Структурно-функциональное исследование канала выхода РНК в транскрипционном комплексе E. coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Коржева, Наталия Валерьевна

• Коржева, Наталия Валерьевна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Коржева, Наталия Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общие сведения о структуре РНК-полимеразы Е. coli и стадиях транскрипционного цикла

1.2. Исторический обзор моделей элонгационного комплекса

1.2.1. Основные характеристики "термодинамической модели"

1.2.2. Модель "прерывистой" элонгации транскрипции

1.3.0сновные современные направления развития моделей элонгационного комплекса и появление новых взглядов на механизмы синтеза РНК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональное исследование канала выхода РНК в транскрипционном комплексе E. coli»

Актуальность темы. Важным этапом в понимании механизмов синтеза РНК и его регуляции, осуществляемого ДНК-зависимой РНК -полимеразой, является локализация и определение функциональной роли районов фермента, которые связывают РНК и ДНК в тройной элонгационный комплекс (ЭК). Наиболее изученной к настоящему времени является РНК-полимераза E.coli. (Burgess et al., 1969; 1975). Это сложный белковый комплекс с молекулярной массой 450 kDa, состоящий из четырехсубъединичного кор-фермента (агРР'), обладающего каталитической активностью, и cr-субъединицы, необходимой для специфического узнавания промоторов и эффективной инициации транскрипции (Gross et al., 1992; Helmann et al., 1988). Наши знания о функциональной роли различных участков субъединиц РНК-полимеразы весьма ограничены. Мультисубъединичное строение и большие размеры белка затрудняют применение прямых структурных методов для его изучения. Вследствие чего, только недавно была получена пространственная структура кор-фермента РНК-полимеразы Thermus aquaticus с разрешением 3.3 ангстрема (Zhang et al., 1999). Белковые последовательности РНК-полимеразы Thermus aquaticus и РНК-полимеразы E.coli высоко гомологичны и практически полностью идентичны друг другу в консервативных районах, общих для большинства мультисубъединичных РНК-полимераз (Berghofer et al., 1988; Delarue et al., 1990; Ovchinnikov et al., 1982). Это положило начало новому этапу изучения РНК-полимеразы E.coli и осмыслению уже имеющихся данных в структурно-функциональном аспекте. Однако, до сих пор не 5 получены пригодные для рентгено-структурного анализа кристаллы элонгационного комплекса. Поэтому, для определения контактов фермента с РНК и ДНК, представляется целесообразным использование метода аффинной химической модификации, эффективное применение которого стало возможно после разработки быстрого метода картирования точек пришивки (Grachev et al., 1989). Систематическое применение этого подхода в сочетании с сайт-направленным мутагенезом позволило получить информацию о топографии активного центра (Zaychikov et al., 1996), а также РНК- и ДНК-евязывающих участков фермента (Nudler et al., 1998).

ЭК можно механистически представить себе как РНК-ДНК остов, окруженный РНК-полимеразой. Теоретически можно выделить 5 частей этого остова, взаимодействующих с белком (рис. 1): двухцепочечная ДНК впереди и сзади транскрипционного пузыря, РНК-ДНК гетеродуплекс, участок растущей цепи однонитевой РНК и однонитевой участок нематричной цепи ДНК.

Рис. 1. Схема РНК-ДНК остова в ЭК. Показано наличие 5 предполагаемых участков, которые могут взаимодействовать с РНК-полимеразой.

Канал выхода растущего РНК-продукта в рамках этой схемы формируется участками фермента и ДНК в районах РНК-ДНК гетеродуплекса и однонитевой РНК, контактирующими с транскриптом по ходу траектории его движения в ЭК.

