Структурно-функциональная характеристика С5-цитозиновой ДНК-метилтрансферазы SsoII и ее комплексов с ДНК-лигандами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Рязанова, Александра Юрьевна

• Рязанова, Александра Юрьевна
• кандидат химических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат химических наук Рязанова, Александра Юрьевна

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Структурно-функциональная характеристика доменов, входящих в состав

С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз (Обзор литературы)

1.1. Структурно-функциональная характеристика метилтрансферазного домена у прокариотических и эукариотических С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз

1.1.1. Структурная организация метилтрансферазного домена

1.1.2. Механизм метилирования ДНК

1.2. ДНК-метилтрансферазы с неколькими метилтрансферазными доменами

1.3. Дополнительные функции С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз у прокариот

1.3.1. Дезаминирование остатков цитозина и 5-метилцитозина

1.3.2. Эндонуклеазная активность

1.3.3. Топоизомеразная активность

1.3.4. С5-цитозиновые ДНК-метилтрансферазы как факторы транскрипции

1.4. Домены эукариотических ДНК-метилтрансфераз

1.4.1. Функциональные домены ОптН млекопитающих

1.4.1.1. БМАР1 -связывающий домен

1.4.1.2. РСМА-связывающий домен

1.4.1.3. КГТ8-домен

1.4.1.4. СХХС-домен

1.4.1.5. ВАН-домены

1.4.1.6. Кв-линкер

1.4.2. Функциональные домены ферментов семейства БппйЗ млекопитающих

1.4.2.1. РМ^-домен

1.4.2.2. АББ-домен

1.4.3. Домены ДНК-метилтрансфераз растений

ГЛАВА 2. Структурно-функциональная характеристика ДНК-метилтрансферазы 8зо11

и ее комплексов с ДНК-лигандами (Результаты и их обсуждение)

2.1. Характеристика объектов исследования

2.2. Экспрессия, выделение и очистка рекомбинантных ДНК-метилтрансфераз

2.3. Структура апо-формы ДНК-метилтрансферазы БзоН и ее делеционных мутантов

2.3.1. Определение олигомерного состояния ДНК-метилтрансфераз SsoII и NlaX методом гель-фильтрации

2.3.2. Структура низкого разрешения ДНК-метилтрансфераз NlaX и SsoII

2.3.3. Структурная характеристика N-концевой области SsoII-подобных ДНК-метилтрансфераз

2.3.4. Конформационная подвижность линкера, соединяющего домен ДНК-метилтрансферазы SsoII, ответственный за регуляцию транскрипции, с доменом, ответственным за метилирование

2.4. Метилтрансфераза SsoII как фермент, модифицирующий ДНК

2.4.1. Взаимодействие ДНК-метилтрансферазы SsoII с кофактором и аналогом кофактора

2.4.2. Особенности комплексообразования ДНК-метилтрансферазы SsoII

с ДНК-дуплексом, содержащим участок метилирования

2.4.2.1. Комплексообразование

2.4.2.2. Стехиометрия комплексов ДНК-метилтрансферазы SsoII с ДНК-дуплексами, содержащими участок метилирования

2.4.2.3. Структура низкого разрешения комплекса ДНК-метилтрансферазы

SsoII с 15-звенным ДНК-дуплексом, содержащим участок метилирования

2.4.2.4. Кинетика взаимодействия ДНК-метилтрансферазы SsoII с ДНК-дуплексом, содержащим участок метилирования

2.4.2.5. Кинетика «выпетливания» гетероциклического основания при взаимодействии ДНК-метилтрансферазы SsoII с ДНК-дуплексом, содержащим участок метилирования

2.5. ДНК-метилтрансфераза SsoII как фактор транскрипции: структурные особенности комплексов с ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок

2.5.1. Комплексообразование N-концевой области SsoII-подобных ДНК-метилтрансфераз с ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок

2.5.2. Стехиометрия комплексов ДНК-метилтрансферазы SsoII с ДНК-дуплексами, содержащими регуляторный участок

2.5.3. Сближенность белковых субъединиц в комплексе ДНК-метилтрансферазы SsoII с 60-звенным ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок

2.5.4. Взаимное расположение доменов ДНК-метилтрансферазы SsoII в комплексах с 60-звенным ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок

2.5.4.1. Ковалентная «сшивка» остатков цистеина с помощью ВМОЕ и ВМ[РЕО]4

2.5.4.2. Фотокросслинкинг с помощью ВРМ

2.5.5. Модель взаимодействия ДНК-метилтрансферазы SsoII с регуляторным участком ДНК

2.5.6. Значение структурной организации комплекса ДНК-метилтрансферазы SsoII с регуляторным участком для функционирования ДНК-метилтрансферазы

SsoII в качестве фактора транскрипции

2.6. Сравнение эффективности взаимодействия ДНК-метилтрансферазы SsoII с

ДНК-лигандами

2.6.1. Кинетика взаимодействия ДНК-метилтрансферазы SsoII с ДНК-лигандами

2.6.1.1. Анализ кинетики методом акустической детекции на

пьезоэлектрическом сенсоре

2.6.1.2. Анализ кинетики методом «остановленного потока»

2.6.2. Сравнение сродства ДНК-метилтрансферазы SsoII к ДНК-дуплексам, содержащим участки узнавания, в равновесных условиях

2.6.3. Особенности существования системы рестрикции-модификации SsoII в клетке

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Реактивы и материалы

3.2. Приборы и методы

3.3. Общие методики

3.3.1. Приготовление компетентных клеток

3.3.2. Трансформация клеток методом теплового шока

3.3.3. Экспрессия белков

3.3.4. Выделение и очистка белков

3.3.5. Определение молекулярной массы белков методом гель-фильтрации

3.3.6. Определение вторичной структуры белков методом спектроскопии кругового дихроизма

3.3.7. Получение структуры низкого разрешения методом малоуглового

рассеяния рентгеновских лучей (SAXS)

3.3.8. Анализ эффективности взаимодействия ДНК-метилтрансферазы SsoII с кофактором методом измерения собственной флуоресценции белка

3.3.9. Конструирование 32Р-меченных ДНК-дуплексов

3.3.10. Анализ кинетики метилирования ДНК-субстрата ДНК-

метилтрансферазой SsoII

3.3.11. Комплексообразование ДНК-метилтрансфераз SsoII, Ecll8kl, NlaX и белка A(72-379)M.Ecll8kI с ДНК-дуплексами

3.3.12. Определение стехиометрии ДНК-белковых комплексов

3.3.13. Анализ кинетики взаимодействия ДНК-метилтрансферазы SsoII с ДНК методом акустической детекции на пьезоэлектрическом сенсоре

3.3.14. Анализ взаимодействия ДНК-метилтрансферазы SsoII с флуоресцентно меченными ДНК-дуплексами в равновесном состоянии

3.3.15. Анализ кинетики взаимодействия ДНК-метилтрансферазы SsoII с ДНК методом «остановленного потока»

3.3.16. Анализ доступности для модификации остатков цистеина ДНК-метилтрансферазы SsoII

3.3.17. Анализ структуры ДНК-метилтрансферазы SsoII и ее комплексов с ДНК с помощью бифункциональных «сшивающих» реагентов (метод кросслинкинга)

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

2-АП 2-аминопурин

АА 5 '-амино-5 '-дезоксиаденозин

а. о. аминокислотный остаток

БСА бычий сывороточный альбумин

БФС бромфеноловый синий

Да,кДа дальтон, килодальтон

ДМСО диметилсульфоксид

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ДНКаза I дезоксирибонуклеаза I

дсн додецилсульфат натрия

дтт дитиотреит (1,4-димеркапто-2,3-бутандиол)

иптг изопропил-1-тио-(3-/)-галактопиранозид

КД круговой дихроизм

мм молекулярная масса

МТаза метилтрансфераза

ПААГ полиакриламидный гель

п. н. пара нуклеотидов

Р-М рестрикция-модификация

РНК рибонуклеиновая кислота

РНКП РНК-полимераза

РСА рентгеноструктурный анализ

СПС спираль-поворот-спираль

ТЕМЕД М, Ы, Ы', тУ'-тетраметилэтилендиамин

Трис трис(гидроксиметил)аминометан

ХД хромодомен

хмт хромометилтрансфераза

ЧСА сывороточный альбумин человека

ЭДТА этилендиаминтетраацетат, натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты

ЭР эндонуклеаза рестрикции

ЯМР ядерный магнитный резонанс

Ас1оНсу Я- аденозил-1-гомоцистеин

АсЬМег ¿»-аденозил-Х-метионин

ВМОЕ А/,у-гпа1е1ш1ёоеАапе; бг/с-малеимидоэтан

ВМ[РЕ0]4 1,11 -A/'s'-maleimidotetraethyleneglycol; 1,11 -быс-малеимидотетраэтиленгликоль

ВРМ 4-(iV-maleimido)benzophenone; 4-(А'-малеимидо)бензофенон

С5-МТаза С5-цитозиновая метилтрансфераза

DRM domains rearranged methyltransferase; семейство ДНК-МТаз, содержащих

консервативные мотивы в необычном порядке

EtBr этидия бромид

FPLC Fast Protein Liquid Chromatography; быстрая жидкостная хроматография белков

HEPES А?-2-гидроксиэтшшиперазин-Л''-2-этансульфоновая кислота

Ml.LlaJI С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза LlaJI, модифицирующая следующий

остаток цитозина: 5'-GACGC-373'-CTGCG-5'

М2.LlaJI С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза LlaJI, модифицирующая следующий

остаток цитозина: 5'-GACGC-3'/3'-CTGCG-5'

M.Ecl 18kl С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза Eel 18kl

М.Есо47П С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза Eco47II

M.EcoRII С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза EcoRII

М.НаеШ С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза НаеШ

M.Hhal С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза Hhal

M.MspI С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза Mspl

M.NlaX С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза NlaX

M.ScrFIA С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза ScrFIA

М.SsoII С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза SsoII

M.SssI С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза SssI

N4-MTa3a Ш-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза

N6-MTa3a К6-адениновая ДНК-метилтрансфераза

PDB Protein Data Bank, банк пространственных структур макромолекул

PMSF phenylmethanesulfonylfluoride; фенилметансульфонилфторид

R.SsoII эндонуклеаза рестрикции SsoII

SAXS small-angle X-ray scattering; малоугловое рассеяние рентгеновских лучей

TSM thickness shear mode; деформация сдвига по толщине

TRD target recognition domain; область в малом субдомене ДНК-МТаз,

обеспечивающая субстратную специфичность

Для обозначения аминокислотных остатков, нуклеотидов, олиго- и полинуклеотидов использовали символы, рекомендованные Комиссией по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии (ШРАС) и Международного союза биохимиков (ШВ).

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональная характеристика С5-цитозиновой ДНК-метилтрансферазы SsoII и ее комплексов с ДНК-лигандами»

ВВЕДЕНИЕ

Реакция метилирования ДНК является одной из основных в биохимии клетки. У млекопитающих метилирование ДНК играет существенную роль в регуляции экспрессии генов, импринтинге, упаковке хроматина, эмбриональном развитии, возникновении онкологических заболеваний. У прокариот метилирование ДНК обеспечивает защиту клетки от чужеродной ДНК, а также тесно связано с регуляцией экспрессии генов и с процессами репликации и репарации ДНК. Метилирование ДНК катализируется важнейшим классом ферментов нуклеинового обмена - ДНК-метилтрансферазами (МТазами).

С5-Цитозиновые ДНК-МТазы (С5-ДНК-МТазы) обнаружены как у прокариот, так и у эукариот. Каталитические домены бактериальных и эукариотических С5-ДНК-МТаз характеризуются общей структурной организацией. Систематический анализ аминокислотных последовательностей этих ферментов, имеющихся в базах данных, позволяет утверждать, что многие МТазы в клетке не только осуществляют метилирование ДНК, но и обладают другими функциями. Бифункциональность белков - это эффективный и экономичный способ связать друг с другом различные клеточные события, возникший в эволюции достаточно давно [1]. Однако из тысяч бифункциональных и мультифункциональных С5-ДНК-МТаз на данный момент изучены единицы.

Данная работа направлена на исследование механизмов узнавания ДНК бифункциональными МТазами на примере прокариотической С5-ДНК-МТазы БбоП (М.БзоП), входящей в систему рестрикции-модификации (Р-М) П-го типа 88о11. М.ЗяоИ узнает в двутяжевой ДНК последовательность 5'-ССНОО-3' (где N = А, С, О или Т) и в присутствии кофактора Я-аденозил-Х-метионина (А<1оМе1:) метилирует внутренний остаток цитозина с образованием остатка 5-метилцитозина. Интересной особенностью М.8зо11 является наличие протяженного Ы-концевого участка (1-71 аминокислотные остатки (а. о.)), структура которого обусловливает способность МТазы выступать в роли фактора транскрипции и регулировать экспрессию собственного гена, а также гена, кодирующего эндонуклеазу рестрикции БзоП (И^оП). Регуляция осуществляется благодаря специфическому взаимодействию М^оН с промоторной областью генов системы Р-М БбоП [2, 3]. Основное число контактов М.БзоП с промоторной областью обеспечивает локализованный внутри последней 15-звенный инвертированный повтор (в дальнейшем называемый регуляторным участком).

Таким образом, М^оП представляет собой бифункциональный белок: с одной стороны это фактор транскрипции, а с другой - фермент, катализирующий реакцию метилирования ДНК. Какова взаимосвязь между активностями, которые обеспечиваются разными доменами

в составе одной полипептидной цепи, - вопрос, для МТаз практически не исследованный. Это определяет актуальность всестороннего изучения структурно-функциональной организации комплексов M.SsoII с участком метилирования и с регуляторным участком.

Целью работы являлась структурно-функциональная характеристика С5-цитозиновой ДНК-метилтрансферазы SsoII и ее комплексов с ДНК-дуплексами, содержащими участок метилирования и регуляторный участок.

В ходе работы необходимо было решить следующие задачи.

1. Охарактеризовать третичную и четвертичную структуру ало-формы M.SsoII и ее делеционных мутантов.

2. Изучить комплексообразование M.SsoII с ДНК-дуплексами, содержащими участок метилирования или регуляторный участок:

• стехиометрию комплексов;

• эффективность связывания M.SsoII с ДНК-дуплексами;

• скорости комплексообразования M.SsoII с ДНК-дуплексами.

3. Проанализировать структурную организацию комплекса M.SsoII с ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок.

4. Детализировать модель функционирования M.SsoII в клетке как фермента модификации и как фактора транскрипции.

В данной работе впервые продемонстрировано, что МТазная и регуляторная активности M.SsoII являются взаимоисключающими: комплексообразование этого белка с регуляторным участком предотвращает его связывание с участком метилирования. Показано, что эффективное метилирование клеточной ДНК обеспечивается M.SsoII за счет большей скорости связывания с участком метилирования и за счет значительного избытка участков метилирования относительно регуляторных участков.

Работа включает обзор литературы, посвященный структурно-функциональной характеристике различных доменов, входящих в состав С5-ДНК-МТаз.

ГЛАВА 1. Структурно-функциональная характеристика доменов, входящих в состав С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз

(Обзор литературы)

С5-цитозиновые ДНК-метилтрансферазы (С5-ДНК-МТазы) катализируют перенос метильной группы с ¿у-аденозил-Х-метионина (АёоМе1) на атом углерода в пятом положении остатка цитозина. АёоМе! при этом превращается в З'-аденозил-Х-гомоцистеин (АёоНсу). Метилированы могут быть как одна, так и обе цепи молекулы ДНК. Метальная группа локализована в большой бороздке и не нарушает уотсон-криковских взаимодействий в двойной спирали ДНК. С5-ДНК-МТазы специфически узнают в двуцепочечной ДНК участки метилирования - короткие последовательности, в большинстве случаев палиндромные и имеющие длину 2-6 п. н.

У прокариот, помимо метилирования С5-атома остатка цитозина, также возможно метилирование Ж-атома остатка цитозина и Ш-атома остатка аденина. Эти модификации осуществляются разными классами ДНК-метилтрансфераз (ДНК-МТаз). Метилирование ДНК у прокариот обеспечивает осуществление трех важнейших процессов: дискриминации собственной и чужеродной ДНК; дискриминации материнской и дочерней цепей ДНК (необходимо для исправления ошибок репликации в дочерней цепи); а также контроля репликации ДНК и связи репликации с клеточным циклом [4].

Большинство обнаруженных к настоящему времени ДНК-МТаз входят в состав систем рестрикции-модификации (Р-М). Бактериальные клетки используют их для своей защиты от чужеродной ДНК. В состав системы Р-М входят МТаза и эндонуклеаза рестрикции (ЭР), узнающие в ДНК одну и ту же последовательность нуклеотидов. При этом МТаза метилирует определенные нуклеотидные остатки внутри узнаваемой последовательности, а сопряженная ЭР гидролизует фосфодиэфирные связи внутри или вблизи этой последовательности, если она не метилирована. Таким образом, вся ДНК клетки-хозяина защищена метилированием, а в случае заражения клетки бактериофагом его ДНК гидролизуется ЭР, поскольку является неметилированной [5].

