применения однодоменных антител

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы

2.1.1 Реагенты и расходные материалы

2.1.2 Штаммы бактерий и клеточные культуры

2.2 Молекулярное клонирование и секвенирование

2.2.1 Создание генетических конструкций

2.2.2 Секвенирование и анализ данных

2.3 Экспрессия и очистка рекомбинантных белков

2.3.1 Бактериальная экспрессия однодоменных антител

2.3.2 Экспрессия фрагментов рецептора ЕгЬВ3 в клетках млекопитающих

2.4 Анализ структуры и стабильности однодоменных антител

2.4.1 Анализ спектров кругового дихроизма

2.4.2 Аналитическая гель-фильтрация

2.4.3 Определение дисульфидных связей методом Эллмана

2.4.4 Анализ посттрансляционных модификаций при помощи масс-спектрометрии

2.4.5 Получение кривых денатурации и анализ термодинамической стабильности

2.5 Макромолекулярная кристаллография и моделирование

2.5.1 Поиск и оптимизация условий кристаллизации

2.5.2 Съемка и обработка рентгеновских данных

2.5.3 Молекулярное моделирование комплексов антител с рецептором ErbB3

2.6 Исследования связывания однодоменных антител с рецептором

2.6.1 Изучение кинетики и аффинности связывания однодоменных антител с рецептором методом поверхностного плазмонного резонанса

2.6.2 Эпитопное картирование и изучение конкуренции с лигандом

2.6.3 Флуоресцентная конфокальная микроскопия

2.7 Изучение антипролиферативной активности однодоменных антител

2.7.1 Тесты на антипролиферативную активность

2.7.2 Проточная цитофлуориметрия

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Совершенствование технологий отбора антител

3.1.1 Изучение ошибок и изменения клонального разнообразия при

амплификации сложных библиотек ДНК

3.1.2 Теоретическая модель эффективности амплификации библиотеки ДНК, инкапсулированной в капли эмульсии

3.2 Разработка системы гетерологической экспрессии однодоменных антител

3.2.1 Экспрессия в бактериях E. coli AtrxB Agor cDsbC в виде химеры с белком SUMO позволяет получать растворимые фолдированные однодоменные антитела

без молекулярных тагов

3.2.2 Цитоплазматическая экспрессия имеет большую эффективность

чем классическая система периплазматической экспрессии

3.3 Структурные и биохимические характеристики однодоменных антител

3.3.1 Исследованные однодоменные антитела находятся в мономерной форме

и обладают вторичной структурой, характерной для иммуноглобулинового домена

3.3.2 Однодоменные антитела BCD090-P1 и BCD090-M2, но не BCD090-M456,

имеют каноническую дисульфидную связь

3.3.3 Однодоменное антитело BCD090-P1 обладает уникальной

термодинамической стабильностью

3.4 Исследование пространственных структур высокого разрешения

3.4.1 Изучение пространственных структур однодоменного антитела BCD090-M2

в различных кристаллических формах

3.4.2 Моделирование комплекса однодоменного антитела BCD090-M2

с эктодоменом рецептора ErbB3

3.5 Взаимодействие однодоменных антител с рецептором ErbB3

3.5.1 Однодоменные антитела BCD090-P1 и BCD090-M2 связываются

с эктодоменом ErbB3 с высокой аффинностью

3.5.2 BCD090-P1 и BCD090-M2 взаимодействуют с разными эпитопами

3.5.3 Однодоменные антитела связываются с рецептором на опухолевых клетках

и ко-локализуются с HER2 и ErbB3

3.6 Антипролиферативное действие однодоменных антител

3.6.1 Однодоменные антитела подавляют ЕгЬВ3-зависимую пролиферацию

клеток рака молочной железы MCF-7

3.6.2 Однодоменные антитела подавляют ЕгЬВ3-зависимую пролиферацию гиперэкспрессирующих рецептор HER2 клеток рака молочной железы SK-BR-3

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Структура антител

CDR гипервариабельные участки вариабельного домена, определяющие связывание с антигеном: H1-3 тяжелой цепи, L1-3 легкой цепи, 1-3 однодоменного антитела

CH константный домен тяжелой цепи (CH1-3)

СL константный домен легкой цепи

Fab антигенсвязывающий фрагмент антитела, состоящий из доменов VH, VL, CH1 и CL

Fc отвечающий за эффекторные функции фрагмент антитела, состоящий из CH2 и CH3

FR каркасные области вариабельного домена (FR1-4)

sdAb однодоменное антитело, то же, что VHH

VH вариабельный домен тяжелой цепи классического антитела

VHH вариабельный домен тяжелоцепочечного антитела верблюдовых

VL вариабельный домен легкой цепи классического антитела

Гены и белки

Akt протеинкиназа B, группа из 3-х родственных серин/треониновых киназ

BiP иммуноглобулин-связывающий белок, шаперон, кодируемый геном HSPA5

CD20 B-лимфоцитарный антиген, мишень ритуксимаба, кодируется геном MS4A1

CD16A активирующий Fcy рецептор, кодируемый геном FCGR3A

CD32B ингибирующий Fcy рецептор, кодируемый геном FCGR2B

CD3 мембранный комплекс, коактиватор T-клеток в составе T-клеточного рецептора

DsbC бактериальный фермент дисульфид-изомераза

ECD внеклеточный домен (эктодомен) рецептора ErbB3, ECD111 — субдомен III

EGF эпидермальный фактор роста

EGFR рецептор эпидермального фактора роста, кодируемый геном ErbB

ER рецептор эстрогена

ErbB семейство рецепторов эпидермального фактора роста ErbB1-4

ErbB3 рецептор эпидермального фактора роста, кодируемый геном ErbB3, также HER3

ErbB4 рецептор эпидермального фактора роста, кодируемый геном ErbB4, также HER4

FcRn неонатальный Fc рецептор

gor бактериальный фермент глутатион-редуктаза

HER2 рецептор эпидермального фактора роста, кодируемый геном ErbB2

HRG херегулин ß 1, одна из изоформ NRG1

HSA человеческий сывороточный альбумин

MAPK митоген-активируемые протеинкиназы, семейство протеинкиназ

neu онкоген нейробластом крыс, гомолог HER2

NRG нейрегулины 1-4, группа лигандов рецепторов ErbB3 и ErbB4

PD1 рецептор программируемой клеточной гибели, кодируемый геном PDCD1

PI3K фосфоинозитид-3-киназы

PTEN фосфатаза, кодируемая геном PTEN, антионкобелок

p53 транскрипционный фактор, кодируемый геном TP53, антионкобелок

p73 родственный p53 антионкобелок, кодируемый геном TP73

p85 адаптерный белок, регуляторный компонент PI3K

Ras семейство гомологичных ГТФаз, мощных онгогенов

Shc адаптерный белок, связывающийся с рецепторами ErbB, онкоген

SH2 белковый домен, ответственный за распознавание фосфотирозинов

SUMO убиквитин-подобный белок

TGFa трансформирующий фактор роста-a

TNFa фактор некроза опухоли-a

trxB бактериальный фермент тиоредоксин-редуктаза

vWF фактор фон Виллебранда

v-erbB онкоген, вирусный гомолог EGFR

Реагенты

DTT дитиотрейтол

EDC 1 -этил-3 -(3 -диметиламинопропил)карбодиимид

EDTA этилендиаминтетрауксусная кислота

FBS эмбриональная бычья сыворотка

HBS буфер на основе HEPES c 150 мМ NaCl

HEPES 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота

IPTG изопропил-P-D-1 -тиогалактопиранозид

LB стандартная ростовая среда для бактерий, "lysogeny broth"

MES морфолино-2-этансульфоновая кислота

MTS реагент для спектрофотометрического определения пролиферации, 3-(4,5-

диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолий

NHS N-гидроксисукцинимид

NTA нитрилотриуксусная кислота, Ni-NTA — сорбент для хроматографии

NTB тионитрофильный анион, продукт реакции тиольной группы с реагентом Эллмана

NTSB 2-нитро-5-тиосульфобензоат натрия

PBS фосфатно-солевой буфер

PEG полиэтиленгликоль

PMSF фенилметилсульфонилфторид, ингибитор протеаз

PNGаза пептид-^гликозидаза, фермент для дегликозилирования белков

SDS додецилсульфат натрия

TB богатая ростовая среда для бактерий, "terrific broth"

TEV протеаза вируса табачной мозаики

Tris трис(гидроксиметил)аминометан

АТФ аденозинтрифосфат

Прочее

CMV цитомегаловирус, hCMV — соответствующий промотор

DM1 мертанзин, высокоактивный токсин из класса маитанзинов

FDA Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США

IMAC металл-хелатная хроматография

NGS секвенирование следующего поколения

PDB база данных белковых структур Protein Data Bank (www.rcsb.org)

pelB сигнальный пептид, определяющий транспорт в периплазму

pRha рамнозный промотор E. coli

RMSD среднеквадратичное отклонение

RSV респираторно-синцитиальный вирус

RU единицы отклика поверхностного плазмонного резонанса, "resonance units"

SAD метод одноволновой аномальной дифракции

SEC аппарат транслокации в периплазму в бактериях E. coli

КД круговой дихроизм

ПЦР полимеразная цепная реакция

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Однодоменные антитела ламы для блокирования активации рецептора ErbB3: разработка, структурно-функциональные исследования, перспективы применения в иммунотерапии»

Актуальность исследования

Иммунотерапия при помощи моноклональных антител, предсказанная более века назад Паулем Эрлихом [1], реализует принципы идеального этиотропного лечения, воздействующего специфически на вызывающие болезнь факторы. Многие десятилетия прошли, прежде чем реализация идей Эрлиха стала возможной благодаря созданию технологии гибридом для получения моноклональных антител [2]. Именно так было получено первое терапевтическое антитело, муромонаб CD3 [3], применяющееся для подавления отторжения трансплантата [4]. Вскоре были разработаны ключевые технологии для конструирования библиотек генов иммуноглобулинов, отбора антител необходимой специфичности и их гуманизации [5]. Создание эффективной технологической платформы для разработки антител позволило им стать основным классом новых лекарств в последние годы, особенно в области клинической иммунологии и онкологии [6]. К 2021 году общее количество одобренных для терапевтического применения антител достигло ста [7], что демонстрирует ценность этих молекул для медицины.

Мишенями терапевтических антител чаще всего являются рецепторы на поверхности клеток. Терапевтические антитела к рецепторам могут вызывать лизис определенных типов клеток посредством активации системы комплемента [8] и задействования эффекторных клеток [9; 10]. Помимо прямого цитотоксического действия моноклональные антитела также могут выполнять роль агонистов [11; 12] или антагонистов рецепторов [13], тем самым воздействуя на внутриклеточные сигнальные пути и меняя фенотип клеток.

Важнейшими мишенями в терапии онкологических заболеваний являются рецепторные тирозинкиназы, в особенности представители семейства рецепторов эпидермального фактора роста ЕгЬВ [14]. Четыре рецептора ЕгЬВ1 (EGFR), ЕгЬВ2 (HER2), ЕгЬВЗ (HER3) и ЕгЬВ4 (HER4) служат интерфейсом к сложной сигнальной сети, регулирующей ключевые клеточные процессы в развитии эпителия, сердца, нервной системы и молочной железы [15]. Нарушения сигнализации рецепторами EGFR и НЕЯ2, вызванные амплификацией их генов, делециями во внеклеточном домене, активирующими мутациями во внутриклеточном киназном домене или коэкспрессией лиганда, приводят к развитию рака молочной железы, легких и колоректального рака [16]. Онкогенная природа рецепторов EGFR и НЕЯ2 обусловлена функциями регулируемых ими сигнальных путей. Среди них можно прежде всего выделить путь Ras-MAPK, запускающий клеточную пролиферацию, и путь Р13К-Ак;, обеспечивающий выживание клеток за счет подавления апоптоза [17; 18]. Активация рецепторов ЕгЬВ начинается со связывания лиганда, который индуцирует конформационные изменения во внеклеточном домене, ведущие к димеризации рецепторов и последующей аллостерической активации внутриклеточного

киназного домена. Существующие терапевтические моноклональные антитела подавляют процесс активации рецепторов EGFR и НЕЯ2 посредством конкуренции с лигандом, а также препятствования необходимым конформационным изменениям внеклеточного домена или прямого блокирования димеризации [18]. Клиническая эффективность первых терапевтических моноклональных антител к рецепторам EGFR и НЕЯ2, цетуксимаба [19] и трастузумаба [20], продемонстрировала перспективы данного подхода. В настоящее время моноклональные антитела к рецептору НЕЯ2 являются стандартной терапией при раке молочной железы с повышенной экспрессией данного рецептора как в виде одиночных антител и их комбинаций, так и в составе иммуноконъюгатов с цитотоксическими лекарствами [21].