Принципиальным является вопрос о том, в какой части этого остова локализуются взаимодействия с белком, обеспечивающие такие противоречивые свойства ЭК, как свободное скольжение вдоль матрицы и одновременно прочное связывание цепей РНК и ДНК. За последние 10 лет было выдвинуто несколько структурно-функциональных моделей ЭК, объясняющих его основные свойства, а именно: процессивность, стабильность и терминацию синтеза РНК. Эти модели, по-разному рассматривающие роль РНК, ДНК и белка в функционировании ЭК и зачастую противоречащие друг другу, до сих пор не позволили создать единую картину механизма синтеза РНК (von Hippel, Н.Р., 1995; 1998; Nudler et al., 1998; Komissarova et al., 1997, А, Б; Chamberlin, M.J., 1995; Uptain et al., 1997, А, Б).

Цель работы и задачи исследования. Целью работы являлось изучение структурных и функциональных взаимодействий растущей цепи РНК и остова ДНК с субъединицами РНК-полимеразы, ответственных за главные свойства транскрипционной машины: стабильность и процессивность в процессе элонгации.

В работе ставились следующие задачи: а) Определить минимальную длину РНК, необходимую для существования стабильного ЭК, и локализовать главные стабилизирующие взаимодействия РНК-полимеразы с РНК в канале выхода транскрипта. б) С помощью методов афинной модификации идентифицировать участки субъединиц РНК-полимеразы, вовлеченные в образование канала выхода РНК. в) Определить вклад РНК-ДНК гетеродуплекса в стабильность ЭК. г) Выяснить механизм разделения цепей РНК-ДНК гетеродуплекса в процессе синтеза РНК.

Научная новизна и практическая ценность работы. Настоящая работа позволила идентифицировать в РНК-полимеразе РНК-связывающий сайт, в котором происходят главные взаимодействия, стабилизирующие ЭК. Для локализации этого сайта и исследования его свойств разработан способ получения минимальных элонгационных комплексов, содержащих короткую РНК, с помощью реакции пирофосфоролиза. Подробно изучены свойства минимальных ЭК. Исследована роль длины и нуклеотидного состава РНК-ДНК гетеродуплекса в стабильности ЭК. Впервые выполнены эксперименты по изучению влияния ДНК дуплекса позади транскрипционного пузыря на свойства ЭК. Показано, что именно белок разрушает РНК-ДНК гетеродуплекс и направляет РНК в канал выхода. Выявлена дестабилизирующая роль а-субъединицы на стадии инициации синтеза РНК.

Методом аффинной модификации идентифицированы участки фермента, образующие РНК-связывающий сайт, а также подробно картированы контакты 5'-конца последовательно удлиняющейся РНК с р- и (З'-субъединицами РНК-полимеразы. Результаты данной работы позволили предложить новую структурно-функциональную модель ЭК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста и содержит 27 рисунков. Библиография включает в себя 128 названий, в том числе 2 русских и 126 иностранных.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Коржева, Наталия Валерьевна

ВЫВОДЫ

1. Получены данные, свидетельствующие о том, что в молекуле РНК-полимеразы существует специальный РНК-связывающий сайт, который вносит основной вклад в стабилизацию ЭК путем взаимодействия с двумя последними нуклеотидами РНК в составе РНК-ДНК гетеродуплекса. Этот сайт находится на расстоянии 7-8 нуклеотидов от З'-конца РНК и также обеспечивает активное вытеснение нити РНК-продукта из гетеродуплекса. Картирование участков РНК-полимеразы, взаимодействующих с 5'-концом РНК размером 7-8 нуклеотидов, показало, что этот сайт образован районом Ме1298-330 р'- субъединицы и районом Ме1492-515 р - субъединицы.

2. Показано, что РНК-ДНК гетеродуплекс вносит вклад в стабилизацию элонгационного комплекса. Степень стабилизирующего влияния гетеродуплекса зависит от его нуклеотидного состава.

3. Установлено, что восстановление ДНК дуплекса в задней части транскрипционного пузыря оказывает заметное дестабилизирующее влияние на ЭК. Оно наиболее сильно выражено в элонгационных комплексах с короткой РНК (размером 6-8 нуклеотидов).

