Получение и биофизическое исследование меченных стабильными изотопами метаболитов и мембранных белков: методологии и перспективы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, доктор химических наук Егорова, Татьяна Анатольевна

• Егорова, Татьяна Анатольевна
• доктор химических наук
• 2011

Оглавление диссертации доктор химических наук Егорова, Татьяна Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОТ ИСТОЧНИКА К ЦЕЛЕВОМУ ПРОДУКТУ:

ПОТЕНЦИАЛ ПРИРОДНОГО РАЗНООБРАЗИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕЧЕНИЯ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ 13С,

1.1 Потенциал меченных стабильными изотопами, биологически активных соединений.

1.2 Водоросли для битехнологии: от вида к продукту.

1.3 Археи и бактерии.

1.4 Дрожжевые экстракты как компоненты питательных сред.

1.5 Мониторинг состава биомасс из различных источников методом ИК.

ГЛАВА 2. МЕЧЕННЫЕ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ АМИНОКИСЛОТЫ И ПЕПТИДЫ ДЛЯ ПРОТЕОМИКИ И СТРУКТУРНОЙ БИОЛОГИИ

2.1 Меченные стабильными изотопами аминокислоты.

2.2 Меченные стабильными изотопами пептаиболы.

ГЛАВА 3. МЕЧЕННЫЕ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ

НАСЕКОМЫХ И МЛЕКОПИТАЮЩИХ. ПОЛУЧЕНИЕ БЕЛКОВ-МИШЕНЕЙ

3.1 Меченные стабильными изотопами клеточные линии млекопитающих.

3.2 Меченные стабильными изотопами клеточные линии насекомых.

ГЛАВА 4. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕМБРАННЫХ КОМПЛЕКСОВ: СТРАТЕГИИ ТОТАЛЬНОГО МЕЧЕНИЯ ' СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ

4.1 Характеристика [и-|3С,15М] пигментов: химические сдвиги 13С, 15Ы в растворе и твёрдом теле.

4.2 [и-13С,,5М] лиганд в мембранном белковом комплексе: лиганд-белковые взаимодействия.

4.2.1 Фотосинтетические РЦ с [и~13С]РЬео а.

4.2.2 Фотосинтетические РЦ с [и-13С,15М]ВРЬео а.

4.2.3 Фотосинтетические СК2 с [и-13С,15М] ВСЫ а В800 и [и-13С,15Ы] СК2. Электронная структура кофакторов, кофактор-кофакторные и кофактор-белковые взаимодействия.

4.3 Тотально меченный стабильными изотопами мембранный белковый комплекс.

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и биофизическое исследование меченных стабильными изотопами метаболитов и мембранных белков: методологии и перспективы»

Актуальность темы. В настоящее время возрастает необходимость ускорения и повышения эффективности процесса разработки новых лекарственных препаратов для борьбы с существующими, вновь рецидивирующими и возникающими заболеваниями. Наряду с этим растёт потребность в разработке новых профилактических фармакологических и диетических подходов и связанных с ними чувствительных тестов для ранней диагностики в целях предотвращения заболеваний. Для осуществления выпуска новых препаратов фармацевтические фирмы стремятся использовать более быстрые и эффективные методы их разработки и для обеспечения 4-8% годового роста продаж увеличить разработку лекарств, в среднем, от 1-1.5 до 3-5 в год. В связи с этим расширяются программы по разработке новых лекарств, которые включают высокоэффективный скрининг сотен тысяч потенциальных соединений в качестве их кандидатов, и важную роль приобретают подходы, основанные на знании структуры мишени, на которую направлены действия лекарств. Детальное определение трёхмерной структуры мишени, как полагают, сможет служить основой для моделирования in silico, докинга, виртуального скрининга и дальнейшего конструирования фармакологически подходящих соединений с определённой заданной или даже новой физиологической активностью.

Имеющиеся на сегодняшний день на рынке лекарства действуют на 500 мишеней, из которых более, чем 90% составляют белки. Причём более половины имеющихся на рынке лекарств действуют на мишени, представляющие собой мембранные белки класса G-белок сопряженных рецепторов (GPCR1). В то время, когда на сегодняшний день согласно базе белковых структур PDB, трёхмерное строение более, чем 10,000 водорастворимых белков известно и определено такими классическими методами как кристаллография и ЯМР с разрешением выше чем 3 Á, пространственное строение установлено лишь для нескольких белков класса GPCR: родопсина в 2000 г., 02 и Pj адренорецепторов в 2007 и 2008 г., аденозинового рецептора А?л в 2008 г, хемокинового CXCR4 и дофаминового D3 в 2010 г.

В случае белков, кристаллы которых получить сложно, Ядерный Магнитный Резонанс (ЯМР) твёрдого тела является практически единственным возможным способом исследования. Преимуществом ЯМР является также возможность изучения белков в физиологическом окружении. Структурно-функциональный анализ с помощью ЯМР позволяет получить детальную информацию о трёхмерной структуре связанного с рецептором лиганда, о его участке связывания, о взаимодействии рецептор-лиганд, в том

1 Список сокращений приведён на стр. 265 числе, Н-связывании, я-взаимодействии, электростатических эффектах и перераспределении зарядов. Для этих исследований требуются миллиграммовые

1"Я количества высокоочищенных белков, меченных стабильными изотопами, такими как С, 15Ы или их комбинации. Белки могут быть получены экспрессией соответствующей копийной ДНК в выбранной клетке-хозяине.

В настоящей работе разрабатывались методологические подходы, связанные с созданием эффективных методов тотального мечения биомолекул стабильными изотопами, [и-БГЦ, а также структурно-функциональными исследованиями мембранных белков методами ЯМР и Фурье-ИК. Особое внимание уделено методам [Ц-БГЦ, позволяющим получить структурную информацию с помощью лишь одного образца.

