Структурно-функциональная организация и генно-инженерная модификация липополисахарида Yersinia pestis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Шайхутдинова, Рима Завдатовна

• Шайхутдинова, Рима Завдатовна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шайхутдинова, Рима Завдатовна

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИ

НИЦ И ТЕРМИНОВ.

ВВЕДЕНИЕ.Ю

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ ЛПС.

1.2. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ.

1.3. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛПС.

1.4. СТРУКТУРА МОЛЕКУЛ ЛПС.

1.5. ХИМИЧЕСКАЯ И ГЕННО-ИНЖЕНЕРНАЯ МОДИФИКАЦИЯ ЛПС.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональная организация и генно-инженерная модификация липополисахарида Yersinia pestis»

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Липополисахариды (ЛПС) - специфические компоненты внешней мембраны грамот-рицательных бактерий, в значительной степени обусловливающие физико-химические и биологические свойства бактериальных клеток. ЛПС обеспечивает целостность и стабильность мембраны, ее нормальное функционирование (селективную проницаемость, межклеточные взаимодействия) [Ьискгкг О. е( а1., 1982]. Кроме того, эти молекулы играют существенную роль во взаимоотношениях паразит-хозяин и являются одним из основных факторов патогенности грамотрицательных бактерий [Репу Ы., РеШе^оп I., 1997].

Молекулы ЛПС, как правило, состоят из липида, называемого липидом А, который ковалентно связан с гетерополисахаридными цепями, включающими две субструктуры - ко-ровые олигосахариды (непосредственно связаны с липидом А) и О-специфические цепи, которые представляют собой повторяющиеся олигосахаридные единицы. Такой тип структуры придает ЛПС амфифильный характер из-за гидрофобности липида А и гидрофильности ге-терополисахаридных цепей раЬппяег и. а а.1., 1994].

Липид А - часть молекулы ЛПС, ответственная за его эндотоксическую активность, то есть способность вызывать эндотоксический шок, возникающий в результате лавинообразной экспрессии провоспалительных цитокинов, основным из которых является "ПЧР-а [ВеиНегВ., Сегагш А., 1988; БтагеПо С. 1991]. К настоящему времени получены данные, свидетельствующие о зависимости эндотоксической активности ЛПС для млекопитающих от количества, длины, степени насыщенности жирнокислотных остатков, а также наличия фосфатных групп в липидной части молекулы ЛПС. Показано, что максимальной эндотоксической активностью обладает ЛПС с дифосфорилированным липидом А, состоящим из двух /?-1,6-связанных остатков Б-глюкозамина, ацилированный шестью жирными кислотами [Ь^БсИе! Е. е/ а1., 1987, Такас1а Н. ег1 а/., 1992]. Любые отклонения от этой структуры приводят к уменьшению токсичности молекулы [Rietschel Е. et al., 1994]. В частности, биологические свойства ЛПС Francisella tularensis (низкая токсичность), по-видимому, связаны с необычной структурой липида A [Vinogradov Е. et al., 2002]. Кроме того, показано, что есть определенная зависимость между токсичностью и пространственной конформацией молекул ЛПС, которая характеризуется Тс-температурой фазового перехода от ламеллярной (бислой-ной) фазы в гексагональную фазу. Наиболее биологически активный липид А имеет коническую или цилиндрическую форму [Seydel U. et al., 1993].

Известно, что, в отличие от большинства других патогенных бактерий семейства Enterobacteriaceae, Yersinia pestis — возбудитель чумы, продуцирует ЛПС, лишенный О-полисахаридных цепей [Brubaker R., 1972; Darveau R. et al.; 1983; Chart H. et al., 1995; Minka S., Bruneteau M., 1998; Prior J. et al., 2001]. Изучение биологических свойств показало, что ЛПС штаммов Y. pestis, выращенных при температуре 28 °С, более токсичен для мышей, чем ЛПС штаммов Y. pestis, выращенных при температуре 37 °С [Тынянова В. и др., 2003], что v связано с отличиями в структуре молекул ЛПС [Kawahara К. et al., 2002].