Долгое время считалось, что рецептор ЕгЬВЗ не проявляет тирозинкиназной активности [22] и, следовательно, не участвует в сигнальных путях опухолевой клетки. В связи с этим ЕгЬВЗ не рассматривался как важная терапевтическая мишень. Однако клинические исследования продемонстрировали, что повышенная экспрессия ЕгЬВЗ в опухолях молочной железы прогнозирует более низкую выживаемость [23; 24]. С молекулярной точки зрения, два из четырех рецепторов ЕгЬВ не автономны: НЕЯ2 не взаимодействует с лигандами [25] а ЕгЬВЗ каталитически неактивен, что допускает их активацию только в составе гетеродимеров. В частности, отклик рецептора ЕгЬВЗ на связывание естественного лиганда, херегулина, осуществляется через НЕЯ2-опосредованную трансактивацию, происходящую в гетеродимерах НЕЯ2:ЕгЬВЗ [26]. Пролиферация клеток рака молочной железы с гиперэкспрессией НЕЯ2 требует ЕгЬВЗ, указывая на то, что именно гетеродимер НЕЯ2:ЕгЬВЗ является мощным онкогенным элементом [27]. Активация данного гетеродимера задействует как сигнальный путь пролиферации Ras-MAPK через единственный сайт фосфорилирования на С-конце НЕЯ2 [28], так и антиапоптотический путь Р1ЗК-Ак через шесть сайтов фосфорилирования на С-конце ЕгЬВЗ [29].

Актуальность исследования обусловлена необходимостью разработки новых иммунотерапевтических подходов и молекул для блокирования активации рецептора ЕгЬВЗ. Важность рецептора ЕгЬВЗ как терапевтической мишени связана не только с его участием в процессе опухолевой трансформации, но и с его центральной ролью в развитии резистентности раковых клеток к ингибированию НЕЯ2. Блокирование НЕЯ2 при помощи ингибиторов тирозинкиназ ведет к увеличению экспрессии ЕгЬВЗ и активации антиапоптотического сигнального пути Р1ЗК-Ак;, делающего ингибиторы неэффективными [З0; З1]. При этом подавление экспрессии ЕгЬВЗ при помощи малых интерферирующих РНК либо его блокирование моноклональным антителом полностью возвращало чувствительность раковых клеток к ингибиторам тирозинкиназной активности НЕЯ2. Таким образом, новые

моноклональные антитела к внеклеточному домену рецептора ErbB3 могут стать важными терапевтическими инструментами регуляции активности рецепторов ErbB.

Степень разработанности темы исследования

Механизмы ЕгЬВЗ-опосредованной резистентности к анти-EGFR/HER2 моноклональным антителам, ингибиторам тирозинкиназ и гормональной терапии, а также различные подходы к терапевтическому воздействию на данный рецептор были рассмотрены в обзорах [32-35]. Основной стратегией является создание моноклональных антител к внеклеточному домену ErbB3, которые могут заблокировать его в неактивной конформации, помешать связыванию лиганда, препятствовать димеризации с другими рецепторами ErbB, а также вызывать лизис посредством активации системы комплемента и эффекторных клеток. В настоящее время несколько антител находятся в стадии доклинических и клинических исследований, все они связываются с различными эпитопами на рецепторе и, соответственно, обладают уникальными механизмами действия и фармакологическими характеристиками. Элгемтумаб (LJM716) связывается с субдоменами II и IV внеклеточного домена ErbB3 и блокирует рецептор в неактивной конформации, таким образом ингибируя как стимулированную лигандом, так и лиганд-независимую пролиферацию различных клеточных линий рака молочной железы [36]. Лумретузумаб (RG7116) связывается с субдоменом I, блокирует связывание лиганда и тем самым предотвращает фосфорилирование рецептора, а также снижает его поверхностную концентрацию [37]. Другое антитело, KTN3379, ингибирует активацию ErbB3 аллостерически, связываясь с субдоменом III и его линкером с субдоменом II, и как следствие блокируя конформационные изменения необходимые для связывания с лигандом и димеризации [38].

Все приведенные выше разрабатываемые моноклональные антитела к рецептору ErbB3 являются классическими иммуноглобулинами G. В данном исследовании предлагается альтернативный подход, заключающийся в применении неканонических антител верблюдовых. Впервые обнаруженные в сыворотке верблюда [39], данные антитела не имеют CH1 домена тяжелой цепи и полностью лишены легких цепей. Их вариабельные фрагменты, также называемые однодоменными антителами или нанотелами, представляют собой одиночный иммуноглобулиновый домен молекулярной массой 12-15 кДа. Однодоменные антитела обладают множеством преимуществ, включая высокую растворимость, стабильность и относительную простоту биотехнологического производства [40]. Их генетические и структурные особенности порождают необычный антигенный репертуар с широким спектром эпитопов, отличающихся от классических антител [41; 42]. Многочисленные потенциальные варианты терапевтического применения однодоменных антител были рассмотрены в исчерпывающей обзорной статье [43]. Недавнее одобрение для терапевтического использования первого однодоменного антитела, каплацизумаба [44], использующегося для лечения

приобретённой тромботической тромбоцитопенической пурпуры [45; 46], позволяет рассчитывать, что вскоре молекулы данного типа найдут широкое применение в медицине. На данный момент блокирование функции рецептора ЕгЬВЗ при помощи однодоменных антител не было продемонстрировано.

Цель и задачи исследования

Целью данного исследования являлась разработка и структурно-функциональные исследования новых однодоменных антител ламы как перспективных средств для иммунотерапии онкологических заболеваний, основанной на блокировании активации рецептора ЕгЬВЗ в опухолевых клетках.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить закономерности амплификации сложных ансамблей фрагментов ДНК при проведении обычной и эмульсионной полимеразной цепной реакции для совершенствования методов конструирования библиотек антител.

2. Разработать эффективную систему гетерологической экспрессии для получения растворимых однодоменных антител высокой степени очистки в нативной конформации.

3. Изучить структурные и биохимические характеристики однодоменных антител к внеклеточному домену рецептора ЕгЬВЗ.

4. Изучить связывание однодоменных антител с рецептором ЕгЬВЗ и их функциональную активность на клеточных линиях рака молочной железы.

Методология и методы исследования

Для решения задач данного исследования были применены различные методы биохимии, молекулярной иммунологии, структурной и клеточной биологии. Для создания отдельных генетических конструкций применялись методы молекулярного клонирования. Анализ генетических последовательностей и клонального разнообразия библиотек проводился при помощи секвенирования следующего поколения. Для получения рекомбинантных однодоменных антител и фрагментов рецептора применялись методы гетерологической экспрессии и различные хроматографические техники. Биохимическая характеризация и исследования стабильности однодоменных антител включали использование методов масс-спектрометрии и спектроскопии собственной флуоресценции белков. Для структурных исследований были применены методы спектроскопии кругового дихроизма, макромолекулярной кристаллографии и молекулярного моделирования. Функциональные исследования однодоменных антител задействовали методы измерения поверхностного плазмонного резонанса, конфокальной флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрии.

Положения, выносимые на защиту

1. Предложенная теоретическая модель точно описывает процесс амплификации сложных библиотек ДНК при проведении полимеразной цепной реакции, тем самым создавая теоретическую основу для совершенствования методов конструирования библиотек антител, сохраняющих их клональное разнообразие.

2. Гетерологическая экспрессия в цитоплазме бактерий E. coli AtrxB Agor cDsbC в виде химерной конструкции с белком SUMO позволяет более эффективно по сравнению с классической системой периплазматической экспрессии получать однодоменные антитела ламы.

3. Разработанные однодоменные антитела к рецептору ErbB3 обладают высокой термодинамической стабильностью и нативной структурой иммуноглобулинового домена; полученные кристаллические структуры высокого разрешения позволяют изучить конформации гипервариабельных участков и построить модель связывания с эктодоменом рецептора ErbB3.

4. Два разработанных однодоменных антитела неконкурентно связываются с эпитопами на субдоменах I и III эктодомена рецептора ErbB3 с наномолярной аффинностью и эффективно подавляют ЕгЬВЗ-зависимую пролиферацию HER2- и HER2+ клеток рака молочной железы как посредством прямой конкуренции с лигандом, так и без нее.

Научная новизна полученных результатов

В результате исследования разработан новый иммунотерапевтический подход к блокированию активации рецептора ErbB3 в опухолевых клетках. Впервые для этой цели созданы особые неканонические антитела верблюдовых, не имеющие легких цепей.

В рамках исследования развиты технологии молекулярной иммунологии для отбора и синтеза однодоменных антител. Впервые продемонстрированы фундаментальные закономерности, определяющие эффективность амплификации и эволюцию клонального разнообразия библиотек. Разработан метод гетерологической экспрессии однодоменных антител в цитоплазме бактерий E. coli для эффективного получения фолдированных растворимых однодоменных антител без молекулярных тагов. Показана высокая термодинамическая стабильность созданных однодоменных антител и проанализированы ее структурные детерминанты.

Два полученных антитела являются первыми высокоаффинными ингибирующими однодоменными антителами к внеклеточному домену рецептора ErbB3. Продемонстрировано, что они связываются неконкурентно с двумя эпитопами на рецепторе и блокируют его активацию различными путями, отличающимися от известных моноклональных антител к ErbB3. Оба высокоаффинных однодоменных антитела проявляют функциональную активность и подавляют ЕгЬВЗ-зависимую пролиферацию клеток рака молочной железы.

Теоретическая и практическая значимость работы

Значимость работы обусловлена ее вкладом в развитие ключевых технологий молекулярной иммунологии и в исследования однодоменных антител как нового класса молекул для терапии и диагностики.

Технология библиотек ДНК является важнейшим инструментом отбора антител необходимой специфичности, при этом сохранение клонального разнообразия необходимо для поиска редких функционально активных антител. В данном исследовании была предложена теоретическая модель, предсказывающая эффективность амплификации библиотек при использовании обычной полимеразной цепной реакции и при инкапсуляции библиотеки в капли эмульсии. Данная модель хорошо согласуется с экспериментальными данными и представляет теоретическую основу для анализа эволюции репертуара библиотек и оптимизации протоколов их амплификации и клонирования.

Неканонические антитела верблюдовых обладают уникальными свойствами, которые могут быть реализованы в создании новых иммунотерапевтических средств. Однако их структурно-функциональные характеристики, такие как антигенный репертуар, структуры гипервариабельных участков и молекулярные детерминанты термодинамической стабильности, остаются относительно малоизученными. В данном исследовании получены фундаментальные знания об устройстве и свойствах однодоменных антител. Показано, что консервативная дисульфидная связь в однодоменном антителе может отсутствовать при сохранении фолдинга, высокой стабильности и функции данной молекулы. Полученные структуры высокого разрешения позволили изучить конформации гипервариабельных участков. Структура гипервариабельного участка CDR3 в одном из однодоменных антител отличается от всех известных классов структур для классических иммуноглобулинов G, что демонстрирует различия в репертуарах и механизмах молекулярного узнавания между ними. Сравнительные исследования стабильности однодоменных антител позволили выявить определяющие ее аминокислотные остатки. Исследование также обладает высокой практической значимостью, поскольку разработанные методы получения однодоменных антител являются универсальными и могут быть применены для других молекул данного класса. Разработанные однодоменные антитела, помимо терапевтического применения, могут также быть использованы для визуализации рецептора ЕгЬВЗ и диагностики.

Личный вклад автора

Все представленные в диссертации научные результаты получены автором лично. Эксперименты по созданию генетических конструкций, экспрессии и очистке рекомбинантных белков, изучению биохимических характеристик однодоменных антител, макромолекулярной кристаллографии, изучению взаимодействия однодоменных антител с рецептором и оценке их

антипролиферативной активности были проведены автором собственноручно с использованием оборудования лаборатории нанобиотехнологий Алферовского университета. Работа по изучению амплификации библиотек ДНК выполнена в соавторстве с Л. А. Овчинниковой. Л. А. Овчинниковой созданы библиотеки, разработаны методы эмульсификации и подобраны условия амплификации, проведен количественный анализ продуктов; автором проведен анализ данных секвенирования следующего поколения (NGS) для библиотек, изучены ошибки в фрагментах ДНК и построена теоретическая модель, описывающая процесс амплификации. Иммунизация лам и отбор кандидатных антител проводились компанией «Биокад» и в настоящей диссертации подробно не рассматриваются. Публикации по материалам работы были подготовлены совместно с соавторами и научным руководителем.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, трех основных глав, заключения и выводов. Общий объем диссертации составляет 147 страниц, включая 31 рисунок и 11 таблиц. Список литературы содержит 261 источник.

