Молекулярный механизм реакций расщепления и элонгации РНК-транскрипта, катализируемых ДНК-зависимой РНК-полимеразой E. coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Сосунова, Екатерина Владимировна

• Сосунова, Екатерина Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Сосунова, Екатерина Владимировна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ТЕРМИНОВ.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность темы.

Цель работы и задачи исследования.

Научная новизна и практическая ценность работы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. Структура многосубъединичных ДНК-зависимых РНК-полимераз.

Общие сведения о РНКП и транскрипционном цикле.

Паузирование и бэктрэкинг.

Структурные особенности РНКП,.

Структурно-функциональная модель тройного элонгационного комплекса.18

II. Структурно-функциональная модель активного центра РНКП.

Двуметаллический механизм катализа.

Механизм катализа многосубъединичной РНКП.

Характеристика реакции 3'-5'-экзонуклеазного расщепления.

Влияние мутационных замен в р-субъединице РНКП Е. coli на 3'-5'-экзонуклеазную активность.

Молекулярное моделирование активного центра РНКП Е. coli.

III. Другие механизмы катализа нуклеотидилтрансферазной реакции.

С участием одного иона Me +.

Кислотно-основной механизм катализа (без ионов Ме2+).

IV. Эндонуклеазное расщепление РНК, катализируемое РНКП.

Нестимулируемое эндонуклеазное расщепление.

Фактор-стимулируемое эндонуклеазное расщепление РНК.

V. Структура Gre факторов.

Доменная организация Gre факторов.

Поверхностное распределение зарядов. Роль положительно. заряженного кластера аминокислотных остатков N-концевого домена.

Функции Gre факторов.

Анти-Gre факторы.«.

VI.Crpyicrypa и функции TFIIS.

Доменная организация TFIIS.

Функции TFIIS.

Структура комплекса РНКП-II/TFIIS с разрешением 3.8А.

Взаимодействия TFIIS с другими компонентами транскрипции.

Примеры действия белковых факторов как подвижных каталитических компонентов активного центра.50 ■

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы, плазмиды.

Реактивы.

Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

Электрофорез нуклеиновых кислот в денатурирующем геле.

Белковый SDS-электрофорез.

Получение промоторных фрагментов ДНК.

Получение РНК-полимеразы Е. coli.

Буферы, использовавшиеся при выделении субъединиц и реконструкции РНКП E.coli.

Выделение /? и Р'-субъединиц.

Выделение а-субъединицы.

Выделение а-субъединицы.56 >

Сборка и очистка РНК-полимеразы E.coli.

Выделение клеточной РНКП.

Выделение Gre факторов.

Получение мутационных замен в РНКП и GreB.

Получение РНКП с мутационными заменами.

Получение GreB с мутационными заменами E44Q, D44N.

Условия реакций, катализируемых РНКП Е. coli.

Анализ активности ТЭК и продуктов реакций.

Получение транскрипционных комплексов.

Условия реакции полимеризации и пирофосфоролиза.

Условия реакций 3'-5'-ЭЮО- и эндонуклеазного расщепления.

Введение модифицированных нуклеотидных субстратов в

РНК-транскрипт.

Реакции расщепления РНК, катализируемые щелочной фосфатазой

АР), фосфодиэстеразой змеиного яда (SVPD) и рибонуклеазой Т1.

Метод Fe2+-индуцированного расщепления.

Получение ковалентных сшивок РНКП с GreB.

Получение химических модификаций.

Синтез А ТРаСН3.

Синтез цитидин-5'-фосфат-(2',3)-метилфосфаната.

Синтез цитидин-5'-трифосфат-3метилфосфата.

Идентификация продуктов РНК расщепления в ТЭК методом ТСХ на PEI целлюлозе.

Определение Ка, Кт, Ута*.

Компьютерное моделирование.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

I. Механизм стимуляции реакции эндонуклеазного расщепления РНК

Gre факторами.

Gre факторы резко увеличивают константу связывания Mg-II в активном центре РНК-полимеразы.

Анализ возможности аллостерического механизма действия Gre факторов на связывание каталитического иона Mg-II.

Моделирование комплекса РНК-полимеразы с GreB.

Контакты РНК с GreB в транскрипционном элонгационном комплексе.

Мутационные замены D41N, E44Q в N-концевом домене GreB драматически нарушают стимулирующую активность GreB, но < не влияют на связывание с РНКП.

Мутационные замены D41N, E44Q в N-концевом домене GreB нарушают способность Gre фактора связывать каталитический ион Mg-II в активном центре РНКП.

GreB факторы с мутационными заменами E44Q и D4IN ингибируют внутреннюю» Gre-независимую реакцию эндонуклеазного расщепления РНК.

Мутантные GreB факторы ингибируют элонгацию РНК в ТЖ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярный механизм реакций расщепления и элонгации РНК-транскрипта, катализируемых ДНК-зависимой РНК-полимеразой E. coli»

Атом кислорода в proR положении фосфатной группы первого неспаренного нуклеотидного остатка РНК не участвует в координации Ме-Н, но необходим для катализа эндонуклеазнго расщепления.96

Влияние присутствия дезоксирибонуклеинового остатка в РНК на скорость эндонуклеазного расщепления.99

Роль нуклеотидной части первого неспаренного остатка РНК в эндонуклеазном расщеплении.99

Роль первого неспаренного нуклеотидного остатка РНК, расположенного в +1 положении относительно i+1 сайта, в Gre-зависимом эндонуклеазном расщеплении.102

Построение молекулярной модели эндонуклеазной реакции.104

Пуриновое основание первого неспаренного нуклеотидного остатка РНК участвует в катализе эндонуклеазной реакции.106

Заключение: молекулярный механизм Gre-независимой эндонуклеазной реакции.106

III. Влияние мутационных замен в активном центре РНК-полимеразы на реакции синтеза и деградации.108

Выбор и получение мутационных замен в активном центре

РНК-пол имеразы.108

РНКП с мутационными заменами имеют дефекты в скорости элонгации и увеличенные значения Km для нуклеотидных субстратов.109

Мутационная замена ED813,814AA не влияет на связывание каталитического иона Mg-II в реакции синтеза тримера CpApU.113

Анализ влияния мутационных замен в активном центре РНКП на 3'-5'-экзонуклеазную активность.114

Мутационный анализ Е-сайта.117

Пирофосфат в активном центре РНКП может связываться двумя альтернативными путями.119

Влияние рН на скорость реакций гидролитического расщепления РНК, катализируемых мутантными РНК-полимеразами.120

Влияние мутационных замен на эндонуклеазную реакцию.122'

Анализ способности к бэктрэкингу РНКП с мутационными заменами; методом Ft?*-индуцированного расщепления.125

Заклю чение.127

IV. Обсуждение результатов.130

Сравнение различных структурных моделей комплекса РНКП с транскрипционными факторами расщепления.130

Структурная модель комплекса РНКП/GreB, полученная на основе рентгеноструктурного анализа с разрешением 15 А.130

Биохимический анализ взаимодействия РНКП с Gre.133

Сравнение различных структурных моделей комплекса РНКП/Gre.134

ВЫВОДЫ.137

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.138

БЛАГОДАРНОСТИ.139

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.140

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ТЕРМИНОВ

РНКП - ДНК-зависимая РНК-полимераза

ТЭК — транскрипционный тройной элонгационный комплекс dNTP, NTP - дезоксирибо- и рибо-5'-трифосфат dNDP, NDP - дезоксирибо- и рибо-5'-дифосфат dNMP, NMP - дезоксирибо- и рибо-5'-монофосфат оцДНК/РНК - одноцепочечная ДНК/РНК п.н. - пар нуклеотидов а.к. — аминокислотный остаток нт. - нуклеотид

НК - нуклеиновая кислота

BSA - бычий сывороточный альбумин

DTT- дитиотреитол

EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота

IPTG - изопропил-Р-тио-В-галактопиранозид

PMSF - фенилметилсульфонилфторид

SDS - додецилсульфат натрия

ПААГ - полиакриламидный гель

PCR - полимеразная цепная реакция

ТСХ - тонкослойная хроматография

DMF — диметилформамид

PIPES - 1,4-пиперазинбис(этансульфокислота)

PMSF - фенилметилсульфонилфторид

Tris - 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол

CAPS - З-циклогексиламин-1-пропан сульфокислота (СбНцЫЩСНг^ОзН)

HIV-RT - обратная транскриптаза вируса иммунодефицита человека бэктрэкинг - движение РНКП в обратном транскрипции направлении по ДНК матрице, приводящее к остановке элонгации в следствие потери контакта между 3'-концом РНК транскрипта и активным центром РНКП, и образованию одноцепочечного 3'-концевого фрагмента РНК паузирование - временная остановка транскрипции, вызванная определенными внешними или внутренними сигналами «внутренняя» эндонуклеазная реакция - реакция расщепления 3'-концевого фрагмента РНК, катализируемая только РНКП в отсутствие внешних факторов (Gre-независимая, нестимулируемая) Gre-зависимая эндонуклеазная реакция - реакция расщепления 3'-концевого фрагмента РНК, катализируемая РНКП в присутствии Gre факторов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Основной каталитической функцией ДНК-зависимых РНК-полимераз (РНКП) является образование фосфодиэфирной связи в ходе полимеризации РНК. Кроме того, РНКП обладают эндонуклеазной активностью, благодаря которой происходит гидролитическое отщепление З'-концевого фрагмента РНК. Эта реакция осуществляется в тех случаях, когда в процессе элонгации активный центр утрачивает контакт с 3'-концом РНК-транскрипта в результате «соскальзывания» РНКП в обратном направлении (процесс бэктрэкинга), в результате чего элонгационный комплекс временно или необратимо инактивируется. Гидролитическое отщепление перешедшего в одноцепочечное состояние З'-концевого фрагмента РНК приводит к образованию нового 3'-конца РНК, способного к дальнейшему удлинению.