Основным недостатком используемых в настоящее время живых и убитых вакцин на основе грамотрицательных бактерий, в том числе и чумных, является высокая реактоген-ность, определяемая наличием в их составе ЛПС (эндотоксина) [Дмитровский А., 1994, Ме-дуницын Н., 1997, Galanos, Freudenberg, 1993; Raetz С., 1990, Raetz, Whitfield, 2002; van Am-ersfoort et al., 2003; van der Poll, van Deventer, 1999, Дентовская C.B. и др., 2006]. Химические вакцины позволяют за счет введения в их состав только иммунодоминантных антигенов или кодирующих их генов значительно снизить реактогенность препарата в целом. Они эффективны для ревакцинации, могут быть использованы на фоне экстренной профилактики антибиотиками и исключают возможность возникновения инфекционного процесса у лиц с нарушениями иммунного статуса. Однако, вакцины, сконструированные на основе одного-двух индивидуальных иммунодоминантных антигенов или кодирующих их генов (в случае ДНК вакцин), не являются идеальными, т.к. не могут обеспечить защиты от всех вирулентных вариантов возбудителя инфекции. Отсутствие у патогена антигенов, использованных в составе вакцины, или присутствие их серологически отличающихся вариантов позволяют измененным формам микроорганизмов уклоняться от иммунитета, индуцированного подобной вакцинацией [Anisimov et al., 2004].

В то же время показано, что вакцина живая чумная на основе штамма EV линии НИИЭГ способна обеспечивать защиту животных как от штаммов "дикого" типа (ИИ для белых мышей « 3,3х104, для морских свинок » 1,4х105), так и от их бескапсульных вариантов (ИИ для белых мышей ^2,6х102, для морских свинок » 1,2х106) [Анисимов А., 1999]. Есть данные, что вакцина живая чумная эффективна и в отношении "полевочьих" штаммов возбудителя чумы [Абгарян Г., 1966]. В "полевочьих" штаммах Y. pestis V антиген представлен вариантом, характерным для Y. enterocolitica 0:3 серовара [Anisimov A. et al., 2007; Worsham P., Hunter M., 1998]. Оба серовара V антигена обладали выраженной протективной активностью в отношении штаммов с гомологичным вариантом V антигена, но не обеспечивали защиты животных при заражении штаммами Y. pestis другого серовара [Griffin К. et al., 1998; Roggenkamp A. et al., 1997]. Это подтверждает то, что наличие в живых вакцинах, сконструированных на основе аттенуированных штаммов, не только одного-двух иммунодоми-нантных, но и целого спектра сложных (комплекс белка с ЛПС и т.п.), конформационно-лабильных и минорных антигенов обеспечивает индукцию "гетерогенного" иммунного ответа, способного защитить макроорганизм от патогенных бактерий даже с частично измененной антигенной специфичностью. Для конструирования современных живых чумных вакцин со сниженной реактогенностью необходима генно-инженерная модификация ЛПС Y. pestis, обеспечивающая образование молекул со сниженной эндотоксической активностью.

Генетические аспекты синтеза ЛПС наиболее полно изучены на модели Escherichia coli и Salmonella enterica bv. Typhimurium (далее по тексту S. typhimurium). Определены кластеры генов, кодирующие биосинтез липида А, кора и О-антигена [Coleman J., Raetz С., 1988; Austin Е. et al., 1990; Clementz Т., 1992]. Одним из этапов синтеза липида А является процесс вторичного ацилирования, в котором участвует целый ряд ацилтрансфераз LpxL (HtrB), LpxP и LpxM (MsbB) [Clementz Т. et al., 1997; Murray S. et al., 2001]. В частности, показано, что мутация по гену IpxM в клетках сальмонелл приводила к снижению степени ацилирования липида А и, соответственно, к снижению вирулентности (токсичности) на три-четыре порядка [Raetz С., Whitfield С, 2002].

Доступность аннотированных геномов нескольких штаммов Y. pestis rhttp://www.ericbrc.org/portal/cric/versiniapestis?id=default&subid=versiniapestis) дает возможность провести направленный поиск аналогичных генов и их последующий сайт-направленный мутагенез в клетках возбудителя чумы.