Апробация работы

Основные результаты исследования были представлены на ряде конференций и семинаров, в частности: на 4-й международной школе и конференции "Saint Petersburg OPEN 2017" (Санкт-Петербург, 2017 г.); на семинарах в Индустриальном партнере проекта — ЗАО «Биокад» (Санкт-Петербург, 2017 г.); на 42-й научной конференции с международным участием «Неделя науки СПбПУ» (Санкт-Петербург, 2018 г.); на 5-й международной школе и конференции "Saint Petersburg OPEN 2018" (Санкт-Петербург, 2018 г.); на 6-м всероссийском научном форуме «Наука будущего — наука молодых» (Москва, 2021 г.); на семинаре в Институте экспериментальной медицины (Санкт-Петербург, 2022 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 5 статей в рецензируемых научных журналах, индексируемых в международных базах данных, 1 патент и 6 тезисов докладов.

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Targeting ErbB3 receptor in cancer with inhibitory antibodies from llama / I. E. Eliseev, V. M. Ukrainskaya, A. N. Yudenko [et al.] // Biomedicines. - 2021. - Vol. 9. - № 9. - P. 1106.

2. Liquid drop of DNA libraries reveals total genome information / S. S. Terekhov, I. E. Eliseev,

L. A. Ovchinnikova [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2020. - Vol. 117. -№ 44. - P. 27300-27306.

3. Cadmium SAD phasing at CuKa wavelength / I. E. Eliseev, A. N. Yudenko, V. M. Ukrainskaya,

0. B. Chakchir // F1000Research. - 2019. - Vol. 8. - P. 84.

4. Crystal structures of a llama VHH antibody BCD090-M2 targeting human ErbB3 receptor /

1. E. Eliseev, A. N. Yudenko, V. V. Vysochinskaya [et al.] // F1000Research. - 2018. - Vol. 7. -P. 57.

5. Thermodynamic analysis of the conformational stability of a single-domain therapeutic antibody / I. E. Eliseev, A. N. Yudenko, N. A. Besedina [et al.] // Technical Physics Letters. - 2017. - Vol. 43. -№ 12. - P. 1088-1091.

Патенты:

Патент № 2721854 Российская Федерация, МПК C07K 16/22 (2006.01). Однодоменное антитело, специфически связывающее рецептор ErbB3 человека, без канонической дисульфидной связи : № 2018147039 : заявл. 27.12.2018 : опубл. 25.05.2020 / А. Н. Юденко, И. Е. Елисеев, В. М. Украинская, О. Б. Чакчир ; заявитель СПбАУ РАН им. Ж. И. Алферова - 4 с. : 4 ил.

Тезисы докладов:

1. Разработка систем экспрессии и очистки однодоменного анти-ЕЛВЗ антитела из периплазмы и цитоплазмы E. coli для структурных исследований / И. Е. Елисеев, Н. А. Беседина, А. Н. Юденко [и др.] // Международная научная конференция по биоорганической химии «XII чтения памяти академика Ю. А. Овчинникова» и VIII Российский симпозиум «Белки и пептиды», Москва. — 2017. Acta Naturae (Спецвыпуск). — С. 180.

2. Purification and biophysical characterization of a new single-domain antibody against human HER3 receptor / I. E. Eliseev, N. A. Besedina, A. N. Yudenko [et al.] // 4-я международная школа и конференция "Saint Petersburg OPEN 2017", Санкт-Петербург. — 2017.

Сборник тезисов. — С. 244-247.

3. Бактериальная экспрессия однодоменных антител к рецептору ErbB3 / В. М. Украинская, А. Н. Юденко, И. Е. Елисеев // 42-я научная конференция с международным участием «Неделя науки СПбПУ», Санкт-Петербург. — 2018. Материалы научной конференции. — С. 101-104.

4. Crystallization and X-ray structural studies of single-domain antibodies / I. E. Eliseev,

A. N. Yudenko, O. B. Chakchir // 5-я международная школа и конференция "Saint Petersburg OPEN 2018", Санкт-Петербург. — 2018. Сборник тезисов. — С. 138-139.

5. Phase diagrams of coil-globule transition in single-domain antibodies / A. A. Sakharov, A. N. Yudenko, O. B. Chakchir, I. E. Eliseev // 5-я международная школа и конференция "Saint Petersburg OPEN 2018", Санкт-Петербург. — 2018. Сборник тезисов. — С. 170-171.

6. Однодоменные антитела для блокирования рецептора при раке молочной железы /

И. Е. Елисеев, А. Д. Микушина, А. А. Вронская, О. В. Шамова // З-й Объединенный научный форум физиологов, биохимиков и молекулярных биологов и 10-й Российский симпозиум «Белки и пептиды», Москва. — 2021. Научные труды. — Т. 2. — С. 14З.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Рецепторы эпидермального фактора роста ErbB1-4: EGFR/ErbB1, HER2/ErbB2, HER3/ErbB3, HER4/ErbB4

Начало исследованиям рецепторов эпидермального фактора роста было положено в 1962 г. когда Стэнли Коэн изолировал белок экстракта слюнной железы, способный стимулировать прорезывание зубов и открытие глаз у новорожденных мышей [47]. Обнаружение данного белка, впоследствии названного эпидермальным фактором роста (epidermal growth factor, EGF), стало продолжением предшествовавших исследований Риты Леви-Монтальчини и Стэнли Коэна по идентификации фактора роста нервов. Их работа по ростовым факторам привела к открытию рецепторных тирозинкиназ и регулируемых ими внутриклеточных сигнальных путей и впоследствии была отмечена Нобелевской премией по физиологии и медицине 1986 г. Эпидермальный фактор роста запускает клеточную пролиферацию посредством стимуляции киназной активности соответствующего рецептора, EGFR [48]. EGFR стал первой обнаруженной рецепторной тирозинкиназой и моделью для понимания функций других важнейших клеточных рецепторов, например рецептора инсулина, также осуществляющего фосфорилирование тирозина в ответ на связывание лиганда [49]. Основополагающие работы раннего периода исследований рецепторных тирозинкиназ рассмотрены в обзоре [50]. Секвенирование гена, кодирующего рецептор EGFR [51; 52], обнаружило его гомологию с геном erbB вируса эритробластомы птиц [53], что дало современное название генам семейства рецепторов эпидермального фактора роста: ERBB1, ERBB2, ERBB3 и ERBB4.

Гомология рецептора EGFR (ErbBl) с вирусным онкогеном, его роль в регуляции клеточной пролиферации, а также амплификация и наличие мутантных форм его гена в опухолевых клетках [52] отчетливо продемонстрировали важную роль EGFR в онкогенезе. Вскоре было показано существование второго онкогена семейства ErbB, первоначально обнаруженного в нейробластомах крыс и названного neu, который способен к опухолевой трансформации клеток, и гомологичен гену EGFR [54]. Аналог neu был идентифицирован в геноме человека и секвенирован [55]. Получивший название HER2 (ErbB2) белок является родственной EGFR рецепторной тирозинкиназой. Амплификация гена HER2 встречается в 30% опухолей молочной железы и является самым сильным прогностическим фактором, коррелирующим с более низкой выживаемостью [56]. Третий представитель семейства, ErbB3 (HER3), характеризуется повышенной экспрессией в клеточных линиях рака молочной железы, однако изначально не был идентифицирован как онкоген и отличается от уже известных рецепторных тирозинкиназ мутациями в каталитическом домене [57; 58]. Четвертый рецептор семейства, ErbB4 (HER4),

демонстрирует гомологию с ErbB3 во внеклеточном лиганд-связывающем домене, но его внутриклеточный каталитический домен ближе к EGFR и HER2 [59].

1.1.1 Лиганды рецепторов ErbB

Все известные естественные лиганды рецепторов ErbB являются их агонистами, связываются с внеклеточными доменами рецепторов и аллостерически стимулируют тирозинкиназную активность внутриклеточных доменов [16]. При этом способностью связывать лиганд обладают рецепторы EGFR, ErbB3 и ErbB4, а HER2, по-видимому, не имеет природных агонистов. Условно лиганды рецепторов ErbB можно разделить на две группы. К первой группе относятся семь EGF-подобных молекул: сам EGF, трансформирующий фактор роста-a (TGFa), гепаринсвязывающий EGF-подобный фактор роста (HB-EGF), амфирегулин (AR), бетацеллюлин (BTC), эпирегулин (EPR) и эпиген. Ко второй группе относятся разнообразные лиганды, кодируемые четырьмя генами нейрегулинов NRG1, NRG2, NRG3 и NRG4.

EGF-подобные лиганды синтезируются в виде крупного трансмембранного белка-прекурсора, который затем процессируется протеазами на поверхности клеток [60]. Зрелые пептидные гормоны имеют небольшой EGF-домен размером около 40 аминокислотных остатков, обладающий шестью консервативными остатками цистеина, формирующими дисульфидные связи в соответствии с паттерном 1-3, 2-4, 5-6. Именно EGF-домен ответственен за связывание лигандов с рецепторами семейства ErbB. Все семь EGF-подобных лигандов являются агонистами EGFR, а три из них, HB-EGF, BTC и EPR, также стимулируют ErbB4.

Из четырех генов нейрегулинов наиболее хорошо изучен NRG1. Удивительно, но ген, кодирующий небольшие пептидные гормоны, имеет длину более 1.3 миллионов пар оснований и содержит 19 экзонов и по крайней мере 6 сайтов инициации транскрипции. Сложный альтернативный сплайсинг приводит к формированию более 15 изоформ, регулирующих самые разнообразные физиологические процессы в развитии нервной системы, сердца, молочной железы и мышц [61]. Разнообразные регуляторные функции NRG1 обуславливают его связь с несколькими заболеваниями. В частности, способность активировать рецептор ErbB3 связана с ролью NRG1 в патогенезе рака молочной железы. Недавно было показано, что экспрессия NRG1 увеличивается в ответ на гипергликемию и ведет к прогрессии опухолей [62]. Нейрегулины также подвергаются протеолитическому процессингу и имеют EGF-домен для связывания с ErbB. Действие нейрегулинов лимитировано рецепторами ErbB3 и ErbB4, причем NRG1 и NRG2 активируют оба рецептора, а NRG3 и NRG4 только ErbB4. В контексте активации рецептора ErbB3 при раке молочной железы наиболее интересны изоформы NRG1 типа 1, также называемые херегулинами [63].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Елисеев Игорь Евгеньевич, 2024 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

I. Ehrlich P. Experimental researches on specific therapeutics : The Harben lectures for 1907 of the Royal Institute of Public Health / P. Ehrlich. - London : H. K. Lewis, 1908.

2. Köhler G. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity / G. Köhler, C. Milstein // Nature. - 1975. - Vol. 256. - № 5517. - P. 495-497.

3. Monoclonal antibodies defining distinctive human T cell surface antigens / P. C. Kung, G. Goldstein, E. L. Reinherz, S. F. Schlossman // Science. - 1979. - Vol. 206. - № 4416. - P. 347-349.

4. Treatment of acute renal allograft rejection with OKT3 monoclonal antibody / A. B. Cosimi, R. C. Burton, R. B. Colvin [et al.] // Transplantation. - 1981. - Vol. 32. - № 6. - P. 535.

5. Winter G. Man-made antibodies / G. Winter, C. Milstein // Nature. - 1991. - Vol. 349. - № 6307. -P. 293-299.

6. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases / R.-M. Lu, Y.-C. Hwang, I.-J. Liu [et al.] // Journal of Biomedical Science. - 2020. - Vol. 27. - № 1. - P. 1.

7. Mullard A. FDA approves 100th monoclonal antibody product / A. Mullard // Nature Reviews Drug Discovery. - 2021. - Vol. 20. - № 7. - P. 491-495.

8. Meyer S. Regulation of complement and modulation of its activity in monoclonal antibody therapy of cancer / S. Meyer, J. H. Leusen, P. Boross // mAbs. - 2014. - Vol. 6. - № 5. - P. 1133-1144.

9. The role of Fc receptors on the effectiveness of therapeutic monoclonal antibodies / P. Gogesch, S. Dudek, G. van Zandbergen [et al.] // International Journal of Molecular Sciences. - 2021. - Vol. 22. -№ 16. - P. 8947.

10. Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytoxicity against tumor targets / R. A. Clynes, T. L. Towers, L. G. Presta, J. V. Ravetch // Nature Medicine. - 2000. - Vol. 6. - № 4. - P. 443-446.

II. Unique pharmacology of a novel allosteric agonist/sensitizer insulin receptor monoclonal antibody / S. A. Hinke, A. M. Cieniewicz, T. Kirchner [et al.] // Molecular Metabolism. - 2018. - Vol. 10. - P. 8799.

12. Structure-guided discovery of a single-domain antibody agonist against human apelin receptor / Y. Ma, Y. Ding, X. Song [et al.] // Science Advances. - 2020. - Vol. 6. - № 3. - P. eaax7379.