Прокариотические белковые факторы GreA, GreB и их эукариотический аналог TFIIS, взаимодействуя с РНКП, резко увеличивают скорость эндонуклеазного расщепления РНК. В их присутствии увеличивается эффективность и точность транскрипции in vivo и in vitro, а также существенно уменьшается время прохождения транскрипционных пауз (Borukhov et al., 1993; Izban and Luse, 1992a, Erie et al., 1993).

По аналогии с односубъединичными ДНК- и РНК-полимеризующими ферментами было предположено, что многосубъединичные РНКП осуществляют полимеризацию РНК с участием двух ионов двухвалентных металлов (Steitz, 1998). Однако,. полученные к началу данной работы структурные и биохимические данные позволили надежно идентифицировать только один каталитический ион Mg2+, прочно удерживаемый в активном центре тремя абсолютно консервативными остатками аспартатов универсального мотива NADFDGD. Ни одна из полученных в настоящее время трёхмерных структур РНКП, в том числе структура тройного комплекса дрожжевой РНКП, четкого доказательства присутствия в активном центре второго иона Ме2+, участвующего в полимеризации РНК, не представила. В различных структурах он либо отсутствует, либо связан в разных положениях относительно первого иона Mg и не удовлетворяет условиям катализа с участием двух ионов Ме2+. Роль ионов магния в реакции эндонуклеазного расщепления к началу данной работы была практически не изучена.

Когда данная работа только начиналась, в нашей лаборатории была обнаружена реакция 3'-5' экзонуклеазного расщепления РНК-транскрипта РНКП Е. coli. Было установлено, что 3'-5' экзонуклеазное расщепление происходит с низкой скоростью и требует высоких концентраций ионов Mg2+. В присутствии некомплементарного NTP реакция резко ускоряется и требует значительно меньших концентраций ионов Mg2+ (Сосунов, 2003). Эти наблюдения свидетельствуют о присутствии в активном центре второго, слабосвязанного каталитического иона Mg , стабилизируемого некомплементарным NTP. Эти данные послужили отправной точкой для выдвижения в нашей лаборатории гипотезы единого механизма всех реакций, катализируемых РНКП, в основе которой лежит предположение о том, что второй ион Mg2+ во всех реакциях, катализируемых РНКП, располагается в одном и том же месте активного центра, но может требовать дополнительной стабилизации, специфичной для каждого типа реакций.

Цель работы и задачи исследования

Целью работы являлась проверка двуметаллической модели единого активного центра РНКП E.coli, в котором катализируются все известные активности этого фермента, и построение молекулярных моделей для реакций эндонуклеазного расщепления РНК в присутствии и в отсутствие Gre факторов, катализируемых РНКП с участием двух ионов Mg2+.

В работе ставились следующие задачи:

1. Выяснить природу эффекта стимуляции эндонуклеазной активности РНКП E.coli транскрипционными факторами расщепления GreB и GreA.

2+

2. Изучить роль 3'-концевого фрагмента РНК в удержании второго иона Mg при эндонуклеазной реакции в присутствии и в отсутствие факторов расщепления.

3. Выяснить влияние аминокислотных остатков, расположенных в непосредственной близости от активного центра РНК-полимеразы, на каталитическую активность РНКП в реакциях экзо- и эндонуклеазного расщепления и полимеризации.

Научная новизна и практическая ценность работы

В работе продемонстрировано, что прокариотические факторы расщепления GreA и GreB резко увеличивают константу связывания второго каталитического иона Mg2* (Mg-П) в активном центре РНКП Е. coli. На основании биохимического и мутационного анализа, а также молекулярного моделирования комплекса РНКП с GreB, предложен механизм стимулирующего эндонуклеазное расщепление действия Gre белков, согласно которому два инвариантных аминокислотных остатка D41 и Е44, расположенных в концевой петле N-концевого домена Gre фактора, непосредственно участвуют в координации каталитического иона Mg-II в активном центре РНКП и катализе реакции в процессе эндонуклеазного расщепления.

Продемонстрировано, что первый неспаренный З'-концевой нуклеотидиый остаток РНК-транскрипта, расположенный в +1 положении относительно i+J сайта активного центра РНКП, способствует Gre-независимой эвдонуклеазной реакции: 1) путем предоставления фосфатной группы для дополнительной стабилизации и координации каталитического иона Mg-II и катализа; 2) в случае, если в указанном положении находится остаток пуринового нуклеотида, - путём предоставления атома N7 пуринового основания для катализа реакции.

Показано, что в присутствии каталитически неактивных Gre факторов с мутационными заменами D41N и E44Q ингибируется Gre-независимая «внутренняя» эндонуклеазная реакция. Предположено, что в присутствии Gre факторов изменяется положение фосфатной группы в +1 положении относительно i+1 сайта активного центра, в результате чего происходит ингибирование Gre-независимой эвдонуклеазной реакции.

Изучена роль фосфатной группы первого неспареного З'-концевого нуклеотидного остатка РНК в реакции эндонуклеазного выщепления динуклеотида в присутствии Gre факторов. Показано, что присутствие фосфатной группы в этом положении (+1 положение относительно i+1 сайта активного центра) необходимо для действия Gre факторов.

С учетом двуметаллической модели активного центра РНК-полимеразы К coli построены молекулярные модели для Gre-независимой и Gre-зависимой эндонуклеазных реакций.

Проведен мутационный анализ активного центра РНКП К coli и изучена роль остатков Е813, D814, R1106, R678, К1073 р-субъединицы и остатков N458 и R731 р'-субъединицы в реакциях расщепления и удлинения РНК-транскрипта.

Результаты данной работы подтверждают развиваемую в нашей лаборатории концепцию единого двуметаллического механизма всех реакций, катализируемых единственным активным центром РНКП, в формировании которого кроме РНК-полимеразы принимают участие различные компоненты транскрипционного элонгационного комплекса.

Апробация работы: Материалы диссертационной работы были представлены на Международных конференциях "Prokaryotic transcription initiation", 2001 и 2003, Saxtons River, Vermont, USA.

Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста и содержит 61 рисунок. Библиография включает 190 названия.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Сосунова, Екатерина Владимировна

выводы

1. Прокариотические транскрипционные факторы расщепления GreA и GreB приводят к увеличению связывания второго каталитического иона Mg2+ в активном центре РНКП Е. coli.

2. Предложена модель стимулирующего действия Gre факторов, согласно которой абсолютно консервативные аминокислотные остатки Asp41 и Glu44, расположенные на конце N-терминального домена, принимают прямое участие в катализе реакции эндонуклеазного расщепления РНК путем координации каталитического иона Mg-II и, по-видимому, координации атакующего гидроксила воды.

3. Фосфатная группа нуклеотидного остатка РНК, расположенного в +1 положении относительно i+1 сайта активного центра РНКП Е. coli принимает участие в катализе Gre-независимого эндонуклеазного расщепления.

4. Скорость Gre-независимой эндонуклеазной реакции увеличивается на порядок, когда в +1 положении относительно i+1 сайта находится остаток пуринового нуклеотида, N7 атом которого участвует катализе реакции.

5. Построена структурная модель тройного элонгационного комплекса РНКП с GreB и модель для Gre-независимой реакции эндонуклеазного расщепления.

6. Проведен анализ мутационных замен в активном центре РНК-полимеразы Е. coli PED813,814AA, PR1106A, PR678A, РК1073А, P'N458A, P'R731A. Результаты анализа использованы при построении двуметаллической модели единого активного центра РНКП и модели для нестимулируемой эндонуклеазной реакции.

7. Мутационные замены а.к. остатков R1106, R678, К1073 Р-субъединицы, особенно R678, приводят к нарушениям в связывании фосфатной части NTP в активном центре РНКП.