Исследование структурно-функциональной организации ЛПС возбудителя чумы с привлечением комплекса методов бактериологии, аналитической химии, биофизики и иммунологии позволит получить новые сведения о биосинтезе этой молекулы, ее роли в патогенезе и иммуногенезе чумы. Это создаст основу для разработки методологии получения штаммов чумного микроба с генно-инженерно модифицированным ЛПС, необходимую для конструирования нового поколения экспериментальных вакцинных штаммов со сниженной ре-актогенностью.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - изучение структурно-функциональной организации ли-пополисахаридов Y. pestis и их генно-инженерная модификация, направленная на снижение эндотоксической активности.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Определить структуру ЛПС из штаммов различных внутривидовых групп Y. pestis, выращенных при различных температурах.

2.Изучить зависимость эндотоксической активности ЛПС Y. pestis от его структуры.

3.Разработать на основе методов генной инженерии методологию получения штаммов чумного микроба, синтезирующих ЛПС со сниженной эндотоксической активностью.

4. Оценить биологические свойства мутантов У резИя со сниженной эндотоксической активностью ЛПС, включая вирулентность и иммуногенную активность.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В ходе выполнения данной работы впервые определена структура корового олигосахарида штамма биовара опеЩаИз (эзр. ре^г'я), а также полная структура ЛПС штаммов возбудителя чумы Бэр. резИя, принадлежащих к биоварам ап1^иа и тесИеуаПз, и подвида ca.uca.sica (Ьу. апйциа). Установлено, что структура ЛПС зависит от подвидовой принадлежности и температурных условий культивирования бактерий.

Выявлена взаимосвязь структуры ЛПС и биологических свойств У резШ. Установлено, что более высокая степень ацилирования липида А вызывает повышение ТЫБ-а-индуцирующей активности.

Впервые установлено, что мутация по гену 1рхМ, кодирующему ацилтрансферазу, отвечающую за включение в липид А У резСт шестого жирнокислотного остатка — лауриновой кислоты, не влияет на вирулентность штаммов чумного микроба дикого типа, но снижает вирулентность аттенуированных штаммов У. реэИз.

Впервые установлено, что отсутствие в клетках 1рхМ мутанта вакцинного штамма ЕУ гексаацильных молекул ЛПС сопровождается сочетанным снижением остаточной вирулентности и повышением протективной активности на модели мышей.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ ДИССЕРТАЦИИ.

Разработана простая и надежная методика направленного конструирования вакцинных штаммов грамотрицательных бактерий со сниженной реактогенностью. Полученный штамм У. резИя ЕУД 1рхМ, дефектный по синтезу гекса-ацильных молекул ЛПС, может служить основой для разработки новой живой чумной вакцины

В коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ПМБ депонированы 4 авторских штамма

У. ре.зИз, мутантных по гену 1рхМ.

Результаты проведенных исследований послужили основой для составления ниже перечисленных документов:

- Методические рекомендации «Получение очищенных препаратов ЛОС У. резИя». Оболенск, 2004 (учрежденческий уровень внедрения). \

- Методические рекомендации «Сайт-направленный мутагенез генома чумного микроба». Оболенск, 2004 (учрежденческий уровень внедрения).

Разработанные методические приемы, сконструированные плазмиды и штаммы, а также препараты ЛПС в настоящее время применяются в микробиологических, генетиче- ~ ских, молекулярно-биологических, иммунологических и других исследованиях ряда лабораторий ГЫЦ прикладной микробиологии и биотехнологи (Оболенск, Московская обл.), АООТ "Институт инженерной иммунологии" РАО "Биопрепарат" (Любучаны, Московская обл.), РосНИПЧИ "Микроб", ГИСК им. Л.А. Тарасевича, Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, Института биоорганической химии им. М.М Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Саратовского Государственного университета им. Н.Г. Чернышевского. Список документов по внедрению научных достижений в практику приведен в конце автореферата.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Установлена полная структура ЛПС У. ре.у^'-у основного подвида биоваров апйдиа, тесИеуаНБ, опег^аНэ и кавказского подвида. В бактериальной клетке одновременно образуется несколько структурных вариантов молекулы ЛПС, отличающихся в липиде А - по степени ацилирования и замещения аминоарабинозой фосфатных остатков; в олигосахариде кора - по терминальным углеводам. Преобладание определенных структурных вариантов ЛПС определяется температурой культивирования.