Цель и задачи исследования заключались в разработке мультидисциплинарного подхода и развитии ряда технологий для структурно-функциональных исследований мембранных белковых комплексов методами [и-БГЬ] и последующего вклада в рациональное конструирование лекарственных препаратов. Особое внимание уделялось доступности [и-ЭГЬ] лигандов и [Ц-ЭЛ,] мембранных комплексов при эффективном использовании метаболических предшественников, полученных на базе меченных стабильными изотопами 13с, 15ы, 2Н различных природных источников (бактерии, дрожжи, грибы, водоросли, растения, клеточные линии насекомых и млекопитающих). В ходе исследования были поставлены задачи:

1. Разработать методы эффективного введения стабильной изотопной метки в различные прокариотические и эукариотические источники для последующего выделения целевых2 продуктов. При этом исследовать влияние комбинации выбора природного источника, методов и условий культивирования на выход целевого продукта.

2. Разработать ряд аналитических методов для контроля воспроизводимости получения биомасс, определения их химического состава и степени включения изотопной метки.

3. Решить проблему доступности меченых соединений при их получении в клеточных линиях эукариот. В связи с этим разработать питательные среды для эффективного [и-БШ] клеточных линий насекомых и млекопитающих. Исследовать биотехнологический потенциал дрожжевых экстрактов как компонентов питательных сред.

2Целевым продуктом являются низкомолекулярные и высокомолекулярные соединения, такие как пигменты, липиды, жирные кислоты, стерины, углеводы, аминокислоты, пептиды, мембранные белки, а также различные экстракты, полученные из клеточных биомасс и приготовленные согласно разработанным протоколам с учетом условий их дальнейшего применения.

4. Выбрать фармацевтически важный белок-мишень, получить его в [U-SIL] виде с использованием специально разработанных питательных сред, тем самым продемонстрировать возможность получения [U-SIL] сложных белков-мишеней для получения структурной информации.

5. Исследовать возможности стратегии [U-SIL] и показать её преимущества для дальнейшего применения в метаболомике, протеомике и структурной биологии с помощью методов MAS ЯМР, ИК и МС. Для этого выбрать объекты и изучить как [U-SIL] лиганд в мембранно-белковом комплексе, так и [U-SIL] белковый комплекс в целом.

Научная новизна заключается в разработке на основе [U-SIL] и биофизических методов исследования ряда методологий' для рациональной разработки лекарственных препаратов и для ранней диагностики. В европейском патенте 2003 г, заявленном в Европе, Российской Федерации, Японии, Канаде, США, Австралии и выданном в 2010 г в Австралии и в 2011 г в РФ, отражены композиции и методы мечения молекул стабильными изотопами. Разработаны приёмы эффективного [U-SIL] в клеточных линиях млекопитающих и насекомых.

Замена в синтетических питательных средах для клеточных линий насекомых и млекопитающих дорогостоящих меченных стабильными изотопами индивидуальных аминокислот, органических кислот и других компонентов экстрактами биомасс из различных источников позволяет уменьшить стоимость питательных сред, по крайней мере, в пять раз с учётом лишь стоимости аминокислот. Впервые было продемонстрировано рекомбинантное получение [U-SEL] фармакологически важного рецептора класса GPCR - гистаминового рецептора человека H1R в клеточной линии насекомых sf9 на основе разработанных питательных сред. Таким образом, открыты новые возможности для получения фармацевтически важных белков-мишеней с сохранённой биологической активностью в количествах, достаточных для структурных исследований с помощью ЯМР и получения информации для дальнейшего моделирования ш silico при разработке лекарств, связанных с действием рецептора.

Эффективное биосинтетическое мечение стабильными изотопами позволяет снизить стоимость целевого продукта по сравнению со стандартными методами, тем самым обеспечивает доступность [U-SIL] биомолекул для широкого спектра исследований. Разработанные подходы включают рациональную конверсию метаболического предшественника в целевой продукт, многократное использование культуральной жидкости, создание установок по типу закрытых циркуляционных систем, контроль качества биомасс и степени обогащения. Доступность биомасс с высокой степенью обогащения позволила выделить различные меченные стабильными изотопами соединения, такие как аминокислоты, пептиды, липиды, мембранные белки, а также получить различные экстракты биомасс. Разработанные с помощью ИК и МС аналитические методы мониторинга роста, химического состава, оценки воспроизводимости партий биомасс, степени их изотопного обогащения позволяют изучать их химический* состав, получать характеристики различных штаммов, проводить метаболическое профилирование. Это представляет собой отдельный интерес для протеомики и метаболомики в плане разработки продуктов для ранней диагностики в целях создания индивидуальных диетических программ и изучения их влияния на здоровье человека.

Практическая значимость. Показано, что специализированные [Ц-БТЬ] образцы способствуют развитию методов ЯМР, позволяют проводить эксперименты на одном образце и сократить расходы, связанные с получением целого ряда специфически меченых образцов, с использованием оборудования и с затратой времени для исследований. Возможности стратегии [И-БШ] и ЯМР твёрдого тела продемонстрированы на примере фотосинтетических объектов. При этом была охарактеризована на атомном уровне роль кофакторов фотосинтетических белков в рамках изучения первичного процесса фотосинтеза. В ходе работы выполнены задачи разработки методологии для получения информации с помощью [Ц-БП,] и ЯМР твёрдого тела. Доставка [и-БГЬ] образцов в различные научные и коммерческие организации послужила дальнейшему развитию ЯМР технологий (новые импульсные последовательности, подходы для расшифровки сложных спектров, тестирования чувствительности и разрешающей способности высоких магнитных полей), ИК, МС, а также применению стратегий [и-БЩ] для биофизических и метаболических исследований. Фотосинтетические белки РЦ, СК2, СК1-РЦ использовали в Лейденском Университете и Университете г. Бохума для исследований методами ЯМР, Фурье-ИК и атомно-силовой спектроскопии.