8. Мутационные замены а.к. остатков N458 и R731 Р'-субъединицы приводят к уменьшению стимулирующего эффекта некомплементарного NTP на скорость 3'-5' экзонуклеазной реакции и ухудшению связывания этого NTP, что подтверждает существование и структурное расположение Е-сайта.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Sosunov V, Sosunova Е, Mustaev A, Bass I, Nikiforov V, Goldfarb A. (2003) Unified two-metal mechanism of RNA synthesis and degradation by RNA polymerase. EMBO J. 22(9): 2234-44

2. Sosunova E, Sosunov V, Kozlov M, Nikiforov V, Goldfarb A, Mustaev A. (2003) Donation of catalytic residues to RNA polymerase active center by transcription factor Gre. Proc Natl Acad Sci USA. 100(26): 15469-74

3. Sosunova E, Sosunov V, Nikiforov V, Goldfarb A, Mustaev A. RNA assists self-cleavage in backtracked transcription complexes by catalytic Mg2+-II ion stabilization. FASEB summer research conference «Mechanism and regulation of prokaryotic transcription»; June 2126,2003. Saxtons River, Vermont

4. Sosunov V, Sosunova E, Nikiforov V, Goldfarb A, Mustaev A. The role of the aspartate triad in the active center of RNA polymerase. FASEB summer research conference «Mechanism and regulation of prokaryotic transcription»; June 21-26, 2003. Saxtons River, Vermont

5. Sosunov V, Sosunova E, Nikiforov V, Goldfarb A, Mustaev A. The mechanism of the 3'-5' exonuclease reaction catalysed by RNA polymerase. FASEB summer research conference «Prokaryotic transcription initiation»; Jule 14-19, 2001. Saxtons River, Vermont

БЛАГОДАРНОСТИ

Я искренне благодарна А.А. Мустаеву за помощь и поддержку в процессе выполнения работы, В.Г. Никифорову за руководство и критику, А.Д. Гольдфарбу за создание условий работы и редактирование публикаций, В. Сосунову за безграничную помощь и поддержку. Я очень признательна Ж. М. Горленко, И. А. Басс и А. Кульбачинскому и всем сотрудникам ЛМГМ за доброе отношение и постоянную готовность прийти на помощь в любой ситуации.

Заключение

Нами были проанализированы мутационные замены в р-субъединице: ED813,814AA, R1106A, R678A, К1073А и в р'-субъединице: N458A, R731A. Все заменённые аминокислотные остатки составляют ближайшее окружение активного центра РНКП. К1073, R678, R1106 - образуют ряд положительно заряженных а.к. остатков, которые, согласно ранее полученным данным и модели единого активного центра, должны участвовать в связывании фосфатной части NTP. Кроме того, нам было важно узнать как эти положительно заряженные остатки влияют на связывание каталитического иона Mg-II. Остатки Е813, D814 и N458 согласно разным структурным данным могут принимать участие в связывании Mg-II. Остатки N458 и R731 согласно модели активного центра для 3'-5'-экзонуклеазной реакции принимают участие в образовании Е-сайта, в котором связывается стимулирующий 3'-5'-экзонуклеазную реакцию NTP.

Анализ активности. РНКП с мутационными заменами показал, что в реакции элонгации самые сильные дефекты вызвали мутационные замены ED813,814AA, а также R678A. Наименьший дефект проявил R731A, что вполне оправдано его относительной удалённостью от активного центра.

Сравнение скоростей 3'-5'-экзонуклеазной активности у мутантных РНКП и РНКП дикого типа показало, что ни Е813, D814, ни N458 не участвуют в связывании Mg-II, что учитывалось при построении двуметаллической модели активного центра РНКП (Сосунов, 2003).

Было обнаружено, что мутационная замена остатка N458 меняет предрасположенность РНКП в ТЭК к бэктрэкингу. По-видимому, присутствие N458 необходимо для поддержания 3'-концевого нуклеозидного остатка в /+/ сайте в правильном положении.

На основе полученых данных мы заключили, что высококонсервативные а.к. остатки R1106, R678 и К1073 р-субъединицы действительно принимают участие в связывании фосфатной части NTP, как в реакции полимеризации, так и в реакции NTP-стимулируемого гидролиза РНК. Причем влияние мутационных замен этих а.к. остатков на связывание NTP возрастает в следующем порядке K1073<R1106<R678. То есть остаток R678 наиболее важен для удержания NTP. Этот вывод напрашивается и при анализе трёхмерной структуры РНКП: R1106 в нормальных условиях образует ионный контакт с D814, а положение К1073 не подходит для того, чтобы поддерживать правильное расположение связанного NTP в активном центре, тогда как боковая цепь R678 свободна от ионных контактов и, согласно модели, может образовывать стабилизирующее взаимодействие с р-, у- фосфатами NTP.

Замены всех положительно заряженных а.к. остатков (кроме удаленного от активного центра R731) приводят к улучшению связывания Mg-II, по-видимому, вследствие уменьшения положительного заряда в районе активного центра, электростатически отталкивающего Mg-II. Однако характер зависимости скорости реакции расщепления от концентрации ионов Mg2+ отостается линейным во всех случаях,. кроме R1106А. В случае этой мутационной замены кривая зависимости выходит на плато, что свидетельствует об увеличении константы связывания Mg-II.

Как было показано (Сосунов, 2003) РНКП дикого типа при щелочных рН в присутствии PPi начинает выщеплять NMP вместо NTP, что свидетельствует от том, что пирофосфат и р-, у- фосфаты NTP могут связываться в активном центре РНКП при полимеризации/пирофосфоролизе и при стимуляции 3'-5'-экзонуклеазного расщепления РНК двумя различными способами. Мы обнаружили, что мутационные замены ED813,814AA, R1106А, R678A и частично К1073А в присутствии пирофосфата PPi также катализируют выщепление не NTP, a NMP, по-видимому вследствие: структурных изменений вызванных мутационными заменами. Это служит веским потдверждением сделанного предположения о двух способах связывания пирофосфата и р-, у- фосфатов NTP в активном центре РНКП.

Одна из самых дефектных в реакции полимеризации РНКП R678A в реакции 3'-5'-экзонуклеазного расщепления оказалась наиболее активной (рис. III.5). Скорость расщепления у этой РНКП даже выше, чем у R1106A. Причем это нельзя объяснить повышенной константой связывания Mg-II. По-видимому, замена R678A каким-то образом влияет на катализ реакции или приводит к более эффективной для 3'-5'экзонуклеазной реакции конформации ТЭК. Интересно, что скорость эндонуклеазной реакции у этого мутанта не превышает скорости этой реакции у РНКП дикого типа (рис. III.9). Вполне вероятно, что присутствие R678 необходимо для того, чтобы З'-концевой нуклеотид в +1 положении относительно i+1 сайта, занимал каталитически компетентную конформацию (см. раздел результатов II), что вытекает также из анализа построенной нами модели эндонуклеазной реакции.

Мутационные замены N45 8А и R731A приводят к уменьшению симулирующего эффекта NTP на скорость 3'-5'-экзонуклеазного гидролиза и ухудшению связывания стмулирующего NTP. Это свидетельствует в пользу существования и структурного расположения Е-сайта, предсказанного в модели активного центра РНКП для NTP-стимулируемой реакции 3'-5'-экзонуклеазного расщепления (Сосунов, 2003).

IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Сравнение различных структурных моделей комплекса РНКП с транскрипционными факторами расщепления

Молекулярный механизм стимулирующего действия транскрипционных факторов расщепления долгое время оставался загадкой. Недавно в этом направлении произошел настоящий прорыв. Кроме нашей работы (раздел результатов I), практически одновременно сразу в трёх лабораториях, используя различные подходы, были сделаны структурные модели комплекса РНКП с фактором расщепления и предложен молекулярный механизм стимулирующего действия транскрипционных факторов расщепления (Opalka et al., 2003; Laptenko et al., 2003, Kettenberger et al., 2003). Ниже будут обсуждены особенности структурных моделей комплекса бактериальной РНКП с Gre фактором, которые были получены на основе рентгеноструктурного (Opalka et al., 2003) и биохимического (Laptenko et al., 2003) анализа. Структурная модель комплекса эукариотического фактора TFIIS с РНКП-И, полученная с помощью рентгеноструктурного анализа с разрешением 3.8А (Kettenberger et al., 2003), на основе которой был предположен механизм стимулирующего действия TFIIS, рассмотрена в литературном обзоре (с. 46).

Структурная модель комплекса РНКП/GreB, полученная на основе рентгеноструктурного анализа с разрешением 15 А

В работе (Opalka et al., 2003) механизм действия Gre факторов был предложен, исходя из анализа структурной модели комплекса РНКП/GreB (Е. coli), сделанной путем наложения карты электронной плотности с разрешением 15А, на известные трёхмерные структуры РНКП и GreB (рис. IV. 1 А). Оказалось, что в полученном комплексе структура РНКП находится в приоткрытой конформации, тогда как для тройного элонгационного комплекса (ТЭК), с которым Gre факторы функционально взаимодействуют, характерна закрытая конформация, т.е. конформация, в которой домен «зажим» находится в закрытом состоянии (см. лит. обзор, с. 17). Согласно полученной карте электронной плотности, С-концевой домен GreB связывается возле входа во вторичный канал, как и было предположено (Polyakov et.al., 1998), и взаимодействует в основном с двумя а-спиралями в р'-субъединице, которые образуют часть края входного отверстия во вторичный канал (рис. IV. 1 В). N-концевой домен GreB входит во вторичный канал на 45А, и его концевая петля оказывается рядом с активным центром РНКП (рис. IV. 1 А). Две а-спирали, с которыми, согласно модели Opalka и соавт., в основном взаимодействует CTD-GreB, находятся внутри последовательности между консервативными районами D и

Е Р'-субъединицы. Кончик двойной а-спирали N-концевого домена образует контакты с высококонсервативными районами р и р'-субъединиц, окружающих активный центр РНКП, включая универсальный мотив NADFDGD (р'458^64), который содержит триаду каталитических аспартатов, удерживающих ионы Mg2" в активном центре (рис IV. 1 В).