2. Избирательное "выключение" синтеза гексаацильных форм ЛПС не приводит к снижению вирулентности мутантных штаммов У. ре.дикого типа в отношении белых мышей.

3. Отсутствие в клетках IpxM мутанта вакцинного штамма EV гексаацильных молекул ЛПС сопровождается сочетанным снижением остаточной вирулентности и повышением про-тективной активности. По сравнению с исходным штаммом, величины LD50 мутанта EVЫрхМ при подкожном заражении мышей снизились в 4,6 раз, а протективная активность в отношении вирулентного штамма 231 выросла на 2 порядка.

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА в лаборатории микробиологии чумы (ЛМЧ) ГНЦПМБ по планам НИР в рамках следующих бюджетных тем: "Изучение молекулярных механизмов патогенеза и иммуногенеза чумы, псевдотуберкулеза, сибирской язвы и туляремии" научный руководитель темы д.м.н., с.н.с. А.П. Анисимов, № гос. регистрации 01.200.2 13001; "Структурная организация и биологические свойства липополисахарида Yersinia pestis" отраслевой научно-исследовательской программы «Научные аспекты обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в Российской Федерации» (договор с Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека № 74-Д от 31 декабря 2005 г.), научные руководители темы: к.м.н. C.B. Дентовская и д.м.н., с.н.с. А.П. Анисимов. Данная работа получила финансовую поддержку Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 06-04-49280 "Структурно-функциональный и генетический анализ липополисахарида возбудителя чумы, Yersinia pestis, с помощью сайт-направленного мутагенеза", научный руководитель темы д.м.н., с.н.с. А.П. Анисимов) и Международного научно-технического центра (проект МНТЦ № 1197 "Изучение роли структурной организации липополисахаридов Yersinia pestis в создании иммунных препаратов", научный руководитель темы д.м.н., с.н.с. А.П. Анисимов).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы диссертации доложены и представлены на: 7th International Symposium on Yersinia (Nijmegen, Голландия, 1998 г.), Второй научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002 г.); 8th International Symposium on Yersinia (Турку, Финляндия, 2002 г.); рабочем семинаре DTRA «Обзор совместных научно-исследовательских проектов по биобезопасности» (Серпухов, 3-5 июня 2002 г.); ежегодной конференции Российской Академии Естествознания «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (Лутраки, Греция 5-12 октября 2003 г.); 2-ом Московском международном Конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (10-14 ноября 2003 г., Москва); XIIth European Carbohydrate Symposium (July 6-11, 2003, Grenoble, France); 2-ом Московском международном конгрессе: Биотехнология: состояние и перспективы развития (10-14 ноября 2003 г., Москва); 104th ASM General Meeting (May 23-27, 2004, New Orleans, Louisiana, USA); Международной конференции "Предотвращение распространения биологического оружия: The cooperative biological research: Annual review" (12-15 июля 2004 г., Санкт-Петербург); Международной конференции "Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний" (8-10 сентября 2004 г., "Сосновка", Новосибирская область, Россия); INTAS strategic workshop, Bacterial glycoconjugates in prevention and diagnostics of emerging pathogens: 3rd German-Polish-Russian meeting on bacterial carbohydrates (October 6-9, 2004, Wroctaw, Poland); 105th ASM General Meeting (June 5-9, 2005, Atlanta, GA, USA); VI-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ "Санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях" (13-14 сентября 2005 г., Волгоград); Международной конференции "Предотвращение распространения биологического оружия: The cooperative biological research: Annual review" (1013 октября 2005 г.; Санкт-Петербург); 106th ASM General Meeting (May 21-25, 2006, Orlando, FL, USA) УП-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и саконференции "Предотвращение распространения биологического оружия: The cooperative biological research: Annual review" (10-13 октября 2005 г.; Санкт-Петербург); 106th ASM General Meeting (May 21-25, 2006, Orlando, FL, USA) VII-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств» (3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.); the 2006 NIAID Research Conference (June 24-30, 2006, Opatija, Croatia); 9th International Symposium on Yersinia (October 10-14, 2006, Lexington, Kentucky, USA).