У многоклеточных эукариот наблюдается метилирование ДНК по С5-атому остатка цитозина. Функции метилирования ДНК у эукариот весьма разнообразны: контроль экспрессии генов [6, 7], регуляция геномного импринтинга [8-10], инактивация Х-хромосомы [11-14], защита генома от эндогенных ретровирусов и транспозонов [15, 16], участие в развитии иммунной системы [17] и в функционировании мозга [18, 19]. Нарушения паттернов метилирования наблюдаются у человека при различных заболеваниях, в том числе при психозах, заболеваниях иммунной системы и раке [20-25].

Различные С5-ДНК-МТазы обладают высокой степенью сходства как по первичной, так и по третичной структуре, и потому легко идентифицируются биоинформатическими методами. В базе данных Р£ат (http://pfam.sanger.ac.uk/) содержатся 5065 аминокислотных последовательностей, в которых есть домен, отнесенный к группе С5-ДНК-МТаз (Р1?00145). Из них 3072 аминокислотных последовательностей (61 %) содержат только один домен РР00145, в остальных же имеются удвоения этого домена и/или какие-либо дополнительные домены. Перечень таких доменов, встречающихся в составе одной полипептидной цепи с МТазным доменом, весьма широк (табл. 1.1): в нем есть другие МТазы, эндонуклеазы рестрикции (ЭР), прочие ферменты, факторы транскрипции, домены, характерные для белков, ассоциированных с хроматином, и др.

Таблица 1.1

Домены, встречающиеся в составе одной полипептидной цепи

с С5-ДНК-метилтрансферазным доменом (PF00145) в базе данных Pfam

Крщкое на (канне и IIOMI'P 10MC11U Мсги.11 рансферашые ломе! Описание юмсна 1Ы

DNA methylase (PF00145) С5-цитозиновая ДНК-МТаза (второй и более домен)

Methyltransf 26 (PF13659) МТаза

MethyltransfD 12 (PF02086) Кб-адениновая ДНК-МТаза класса D12

N6_Mtase (PF02384) К6-адениновая ДНК-МТаза из системы рестрикции-модификации типа I

N6 N4 Mtase (PF01555) К6-адениновая или Ы4-цитозиновая ДНК-МТаза

Eco57I (PF07669) Домен, подобный ЭР и Ыб-адениновой ДНК-МТазе Есо571

Cons hypoth95 (PF03602) Предполагаемый консервативный белок 95

EcoRI methylase (PF13651) Домен, подобный Ы6-адениновой ДНК-МТазе EcoRI

Dam (PF05869) Домен, подобный К6-адениновой ДНК-МТазе Dam

)n,wnvK.ieainbic лочены

RE Eco47II (PF09553) Домен, подобный ЭР Есо47П

RE Haell (PF09554) Домен, подобный ЭР НаеП

RE Haelll (PF09556) Домен, подобный ЭР НаеШ

RE Hpall (PF09561) Домен, подобный ЭР НраП

HNH 3 (PF13392) Эндонуклеаза типа ШЧН

MutH (PF02976) Фермент МиШ из системы репарации неканонических пар нуклеотидов

Vsr (PF03852) Эндонуклеаза Увг, узнающая неканонические пары нуклеотидов

DUF559 (PF04480) Домен с неизвестной функцией

BsuBI PstI RE (PF06616) С-концевая область семейства ЭР ВзиБИ/РвЙ

TaqI_C_CPFJ_2950J_______ Реп.1иторы граискршшми С-концевой домен, определяющий специфичность ЭР Тая1

HTH 3 (PF01381) Домен, содержащий мотив спираль-поворот-спираль (СПС)

HTH 17 (PF 12728) Домен, содержащий мотив СПС

HTH 19 (PF12844) Домен, содержащий мотив СПС

HTH 23 (PF13384) Гомеодомен-подобный домен, содержащий мотив СПС

HTH 26 (PF13443) Домен, содержащий мотив СПС, типа Сго/С1

HTH 31 (PF13560) Домен, содержащий мотив СПС

MerR (PF00376) Регуляторный домен из семейства МеЛ, содержащий мотив СПС

MerR 1 (PF13411) Регуляторный домен из семейства МеЖ, содержащий мотив СПС

ОДО1870 (РР08965) | Домен с неизвестной функцией, содержащий мотив СПС Лимоны прочих ферменте, взаимодействующих с ДНК

SNF2 N (PF00176) N-концевой домен семейства SNF2

Helicase C(PF00271) С-концевой домен, консервативный у хеликаз

Terminase 6 (PF03237) Домен, подобный терминазе

RVT 1 (PF00078) Обратная транскриптаза (РНК-зависимая ДНК-полимераза)

DYW deaminase (PF 14432) Домен из семейства деаминаз нуклеиновых кислот DYW

DNA pol3 beta 2 (PF02767) Центральный домен ß-субъединицы ДНК-полимеразы III

DNA pol3 beta 3 (PF02768) С-концевой домен ß-субъединицы ДНК-полимеразы III

HhH-GPD (PF00730) Фермент эксцизионной репарации ДНК из семейства HhH-GPD

Transposase 20 (PF02371) Домен из семейства транспозаз IS116/IS110/IS902

DEDD Tnp IS110 (PF01548) Транспозаза

YTH (PF04146) ¥Т521-В-подобный домен (вовлечен в альтернативный ciuiaiicuni)

Домены белков, ассоциированных с хроматином

Chromo (PF00385) Модификатор организации хроматина

PWWP (PF00855) PWWP-домен (содержит мотив Pro-Trp-Trp-Pro)

ВАН (PF01426) ВАН-домен (bromo-adjacent homology)

DMAP binding (PF06464) DMAP 1-связывающий домен

DNMT1-RFD (PF 12047) Домен, направляющий белок в область репликации ДНК

zf-CXXC (PF02008) «Цинковые пальцы» (СХХС-домен)

PHD (PF00628) Домен PHD-finger (гомеодомен растений)

RCC1 2(PF13540) Регулятор конденсации хромосом CRCC1)

Прочие ломены

Pkinase Tyr(PF07714) Тирозин-киназа белков

PPR (PF01535) Домен, содержащий повтор РРР (пентатрикопептидный повтор)

AOX (PF01786) Альтернативная оксидаза (белок электрон-транспортной цепи)

Cullin (PF00888) Куллин (белок, обеспечивающий структурную основу для убиквитин-лигазы)

Cyt-b5 (PF00173) Цитохром Ь5-подобный домен, связывающий гем и стероиды

PALP (PF00291) Пиридоксальфосфат-зависимый фермент

CH (PF00307) Кальпонин-подобный актин-связывающий домен

Dabb(PF07876) а/р-бочонок, отвечающий на стресс

Hint 2 (PF13403) Нт^домен (обнаруженный в интеинах)

DUF1152 (PF06626) Домен с неизвестной функцией

DUF3444(PF 11926) Домен с неизвестной функцией

Особенности структуры каталитического домена различных ДНК-МТаз, детали каталитического механизма и биологические функции ДНК-МТаз из разных организмов систематизированы в многочисленных обзорах литературы. Поэтому в данном обзоре они обсуждаются достаточно кратко. Основное внимание сфокусировано на рассмотрении дополнительных активностей С5-ДНК-МТаз, а также структуры и функций доменов этих ферментов, отличных от метилтрансферазного домена. С этой точки зрения данные о свойствах С5-ДНК-МТаз еще не систематизированы.

Большинство доменов, перечисленных в табл. 1.1, обнаружено с помощью биоинформатического анализа аминокислотных последовательностей. Экспериментальные подтверждения того, что аннотированный определенным образом домен, находясь в составе данной полипептидной цепи, действительно выполняет приписанную ему функцию,

отсутствуют для подавляющего большинства белков, перечисленных в базе данных Pfam. В данном обзоре подробно рассмотрены только те домены, активность которых в составе С5-ДНК-МТаз изучена экспериментально. В некоторых случаях присутствие «дополнительных» доменов отражается на МТазной активности фермента, в некоторых других - разные домены белка функционируют независимо друг от друга. Особенно подробно обсуждаются эукариотические ферменты Dnmtl, Dnmt3a и Dnmt3b, поскольку они являются наиболее изученными среди мультидоменных С5-ДНК-МТаз.

1.1. Структурно-функциональная характеристика метилтрансферазного домена

у прокариотических и эукариотических С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз

1.1.1. Структурная организация метилтрансферазного домена

Среди прокариотических С5-ДНК-МТаз наиболее изученным ферментом является МТаза Hhal (M.Hhal) из штамма Haemophilus haemolyticus, которая метилирует внутренний остаток цитозина в последовательности 5'-GCGC-373'-CGCG-5'. Она содержит только МТазный домен (рис. 1.16). Структурная организация и каталитический механизм С5-ДНК-МТаз детально изучены на примере именно этого фермента.

Основной домен С5-ДНК-МТаз состоит из двух субдоменов, большого и малого, между которыми расположена ДНК-связывающая полость. В третичной структуре большого (каталитического) субдомена имеется общее структурное ядро - ß-лист, состоящий из семи ß-тяжей и ограниченный с каждой стороны тремя а-спиралями (рис. 1.1а). Из семи ß-тяжей шесть расположены параллельно и один - антипараллельно, причем тяж 1 находится в середине ß-листа, а антипараллельный тяж 7 - между тяжами 5 и 6 (6j 1] 5]. 4J, 1| 2J, 3|). Таким образом, большой субдомен состоит из двух частей, одна из которых (ßl-ß3) формирует центр связывания AdoMet, а другая (ß4-ß7) формирует центр связывания метилируемого основания. Оба центра представляют собой одинаково расположенные гидрофобные «карманы», поэтому была выдвинута идея, что каталитический субдомен мог образоваться в результате дупликации гена [26]. Такой же тип структуры наблюдается в других AdoMet-зависимых МТазах, метилирующих РНК, белки и низкомолекулярные вещества [27].

В малом субдомене располагается область TRD (target recognition domain), имеющая уникальную аминокислотную последовательность у каждого фермента и обеспечивающая субстратную специфичность. Малые субдомены ДНК-МТаз значительно различаются по размеру и пространственной структуре [4].

Рис. 1.1. (л) Структурное ядро большого субдомена С5-ДНК-МТаз и расположение в нем консервативных мотивов [4]. а-Спирали изображены прямоугольниками, р-тяжи - стрелками. Номера консервативных мотивов указаны римскими цифрами, (б) Вторичная и третичная структура С5-ДНК-МТаз на примере M.Hhal (в комплексе с ДНК и AdoHcy, PDB-код 3miit) [28J. В молекуле белка а-спирали выделены розовым, р-тяжн - желтым. Синим выделена ДНК, черным - AdoHcy.

В работе [29] проведено сравнение структуры M.Hhal и ДНК-МТазы Dnmtl мыши {а. о. 650-1602) в комплексах с ДНК. Dnmt] - это МТаза, обеспечивающая поддерживающее метилирование. Основным ее субстратом являются монометшшрованные участки 5'-CG-373'-GC-5'. Каталитические субдомены прокариотической и эукариотической МТаз похожи (среднеквадратичное отклонение Са-атомов составляет лишь 2,0 А для 218 а. о.). Однако субдомены TRD в молекулах Dnmtl и M.Hhal значительно различаются как по первичной, так и по третичной структуре (рис. 1.2). Большая часть TRD Dnmtl уложена в виде независимого структурного элемента и отчасти стабилизируется ионом Zn2~, который координируется тремя остатками Cys и одним остатком His, Кроме того, «шпилька» в начале TRD образует гидрофобные контакты с каталитическим субдоменом и с доменом ВАН1, входящим в состав Dnmtl {см. раздел 1.4.IS). Боковые цепи некоторых аминокислотных остатков {преимущественно аргинина) каталитического субдомена контактируют с фосфатными группами, фланкирующими неметнлированный участок 5'-CG-3'/3'-GC-5'.

В отличие от комплекса с M.Hhal, где ДНК располагается в полости между каталитическим субдоменом и TRD, в комплексе с Dnmtl ДНК закреплена в позиции, удаленной от активного центра фермента (рис. 1.2). По-видимому, это связано с тем, что каталитический домен Dnmtl в изолированном виде неактивен, несмотря на наличие всех аминокислотных мотивов, требуемых для выполнения функции метилирования [30-33]. Регуляция активности каталитичекого домена Dnmtl осуществется N-концевой областью белка (см. раздел 1.4.1).

а б

Рис. 1.2. Сравнение пространственной структуры МТазного домена Сипл! и М.НЬа1 [29]. (а) Структура МТазного домена Опгпг! мыши из комплекса Т)пгп11 (650—] 602) с Ас1оНсу и 19-звенным ДНК-дуплсксом, содержащим два ^модифицированных участка 5'-СО-373 '-ОС-5' (РБВ-код Зргб) [29]. ДНК выделена бежевым, каталитический субдомен - синим, ТИП - голубым, (б) Структура комплекса М.Нйа1 с А<1оНсу и 13-звенным ДНК-дуплексом, содержащим остаток 5-фторцитозина (обозначен как Б) в участке метилирования: 5'-ОЕОС-3'/3'-СС£Ст-5' (РБВ-код 1т1л) [34]. ДНК выделена бежевым, каталитический субдомен - зеленым, ТЯГ) - светло-зеленым.

1.1.2. Механизм метилирования ДНК

Для проведения реакции метилирования требуется связывание МТазой ДНК, содержащей участок узнавания, и кофактора реакции - Ас1оМе1. После формирования «тройного» комплекса МТаза-ДНК-АбоМег происходит метилирование цятозина по механизму ЗиЗ. Процесс можно разделить на 3 основные стадии; выведение остатка цитозина из двойной спирали ДНК («выпетливание»), формирование ковалентного аддукта п собственно перенос метальной группы [35—44], «Выпетливание» остатка цитозина и формирование ковалентного аддукта можно рассматривать как активирование остатка цитозина для того, чтобы перенос мет иль но и группы был возможен (рис. 1.3).

МТаза формирует специфические ДНК-белковые контакты с гетероциклическими основаниями участка узнавания, за исключением самого метилируемого основания. Поэтому замена этого основания на какое-либо другое (например, на флуорофор 2-аминопурин) не препятствует связыванию МТазы с участком метилирования и «выпетливанию» данного основания. Известно, что «выпетливание» происходит тем легче, чем менее стабильна соответствующая пара нуклеотидов [41].

«Выпетливание» метилируемого нуклеотида может происходить самопроизвольно

(ДНК «дышит») или за счет взаимодействия с ферментом. В последнее время накапливаются доказательства активной роли фермента в этом процессе. В случае М.НЬа1, по-видимому, формирование специфических контактов между белком и тремя узнаваемыми парами нуклеотидов приводит к «столкновению» в большой бороздке боковой цени СИп237 и гетероциклического основания «выпетливаемого» Су1. Это вызывает деформацию ДНК и «выталкивание» метилируемого С\ч из структуры двойной спирали [41]. Затем остаток 01п237 формирует водородные связи с остатком гуанина, комплементарным «выпетленпому» СуI, стабилизируя полученную структуру.

Н3С

Y 'v Т v

т.. t _о

«АД

ДНК Cys81 ДНК cVs81 ДНК с>'5*1 ДНК

Цитозин Дигидроцитозин 5-Метилцитозин

'■max ~ 271 Ш ' так к 240 ИМ -'■max - 280 ни

Рис, 1.3. Механизм катализа реакции метилирования цитозина С5-ДНК-МТазой [44].

Кроме того, важную роль в процессе «иынетливания» метилируемого Cyt играют связи M.llhal с фосфатными группами ДИК. В структуре M.Hhal (PDB-код 3mht) остатки Thi250 и Ala253 образуют водородные связи с фосфатными группами остатков гуанина, соседних с «выпетливаемым» остатком цитозина. Небольшой мотив M.Hhal от Thr250 до А1а253 действует наподобие пружины; он слегка деформирует остов ДНК, уменьшая, расстояние между фосфатными группами, с которыми он связан (рис. 1.4). В комплексе 3mht это расстояние равно 11.1 А, а в той цепи, где ни один нуклеотид не выведен из структуры двойной спирали, среднее расстояние между атомами фосфора, принадлежащими нуклеотидам, расположенным через один, составляет V2.8 А.

Следом за «выпетлившшем» метилируемого остатка цитозина (почти одновременно) происходит масштабное передвижение каталитической петли (а. о. 81-100 в M.Hhal) в сторону ДНК, обеспечивающее формирование закрытой каталитической полости, в которой «выпетленное» основание располагается рядом с молекулой кофактора [44—46]. В частности, входящий в состав этой петли остаток Ser87 передвигается на 26 А и занимает свободное пространство, оставшееся после выведения метилируемого остатка цитозина из двойной спирали [47]. При взаимодействии M.Hhal с ДИК-дуплексом, не содержащим участок

метилирования, «закрывания» каталитической петли не происходит. По-видимому, этот механизм обеспечивает специфическое узнавание участка метилирования [48].

Рис. 1.4. Участие мотива Thr250-Ala253 M.Hhal в «выпетливанки» внутреннего остатка цитозина в участке метилирования 5r-GCGC-373'-CG£G-5' (на примере комплекса 3mht). Мотив белка Thr250-Ala253 выделен синим цветом, «выпетленный» остаток цитозина - сиреневым цветом, остальные нуклеотиды серые. Атомы азота M.HhaJ и атомы кислорода ДНК. образующие водородные связи, изображены как синие и зеленые шарики соответственно.