Модель комплекса РНКП/GreB, предложенная Opalka и др., подтверждает предположение об участии кластера положительно заряженных а к. остатков во взаимодействии с 3'-концевым фрагментом РНК Согласно модели, N-концевой домен GreB располагается во вторичном канале таким образом, что положительно заряженные остатки оказываются выстроены в линию вдоль ожидаемого направления выхода одноцепочечного 3'-конца РНК во вторичном канале (рис. IV. 2В) В случае GreA, остатки В

RNAP } »=|

GreB Ж' соёей-ссы! CTD

Рис. IV.I. Структура комплекса РНКП с GreB (Opalka et al., 2003). (А) Результат наложения трёхмерной структуры кор-фермента РНКП Т aquations на карту электронной плотности комплекса с разрешением 15А Трехмерная структура РНКП изображена в виде а-угл сродной цепи Районы совпадения карты электронной плотности с трёхмерной структурой РНКП обозначены голубым цветом. Участки несовпадения обозначены следующим образом: районы pDRl и pDR2, присутствующие в РНКП Е. coli, но отсутствующие в РНКП Taq (Sevcrinov ct a I., 1994). показаны желтым и белым цветами; розовым цветом обозначена электронная плотность, соответствующая GreB. (В) Взаимодействие РНКП с GreB. На рисунке изображена структура РНКП в пределах 4А от GreB. Структуры РНКП и GreB изображены в виде а-углеродной цепи Участки Р-субьедииицы показаны голубым цветом: [V-субъединицы - розовым; каталитический ион Mg-I изображен желтым. Пептидные цепи GreB выделены красным цветом; район NTD GreB. с которым 3"-конец РНК образует ковалентные сшивки, выделен зелёным цветом (Koulich et al. 1997; Stebbins et al., 1995). 8 виде цветных кружков изображены а-углеродные атомы консервативных а.к. остатков положительно заряженного кластера района NTD-GreB. слева-направо: GreA R37 (голубой); GreA R52/GreB К52 (синий); GreB R53, R56, R60 и R67 (тёмно-синий). Показано положение а.к. D121 и Р123 в CTD-GreB, мутационные замены которых оказывают влияние на связывание с РНКП (Loizos and Darst 1999) Матричная нить ДНК изображена темно-зелёным цветом, РНК-транскрипт - фиолетовым. РНКП схематично разделена на три района (вверху рисунка): район активною центра, вторичного канала и край вторичного канала Структура GreB также схематично разделена на три района (внизу): концевая петля NTD (сс tip), N-концевая двойная а-спираль (coiled-coil) и С-концевой домен (CTD), зажим F-мостовая спираль

-----::: . . . , ^ GreB-NTD

GreB-CTD

R37 и R52. образующие положительно-заряженный кластер у этого белка, располагаются на расстоянии около 20А от активного центра. В случае GreB. положительно заряженные а.к. остатки кластера образуют линию вдоль края двойной а-спирали N-концевого домена, при этом расстояние от активною центра до ближайшего остатка 20А, а до самого дальнего - 45А. Это объясняет способность GreB выщеплягь РНК-фрагменты длиной 218 вт, a GreA - РНК-фрагменты длиной 2-3 нт.

Что касается механизма стимулирующего действия GreB. то из-за низкого разрешения кристаллов комплекса авторы не могут точно сказать, прямо Gre белки участвуют в катализе реакции, предоставляя инвариантные остатки NTD D41 и Е44 для координации каталитического иона Mg-II. или индуцируют какое-то аллостерическое изменение в структуре РНКП. Расстояние от кислых а.к. остатков GreB D41 и Е44 до сайта связывания второго иона Mg:\ согласно предложенной авторами структурной модели комплекса, составляет 13.5 и 8.5 А. соответственно. Эго слишком большое расстояние для прямого участия D41 и Е44 в координации Mg-II. Интересно, что в этой работе мутационные замены D41A и Е44А в NTI)-GreB приводят к не очень большому уменьшению активности по сравнению с РНКП WT в системе T3K16G на Т7А1 промоторе (рис. IV.2). Надо заметить, что выбранная система не очень удачна для анализа активности мутантных Gre факторов, т.к. глядя на приведенную авторадиограмму трудно количественно оценить дефект, обусловленный мутационными заменами. Тем не менее, ссылаясь на приведенные данные (рис. IV.2), Opalka и соавт. утверждают, что мутационные замены D41A и Е44А значительно, но не драматически нарушают каталитическую активность Gre факторов.

Структурные и биохимические данные, приведенные Opalka и соавт., свидетельствуют больше в пользу аллоетерического (непрямого) механизма действия Gre факторов, через привлечение а.к. остатка 1)814 fi-субъединицы. Однако, нами было покавремя, мин

T3K16G '

- ,V1 D'.IA tJJA ! .LL§ ' 1? ■ s продать-1 расщепления

GreA время, мин

T3K1SG ■ продукты расщепления I

GreB л 1 D-1'А ( МЛ |0*(1Л fM»

П ] * ' 1 • 1Я is 11 |J |. |3 1 ■

HI i T ! m

Рис. IV.2. Электрофореграмма, демонстрирующая активность Gre факторов с мутационными заменами в реакции расщепления РНК в T3KI6G (данные Opalka el al,, 2003). зано, что этот остаток (D814) не принимает участия в связывании Mg-II в реакции Gre-зависимого расщепления (раздел результатов I, с.71).

Таким образом, рентгеноструктурный анализ двойного комплекса РНКП (в приоткрытой конформации) с GreB с низким разрешением показал, что Gre белки связываются во вторичном канале РНКП и N-концевой1 домен подходит достаточно близко к активному центру РНКП. Однако, полученного разрешения оказалось недостаточно для определения того, как именно Gre фактор участвует в катализе эндонуклеазного расщепления.

Биохимический анализ взаимодействия РНКП с Gre

На основании биохимического анализа комплекса РНКП/Gre была предложена еще одна структурная модель комплекса РНКП/GreA (рис. IV.3; рис. IV.5B) и предположен молекулярный механизм действия Gre факторов (Laptenko et al., 2003).

Определяя область РНКП, участвующую во взаимодействии с Gre белками авторы применили метод ковалентных сшивок. Восемь поверхностно экспонированных, функционально неважных остатков GreB, не участвующих во взаимодействии с РНКП, были заменены на Cys. Мутантные GreB обрабатывали фотореактивным реагентом 4-азидосалицил-2,2-дитиопиридил[358]цистеин (ASDPC), при этом вместо цистеиновой тио-группы образуется фотореактивая азидо-группа, с радиусом действия 15А. Обработанные ASDPC мутантные GreB инкубировали с кор-РНКП, затем облучали УФ и анализировали в SDS-ПААГе. Наиболее эффективная сшивка образуется из двух цистеиновых остатков NTD-GreB: из Cys43, расположенного в N-концевой а-спирали «coiled-coil» домена, и из Cys53, расположенного в середине положительно-заряженного кластера а.к. остатков N-концевого домена, при этом сшивки образуются в основном с Р'-субъединицей. Несколько минорных сшивок образуется из Cys43 с Р-субъединицей. Из Cys23, который расположен на отрицательно-заряженной стороне поверхности NTD GreB, относительно слабое ковалентное взаимодействие образуется с Р'-субъединицей. Остатки Cys97 и Cys78, расположенные в CTD GreB, взаимодействуют с Р- и Р'-субъединицами, соответственно. Ковалентная сшивка из Cys 128 и Cys 154 на положительно-заряженной стороне CTD GreB более эффективна и происходит одновременно с Р- и р'-субъединицами (рис. IV.3A). На основании этих данных было заключено, что NTD-GreB окружен Р'-субъединицей, исключая концевую петлю, которая также контактирует с Р-субъединицей. С-концевой домен GreB расположен рядом с Р- и Р'-субъединицами, по-видимому там, где субъединицы контактируют друг с другом (рис. IV.3 А).

Для более детального анализа комплекса РНКП с GreB был использован гидрокснлрадикальный фугпринтинг Fe-EDTA (Wang et al., 1997), а также локализованы районы расщепления РНКП вблизи активного центра гидроксильными радикалами, образованными ионом связанным в активном центре РНКП (Zaychikov et al., 1996; Mustaev et al., 1997). Согласно полученным данным было показано, Gre факторы взаимодействуют в основном с Р' -субъединицей в районах F, G, G* и с неконсервативными участками между районами Е и F, и между G и Н. Согласно данным по белок-белковым сшивкам, оба Gre фактора взаимодействуют с РНКП в районах D и Е р-субъединицы, те в непосредственной близости от активного центра фермента и его ближайшего окружения Основные районы Gre факторов, находящиеся вблизи активного центра РНКП, расположены внутри консервативного района G40-E47 на конце Gre-NTD. щ шг шЯ&Р*^* р р If "Я

Рнс. IV.3. Биохимический анализ комплекса РНКП/Gre ELcoli (Laptenko et al., 2003). (A) Схематичное представление результатов фотореактивируемых ковалентных сшивок в комплексе РНКП/GreB Обозначено расположение восьми остатков Cys, которые были модифицированы в структуре GreB. (В) Результаты экспериментов по гидрокенлрадикльиому расщеплению РНКП Е. coli в комплексе с Gre факторами (показаны на трехмерной структуре холофермента РНКП Т. thermophilic (Vassylyev et al. 2002». о-субъсдиннца не показана. Петля, несущая триаду каталитических аспартатов, выделена фиолетовым цветом Синим цветом выделены области р-субъединицы, защищенные GreB от гидроксилрадикального расщепления; зелёным - области защищенные от гидроксилрадикального расщепления в р-субъединице; светло-желтым - области слабой защиты в р-субъединице; красным и оранжевым цветами показаны области усиления гидроксилрадикального расщепления в Р и р"-субьединицах в присутствии GreB.