Специализированные образцы были поставлены в Швейцарский федеральный институт технологии, Цюрих; Университет г. Бохум, Германия; Университет г. Ахус, Дания; Университет в Ноттингеме, Великобритания; Вайцмановский институт науки, Израиль; Макс Планк Институт, Франкфурт, Германия; Университет г. Страсбург, Франция, Университет г. Лиеж, Бельгия, Лейденский Институт Химии, Наймегенский центр молекулярных наук о жизни, Университет Вагенинга и Лейден-Амстердам центр по исследованию лекарств, Нидерланды, Институт органической химии РАН им. Н.Д. Зелинского, Россия. Таким образом, новые методологии нашли применение для биомедицинских, метаболических, экологических, бионанотехнологических и фундаментальных исследований.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработка метода получения меченных стабильными изотопами аминокислот из гидролизатов биомасс различных источников; получение меченных стабильными изотопами фармацевтически важных пептидов на примере зервамицинов, изучение влияния условий культивирования на биосинтез пептаиболов, их исследование методом масс спектрометрии.

2. Методология [U-SIL] в клеточных линиях млекопитающих и насекомых и получение белка-мишени на примере гистаминового рецептора H1R человека.

3. Получение и биофизическое изучение с помощью методов ЯМР в растворе и в твёрдом теле [U-13C, 15N] пигментов, таких как: хлорофилл (Chi) а, феофитин (Pheo) а; бактериохлорофилл (BChl) а, бактериофеофитин (BPheo) а.

4. Разработка рациональной и эффективной методологии получения структурной информации о лиганде в мембранно-белковом комплексе, о лиганд-белковом и лиганд-лигандном взаимодействии путём изучения электронной структуры, поляризации, протонирования. На примере бактериальных фотосинтетических мембранных комплексов, таких, как реакционные центры (РЦ) и светособирающий комплекс 2 (СК2) исследованы возможности: А) Методов [U-SIL] и двумерной (2D) корреляционной ЯМР для характеристики атомной структуры лиганда в мембранном белковом комплексе; Б) Фурье-ИК для изучения [U-SIL] лиганда в мембранном белковом комплексе, определения степени замещения лиганда в белковом комплексе и его взаимодействия с белковым окружением. Для этого разработаны условия фотонакопления НА~ в РЦ; В) Изучения кофактор-кофакторного взаимодействия в СК2.

5. Разработка эффективной методологии получения информации о структуре целого мембранно-белкового комплекса с помощью [U-S1L] и 2D корреляционной ЯМР.

Личный вклад автора в диссертацию. Автором чётко выявлялась проблематика по вопросу, изучалась литература, определялись цели и задачи исследования, выбор пути их реализации, новизна, осуществлялось выполнение и анализ экспериментов, обсуждение результатов, их интерпретация и обобщение, формулирование основных положений и выводов.

Апробация работы. Материалы работы были доложены в ряде институтов и университетов, на 38 международных конференциях, съездах и конгрессах: по стабильным изотопам: "2-я всемирная конференция по стабильным изотопам в питании и метаболических исследованиях", Роттердам, (Нидерланды, 1994); "14-й Американский пептидный Симпозиум", Колумбус, (США, 1995); "5-й Неапольский симпозиум по биологически активным пептидам", Капри, (Италия, 1996); "Конференция, посвященная 100 летию со дня рождения Преображенского", Москва, (Россия, 1996); "11-й международный симпозиум по каротиноидам", Лейден, (Нидерланды, 1996); "Х1-й международный конгрессе по фотосинтезу", Будапешт, (Венгрия; 1998); "5-я Европейская конференции по биотехнологии водорослей", Потсдам, (Германия, 2003); "Симпозиум по Hansenula polymorpha", Алгеро, (Италия, 2004); "10-я международная конференция по прикладной фикологии", Кунминг, (Китай, 2005); "11-й интернациональный конгресс Фитофарм", Лейден, (Нидерланды, 2007); EUROMAR 2008, Санкт Петербург, (Россия, 2008); по мембранным белкам: "7-я международная конференция по ретинальным белкам", Зихрон Яков, (Израиль, 1996); "Интернациональная конференция по мембранным белкам", Амстердам, (Нидерланды, 2000); "8-я международная конференция по кристаллизации биологических макромолекул", Сандестин, Флорида, (США, 2000); "Европейский колледж: Как получить белок?" Гронинген, (Нидерланды, 2003); "14-й Камерино-Нордвикерхаут симпозиум по прогрессу в области химии рецепторов", Камерино, (Италия, 2003); "Международная конференция Биобизнес Азия", (Тайвань,

2005); "Нидерландский инновативный семинар", Пекин, Шанхай (Китай, 2005); семинар о технологиях PLI в Биосаенс парке Кэмбриджа, (Великобритания, 2005), "Международная конференция БиоАзия 2006", Хайдарабад, (Индия, 2006) и "БиоБангалор 2006", (Индия,

2006), "XVIII Менделеевский конгресс по прикладной и общей химии", Москва, (Россия,