Формирование ковалентного аддукта M.Hhal с ДНК происходит за счет нуклеофильной атаки Сб-атома остатка цитозина т иол атом остатка CysSl, который входит в состав консервативного дипептида ProCys (мотив IV) фермента (рис. 1.3). Протонирование N3-атома иитозина, осуществляемое остатком Glul 19, входящим в состав трипептида GluAsnVai (мотив VI), облегчает нуклеофильную атаку тиолата. При этом нарушается ароматическая структура остатка цитозина и изменяются его спектральные свойства, что позволило изучить кинетику данного процесса в реальном времени [44]. Изучение свойств точечных мутантов M.Hhal показало, что замена каталитического остатка Cys8I на какой-либо другой приводит к полной потере ферментативной активности [49, 50], а замена остатка Glul 19 на Ala снижает скорость реакции метилирования в 500 раз [51].

В образовавшемся ковалентном интермедиа« С5-атом цитозина несет отрицательный заряд, и, как следствие, происходит его ал кодирование метильной группой AdoMet. Удаление протона от С5-атома метилированного цитозина и p-элиминпрование Cys приводит к распаду ковалентного ДНК-белкового интермедиата и восстановлению ароматичности модифицированного гетероциклического основания (рис. 1.3). Стоит отметить, что для удаления протона какой-либо из аминокислотных остатков МТазы должен выступать в роли кислоты, но какой именно - до сих пор не установлено [52], Возможно, эту роль играет гидроксид-анион [53].

Если заместителем при С5-атоме является атом трития, а не водорода, то по высвобождению трития можно следить за кинетикой реакции метилирования [35]. В отсутствие AdoMet M.Hhal также катализирует высвобождение трития, что свидетельствует об образовании каталитически активного интермедиата даже без участия кофактора [35], Наличие атома фтора в качестве заместителя при С5-атоме цитозина позволяет зафиксировать конъюгат M.Hhal с этим гетероциклическим основанием [34].

Катализируемый M.Hhal перенос метильной группы характеризуется значением

константы скорости О J 4-0,26 с"1 ¡"38, 39]. Происходящее после этого высвобождение продуктов реакции является скорость-лимитирующей стадией каталитического цикла у M.llhal [38. 39J.

С5-ДНК-МТазы. такие как Hhal и Hpall, являющиеся компонентами систем Р-М, катализируют реакцию метилирования дистрибутивно, покидая ДНК-субстрат после каждого акта метилирования [4, 39]. Это может быть связано с тем, что фаговые ДТТК обычно содержат несколько участков узнавания ферментов системы Р-М. ЭР «сканируют» ДНК по механизму линейной диффузии. Важно, чтобы ЭР достигла участка узнавания в ДНК раньше, чем МТаза, так как метилирование может защитить чужеродную ДНК от гидролиза. Для С5-ДНК-МТазы Sssf [54], не имеющей сопряженных ЭР, Показана способность катализировать реакцию метилирования нескольких участков узнавания в одной молекуле ДНК-субстрата процессивно, то есть не диссоциируя с ДНК после каждого акта метилирования.

Как правило, сродство прокарйотических С5-ДНК-МТаз к ДНК-лигандам в присутствии нереакциоиноспособйых аналогов кофактора AdoMet возрастает в следующем ряду: диметилированная ДНК « неметилированная ДНК < монометилированиая ДНК [4, 5, 55, 56]. Аналогичная закономерность наблюдается и для эукариотичсского фермента Dnmtl. Сродство Dnmll к монометилированным участкам 5-CG-31 выше, чем к неметилированным, в 2-200 раз в зависимости от условий эксперимента [33.57-63]. Dnmtl модифицирует мопометилированные участки узнавания процессивно (в среднем более 50 участков за один акт связывания с ДНК), а немстилированные - дистрибутивно (в основном участки 5'-CCGG-3') [64].

С другой стороны, ДНК-МТазы Dnmt3a и Dnmt3b обеспечивают метилирование ДНК de novo в процессе эмбрионального развития у млекопитающих. Dnmt3a и Dnmt3b метилируют в двутяжевой ДНК в основном динуклеотиды 5'-CG-3'. Кроме того, они способны модифицировать динуклеотиды 5-СА-З' (в 10-100 раз менее эффективно) [65]. Однако эффективность метилирования сильно зависит от последовательности, фланкирующей участок узнавания. Оба этих фермента наиболее эффективно модифицируют участки 5'-RCGY-3', а наименее эффективно - 5-YCGR-3' (где R - пуриновый, a Y -пиримидиновый иуклеозиды): разница в скорости метилирования превышает 500 раз ¡66].

Белок Dnmt3L, также относящийся к семейству Dnmt3, каталитически неактивен, но играет важную роль в качестве стимулятора активности Dnmt3a и Dnmt3b. Аминокислотные последовательности каталитических доменов Dnmt3a и Dnmt3b идентичны на 84 %. Каталитические домены Dnmt3a и Dnmt3b, в отличие от Dnmtl. активны в изолированном виде [32,67]. Dnmt3a метилирует ДНК дистрибутивно, a Dnmt3b - процессивно. Это

объясняют тем, что ДНК-связывающий центр у ПгтИЗЬ имеет больший положительный заряд, чем у ПппЦЗа: в нем находится на 6 больше положительно заряженных аминокислотных остатков [65, 67].

Интересно, что в случае изолированного каталитического домена Опт13а замена остатка цистеина из каталитического мотива РгоСуа не приводит к полной потере ферментативной активности, а лишь снижает ее в 2-6 раз. Доказано, что именно этот остаток цистеина ПппД:За участвует в формировании конъюгата с ДНК, содержащей остаток 5-фторцитозина в участке метилирования. Однако каталитический домен ГЗттиЗа полностью теряет ферментативную активность только в случае замены остатка глутамииовой кислоты из мотива ОЫАшУа). По-видимому, активный центр Ошпва имеет неидеальную конформацию, и остаток цистеина расположен таким образом, что вместо него нуклеофильную атаку на Сб-атом остатка цитозина может осуществлять какой-то другой остаток или гидрокеидный ион. Возможно, для активации ЩгШЗ! требуется ее посттрансляционная модификация или взаимодействие с каким-либо другим белком [68].

ЭттИЗа мыши в присутствии АёоМе! способна осуществлять реакцию автометилирования переносить метальную группу на остаток цистеина в собственном активном центре. Эта реакция является необратимой и протекает сравнительно медленно, ее эффективность увеличивается при добавлении ]Эпт13Ь. В присутствие ДНК-дуплекса, содержащего участки 5'-СО-3', происходит метилирование ДНК, а автометилирование не детектируется. Возможно, автометилирование представляет собой регуляторпый механизм, ипактивирующий «лишние» молекулы фермента в клетке. С другой стороны, оно может быть просто побочной реакцией, протекающей в отсутствие субстрата [69].

Методом РС-А определена структура комплекса С-концевых доменов Отп13а и РпгщЗЬ (РОВ-код 2цгу) [70]. Коплекс представляет собой гетеротеграмер, субъедипицы которого расположены в порядке Опт13Ь-ОпгтДЗа-КтЩЗа-1)птгЗЬ (рис. 1.5а). При этом два активных центра ГЗпттЗа находятся рядом и, по-видимому, могут метилировать одновременно два участка 5'-СО-3', расположенных на расстоянии 8-10 п. н.„ то есть одного поворота двойной спирали, друг от друга. В 12 генах мыши, подверженных материнскому импринтингу, участки 5'-СО-3' расположены именно с такой периодичностью. Кроме того, изучение 21 хромосомы человека показало, что в высокометилированиых областях участки 5'-СО-3'. расположенные с интервалами длиной 9. 18 и 27 п. п., встречаются чаще, чем в неметилиро ванных областях [71]. Возможно, эффективное Метилирование соответствующих областей обеспечивается именно «правильным» расстоянием между участками 5'-СО-3'.

Замена аминокислотных остатков 1)пгп13а и Опт 13[-.. не участвующих в катализе, но важных для образования интерфейса ОппиЗа—1 )пт\31, или 1)пт13а-Ппш13а, подавляет

ферментативную активность. Это свидетельствует о важности комплексообразования с ОппПЗЬ для функционирования БпгтЗа [70]. Расположение комплекса Бпп^а с ОшшЗЬ относительно ДНК неизвестно. Методом докинга бьши получены две модели его структурной организации: в одной из них ДНК «пересекает» этот комплекс (рис. 1.5а) [70], а в другой комплекс располагается по периметру нуклеосомы (рис. 1.5о) [72]. В пользу второго варианта свидетельствует совпадение кривизны поверхностей комплекса Шйай&а с Бпгг^ЗЬ и нуклеосомы, а также тот факт, что Опп^ЗЬ специфически связывает неметилированный остаток Ьу§4 гистона НЗ [73].

Нуклеосома

М-концевзя область гистона НЗ

4

; <= %чл -ргч

РптгЗа

ШР л»

Чг

Опт131_

>16 нм-

Опт13а

^¡л^ *

Рис. 1.5. Структура комплекса, состоящего из С-концевых доменов БгитлЗа и ОптсЗЬ, определенная методом РСА (РОВ-код 2qгv) [70], Модель взаимодействия этого комплекса (а) со свободной ДНК [70] и {о) с ДНК в составе нуклеосомы [72]. Схематично показаны другие домены (РАУШР и СХХС) молекулы Оптва. Расположение пептида из М-хонцевой области гистона НЗ взято из структуры комплекса БшиЗЬ с этим пептидом (РОВ-код 2рус) [73].

1.2. ДНК-метилгрансферазы с цеколькими метилтрансфсразиыми доменами

Некоторые С5-ДНК-МТазы содержат более одного МТазного домена. Иногда это дополнительный С5-МТазный домен, иногда - NÖ-адениновая ДНК-МТаза. В базе данных Pfani из 5065 аминокислотных последовательностей, в которых имеется С5-МТазный домен (PF00145), 676 последовательностей (13%) содержат удвоенный домен PF00145, а 42 последовательности (1 %) - утроенный домен PF00145. Такое строение может быть результатом удвоения одного гена или же слияния двух расположенных рядом генов, кодирующих разные С5-МТазы. Однако па данный момент ни один из этих белков не изучен экс периментал ьно.

Совмещение в одной молекуле способности метилировать С5-атом остатка цитозина и Nö-атом остатка аденина характерно для ДНК-МТаз, узнающих асимметричную нуклеотидную последовательность. Впервые это явление было описано для M.Alw26I из штамма Acinetobacter Iwoffi RTL 26 (участок узнавания 5' -G ТС ТС -3 73' - С AG AG - 5') vi M.Esp31 из штамма Hafnia ahm RFL3 (участок узнавания 5'-CGTCTC-3'/3'-GCAGAG-5') [74]. У обоих этих белков домен, типичный для Ш-адейиновых ДНК-МТаз, расположен в N-конпевой области пошшептидной цени, а домен, типичный для С5-ДНК-МТаз, - в С-концевой области [75]. Способность каждого из этих доменов метилировать свой участок узнавания в отсутствие второго домена экспериментально не изучали.

Ген еще одной ДПК-МТазы с двумя МТазными доменами был сконструирован из генов штамма Helicobacter pylori 26695, кодирующих Д1 ПС-МТазы M.HpyAVIB и M.HpyAVIA [76]. Эти гены расположены таидемно (друг за другом в одинаковой ориентации), и вставка одного нук.иеотида перед стоп-кодоном первого из них приводит к образованию «слитого» гена. Аналогичная мутация произошла естественным образом в штамме И. pylori D27 [77]. M.HpyAVIB метилирует С5-атом остатка цитозина. а M.HpyAVIA - Ы6-атом остатка аденина в последовательности 5'-CCTC-3'/3'-GGAG-5'. В полученном бифункциональном белке С5-М Газный домен расположен в N-концевой области полипептидной цепи, а .\'6-МТазный домен - в С-концевой области, и они метилируют тот же участок узнавания. Изучение кинетики метилирования ДНК и свойств точечных мутантов позволило сделать вывод о том, что в составе «слитого» белка эти домены осуществляют метилирование ДИК независимо друг- от друга, причем каждому из них требуется свой каталитический и AdoMet-связывающий мотивы [76].

1.3. Дополнительные функции С5-циточиновы\ ДНК-метилтраи сфераз у прокариот

1.3.1. Дезаминирование остатков цитозина и 5-метилцитозйна

Из четырех гетероциклических оснований, входящих в состав ДНК, цитозип является наименее стабильным. В двуцеиочечной ДНК при 37 "С дезаминирование цитозииа происходит со скоростью 3-7 * 10 3 с"1 [78, 79]. При такой скорости в геноме человека должно случаться 40-100 дезаминирований в день [801. Скорость дезаминирования остатка цитозииа увеличивается при нарушении его комплементационных взаимодействий с остатком гуанина. Так, в одноцепочечной ДНК она в 140 раз выше, чем в двуцеиочечной [78], а в составе неканонических пар С/С и С/Т - в 8 и 26 раз выше, чем в составе пары С*0 [81]. Это объясняется тем, что реакция дезаминирования начинается с протонирования атома N3 (рис. 1.6) [82, 83]. В составе двуцеиочечной ДНК этот атом образует водородную связь с протоном при N1 -атоме ¡уанина и потому менее доступен для протонирования.

1 vi v vii

Рис. 1.6. Механизм спонтанного гидролитического дезаминирования цитозина [83].

Спонтанное гидролитическое дезаминирование цитозина приводит к образованию урацила - гетероциклического основания, нехарактерного для ДНК. При репликации ДНК урацил образует комплементарную пару с аденином. что впоследствии приводит к мутации С —* U —* Т. В клетках содержится урацил-ДНК-гликочилаза - фермент, который удаляет: урацил и инициирует его замену на цитозип. Несмотря на это транзиции С*0 —► Т*А являются наиболее частыми заменами в геноме как Escherichia coli, так и клеток млекопитающих [84-87].

Скорость дезаминирования остатка 5-мстилцитозина в двуцеиочечной ДИК примерно в 2 раза выше, чем остатка цитозина [79]. Кроме того, дезаминирование 5-метилцитозииа приводит к образованию неканонической пары Т/Ц репарация которой протекает сложнее, чем пары U/G Возможно, поэтому участки ДНК, в которых происходит метилирование цитозина, являются «горячими точками» .мутагенеза С —> Т [84. 88-90].

Показано, что ирокариотнческие МТазы M.Hpail, M.Hhal. M.SssI, Dcrri (из E. coli%

M.EcoRIl и M.SsolI увеличивают in vitro скорость мутагенеза С U i T и ni5C —> Т [91-98]. Некоторые из этих ферментов (M.FIpalI, M.EcoRII и Dein) демонстрируют подобную активность и при экспрессии in vivo - вплоть до 50-крашого увеличения скорости мутагенеза [93,94,99]. Интересно, что нрокариотическая МТаза M.MspI не стимулирует дезаминирование цитозина in vitro, 1-го при экспрессии в клетках Е. coli приводит к мутагенезу примерно в той же степени, что и остальные С5-МТазы [100]. Кроме того, для M.EcoRII показано, что этот фермент может катализировать превращение остатков 5-метилцитозина в остатки тимина [96].

Ферментативный катализ дезаминирования цитозина является побочной реакцией при катализе метилирования (рис. 1.7). Нуклеофильная атака Сб-атома остатка цитозина тиолатом остатка Cys, сопровождающаяся протонировапием Ш-атома остатка цитозина, приводит к образованию коваленткого интермедиата. Ароматическая структура остатка цитозина в этом иптермедиате нарушена, а С5-атом несет отрицательный заряд. Однако в отсутствие кофактора следующий этап реакции метилирования - перенос метильной группы на С5-атом - невозможен. Если в активный центр фермента проникает вода, то может происходить гидроксилирование позиции С4 активированного остатка цитозина. что инициирует реакцию дезаминирования. В итоге аминогруппа заменяется на карбонильный кислород и образуется остаток урацила [101, 102). Наличие AdoMet или Adol ley предотвращает попадание воды в активный центр и потому является ингибитором реакции дезаминирования. Так, точечный мутант M.MpalI. неспособный связывать AdoMet, является особенно эффективным катализатором превращения С —¡> U [99].

Такие аналоги AdoMet как синефунгин и 5 ' а мин о - 51 - д с ю кс и ад ен ози н (АА) могут увеличивать скорость ферментативного дезаминирования, даже в присутствии AdoMet и AdoHcy [97]. По-видимому, они делают возможным протекание реакции по еще одному механизму, Детали этого механизма установлены не полностью. Он включает прямую атаку С4-атома цитозина молекулой воды. Для этого требуется протонирование N3-атома, которое осуществляется МТазой, поскольку является одним из этапов реакции метилирования. Возможны два альтернативных варианта этого механизма (рис. 1.8). В первом из них (механизм А) ги дроке ильная группа АА активирует молекулу воды для атаки С 4-атома цитозина (рис. 1.8а). Во втором варианте (механизм Б) АА играет роль кислоты и протопирует N4-aTOM (рис. 1.86), что облегчает элиминирование аминогруппы в виде иона аммония [102]. Ключевое отличие механизма, основанного на прямой атаке С4-атома цитозина молекулой воды, от остальных состоит в том, что он не требует взаимодействия ДПК-МТазы с Сб-атомом цитозина. Поэтому протекание реакции по этому механизму может катализироваться даже мутантной формой ДНК-МТазы, неспособной катализировать

реакцию метилирования. Э го показано экспериментально для точечного мутанта M.EcoRH, в котором каталитический остаток Cys заменен па Ala [102].