4. На основании вышеизложенных результатов выдвинута новая структурно-функциональная модель тройного элонгационного комплекса. В рамках этой модели предложен новый вариант механизма терминации синтеза РНК, согласно которому она происходит в результате одновременного разрушения РНК-связывающего сайта с помощью образующейся РНК-шпильки и "схлопывания" транскрипционного пузыря.

5. С помощью метода аффинной модификации определены контакты растущего РНК-продукта на пути его движения через транскрипционный комплекс. Все области контактов РНК с РНК-полимеразой располагаются в эволюционно консервативных районах р - и р'- субъединиц, что указывает на функциональную значимость этих сайтов для взаимодействия с РНК. Установлено, что движение б'-конца синтезируемого транскрипта относительно фермента прекращается при достижении длины 14 нуклеотидов. Показано, что последующее удлинение РНК происходит с образованием петли.

6. Показано, что РНК, 5'-конец которой фиксирован на РНК-полимеразе за счет ковалентной пришивки, может быть укорочена с помощью пирофосфоролиза. Это свидетельствует о подвижности доменов белка, образующих активный центр и РНК-связывающий сайт, друг относительно друга.

7. Показано существование альтернативного пути выхода РНК в элонгационном комплексе с образованием длинного РНК-ДНК гетеродуплекса.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Коржева, Наталия Валерьевна, 1999 год

1. Грачев, М.А., Лухтанов, Е. А., Мустаев, Абикаюмов, М. Н., В. А., Рабинов, И. В. 1987, Б. Локализация аминокислотного остатка His в участке последовательности РНК-полимеразы Е. coli, связывающем инициирующий субстрат. Биоорган. Химия 13: 992-5.

2. Allison, L. A., Moyle, М., Shales, М. and Ingles С. J. 1985. Extensive homology among the largest subunits of eukaryotic and prokaryotic RNA polymerase. Cell 42:599-610.

3. Arndt, K.M., Chamberlin, M.J. 1990. RNA chain elongation by Escherichia coli RNA polymerase. Factors affecting the stability of elongating ternary complexes. J. Mol. Biol. 213:79-108.

4. Beese L. S., Derbyshire V. and Steitz T. A. 1993, A. Structure of DNA polymerase I Klenow fragment bound to duplex DNA, Science 260, 352-5.

5. Beese L. S., Friedman J. M. and ^teitz T. A. 1993, Б. Crystal structures of the Klenow fragment of DNA polymerase I complexed with deoxynucleoside thriphosphate and pyrophosphate, Biochemistry 32,14095-101.

6. Berghofer, В., Krockel, L., Kortner, C., Truss, M., Schallenberg, J., Klein, A. 1988. Relatedness of archaebacterial RNA polymerase core subunits to their eubacterial and eukaryotic equivalents. Nucleic Acids Res. 16: 8113-28.

7. Bergsland, K. J., Haselkorn, R. 1991. Evolutionary relationships amongeubacteria, cyanobacteria, and chloroplasts: evidence from the rpoC1 gene of Anabaena sp. Strain PCC 7120. J. Bacteriol. 173: 3446-55.

8. Blatter, E. E., Ross, W., Tang, H., Gourse, R. L., Ebright, R. H. 1994. Domain organization of RNA polymerase alpha subunit: C-terminal 85 amino acids constitute a domain capable of dimerization and DNA binding. Cell 78: 889-96.

9. Borukhov, S., Lee, J. and Goldfarb, A. 1991, B. Mapping of a contact for the RNA 3' terminus in the largest subunit of RNA polymerase. J. Biol. Chem. 266: 23932-5.

10. Borukhov, S., Sagitov, V., Goldfarb, A. 1993. Transcript cleavage factors from E. coli. Cell 72: 459-66.

11. Buckle, M., Buc, H. 1989. Fine mapping of DNA single-stranded regions using base-specific chemical probes: study of an open complex formed between RNA polymerase and the lac UV5 promoter. Biochemistry 28: 4388-96.