13. Tsao L.-C. Mechanisms of therapeutic antitumor monoclonal antibodies / L.-C. Tsao, J. Force, Z. C. Hartman // Cancer Research. - 2021. - Vol. 81. - № 18. - P. 4641-4651.

14. Gschwind A. The discovery of receptor tyrosine kinases: targets for cancer therapy / A. Gschwind, O. M. Fischer, A. Ullrich // Nature Reviews Cancer. - 2004. - Vol. 4. - № 5. - P. 361-370.

15. Citri A. EGF-ERBB signalling: Towards the systems level / A. Citri, Y. Yarden // Nature Reviews Molecular Cell Biology. - 2006. - Vol. 7. - № 7. - P. 505-516.

16. Hynes N. E. ErbB receptors and signaling pathways in cancer / N. E. Hynes, G. MacDonald // Current Opinion in Cell Biology. - 2009. - Vol. 21. - № 2. - P. 177-184.

17. Epidermal growth factor receptor: mechanisms of activation and signalling / R. N. Jorissen, F. Walker, N. Pouliot [et al.] // The EGF receptor family / ed. G. Carpenter. - Burlington : Academic Press, 2003. - P. 33-55.

18. Поляновский О. Л. ErbB онкогены - мишени моноклональных антител / О. Л. Поляновский, Е. Н. Лебеденко, С. М. Деев // Биохимия. - 2012. - Vol. 77. - № 3. - P. 289-311.

19. Cetuximab Monotherapy and Cetuximab plus Irinotecan in Irinotecan-Refractory Metastatic Colorectal Cancer / D. Cunningham, Y. Humblet, S. Siena [et al.] // New England Journal of Medicine. - 2004. - Vol. 351. - № 4. - P. 337-345.

20. Use of Chemotherapy plus a Monoclonal Antibody against HER2 for Metastatic Breast Cancer That Overexpresses HER2 / D. J. Slamon, B. Leyland-Jones, S. Shak [et al.] // New England Journal of Medicine. - 2001. - Vol. 344. - № 11. - P. 783-792.

21. Swain S. M. Targeting HER2-positive breast cancer: advances and future directions / S. M. Swain, M. Shastry, E. Hamilton // Nature Reviews Drug Discovery. - 2023. - Vol. 22. - № 2. - P. 101-126.

22. Insect cell-expressed p180(erbB3) possesses an impaired tyrosine kinase activity / P. M. Guy, J. V. Platko, L. C. Cantley [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1994. - Vol. 91. - № 17. - P. 8132-8136.

23. Expression of the HER1-4 family of receptor tyrosine kinases in breast cancer / C. J. Witton, J. R. Reeves, J. J. Going [et al.] // The Journal of Pathology. - 2003. - Vol. 200. - № 3. - P. 290-297.

24. HER-3 Overexpression Is Prognostic of Reduced Breast Cancer Survival: A Study of 4046 Patients / C. G. Chiu, H. Masoudi, S. Leung [et al.] // Annals of Surgery. - 2010. - Vol. 251. - № 6. - P. 1107.

25. The erbB-2/HER2 oncoprotein of human carcinomas may function solely as a shared coreceptor for multiple stroma-derived growth factors / L. N. Klapper, S. Glathe, N. Vaisman [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1999. - Vol. 96. - № 9. - P. 49955000.

26. Heregulin-dependent regulation of HER2/neu oncogenic signaling by heterodimerization with HER3 / C. Wallasch, F. Ulrich Weiß, G. Niederfellner [et al.] // EMBO Journal. - 1995. - Vol. 14. -№ 17. - P. 4267-4275.

27. The ErbB2/ErbB3 heterodimer functions as an oncogenic unit: ErbB2 requires ErbB3 to drive breast tumor cell proliferation / T. Holbro, R. R. Beerli, F. Maurer [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2003. - Vol. 100. - № 15. - P. 8933-8938.

28. A single autophosphorylation site confers oncogenicity to the Neu/ErbB-2 receptor and enables coupling to the MAP kinase pathway / R. Ben-Levy, H. F. Paterson, C. J. Marshall, Y. Yarden // EMBO Journal. - 1994. - Vol. 13. - № 14. - P. 3302-3311.

29. Prigent S. A. Identification of c-erbB-3 binding sites for phosphatidylinositol 3'-kinase and SHC using an EGF receptor/c-erbB-3 chimera / S. A. Prigent, W. J. Gullick // EMBO Journal. - 1994. -Vol. 13. - № 12. - P. 2831-2841.

30. Escape from HER-family tyrosine kinase inhibitor therapy by the kinase-inactive HER3 / N. V. Sergina, M. Rausch, D. Wang [et al.] // Nature. - 2007. - Vol. 445. - № 7126. - P. 437-441.

31. Transcriptional and posttranslational up-regulation of HER3 (ErbB3) compensates for inhibition of the HER2 tyrosine kinase / J. T. Garrett, M. G. Olivares, C. Rinehart [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2011. - Vol. 108. - № 12. - P. 5021-5026.

32. HER3, serious partner in crime: Therapeutic approaches and potential biomarkers for effect of HER3-targeting / A. Kol, A. G. T. Terwisscha Van Scheltinga, H. Timmer-Bosscha [et al.] // Pharmacology and Therapeutics. - 2014. - Vol. 143. - № 1. - P. 1-11.

33. HER3/ErbB3, an emerging cancer therapeutic target / N. Zhang, Y. Chang, A. Rios, Z. An // Acta Biochimica et Biophysica Sinica. - 2015. - Vol. 48. - № 1. - P. 39-48.

34. Targeting HER3 using mono- and bispecific antibodies or alternative scaffolds / M. Malm, F. Y. Frejd, S. Stahl, J. Lofblom // mAbs. - 2016. - Vol. 8. - № 7. - P. 1195-1209.

35. HER3 signaling and targeted therapy in cancer / R. Mishra, H. Patel, S. Alanazi [et al.] // Oncology Reviews. - 2018. - Vol. 12. - № 1. - P. 45-62.

36. An antibody that locks HER3 in the inactive conformation inhibits tumor growth driven by HER2 or neuregulin / A. P. Garner, C. U. Bialucha, E. R. Sprague [et al.] // Cancer Research. - 2013. - Vol. 73. - № 19. - P. 6024-6035.

37. RG7116, a therapeutic antibody that binds the inactive HER3 receptor and is optimized for immune effector activation / C. Mirschberger, C. B. Schiller, M. Schraml [et al.] // Cancer Research. - 2013. -Vol. 73. - № 16. - P. 5183-5194.

38. Inhibition of ErbB3 by a monoclonal antibody that locks the extracellular domain in an inactive configuration / S. Lee, E. B. Greenlee, J. R. Amick [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2015. - Vol. 112. - № 43. - P. 13225-13230.

39. Naturally occurring antibodies devoid of light chains / C. Hamers-Casterman, T. Atarhouch, S. Muyldermans [et al.] // Nature. - 1993. - Vol. 363. - № 6428. - P. 446-448.

40. Harmsen M. M. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments / M. M. Harmsen, H. J. De Haard // Applied Microbiology and Biotechnology. - 2007. -Vol. 77. - № 1. - P. 13-22.

41. Camel heavy-chain antibodies: Diverse germline V(H)H and specific mechanisms enlarge the antigen-binding repertoire / V. K. Nguyen, R. Hamers, L. Wyns, S. Muyldermans // EMBO Journal. -2000. - Vol. 19. - № 5. - P. 921-930.

42. Rios M. de los. Structural and genetic diversity in antibody repertoires from diverse species / M. de los Rios, M. F. Criscitiello, V. V. Smider // Current Opinion in Structural Biology. - 2015. - Vol. 33. -P. 27-41.

43. Steeland S. Nanobodies as therapeutics: Big opportunities for small antibodies / S. Steeland, R. E. Vandenbroucke, C. Libert // Drug Discovery Today. - 2016. - Vol. 21. - № 7. - P. 1076-1113.

44. Duggan S. Caplacizumab: First Global Approval / S. Duggan // Drugs. - 2018. - Vol. 78. - № 15. -P. 1639-1642.

45. Caplacizumab for Acquired Thrombotic Thrombocytopenic Purpura / F. Peyvandi, M. Scully, J. A. Kremer Hovinga [et al.] // New England Journal of Medicine. - 2016. - Vol. 374. - № 6. - P. 511-522.

46. Caplacizumab Treatment for Acquired Thrombotic Thrombocytopenic Purpura / M. Scully, S. R. Cataland, F. Peyvandi [et al.] // New England Journal of Medicine. - 2019. - Vol. 380. - № 4. - P. 335346.

47. Cohen S. Isolation of a Mouse Submaxillary Gland Protein Accelerating Incisor Eruption and Eyelid Opening in the New-born Animal / S. Cohen // Journal of Biological Chemistry. - 1962. - Vol. 237. -№ 5. - P. 1555-1562.

48. Carpenter G. Epidermal growth factor stimulates phosphorylation in membrane preparations in vitro / G. Carpenter, L. King, S. Cohen // Nature. - 1978. - Vol. 276. - № 5686. - P. 409-410.

49. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system / M. Kasuga, Y. Zick, D. L. Blithe [et al.] // Nature. - 1982. - Vol. 298. - № 5875. - P. 667-669.

50. Schlessinger J. Receptor Tyrosine Kinases: Legacy of the First Two Decades / J. Schlessinger // Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. - 2014. - Vol. 6. - № 3. - P. a008912.

51. Close similarity of epidermal growth factor receptor and v-erb-B oncogene protein sequences / J. Downward, Y. Yarden, E. Mayes [et al.] // Nature. - 1984. - Vol. 307. - № 5951. - P. 521-527.

52. Human epidermal growth factor receptor cDNA sequence and aberrant expression of the amplified gene in A431 epidermoid carcinoma cells / A. Ullrich, L. Coussens, J. S. Hayflick [et al.] // Nature. -1984. - Vol. 309. - № 5967. - P. 418-425.

53. The erbB gene of avian erythroblastosis virus is a member of the src gene family / T. Yamamoto, T. Nishida, N. Miyajima [et al.] // Cell. - 1983. - Vol. 35. - № 1. - P. 71-78.

54. The neu oncogene: an erb-B-related gene encoding a 185,000-Mr tumour antigen / A. L. Schechter, D. F. Stern, L. Vaidyanathan [et al.] // Nature. - 1984. - Vol. 312. - № 5994. - P. 513-516.

55. Tyrosine Kinase Receptor with Extensive Homology to EGF Receptor Shares Chromosomal Location with neu Oncogene / L. Coussens, T. L. Yang-Feng, Y.-C. Liao [et al.] // Science. - 1985. -Vol. 230. - № 4730. - P. 1132-1139.

56. Human Breast Cancer: Correlation of Relapse and Survival with Amplification of the HER-2/neu Oncogene / D. J. Slamon, G. M. Clark, S. G. Wong [et al.] // Science. - 1987. - Vol. 235. - № 4785. -P. 177-182.

57. Isolation and characterization of ERBB3, a third member of the ERBB/epidermal growth factor receptor family: evidence for overexpression in a subset of human mammary tumors. / M. H. Kraus, W. Issing, T. Miki [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1989. - Vol. 86. - № 23. - P. 9193-9197.

58. Molecular cloning and expression of an additional epidermal growth factor receptor-related gene. / G. D. Plowman, G. S. Whitney, M. G. Neubauer [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1990. - Vol. 87. - № 13. - P. 4905-4909.

59. Ligand-specific activation of HER4/p180erbB4, a fourth member of the epidermal growth factor receptor family. / G. D. Plowman, J. M. Culouscou, G. S. Whitney [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1993. - Vol. 90. - № 5. - P. 1746-1750.

60. Harris R. C. EGF receptor ligands / R. C. Harris, E. Chung, R. J. Coffey // The EGF Receptor Family / ed. G. Carpenter. - Burlington : Academic Press, 2003. - P. 3-14.

61. Falls D. L. Neuregulins: Functions, forms, and signaling strategies / D. L. Falls // The EGF Receptor Family / ed. G. Carpenter. - Burlington : Academic Press, 2003. - P. 15-31.

62. Epigenetic regulation of Neuregulin 1 promotes breast cancer progression associated to hyperglycemia / C. Lee, M. Kim, C. Park [et al.] // Nature Communications. - 2023. - Vol. 14. - № 1.

- P. 439.

63. Hayes N. V. L. The Neuregulin Family of Genes and their Multiple Splice Variants in Breast Cancer / N. V. L. Hayes, W. J. Gullick // Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. - 2008. - Vol. 13.

- № 2. - P. 205-214.

64. ErbB-2 is a common auxiliary subunit of NDF and EGF receptors: implications for breast cancer. / D. Karunagaran, E. Tzahar, R. R. Beerli [et al.] // The EMBO Journal. - 1996. - Vol. 15. - № 2. -P. 254-264.