Ии

Cys

Цитоаин I JL

ДНК ^ ®

ДНК

Урацил

Cys

г ос

ДНК

I-

т СО

ДНК

ж

г

Giu

Неизвестное i основание

днк ^ с

Рис. 1,7. Дез амин ированиё цитозина как побочная реакция, катализируемая С5-ДНК-МТазой в отсутствие Ас1оМе[ [52].

Механизм А

"Yv к г-

Н с

Механизм К

■Yv бо

ЪяШ-S л \f

■ ив'

Ш

гДч

■ мн3

-nh,

Ó

А»

N

O'^N'

Рис. 1.8. Дезаминировапие цитозина, катализируемое синефунгйнём и 5'-амино-5'-дезоксиадеиозином (АА). Предполагаемый механизм реакции в случае, если синефунгин или АА выступает в роли основания (механизм А) или кислоты (механизм Б) [102].

Как для метилирования, так и для дезамипирования требуется «выиетливание» остатка цитозина. Поэтому чем дольше цитозин находится вне двойной спирали, тем с большей скоростью протекают обе эти реакции. Скорость обмена трития, находящегося в качестве заместителя при С5-атоме цитозина, на водород используется для оценки скорости образования ко валентного аддукта. который является общим интермедиатом в реакциях метилирования и дезамипирования (рис. 1.3 и 1.7). У РпшИ мыши в отсутствие кофактора такой обмен происходит гораздо медленнее, чем у прокариотической М.НЬа! [103].

Следовательно, в отсутствие кофактора Dnmtl формирует ковал ентный аддукт с гораздо меньшей вероятностью и потому является значительно менее мутагенной, чем M.Hlial [103]. I ^против, прокариотические МТазы именно в отсутствие кофактора демонстрируют эффективный катализ дезамигшрования [91. 97, 100].

Разница в скорости образования ковалентного аддукта в отсутствие кофактора может отражать разницу в физиологических функциях эукариотических и прокариотических ферментов. У прокариот в случае дефицита питательных веществ образуется внутриклеточный недостаток AdoMet. Мутации, вызванные дезаминированием цигозина, не обязательно оказываются летальными для бактериальной клетки и при этом увеличивают вероятность избежать гидролиза клеточной ДНК фаговыми эндонуклеазами. Таким образом, способность С5-МТазы катализировать дезаминироиание может оказаться физиологическим преимуществом для бактериальной клетки. С другой стороны, клетки млекопитающих вряд ли могут извлечь пользу из мутагенеза, вызванного дезаминированием цигозина. Поэтому у них выработались механизмы, обеспечивающие низкую скорость дезаминирования [104].

1.3.2. Эндонуклеазная активность

В базе данных Pfam обнаружены несколько различных эндонуклеазных доменов, которые могут существовать в составе одного полипептида с С5-МТазным доменом (табл. 1.1). Число таких аминокислотных последовательностей невелико (в общей сложности менее 1 % от всех последовательностей, содержащих С5-МТазный домен). Ни один из этих белков не изучен экспериментально.

Системы Р-М типа II, в которых ЭР и М'Газа представляют собой единую пол и пептидную цепь, относятся к подтипам IIC и IIG [105]. На сегодняшний день в базе данных REBASE (http ://re base. neb. со m/rebase/rebase. html) среди охарактеризованных биохимически представителей подтипов ПС и I1G встречаются только Nó-адениновые Д11К-МТазы. Однако не исключено, что со временем среди полипептидов, несущих одновременно МТазную и эндонуклеазную активность, будут обнаружены и С5-Д1 IK-М'Газы.

1.3.3. Топощомеразная активность

Известны две прокариотические С5-ДНК-МТазы^ способные проявлять топоизомеразную активность, - M.Sssl из штамма Spiroplasma MQI и M.MspI из штамма Moraxella species. Как уже упоминалось, M.Sssl не является частью системы Р-М (в геноме спироплазмы отсутствует сопряженная ЭР). Она метилирует остатки цигозина в последовательности 5 '-CG-3 73 '-GC-5как и эу кари оти чес кие МТазы [106].

Добавление ионов Mg2 до концентрации 10 мМ приводит к релаксации отрицательно

су перекрученных плазм ид под действием M.SssI. В результате образуется набор плазмид с различной степенью суперспирализации, аналогичный продуктам реакции с топоюомеразой I из тимуса теленка. Добавление А'ГФ не влияет на топоизомеразпую активность M.SssI. Поскольку топоизомеразы типа ¡1 требуют А'ГФ для ферментативной активности, это позволяет отнести M.SssI к гопоизомеразам типа I [107]. МТазная и топоизомеразная активности M.SssI функционально разделены, поскольку для проявления первой из них требуется наличие в реакционной смеси AdoMet, а второй - ионов Mg2"1".

Аминокислотная последовательность консервативного мотива IV M.SssJ имеет сходство с гопоизомеразам и (рис. 1,9 а). В частности, в этом мотиве расположен остаток тирозина, который у тоноизомераз участвует в каталитическом акте. Сходство с топоизомеразами также наблюдается в консервативном мотиве VIII M.SssI (рис. 1.96). Более детальный анализ структур, отвечающих за топоизомеразную активность M.SssI, не проводился.

Почему в одной молекуле M.SssI сочетаются МТазная и топоизомеразная активности? Возможны различные объяснения. Во-первых, топоизомеразная активность может изменять восприимчивость ДНК к метилированию, облегчая или усложняя «выпетливапие» остатка цитозипа ири изменении степени суперсиирализации. Во-вторых, метилирование последовательностей 5'-CG-3f с помощью M.SssI может вызывать изменение структуры ДНК. Например, при высокой отрицательной суперспирализации участок ДНК. содержащий большое количество метилированных последовательностей 5'~CG-3', может переходить в Z-форму, и для возвращения ДНК в B-форму может потребоваться топоизомеразная активность. В-третьих, возможно, что изменения топологии ДНК влияют на экспрессию генов у егшроплазм. Наконец, две активности могут совмещаться в одном белке для «экономии места» в геноме. Род Spiroplasma относится к ми ко плазмам — клеточным организмам, имеющим самый маленький геном (от 600 до 1800 т. п. и.). Для сравнения можно привести размер генома бактериофага Т4 - 165 т. п. н. и генома Е. coli - 4600 т. п. п. [107].

M.Mspl входит в состав системы Р-М Mspl и метилирует внешний остаток цитозина в последовательности 5'-CCOG-3V3'-GGCC-5' [109]. Интересной особенностью этой МТазы является то, что при связывании с участком метилирования она изгибает ДНК па 142 ± 4° (как показано на ДНК-дуплексе длиной 127 п. н.). Такой значительный изгиб ДИК неизвестен больше пи для одной МТазы [ПО].

В отличие от M.SssI. M.Mspl обладает топоизомеразной активностью за счет своей N-конце вой области (107 а. о.), расположенной перед консервативным мотивом I, Сходство с аминокислотными последовательностями тоноизомераз проявляется во фрагменте 32-98 а. о. (рис. 1.%), а также в консервативном мотиве VIII, как и у M.SssI (рис. 1.9(7), но не в

консервативном мотиве IV. Делеционная форма M.MspI. в которой отсутствовали первые 34 а. о., сохраняла способность метилировать ДНК, однако утрачивала топоизомеразную активность. Мутантиые белки M.MspI(W34A) и M.MspI(Y74A) также не проявляли топоизомеразную активность, но сохраняли способность метилировать ДИК-субстраг [108].

T.SC3 T.ßfA

Т.бсо T.SyA M.Sssl

Q KG V \ sly

D KG Y L sW

Е AG У r ТВ

Е ftG F 1 TW

|Nj 1 D LL Tfr

PfiTETBlTEPHAMD

PRTQD№ RTDSTN ... RR D 8 V H S FPCQ0-

та

L

i,

SOG

sao

мТазы i *0 xbxGG FPCQ x - FS* x G x

Т.Есо N АН Y EVLPG- M E Щ V (si) домен l

T.Dro M ¡RE FG É CMlDGH к E К 1 (sea

T.Mou L KE YG P CVMDNH R E R 1 (341)

Т. Hura L KE YG F С 1 MDNH К E R (338)

T.Vac RR QY (f YGKMHV Q N R (70)

T.SVf T RD T i f? t KVH RVTD К T (87)

(SSO T.Ara M R E TD Y YTKPQF R E N £ (410)

(гее) Резольва:аТп21 GAFAE F -ERA L í R E R O (117)

(SM) домен III

(Si)! M.Sssl L N A AD 1 - GS 3 QA R R R V МОТИВ VIII

(ие) мотаа IV M.Mspl L D ASH 1 -G1PQK R К n F мотив VII)

консенсус мотива [V МТЗЗЫ Ь z А * X i -bbPQx a Г R b консенсус мотива Vid

¡ШУКМК дамк ШШ

шшдак

ШВХШ jR'v'KHUNT

»©да

iBXYMSMK1. 1ШСШ BIRK»

M. Kipt

•isa итш*

jr.. laevis "-Щ 450 К HbsmhiB 5С0 Г. elm&ans

Р,.

са г J ft U

435 S. pntt'-л;

O. merlannjfaster F. íüiCipazur 5. C8»»Í.íl'M 4C2 :?.

Ó

it

•MP РТ: рт.

QUtsSpjMKTi

ртйМещз

iFTKA¡f||&DIí

ШШс

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Рязанова, Александра Юрьевна

выводы

1. Впервые получены структуры низкого разрешения ДНК-метилтрансферазы SsoII и ее комплекса с 15-звенным ДНК-дуплексом, содержащим участок метилирования, в присутствии 5,-аденозил-/,-гомоцистеииа. ДНК-метилтрансфераза SsoII является мономером в апо-форме и в комплексе с метилируемой ДНК. Показана компактизация молекулы белка при связывании с ДНК-субстратом.

2. Экспериментально доказано, что ДНК-метилтрансфераза SsoII взаимодействует с регуляторным участком в составе межгенной области системы рестрикции-модификации SsoII с образованием комплекса, состоящего из двух молекул белка и одного ДНК-дуплекса. В этом комплексе остаток Cysl42 каталитического центра ДНК-метилтрансферазы SsoII сближен с ДНК, фланкирующей регуляторный участок.

3. Установлено, что делеционный мутант, представляющий собой N-концевую область SsoII-подобных ДНК-метилтрансфераз, сохраняет ярко выраженную вторичную структуру и способен специфически связывать ДНК, содержащую регуляторный участок. Продемонстрирована высокая подвижность линкера, соединяющего N-концевую область ДНК-метилтрансферазы SsoII (аминокислотные остатки 1-71) и область этого белка, ответственную за метилирование.

4. Впервые показано, что метилтрансферазная и регуляторная активности SsoII являются взаимоисключающими: комплексообразование этого белка с регуляторным участком предотвращает его связывание с участком метилирования. Эффективное метилирование клеточной ДНК обеспечивается метилтрансферазой SsoII за счет большей скорости связывания с участком метилирования и за счет значительного избытка участков метилирования относительно регуляторных участков.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Рязанова, Александра Юрьевна, 2012 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Radhakrishnan S.K., Viollier P. Two-in-one: bifunctional regulators synchronizing developmental events in bacteria. // Trends Cell Biol. 2012. V. 22. P. 14-21.

2. Karyagina A., Shilov I., Tashlitskii V., Khodoun M., Vasil'ev S., Lau P.C.K., Nikolskaya I. Specific binding of SsoII DNA methyltransferase to its promoter region provides the regulation of SsoII restriction-modification gene expression. II Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 2114—2120.

3. Shilov I., Tashlitsky V., Khodoun ML, Vasil'ev S., AlekseevY., KuzubovA., KubarevaE., Karyagina A. DNA-methyltransferase SsoII interaction with own promoter region binding site. // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 2659-2664.

4. Jeltsch A. Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases. // ChemBioChem. 2002. V. 3. P. 274-293.

5. Громова E.C., Хорошаев A.B. Прокариотические ДНК-метилтрансферазы: структура и механизм взаимодействия с ДНК. // Молекуляр. биология. 2003. Т. 37. С. 1-15.

6. Miranda Т.В., Jones Р.А. DNA methylation: the nuts and bolts of repression. Il J. Cell. Physiol. 2007. V. 213. P. 384-390.

7. Lande-Diner L., Zhang J., Ben-Porath I., Amariglio N., Keshet I., Hecht M., Azuara V., Fisher A.G., Rechavi G., Cedar H. Role of DNA methylation in stable gene repression. // J. Biol. Chem. 2007. V. 282. P. 12194-12200.

8. Délavai K., Feil R. Epigenetic regulation of mammalian genomic imprinting. // Curr. Opin. Genet. Dev. 2004. V. 14. P. 188-195.

9. Ноге T.A., Rapkins R.W., Graves J.A. Construction and evolution of imprinted loci in mammals. // Trends Genet. 2007. V. 23. P. 440-448.

10. Sha K. A mechanistic view of genomic imprinting. // Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2008. V. 9. P. 197-216.

11. Heard E. Recent advances in X-chromosome inactivation. // Curr. Opin. Cell. Biol 2004. V. 16. P. 247-255.

12. Chang S.C., Tucker T., Thorogood N.P., Brown C.J. Mechanisms of X-chromosome inactivation. II Front Biosci. 2006. V. 11. P. 852-866.

13. YenZ.C., Meyer I.M., Karalic S., Brown C.J. A cross-species comparison of X-chromosome inactivation in Eutheria. // Genomics. 2007. V. 90. P. 453—463.

14. Straub T., Becker P.B. Dosage compensation: the beginning and end of generalization. // Nat. Rev. Genet. 2007. V. 8. P. 47-57.

15. Howard G., Eiges R., GaudetF., JaenischR., Eden A. Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice. // Oncogene. 2008. V. 27. P. 404-408.

16. Yoder J.A., Soman N.S., Verdine G.L., Bestor T.H. DNA (cytosine-5)-methyltransferases in mouse cells and tissues. Studies with a mechanism-based probe. // J. Mol. Biol. 1997. V. 270. P. 385-395.

17. Fitzpatrick D.R., Wilson C.B. Methylation and demethylation in the regulation of genes, cells, and responses in the immune system. // Clin. Immunol. 2003. V. 109. P. 37-45.

18. Sweatt J.D. Experience-dependent epigenetic modifications in the central nervous system. // Biol. Psychiatry. 2009. V. 65. P. 191-197.

19. McCarthy M.M., Auger A.P., Bale T.L., De Vries G.J., Dunn G.A., Forger N.G., Murray E.K., Nugent B.M., Schwarz J.M., Wilson M.E. The epigenetics of sex differences in the brain. II J. Neurosci. 2009. V. 29. P. 12815-12823.

20. Hendrich B. Methylation moves into medicine. // Curr. Biol. 2000. V. 10. P. R60-63.

21. Robertson K.D. DNA methylation and human disease. // Nat. Rev. Genet. 2005. V. 6. P. 597-610.

22. Feinberg A.P. Phenotypic plasticity and the epigenetics of human disease. // Nature. 2007. V. 447(7143) :433-440.

23. Jones P.A., Baylin S.B. The epigenomics of cancer. // Cell. 2007. V. 128. P. 683-692.

24. Feinberg A.P., Tycko B. The history of cancer epigenetics. // Nat. Rev. Cancer. 2004. V. 4. P. 143-153.

25. Jones P.A., Baylin S.B. The fundamental role of epigenetic events in cancer. // Nat. Rev. Genet. 2002. V. 3. P. 415^128.

26. Malone T., Blumenthal R.M., Cheng X. Structure-guided analysis reveals nine sequence motifs conserved among DNA amino-methyltransferases, and suggests a catalytic mechanism for these enzymes. II J. Mol. Biol. 1995. V. 253. P. 618-632.

27. Cheng X., Roberts R.J. AdoMet-dependent methylation, DNA methyltransferases and base flipping. // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 3784-3795.

28. O'Gara M., Klimasauskas S., Roberts R.J., Cheng X. Enzymatic C5-cytosine methylation of DNA: mechanistic implications of new crystal structures for Hhal methyltransferase-DNA-AdoHcy complexes. // J. Mol. Biol. 1996. V. 261. P. 634-645.

29. Song J., Rechkoblit O., Bestor T.H., Patel D.J. Structure of DNMT1-DNA complex reveals a role for autoinhibition in maintenance DNA methylation. // Science. 2011. V. 331. P. 1036-1040.

30. Zimmermann C., Guhl E., Graessmann A. Mouse DNA methyltransferase (MTase) deletion

mutants that retain the catalytic domain display neither de novo nor maintenance methylation activity in vivo. II Biol. Chem. 1997. V. 378. P. 393-405.

31. Margot J.B., Aguirre-Arteta A.M., Di Giacco B.V., Pradhan S., Roberts R.J., Cardoso M.C., Leonhardt H. Structure and function of the mouse DNA methyltransferase gene: Dnmtl shows a tripartite structure. II J. Mol. Biol. 2000. V. 297. P. 293-300.

32. Margot J.B., Ehrenhofer-Murray A.E., Leonhardt H. Interactions within the mammalian DNA methyltransferase family. // BMC Mol. Biol. 2003. V. 4. P. 7.