12. Burgess, R.R., Travers, A.A., Dunn, J.J., Bautz, E.K. 1969. Factor stimulating transcription by RNA polymerase. Nature 221: 43-6.

13. Burgess, R. R. and Jendrisak, J. J. 1975. A procedure for the rapid, large-scale purification of Escherichia coli DNA-dependent RNA polymerase involving polymin

14. P precipitation and DNA-cellulose chromatography. Biochemistry 14: 4634-8.

15. Burmeister, M., Monaco, A.P., Gillard, E.F., van Ommen, G.J., Affara, N.A., Ferguson-Smith, M.A., Kunkel, L.M., Lehrach, H. 1988. A 10-megabase physical map of human Xp21, including the Duchenne muscular dystrophy gene. Genomics 2:189-202.

16. Busby, S., Ebright, R. H. 1994. Promoter structure, promoter recognition, and transcription activation in prokaryotes. Cell 79: 743-6.

17. Chamberlin, M., Kingston, R., Gilman, M., Wiggs, J., deVera, A. 1983. Isolation of bacterial and bacteriophage RNA polymerases and their use in synthesis of RNA in vitro. Methods Enzymol .101: 540-68.

18. Chamberlin, M.J. 1995. New models for the mechanism of transcription elongation and its regulation. Harvey Lect. 88:1-21.

19. Darst, S. A., Kubalek, E. W. and Kornberg, R. D. 1989. Three-dimensional structure of Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme determined by electron crystallography. Nature 340: 730-2.

20. Darst, S.A., Edwards, A.M. 1995. Epitaxial growth of protein crystals from two-dimensional crystals on lipid layers. Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 640-4.

21. Daube, S.S., von Hippel, P.H. 1992 Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science 258:1320-4.

22. Daube, S.S., Hart, C.R., von Hippel, P.H. 1994, A. Coupling of RNA displacement and intrinsic termination in transcription from synthetic RNA-DNA bubble duplex constructs.Proc. Natl. Acad. Sei. U S A 91: 9539-43.

23. Daube, S.S., von Hippel, P.H. 1994, E. RNA displacement pathways during transcription from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Biochemistry 33:340-7.

24. Delarue M., Poch O., Tordo N., Moras D. and Argos P. (1990). An attempt tounify the structure of polymerases, Protein Eng. 3, 461-7.

25. Dombroski, A. J., Walter, W. A., Record, M. T. Jr., Siegele, D. A., Gross, C. A. 1992. Polypeptides containing highly conserved regions of transcription initiation factor sigma 70 exhibit specificity of binding to promoter DNA. Cell 70: 501-12.

26. Dombroski, A. J., Walter, W. A., Gross, C. A. 1993. Amino-terminal amino acids modulate sigma-factor DNA-binding activity. Genes Dev. 7: 2446-55.

27. Ebright, R. H., Busby, S. 1995. The Escherichia coli RNA polymerase alpha subunit: structure and function. Curr. Opin. Genet. Dev. 5:197-203.

28. Erie, D.A., Hajiseyedjavadi, O., Young, M.C., von Hippel, P.H. 1993. Multiple RNA polymerase conformations and GreA: control of the fidelity of transcription. Science 262: 867-73.

29. Erie, D.A., Yager, T.D., von Hippel, P.H. 1992. The single-nucleotide addition cycle in transcription: a biophysical and biochemical perspective. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21: 379-415.

30. Fu, J., Gnatt, A.L., Bushneil, D.A., Jensen, G.J., Thompson, N.E., Burgess, R.R., David, P.R., Kornberg, R.D. 1999. Yeast RNA polymerase II at 5 A resolution. Cell 98:799-810.

31. Johnson TL, Chamberlin MJ (1994) Complexes of yeast RNA polymerase II and RNA are substrates for TFIIS-induced RNA cleavage. Cell. 77(2):217-24.