65. Jones J. T. Binding specificities and affinities of egf domains for ErbB receptors / J. T. Jones, R. W. Akita, M. X. Sliwkowski // FEBS Letters. - 1999. - Vol. 447. - № 2. - P. 227-231.

66. Epiregulin Is a Potent Pan-ErbB Ligand That Preferentially Activates Heterodimeric Receptor Complexes / M. Shelly, R. Pinkas-Kramarski, B. C. Guarino [et al.] // Journal of Biological Chemistry.

- 1998. - Vol. 273. - № 17. - P. 10496-10505.

67. Formation of a high affinity heregulin binding site using the soluble extracellular domains of ErbB2 with ErbB3 or ErbB4 / V. D. Fitzpatrick, P. I. Pisacane, R. L. Vandlen, M. X. Sliwkowski // FEBS Letters. - 1998. - Vol. 431. - № 1. - P. 102-106.

68. Chicken epidermal growth factor (EGF) receptor: cDNA cloning, expression in mouse cells, and differential binding of EGF and transforming growth factor alpha. / I. Lax, A. Johnson, R. Howk [et al.] // Molecular and Cellular Biology. - 1988. - Vol. 8. - № 5. - P. 1970-1978.

69. Cho H.-S. Structure of the Extracellular Region of HER3 Reveals an Interdomain Tether / H.-S. Cho, D. J. Leahy // Science. - 2002. - Vol. 297. - № 5585. - P. 1330-1333.

70. Crystal Structure of a Truncated Epidermal Growth Factor Receptor Extracellular Domain Bound to Transforming Growth Factor a / T. P. J. Garrett, N. M. McKern, M. Lou [et al.] // Cell. - 2002. -Vol. 110. - № 6. - P. 763-773.

71. Crystal Structure of the Complex of Human Epidermal Growth Factor and Receptor Extracellular Domains / H. Ogiso, R. Ishitani, O. Nureki [et al.] // Cell. - 2002. - Vol. 110. - № 6. - P. 775-787.

72. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab / H.-S. Cho, K. Mason, K. X. Ramyar [et al.] // Nature. - 2003. - Vol. 421. - № 6924. - P. 756-760.

73. Alvarado D. ErbB2 resembles an autoinhibited invertebrate epidermal growth factor receptor / D. Alvarado, D. E. Klein, M. A. Lemmon // Nature. - 2009. - Vol. 461. - № 7261. - P. 287-291.

74. Structures of the HER2-HER3-NRG1P complex reveal a dynamic dimer interface / D. Diwanji, R. Trenker, T. M. Thaker [et al.] // Nature. - 2021. - Vol. 600. - № 7888. - P. 339-343.

75. A single ligand is sufficient to activate EGFR dimers / P. Liu, T. E. Cleveland, S. Bouyain [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2012. - Vol. 109. - № 27. - P. 10861-10866.

76. Structure and dynamics of the EGFR/HER2 heterodimer / X. Bai, P. Sun, X. Wang [et al.] // Cell Discovery. - 2023. - Vol. 9. - № 1. - P. 1-16.

77. Rosen J. M. Paracrine signaling in mammary gland development: what can we learn about intratumoral heterogeneity? / J. M. Rosen, K. Roarty // Breast Cancer Research. - 2014. - Vol. 16. -№ 1. - P. 202.

78. The membrane protein CD9/DRAP 27 potentiates the juxtacrine growth factor activity of the membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor / S. Higashiyama, R. Iwamoto, K. Goishi [et al.] // The Journal of Cell Biology. - 1995. - Vol. 128. - № 5. - P. 929-938.

79. Wang J. Y. The N-terminal Region of Neuregulin Isoforms Determines the Accumulation of Cell Surface and Released Neuregulin Ectodomain / J. Y. Wang, S. J. Miller, D. L. Falls // Journal of Biological Chemistry. - 2001. - Vol. 276. - № 4. - P. 2841-2851.

80. Nicholson K. M. Autocrine signalling through erbB receptors promotes constitutive activation of protein kinase B/Akt in breast cancer cell lines / K. M. Nicholson, C. H. Streuli, N. G. Anderson // Breast Cancer Research and Treatment. - 2003. - Vol. 81. - № 2. - P. 117-128.

81. An heregulin-EGFR-HER3 autocrine signaling axis can mediate acquired lapatinib resistance in HER2+ breast cancer models / W. Xia, E. F. Petricoin, S. Zhao [et al.] // Breast Cancer Research. -2013. - Vol. 15. - № 5. - P. R85.

82. An activated ErbB3/NRG1 autocrine loop supports in vivo proliferation in ovarian cancer cells / Q. Sheng, X. Liu, E. Fleming [et al.] // Cancer cell. - 2010. - Vol. 17. - № 3. - P. 298-310.

83. Autocrine activation of ErbB2/ErbB3 receptor complex by NRG-1 in non-small cell lung cancer cell lines / M. Gollamudi, D. Nethery, J. Liu, J. A. Kern // Lung Cancer. - 2004. - Vol. 43. - № 2. - P. 135143.

84. Yarden Y. Untangling the ErbB signalling network / Y. Yarden, M. X. Sliwkowski // Nature Reviews Molecular Cell Biology. - 2001. - Vol. 2. - № 2. - P. 127-137.

85. Lemmon M. A. Ligand-induced ErbB receptor dimerization : Invited Reviews: ErbB Receptors / M. A. Lemmon // Experimental Cell Research. - 2009. - Vol. 315. - № 4. - P. 638-648.

86. An Open-and-Shut Case? Recent Insights into the Activation of EGF/ErbB Receptors / A. W. Burgess, H.-S. Cho, C. Eigenbrot [et al.] // Molecular Cell. - 2003. - Vol. 12. - № 3. - P. 541-552.

87. Sako Y. Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells / Y. Sako, S. Minoghchi, T. Yanagida // Nature Cell Biology. - 2000. - Vol. 2. - № 3. - P. 168-172.

88. Single-molecule functional anatomy of endogenous HER2-HER3 heterodimers / B. Choi, M. Cha, G. S. Eun [et al.] // eLife. - 2020. - Vol. 9. - P. e53934.

89. Functional selectivity of EGF family peptide growth factors: Implications for cancer / K. J. Wilson, J. L. Gilmore, J. Foley [et al.] // Pharmacology & Therapeutics. - 2009. - Vol. 122. - № 1. - P. 1-8.

90. Macdonald J. L. Heterogeneity in EGF-binding affinities arises from negative cooperativity in an aggregating system / J. L. Macdonald, L. J. Pike // Proceedings of the National Academy of Sciences. -2008. - Vol. 105. - № 1. - P. 112-117.

91. Alvarado D. Structural Basis for Negative Cooperativity in Growth Factor Binding to an EGF Receptor / D. Alvarado, D. E. Klein, M. A. Lemmon // Cell. - 2010. - Vol. 142. - № 4. - P. 568-579.

92. EGFR Ligands Differentially Stabilize Receptor Dimers to Specify Signaling Kinetics / D. M. Freed, N. J. Bessman, A. Kiyatkin [et al.] // Cell. - 2017. - Vol. 171. - № 3. - P. 683-695.e18.

93. Extensive conformational and physical plasticity protects HER2-HER3 tumorigenic signaling / M. R. Campbell, A. Ruiz-Saenz, Y. Zhang [et al.] // Cell Reports. - 2022. - Vol. 38. - № 5. - P. 110285.

94. Baselga J. Novel anticancer targets: revisiting ERBB2 and discovering ERBB3 / J. Baselga, S. M. Swain // Nature Reviews Cancer. - 2009. - Vol. 9. - № 7. - P. 463-475.

95. ErbB3/HER3 intracellular domain is competent to bind ATP and catalyze autophosphorylation / F. Shi, S. E. Telesco, Y. Liu [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2010. - Vol. 107.

- № 17. - P. 7692-7697.

96. Receptor tyrosine kinases with intracellular pseudokinase domains / J. M. Mendrola, F. Shi, J. H. Park, M. A. Lemmon // Biochemical Society Transactions. - 2013. - Vol. 41. - № 4. - P. 1029-1036.

97. An Allosteric Mechanism for Activation of the Kinase Domain of Epidermal Growth Factor Receptor / X. Zhang, J. Gureasko, K. Shen [et al.] // Cell. - 2006. - Vol. 125. - № 6. - P. 1137-1149.

98. Structural analysis of the EGFR/HER3 heterodimer reveals the molecular basis for activating HER3 mutations / P. Littlefield, L. Liu, V. Mysore [et al.] // Science Signaling. - 2014. - Vol. 7. - № 354. -P. ra114-ra114.

99. Role of ErbB Receptors in Cancer Cell Migration and Invasion / A. Appert-Collin, P. Hubert, G. Cremel, A. Bennasroune // Frontiers in Pharmacology. - 2015. - Vol. 6. - P. 283.

100. Kumagai S. Antitumour immunity regulated by aberrant ERBB family signalling / S. Kumagai, S. Koyama, H. Nishikawa // Nature Reviews Cancer. - 2021. - Vol. 21. - № 3. - P. 181-197.

101. Targeted Disruption of Mouse EGF receptor: Effect of Genetic Background on Mutant Phenotype / D. W. Threadgill, A. A. Dlugosz, L. A. Hansen [et al.] // Science. - 1995. - Vol. 269. -№ 5221. - P. 230-234.

102. Targeted inactivation of the EGF and amphiregulin genes reveals distinct roles for EGF receptor ligands in mouse mammary gland development / N. C. Luetteke, T. H. Qiu, S. E. Fenton [et al.] // Development. - 1999. - Vol. 126. - № 12. - P. 2739-2750.

103. Meyer D. Multiple essential functions of neuregulin in development / D. Meyer, C. Birchmeier // Nature. - 1995. - Vol. 378. - № 6555. - P. 386-390.

104. Generation and Characterization of Neuregulin-2-Deficient Mice / J. M. Britto, S. Lukehurst, R. Weller [et al.] // Molecular and Cellular Biology. - 2004. - Vol. 24. - № 18. - P. 8221-8226.

105. Requirement for neuregulin receptor erbB2 in neural and cardiac development / K.-F. Lee, H. Simon, H. Chen [et al.] // Nature. - 1995. - Vol. 378. - № 6555. - P. 394-398.

106. Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor / M. Gassmann, F. Casagranda, D. Orioli [et al.] // Nature. - 1995. - Vol. 378. - № 6555. - P. 390-394.

107. ErbB3 is required for normal cerebellar and cardiac development: a comparison with ErbB2- and heregulin-deficient mice / S. L. Erickson, K. S. O'Shea, N. Ghaboosi [et al.] // Development. - 1997. -Vol. 124. - № 24. - P. 4999-5011.

108. Schroeder J. A. Dynamic expression and activation of ERBB receptors in the developing mouse mammary gland / J. A. Schroeder, D. C. Lee // Cell Growth & Differentiation. - 1998. - Vol. 9. - № 6.

- P. 451-464.

109. Ciarloni L. Amphiregulin is an essential mediator of estrogen receptor a function in mammary gland development / L. Ciarloni, S. Mallepell, C. Brisken // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2007. - Vol. 104. - № 13. - P. 5455-5460.

110. Stern D. F. ErbBs in mammary development / D. F. Stern // The EGF Receptor Family / ed. G. Carpenter. - Burlington : Academic Press, 2003. - P. 93-102.

111. Keefe D. L. Trastuzumab-associated cardiotoxicity / D. L. Keefe // Cancer. - 2002. - Vol. 95. -№ 7. - P. 1592-1600.

112. Lemmens K. Role of Neuregulin-1/ErbB Signaling in Cardiovascular Physiology and Disease / K. Lemmens, K. Doggen, G. W. De Keulenaer // Circulation. - 2007. - Vol. 116. - № 8. - P. 954-960.

113. Cardiac Endothelial Cells Regulate Reactive Oxygen Species-induced Cardiomyocyte Apoptosis through Neuregulin-1ß/erbB4 Signaling / Y. Kuramochi, G. M. Cote, X. Guo [et al.] // Journal of Biological Chemistry. - 2004. - Vol. 279. - № 49. - P. 51141-51147.

114. Neuregulin-1 Induces a Negative Inotropic Effect in Cardiac Muscle / K. Lemmens, P. Fransen, S. U. Sys [et al.] // Circulation. - 2004. - Vol. 109. - № 3. - P. 324-326.

115. Nave K.-A. Axonal regulation of myelination by neuregulin 1 : Neuronal and glial cell biology / New technologies / K.-A. Nave, J. L. Salzer // Current Opinion in Neurobiology. - 2006. - Vol. 16. -№ 5. - P. 492-500.

116. Neuregulin-1 controls an endogenous repair mechanism after spinal cord injury / K. Bartus, J. Galino, N. D. James [et al.] // Brain. - 2016. - Vol. 139. - № 5. - P. 1394-1416.