33. FatemiM., Hermann A., Pradhan S., JeltschA. The activity of the murine DNA methyltransferase Dnmtl is controlled by interaction of the catalytic domain with the N-terminal part of the enzyme leading to an allosteric activation of the enzyme after binding to methylated DNA. II J. Mol. Biol 2001. V. 309. P. 1189-1199.

34. Klimasauskas S., Kumar S., Roberts R. J., Cheng X. Hhal methyltransferase flips its target base out of DNA helix. // Cell. 1994. V. 76. P. 357-369.

35. Wu J.C., Santi D.V. Kinetic and catalytic mechanism of Hhal methyltransferase. // J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 4778-4786.

36. Klimasauskas S., Szyperski T., Serva S., Wiithrich K. Dynamic modes of the flipped-out cytosine during Hhal methyltransferase-DNA interactions in solution. // EMBO J. 1998.

V. 17. P. 317-324.

37. Wang P., BrankA.S., Banavali N.K., Nicklaus M.C., MarquezV.E., Christman J.K., MacKerell A.D. Use of oligodeoxyribonucleotides with conformationally constrained abasic sugar targets to probe the mechanism of base flipping by Hhal DNA (cytosine C5)-

methyltransferase. II J. Am. Chem. Soc. 2000. V. 122. P. 12422-12434.

38. Lindstrom W.M. Jr., Flynn J., Reich N.O. Reconciling structure and function in Hhal DNA cytosine-C-5 methyltransferase. IIJ. Biol Chem. 2000. V. 275. P. 4912-4919.

39. Yilkaitis G., Merkiene E., Serva S., Weinhold E., Klimasauskas S. The mechanism of DNA cytosine-5 methylation. Kinetic and mutational dissection of Hhal methyltransferase. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 20924-20934.

40. Svedruzic Z.M., Reich N.O. The mechanism of target base attack in DNA cytosine carbon 5 methylation. // Biochemistry. 2004. V. 43. P. 11460-11473.

41. Daujotyte D., Serva S., Vilkaitis G., Merkiene E., Venclovas C., Klimasauskas S. Hhal DNA methyltransferase uses the protruding Gln237 for active flipping of its target cytosine. //

Structure. 2004. V. 12. P. 1047-1055.

42. HortonJ.R., RatnerG., BanavaliN.K., HuangN., ChoiY., MaierM.A., MarquezV.E., MacKerell A.D., Cheng X. Caught in the act: visualization of an intermediate in the DNA

43. Merkiene E., Klimasauskas S. Probing a rate-limiting step by mutational perturbation of AdoMet binding in the Hhal methyltransferase. // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. P. 307315.

44. Gerasimaite R., Merkiene E., Klimasauskas S. Direct observation of cytosine flipping and covalent catalysis in a DNA methyltransferase. // Nucleic Acids Res. 2011. V. 39. P. 37713780.

45. Estabrook R.A., Nguyen T.T., Fera N., Reich N.O. Coupling sequence-specific recognition to DNA modification. II J. Biol. Chem. 2009. V. 284. P. 22690-22696.

46. Matje D.M., Coughlin D.F., Connolly B.A., Dahlquist F.W., Reich N.O. Determinants of precatalytic conformational transitions in the DNA cytosine methyltransferase M.Hhal. // Biochemistry. 2011. V. 50. P. 1465-1473.

47. Estabrook R.A., Lipson R., Hopkins B., Reich N. The coupling of tight DNA binding and base flipping: identification of a conserved structural motif in base flipping enzymes. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 31419-31428.

48. Estabrook R.A., Reich N. Observing an induced-fit mechanism during sequence-specific DNA methylation. II J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 37205-37214.

49. Mi S., Roberts R.J. The DNA binding affinity of Hhal methylase is increased by a single amino acid substitution in the catalytic center. // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 24592464.

50. Youngblood B., Shieh F.K., Buller F., Bullock T., Reich N.O. S-adenosyl-L-methionine-dependent methyl transfer: observable precatalytic intermediates during DNA cytosine methylation. // Biochemistry. 2007. V. 406. P. 8766-8775.

51. Shieh F.K., Reich N.O. AdoMet-dependent methyl-transfer: Glull9 is essential for DNA C5-cytosine methyltransferase M.Hhal. II J. Mol. Biol. 2007. V. 373. P. 1157-1168.

52. Xu F„ Mao C., Ding Y., Rui C„ Wu L„ Shi A., Zhang H., Zhang L„ Xu Z. Molecular and enzymatic profiles of mammalian DNA methyltransferases: structures and targets for drugs. // Curr. Med. Chem. 2010. V. 17. P. 4052-4071.

53. Zhang X., BruiceT.C. The mechanism of M.Hhal DNA C5 cytosine methyltransferase enzyme: a quantum mechanics/molecular mechanics approach. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006. V. 103. P. 6148-6153.

54. Renbaum P., Razin A. Mode of action of the Spiroplasma CpG methylase M.SssI. // FEBS Lett. 1992. V. 313. P. 243-247.

55. Dry den D.T.F. Bacterial DNA methyltransferases. // In: S-Adenosylmethionine-dependent

methytransferases: structures and functions. / Eds. Cheng X., Blumenthal R.M. Singapore: World Scientific Publishing. 1999. P. 283-340.

56. O'GaraM., Roberts R.J., Cheng X. A structural basis for the preferential binding of hemimethylated DNA by Hhal DNA methyltransferase. // J. Mol. Biol. 1996. V.263. P. 597-606.

57. Christman J.K., Sheikhnejad G., Marasco C.J., Sufrin J.R. 5-Methyl-2'-deoxycytidine in single-stranded DNA can act in eis to signal de novo DNA methylation. // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 1995. V. 92. P. 7347-7351.

58. Tollefsbol T.O., Hutchison C.A. 3rd. Mammalian DNA (cytosine-5)-methyltransferase expressed in Escherichia coli, purified and characterized. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 18543-18550.

59. Tollefsbol T.O., Hutchison C.A. 3rd. Control of methylation spreading in synthetic DNA sequences by the murine DNA methyltransferase. H J. Mol. Biol. 1997. V. 269. P. 494-504.

60. FlynnJ., Glickman J.F., Reich N.O. Murine DNA cytosine-C5 methyltransferase: pre-steady- and steady-state kinetic analysis with regulatory DNA sequences. // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 7308-7315.

61. Pradhan S., Bacolla A., Wells R.D., Roberts R.J. Recombinant human DNA (cytosine-5) methyltransferase. I. Expression, purification, and comparison of de novo and maintenance methylation. II J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 33002-33010.

62. Fatemi M., Hermann A., Gowher H., Jeltsch A. Dnmt3a and Dnmtl functionally cooperate during de novo methylation of DNA. II Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. P. 4981^1984.

63. Hermann A., GoyalR., Jeltsch A. The Dnmtl DNA-(cytosine-C5)-methyltransferase methylates DNA processively with high preference for hemimethylated target sites. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 48350-48359.

64. Goyal R., Reinhardt R., Jeltsch A. Accuracy of DNA methylation pattern preservation by the Dnmtl methyltransferase. // Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P. 1182-1188.

65. Gowher H., Jeltsch A. Enzymatic properties of recombinant Dnmt3a DNA methyltransferase from mouse: the enzyme modifies DNA in a non-processive manner and also methylates non-CpG sites. II J. Mol. Biol. 2001. V. 309. P. 1201-1208.

66. Handa V., Jeltsch A. Profound flanking sequence preference of Dnmt3a and Dnmt3b mammalian DNA methyltransferases shape the human epigenome. // J. Mol. Biol. 2005. V. 348. P. 1103-1112.

67. Gowher H., Jeltsch A. Molecular enzymology of the catalytic domains of the Dnmt3a and Dnmt3b DNA methyltransferases. II J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 20409-20414.

68. Reither S., Li F., Gowher H., Jeltsch A. Catalytic mechanism of DNA-(cytosine-C5)-methyltransferases revisited: covalent intermediate formation is not essential for methyl

group transfer by the murine Dnmt3a enzyme. // J. Mol. Biol. 2003. V. 329. P. 675-684.

69. Siddique A.N., Jurkowska R.Z., Jurkowski T.P., Jeltsch A. Auto-methylation of the mouse DNA-(cytosine C5)-methyltransferase Dnmt3a at its active site cysteine residue. // FEBSJ. 2011. V. 278. P. 2055-2063.

70. JiaD., Jurkowska R.Z., Zhang X., Jeltsch A., Cheng X. Structure of Dnmt3a bound to Dnmt3L suggests a model for de novo DNA methylation. // Nature. 2007. V. 449. P. 248251.

71. Zhang Y., RohdeC., Tierling S., Jurkowski T.P., BockC., SantacruzD., Ragozin S., Reinhardt R., Groth M., Walter J., Jeltsch A. DNA methylation analysis of chromosome 21 gene promoters at single base pair and single allele resolution. // PLoS Genet. 2009. V. 5. P. el000438.

72. Cheng X., Blumenthal R.M. Mammalian DNA methyltransferases: a structural perspective. // Structure. 2008. V. 16. P. 341-350.

73. Ooi S.K., Qiu C., Bernstein E., Li K., Jia D., Yang Z., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Lin S.P., Allis C.D., Cheng X., Bestor T.H. Dnmt3L connects unmethylated lysine 4 of histone H3 to de novo methylation of DNA. // Nature. 2007. V. 448. P. 714-717.

74. BitinaiteJ., Maneliene Z., Menkevicius S., Klimasauskas S., ButkusV., JanulaitisA. Alw26I, Eco31I and Esp3I - type lis methyltransferases modifying cytosine and adenine in complementary strands of the target DNA. // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 4981-4985.

75. Bitinaite J., Mitkaite G., Dauksaite V., Jakubauskas A., Timinskas A., Vaisvila R., Lubys A., JanulaitisA. Evolutionary relationship of Alw26I, Eco31I and Esp3I, restriction endonucleases that recognise overlapping sequences. // Mol. Genet. Genomics. 2002. V. 267. P. 664-672.

76. Kumar R., Rao D.N. A nucleotide insertion between two adjacent methyltransferases in Helicobacter pylori results in a Afunctional DNA methyltransferase. // Biochem. J. 2011. V. 433. P. 487-495.

77. Chan S.H., Opitz L., Higgins L., O'Loane D., Xu S.Y. Cofactor requirement of HpyAV restriction endonuclease. // PLoS One. 2010. V. 5. P. e9071.

78. Frederico L.A., Kunkel T.A., Shaw B.R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 2532-2537.

79. Shen J.-C., Rideout W.M. 3rd, Jones P.A. The rate of hydrolytic deamination of 5-methylcytosine in double-stranded DNA. // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 972-976.

80. Beletskii A., Bhagwat A.S. Transcription-induced mutations: increase in C to T mutations in the nontranscribed strand during transcription in Escherichia coli. II Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996. V. 93. P. 13919-13924.

81. Frederico L.A., Kunkel T.A., Shaw B.R. Cytosine deamination in mismatched base pairs. // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 6523-6530.

82. Shapiro R., Klein R.S. The deamination of cytidine and cytosine by acidic buffer solutions. Mutagenic implications. // Biochemistry. 1966. V. 5. P. 2358-2362.

83. Garrett E.R., TsauJ. Solvolyses of cytosine and cytidine. // J. Pharm. Sei. 1972. V. 61. P. 1052-1061.

84. Coulondre C., Miller J.H., Farabaugh P.J., Gilbert W. Molecular basis of base substitution hotspots in Escherichia coli. I/Nature. 1978. V. 274. P. 775-780.

85. de Jong P.J., Grosovsky A.J., GlickmanB.W. Spectrum of spontaneous mutation at the APRT locus of Chinese hamster ovary cells: an analysis at the DNA sequence level. // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 1988. V. 85. P. 3499-3503.

86. HallidayJ.A., GlickmanB.W. Mechanisms of spontaneous mutation in DNA repair-proficient Escherichia coli. // Mutat. Res. 1991. V. 250. P. 55-71.

87. Douglas G.R., Gingerich J.D., Gossen J.A., Bartlett S.A. Sequence spectra of spontaneous lacZ gene mutations in transgenic mouse somatic and germline tissues. // Mutagenesis. 1994. V. 9. P. 451-458.

88. Lieb M. Spontaneous mutation at a 5-methylcytosine hotspot is prevented by very short patch (VSP) mismatch repair. // Genetics. 1991. V. 128. P. 23-27.

89. Cooper D.N., Youssoufian H. The CpG dinucleotide and human genetic disease. // Hum. Genet. 1988. V. 78. P. 151-155.

90. Greenblatt M.S., Bennett W.P., Hollstein M., Harris C.C. Mutations in the p53 tumor suppressor gene: clues to cancer etiology and molecular pathogenesis. // Cancer Res. 1994. V. 54. P. 4855-4878.

91. ShenJ.-C., RideoutW.M., Jones P.A. High frequency mutagenesis by a DNA methyltransferase. // Cell. 1992. V. 71. P. 1073-1080.

92. Wyszynski M., Gabbara S., Bhagwat A.S. Cytosine deamitations catalysed by DNA cytosine methyltransferases are unllikely to be the major cause of mytational hot-spots at sites of cytosine methylation in E. coli. //Proc. Natl. Acad Sei. USA. 1994. V. 91. P. 1574-1578.

93. BandaruB., Wyszynski M., Bhagwat A.S. Hpall methyltransferase is mutagenic in Escherichia coli. // J. Bacteriol. 1995. V. 177. P. 2950-2952.

94. BandaruB., GopalJ., BhagwatA.S. Overproduction of DNA cytosine methyltransferase causes methylation and C —> T mutations at non-canonical sites. // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 7851-7859.

95. YangAS., ShenJ.-C., ZinggJ.-M., Mi S„ Jones P.A. Hhal and Hpall DNA methyltransferases bind DNA mismatches, methylate uracil and block DNA repair. //

Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 1380-1387.

96. Yebra M.J., Bhagwat A.S. A cytosine methyltransferase converts 5-methylcytosine in DNA to thymine. II Biochemistry. 1995. V. 34. P. 14752-14757.

97. ZinggJ.-M., ShenJ.-C., YangA.S., RapoportH., Jones P.A. Methylation inhibitors can increase the rate of cytosine deamination by (cytosine-5)-DNA methyltransferase. // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 3267-3275.

98. Воробьева O.B. С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза SsoII как бифункциональный белок: изучение взаимодействия с участком метилирования и с промоторной областью генов системы рестрикции-модификации SsoII. // Дис. ... канд. хим. наук. Москва. 2004. 157 с.

99. ShenJ.-C., ZinggJ.-M., YangA.S., SchmutteC., Jones P.A. A mutant Hpall methyltransferase functions as a mutator enzyme. // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 4275-4282.

100. Zingg J.-M., Shen J.-C., Jones P.A. Enzyme-mediated cytosine deamination by the bacterial methyltransferase M.MspI. // Biochem. J. 1998. V. 332. P. 223-230.

101. Selker E.U, Premeiotic instability of repeated sequences in Neurospora crassa. II Annu. Rev. Genet. 1990. V. 24. P. 579-613.

102. Sharath A.N., Weinhold E., Bhagwat A.S. Reviving a dead enzyme: cytosine deaminations promoted by an inactive DNA methyltransferase and an S-adenosylmethionine analogue. // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 14611-14616.

103. Svedruzic Z.M., Reich N.O. DNA cytosine C5 methyltransferase Dnmtl: catalysis-dependent release of allosteric inhibition. // Biochemistry. 2005. V. 44. P. 9472-9485.

104. Svedruzic Z.M. Mammalian cytosine DNA methyltransferase Dnmtl: enzymatic mechanism, novel mechanism-based inhibitors, and RNA-directed DNA methylation. // Curr. Med. Chem. 2008. V. 15. P. 92-106.

105. Roberts R.J., Beifort M., Bestor Т., Bhagwat A.S., Bickle T.A., Bitinaite J., Blumenthal R.M., Degtyarev S.Kh., Dryden D.T., Dybvig K., Firman K., Gromova E.S., Gumport R.I., Haiford S.E., Hattman S., Heitman J., Hornby D.P., Janulaitis A., Jeltsch A., Josephsen J., Kiss A., Klaenhammer T.R., Kobayashi I., Kong H., Krüger D.H., Lacks S., Marinus M.G., Miyahara M., Morgan R.D., Murray N.E., Nagaraja V., Piekarowicz A., Pingoud A., Raleigh E., Rao D.N., Reich N., Repin V.E., Selker E.U., Shaw P.C., Stein D.C., Stoddard B.L., Szybalski W., Trautner T.A., Van Etten J.L., Vitor J.M., Wilson G.G., Xu S.Y. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. II Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 1805-1812.

106. Renbaum P., Abrahamove D., Fainsod A., Wilson G.G., Rottem S., Razin A. Cloning, characterization, and expression in Escherichia coli of the gene coding for the CpG DNA

methylase from Spiroplasma sp. strain MQ1 (M.SssI). // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 1145-1152.

107. Matsuo K., Silke J., Gramatikoff K., Schaffner W. The CpG-specific methylase SssI has topoisomerase activity in the presence of Mg2+. // Nucleic Acids Res. 1994, V. 22. P. 53545359.

108. Bhattacharya S.K., Dubey A.K. The N-terminus of m5C-DNA methyltransferase Mspl is involved in its topoisomerase activity. // Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. P. 2491-2497.