Сравнение структурных моделей комплекса РНКП/Gre

Сравнение структурных моделей, предложенных в разных работах, показало, что построенная нами модель, отличается от структурной модели Opalka и соавт углом поворота GreB во вторичном канале В нашей модели CTD повёрнут против часовой стрелки приблизительно на 120 градусов, относительно оси вторичного канала, по сравне

Рнс. IV.4. Структурная модель комплекса РНКП/GreB, сделанная в настоящей работе (II) и предложенная Opalka и соавт, на основе данных рентгеноструктурного анализа комплекса РНКП/GrcB (I). Стрелкой показано направление вращения структуры GreB относительно продольной оси вторичного каната в модели Opalka и соавт, необходимого для того, чтобы она приняла положение аналогичное положению GreB в нашей модели (II). Из структуры РНКП изображены только участки Р"-субъединицы: неструктурированные участки полипептидной цепи изображены белым цветом, р-слон - в виде голубых стрелок, а-спирали - в виде красных цилиндров: указано положение двух каталитических ионов Mg3' (зелёный и фиолетовый). Структура GreB изображена зелёным цветом Показано положение аминокислотных остатков Gre В D41 и Е44 и расстояние от них до каталитического нона Mg-II в случае каждой структурной модели. нию с положением CTD-GreB в структуре Opalka и соавт (рис. 1V.4). При таком расположении концевые остатки D41 и Е44 NTD находятся достаточно близко к активному центру, чтобы напрямую координировать Mg-II и атакующую молекулу воды, а С-концевой домен взаимодействует как с р'-субъединицей, так и с fi-субъединицей Как уже обсуждалось выше в комплексе РНКП/GreB Opalka и соавт РНКП, во-первых, находится в приоткрытой конформации, во-вторых, не связана с НК, т.е. присутствует в свободном виде, а не в сосгаве тройного элонгационного комплекса, с которым функционально взаимодействует Gre фактор. Перечисленные факты оставляют возможность того, что GreB в комплексе с такой РНКП находится не в окончательном функционально-компетентном положении, а в промежуточном положении, которое он может занимать на пути к правильному связыванию

Данные Laptenko и соавт показывают, что вся N-концевая «coiled-coil» спираль f}'(V673-E695) в присутствии Gre факторов защищена от гид роксил рад и кал ьного расщепления (рис. IV.5B), а С-концевой домен образует контакты как с р1-субъединицей, так и с Р-субъединицей (pHC.IV.ЗА). Эти данные «перекрывают» районы взаимодействия Gre фактора с РНКП как в модели Opalka и соавт , так и в нашей структурной модели (рис IV 5). В структурной модели Laptenko и соавт., построенной с учетом рентгеноструктурных данных Opalka и соавт., GreA фактор занимает промежуточное положение по сравнению с положением GreB в нашей модели и модели Opalka и соавт. (рис. IV.4, I; рис. IV 5)

Не исключено, что перед тем как занять наиболее выгодное для стимуляции эндонуклеазного расщепления положение, Gre фактор занимает несколько предварительных сайтов связывания во вторичном канале РНКП, что и отражают результаты структурного и биохимического анализа комплекса РНКП/Gre Возможно также, что относительное расположение доменов в Gre факторе после связывания с РНКП может изменяться, как в случае фактора TFIIS (см. лит обзор).

Рис. IV.5. Сравнение структурных моделей комплекса РНКП/Gre. (А) Структурная модель, сделанная на основе трёхмерной карты электронной плотности с разрешением J 5 A (Opalka et al., 2003). Вид со стороны вторичного канала. GreB обозначен зелёным цветом. р-субъеднница -желтым, р' - белым, а 1 и II - синим и болотным; «1 - тёмно-зелёным Показано взаимодействие CTD GreB с двумя а-сп и рал я ми Р'-субъединицы расположенных при входе во вторичный канал (В) Структурная модель комплекса GrcA/РНКП Т. thermophilic, сделанная на основе биохимического анализа комплекса Gre факторов с РНКП Е. coli (Laptenko et al., 2003) Аналогичное представление со стороны вторичного канала GreB обозначен голубым цветом, р-субъединица - желто-оранжевым, р' - белым. Синим цветом выделены области Р'-субъединицы защищенные GreB от гидроксилрадикального расщепления, зеленым — области защиты в р-субъедннице, красным цветом - области усиления расщепления в присутствии Gre.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Сосунова, Екатерина Владимировна, 2004 год

1. Кульбачинский А. (2003), кандидатская диссертация, Институт молекулярной генетики РАН, Москва.

2. Николаев Т. (1999), дипломная работа, Институт молекулярной генетики РАН, Москва.

3. Сосунов В. (2003), кандидатская диссертация, Институт молекулярной биологии РАН, Москва.

4. Лурье Ю. (1989) Учебник по аналитической химии, Химия, Москва

5. Agarwal К., Baek К.Н., Jeon С.J., Miyamoto К., Ueno A., Yoon H.S. (1991) Stimulation of transcript elongation requires both the zinc finger and RNA polymerase II binding domains of human TFIIS. Biochemistry, 30; 7842-51.

6. Armache K.J., Kettenberger H., Cramer P. (2003) Architecture of initiation-competent 12-subunit RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sci USA, 100; 6964-8.

7. Arndt K.M. and Chamberlin M.J. (1990) RNA chain elongation by Escherichia coli RNA polymerase. Factors affecting the stability of elongating ternary complexes. J. Mol. Biol. 213; 79-108.

8. Artsimovitch I., Landick R. (2000) Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc Natl Acad Sci USA, 97; 7090-5.

9. Awrey D.E., Weilbaecher R.G., Hemming S.A., Orlicky S.M., Kane C.M., Edwards A.M. (1997) Transcription elongation through DNA arrest sites. A multistep process involving both RNA polymerase II subunit RPB9 and TFIIS. J Biol Chem., 272; 14747-54.

10. Barr J.N., Whelan S.P., Wertz G.W. (2002) Transcriptional control of the RNA-dependent RNA polymerase of vesicular stomatitis virus. Biochim Biophys Acta, 1577; 337-53.

11. Beese L.S., Steitz T.A. (1991) Structural basis for the 3-5' exonuclease activity of Escherichia coli DNA polymerase I: a two metal ion mechanism. EMBOJ., 10; 25-33.

12. Bengal E., Flores O., Krauskopf A., Reinberg D., Aloni Y. (1991) Role of the mammalian transcription factors IIF, IIS, and IIX during elongation by RNA polymerase II. Mol Cell Biol, 11; 1195-206.

13. Bentley D.L., Groudine M. (1988) Sequence requirements for premature termination of transcription in the human c-myc gene. Cell, 53; 245-56.

14. Booth V., Koth C.M., Edwards A.M., Arrowsmith C.H. (2000) Structure of a conserved domain common to the transcription factors TFIIS, elongin A, and CRSP70. J Biol Chem., 275; 31266-8.

15. Borukhov S., Polyakov A., Nikiforov V., Goldfarb A. ( 1992) GreA protein: a transcription elongation factor from Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA, 89; 8899-902.

16. Borukhov S., Sagitov V., Goldfarb A. (1993a) Transcript cleavage factors from E. coli. Cell, 72; 459-66.

17. Borukhov S., Goldfarb A. (1993b) Recombinant Escherichia coli RNA polymerase: purification of individually overexpressed subunits and in vitro assembly. Protein Expr Purif., 4; 503-11.

18. Borukhov S., Goldfarb A. (1996) Purification and assay of Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB. Methods Enzymol., 274; 315-26.

19. Borukhov S., Laptenko O. and Lee J. (2001) Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB: functions and mechanisms of action. Methods Enzymol., 342; 64-76.

20. Burgess R.R., Jendrisak J.J. (1991) A procedure for the rapid, large-scall purification of Escherichia coli DNA-dependent RNA polymerase involving Polymin P precipitation and DNA-cellulose chromatography. Biochemistry, 14; 4634-8.

21. Campbell E.A., Korzheva N., Mustaev A., Murakami K., Nair S., Goldfarb A., Darst S.A. (2001) Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase. Cell, 104; 901-12.

22. Cipres-Palacin G., Kane C.M. (1994) Cleavage of the nascent transcript induced by TFIIS is insufficient to promote read-through of intrinsic blocks to elongation by RNA polymerase 11. Proc Natl Acad Sci USA, 91; 8087-91.

23. Cipres-Palacin G., Kane C.M. (1995) Alanine-scanning mutagenesis of human transcript elongation factor TFIIS. Biochemistry, 34; 15375-80.