32. Gardella, T., Moyle, H. and Susskind, M. M. 1989. A mutant Escherichia coli sigma 70 subunit RNA polymerase with altered promotor specificity. J. Mol. Biol.206: 579-90.

33. Glass, R. E., Jones, S. T., Ishihama, A. 1986. Genetic studies on the beta subunit of Escherichia coli RNA polymerase. VII. RNA polymerase is a target for ppGpp. Mol. Gen. Genet. 203: 265-8.

34. Gralla, J. D., Carpousis, A. J., Stefano, J. E. 1980. Productive and abortive initiation of transcription in vitro at the lac UV5 promoter. Biochemistry 19: 5864-9.

35. Gross, C. A., Lonetto, M., Losick, R. 1992. Bacterial sigma factors, p.129-76. Transcriptional regulation. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

36. Hansen, U. M., McClure, W. R. 1980, A. Role of the sigma subunit of Escherichia coli RNA polymerase in initiation. I. Characterization of core enzyme open complexes. J. Biol. Chem. 255: 9556-63.

37. Hansen, U. M., McClure, W. R. 1980, B. Role of the sigma subunit of Escherichia coli RNA polymerase in initiation. II. Release of sigma from ternary complexes. J. Biol. Chem. 255: 9564-70.

38. Harley, C. B., Reynolds, R. P. 1987. Analysis of E. coli promoter sequences. Nucleic Acids Res. 15: 2343-61.

39. Helmann, J. D., Chamberlin, M. J. 1988. Structure and function of bacterial sigma factors. Annu. Rev. Biochem. 57: 839-72.

40. Hinkle, D. C., Chamberlin, M. J. 1972. Studies of the binding of Escherichia coli

41. RNA polymerase to DNA. I. The role of sigma subunit in site selection. J. Mol. Biol. 70:157-85.1.hihama, Ä. 1993. Protein-protein communication within the transcription apparatus. J. Bacteriol. 175: 2483-9.

42. Kashlev, M., Lee, J., Zalenskaya, K., Nikiforov, V. and Goldfarb, A. 1990. Blocking of the initiation-to-elongation transition by a transdominant RNA polymerase mutation. Science 248:1006-9.

43. Kashlev, M., Nudler, E., Severinov, K., Borukhov, S., Komissarova, N., Goldfarb, A. 1996. Histidine-tagged RNA polymerase of Escherichia coli and transcription in solid phase. Methods Enzymol. 274: 326-34.

44. Kassavetis, G.A., Geiduschek, E.P. 1993. RNA polymerase marching backward. Science 259: 944-5.

45. Komissarova, N., Kashlev, M. 1997, A. RNA polymerase switches between inactivated and activated states by translocating back and forth along the DNA and the RNA. J. Biol. Chem. 272:15329-38.

46. Komissarova, N., Kashlev, M. 1997, 5. Transcriptional arrest; Escherichia coli RNA polymerase translocates backward, leaving the 3' end of the RNA intact and extruded. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:1755-60.

47. Komissarova, N., Kashlev, M. 1998. Functional topography of nascent RNA in elongation intermediates of RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95: 14699-704.

48. Kong, X. P., Onrust, R., O'Donnell, M., Kuriyan, J. 1992. Three-dimensional structure of the beta subunit of E. coli DNA polymerase III holoenzyme: a sliding DNA clamp. Cell 69: 425-37.

49. Koulich, D., Orlova, M., Malhotra, A., Sali, A., Darst, S. A., Borukhov, S. 1997.

50. Domain organization of Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB. J. Biol. Chem. 272: 7201-10.

51. Krishna, T. S., Kong, X. P., Gary, S., Burgers, P. M., Kuriyan, J. 1994. Crystal structure of the eukaryotic DNA polymerase processivity factor PCNA. Cell 79: 1233-43.