109. Wälder R.Y., Langtimm С.J., Catterjee R., Walder J.A. Cloning of the Mspl modification enzyme. II J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 1235-1241.

110. Dubey A.K., Bhattacharya S.K. Angle and locus of the bend induced by the Mspl DNA methyltransferase in a sequence-specific complex with DNA. // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 2025-2029.

111. Brennan R.G., Matthews B.W. The helix-turn-helix DNA binding motif. // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 1903-1906.

112. Luscombe N.M., Austin S.E., Berman H.M., Thornton J.M. An overview of the structures of protein-DNA complexes. // Genome Biol. 2000. V. 1. P. reviewsOOl.

ИЗ. Нагорных M.O., Богданова E.C., Проценко A.C., Захарова M.B., Северинов K.B. Регуляция экспрессии генов систем рестрикции-модификации второго типа. // Генетика. 2008. Т. 44. С. 1-10.

114. ProtsenkoA., ZakharovaM., NagornykhM., SoloninA., SeverinovK. Transcription regulation of restriction-modification system Ecll8kl. // Nucleic Acids Res. 2009. V. 37. P. 5322-5330.

115. Stankevicius K., Timinskas A. Expression autoregulation of the Eco47II methyltransferase gene. // Biologija. 1996. V. 0. P. 54-56.

116. Som S., Friedman S. Regulation of EcoRII methyltransferase: effect of mutations on gene expression and in vitro binding to the promoter region. // Nucleic Acids Res. 1994. V. 24. P. 5347-5353.

117. Som S., Friedmans. Autogenous regulation of the EcoRII methylase gene at the trancriptional level: effect of 5-azacytidine. /IEMBOJ. 1993. V. 12. P. 4297^1303.

118. Friedmans., Som S. Induction of EcoRII methyltransferase: evidence for autogenous control. II J. Bacteriol. 1993. V. 175. P. 6293-6298.

119. Som S., Friedman S. Characterization of the intergenic region which regulates the Mspl restriction-modification system. H J. Bacteriol. 1997. V. 179. P. 964-967.

120. Butler D., Fitzgerald G.F. Transcriptional analysis and regulation of expression of the ScrFI restriction-modification system of Lactococcus lactis subsp. cremoris UC503 // J. Bacteriol.

2001. V. 183. P. 4668^1673.

121. O'Driscoll J., Glynn F., Cahalane 0., O'Connell-Motherway M., Fitzgerald G.F., van Sinderen D. Lactococcal plasmid pNP40 encodes a novel, temperature-sensitive restriction-modification system. // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. P. 5546-5556.

122. O'Driscoll J., Fitzgerald G.F., van Sinderen D. A dichotomous epigenetic mechanism governs expression of the LlaJI restriction/modification system. // Mol. Microbiol. 2005. V. 57. P. 1532-1544.

123. Воробьева O.B., Васильев С.А., Карягина A.C., Орецкая Т.С., Кубарева Е.А. Анализ контактов между ДНК и белком в комплексе метилтрансфераза SsoII - промоторная область генов системы рестрикции-модификации SsoII. // Молекуляр. биология. 2000. Т. 34. С. 1074-1080.

124. Karyagina A.S., Alexeevski A.V., Golovin A.V., Spirin S.A., Vorob'eva O.V., Kubareva Е.А. Computer modeling of complexes of (C5-cytosine)-DNA methyltransferase SsoII with target and regulatory DNAs. II Biophysics. 2003. V. 48. Suppl. 1. P. S45-S55.

125. Федотова E.A., Проценко A.C., Захарова M.B., Лаврова Н.В., Алексеевский А.В., Орецкая Т.С., Карягина А.С., Солонин А.С., Кубарева Е.А. SsoII-подобная ДНК-метилтрансфераза Ecll8kl: взаимосвязь между регуляторной и метилирующей функциями. II Биохимия. 2009. Т. 74. С. 108-116.

126. Федотова Е.А. Особенности регуляции генной экспрессии в системе рестрикции-модификации SsoII. // Дис. ... канд. хим. наук. Москва. 2006. 138 с.

127. Cardoso М.С., Leonhardt H. DNA methyltransferase is actively retained in the cytoplasm during early development. // J. Cell. Biol. 1999. V. 147. P. 25-32.

128. Bestor Т.Н. Activation of mammalian DNA methyltransferase by cleavage of a Zn binding regulatory domain. IIEMBO J. 1992. V. 11. P. 2611-2617.

129. Jurkowska R.Z., Jurkowski T.P., Jeltsch A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. // ChemBioChem. 2011. V. 12. P. 206-222.

130. Takeshita K., Suetake I., Yamashita E., Suga M., Narita H., Nakagawa A., Tajima S. Structural insight into maintenance methylation by mouse DNA methyltransferase 1 (Dnmtl). // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2011. V. 108. P. 9055-9059.

131. Leonhardt H., Page A.W., WeierH.U., Bestor Т.Н. A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei. // Cell. 1992. V. 71. P. 865-873.

132. Chuang L.S., IanH.I., KohT.W., Ng H.H., XuG., LiB.F. Human DNA-(cytosine-5) methyltransferase-PCNA complex as a target for p21WAFl. // Science. 1997. V. 277. P. 1996-2000.

133. Liu Y., Oakeley E.J., Sun L., Jost J.P. Multiple domains are involved in the targeting of the

mouse DNA methytransferase to the DNA replication foci. // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 1038-1045.

134. Rountree M.R., Bachman K.E., Baylin S.B. Dnmtl binds HDAC2 and a new co-repressor, DMAP1, to form a complex at replication foci. // Nat. Genet. 2000. V. 25. P. 269-277.

135. Ding F., Chaillet J.R. In vivo stabilization of the Dnmtl (cytosine-5)-methyltransferase protein. UProc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 2002. V. 99. P. 14861-14866.

136. Margot J.B., Cardoso M.C., Leonhardt H. Mammalian DNA methyltransferases show different subnuclear distributions. H J. Cell. Biochem. 2001. V. 83. P. 373-379.

137. Krude T. Chromatin. Nucleosome assembly during DNA replication. // Curr. Biol. 1995. V. 5. P. 1232-1234.

138. Gasser R., Koller T., Sogo J.M. The stability of nucleosomes at the replication fork. // J. Mol. Biol. 1996. V. 258. P. 224-239.

139. McArthur M., Thomas J.O. A preference of histone HI for methylated DNA. // EMBO J. 1996. V. 15. P. 1705-1714.

140. Carotti D., Funiciello S., Lavia P., Caiafa P., Strom R. Different effects of histone HI on de novo DNA methylation in vitro depend on both the DNA base composition and the DNA methytransferase. // Biochemistry. 1996. V. 5. P. 11660-11667.

141. Easwaran H.P., Schermelleh L., Leonhardt H., Cardoso M.C. Replication-independent chromatin loading of Dnmtl during G2 and M phases. // EMBO Rep. 2004. V. 5. P. 11811186.

142. Syeda F., Fagan R.L., Wean M., Awakumov G.V., Walker J.R., Xue S., Dhe-Paganon S., Brenner C. The replication focus targeting sequence (RFTS) domain is a DNA-competitive inhibitor of Dnmtl. Ill Biol. Chem. 2011. V. 286. P. 15344-15351.

143. Fellinger K., Rothbauer U., Felle M., Längst G., Leonhardt H. Dimerization of DNA methytransferase 1 is mediated by its regulatory domain. II J. Cell. Biochem. 2009. V. 106. P. 521-528.

144. Cross S.H., Meehan R.R., Nan X., Bird A. A component of the transcriptional repressor MeCPl shares a motif with DNA methytransferase and HRX proteins. // Nat. Genet. 1997. V. 16. P. 256-259.

145. Lee J.H., Voo K.S., Skalnik D.G. Identification and characterization of the DNA binding domain of CpG-binding protein. II J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 44669-44676.

146. Lee J.H., Skalnik D.G. CpG-binding protein (CXXC finger protein 1) is a component of the mammalian Setl histone H3-Lys4 methyltransferase complex, the analogue of the yeast Setl/COMPASS complex. II J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 41725-41731.

147. Tsukada Y., Fang J., Erdjument-Bromage H., Warren M.E., Borchers C.H., Tempst P., Zhang

Y. Histone demethylation by a family of JmjC domain-containing proteins. // Nature. 2006. V. 439. P. 811-816.

148. Jorgensen H.F., Ben-Porath I., BirdA.P. Mbdl is recruited to both methylated and nonmethylated CpGs via distinct DNA binding domains. // Mol. Cell. Biol. 2004. V. 24. P. 3387-3395.

149. Birke M., Schreiner S„ Garcia-Cuellar M.P., Mahr K., Titgemeyer F., Slany R.K. The MT domain of the proto-oncoprotein MLL binds to CpG-containing DNA and discriminates against methylation. II Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. P. 958-965.

150. Allen M.D., Grummitt C.G., Hilcenko C., Min S.Y., Tonkin L.M., Johnson C.M., Freund S.M., Bycroft M., Warren A.J. Solution structure of the nonmethyl-CpG-binding CXXC domain of the leukaemia-associated MLL histone methyltransferase. // EMBO J. 2006. V. 25. P. 4503-4512.

151. Pradhan M., Esteve P.O., Chin H.G., Samaranayke M., Kim G.D., Pradhan S. CXXC domain of human Dnmtl is essential for enzymatic activity. // Biochemistry. 2008. V. 47. P. 1000010009.

152. Bacolla A., Pradhan S., Roberts R.J., Wells R.D. Recombinant human DNA (cytosine-5) methyltransferase. II. Steady-state kinetics reveal allosteric activation by methylated DNA. II J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 33011-33019.

153. TakeuchiH., HanamuraN., HayasakaH., Haradal. B-Z transition of poly(dG-m5dC) induced by binding of Lys-containing peptides. // FEBSLett. 1991. V. 279. P. 253-255.

154. Takeuchi H., Hanamura N., Harada I. Structural specificity of peptides in Z-DNA formation and energetics of the peptide-induced B-Z transition of poly(dG-m5dC). // J. Mol. Biol. 1994. V. 236. P. 610-617.

155. Krzyzaniak A., SiateckaM., SzykA., MuchaP., Rekowski P., Kupryszewski G., Barciszewski J. Specific induction of Z-DNA conformation by a nuclear localization signal peptide of lupin glutaminyl tRNA synthetase. II Mol. Biol. Rep. 2000. V. 27. P. 51-54.

156. Kim Y.G., Park HJ., Kim K.K., Lowenhaupt K., Rich A. A peptide with alternating lysines can act as a highly specific Z-DNA binding domain. // Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P. 4937^1942.

157. Rich A., Nordheim A., Wang A.H. The chemistry and biology of left-handed Z-DNA. // Annu. Rev. Biochem. 1984. V. 53. P. 791-846.

158. BestorT. Supercoiling-dependent sequence specificity of mammalian DNA methyltransferase. 11 Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. P. 3835-3843.

159. Okano M., Xie S., Li E. Cloning and characterization of a family of novel mammalian DNA (cytosine-5) methyltransferases. II Nat. Genet. 1998. V. 19. P. 219-220.

160. Okano M., Bell D.W., Haber D.A., Li E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are

essential for de novo methylation and mammalian development. // Cell. 1999. V. 99. P. 247257.

161. Hansen R.S., Wijmenga C., Luo P., Stanek A.M., Canfield Т.К., Weemaes C.M., Gartler S.M. The DNMT3B DNA methyltransferase gene is mutated in the ICF immunodeficiency syndrome. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999. V. 96. P. 14412-14417.

162. Xu G.L., Bestor Т.Н., Bourc'his D., HsiehC.L., TommerupN., BuggeM., HultenM., QuX., RussoJ.J., Viegas-Pequignot E. Chromosome instability and immunodeficiency syndrome caused by mutations in a DNA methyltransferase gene. // Nature. 1999. V. 402. P. 187-191.

163. XieS., WangZ., OkanoM., NogamiM., Li Y., HeW.W., OkumuraK., LiE. Cloning, expression and chromosome locations of the human DNMT3 gene family. // Gene. 1999. V. 236. P. 87-95.

164. Cao X., Springer N.M., Muszynski M.G., Phillips R.L., Kaeppler S., Jacobsen S.E. Conserved plant genes with similarity to mammalian de novo DNA methyltransferases. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000. V. 97. P. 4979-4984.

165. Hata К., Okano M., Lei H., Li E. Dnmt3L cooperates with the Dnmt3 family of de novo DNA methyltransferases to establish maternal imprints in mice. // Development. 2002. V. 129. P. 1983-1993.

166. Bourc'his D., Xu G.L., Lin C.S., Bollman В., Bestor Т.Н. Dnmt3L and the establishment of maternal genomic imprints. II Science. 2001. V. 294. P. 2536-2539.

167. Bourc'his D., Bestor Т.Н. Meiotic catastrophe and retrotransposon reactivation in male germ cells lacking Dnmt3L. // Nature. 2004. V. 431. P. 96-99.

168. Webster K.E., O'Biyan M.K., Fletcher S., Crewther P.E., Aapola U., Craig J., Harrison D.K., AungH., Phutikanit N., LyleR., MeachemS.J., Antonarakis S.E., de Kretser D.M., HedgerM.P., Peterson P., Carroll B.J., Scott H.S. Meiotic and epigenetic defects in Dnmt3L-knockout mouse spermatogenesis. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005. V. 102. P. 4068-4073.

169. QiuC., SawadaK., Zhang X., Cheng X. The PWWP domain of mammalian DNA methyltransferase Dnmt3b defines a new family of DNA-binding folds. // Nat. Struct. Biol. 2002. V. 9. P. 217-224.

170. Maurer-Stroh S., Dickens N. J., Hughes-Davies L., Kouzarides Т., Eisenhaber F., Ponting C.P. The Tudor domain 'Royal Family': Tudor, plant Agenet, Chromo, PWWP and МВТ domains. // Trends Biochem. Sci. 2003. V. 28. P. 69-74.

171. TavernaS.D., LiH., Ruthenburg A.J., AllisC.D., PatelD.J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2007. V. 14. P. 1025-1040.

172. WuH., ZengH., LamR., Tempel W., AmayaM.R, XuC., Dombrovski L„ QiuW., Wang Y., Min J. Structural and histone binding ability characterizations of human PWWP domains. // PLoS One. 2011. V. 6. P. el8919.

173. Chen T., Tsujimoto N., Li E. The PWWP domain of Dnmt3a and Dnmt3b is required for directing DNA methylation to the major satellite repeats at pericentric heterochromatin. // Mol. Cell. Biol. 2004. V. 24. P. 9048-9058.

174. BachmanK.E., Rountree M.R., BaylinS.B. Dnmt3a and Dnmt3b are transcriptional repressors that exhibit unique localization properties to heterochromatin. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 32282-32287.

175. Ge Y.Z., Pu M.T., Gowher H., Wu H.P., Ding J.P., Jeltsch A., Xu G.L. Chromatin targeting of de novo DNA methyltransferases by the PWWP domain. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 25447-25454.

176. ShirohzuH., KubotaT., KumazawaA., SadoT., ChijiwaT., InagakiK., SuetakeL, Tajima S., Wakui K., Miki Y., Hayashi M., Fukushima Y., Sasaki H. Three novel Dnmt3B mutations in Japanese patients with ICF syndrome. // Am. J. Med. Genet. 2002. V. 112. P. 31-37.

177. Dhayalan A., Rajavelu A., Rathert P., Tamas R., Jurkowska R.Z., Ragozin S., Jeltsch A. The Dnmt3a PWWP domain reads histone 3 lysine 36 trimethylation and guides DNA methylation. II J. Biol. Chem. 2010. V. 285. P. 26114-26120.

178. LeeJ.S., Shilatifard A. A site to remember: H3K36 methylation a mark for histone deacetylation. // Mutat. Res. 2007. V. 618. P. 130-134.

179. Meissner A., Mikkelsen T.S., Gu H., Wernig M., Hanna J., Sivachenko A., Zhang X., Bernstein B.E., Nusbaum C., Jaffe D.B., Gnirke A., Jaenisch R., Lander E.S. Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells. // Nature. 2008. V. 454. P.766-770.

180. Hodges E., Smith A.D., Kendall J., XuanZ., RaviK., Rooks M., Zhang M.Q., YeK., Bhattacharjee A., BrizuelaL., McCombie W.R., WiglerM., Hannon G.J., Hicks J.B. High definition profiling of mammalian DNA methylation by array capture and single molecule bisulfite sequencing. // Genome Res. 2009. V. 19. P. 1593-1605.

181. Argentaro A., Yang J.C., Chapman L., Kowalczyk M.S., Gibbons R.J., Higgs D.R., Neuhaus D., Rhodes D. Structural consequences of disease-causing mutations in the ATRX-DNMT3-DNMT3L (ADD) domain of the chromatin-associated protein ATRX. // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 2007. V. 104. P. 11939-11944.

182. Otani J., Nankumo T., Arita K., Inamoto S., Ariyoshi M., Shirakawa M. Structural basis for recognition of H3K4 methylation status by the DNA methyltransferase 3A ATRX-Dnmt3-Dnmt3L domain. // EMBO Rep. 2009. V. 10. P. 1235-1241.

183. Suzuki M., Yamada T., Kihara-Negishi F., Sakurai T., Hara E., Tenen D.G., Hozumi N., Oikawa T. Site-specific DNA methylation by a complex of PU.l and Dnmt3a/b. // Oncogene. 2006. V. 25. P. 2477-2488.