План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на Ученом Совете ГНЦ ПМБ 7 декабря 2006 г. протокол №11. Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного семинара ГНЦ ПМБ 24 июля 2006 г.

ПУБЛИКАЦИИ. Основное содержание работы отражено в 30 научных публикациях, в том числе в семи статьях, список которых приведен в автореферате (включая пять статей в международных рецензируемых журналах, а четыре статьи в изданиях из списка, рекомендованного ВАК).

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Шайхутдинова, Рима Завдатовна

ВЫВОДЫ

1. Впервые установлена полная структура ЛПС штаммов Y.pestis основного подвида биоваров antiqua, medievalis, кавказского подвида и уточнена структура основного подвида биовара orientalis.

2. Впервые показано, что в клетках Y.pestis одновременно образуются несколько структурных вариантов молекулы ЛПС, отличающихся в липиде А: по степени ацилирова-ния и степени замещения аминоарабинозой фосфатных остатков и в олигосахариде кора по терминальным углеводам. Преобладание определенных структурных вариантов ЛПС определяется температурой культивирования.

3. Подтверждена взаимосвязь структуры липида А и биологических свойств Y.pestis - более высокая степень ацилирования липида А вызывает повышение TNF-or-индуцирующей активности.

4. Разработана методика получения штаммов чумного микроба, синтезирующих ЛПС со сниженной эндотоксической активностью.

5. Впервые показано, что мутация по гену 1рхМ, кодирующему ацилтрансферазу, отвечающую за включение в липид А У. реяМя лауриновой кислоты, не влияет на вирулентность штаммов чумного микроба дикого типа, но снижает остаточную вирулентность атте-нуированных штаммов У. резШ.

6. Впервые доказано, что снижение остаточной вирулентности 1рхМ мутанта вакцинного штамма ЕУ сопровождается сочетанным повышением его протективной активности.

7. Сконструированный штамм У. резШ ЕУА 1рхМ, дефектный по синтезу гексаа-цильных молекул ЛПС, может служить основой для разработки новой живой чумной вакцины

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Чума одно из самых опасных инфекционных заболеваний в человеческой истории. В результате трех пандемий: «чумы Юстиниана» (541-767 г.г.), «черной смерти» (1346-1350 г.г.) и третьей, начавшейся в Китае и распространившейся по всему миру, по разным данным погибло около 200 миллионов человек [Perry, Fetherston, 1997].

С приходом эры антибиотиков в 30-40 годы прошлого столетия чума, казалось бы, перестала представлять глобальную опасность для человечества, но эпидемические вспышки чумы продолжают регистрироваться ежегодно. По данным ВОЗ за период с 1987 г. по 2001 г. в мире зарегистрировано 36876 случаев заболевания чумой, из них 2847 закончились гибелью людей. Причем, большая часть заболеваний приходилась на долю африканского континента [Prentice, Rahalison, 2007].

В ходе энзоотического цикла передача Y. pestis в популяциях восприимчивых теплокровных животных (грызунах и логоморфах) осуществляется кровососущими насекомыми -блохами Передача Y. pestis блохами обеспечивается высоким уровнем предагональной бактериемии у инфицированных грызунов [Анисимов, 1999, 2002; Brubaker, 1991; Hinnebusch, 2004; Lorange et al, 2005; Perry, Fetherston, 1997].