117. ErbB receptor signaling directly controls oligodendrocyte progenitor cell transformation and spontaneous remyelination after spinal cord injury / K. Bartus, E. R. Burnside, J. Galino [et al.] // Glia. - 2019. - Vol. 67. - № 6. - P. 1036-1046.

118. HER2 as a prognostic and predictive marker for breast cancer / T. Cooke, J. Reeves, A. Lanigan, P. Stanton // Annals of Oncology. - 2001. - Vol. 12. - P. S23-S28.

119. Molecular portraits of human breast tumours / C. M. Perou, T. S0rlie, M. B. Eisen [et al.] // Nature. - 2000. - Vol. 406. - № 6797. - P. 747-752.

120. Gravalos C. HER2 in gastric cancer: a new prognostic factor and a novel therapeutic target / C. Gravalos, A. Jimeno // Annals of Oncology. - 2008. - Vol. 19. - № 9. - P. 1523-1529.

121. HER2 Status in Colorectal Cancer: Its Clinical Significance and the Relationship between HER2 Gene Amplification and Expression / A. N. Seo, Y. Kwak, D.-W. Kim [et al.] // PLOS ONE. - 2014. -Vol. 9. - № 5. - P. e98528.

122. Epidermal Growth Factor Receptor and HER2-neu mRNA Expression in Non-Small Cell Lung Cancer Is Correlated with Survival / J. Brabender, K. D. Danenberg, R. Metzger [et al.] // Clinical Cancer Research. - 2001. - Vol. 7. - № 7. - P. 1850-1855.

123. Nicholson R. I. EGFR and cancer prognosis / R. I. Nicholson, J. M. W. Gee, M. E. Harper // European Journal of Cancer. - 2001. - Vol. 37. - P. 9-15.

124. Impact of EGFR expression on colorectal cancer patient prognosis and survival / J.-P. Spano, C. Lagorce, D. Atlan [et al.] // Annals of Oncology. - 2005. - Vol. 16. - № 1. - P. 102-108.

125. Cetuximab for the Treatment of Colorectal Cancer / D. J. Jonker, C. J. O'Callaghan, C. S. Karapetis [et al.] // New England Journal of Medicine. - 2007. - Vol. 357. - № 20. - P. 2040-2048.

126. Cetuximab Shows Activity in Colorectal Cancer Patients With Tumors That Do Not Express the Epidermal Growth Factor Receptor by Immunohistochemistry / K. Y. Chung, J. Shia, N. E. Kemeny [et al.] // Journal of Clinical Oncology. - 2005. - Vol. 23. - № 9. - P. 1803-1810.

127. Activating Mutations in the Epidermal Growth Factor Receptor Underlying Responsiveness of Non-Small-Cell Lung Cancer to Gefitinib / T. J. Lynch, D. W. Bell, R. Sordella [et al.] // New England Journal of Medicine. - 2004. - Vol. 350. - № 21. - P. 2129-2139.

128. Ligand-Independent EGFR Signaling / G. Guo, K. Gong, B. Wohlfeld [et al.] // Cancer Research.

- 2015. - Vol. 75. - № 17. - P. 3436-3441.

129. Differential Constitutive Activation of the Epidermal Growth Factor Receptor in Non-Small Cell Lung Cancer Cells Bearing EGFR Gene Mutation and Amplification / T. Okabe, I. Okamoto, K. Tamura [et al.] // Cancer Research. - 2007. - Vol. 67. - № 5. - P. 2046-2053.

130. Huang P. H. Oncogenic EGFR Signaling Networks in Glioma / P. H. Huang, A. M. Xu, F. M. White // Science Signaling. - 2009. - Vol. 2. - № 87. - P. re6.

131. Activating HER2 Mutations in HER2 Gene Amplification Negative Breast Cancer / R. Bose, S. M. Kavuri, A. C. Searleman [et al.] // Cancer Discovery. - 2013. - Vol. 3. - № 2. - P. 224-237.

132. Hanahan D. The Hallmarks of Cancer / D. Hanahan, R. A. Weinberg // Cell. - 2000. - Vol. 100.

- № 1. - P. 57-70.

133. Ellis L. M. Epidermal growth factor receptor in tumor angiogenesis / L. M. Ellis // Hematology/Oncology Clinics of North America. - 2004. - Vol. 18. - № 5. - P. 1007-1021.

134. Adjuvant Pertuzumab and Trastuzumab in Early HER2-Positive Breast Cancer / G. von Minckwitz, M. Procter, E. de Azambuja [et al.] // New England Journal of Medicine. - 2017. - Vol. 377.

- № 2. - P. 122-131.

135. Differential Sensitivity of ERBB2 Kinase Domain Mutations towards Lapatinib / R. K. Kancha, N. von Bubnoff, N. Bartosch [et al.] // PLOS ONE. - 2011. - Vol. 6. - № 10. - P. e26760.

136. Expression of p95HER2, a Truncated Form of the HER2 Receptor, and Response to Anti-HER2 Therapies in Breast Cancer / M. Scaltriti, F. Rojo, A. Ocana [et al.] // JNCI: Journal of the National Cancer Institute. - 2007. - Vol. 99. - № 8. - P. 628-638.

137. PIK3CA mutations are associated with reduced pathological complete response rates in primary HER2-positive breast cancer: pooled analysis of 967 patients from five prospective trials investigating lapatinib and trastuzumab / S. Loibl, I. Majewski, V. Guarneri [et al.] // Annals of Oncology. - 2016. -Vol. 27. - № 8. - P. 1519-1525.

138. Frequent Mutational Activation of the PI3K-AKT Pathway in Trastuzumab-Resistant Breast Cancer / S. Chandarlapaty, R. A. Sakr, D. Giri [et al.] // Clinical Cancer Research. - 2012. - Vol. 18. -№ 24. - P. 6784-6791.

139. A Hierarchical Network of Interreceptor Interactions Determines Signal Transduction by Neu Differentiation Factor/Neuregulin and Epidermal Growth Factor / E. Tzahar, H. Waterman, X. Chen [et al.] // Molecular and Cellular Biology. - 1996. - Vol. 16. - № 10. - P. 5276-5287.

140. MET Amplification Leads to Gefitinib Resistance in Lung Cancer by Activating ERBB3 Signaling / J. A. Engelman, K. Zejnullahu, T. Mitsudomi [et al.] // Science. - 2007. - Vol. 316. -№ 5827. - P. 1039-1043.

141. Activating HER3 mutations in breast cancer / R. Mishra, S. Alanazi, L. Yuan [et al.] // Oncotarget. - 2018. - Vol. 9. - № 45. - P. 27773-27788.

142. Co-occurring gain-of-function mutations in HER2 and HER3 modulate HER2/HER3 activation, oncogenesis, and HER2 inhibitor sensitivity / A. B. Hanker, B. P. Brown, J. Meiler [et al.] // Cancer Cell. - 2021. - Vol. 39. - № 8. - P. 1099-1114.e8.

143. Humanization of an anti-p185HER2 antibody for human cancer therapy. / P. Carter, L. Presta, C. M. Gorman [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1992. - Vol. 89. - № 10. - P. 4285-4289.

144. Hudis C. A. Trastuzumab — Mechanism of Action and Use in Clinical Practice / C. A. Hudis // New England Journal of Medicine. - 2007. - Vol. 357. - № 1. - P. 39-51.

145. Nahta R. The HER-2-Targeting Antibodies Trastuzumab and Pertuzumab Synergistically Inhibit the Survival of Breast Cancer Cells / R. Nahta, M.-C. Hung, F. J. Esteva // Cancer Research. - 2004. -Vol. 64. - № 7. - P. 2343-2346.

146. Pertuzumab, Trastuzumab, and Docetaxel in HER2-Positive Metastatic Breast Cancer / S. M. Swain, J. Baselga, S.-B. Kim [et al.] // New England Journal of Medicine. - 2015. - Vol. 372. - № 8. -P. 724-734.

147. Efficacy of Margetuximab vs Trastuzumab in Patients With Pretreated ERBB2-Positive Advanced Breast Cancer: A Phase 3 Randomized Clinical Trial / H. S. Rugo, S.-A. Im, F. Cardoso [et al.] // JAMA Oncology. - 2021. - Vol. 7. - № 4. - P. 573-584.

148. Bispecific antibodies: a mechanistic review of the pipeline / A. F. Labrijn, M. L. Janmaat, J. M. Reichert, P. W. H. I. Parren // Nature Reviews Drug Discovery. - 2019. - Vol. 18. - № 8. - P. 585-608.

149. Abstract 1005: The bispecific antibody zanidatamab's (ZW25's) unique mechanisms of action and durable anti-tumor activity in HER2-expressing cancers / N. E. Weisser, G. Wickman, L. Abraham [et al.] // Cancer Research. - 2021. - Vol. 81. - Abstract 1005. - № 13_Supplement. - P. 1005.

150. First-in-human HER2-targeted Bispecific Antibody KN026 for the Treatment of Patients with HER2-positive Metastatic Breast Cancer: Results from a Phase I Study / J. Zhang, D. Ji, L. Cai [et al.] // Clinical Cancer Research. - 2021. - Vol. 28. - № 4. - P. 618-628.

151. Haikala H. M. Thirty Years of HER3: From Basic Biology to Therapeutic Interventions / H. M. Haikala, P. A. Jänne // Clinical Cancer Research. - 2021. - Vol. 27. - № 13. - P. 3528-3539.

152. A Novel Therapeutic Anti-ErbB3, ISU104 Exhibits Potent Antitumorigenic Activity by Inhibiting Ligand Binding and ErbB3 Heterodimerization / M. Hong, Y. Yoo, M. Kim [et al.] // Molecular Cancer Therapeutics. - 2021. - Vol. 20. - № 6. - P. 1142-1152.

153. Unbiased Combinatorial Screening Identifies a Bispecific IgG1 that Potently Inhibits HER3 Signaling via HER2-Guided Ligand Blockade / C. A. W. Geuijen, C. D. Nardis, D. Maussang [et al.] // Cancer Cell. - 2018. - Vol. 33. - № 5. - P. 922-936.e10.

154. Zenocutuzumab, a HER2xHER3 Bispecific Antibody, Is Effective Therapy for Tumors Driven by NRG1 Gene Rearrangements / A. M. Schram, I. Odintsov, M. Espinosa-Cotton [et al.] // Cancer Discovery. - 2022. - Vol. 12. - № 5. - P. 1233-1247.

155. Antitumor Activity of a Novel Bispecific Antibody That Targets the ErbB2/ErbB3 Oncogenic Unit and Inhibits Heregulin-Induced Activation of ErbB3 / C. F. McDonagh, A. Huhalov, B. D. Harms [et al.] // Molecular Cancer Therapeutics. - 2012. - Vol. 11. - № 3. - P. 582-593.

156. Chau C. H. Antibody-drug conjugates for cancer / C. H. Chau, P. S. Steeg, W. D. Figg // The Lancet. - 2019. - Vol. 394. - № 10200. - P. 793-804.

157. Strategies and challenges for the next generation of antibody-drug conjugates / A. Beck, L. Goetsch, C. Dumontet, N. Corvaia // Nature Reviews Drug Discovery. - 2017. - Vol. 16. - № 5. -P. 315-337.

158. Bystander effect of antibody-drug conjugates: fact or fiction? / F. Giugliano, C. Corti, P. Tarantino [et al.] // Current Oncology Reports. - 2022. - Vol. 24. - № 7. - P. 809-817.

159. Targeting HER2-Positive Breast Cancer with Trastuzumab-DM1, an Antibody-Cytotoxic Drug Conjugate / G. D. Lewis Phillips, G. Li, D. L. Dugger [et al.] // Cancer Research. - 2008. - Vol. 68. -№ 22. - P. 9280-9290.

160. Trastuzumab Emtansine for Residual Invasive HER2-Positive Breast Cancer / G. von Minckwitz, C.-S. Huang, M. S. Mano [et al.] // New England Journal of Medicine. - 2019. - Vol. 380. - № 7. -P. 617-628.

161. Yver A. The art of innovation: clinical development of trastuzumab deruxtecan and redefining how antibody-drug conjugates target HER2-positive cancers / A. Yver, T. Agatsuma, J.-C. Soria // Annals of Oncology. - 2020. - Vol. 31. - № 3. - P. 430-434.

162. Trastuzumab Deruxtecan in Previously Treated HER2-Positive Breast Cancer / S. Modi, C. Saura, T. Yamashita [et al.] // New England Journal of Medicine. - 2020. - Vol. 382. - № 7. - P. 610621.

163. Trastuzumab Deruxtecan in Previously Treated HER2-Low Advanced Breast Cancer / S. Modi, W. Jacot, T. Yamashita [et al.] // New England Journal of Medicine. - 2022. - Vol. 387. - № 1. - P. 920.