52. Krumm, A., Meulia, T., Groudine, M. 1993. Common mechanisms for the control of eukaryotic transcriptional elongation. Bioessays 15: 659-65.

53. Krummel, B., Chamberlin, M.J. 1992, A. Structural analysis of ternary complexes of Escherichia coli RNA polymerase. Deoxyribonuclease I footprinting of defined complexes. J. Mol. Biol. 225: 239-50.

54. Malhotra, A., Severinova, E. and Darst, S. A. 1996. Crystal structure of a sigma 70 subunit fragment from E. coli RNA polymerase. Cell 87:127-36.

55. Maniatis, T., Fritch, E. F. and Hayward, R. S. 1982. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.

56. Markovtsov, V., Mustaev, A. and Goldfarb, A. 1996. Protein-RNA interactions in the active center of transcription elongation complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3221-6.

57. Martin, E., Sagitov, V., Burova, E., Nikiforov, V. and Goldfarb, A. 1992. Genetic dissection of the transcription cycle. J. Biol. Chem. 267: 20175-80.

58. McClure, W.R. 1985. Mechanism and control of transcription initiation iniprokaryotes. Annu. Rev. Biochem. 54:171-204.

59. Mecsas, J., Cowing, D.W., Gross, C.A. 1991. Development of RNA polymerase-promoter contacts during open complex formation. J. Mol. Biol. 220: 585-97.

60. Milan, S., D'Ari, L., Chamberlin, M.J. 1999. Structural analysis of ternary complexes of Escherichia coli RNA polymerase: ribonuclease footprinting of the nascent RNA in complexes. Biochemistry 38: 218-25.

61. Mookhtiar, K. A., Peluso, P. S., Muller, D. K., Dunn, J. J. and Coleman, J. E. 1991.

62. Processivity of T7 RNA polymerase requires the C-terminal Phe882-Ala883-COO~foot". Biochemistry 30: 6305-13.

63. Muller, D. K., Martin, C. T. and Coleman, J. E. 1988. Processivity ofproteolytically modified forms of T7 RNA polymerase. Biochemistry 27: 5763-71.

64. Mustaev, A., Zaychikov, E., Severinov, K., Kashlev, M., Polyakov, A., Nikiforov, V. and Goldfarb, A. 1994. Topology of the RNA polymerase active center probed by chimeric rifampicin-nucleotide compounds, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 12036-40.

65. Nudler, E., Goldfarb, A., Kashlev, M. 1994. Discontinuous mechanism of transcription elongation. Science 265: 793-6.

66. Nudler, E., Kashlev, M., Nikiforov, V., Goldfarb, A. 1995. Coupling between transcription termination and RNA polymerase inchworming. Cell 81: 351-7.

67. Nudler, E., Avetissova, E., Markovtsov, V. and Goldfarb, A. 1996. Transcription processivity: protein-DNA interactions holding together the elongation complex. Science 273: 211-7.

68. Nudler, E., Mustaev, A., Lukhtanov, E., Goldfarb, A. 1997. The RNA-DNA hybrid maintains the register of transcription by preventing backtracking of RNA polymerase. Cell 89:33-41.

69. Nudler, E., Gusarov, I., Avetissova, E., Kozlov, M. and Goldfarb, A. 1998. Spatial organization of transcription elongation complex in Escherichia coli. Science 281: 424-8.

70. Orlova, M., Newlands, J., Das, A., Goldfarb, A., Borukhov, S. 1995. Intrinsic transcript cleavage activity of RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 92: 4596-600.

71. Poglitsch, C.L., Meredith, G.D., Gnatt, A.L., Jensen, G.J., Chang, W.H., Fu, J., Kornberg, R.D. 1999. Electron crystal structure of an RNA polymerase II transcription elongation complex. Cell 98: 791-8.

72. Polyakov, A., Severinova, E. and Darst, S. A. 1995. Tree-dimensional structure of E. coli core RNA polymerase: promoter binding and elongation conformations of the enzyme. Cell 83: 365-73.