В организме блохи Y. pestis размножается в виде бактериальных биофильмов, заполняя преджелудок (клапан, соединяющий пищевод и среднюю кишку) и блокирует прохождение пищи. Постоянные попытки блокированных блох поглотить новую порцию крови ведут "к переполнению пищевода и регургитации крови вместе со смытыми бактериями в ранку от укуса. Попав в организм млекопитающего, Y. pestis преодолевает врожденный иммунитет и начинает безудержное размножение [Анисимов, 1999, 2002; Brubaker, 1991; Hinnebusch, 2003, 2004; Lorange et al., 2005; Perry, 2003; Perry, Fetherston, 1997]. Обычно, фаза бактериемии приводит к летальному септическому шоку, а гибель млекопитающего хозяина вынуждает блох искать новых прокормителей, вызывая инфицирование последних [Анисимов, 2002; Brubaker, 1991; Butler, 1989].

Пусковым механизмом септического шока, вызываемого грамотрицательными бактериями, является ЛПС. Липид А, токсическая составляющая молекулы ЛПС, индуцирует в организме млекопитающих синтез различных провоспалительных цитокинов, активирует систему комплемента сыворотки и коагуляционные процессы [Das, 2000; Van Amersfoort, 2003].

ЛПС Y. pestis не содержит О-антигенных полисахаридных цепей, но состоит из липи-да А и олигосахарида, аналога внутреннего и внешнего кора ЛПС энтеробактерий [Gremy-akova et al., 2003; Hitchen et al., 2002; Kawahara et al, 2002; Knirel et al., 2005a, 2005b; Prior et al., 2001; Rebeil et al., 2004; Vinogradov et al., 2002]. Как показано для E. coli, главными отличительными чертами, обеспечивающими максимальную эндотоксическую активность, является наличие в молекуле ЛПС дифосфорилированного липида А, состоящего из двух /?-1,6-связанных остатков D-глюкозамина, ацилированных шестью жирными кислотами [Alexander, Rietschel, 2001; Rietschel et al., 1994]. Показано, что у У. pestis повышение температуры при передаче от блох (21-28 °С) теплокровным животным (37 °С) вызывает уменьшение уровня ацилирования липида А с шести до четырех жирнокислотных остатков [Kawahara et al., 2002; Knirel et al., 2005a; Rebeil et al., 2004; раздел 3.1 настоящего исследования] и соответственное уменьшение иммуностимулирующей/эндотоксической активности ЛПС [Kawahara et al., 2002; Rebeil et al., 2004; Тынянова и др., 2003; раздел 3.2 настоящего исследования].

Остановимся более подробно на особенностях структурного разнообразия и характера температуро-зависимых изменений ЛПС у представителей различных внутривидовых групп У. pestis, выявленых нами в ходе выполнения данной работы. Основные изменения структуры ЛПС Y. pestis, вызванные повышением температуры до температуры тела млекопитающих (37 °С) можно свести к следующему:

• для штаммов всех подвидов - замена терминального углевода внутренней части кора Ко на Kdo, т.е. его дегидроксилирование;

• для штаммов основного подвида - преобладание в качестве терминального углевода внешней части кора гептозы над галактозой;

• для штаммов подвидов caucasica и altaica - уменьшение содержания галактозы -терминального углевода внешней части кора (при полном отсутствии терминальной гептозы);

• для штаммов всех подвидов - увеличение содержания GlcNAc и уменьшение содержания глицина;

• для штаммов всех подвидов - уменьшение степени ацилирования липида А - преобладание тетраацильных форм;

• для штаммов основного подвида и подвида altaica - уменьшение гликозилирова-ния фосфатных групп катионными углеводами, в частности Ara4N; а для подвида altaica -появление пирофосфатной группы;

• в штаммах подвида caucasica - отсутствует температурная зависимость включения Ara4N, и, как правило, оно стехиометрично.

Суммируя вышеизложенное, можно сказать, что Y. pestis реагирует на повышение температуры культивирования не только увеличением отрицательного заряда на поверхности клетки счет снижения содержания катионного моносахарида Ara4N в липиде А, но и уменьшением гидрофобности молекул ЛПС, которое обеспечивается как уменьшением ацилирования, так и увеличением углеводной части за счет включения GlcNAc. Это, в свою очередь, может привести к существованию индивидуальных молекул ЛПС в ламеллярной (биологически малоактивной форме).