2007); по спектороскопнческим методам: 39-я, 40-я и 41-я конференция по экспериментальной ЯМР, Азиломар, Калифорния, (США, 1998, 1999, 2000); "3-я Европейская конференция по ЯМР биомолекул, меченных стабильными изотопами", Оксфорд, (Великобритания, 1998); симпозиум "Перенос энергии в биологических системах", Оеирас, (Португалия, 1998); "3-й международный симпозиум по инфракрасной и рамановской спектроскопии", Вена, (Австрия, 1998); Лаборатория физической химии, Швейцарский Федеральный Институт Технологии, Цюрих, (Швейцария, 1999); Институт Ботаники Университета Мюнхен, (Германия, 1999); "Альпийская конференция по ЯМР твёрдого тела", Шамони МонБлан, (Франция, 1999); Симпозиум по внутреннему и внешнему переносу электрона, Вилдбад Креут, (Германия, 2000); международный симпозиум "Будущее ЯМР твёрдого тела в биологии", Лейден, (Нидерланды, 2000); Центр Томографии и Спектроскопии Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова, Москва, (Россия, 2007), "EUROMAR 2008", Санкт Петербург, (Россия). Новые технологии по [U-SIL] и биофизическим исследованиям структуры и функций биомолекул были представлены на научном семинаре фирм Солвей Фармацевтикалз,

Вейсп, (Нидерланды, 2004), ГлаксоСмисКляйн, Стивенэдж, (Великобритания, 2005) и на телеконференции Эли Лилли, (США, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 23 научные статьи, свыше 40 тезисов научных докладов, 2 публикации в книгах, Европейский патент, заявленный в РФ, США, Европе, Австралии, Канаде, Японии и выданный в 2010 г в Австралии и в 2011 г в РФ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 275 страницах, содержит 25 таблиц, 77 рисунков, включает введение, 4 главы - От источника к целевому продукту: потенциал природного разнообразия и эффективность мечения стабильными изотопами (1); Меченные стабильными изотопами аминокислоты и пептиды (2); Меченные стабильными изотопами клеточные линии насекомых и млекопитающих и белки-мишени (3); Структурно-функциональные исследования мембранных комплексов: стратегии тотального мечения стабильными изотопами (4); Выводы. В каждой из глав представлен обзор литературы, включающий новейшие данные, с общим библиографическим списком свыше 500 наименований. Работа выполнена при поддержке грантов нидерландской организацией по научным исследованиям (NWO), европейского научного общества (ESF), проекта ZonMW 014-81-133 Т.А. Егоровой по программе по стимулированию инновационного исследования медицинских препаратов и предпринимательства в Нидерландах, компании PLI, Лейден, и явилась частью демонстрационного проекта В104-СТ97-2101 комиссии Европейских обществ.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Егорова, Татьяна Анатольевна

Выводы

Нами изучалась эффективность использования SIL субстратов при получении SIL биомассы фототрофных водорослей. При этом использовали как оборудование лабораторного типа для получения, например, Galderia, Cyanidium, Scenedesmus, так и биореактор для получения Phaeodactylum. Особое внимание уделялось исследованию эффективных путей получения биомассы фототрофных организмов в биореакторе. В основе процесса лежит фотобиореактор с рециркуляцией газа при низком давлении. Получены [U-13C], [U-15N] и [U-I3C,15N] биомассы. Для получения U-13С биомассы, в качестве источника углерода использовали 13СОг. Для [U-15N] биомассы использовали Na15N03 в качестве источника азота. Реактор функционировал в полунепрерывном режиме с производительностью 0.3 г/л биомассы в день. Для повышения эффективности использования SIL субстратов осуществляли реутилизацию неорганического углерода из супернатанта с помощью подкисления/десорбции, 15ЫОз" использовали в минимальных концентрациях. По данным элементного анализа, конверсия СОг в биомассу составила 89.2%, а его количество в супернатанте составило 6.9%. Что касается 15N, то его конверсия в биомассу составила 97.8%, его содержание в супернатанте составило 1.3%. Эффективность введения изотопной метки определяли методами GC-MS, LC-MS/MS, PIK, при этом наблюдалось хорошее соответствие. Определили, что степень обогащения жирных кислот в Р. tricornntum достигает 96%-99%, а эффективность 15N мечения белков в G. sulfuraria составляет 99%. Таким образом, получили более 160 г SIL биомассы. Биореактор может быть использован для SIL различных фототрофных организмов.

Разработанные процессы позволяют получать [U-SIL] биомассы различных фототрофных организмов и использовать их, как для получения экстрактов и гидролизатов, так и для выделения индивидуальных соединений. Примеры включают выделение аминокислот для протеомики и структурной биологии (глава 2), получение экстрактов для составления питательных сред для клеточных линий насекомых и млекопитающих (глава 3), получения хлорофилла и феофитина для изучения лиганд-белковых взаимодействий в фотосинтезе (глава 4). Таким образом, нами учитывалась взаимосвязь между выбором вида водоросли, влиянием условий культивирования на выход целевого продукта, а также эффективность конверсии меченных стабильными изотопами предшественников. Всё большую актуальность приобретают [U-SIL] соединения из водорослей в качестве стандартов для исследований, как в экологии, так и в диагностике. Помимо этого, разработка методов эффективного [U-SIL] является весьма актуальной в связи с прогнозируемым увеличением количества лекарств на основе водорослей.

Список литературы диссертационного исследования доктор химических наук Егорова, Татьяна Анатольевна, 2011 год

1. Spolaore P., Joannis-Cassan С., Duran Е., Isambert A. Commercial applications of microalgae. //J. Biosci. Bioeng. -2006.- 101(2), 87-96.

2. Jensen G.S., Ginsberg D.I., Drapeau M.S. Blue-green algae as an immuno-enhancer and biomodulator. //J. Am. Nutraceut. Assn. -2001,- 3, 24-30.

3. Borowitzka M.A., Commercial production of microalgae: ponds, tanks, tubes and fermenters. //J. Biotechnol. -1999.- 70. 313-321.

4. Morweiser Mi, Kruse O., Hankamer В., Posten C. Developments and perspectives of photobioreactors for biofuel production. //Appl. Microbiol. Biotechnol. -2010.- 87(4), 1291-301.

5. Raja R., Hemaiswarya S., Kumar.N.A., Sridhar S., Rengasamy R. A perspective on the biotcchnological potential of microalgae. //Crit .Rev. Microbiol. -2008.-34(2), 77-88.