24. Cech T.R. (1990) Self-splicing of group I introns. Annu Rev Biochem., 59; 543-68.

25. Cech T.R. (1993) Catalytic RNA: structure and mechanism. Biochem Soc Trans., 21;229.34.

26. Chang C.H., Luse D.S. (1997) The H3/H4 tetramer blocks transcript elongation by RNA polymerase II in vitro. J Biol Chem., 272; 23427-34.

27. Chedin S., Riva M., Schultz P., Sentenac A., Carles C. (1998) The RNA cleavage activity of RNA polymerase III is mediated by an essential TFIIS-like subunit and is important for transcription termination. Genes Dev. 12; 3857-71.

28. Christie K.R., Awrey D.E., Edwards A.M., Kane C.M. (1994) Purified yeast RNA polymerase II reads through intrinsic blocks to elongation in response to the yeast TFIIS analogue, P37. J Biol Chem., 269; 936-43.

29. Conaway R.C., Kong S.E., Conaway J.W. (2003) TFIIS and GreB: two like-minded transcription elongation factors with sticky fingers. Cell, 114; 272-4.

30. Costa P.J., Arndt K.M. (2000) Synthetic lethal interactions suggest a role for the Saccharomyces cerevisiae Rtfl protein in transcription elongation.Genetics, 156; 535-47.

31. Cramer P., Bushnell D.A., Fu J., Gnatt A.L., Maier-Davis В., Thompson N.E., Burgess R.R., Edwards A.M., David P.R., Kornberg R.D. (2000) Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism. Science, 288; 640-9.

32. Cramer P., Bushnell D.A., Kornberg R.D. (2001) Structural basis of transcription: RNA polymerase II at 2.8 angstrom resolution. Science, 292; 1863-76.

33. Cramer P. (2002) Multisubunit RNA polymerases. Curr. Opin. Struct. Biol.l2; 89-97.

34. Darst S.A., Kubalek E.W., Kornberg R.D. (1989) Three-dimensional structure of Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme determined by electron crystallography. Nature, 340; 730-2.

35. Darst S.A., Kubalek E.W., Edwards A.M., Kornberg R.D. (1991) Two-dimensional and epitaxial crystallization of a mutant form of yeast RNA polymerase II. J Mol Biol., 221; 347-57.

36. Darst S.A, (2001) Bacterial RNA polymerase.Curr Opin Struct Biol., 11; 155-62.

37. Davie J.K., Kane C.M. (2000) Genetic interactions between TFIIS and the Swi-Snf chromatin-remodeling complex. Mol Cell Biol., 20; 5960-73.

38. Derbyshire V., Pinsonneault J.K., Joyce C.M. (1995) Structure-function analysis of 3'— >5'-exonuclease of DNA polymerases. Methods Enzymol., 262; 363-85.

39. Doherty E.A. and Doudna J.A. (2000) Ribozyme structures and mechanisms. Annu Rev Biochem., 69; 597-615.

40. Ebright R.H. (2000) RNA polymerase: structural similarities between bacterial RNA polymerase and eukaryotic RNA polymerase II. J Mol Biol., 304; 687-98.

41. Eckstein F., Gindl H. (1970) Polyribonucleotides containing a phosphorothioate backbone. Eur J Biochem., 13; 558-64.

42. Eckstein F., Armstrong V.W., Sternbach H. (1976) Stereochemistry of polymerization by DNA-dependent RNA-polymerase from Escherichia coli: an investigation with a diastereomeric ATP-analogue. Proc Natl Acad Sci USA, 73; 2987-90.

43. Ederth J., Artsimovitch I., Isaksson L.A., Landick R. (2002) The downstream DNA jaw of bacterial RNA polymerase facilitates both transcriptional initiation and pausing. J Biol Chem., Ill-, 37456-63.

44. Edwards A.M., Kane C.M., Young R.A., Kornberg R.D. (1991) Two dissociable subunits of yeast RNA polymerase II stimulate the initiation of transcription at a promoter in vitro. J Biol Chem., 266; 71-5.

45. Ellinger Т., Behnke D., Bujard H., Gralla J.D. (1994) Stalling of Escherichia coli RNA polymerase in the +6 to +12 region in vivo is associated with tight binding to consensus promoter elements. J Mol Biol., 239; 455-65.

46. Epshtein V., Mustaev A., Markovtsov V., Bereshchenko O., Nikiforov V., Goldfarb A. (2002) Swing-gate model of nucleotide entry into the RNA polymerase active center. Mol Cell, 10; 623-34.

47. Erie D.A., Hajiseyedjavadi O., Young M.C., von Hippel P.H. (1993) Multiple RNA polymerase conformations and GreA: control of the fidelity of transcription. Science, 262; 86773.

48. Exinger F., Lacroute F. (1992) 6-Azauracil inhibition of GTP biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet., 22; 9-11.

49. Fedor M.J. (2000) Structure and Function of the Hairpin Ribozyme. J. Mol. Biol., 297; 269-291.

50. Fish R.N., Kane C.M. (2002) Promoting elongation with transcript cleavage stimulatory factors. Biochim Biophys Acta, 1577; 287-307.

51. Furter-Graves E.M., Hall B.D., Furter R. (1994) Role of a small RNA pol II subunit in TATA to transcription start site spacing. Nucleic Acids Res., 22; 4932-6.

52. Galburt E.A., Chevalier В., Tang W., Jurica M.S., Flick K.E., Monnat R.Jr., Stoddard B.L. (1999) A novel endonuclease mechanism directly visualized for I-Ppol. Nat Struct Biol., 6; 1096-9.

53. Gnatt A.L., Cramer P., Fu J., Bushnell D.A., Kornberg R.D. (2001) Structural basis of transcription: an RNA polymerase II elongation complex at 3.3 A resolution. Science, 292(5523): 1876-82.

54. Gnatt A.L. (2002) Elongation by RNA polymerase II: structure-function relationship. Biochim Biophys Acta, 1577(2); 175-90.

55. Gribskov M., Burgess R.R. (1983) Overexpression and purification of the sigma subunit of Escherichia coli RNA polymerase. Gene, 26(2-3); 109-118.

56. Gross С.A., Chan С., Dombroski A., Gruber Т., Sharp M.f Tupy J., Young B. (1998) The functional and regulatory roles of sigma factors in transcription. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 63; 141-155.

57. Guo H., Price D.H. (1993) Mechanism of DmS-II-mediated pause suppression by Drosophila RNA polymerase II. J Biol Chem., 268; 18762-70.

58. Hagler J., Shuman S. (1993) Nascent RNA cleavage by purified ternary complexes of vaccinia RNA polymerase. J Biol Chem., 268; 2166-73.

59. Hausner W., Lange U., Musfeldt M. (2000) Transcription factor S, a cleavage induction factor of the archaeal RNA polymerase. J Biol Chem., 275; 12393-9.

60. Hawley D.K., Wiest D.K., Holtz M.S., Wang D. (1993) Transcriptional pausing, arrest, and readthrough at the adenovirus major late attenuation site. Cell Mol Biol Res., 39; 339-48.

61. Higuchi H., Endo Т., Kaji A. (1990) Enzymic synthesis of oligonucleotides containing methylphosphonate internucleotide. Biochemistry, 29; 8747-53.

62. Hirai H., Sekimizu K., Horikoshi M., Nakanishi Y., Natori S. (1988) Stimulation of transcription from accurate initiation sites by purified S-II. FEBS Lett., 238; 119-22.

63. Hogan B.P., Hartsch Т., Erie D.A. (1995) Transcript cleavage by Thermus thermophilus RNA polymerase. Effects of GreA and anti-GreA factors. J Biol Chem., 277; 967-75.

64. Hoard D.E., Ott D.G. (1964) The conversion of mono- and olygodeoxyribonucleotides to their 5'-triphosphates. LA-3132-MS. LA Rep., 127; 242-4.

65. Hsu L.M., Vo N.V., Chamberlin M.J. (1995) Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB stimulate promoter escape and gene expression in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci USA, 92; 11588-92.

66. Jairajpuri M.A., Azam N., Baburaj K., Bulliraju E., Durani S. (1998) Charge and solvation effects in anion recognition centers: an inquiry exploiting reactive arginines. Biochemistry, 37; 10780-91.

67. Jeon C., Yoon H., Agarwal K. (1994) The transcription factor TFIIS zinc ribbon dipeptide Asp-Glu is critical for stimulation of elongation and RNA cleavage by RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sci USA, 91; 9106-10.

68. Jeon C., Agarwal K. (1996) Fidelity of RNA polymerase II transcription controlled by elongation factor TFIIS. Proc Natl Acad Sci USA, 93; 13677-82.

69. Jensen G.J., Meredith G., Bushnell D.A., Kornberg R.D. (1998) Structure of wild-type yeast RNA polymerase II and location of Rpb4 and Rpb7. EMBOJ., 17; 2353-8.

70. Kashlev M., Nudler E., Severinov K., Borukhov S., Komissarova N., Goldfarb A. (1998) Histidine-tagged RNA polymerase of Escherichia coli and transcription in solid phase. Methods EnzymoL, 274; 326-34.

71. Kassavetis G.A., Geiduschek E.P. (1993) RNA polymerase marching backward. Science, 259; 944-5.

72. Kettenberger H., Armache K.J., Cramer P. (2003) Architecture of the RNA polymerase II-TFIIS complex and implications for mRNA cleavage. Cell, 114; 347-57.