164. U3-1402, a Novel HER3-Targeting Antibody-Drug Conjugate, for the Treatment of Colorectal Cancer / S. Koganemaru, Y. Kuboki, Y. Koga [et al.] // Molecular Cancer Therapeutics. - 2019. -Vol. 18. - № 11. - P. 2043-2050.

165. EV20-mediated delivery of cytotoxic auristatin MMAF exhibits potent therapeutic efficacy in cutaneous melanoma / E. Capone, A. Lamolinara, D. D'Agostino [et al.] // Journal of Controlled Release. - 2018. - Vol. 277. - P. 48-56.

166. Pharmacological targeting of the pseudokinase Her3 / T. Xie, S. M. Lim, K. D. Westover [et al.] // Nature Chemical Biology. - 2014. - Vol. 10. - № 12. - P. 1006-1012.

167. Combinatorial surrobody libraries / L. Xu, H. Yee, C. Chan [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2008. - Vol. 105. - № 31. - P. 10756-10761.

168. ErbB3 Inhibitory Surrobodies Inhibit Tumor Cell Proliferation In Vitro and In Vivo / P. K. Foreman, M. Gore, P. A. Kobel [et al.] // Molecular Cancer Therapeutics. - 2012. - Vol. 11. - № 7. -P. 1411-1420.

169. Affibody molecules: Engineered proteins for therapeutic, diagnostic and biotechnological applications : Gothenburg Special Issue: Molecules of Life / J. Löfblom, J. Feldwisch, V. Tolmachev [et al.] // FEBS Letters. - 2010. - Vol. 584. - № 12. - P. 2670-2680.

170. Combining phage and staphylococcal surface display for generation of ErbB3-specific Affibody molecules / N. Kronqvist, M. Malm, L. Göstring [et al.] // Protein Engineering, Design and Selection. -2011. - Vol. 24. - № 4. - P. 385-396.

171. Cellular effects of HER3-specific Affibody molecules / L. Göstring, M. Malm, I. Hôidén-Guthenberg [et al.] // PLoS ONE. - 2012. - Vol. 7. - № 6. - P. e40023.

172. An Unfolded CH1 Domain Controls the Assembly and Secretion of IgG Antibodies / M. J. Feige, S. Groscurth, M. Marcinowski [et al.] // Molecular Cell. - 2009. - Vol. 34. - № 5. - P. 569-579.

173. Exploiting sequence and stability information for directing nanobody stability engineering / P. Kunz, T. Flock, N. Soler [et al.] // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. - 2017. -Vol. 1861. - № 9. - P. 2196-2205.

174. Vermeer A. W. P. The Thermal Stability of Immunoglobulin: Unfolding and Aggregation of a Multi-Domain Protein / A. W. P. Vermeer, W. Norde // Biophysical Journal. - 2000. - Vol. 78. - № 1.

- P. 394-404.

175. The structural basis of nanobody unfolding reversibility and thermoresistance / P. Kunz, K. Zinner, N. Mücke [et al.] // Scientific Reports. - 2018. - Vol. 8. - № 1. - P. 7934.

176. Comparative Analysis of Immune Repertoires between Bactrian Camel's Conventional and Heavy-Chain Antibodies / X. Li, X. Duan, K. Yang [et al.] // PLOS ONE. - 2016. - Vol. 11. - № 9. -P. e0161801.

177. Molecular basis for the preferential cleft recognition by dromedary heavy-chain antibodies / E. De Genst, K. Silence, K. Decanniere [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2006.

- Vol. 103. - № 12. - P. 4586-4591.

178. A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology / E. Pardon, T. Laeremans, S. Triest [et al.] // Nature Protocols. - 2014. - Vol. 9. - № 3. - P. 674-693.

179. Bélanger K. High-efficacy, high-manufacturability human VH domain antibody therapeutics from transgenic sources / K. Bélanger, J. Tanha // Protein Engineering, Design and Selection. - 2021. -Vol. 34. - P. gzab012.

180. Generation of heavy-chain-only antibodies in mice / R. Janssens, S. Dekker, R. W. Hendriks [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2006. - Vol. 103. - № 41. - P. 15130-15135.

181. Expression Cloning and Production of Human Heavy-Chain-Only Antibodies from Murine Transgenic Plasma Cells / D. Drabek, R. Janssens, E. de Boer [et al.] // Frontiers in Immunology. - 2016.

- Vol. 7. - P. 619.

182. NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies / S. Moutel, N. Bery, V. Bernard [et al.] // eLife. - 2016. - Vol. 5. - NaLi-H1. - P. e16228.

183. Hoogenboom H. R. Selecting and screening recombinant antibody libraries / H. R. Hoogenboom // Nature Biotechnology. - 2005. - Vol. 23. - № 9. - P. 1105-1116.

184. Selection of human antibody fragments by phage display / C. M. Y. Lee, N. Iorno, F. Sierro, D. Christ // Nature Protocols. - 2007. - Vol. 2. - № 11. - P. 3001-3008.

185. Ghadessy F. J. Directed evolution of polymerase function by compartmentalized self-replication / F. J. Ghadessy, J. L. Ong, P. Holliger // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2001. -Vol. 98. - № 8. - P. 4552-4557.

186. Rare, high-affinity anti-pathogen antibodies from human repertoires, discovered using microfluidics and molecular genomics / A. S. Adler, R. A. Mizrahi, M. J. Spindler [et al.] // mAbs. -2017. - Vol. 9. - № 8. - P. 1282-1296.

187. Liu Y. Expression of single-domain antibody in different systems / Y. Liu, H. Huang // Applied Microbiology and Biotechnology. - 2018. - Vol. 102. - № 2. - P. 539-551.

188. Large-scale production of VHH antibody fragments by Saccharomyces cerevisiae : Third International Symposium on Industrial Proteins / Y. E. Thomassen, W. Meijer, L. Sierkstra, C. T. Verrips // Enzyme and Microbial Technology. - 2002. - Vol. 30. - № 3. - P. 273-278.

189. A rice-based soluble form of a murine TNF-specific llama variable domain of heavy-chain antibody suppresses collagen-induced arthritis in mice / M. Abe, Y. Yuki, S. Kurokawa [et al.] // Journal of Biotechnology. - 2014. - Vol. 175. - P. 45-52.

190. Kipriyanov S. M. High level production of soluble single chain antibodies in small-scale Escherichia coli cultures / S. M. Kipriyanov, G. Moldenhauer, M. Little // Journal of Immunological Methods. - 1997. - Vol. 200. - № 1-2. - P. 69-77.

191. SHuffle, a novel Escherichia coli protein expression strain capable of correctly folding disulfide bonded proteins in its cytoplasm / J. Lobstein, C. A. Emrich, C. Jeans [et al.] // Microbial Cell Factories. - 2012. - Vol. 11. - № 1. - P. 753.

192. High-yield production of functional soluble single-domain antibodies in the cytoplasm of Escherichia coli / K. Zarschler, S. Witecy, F. Kapplusch [et al.] // Microbial Cell Factories. - 2013. -Vol. 12. - № 1. - P. 97.

193. Tillib S. V. Prospective Applications of Single-Domain Antibodies in Biomedicine / S. V. Tillib // Molecular Biology. - 2020. - Vol. 54. - № 3. - P. 317-326.

194. Nanobodies: A Review of Generation, Diagnostics and Therapeutics / B. Jin, S. Odongo, M. Radwanska, S. Magez // International Journal of Molecular Sciences. - 2023. - Vol. 24. - № 6. -P. 5994.

195. Orally delivered single-domain antibodies against gastrointestinal pathogens / M. Petersson, S. W. Thrane, L. Gram [et al.] // Trends in Biotechnology. - 2023. - epub ahead of print.

196. Rice-based oral antibody fragment prophylaxis and therapy against rotavirus infection / D. Tokuhara, B. plvarez, M. Mejima [et al.] // The Journal of Clinical Investigation. - 2013. - Vol. 123. -№ 9. - P. 3829-3838.

197. Nebulised ALX-0171 for respiratory syncytial virus lower respiratory tract infection in hospitalised children: a double-blind, randomised, placebo-controlled, phase 2b trial / S. Cunningham,

P. A. Piedra, F. Martinon-Torres [et al.] // The Lancet Respiratory Medicine. - 2021. - Vol. 9. - № 1. -P. 21-32.

198. Nanobodies from camelid mice and llamas neutralize SARS-CoV-2 variants / J. Xu, K. Xu, S. Jung [et al.] // Nature. - 2021. - Vol. 595. - № 7866. - P. 278-282.

199. Inhalable Nanobody (PiN-21) prevents and treats SARS-CoV-2 infections in Syrian hamsters at ultra-low doses / S. Nambulli, Y. Xiang, N. L. Tilston-Lunel [et al.] // Science Advances. - 2021. -Vol. 7. - № 22. - P. eabh0319.

200. In vivo and in vitro characterization of TEV protease mutants / L. Wei, X. Cai, Z. Qi [et al.] // Protein Expression and Purification. - 2012. - Vol. 83. - № 2. - P. 157-163.

201. Integration of PCR Fragments at Any Specific Site within Cloning Vectors without the Use of Restriction Enzymes and DNA Ligase / M. Geiser, R. Cebe, D. Drewello, R. Schmitz // BioTechniques.

- 2001. - Vol. 31. - № 1. - P. 88-92.

202. Inoue H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids / H. Inoue, H. Nojima, H. Okayama // Gene. - 1990. - Vol. 96. - № 1. - P. 23-28.

203. Biopython: freely available Python tools for computational molecular biology and bioinformatics / P. J. A. Cock, T. Antao, J. T. Chang [et al.] // Bioinformatics. - 2009. - Vol. 25. - № 11. - P. 14221423.

204. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools / H. Li, B. Handsaker, A. Wysoker [et al.] // Bioinformatics. - 2009. - Vol. 25. - № 16. - P. 2078-2079.

205. Martin M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads / M. Martin // EMBnet.journal. - 2011. - Vol. 17. - № 1. - P. 10-12.

206. Li H. Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences / H. Li // Bioinformatics. - 2018.

- Vol. 34. - № 18. - P. 3094-3100.

207. SSW Library: An SIMD Smith-Waterman C/C++ Library for Use in Genomic Applications / M. Zhao, W.-P. Lee, E. P. Garrison, G. T. Marth // PLOS ONE. - 2013. - Vol. 8. - № 12. - P. e82138.

208. Nossal N. G. The Release of Enzymes by Osmotic Shock from Escherichia coli in Exponential Phase / N. G. Nossal, L. A. Heppel // Journal of Biological Chemistry. - 1966. - Vol. 241. - № 13. -P. 3055-3062.

209. Accurate secondary structure prediction and fold recognition for circular dichroism spectroscopy / A. Micsonai, F. Wien, L. Kernya [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2015. - Vol. 112. - № 24. - P. E3095-E3103.

210. BeStSel: A web server for accurate protein secondary structure prediction and fold recognition from the circular dichroism spectra / A. Micsonai, F. Wien, E. Bulyaki [et al.] // Nucleic Acids Research.

- 2018. - Vol. 46. - № W1. - P. W315-W322.

211. Thannhauser T. W. Sensitive quantitative analysis of disulfide bonds in polypeptides and proteins / T. W. Thannhauser, Y. Konishi, H. A. Scheraga // Analytical Biochemistry. - 1984. - Vol. 138.

- № 1. - P. 181-188.

212. Using theoretical protein isotopic distributions to parse small-mass-difference post-translational modifications via mass spectrometry / T. W. Rhoads, J. R. Williams, N. I. Lopez [et al.] // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. - 2013. - Vol. 24. - № 1. - P. 115-124.

213. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold / J. Jumper, R. Evans, A. Pritzel [et al.] // Nature. - 2021. - Vol. 596. - № 7873. - P. 583-589.

214. Protein complex prediction with AlphaFold-Multimer / R. Evans, M. O'Neill, A. Pritzel, [et al.]. - bioRxiv, 2021.

215. ColabFold: making protein folding accessible to all / M. Mirdita, K. Schütze, Y. Moriwaki [et al.] // Nature Methods. - 2022. - Vol. 19. - № 6. - P. 679-682.

216. Goodsell D. S. Illustrate: Software for Biomolecular Illustration / D. S. Goodsell, L. Autin, A. J. Olson // Structure. - 2019. - Vol. 27. - № 11. - P. 1716-1720.e1.

217. Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors / Y. N. Abdiche, D. S. Malashock, A. Pinkerton, J. Pons // Analytical Biochemistry. - 2009. - Vol. 386. - № 2. - P. 172-180.

218. Wisdom G. B. Conjugation of antibodies to fluorescein or rhodamine. / G. B. Wisdom // Immunochemical Protocols. Methods in Molecular Biology Vol. 295 / ed. R. Burns. - Totowa, NJ : Humana Press, 2005. - P. 131-134.