Билогическая роль этих структурных изменений при повышении температуры культивирования до температуры тела млекопитающих (37 °С) выражается в уменьшении токсичности препаратов ЛПС. Наблюдается ослабление цитокин-индуцирующей активности (на примере одного из основных медиаторов эндотоксического шока - TNF-а) и увеличение LD50 препаратов ЛПС из представителей всех изученных подвидов Y. pestis. Отсутствие полной корреляции между TNF-ог-индуцирующей активностью ЛПС Y. pestis на клетках мышиной макрофагоподобной клеточной линией J774A.1 и его летальной токсичностью на модели мышей может быть связано с изменением пространственной конформации молекул ЛПС in v/vo-Наши предположения требуют дальнейших исследований в области определения трехмерной структуры ЛПС. Работы в этом направлении уже ведутся. В любом случае моделирование такого сложного явления как септический шок на изолированных клетках животных, культивируемых в питательных средах вне организма, позволяет изучать тонкие механизмы взаимодействия эндотоксинов с отдельными эукариотическими клетками, но не может создать полную картину синдрома системного воспалительного ответа в макроорганизме.

Генетические аспекты синтеза ЛПС наиболее полно изучены на модели Е. coli иг S. typhimurium [Raetz С., 1996, Raetz С., Whitfield С., 2002, Clementz Т., 1992]. Одним из этапов синтеза липида А является процесс вторичного ацилирования, в котором участвует мембранные белки - Kdo зависимые ацилтрансферазы LpxL и LpxM [Reeves et al., 1996; Clementz Т. et al., 1997; Murray S. et al., 2001; Brozek, Raez, 1990; Nichols et al., 1997; Raetz, Whitfield, 2002; Sunshine et al., 1997]. LpxM - «поздняя» ацилтрансфераза, переносящая миристат (Си) после инкорпорирования лаурата (С12) в структуру KD02-lipid IVA [Clementz et al., 1997; Raetz, Whitfield, 2002]. Показано, что ЛПС, выделенный из ЫрхМ нокаутных мутантов, содержащий пентаацильный липид А, и клетки ЫрхМ мутантов Е. coli обладали в 1000-10000 раз меньшей способностью стимулировать продукцию Е-селектина человеческими эндоте-лиальными клетками и продукцию TNF-a моноцитами по сравнению с исходными бактериями, продуцирующими гексаацильный липид A [Somerville et al., 1996]. Позднее было показано, что в Y. pestis гомологи IpxM [Dentovskaya et al., 2006; Rebeil et al. 2006; раздел 3.3 настоящего исследования] и IpxP [Rebeil et al., 2006] кодируют ацилтрансферазы, добавляющие, соответственно, С12 и С]б 1 жирнокислотные группы к липиду, и экспрессия этих генов происходит при температуре 21 °С in vitro и в организме блох [Rebeil et al., 2006].

В мутантных по гену IpxM бактериях Е. coli [Somerville J. et al 1996, Somerville J.et al., 1999, Vaara M., 1999; Vorachek-Warren M., 2002], H.s influenzae [Low K. et al, 1999], S. enterica [Khan S. et al., 1998, Low K. et al., 1999], N. meningitidis и N. gonorrhoeae [Van der Ley et al. 2001; Post D. et al., 2002], Shigella flexneri [d'Hauteville et al., 2002] проявлялись общие свойства: снижение способности стимулировать продукцию TNF-a как моноцитами человека, так и дендритными и макрофагальными клетками мыши [D.M. Hone et al., 1998, Kalupahana et al. 2003] и уменьшение эндотоксической активности, выражающееся в увеличении величины LD50 на мышиной модели по сравнению с исходными штаммами [Somerville J. et al., 1999].

Пентаацильный ЛПС, выделенный из мутантного штамма N. meningitidis ЫрхМ имел уменьшенную эндотоксическую активность, но демонстрировал хорошие адьювантные свойства [van der Ley et al., 2001]. Эти данные позволили нам предположить, что штаммы Y. pestis, мутантные по гену IpxM будут менее вирулентны и могут использоваться для создания новых вакцин.