6. Stephens E., Ross I.L., Mussgnug J.H., Wagner L.D., Borowitzka M.A., Posten C., Kruse O., Hankamer B. Future prospects of microalgal biofuel production systems. //Trends Plant Sci. -2010.-15(10), 554-64.

7. Pulz O., Gross W. Valuable products from biotechnology of microalgae. //Appl. Microbiol. Biotechnol. -2004,- 65, 635-648.

8. Cohen Z. Chemicals from microalgae. //Talor & Francias LTD. -1999.9. Becker W. Microalgae in human and animal nutrition. In Richmonds A. (Ed). Handbook of microalgal culture. Blackwell Oxford. -2004.- 312-351. 1

9. Borowizka M.A. Microalgae as sources of pharmaceuticals and other biologically active compounds. // J. Appli. Phycol. -1988.- 7, 3-15.

10. Chisti Y. Biodiezel from microalgae. //Biotechnol. Adv. -2007.- 25, 294-306.

11. Stolz P., Obermayer B. Manufacturing microlagae for skin care. //Cosmetics Toiletries. -2005.- 120, 99-106.

12. Sun S.S. Application of agricultural biotechnology to improve food nutrition and healthcare products. //Asia Рас. J. Clin. Nutr. -2008.- 17(1), 87-90.

13. Blunt J.W., Copp B.R., Hu W.P., Munro M.H., Northcote P.T., Prinsep M.R. Marine natural products. //Nat. Prod. Rep. -2011,- 28(2), 196-268.

14. Meireles L.A., Guedes A.C., Malcata F.X. Lipid class composition of the microalga Pavlova lutheri: eicosapcntaenoic and docosahexaenoic acids. //J. Agric. Food Chem. -2003.- 51(8), 2237-41.

15. Wen Z.Y., Chen F. Geterotrophic production of eicosapentaenoic acid by microalgae. //Biotechnol. Adv. -2003.- 3 (4), 273-94.

16. Harwood J.L., Guschina I. A. The versatility of algae and their lipid metabolism. //Biochimie. -2009.-91(6), 679-84.

17. Singh S., Kate B.N., Baneqee U.C. Bioactive compounds from cyanobacteria and microalgae: an overview. //Crit. Rev. Biotechnol. -2005.- 25(3), 73-95.

18. Bhosale P. Environmental and cultural stimulants in the production of carotenoids from microorganisms. //Appl. Microbiol. Biotechnol. -2004.- 63(4), 351-61.

19. Del Campo J.A., García-González M., Guerrero M.G. Outdoor cultivation of microalgae for carotenoid production: current state and perspectives. //Appl. Microbiol. Biotechnol. -2007.- 74(6), 1163-74.

20. Volkman J.K. Sterols in microorganisms. //Appl. Microbiol. Biotechnol. -2003.- 60(5), 495-506.

21. Kaku K., Hiraga Y. Sterol composition of a cultured marine dinoflagellate, Hctcrocapsa circularisquama. //Nat. Prod. Res. -2003.- 17(4), 263-267.

22. CarbaJlo-Cárdcnas E.C, Tuan P.M., Janssen M., Wijffels R.H. Vitamin E (alpha-tocopherol) production by the marine microalgae Dunaliella tertiolecta and Tetraselmis suecica in batch cultivation. // Biomol Eng. -2003.- 20(4-6), 139-47.

23. Borowitzka M.A., Vitamins and fine chemicals from microalgae. In Borowitzka, M.A., Borowitzka, L.J. Micro-algal biotechnology. //Cambridge University Press. Cambridge. -1988.-153, 196.

24. Stabler S.P., Allen R'.H. Vitamin B12 deficiency as a worldwide problem. //Annu. Rev. Nutr. -2004.24, 299-326.

25. Bilan M.I, Usov A.I. Polysaccharides of calcareous algae and their effect on calcification process. // Bioorg. Khim. -2001.- 27(1), 4-20.

26. Van Dolah F.M., Ramsdell J.S. Review and assessment of in vitro detection methods for algal toxins. //J. AOAC Int. -2001.- 84(5), 1617-25.

27. Oien A., Gunde-Cimcrman N. Mycosporines and mycosporine-like amino acids: UV protectants or multipurpose secondary metabolites? // FEMS Microbiol. Lett. -2007.- 269 (1), 1-10.

28. Villar R., Laguna M.R., Calleja J.M., Cadavid I. Effects of Phaeodactylum tricornutum and Dunaliella tertiolecta extracts on the central nervous system. //Planta Med. -1992.- 8(5), 405-409.

29. Mayfield S.P., Manuell A.L, Chen S., Wu J., Tran M„ Siefker D., Muto M., Marin-Navarro J. Chlamydomonas reinhardtii chloroplasts as protein factories. //Curr. Opin. Biotechnol. -2007.- 18(2), 12633.

30. Harris W.S., Miller M., Tighe A.P., Davidson M.H., Schaefer E.J. Omega-3 fatty acids and coronary heart disease risk: Clinical and mechanistic perspectives. //Atherosclerosis. -2008.- 197(1), 1224.

31. Bourre J.M. Effect of increasing the omega-3 fatty acid in the diets of animals on the animal products consumed by humans. //Med. Sci (Paris). -2005.- 21(8-9), 773-9.

32. Bourre J.M. Omega-3 fatty acids in psychiatry. //Med. Sci. (Paris). -2005.- 21(2), 216-21

33. Rupp H., Wagner D., Rupp T., Schulte L.M., Maisch B. Risk stratificationby the "EPA+DHA level" and the "EPA/AA ratio" focus on anti-inflammatory and antiarrhythmogenic effects of long-chain omega-3 fatty acids. //Herz. -2004.- 29(7), 673-85.