184. Brenner C., Déplus R., Didelot C., Loriot A., Viré E., De Smet C., Gutierrez A., Danovi D., Bernard D., Boon T., Pelicci P.G., Amati B., Kouzarides T., de Launoit Y., Di Croce L., Fuks F. Myc represses transcription through recruitment of DNA methyltransferase corepressor. Il EMBOJ. 2005. V. 24. P. 336-346.

185. Fuks F., Burgers W.A., Godin N., Kasai M., Kouzarides T. Dnmt3a binds deacetylases and is recruited by a sequence-specific repressor to silence transcription. // EMBO J. 2001. V. 20. P. 2536-2544.

186. Fuks F., Hurd P.J., Déplus R., Kouzarides T. The DNA methyltransferases associate with HP1 and the SUV39H1 histone methyltransferase. II Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 2305-2312.

187. LiH., RauchT., ChenZ.X., Szabô P.E., RiggsA.D., PfeiferGP. The histone methyltransferase SETDB1 and the DNA methyltransferase Dnmt3A interact directly and localize to promoters silenced in cancer cells. // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 1948919500.

188. ViréE., Brenner C., Déplus R., BlanchonL., FragaM., Didelot C., MoreyL., VanEyndeA., Bernard D., Vanderwinden J.M., BollenM., EstellerM., Di Croce L., de Launoit Y., Fuks F. The Polycomb group protein EZH2 directly controls DNA methylation. II Nature. 2006. V. 439. P. 871-874.

189. Datta J., Majumder S., Bai S., Ghoshal K„ Kutay H., Smith D.S., Crabb J.W., Jacob S.T. Physical and functional interaction of DNA methyltransferase 3A with Mbd3 and Brgl in mouse lymphosarcoma cells. II Cancer Res. 2005. V. 65. P. 10891-10900.

190. Zhang Y., JurkowskaR., Soeroes S., RajaveluA., DhayalanA., BockL, RathertP., Brandt O., ReinhardtR., Fischle W., JeltschA. Chromatin methylation activity of Dnmt3a and Dnmt3a/3L is guided by interaction of the ADD domain with the histone H3 tail. // Nucleic Acids Res. 2010. V. 38. P. 4246^1253.

191. Finnegan E.J., Dennis E.S. Isolation and identification by sequence homology of a putative cytosine methyltransferase from Arabidopsis thaliana. II Nucl. Acids Res. 1993. V. 21. P. 2383-2388.

192. Callebaut I., Courvalin J.C., Mornon J.P. The BAH (bromo-adjacent homology) domain: a link between DNA methylation, replication and transcriptional regulation. // FEES Lett. 1999. V. 446. P. 189-193.

193. Pavlopoulou A., Kossida S. Plant cytosine-5 DNA methyltransferases: structure, function, and molecular evolution. // Genomics. 2007. V. 90. P. 530-541.

194. Xu S., Xiao J., PosfaiJ., MaunusR., Benner J. 2nd. Cloning of the BssHII restriction-modification system in Escherichia coli: BssHII methyltransferase contains circularly permuted cytosine-5 methyltransferase motifs. // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 3991— 3994.

195. Göll M.G., Bestor Т.Н. Eukariotic cytosine methyltransferases. // Annu. Rev. Biochem. 2005. V. 74. P. 481-514.

196. Wada Y., Ohya H., Yamaguchi Y., Koizumi N., Sano H. Preferential de novo methylation of cytosine residues in non-CpG sequences by a domains rearranged DNA methyltransferase from tobacco plants. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 42386-42393.

197. Henderson I.R., DelerisA., WongW., Zhong X., ChinH.G., Horwitz G.A., Kelly K.A., Pradhan S., Jacobsen S.E. The de novo cytosine methyltransferase DRM2 requires intact UBA domains and a catalytically mutated paralog DRM3 during RNA-directed DNA methylation in Arabidopsis thaliana. IIPLoS Genet. 2010. V. 6. P. el001182.

198. Eissenberg J.C. Molecular biology of the chromo domain: an ancient chromatin module comes of age. // Gene. 2001. V. 275. P. 19-29.

199. HenikofFS., Cornai L. A DNA methyltransferase homolog with a chromodomain exists in multiple polymorphic forms in Arabidopsis. II Genetics. 1998. V. 149. P. 307-318.

200. Lindroth A.M., CaoX., Jackson J.P., ZilbermanD., McCallum C.M., HenikoffS., Jacobsen S.E. Requirement of CHROMOMETHYLASE3 for maintenance of CpXpG methylation. // Science. 2001. V. 292. P. 2077-2080.

201. Bartee L., Malagnac F., Bender J. Arabidopsis cmt3 chromomethylase mutations block non-CG methylation and silencing of an endogenous gene. // Genes Dev. 2001. V. 15. P. 17531758.

202. Никольская И.И., Карташова И.М., Лопатина Н.Г. Ферменты новой системы хозяйской специфичности SsoAlW. II Молекул, генетика. 1983. Т. 12. С. 5-10.

203. Никольская И.И., Лопатина Н.Е., Сучков C.B., Дебов С.С. Сайт-специфичность ДНК-метилаз из клеток Shigella sonnei Al. II Биохимия. 1985. T. 50. С. 1694-1700.

204. Kubareva E. A., Walter J., KaryaginaA. S., Vorob'eva О. V., Lau P. С., Trautner T. Determination of methylation site of DNA-methyltransferase NlaX by a hybrid method. // Biotechniques. 2002. V. 33. P. 526-531.

205. Denjmukhametov M.M., BrevnovM.G., Zakharova M.V., RepykA.V., SoloninA.S., Petrauskene O.V., GromovaE.S. The Ecll8kl restriction-modification system: cloning, expression, properties of the purified enzymes. // FEBSLett. 1998. V. 433. P. 233-236.

206. Kumar S., Cheng X., Klimasauskas S., Mi S., Posfai J., Roberts R.J., Wilson G.G. The DNA (cytosine-5) methyltransferases. // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 1-10.

207. Zakharova M.V., Beletskaya I.V., Denjmukhametov M.M., Yurkova T.V., Semenova L.M., Shlyapnikov M.G., SoloninA.S. Characterization of pECL18 and pKPN2: a proposed pathway for the evolution of two plasmids that carry identical genes for a Type II restriction-modification system. // Mol. Genet. Genomics. 2002. V. 267. P. 171-178.

208. Miyahara M., Ishiwata N., Yoshida Y. StyD4I restriction-modification system of Salmonella typhi D4: cloning and sequence analysis. II Biol. Pharm. Bull. 1997. V. 20. P. 201-203.

209. IbáñezM., Alvarez I., Rodríguez-Peña J.M., RotgerR. A ColEl-type plasmid from Salmonella enteritidis encodes a DNA cytosine methytransferase. // Gene. 1997. V. 196. 145-158.

210. Karyagina A.S., LuninV.G., Levtchenko I.Ya., LabbéD., BrousseauR., LauP.C.K., Nikolskaya I.I. The SsoII and NlaX DNA methytransferases: overproduction and functional analysis. // Gene. 1995. V. 157. P. 93-96.

211. Воробьева O.B., Карягина A.C., Волков E.M., ВирясовМ.Б., ОрецкаяТ.С., Кубарева Е.А. Анализ контактов в комплексе ДНК-метилтрансферазы SsoII с участком метилирования. II Биоорганическая химия. 2002. Т. 28. С. 402-410.

212. Романенков А.С., КисильО.В., Зацепин Т.С., ЯмсковаО.В., Карягина А.С., Метелев В.Г., Орецкая Т.С., Кубарева Е.А. ДНК-метилтрансфераза SsoII как бифункциональный белок: особенности взаимодействия с промоторной областью генов системы рестрикции-модификации SsoII. II Биохимия. 2006. Т. 71. С. 1648-1658.

213. Carson M., Johnson D.H., McDonald H., Brouillette С., Delucas L.J. His-tag impact on structure. Il Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2007. V. 63. P. 295-301.

214. Карягина A.C. Структурно-функциональная характеристика систем рестрикции-модификации ДНК штамма Shigella sonnei 47. II Дис. ... докт. биол. наук. Москва. 1997.331 с.

215. LaemmliU.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

216. Piekarowicz A., BrzezinskiR. Cleavage and methylation of DNA by the restriction endonuclease Hinflll isolated from Haemophilus influenzae Rf. // J. Mol. Biol. 1980. V. 144. P. 415-429.

217. Kumar S., Cheng X., Pflugrath J.W., Roberts R.J. 1992. Purification, crystallization, and preliminary X-ray diffraction analysis of an M.Hhal-AdoMet complex. // Biochemistry. V.31.P. 8648-8653.

218. Szczelkun M.D., Connolly B.A. Sequence-specific binding of DNA by the EcoRV restriction and modification enzymes with nucleic acid and cofactor analogues. // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 10724-10733.

219. Schluckebier G., Kozak M., Bleimling N., Weinhold E., Saenger W. Differential binding of

S-adenosylmethionine S-adenosylhomocysteine and Sinefungin to the adenine-specific DNA methytransferase M.Taql. H J. Mol. Biol. 1997. V. 265. P. 56-67.

220. de la Campa A., Kale P., Springhorn S., Lacks S. Proteins encoded by the DpnII restriction gene cassette. Two methylases and an endonuclease. // J. Mol. Biol 1987. V. 196. P. 457469.

221. DubeyA.K., MolletB., Roberts R.J. Purification and characterization of the Mspl DNA methyltransferase cloned and overexpressed in E. coli. // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 1579-1585.

222. Dong A., Zhou L., Zhang X., Stickel S., Roberts R. J., Cheng X. Structure of the Q237W mutant of Hhal DNA methyltransferase: an insight into protein-protein interactions. // Biol. Chem. 2004. V. 385. P. 373-379.

223. Thomas C.B., Gumport R.I. Dimerization of the bacterial RsrI N6-adenine DNA methyltransferase. II Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P. 806-815.

224. MrukL, CichowiczM., Kaczorowski T. Characterization of the LlaCI methyltransferase from Lactococcus lactis subsp. cremoris W15 provides new insights into the biology of type II restriction-modification systems. // Microbiology. 2003. V. 149. P. 3331-3341.

225. Bheemanaik S., Chandrashekaran S., Nagaraja V., Rao D.N. Kinetic and catalytic properties of dimeric Kpnl DNA methyltransferase. II J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 7863-7874.

226. Bheemanaik S., Bujnicki J.M., Nagaraja V., Rao D.N. Functional analysis of amino acid residues at the dimerisation interface of Kpnl DNA methyltransferase. // Biol. Chem. 2006. V. 387. P. 515-523.

227. Finzi L., Dunlap D.D. Single-molecule approaches to probe the structure, kinetics, and thermodynamics of nucleoprotein complexes that regulate transcription. // J. Biol. Chem. 2010. V. 285. P. 18973-18978.

228. Остерман JI.A. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. // М.: Наука. 1985.

229. Porod G. General theory. // In: Small-angle X-ray scattering. / Eds. Glatter O., Kratky O. London: Academic Press. 1982. P. 17-51.

230. Svergun D.I. Restoring low resolution structure of biological macromolecules from solution scattering using simulated annealing. // Biophys. J. 1999. V. 76. P. 2879-2886.

231. Svergun D.I., Barberato C., Koch M.H.J. CRYSOL - a program to evaluate X-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. // J. Appl. Crystallogr. 1995. V. 28. P. 768-773.

232. Petoukhov M.V., Svergun D.I. Global rigid body modelling of macromolecular complexes against small-angle scattering data. II Biophys. J. 2005. V. 89. P. 1237-1250.

233. The NCBI Handbook. // Eds. McEntyre- J., Ostell J. Bethesda (MD): National Center for

Biotechnology Information (US). 2002.

234. Martin S.R., Schilstra M.J. Circular dichroism and its application to the study of biomolecules. // Methods Cell Biol. 2008. V. 84. P. 263-293.

235. Kelly S.M., Jess T.J., Price N.C. How to study proteins by circular dichroism. // Biochim. Biophys. Acta. 2005. V. 1751. P. 119-139.

236. SreeramaN., Woody R.W. Estimation of protein secondary structure from circular dichroism spectra: comparison of CONTIN, SELCON, and CDSSTR methods with an expanded reference set. II Anal. Biochem. 2000. V. 287. P. 252-260.

237. Jones D.T. Protein secondary structure prediction based on position-specific scoring matrices. II J. Mol Biol. 1999. V. 292. P. 195-202.

238. Bryson K., McGuffin L.J., Marsden R.L., Ward J.J., Sodhi J.S., Jones D.T. Protein structure prediction servers at University College London. // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. P. W36-W38.

239. Cheng X., Kumar S., Posfai J., Pflugrath J.W., Roberts R.J. Crystal structure of the Hhal DNA methyltransferase complexed with S-adenosyl-L-methionine. II Cell. 1993. V. 74. P. 299-307.

240. Reinisch K.M., Chen L., Verdine G.L., Lipscomb W.N. The crystal structure of Haelll methyltransferase convalently complexed to DNA: an extrahelical cytosine and rearranged base pairing. // Cell. 1995. V. 82. P. 143-153.

241. Финкельштейн A.B., Птицын О.Б. Физика белка. // М.: КДУ. 2005. 456 с.

242. McLuskey К., Cameron S., Hammerschmidt F., Hunter W.N. Structure and reactivity of hydroxypropylphosphonic acid epoxidase in fosfomycin biosynthesis by a cation- and flavin-dependent mechanism. // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 2005. V. 102. P. 1422114226.

243. Cox M., van Tilborg P.J., de Laat W., Boelens R., van Leeuwen H.C., van der Vliet P.C., Kaptein R. Solution structure of the Oct-1 POU homeodomain determined by NMR and restrained molecular dynamics. II J. Biomol. NMR. 1995. V. 6. P. 23-32.

244. Morita E.H., Shirakawa M., Hayashi F., Imagawa M., Kyogoku Y. Structure of the Oct-3 POU-homeodomain in solution, as determined by triple resonance heteronuclear multidimensional NMR spectroscopy. // Protein Sei. 1995. V. 4. P. 729-739.

245. Albright R.A., Matthews B.W. Crystal structure of lambda-Cro bound to a consensus operator at 3.0 A resolution. II J. Mol. Biol. 1998. V. 280. P. 137-151.

246. Green N.S., ReislerE., HoukK.N. Quantitative evaluation of the lengths of homobifunctional protein cross-linking reagents used as molecular rulers. // Protein Sei. 2001. V. 10. P. 1293-1304.

247. Giron-Monzon L., Manelyte L., Ahrends R., Kirsch D., Spengler В., Friedhoff R Mapping protein-protein interactions between MutL and MutH by cross-linking. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279 P. 49338-49345.

248. HeinzeRJ., Giron-Monzon L., Solovyova A., Elliot S.L., Geisler S., Cupples C.G., Connolly B.A., Friedhoff P. Physical and functional interactions between Escherichia coli MutL and the Vsr repair endonuclease. // Nucleic Acids Res. 2009. V. 37. P. 4453-4463.

249. Smyth D.G., Blumenfeld O.O., Königsberg W. Reactions of Ar-ethylmaleimide with peptides and amino acids. // Biochem. J. 1964. V. 91. P. 589-595.

250. O'GaraM., Zhang X., Roberts R.J., Cheng X. Structure of a binary complex of Hhal methyltransferase with S-adenosyl-L-methionine formed in the presence of a short nonspecific DNA oligonucleotide. II J. Mol. Biol. 1999. V. 287. P. 201-209.

252. Sankpal U.T., Rao D.N. Mutational analysis of conserved residues in Hhal DNA methyltransferase. II Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. P. 2628-2638.

253. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия. // М.: Мир. 1980. Т. 2. С. 93.

254. Lakowicz J.R., Weber G. Quenching of protein fluorescence by oxygen. Detection of structural fluctuations in proteins on the nanosecond time scale. // Biochemistry. 1973. V. 12. P. 4171-4179.

255. Vivian J.T., CallisP.R. Mechanisms of Tryptophan Fluorescence Shifts in Proteins. // Biophys. J. 2001. V. 80. P. 2093-2109.

256. Chattopadhyay A., Rawat S.S., KelkarD.A., Ray S., Chakrabarti A. Organization and dynamics of tryptophan residues in erythroid spectrin: Novel structural features of denatured spectrin revealed by the wavelength-selective fluorescence approach. // Protein Sei. 2003. V. 12. P. 2389-2403.

257. Lakowicz J.R. Principles of fluorescence spectroscopy, 3rd ed. // Springer. 2006. P. 277289.

258. Samworth C.M., Degli Esposti M., Lenaz G. Quenching of the intrinsic tryptophan fluorescence of mitochondrial ubiquinol-cytochrome-c reductase by the binding of ubiquinone. И Eur. J. Biochem. 1988. V. 171. P. 81-86.

259. Schluckebier G., O'Gara M., Saenger W., Cheng X. Universal catalytic domain structure of AdoMet-dependent methyltransferases. П J. Mol. Biol. 1995. V. 247. P. 16-20.

260. MalyginE.G., Evdokimov A.A., HattmanS. Dimeric/oligomeric DNA methyltransferases: an unfinished story. I/ Biol. Chem. 2009. V. 390. P. 835-844.