73. Reeder, T.C., Hawley, D.K. 1996. Promoter proximal sequences modulate RNA polymerase II elongation by a novel mechanism. Cell 87:767-77.

74. Rees, W.A., Keller, R.W., Vesenka, J.P., Yang, G., Bustamante, C. S. 1993. Evidence of DNA bending in transcription complexes imaged by scanning force microscopy. Science 260:1646-9.

75. Reines, D., Chamberlin, M.J., Kane, C.M. 1989. Transcription elongation factor Sil (TFIIS) enables RNA polymerase II to elongate through a block to transcription in a human gene in vitro. J. Biol. Chem. 264:10799-809.

76. Reines, D., Mote, J. Jr. 1993. Elongation factor Sll-dependent transcription by RNA polymerase II through a sequence-specific DNA-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sei. U S A 90:1917-21.

77. Reines, D., Conaway, J.W., Conaway, R.C. 1996. The RNA polymerase II general elongation factors. Trends Biochem. Sei. 21: 351-5.

78. Reznikoff, W. S. 1977. Formation of the RNA polymerase-lac promoter open complex, pp. 441-54. In: Losick, R., Chamberlin, M. Ed. RNA polymerase. Cold1. Spring Harbor, N.Y.

79. Reynolds, R., Bermudez-Cruz, R.M., Chamberlin, M.J.1992. Parameters affecting transcription termination by Escherichia coli RNA polymerase. I. Analysis of 13 rho-independent terminators. J. Mol. Biol. 224: 31-51.

80. Reynolds, R., Chamberlin, M.J. 1992. Parameters affecting transcription termination by Escherichia coli RNA. II. Construction and analysis of hybrid terminators. J. Mol. Biol. 224: 53-63.

81. Rice, G.A., Kane, C.M., Chamberlin, M.J. 1991. Footprinting analysis of mammalian RNA polymerase II along its transcript: an alternative view of transcription elongation. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 4245-9.

82. Rice, G.A., Chamberlin, M.J., Kane, C.M. 1993. Contacts between mammalian RNA polymerase II and the template DNA in a ternary elongation complex. Nucleic Acids Res. 21:113-8.

83. Rozovskaia, T.A., Chenchik, A.A., Tarusova, N.B., Bibilashvili, R.Sh., Khomutov, R.M. 1981. Pyrophosphate analogs in the pyrophosphorolysis reaction catalyzed by Escherichia coli RNA polymerase. Mol. Biol. (Mosk) 15:1205-23.

84. Rozovskaia, T.A., Chenchik, A.A., Bibilashvili, R.Sh. 1981. Reaction of pyrophosphorolysis catalyzed by Escherichia coli RNA polymerase. Mol. Biol. (Mosk) 15: 636-52.

85. Sastry, S. and Ross, B. M. 1998. RNA-binding site in T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95: 9111-6.

86. Severinov, K., Mooney, R., Darst, S. A., Landick, R. 1997. Tethering of the large subunits of Escherichia coli RNA polymerase. J. Biol. Chem. 272: 24137-40.

87. Schickor, P., Metzger, W., Werel, W., Lederer, H., Heumann, H. 1990. Topography of intermediates in transcription initiation of E.coli. EMBO J. 9: 221520.

88. Siebenlist, U., Simpson, R. B., Gilbert, W. 1980. E. coli RNA polymerase interacts homologously with two different promoters. Cell 20: 269-81.

89. Siegele, D.A., Hu, J.C., Walter, W.A. and Gross, C.A. 1989. Altered promotor recognition by mutant forms of the sigma 70 subunit of Escherichia coli RNA polymerase. J. Mol. Biol. 206: 591-603.

90. Sidorenkov, I., Komissarova, N., Kashlev, M. 1998. Crucial role of the RNA:DNA hybrid in the processivity of transcription. Mol.Cell 2: 55-64.