73. Kim E.E., and Wyckoff H.W. (1991) Reaction mechanism of alkaline phosphatase based on crystal structures. Two-metal ion catalysis. J Mol Biol., 218(2); 449-64.

74. Komarnitsky P.B., Cho E-J., Buratowski S. (2000) Different phosphorylated forms of RNA polymerase II and associated mRNA processing factors during transcription. Genes Dev., 14; 2452-60.

75. Korzheva N., Mustaev A., Nudler E., Nikiforov V., Goldfarb A. (1998)Mechanistic model of the elongation complex of Escherichia coli RNA polymerase. Cold Spring Harb Symp Quant Biol., 63; 337-45.

76. Korzheva N., Mustaev A., Kozlov M., Malhotra A., Nikiforov V., Goldfarb A., Darst S.A. (2000) A structural model of transcription elongation. Science. 289; 619-25.

77. Korzheva N., Mustaev A. (2001) Transcription elongation complex: structure and function. Curr Opin Microbiol., 4; 119-25.

78. Koulich D., Orlova M., Malhotra A., Sali A., Darst S.A., Borukhov S. (1997) Domain organization of Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB .J Biol Chem., 272; 7201-10.

79. Koulish D., Nikiforov V., Borukhov S. (1998) Distinct functions of N and C-terminal domains of GreA, an Escherichia coli transcript cleavage factor. J Mol Biol., 276; 379-89.

80. Kulish D., Lee J., Lomakin I., Nowicka В., Das A., Darst S., Normet K., Borukhov S. (2000) The functional role of basic patch, a structural element of Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB. J Biol Chem., 275; 12789-98.

81. Kulish D., Struhl K. (2001) TFIIS enhances transcriptional elongation through an artificial arrest site in vivo. Mo I Cell Biol., 13; 4162-8.

82. Kravchuk A.V., Zhao L., Kubiak R.J., Bruzik K.S., Tsai M.D. (2001) Mechanism of phosphatidylinositol-specific phospholipase C: origin of unusually high nonbridging thio effects. Biochemistry, 40: 5433-9.

83. Markovtsov V., Mustaev A., Goldfarb A. (1996) Protein-RNA interactions in the active center of transcription elongation complex. Proc. Natl. Acad. Sci. US, 93; 3221-3226.

84. Marr M.T., Roberts J.W. (2000) Function of transcription cleavage factors GreA and GreB at a regulatory pause site. Mol Cell., 6; 1275-85.

85. Martin F.H., Castro M.M., Aboul-ela F., Tinoco I Jr. (1985) Base pairing involving deoxyinosine: implications for probe design. Nucleic Acids Res., 13; 8927-38.

86. McClure W.R. (1985) Mechanism and control of transcription initiation in prokaryotes. Annu Rev Biochem., 54; 171-204.

87. McClure W.R. (1980) On the mechanism of streptolydigin inhibition of Escherichia coli RNA polymerase. J Biol Chem., 255; 1610-6.

88. Miller M.D., Cai J., Krause K.L. (1999) The active site of Serratia endonuclease contains a conserved magnesium-water cluster. J Mol Biol., 288; 975-87.

89. Morin P.E., Awrey D.E., Edwards A.M., Arrowsmith C.H. (1996) Elongation factor TFIIS contains three structural domains: solution structure of domain II. Proc Natl Acad Sci USA, 93;10604-8.

90. Mote J Jr., Ghanouni P., Reines D. (1994) A DNA minor groove-binding ligand both potentiates and arrests transcription by RNA polymerase II. Elongation factor SII enables readthrough at arrest sites. J Mol Biol., 236; 725-37.

91. Mote J Jr., Reines D. (1998) Recognition of a human arrest site is conserved between RNA polymerase II and prokaryotic RNA polymerases. J Biol Chem., 273; 16843-52.

92. Murakami K.S., Masuda S., Campbell E.A., Muzzin O., Darst S.A. (2002) Structural basis of transcription initiation: an RNA polymerase holoenzyme-DNA complex. Science, 296; 1285-90

93. Murray J.B., Seyhan A.A., Walter N.G., Burke J.M., Scott W.G. (1998) The hammerhead, hairpin and VS ribozymes are catalytically proficient in monovalent cations alone. Chem Biol., 5; 587-95.

94. Murray S., Udupa R., Yao S., Hartzog G., Prelich G. (2001) Phosphorylation of the RNA polymerase II carboxy-terminal domain by the Burl cyclin-dependent kinase. Mol Cell Biol. 21; 4089-96.

95. Mustaev A., Kozlov M., Markovtsov V., Zaychikov E., Denissova L., Goldfarb A. (1997) Modular organization of the catalytic center of RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A, 94; 6641-5.

96. Nakanishi Т., Nakano A., Nomura K., Sekimizu K., Natori S. (1992) Purification, gene cloning, and gene disruption of the transcription elongation factor S-II in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem., 267; 13200-4.

97. Nakanishi Т., Shimoaraiso M., Kubo Т., Natori S. (1995) Structure-function relationship of yeast S-II in terms of stimulation of RNA polymerase II, arrest relief, and suppression of 6-azauracil sensitivity. J Biol Chem., 270; 8991-5.

98. Nechaev S., Chlenov M., Severinov K. (2000) Dissection of two hallmarks of the open promoter complex by mutation in an RNA polymerase core subunit. J Biol Chem., 275; 2551622.

99. Neuman K.C., Abbondanzieri E.A., Landick R., Gelles J., Block S.M. (2003) Ubiquitous transcriptional pausing is independent of RNA polymerase backtracking. Cell, 115; 437-47.

100. Nudler E., Avetissova E., Markovtsov V., Goldfarb A. (1996) Protein-DNA interactions holding together the elongation complex. Science, 273; 211-7.

101. Nudler E., Mustaev A., Lukhtanov E., Goldfarb A. (1997) The RNA-DNA hybrid maintains the register of transcription by preventing backtracking of RNA polymerase. Cell, 89; 33-41.

102. Orphanides G., LeRoy G., Chang C.H., Luse D.S., Reinberg D. (1998) FACT, a factor that facilitates transcript elongation through nucleosomes. Cell, 92; 105-16.

103. Orlova M., Newlands J., Das A., Goldfarb A., Borukhov S. (1995) Intrinsic transcript cleavage activity of RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U SA, 92; 4596-600.

104. Opalka N., Chlenov M., Chacon P., Rice W.J., Wriggers W., Darst S.A. (2003) Structure and function of the transcription elongation factor GreB bound to bacterial RNA polymerase. Cell, 114; 335-45.

105. Pan G., Aso Т., Greenblatt J. (1997) Interaction of elongation factors TFIIS and elongin A with a human RNA polymerase II holoenzyme capable of promoter-specific initiation and responsive to transcriptional activators. J Biol Chem., 272; 24563-71.

106. Pelletier H., Sawaya M.R., Wolfle W., Wilson S.H., Kraut J. (1996) Crystal structures of human DNA polymerase beta complexed with DNA: implications for catalytic mechanism, processivity, and fidelity. Biochemistry, 35; 12742-61.

107. Huang H., Chopra R., Verdine G.L., Harrison S.C. (1998) Structure of a covalently trapped catalytic complex of HIV-1 reverse transcriptase: implications for drug resistance. Science, 282; 1669-75.

108. Pecoraro V.L., Hermes J.D., Cleland W.W. (1984) Stability constants of Mg2+ and Cd2+ complexes of adenine nucleotides and thionucleotides and rate constants for formation and dissociation of MgATP and MgADP. Biochemistry, 23; 5262-71.

109. Pokholok D.K., Hannett N.M., Young R.A. (2002) Exchange of RNA polymerase II initiation and elongation factors during gene expression in vivo. Mol Cell, 9; 799-809.

110. Polyakov A., Richter C., Malhotra A., Koulich D., Borukhov S., Darst S.A. (1998) Visualization of the binding site for the transcript cleavage factor GreB on Escherichia coli RNA polymerase. J Mol Biol., 281; 465-73.

111. Polyakov A., Nikiforov V., Goldfarb A. (1999) Disruption of substrate binding site in E. coli RNA polymerase by lethal alanine substitutions in carboxy terminal domain of the beta subunit. FEBSLett., 444; 189-94.

112. Powell W., Bartholomew В., Reines D. (1996) Elongation factor SII contacts the 3'-end of RNA in the RNA polymerase II elongation complex. J Biol Chem. 271; 22301-4.

113. Reinberg D., Roeder R.G. (1987) Factors involved in specific transcription by mammalian RNA polymerase II. Transcription factor IIS stimulates elongation of RNA chains. J Biol Chem., 262; 3331-7.

114. Reines D. (1992) Elongation factor-dependent transcript shortening by template-engaged RNA polymerase II. J Biol Chem., 267; 3795-800.

115. Reines D., Ghanouni P., Li Q., Mote J. Jr. (1992) The RNA polymerase II elongation complex. Factor-dependent transcription elongation nascent RNA cleavage. J Biol Chem., 267; 15516-22.

116. Reines D., Mote J Jr. (1993) Elongation factor SH-dependent transcription by RNA polymerase II through a sequence-specific DNA-binding protein. Proc Natl Acad Sci USA, 90; 1917-21.