261. Bading H. Determination of the molecular weight of DNA-bound protein(s) responsible for gel electrophoretic mobility shift of linear DNA fragments examplified with purified viral myb protein. 11 Nucleic Acids Res. 1988. V. 16. P. 5241-5248.

262. DubeyA.K.; Roberts R.J. Sequence-specific DNA binding by the Mspl DNA methyltransferase. II Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 3167-3173.

263. RenbaumP., RazinA. Footprint analysis of M.SssI and M.Hhal methyltransferases reveals extensive interactions with the substrate DNA backbone. // J. Mol. Biol. 1995. V. 248. P. 1926.

264. Finta C., Kiss A. Footprint analysis of the BspRI DNA methyltransferase-DNA interaction. II Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 2841-2846.

265. Svergun D.I., Nierhaus K.H. A map of protein-rRNA distribution in the 70 S Escherichia coli ribosome. II J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 14432-14439.

266. Heyduk T., Ma Y., Tang H., Ebright R.H. Fluorescence anisotropy: rapid, quantitative assay for protein-DNA and protein-protein interaction. // Methods Enzymol. 1996. V. 274. P. 492503.

267. Vilkaitis G., Dong A., WeinholdE., Cheng X., Klimasauskas S. Functional roles of the conserved threonine 250 in the target recognition domain of Hhal DNA methyltransferase. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 38722-38730.

268. PatroJ.N., Urban M., KuchtaR.D. Role of the 2-amino group of purines during dNTP polymerization by human DNA polymerase R. // Biochemistry. 2009. V. 48. P. 180-189.

269. Allan B.W., Beechem J.M., Lindstrom W.M., Reich N.O. Direct real time observation of base flipping by the EcoRI DNA methyltransferase. II J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 23682373.

270. LiebertK., Hermann A., Schlickenrieder M., JeltschA. Stopped-flow and mutational analysis of base flipping by the Escherichia coli Dam DNA-(adenine-N6)-methyltransferase. II J. Mol. Biol. 2004. V. 341. P. 443-454.

271. Allan B.W., Reich N.O. Targeted base stacking disruption by the EcoRI DNA methyltransferase. II Biochemistry. 1996. V. 35. P. 14757-14762.

272. Klimasauskas S., Roberts R.J. M.Hhal binds tightly to substrates containing mismatches at the target base. II Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 1388-1395.

273. Bheemanaik S., Reddy Y.V.R., Rao D.N. Structure, function and mechanism of exocyclic DNA methyltransferases. II Biochem. J. 2006. V. 399. P. 177-190.

274. O'Gara M., McCloy K., Malone T., Cheng X. Structure-based sequence alignment of three AdoMet-dependent DNA methyltransferases. // Gene. 1995. V. 157. P. 135-138.

275. Rachofsky E.L., Osman R., Ross J.B. Probing structure and dynamics of DNA with 2-aminopurine: effects of local environment on fluorescence. // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 946-956.

276. O'Gara M., HortonJ.R., Roberts R.J., Cheng X. Structures of Hhal methyltransferase

complexed with substrates containing mismatches at the target base. // Nature Struct. Biol. 1998. V. 5. P. 872-877.

277. Manna P., Nieder R.P., Schaefer M.R. DNA-Binding properties of the Fremyella diplosiphon RpbA repressor. II J. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 51-56.

278. Streeter S.D., Papapanagiotou I., MeGeehan J.E., Kneale G.G. DNA footprinting and biophysical characterization of the controller protein C.Ahdl suggests the basis of a genetic switch. II Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. 6445-6453.

279. Knowle D., Lintner R.E., Tourna Y.M., Blumenthal R.M. Nature of the promoter activated by C.PvuII, an unusual regulatory protein conserved among restriction-modification systems. II J. Bacteriol. 2005. V. 187. P. 488-497.

280. Tao T., Bourne J.C., Blumenthal R.M. A family of regulatory genes associated with type II restriction-modification systems.//J. Bacteriol. 1991. V. 173. P. 1367-1375.

281. Tao T., Blumenthal R.M. Sequence and characterization of pvuIIR, the Pvull endonuclease gene, and oîpvuIIC, its regulatory gene. II J. Bacteriol. 1992. V. 174. P. 3395-3398.

282. MeGeehan J.E., Streeter S.D., Papapanagiotou I., Fox G.C., Kneale G.G. High-resolution crystal structure of the restriction-modification controller protein C.Ahdl from Aeromonas hydrophila. II J. Mol. Biol. 2005. V. 346. P. 689-701.

283. Sawaya M.R., Zhu Z., Mersha F., Chan S.H., Dabur R., Xu S.Y., Balendiran G.K. Ciystal structure of the restriction modification system control element C.BclI and mapping of its binding site. //Structure. 2005. V. 13. P. 1837-1847.

284. Ball N., Streeter S.D., Kneale G.G., MeGeehan J.E. Structure of the restriction-modification controller protein C.Espl396I. // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2009. V. 65. P. 900905.

285. MeGeehan J.E., Streeter S.D., Thresh S.J., Taylor J.E., Shevtsov M.B., Kneale G.G. Structural analysis of a novel class of R-M controller proteins: C.Csp231I from Citrobacter sp. RFL231. //J. Mol. Biol. 2011. V. 409. P. 177-188.

286. Ives C.L., Sohail A., Brooks J.E. The regulatory C proteins from different restriction-modification systems can cross-complement. //J. Bacteriol. 1995. V. 177. P. 6313-6315.

287. SemenovaE., MinakhinL., BogdanovaE., NagornykhM., VasilovA., HeydukT., Solonin A., Zakharova M., Severinov K. Transcription regulation of the EcoRV restriction modification system. // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. P. 6942-6951.

288. Vijesurier R.M., Carlock L., Blumenthal R.M., Dunbar J.C. Role and mechanism of action of C. Pvull, a regulatory protein conserved among restriction-modification systems. // J. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 477-487.

289. MeGeehan J.E., Streeter S.D., Thresh S.J., Ball N., Ravelli R.B., Kneale G.G. Structural analysis of the genetic switch that regulates the expression of restriction-modification genes.

// Nucleic Acids Res. 2008. V. 36. P. 4778-4787.

290. Sorokin V., Severinov K., Gelfand M.S. Systematic prediction of control proteins and their DNA binding sites. // Nucleic Acids Res. 2009. V. 37. P. 441-451.

291. Ahrends R., KosinskiJ., Kirsch D., ManelyteL., Giron-Monzon L., Hummerich L., Schulz O., Spengler B., Friedhoff P. Identifying an interaction site between MutH and the C-terminal domain of MutL by crosslinking, affinity purification, chemical coding and mass spectrometry. /1 Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P. 3169-3180.

292. TamuraM., IgarashiT., KasaiK., ArataY. Side chain orientation of the amino acid substituted by a cysteine residue is important for successful crosslinking of galectin to its glycoprotein ligand using a photoactivatable sulfhydryl reagent. // Yakugaku Zasshi. 2010. V. 130. P. 1375-1379.

293. Dormán, G.; Prestwich, G.D. Benzophenone photophores in biochemistry. // Biochemistry. 1994. Y. 33. P. 5661-5673.

294. Hermanson G.T. Bioconjugate Techniques. 2nd ed. // San Diego (CA): Academic Press. 2008. P. 205.

295. Thompson M., Woodbury N.W. Thermodynamics of specific and nonspecific DNA binding by two DNA-binding domains conjugated to fluorescent probes. // Biophys. J. 2001. V. 81. P. 1793-1804.

296. Papapanagiotou I., Streeter S.D., Cary P.D., Kneale G.G. DNA structural deformations in the interaction of the controller protein C.Ahdl with its operator sequence. // Nucleic Acids Res. 2007. V. 35. P. 2643-2650.

297. Barbie A., Zimmer D.P., Crothers D.M. Structural origins of adenine-tract bending. // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 2003. V. 100. P. 2369-73.

298. Roostalu J., Jöers A., Luidalepp H., Kaldalu N., Tensón T. Cell division in Escherichia coli cultures monitored at single cell resolution. // BMC Microbiol. 2008. V. 8. P. 68.

299. GowherH., JeltschA. Molecular enzymology of the EcoRV DNA-(adenine-N(6))-methyltransferase: kinetics of DNA binding and bending, kinetic mechanism and linear diffusion of the enzyme on DNA. II J. Mol. Biol. 2000. V. 303. P. 93-110.

300. Sauerbrey G. The use of oscillator for weighing thin layers and for micro weighing. // Z. Phys. 1959. V. 155. P. 206-210.

301. Ellis J.S., Thompson M. Acoustic coupling at multiple interfaces and the liquid phase response of the thickness shear-mode acoustic wave sensor. // Chem. Commun. 2004. P. 1310-1311.

302. Molecular probes handbook, a guide to fluorescent probes and labeling technologies. 11th ed. // Eds. Johnson I., Spence M.T.Z. 2010.

303. Tassew N., Thompson M. Kinetic characterization of TAR RNA-Tat peptide and neomycin interactions by acoustic wave biosensor. // Biophys. Chem. 2003. V. 106. R 241-252.

304. Lucklum R., Doerner S., Schneider Т., Schlatt-Masuth В., Jacobs Т., Hauptmann R Realtime kinetic analysis with quartz crystal resonator sensors. // IEEE Int. Freq. Contr. Symp. Proceedings. 2006. P. 528-534.

305. SuH.B., Kallury K.M.R., Thompson M., Roach A. Interfacial nucleic-acid hybridisation studied by random primer P-32 labelling and liquid-phase acoustic network analysis. // Anal. Chem. 1994. V. 66. P. 769-777.

306. Wang X., Ellis J.S., Lyle E.-L., Sundaram P., Thompson M. Conformational chemistry of surface-attached calmodulin detected by acoustic shear wave propagation. // Mol. BioSyst. 2006. V. 2. P. 184-192.

307. Ballantine D.S., White R.M., Martin S.J., Ricco A.J., Frye G.C., Zellars E.T., Wohltjen H. Acoustic wave sensors. Theory, design, and physico-chemical applications. // San Diego: Academic Press Inc. 1997.

308. Skladal P. Piezoelectric quartz crystal sensors applied for bioanalytical assays and characterization of affinity interactions. II J. Braz. Chem. Soc. 2003. V. 14. P. 491-502.

309. Halford S.E. An end to 40 years of mistakes in DNA-protein association kinetics? // Biochem. Soc. Trans. 2009. V. 37. P. 343-347.

310. Kubitschek H.E. Cell volume increase in Escherichia coli after shifts to richer media. // J. Bacteriol. 1990. V. 172. P. 94-101.

311. Тедиашвили М.И., Упорова T.M., Никольская И.И., Дебов С.С. Обнаружение системы хозяйской специфичности у шигелл. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1980. Т. 90. С. 324-325.

312. Yang F., Yang J., Zhang X., Chen L., Jiang Y., Yan Y., Tang X., Wang J., Xiong Z., Dong J., Xue Y., Zhu Y., Xu X., Sun L„ Chen S., Nie H., Peng J., Xu J., Wang Y„ Yuan Z„ Wen Y„ Yao Z., Shen Y., Qiang В., Hou Y., Yu J., Jin Q. Genome dynamics and diversity of Shigella species, the etiologic agents of bacillary dysentery. // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. P. 6445-6458.

313. LanR., AllesM.C., DonohoeK., Martinez M.B., Reeves PR. Molecular evolutionary relationships of enteroinvasive Escherichia coli and Shigella spp. 11 Infect. Immun. 2004. V. 72. P. 5080-5088.

314. Karyagina A.S., Lunin V.G., Nikolskaya I.I. Characterization of the genetic determinants of Ssoil-restriction endonuclease and modification methyltransferase. // Gene. 1990. V. 87. P. 113-118.

315. JeltschA. 2003. Maintenance of species identity and controlling speciation of bacteria: a new function for restriction/modification systems? // Gene. 1997. V. 317. P. 13-16.

316. Karyagina A.S., Lunin V.G., Degtyarenko K.N., Uvarov Y.Y., Nikolskaya I.I. Analysis of the nucleotide and derived amino acid sequences of the SsoII restriction endonuclease and methyltransferase. // Gene. 1993. V. 124. P. 13-19.

317. Kobayashi I. 2001. Behavior of restriction-modification systems as selfish mobile elements and their impact on genome evolution. /У Nucleic Acids Res. V. 29. P. 3742-3756.

318. Виноградова M.H., Громова E.C., Упорова T.M., Никольская И.И., Шабарова З.А., Дебов С.С. Эндонуклеаза рестрикции SsoII: взаимодействие с модифицированными субстратами. 11 Доклады АН СССР. 1987. Т. 295. С. 732-736.

319. LlosaM., Gomis-Rüth F.X., CollM., de la Cruz R Bacterial conjugation: a two-step mechanism for DNA transport. // Mol. Microbiol. 2002. V. 45. P. 1-8.

320. Lang S., Gruber К., Mihajlovic S., Arnold R., Gruber C.J., Steinlechner S., Jehl M.A., Rattei Т., Fröhlich K.U., Zechner E.L. Molecular recognition determinants for type IV secretion of diverse families of conjugative relaxases. // Mol. Microbiol. 2010. V. 78. P. 1539-1555.

321. MarinusM.G., Morris N.R. Isolation of deoxyribonucleic acid methylase mutants of Escherichia coli К-12. II J. Bacteriol. 1973. V. 114. P. 1143-1150.

322. May M.S., Hattman S. Analysis of bacteriophage deoxyribonucleic acid sequences methylated by host- and R-factor-controlled enzymes. // J. Bacteriol. 1975. V. 123. P. 768770.

323. Clewell D.B., Helinski D.R. Effect of growth conditions on the formation of the relaxation complex of supercoiled ColEl deoxyribonucleic acid and protein in Escherichia coli. II J. Bacteriol. 1972. V. 110. P. 1135-1146.

324. Hershfield V., Boyer H.W., Yanofsky C., Lovett M.A., Helinski D.R. Plasmid ColEl as a molecular vehicle for cloning and amplification of DNA. // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 1974. V. 71. P. 3455-3459.

325. Carey J. Gel retardation. // Methods Enzymol. 1991. V. 208. P. 103-117.

326. Thompson J.D., Gibson T.J., Higgins D.G. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX. // Curr. Protoc. Bioinformatics. 2002. Chapter 2. Unit 2.3.

327. Konarev P.V., VolkovV.V., SokolovaA.V., KochM.H.J., SvergunD.I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. // J. Appl. Cryst. 2003. V. 36. P. 1277-1282.

328. GuinierA. La diffraction des rayons X aux tres petits angles; application a l'etude de phenomenes ultramicroscopiques. II Ann. Phys. (Paris). 1939. V. 12. P. 161-237.

329. Svergun D.I. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. II J. Appl. Crystallogr. 1992. V. 25. P. 495-503.

330. KozinM.B., SvergunD.I. Automated matching of high- and low-resolution structural models. II J. Appl. Crystallogr. 2001. V. 34. P. 33^1.

331. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. // М.: Мир. 1991.

332. HianikT., OstatnaV., Sonlajtnerova М., Grmanl. Influence of ionic strength, pH and aptamer configuration for binding affinity to thrombin. // Bioelectrochemistry. 2007. V. 70. P. 127-133.

333. Snejdarkova M., Svobodova L., Polohova V., Hianik T. The study of surface properties of an IgE-sensitive aptasensor using an acoustic method. II Anal. Bioanal. Chem. 2008. V. 390. P. 1087-1091.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность своему научному руководителю профессору Елене Александровне Кубаревой и заведующей отделом химии нуклеиновых кислот НИИ физико-химической биологии имени А. И. Белозерского Татьяне Семеновне Орецкой, а также профессорам, предоставившим возможность выполнить отдельные части данной работы в лабораториях, которыми они руководят: проф. Питеру Фридхоффу (Институт биохимии Университета имени Ю. Либиха, г. Гиссен, Еермания); проф. Хансу-Дитеру Бартунику (Институт имени М. Планка, г. Еамбург, Еермания); проф. Дмитрию Ивановичу Свергуну (Европейская молекулярно-биологическая лаборатория (ЕМВЕ), г. Гамбург, Еермания); проф. Тибору Гианику (отделение ядерной физики и биофизики факультета математики, физики и вычислительной техники Университета имени Коменского, г. Братислава, Словакия). Отдельная благодарность д-ру Галине Сергеевне Качаловой за школу жизни.

Автор благодарит своих коллег и соавторов: д-ра П. В. Конарева (ЕМВЕ, г. Еамбург, Еермания), д-ра Инее Винклер (Институт биохимии Университета имени Ю. Либиха, г. Гиссен, Германия), д-ра Игоря Грмана (Университет имени Коменского, г. Братислава, Словакия), с.н.с. Н. В. Молочкова (НИИ теоретической и экспериментальной биофизики, г. Пущино, Россия), с.н.с. Е. М. Рязанову (НИИ сельскохозяйственной биотехнологии, г. Москва), с.н.с. Е. А. Романову и в.н.с. А. В. Алексеевского (НИИ физико-химической биологии имени А. Н. Белозерского, г. Москва), проф. А. С. Карягину-Жулину и с.н.с. Н. В. Лаврову (НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Еамалеи, г. Москва).

Автор выражает сердечную благодарность всем своим коллегам по лаборатории, членам семьи и друзьям за постоянную помощь и поддержку.