91. Sousa, R., Chang, Y. J., Rose, J. P. and Wang, B. C. 1993. Crystal structure ofbacteriophage T7 RNA polymerase at 3.3 A° resolution. Nature 364: 593-9.

92. Sousa, R. and Padilla, R. 1995. A mutant T7 RNA polymerase as a DNA polymerase. EMBO J. 14: 4609-21.

93. Sousa, R. 1996. Structural and mechanistic relationships between nucleic acid polymerases. TIBS 21:186-90.

94. Straney, D. C., Crothers, D. M. 1987. A stressed intermediate in the formation of stably initiated RNA chains at the Escherichia coli lac UV5 promoter. J. Mol. Biol. 193: 267-78.

95. Sweetser, D., Nonet, M. and Yong, R. A. 1987. Prokaryotic and eukaryotic RNA polymerases have homologous core subunits. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:11926.

96. Suh, W.C., Ross, W., Record, M.T. 1993. Two open complexes and a requirement for Mg2+ to open the lambda PR transcription start site. Science 259: 358-61.

97. Surratt, C.K., Milan, S.C., Chamberlin, M.J. 1991. Spontaneous cleavage of RNA in ternary complexes of Escherichia coli RNA polymerase and its significance for the mechanism of transcription. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 7983-7.

98. Uptain, S.M., Kane, C.M., Chamberlin, M.J. 1997, A. Basic mechanisms of transcript elongation and its regulation. Annu. Rev. Biochem. 66:117-72.

99. Uptain, S.M., Chamberlin, M.J. 1997, E. Escherichia coli RNA polymerase terminates transcription efficiently at rho-independent terminators on single-stranded DNA templates. Proc. Natl. Acad. Sei. U S A 94:13548-53.

100. Wang, D., Meier, T.I., Chan, C.L., Feng, G., Lee, D.N., Landick, R. 1995. Discontinuous movements of DNA and RNA in RNA polymerase accompany formation of a paused transcription complex. Cell 81: 341-50.

101. Waldburger, C., Gardella, T., Wong, R. and Susskind, M. M. 1990. Changes in conserved region 2 of Escherichia coli sigma 70 affecting promotor recognition. J. Mol. Biol. 215:267-76.

102. Wilson, K.S., von Hippel, P.H. 1994. Stability of Escherichia coli transcription complexes near an intrinsic terminator. J. Mol. Biol. 244: 36-51.

103. Wilson, K.S., von Hippel, P.H. 1995. Transcription termination at intrinsic terminators: the role of the RNA hairpin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8793-7.

104. Wu, F. Y., Yarbrough, L. R., Wu, C. W. 1976. Conformational transition of Escherichia coli RNA polymerase induced by the interaction of sigma subunit with core enzyme. Biochemistry 15: 3254-8.

105. Yager, T.D., von Hippel, P.H. 1991, A. thermodynamic analysis of RNA transcript elongation and termination in Escherichia coli. Biochemistry 30:1097-118.

106. Zaychikov, E., Martin, E., Denissova, L., Kozlov, M., Markovtsov, V., Kashlev, M., Heumann, H., Nikiforov, V., Goldfarb, A. and Mustaev, A. 1996. Mapping of catalytic residues in the RNA polymerase active center. Science 273:107-9.

107. Zhang, G. and Darst, S. A. 1998. Structure of the Escherichia coli RNA polymerase alpha subunit amino-terminal domain. Science 281: 262-6.

108. Zhang, G., Campbell, E., Minakhin, L., Richter, C., Severinov, K. and Darst, S. 1999. Crystal Structure of Thermus aquaticus Core RNA polymerase at 3.2 A Resolution. Cell 98: 811-24.

109. Zhou, W., Reines, D., Doetsch, P.W. 1995. T7 RNA polymerase bypass of large gaps on the template strand reveals a critical role of the nontemplate strand in elongation. Cell 82: 577-85.