34. Stahl L.A., Begg D.P., Weisinger R.S., Sinclair A .J. The role of omega-3 fatty acids in mood disorders. //Curr. Opin. Investig. Drugs. -2008.- 9(1), 57-64.

35. Metting F.B. Biodiversity and application of microalgae. //J. Ind. Microbiol. -1996.- 17, 477-489:

36. Chen G.Q., Chen F. Growing phototrophic cells without light. //Biotechnol. Lett. -2006.- 28(9), 60716.

37. Lebeau T., Robert J.M. Diatom cultivation and biotcchnologically relevant products. Part I: cultivation at various scales. //Appl. Microbiol. Biotechnol. -2003.- 60(6), 612-23.

38. Cox J., Kyle D., Radmer R., Delente J. Stable-isotope-labelled biochemicals from microalgae. TIBETCH. -1988.- 6, 279-282.

39. Berthold H.K., Hachey D.L., Reeds P.J., Thomas O.P., Hoeksema S., Klein P.D. Uniformly 13C labeled algal protein used to determine amino acid essentially in vivo. //Proc. Natl. Acad. Sci. -1991.- 88, 8091-8095.

40. Acicn F.G., Brindley C., Sánchez J.A., Fernández J.M., Ibáñez M.J., Molina E. Production of 13C polyunsaturated fatty acids from the microalga Phaeodactylum tricornutum. //J. Applied Phycology -2003,- 15, 299-237.

41. Egorova-Zachernyuk T.A. Application of stable isotope labelled products from algae: new opportunities for structure based drug design and solid state NMR. //The 10-th International Conference on Applied Phycology. Thesis. -2005. Kunming, China, P 43.

42. Acien F.G., Fernandez J.M., Egorova-Zachernyuk T.A., Molina E. Production of 13C, 15N labelled biomass from phototrophic microalgae art commercial scale. //The 10-th International Conference on Applied Phycology. Thesis. -2005.- Kunming, China, P 109.

43. Bequette B.J., Sunny N.E., El-Kadi S.W., Owens S.L. Application of stable isotopes and mass isotopomer distribution analysis to the study of intermediary metabolism in nutrients. //J. Anim. Sci. -2006.- 84, 50-59.

44. Emken E.A. Stable isotope approaches, applications and issues related to polyunsaturated fatty acid metabolism studies. //Lipids. -2001.- 36 (9), 965-973.

45. Crespi H.L., KatzJJ. Preparations of deuterated proteins and enzymes. In Hirs C.H.W., Timasheff C.N., Eds. //Methods Enzymol. Academic Press, Dordreclit-Holland. -1972.- 26, 627-637.

46. Sorensen P.', Poulsen F.M. A simple and economical algal culture system for stable isotope labelling. //J. Biomol. NMR. -1992.- 2, 99-101.

47. Patzelt H., Keüler B., Oschkinat H., Oesterhelt D. The entire metabolite spectrum of the green alga' Scenedesmus obliquus in isotope-labelled form. //Phytochemistry. -1999.- 50, 215-217.

48. Lugtenburg J., Creemers A.F.L., Verhoeven M.A., van Wijk A.A.C., Verdegem P.J.E., Monnee M.C.F., Jansen F.J.H.M. Synthesis of 13C labelled carotenoids and retinoids. //Pure Appl. Chem -1999.71,2245-2251.

49. Yongmanitchai W., Ward O.P. Screening of algae for potential alternative sources of eicosapentaenoic acid. //Phytochemistry. -1991.- 30(9), 2963-2967.

50. Boyle-Roden E., German J.B., Wood B.J.B. The production of lipids alternately labelled with carbon-13. //Biomol. Engineering. -2003.- 20, 285-/289.

51. Mann J.E., Myers J. On pigments, growth, and photosyntheis ogf phaeodactylum tricornutum. //J. Phycololgy. -1968.-4, 349-355.

52. Cawse P. A. The determination of nitrate in soil solutions by ultraviolet spectrophotometry. //Analyst. 92-1967.- 311-315.

53. Lepage G., Roy C. Improved recovery of fatty acid through direct transesterification without prior extraction or purification. //J. Lipid Research -1984.- 25, 1391-1396.

54. García Sánchez J.L., Molina Grima E., García Camacho F., Sánchez Pérez J.A., Giménez Giménez A. Cuantiíicación de ácidos grasos a partir de biomasa microalgal. //Grasas y Aceites. -1993.- 44(6), 348353.

55. Sun M.Y. Mass spectrometric characterizations of 13C-labeled lipid tracers and their degradation products in microcosm sediments. //Org. Geochem. -2000.-31, 199-209.

56. Molina Grima E., Acién Fernández F.G., García Camacho F., Camacho Rubio F., Chisti Y. Scale-up of tubular photobioreactors. //J. Appl. Phycol. -2000.- 12, 355-368.

57. Takeda, H. Cell wall sugars of some Scenedesmus species. //Phytochemistry. -1996.- .42. (3), 673675.

58. Gross W., Schnarrenberger C. Heterotrophic Growth of Two Strains of the Acido-Thermophilic Red Alga Galdieria sulphuraria. //Plant Cell Physiol. -1995.- 36, (4) 633-638.

59. Oesterhelt C., Gross W. Different Sugar Kinases Are Involved in the Sugar. Sensing of Galdieria sulphuraria. //Plant Physiol. -2002,- 128(1), 291 299.

60. BoenziD., deLuca P., TaddeiR. Fatty acids inCyanidium. //Giorn.Bot. Ital. -1977.- Ill, 129-134.

61. Seckbach J., Dean R., Ringelberg D., White D. Sterols and phylogeny of the acidophilic hot springs algae Cyanidium caldarium and Galdieria Sulphuraria. //Phytochemistry. -1993.- 34(5), 1345-1349.