117. Reines D., Conaway R.C., Conaway J.W. (1999) Mechanism and regulation of transcriptional elongation by RNA polymerase II. Curr Opin Cell Biol., 11; 342-6

118. Richards F.M. and Wyckoff H.W. (1971) The Enzymes, Boyer PD, Academic, New York, Vol. 4,647-804.

119. Rudd M.D., Izban M.G., Luse D.S. (1994) The active site of RNA polymerase II participates in transcript cleavage within arrested ternary complexes. Proc Natl Acad Sci USA, 91; 8057-61.

120. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989) Molecular cloning. Cold spring harborpress.

121. Sastry S.S., Ross B.M. (1997) Nuclease activity of T7 RNA polymerase and the heterogeneity of transcription elongation complexes. J Biol Chem. 272; 8644-52.

122. Shaevitz J.W., Abbondanzieri E.A., Landick R., Block S.M. (2003) Backtracking by single RNA polymerase molecules observed at near-base-pair resolution. Nature, 426; 684-7.

123. Scheffzek K., Ahmadian M.R., Kabsch W., Wiesmuller L., Lautwein A., Schmitz F., Wittinghofer A. (1997) The Ras-RasGAP complex: structural basis for GTPase activation and its loss in oncogenic Ras mutants. Science, 277; 333-8.

124. Schnapp G., Graveley B.R., Grummt I. (1996) TFIIS binds to mouse RNA polymerase I and stimulates transcript elongation and hydrolytic cleavage of nascent rRNA. Mol Gen Genet., 252; 412-9.

125. Scott W.G., Murray J.B., Arnold J.P., Stoddard B.L., Klug A. (1996) Capturing the structure of a catalytic RNA intermediate: the hammerhead ribozyme. Science, 274; 2065-69.

126. Seibert G., Maidhof A., Zahn R.K., Muller W.E. (1978) Tubercidin metabolism in mouse L5178y cells in vivo and in vitro. Gann., 69; 739-47.

127. Sekimizu K., Kobayashi N., Mizuno D., Natori S. (1976) Purification of a factor from Ehrlich ascites tumor cells specifically stimulating RNA polymerase II. Biochemistry, 15; 506470.

128. Sekimizu K., Kubo Y., Segawa K., Natori S. (1981) Difference in phosphorylation of two factors stimulating RNA polymerase II of Ehrlich ascites tumor cells. Biochemistry, 20; 2286-92.

129. Sen R., Nagai H., Shimamoto N. (2001) Conformational switching of Escherichia coli RNA polymerase-promoter binary complex is facilitated by elongation factor GreA and GreB. Genes Cells, 6; 389-401.

130. Severinov К., Soushko M., Goldfarb A., Nikiforov V. (1993) Rifampicin region revisited. New rifampicin-resistant and streptolydigin-resistant mutants in the beta subunit of Escherichia coli RNA polymerase. J. Biol. Chem. 268; 14820-14825.

131. Shilatifard A., Conaway R.C., Conaway J.W. (2003) The RNA polymerase II elongation complex. Annu Rev Biochem., 72; 693-715.

132. Sluder A.E., Greenleaf A.L., Price D.H. (1989) Properties of a Drosophila RNA polymerase II elongation factor. J Biol Chem., 264; 8963-9.

133. Sparkowsky J., Das A. (1990) Nucleic acids res., 18 (1990) 6443.

134. Stebbins C.E., Borukhov S., Orlova M., Polyakov A., Goldfarb A., Darst S.A. (1995) Crystal structure of the GreA transcript cleavage factor from Escherichia coli. Nature, 373; 63640.

135. Steitz T.A. (1998) A mechanism for all polymerases. Nature, 391; 231-2.

136. Steitz T.A. and Steitz J.A. (1993) A general two-metal-ion mechanism for catalytic RNA. Proc Natl Acad Sci USA, 90; 6498-6502.

137. Stolinski L.A., Eisenmann D.M., Arndt K.M. (1997) Identification of RTF1, a novel gene important for TATA site selection by TATA box-binding protein in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol., 17; 4490-500.

138. Suck D., Lahm A. and Oefner C. (1988) Structure refined to 2A of a nicked DNA octanucleotide complex with DNase I. Nature, 332; 464-8.

139. Surratt C.K., Milan S.C., Chamberlin M.J. (1991) Spontaneous cleavage of RNA in ternary complexes of Escherichia coli RNA polymerase and its significance for the mechanism of transcription. Proc Natl Acad Sci USA, 88; 7983-7.

140. Takagi Y., Warashina M., Stec W.J., Yoshinari K., Taira K. (2001) Recent advances in the elucidation of the mechanisms of action of ribozymes. Nucleic Acids Res., 29; 1815-34.

141. Tennyson C.N., Klamut H.J., Worton R.G. (1995) The human dystrophin gene requires 16 hours to be transcribed and is cotranscriptionally spliced. Nat Genet., 9; 184-90.

142. Thomas M.J., Platas A.A., Hawley D.K. (1998) Transcriptional fidelity and proofreading by RNA polymerase II. Cell, 93; 627-37.

143. Toulme F., Guerin M., Robichon N., Leng M., Rahmouni A.R. (1999) In vivo evidence for back and forth oscillations of the transcription elongation complex. EMBOJ., 18; 5052-60.

144. Toulme F., Mosrin-Huaman C., Sparkowski J., Das A., Leng M., Rahmouni A.R. (2000) GreA and GreB proteins revive backtracked RNA polymerase in vivo by promoting transcript trimming. EMBOJ., 19; 6853-9.

145. Toulokhonov I., Artsimovitch I., Landick R. (2001). Allosteric control of RNA polymerase by a site that contacts nascent RNA hairpins. Science 292; 730-733.

146. Tschochner H. (1996) A novel RNA polymerase I-dependent RNase activity that shortens nascent transcripts from the 3' end. Proc Natl Acad Sci USA, 93; 12914-9.

147. Ubukata Т., Shimizu Т., Adachi N., Sekimizu K., Nakanishi T. (2003) Cleavage, but not read-through, stimulation activity is responsible for three biologic functions of transcription elongation factor S-II. J Biol Chem., 278; 8580-5.

148. Ueno K., Sekimizu K., Mizuno D., Natori S. (1979) Antibody against a stimulatory factor of RNA polymerase II inhibits nuclear RNA synthesis. Nature, 277; 145-6.

149. Ueno A., Baek K., Jeon C., Agarwal K. (1992) Netropsin specifically enhances RNA polymerase II termination at terminator sites in vitro. Proc Natl Acad Sci USA, 89; 3676-80.

150. Vassylyev D.G., Sekine S., Laptenko O., Lee J., Vassylyeva M.N., Borukhov S., Yokoyama S. (2002) Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 A resolution. Nature, 417; 712-9.

151. Zalenskaya K., Lee J., Gujulova C.N., Shin Y.K., Slutsky M., Goldfarb A. (1990) Recombinant RNA polymerase: inducible overexpression, purification and assembly of Escherichia coli rpo gene products. Gene, 89; 7-12.

152. Zaychikov E., Martin E., Denissova L., Kozlov M., Markovtsov V., Kashlev M., Heumann H., Nikiforov V., Goldfarb A., Mustaev A. (1996) Mapping of catalytic residues in the RNA polymerase active center. Science, 273; 107-9.

153. Zhu Y., Pe'ery Т., Peng J., Ramanathan Y., Marshall N., Marshall Т., Amendt В., Mathews M.B., Price D.H. (1997) Transcription elongation factor P-TEFb is required for HIV-1 tat transactivation in vitro. Genes Dev., 11; 2622-32

154. Zhang G., Campbell E.A., Minakhin L., Richter C., Severinov K., Darst S.A. (1999) Crystal structure of Thermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3 A resolution. Cell, 98; 811824.

155. Wang Y., Severinov K., Loizos N., Fenyo D., Heyduk E., Heyduk Т., Chait B.T., Darst S.A. (1997) Determinants for Escherichia coli RNA polymerase assembly within the beta subunit. JMol Biol, 270; 648-62.

156. Wang D., Hawley D.K. (1993) Identification of a 3'—>5' exonuclease activity associated with human RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sci USA. 90; 843-7.

157. Weilbaecher R.G., Awrey D.E., Edwards A.M., Kane C.M. (2003) Intrinsic transcript cleavage in yeast RNA polymerase II elongation complexes. J Biol Chem., 278; 24189-99.

158. Werner F., Weinzierl R.O. (2002) A recombinant RNA polymerase II-like enzyme capable of promoter-specific transcription. Mol Cell, 10; 635-46.

159. Whitehall S.K., Bardeleben C., Kassavetis G.A. (1994) Hydrolytic cleavage of nascent RNA in RNA polymerase III ternary transcription complexes. J Biol Chem., 269; 2299-306.

160. Yee D., Armstrong V.W., Eckstein F. (1979) Mechanistic studies on deoxyribonucleic acid dependent ribonucleic acid polymerase from Escherichia coli using phosphorothioate analogues. 1. Initiation and pyrophosphate reactions. Biochemistry, 18; 4116-20.

161. Young R.A. (1991) RNA polymerase II. Annu Rev Biochem., 60; 689-715.