219. Endocrine response phenotypes are altered by charcoal-stripped serum variability / M. J. Sikora, M. D. Johnson, A. V. Lee, S. Oesterreich // Endocrinology. - 2016. - Vol. 157. - № 10. - P. 3760-3766.

220. Potapov V. Examining Sources of Error in PCR by Single-Molecule Sequencing / V. Potapov, J. L. Ong // PLOS ONE. - 2017. - Vol. 12. - № 1. - P. e0169774.

221. Amplification of complex gene libraries by emulsion PCR / R. Williams, S. G. Peisajovich, O. J. Miller [et al.] // Nature Methods. - 2006. - Vol. 3. - № 7. - P. 545-550.

222. Functional interrogation and mining of natively paired human VH:VL antibody repertoires / B. Wang, B. J. DeKosky, M. R. Timm [et al.] // Nature Biotechnology. - 2018. - Vol. 36. - № 2. - P. 152155.

223. Liquid drop of DNA libraries reveals total genome information / S. S. Terekhov, I. E. Eliseev, L. A. Ovchinnikova [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2020. - Vol. 117. -№ 44. - P. 27300-27306.

224. Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: Enhanced expression and solubility with SUMO / J. G. Marblestone, S. C. Edavettal, Y. Lim [et al.] // Protein Science. - 2006. - Vol. 15. - № 1. - P. 182-189.

225. Targeting ErbB3 Receptor in Cancer with Inhibitory Antibodies from Llama / I. E. Eliseev, V. M. Ukrainskaya, A. N. Yudenko [et al.] // Biomedicines. - 2021. - Vol. 9. - № 9. - P. 1106.

226. Rusch S. L. Interactions That Drive Sec-Dependent Bacterial Protein Transport / S. L. Rusch, D. A. Kendall // Biochemistry. - 2007. - Vol. 46. - № 34. - P. 9665-9673.

227. Rashid M. H. Full-length recombinant antibodies from Escherichia coli: production, characterization, effector function (Fc) engineering, and clinical evaluation / M. H. Rashid // mAbs. -2022. - Vol. 14. - № 1. - P. 2111748.

228. Efficient expression of full-length antibodies in the cytoplasm of engineered bacteria / M.-P. Robinson, N. Ke, J. Lobstein [et al.] // Nature Communications. - 2015. - Vol. 6. - № 1. - P. 8072.

229. Greenfield N. J. Using circular dichroism spectra to estimate protein secondary structure / N. J. Greenfield // Nature Protocols. - 2006. - Vol. 1. - № 6. - P. 2876-2890.

230. Tetin S. Y. Accuracy of protein secondary structure determination from circular dichroism spectra based on immunoglobulin examples / S. Y. Tetin, F. G. Prendergast, S. Y. Venyaminov // Analytical Biochemistry. - 2003. - Vol. 321. - № 2. - P. 183-187.

231. Comparison of Ellman's reagent with N-(1-pyrenyl)maleimide for the determination of free sulfhydryl groups in reduced cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei / J. Woodward, J. Tate, Paul. C. Herrmann, B. R. Evans // Journal of Biochemical and Biophysical Methods. - 1993. - Vol. 26. - № 2.

- P. 121-129.

232. Riener C. K. Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4'-dithiodipyridine / C. K. Riener, G. Kada, H. J. Gruber // Analytical and Bioanalytical Chemistry. - 2002.

- Vol. 373. - № 4-5. - P. 266-276.

233. Doll S. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications / S. Doll, A. L. Burlingame // ACS Chemical Biology. - 2015. - Vol. 10. - № 1. - P. 6371.

234. Thermodynamic Analysis of the Conformational Stability of a Single-Domain Therapeutic Antibody / I. E. Eliseev, A. N. Yudenko, N. A. Besedina [et al.] // Technical Physics Letters. - 2017. -Vol. 43. - № 12. - P. 1088-1091.

235. ProThermDB: thermodynamic database for proteins and mutants revisited after 15 years / R. Nikam, A. Kulandaisamy, K. Harini [et al.] // Nucleic Acids Research. - 2021. - Vol. 49. - № D1. -P. D420-D424.

236. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution / P. D. Adams, P. V. Afonine, G. Bunkoczi [et al.] // Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. - 2010. - Vol. 66. - № 2. - P. 213-221.

237. Bunkoczi G. Improvement of molecular-replacement models with Sculptor / G. Bunkoczi, R. J. Read // Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. - 2011. - Vol. 67. - № 4. -P. 303-312.

238. Phaser crystallographic software / A. J. McCoy, R. W. Grosse-Kunstleve, P. D. Adams [et al.] // Journal of Applied Crystallography. - 2007. - Vol. 40. - № 4. - P. 658-674.

239. Structural evaluation of a nanobody targeting complement receptor Vsig4 and its cross reactivity / Y. Wen, Z. Ouyang, S. Schoonooghe [et al.] // Immunobiology. - 2017. - Vol. 222. - № 6. - P. 807813.

240. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard / T. C. Terwilliger, R. W. Grosse-Kunstleve, P. V. Afonine [et al.] // Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. - 2008. - Vol. 64. - № 1. - P. 61-69.

241. Features and development of Coot / P. Emsley, B. Lohkamp, W. G. Scott, K. Cowtan // Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. - 2010. - Vol. 66. - № 4. - P. 486-501.

242. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine / P. V. Afonine, R. W. Grosse-Kunstleve, N. Echols [et al.] // Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography.

- 2012. - Vol. 68. - № 4. - P. 352-367.

243. Crystal structures of a llama VHH antibody BCD090-M2 targeting human ErbB3 receptor / I. E. Eliseev, A. N. Yudenko, V. V. Vysochinskaya [et al.] // F1000Research. - 2018. - Vol. 7. - P. 57.

244. Al-Lazikani B. Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins11Edited by I. A. Wilson / B. Al-Lazikani, A. M. Lesk, C. Chothia // Journal of Molecular Biology. - 1997. - Vol. 273. - № 4. - P. 927-948.

245. PyIgClassify: a database of antibody CDR structural classifications / J. Adolf-Bryfogle, Q. Xu, B. North [et al.] // Nucleic Acids Research. - 2015. - Vol. 43. - № D1. - P. D432-D438.

246. Cadmium SAD phasing at CuKa wavelength / I. E. Eliseev, A. N. Yudenko, V. M. Ukrainskaya, O. B. Chakchir // F1000Research. - 2019. - Vol. 8. - P. 84.

247. Cadmium-induced crystallization of proteins: II. Crystallization of the Salmonella typhimuri histidine-binding protein in complex with L-histidine, L-arginine, or L-lysine / G. F.-L. Ames, D. I. Kreimer, S. Trakhanov [et al.] // Protein Science. - 1998. - Vol. 7. - № 3. - P. 600-604.

248. Harnessing protein folding neural networks for peptide-protein docking / T. Tsaban, J. K. Varga, O. Avraham [et al.] // Nature Communications. - 2022. - Vol. 13. - № 1. - P. 176.

249. Benchmarking AlphaFold for protein complex modeling reveals accuracy determinants / R. Yin, B. Y. Feng, A. Varshney, B. G. Pierce // Protein Science. - 2022. - Vol. 31. - № 8. - P. e4379.

250. Holliday D. L. Choosing the right cell line for breast cancer research / D. L. Holliday, V. Speirs // Breast Cancer Research. - 2011. - Vol. 13. - № 4. - P. 215.

251. A single-cell analysis of breast cancer cell lines to study tumour heterogeneity and drug response / G. Gambardella, G. Viscido, B. Tumaini [et al.] // Nature Communications. - 2022. - Vol. 13. - № 1.

- P. 1714.

252. Berthois Y. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: Implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture / Y. Berthois, J. A. Katzenellenbogen, B. S. Katzenellenbogen // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.

- 1986. - Vol. 83. - № 8. - P. 2496-2500.

253. Trastuzumab-Resistant Breast Cancer Cells Remain Sensitive to the Auger Electron-Emitting Radiotherapeutic Agent 111 In-NLS-Trastuzumab and Are Radiosensitized by Methotrexate / D. L. Costantini, K. Bateman, K. McLarty [et al.] // Journal of Nuclear Medicine. - 2008. - Vol. 49. - № 9. -P. 1498-1505.

254. Patent US10808032B2. Biological materials related to HER3 / C. Knuehl, B. Hock, R. Hofmeister, [et al.]. - 2020.

255. HER3 specific biodistribution and tumor uptake of 89Zr-MSB0010853 visualized by real-time and non-invasive PET imaging / F.-J. Warnders, A. G. T. van Scheltinga, C. Knuehl [et al.] // Journal of Nuclear Medicine. - 2017.

256. Inhibition of triple-negative breast cancer models by combinations of antibodies to EGFR / D. A. Ferraro, N. Gaborit, R. Maron [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2013. - Vol. 110. - № 5. - P. 1815-1820.

257. Persistent elimination of ErbB-2/HER2-overexpressing tumors using combinations of monoclonal antibodies: Relevance of receptor endocytosis / T. Ben-Kasus, B. Schechter, S. Lavi [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2009. - Vol. 106. - № 9. - P. 3294-3299.

258. Examination of HER3 targeting in cancer using monoclonal antibodies / N. Gaborit, A. Abdul-Haia, M. Mancini [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2015. - Vol. 112. - № 3. - P. 839-844.

259. Patritumab deruxtecan (HER3-DXd), a novel HER3 directed antibody drug conjugate, exhibits in vitro activity against breast cancer cells expressing HER3 mutations with and without HER2 overexpression / K. Koyama, H. Ishikawa, M. Abe [et al.] // PLOS ONE. - 2022. - Vol. 17. - № 5. -P. e0267027.

260. HERTHENA-Lung01: a phase II study of patritumab deruxtecan (HER3-DXd) in previously treated metastatic EGFR-mutated NSCLC / H. A. Yu, J. C.-H. Yang, H. Hayashi [et al.] // Future Oncology. - 2023.

261. Van Hoecke L. How mRNA therapeutics are entering the monoclonal antibody field / L. Van Hoecke, K. Roose // Journal of Translational Medicine. - 2019. - Vol. 17. - № 1. - P. 54.

БЛАГОДАРНОСТИ

Данная работа была поддержана грантом Минобрнауки РФ RFMEFI57716X0217 «Разработка новых терапевтических VHH-антител к рецептору HER3» (2016-2019 г.), стипендией Президента РФ для молодых ученых (2021-2022 г.) и софинансирована ЗАО «Биокад». Благодарю Научный парк СПбГУ за помощь в организации экспериментов по масс-спектрометрии, SPC Facility EMBL Hamburg за организацию экспериментов по скринингу условий кристаллизации и ЦКП «Геномика» СО РАН за проведение экспериментов по NGS секвенированию.

Я благодарен всем коллегам и соавторам из компании «Биокад», которые вовлекли меня в исследования антител лам: А. И. Афремовой, А. В. Евстратьевой, М. С. Дрожжачих, Е. А. Кренделевой, А. К. Владимировой, Т. А. Неманкину, В. М. Екимовой, М. И. Ломовской, С. Р. Евдокимову, Ю. В Путинцевой, А. Б. Улитину, П. А. Яковлеву и Р. А. Иванову. Благодарю

A. Г. Габибова и коллег из ИБХ РАН, В. М. Украинскую, А. В. Степанова, А. Э. Мамедова, Я. А. Ломакина, Л. А. Овчинникову, Ю. А. Мокрушину, С. С. Терехова, А. А. Белогурова и И. С. Смирнова, у которых мне посчастливилось научиться многим аспектам практической молекулярной иммунологии. Первому опыту макромолекулярной кристаллографии я обязан

B. Ламзину и Й. Каллио из EMBL Hamburg и А. Г. Габдулхакову, А. Д. Никулину и М. Б. Гарбер из Института белка РАН. Благодарю за помощь и поддержку моих коллег и соавторов,

A. Н. Юденко, И. Н. Тертерова, Н. А. Беседину, А. А. Свирину, С. В. Шмакова, А. С. Букатина,

B. В. Высочинскую, Н. А. Князева и Ф. В. Моисеенко, вместе с которыми мне довелось развивать биологическое направление исследований в лаборатории М. В. Дубины в Алферовском университете. Благодарю моих бывших и нынешних студентов, общение с которыми всегда было стимулирующим: Н. П. Родину, А. А. Сахарова, Г. А. Лелейтнера, А. М. Лисаченко, И. С. Воропаева, Я. Г. Каюмова, А. А. Вронскую, Р. В. Сметанина, А. И. Калганову и А. Д. Микушину.

Я искренне благодарю профессора Ольгу Валерьевну Шамову, без которой данная работа была бы невозможной, за наставничество и поддержку.

Спасибо моим родителям за терпение и моей жене за то, что она не раз прочитала этот текст и помогла сделать его немного более понятным.

Май 2023 года Чешме