62. Nagaschima H. Natural products of the Cyanidiophyceae. In (Seckbach: J. ed) Evolutionary Pathways and Enigmatic algae: Cyanidium caldarium (Rhodophyta) and related cells. -1994.- 201; 214.

63. Gravcrholt O.S., Eriksen N.T. Heterotrophic high-cell-density fed-batch and continuous-flow cultures of Galdieria sulphuraria and production of phycocyanin. //Appl. Microbiol. Biotechnol. -2007.- 77(1), 6975.

64. Meyer H. //Naturwissenschaften -1936.- 22, 346.

65. Katz J., Crespi'H., in Collins, C.J., Browman, N.S. Eds. Isotope effects in reaction rates. Van NostrandReinhord. New York. USA. -1971.- Ch. 5.

66. Blake M.I., Crane F.A. Uphaus R.A. Katz J.J. Can Jt J. Effect of deuterium oxide on the growth of peppermint (Mentha piperita L.). Morphological study. //J. Pharm. Sei. -1964.-53, 79-83.

67. Uphause R.A., Blake M.I., Katz J.J. Deuterium isotope effects in Nicotiana tabacum. //Can. J. Bot. -1975.- 53,2128-2133.

68. Dolnikowski G.G., Sun- Z., Grusak M.A., Peterson J.W., Booth S.L. HPLC and GC/MS determination of deuterated vitamin K (phylloquinone) in human serum after ingestion of deuteriumlabeled broccoli.//J. Nutr. Biochem. -2002.- 13(3), 168-174.

69. Putzbach K., Krucker M., Albert K., Grusak M.A., Tang G., Dolnikowski G.G. Structure determination of partially deuterated carotenoids from intrinsically labeled vegetables by HPLC-MS and 1H NMR. //J. Agric. Food. Chem. -2005.- 53(3), 671-677.

70. Lienau A., Glaser T., Tang G., Dolnikowski G.G., Grusak M.A., Albert K. Bioavailability of lutein in humans from intrinsically labeled vegetables determined by LC-APCI-MS. //J. Nutr. Biochem. -2003.-14(11), 663-70.

71. Mesnard F., Ratcliffe R.G. NMR analysis of plant nitrogen metabolism. //Photosynth. Res. -2005. 3(2), 163-80.

72. Osaki M., Shirai J., Shinano T., Tadano T. 15N-Allocation of 15NH4-N and 1SN03-N to nitrogenous compounds at the vegetative growth stage of potato plants. //Soil Sei. Plant Nutr. -1995.- 41, 699-708.

73. Dyckmans J., Flessa H., Influence of tree internal N status on uptake and translocation C and N in the beech: a dual 13C, 15N labelling approach. //Tree Physiol. -2001.- 21, 395-401.

74. Ippel J.H., Pouvrcau L., Kroef Т., Gruppen H., Versteeg G., van den Putten P., Struik P.C., van Mierlo, C.P.M. In vivo uniform 15N isotope labelling of plants: Using the greenhouse for structural proteomics. //Proteomics. -2004.- 4, 226-234.

75. Husemaim W., Barz W. Phototrophic growth and photosynthesis in cell suspension cultures of Chenopodium rubrum. //Physiol. Plant. -1977.- 40, 77-81.

76. Hall R.D., Brouwer I.D., Fitzgerald M.A. Plant metabolomics and its potential application for human nutrition. //Physiol Plant. -2008,- 132 (2), 162-175.

77. Усов А.И., Смирнова Г.П., Клочкова Н.Г. Полисахариды водорослей. 55. Полисахаридный состав некоторых бурых водорослей Камчатки. //Биоорганическая химия. -2001.- 27(6), 444-468.

78. Shulaev V., Cortes D., Miller G., Mittler R. Metabolomics for plant stress response. //Physiol Plant. -2008,- 132(2), 199-208.

79. Holtkamp A.D., Kelly S., Ulber R., Lang S. Fucoidans and fiicoidanases-focus on techniques for molecular structure elucidation and modification of marine polysascharides. //Appl. Microbiol. Biotechnol. -2009.- 82, 1-11.13. Археи и бактерии.1. Введение

80. Условия выращивания фотосинтетических бактерий

81. После разделения было чётко видны три полосы: нижняя соответствующая СК1-РЦ,средняя — GK2 комплекс, и; верхняя, содержащая другие белки и свободные пигменты.

82. Рис 1.3.1 Спектр поглощения фотосинтетических мембранных комплексов, выделенных из биомассы Rps. acidophila. А) СК2 и Б) СК1-РЦ.

83. Рис. 1.3.2. ИК спектры биомассы В. methylicurrr. U-2H. (а) и природной (б). Обозначен сдвиг вибрационных полос С-Н в области 2800 см-1 в область 2260 см"' в результате С-2Н. Введение изотопной метки составило не мене 96% по 'Н.

84. Список литературы к Главе 1.3

85. Taylor M.W., Radax R., Steger D., Wagner M. Sponge-associated microorganisms: evolution, ecology, and biotechnological potential. //Microbiol. Mol. Biol. Rev. -2007.- 71(2), 295-347.

86. Debbab A., Aly A.H., Lin W.H., Proksch P. Bioactive compounds from marine bacteria and fungi. // Microb. Biotechnol. -2010.- 3(5), 544-63.

87. Liebezeit G. Aquaculture of "non-food organisms" for natural substance production. //Adv. Biochem. Eng. Biotechnol.- 2005.- 97, 1-28.

88. König G.M., Kehraus S., Seibert S.F., Abdel-Lateff A., Müller D. Natural products from marine organisms and their associated microbes. //Chembiochem. -2006,- 7(2), 229-38.

89. Foster J.A., Moore J. Microbiome studies: psb 2011 special session introduction. //Pac. Symp. Biocomput. -2011.- 118-20.

90. Hölzl G., Dörmann P. Structure and function of glycoglycerolipids in plants and bacteria. //Prog. Lipid Res. -2007,- 46(5), 225-43.

91. Kumar A.S., Mody K., Jha B. Bacterial exopolysaccharides- a perception. //J. Basic Microbiol. -2007.-47(2), 103-17.

92. Volkman J.K. Sterols in microorganisms. //Appl. Microbiol. Biotechnol. -2003.- 60(5), 495-506.

93. Nichols D.S. Prokaryotes and the input of polyunsaturated fatty acids to the marine food web. //FEMS Microbiol. Lett. -2003.-219(1), 1-7.

94. Bremus C., Herrmann U., Bringer-Meyer S., Sahm H. The use of microorganisms in L-ascorbic acid production. //J. Biotechnol. -2006,- 124(1), 196-205.

95. Newmann D.J., Hill R.T. New drugs from marine microbes: the tide is turning. //J. Ind. Microbiol. Biotechnol. -2006,- 33, 539-544.

96. Dunlap W.C., Battershill C.N., Liptrot C.H., Cobb R.E., Bourne D.G., Jaspars M., Long P.F., Newman D J. Biomedicinals from the phytosymbionts of marine invertebrates: a molecular approach. //Methods. -2007,- 42(4), 358-76.

97. Bryant D.A., Frigaard N-U. Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated. //Trends Microbiol. -2006.-14 (11), 488-496.

98. Chew A. G. M., Bryant D.A. Chlorophyll biosynthesis in bacteria: the origins of structural and fundamental diversity. //Annu. Rev. Microbiol. -2007.- 61, 113-129.

99. Woese C., Kandier O., Wheelis M. Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya. //Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -1990.- 87 (12), 4576-9

100. Wang M., Yafremava L.S., Caetano-Anolles D., Mittenthal J.E., Caetano-Anolles G. Reductive evolution of architectural repertoires in proteomes and the birth of the tripartite world. //Genome Res. -2007.- 17(11), 1572-85.

101. Valentine D.L. Adaptations to energy stress dictate the ecology and evolution of the Archaea. // Nat. Rev. Microbiol. -2007.- 5 (4), 316-23.

102. DeLong E.F., Pacc N.RI Environmental diversity of bacteria and archaea. //Syst. Biol. -2001.- 50 (4), 470-8.

103. Karner M.B., DeLong E.F., Karl D.M . Archaeal dominance in the mesopelagic zone of the Pacific Ocean. //Nature. -2001.- 409 (6819), 507-10.

104. Schiraldi C., Giuliano M., De Rosa M. Perspectives on biotechnological applications of archaea.// Archaea. -2002.- 1(2), 75-86.

105. Breithaupt H. The hunt for living gold. The search for organisms in extreme environments yields useful enzymes for industry. //EMBO Rep. -2001.- 2 (11), 968-71.

106. Synowiecki J., Grzybowska В., Zdzieblo A. Sources, properties and suitability of new thermostable enzymes in food processing. //Crit. Rev. Food Sci. Nutr. -2006,- 46 (3), 197-205.

107. Egorova K., Antranikian G. Industrial relevance of thermophilic Archaea. //Curr. Opin. Microbiol. -2005.- 8 (6), 649-55.

108. Norris P.R, Burton N.P., Foulis N.A. Acidophiles in bioreactor mineral processing. //Extremophiles. -2000,- 4 (2), 71-6.

109. Мосин О.В., Складнев Д.А., Швец В.И. Исследование физиологической адаптации бактерий к тяжёлой воде. // Биотехнология. -1999.- 4,21-31.

110. Диканская Э.М., Долгая М.Б., Калунянц Н.П., Родионова Г.С., Фишер П.Н., Кондратьева Е.Н., Нетрусов А.И., Ивановский Р.Н. Штам облигатно метилотрофной бактерии Methylobacillus Methylophillus BCB-792.SU 989867. 3.12.80.

111. Skladnev D.A., Egorova T.A. Isotopically labelled bacteriorhodopsin for computers. 7th bitrernational Conference on Retinal Proteins. Zichron Yaacov. Israel. -1996,- 55.

112. Егорова-Зачернюк Т. А., Складнее Д.А., Швец, В.И. Биотехнологическое получение униформно дейтерированных пурпурных мембран галобактерий для нанобиотехнологии. //Биотехнология. -2008.- 6, 60-72.

113. Crespi H.L. The isolation of deuterated bacteriorhodopsin from fully deuterated Halobacterium halobium. //Method. Enzymol. 1982, 88(1), 3-12.

114. Katz J.J., Crespi H.L. Deuterated organisms: cultivation and uses. //Science. 1966, 151(715), 1187-94.

115. Grishko V.L., Duley W.W. Infrared absorption spectra of deuterated amorphous carbon. //Astrophys. J. -2003.- 583, 43-45.

116. Gazi E., Garder P., Lockey N.P., Hart C.A., Brown M.D., Clarke N.W. Direct evidence of lipid translocation between adipocytes and prostate cancer cells with imaging FTIR microspectroscopy. //J. Lipid Res. -2007.-48(8), 1846-1856.

117. Дрожжевые экстракты как компоненты питательных сред Введение

118. Культивирование дрожжей в колбах

119. Культивирование дрожжей в биореакторе

120. Мечение стабильными изотопами

121. Рис. 1.4.1. ИК спектры биомассы Н. ро1утогрИа: и-15М. (а), [и-'3С, 15Ы] (б) и природной (в). Коррекция базовой линии выполнена при 1950 см"'. Введение изотопной метки составило не менее 98% по |5Ы и 99% по '3С.

122. Автолизаты как компоненты питательных сред

123. Процесс в колбах и биореакторе

124. Оптимизация получения дрожжевой биомассы