Установление структурно-функциональной организации ЛПС и определение генов, отвечающих за биосинтез липида А, позволили нам разработать методику направленного конструирования мутантов Y. pestis с нарушенным синтезом одной из ацилтрансфераз -LpxM, обладающих сниженной эндотоксической активностью. Инактивацию предполагаемого гена IpxM в клетках возбудителя чумы мы проводили сайт-направлепным мутагенезом с использованием суицидного вектора pMSB3K, позволяющего за счет гомологичной рекомбинации осуществлять замену интактного гена IpxM хромосомы на аллельный ген, большая часть которого была замещена геном, кодирующим канамицинфосфотрансферазу. Проведенный нами сравнительный структурный анализ препаратов ЛПС из полученных мутантов показал, что мутантные штаммы синтезируют только тетра-и пентаацильные формы липида А, не содержащие остатки лауриновой кислоты. Таким образом, мутация привела к инактивации гена, кодирующего соответствующую ацилтрансферазу (LpxM) [Шайхутдинова и др., 2003; раздел 3.3 настоящего исследования]. Следовательно, в хромосоме Y. pestis был идентифицирован функциональный ген, кодирующий ацилтрансферазу, ответственную за добавление лаурата С12 к удаленному остатку GlcN11 при температурах ниже 37 °С. Позднее наши данные были подтверждены зарубежными коллегами [Rebeil et al., 2006].

Для изучения влияния этой мутации на эндотоксическую активность, вирулентность и иммуногенность мы сконструировали ЫрхМ мутанты на основе ряда штаммов, в том числе вирулентного штамма 231 и вакцинного штамма EV линии НИИЭГ. Мы обнаружили 10-кратное увеличение величин LD5o для ЛПС ЫрхМ мутанта по сравнению с ЛПС дикого типа (Р<0,05). Неспособность вирулентного штамма Y. pestis 231 ЫрхМ продуцировать гексаа-цильный ЛПС не снижала его вирулентность, в то время как вакцинный штамм при некотором снижении токсических свойств для белых мышей продемонстрировал значительное повышение иммуногенности, обеспечивая защиту от 71,4 % до 100 % животных после заражения вирулентным штаммом Y. pestis 231. Сравнительный анализ уровня антител в сыворотке мышей после их вакцинирования показал значительное превышение уровня'антител, в случае мутантного штамма, что свидетельствует о более эффективном вакцинальном процессе.

Суммируя вышеизложенное, отметим, что установление структурно-функциональной организации ЛПС позволило приступить к направленному конструированию штаммов гра-мотрицательных бактерий, обладающих сниженной на несколько порядков эндотоксической активностью. Можно ожидать, что использование мутантов с редуцированным числом вторичных ацильных заместителей в липиде А в качестве продуцентов биологически активных веществ для фармацевтической промышленности даст возможность значительно повысить степень очистки конечного продукта от эндотоксина.

Использование аттенуированных IpxL и IpxM мутантов в качестве вакцинных штаммов может привести к разработке нового поколения живых и убитых вакцин, обладающих пониженной реактогенностью. Принимая во внимание то, что одни и те же структурные варианты липида А могут вызывать эндотоксические эффекты разнонаправленного действия у человека и мыши [Delude R. et al., 1995] или отличаться по степени токсичности для этих видов на несколько порядков [Kawahara К. et al., 2002, Somerville J. et al., 1996, Somerville J. et al., 1999], можно прогнозировать, что наиболее выраженный эффект снижения реактогенно-сти будет проявляться при клиническом применении подобных вакцин, а не при их испытаниях на лабораторных животных.

Учитывая, что IpxM мутанты, в отличие от бактерий, дефектных по гену IpxL, не являются температуро-чувствительными [Karow, Georgopoulus, 1992], именно они являются оптимальными для конструирования живых вакцин, так как в ходе развития вакцинального процесса бактерии должны одну-две недели персистировать в макроорганизме при температурах выше 36 °С. В свою очередь, IpxL мутанты могут быть использованы при температурах культивирования, не превышающих 33 °С, в качестве основы для убитых вакцин.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шайхутдинова, Рима Завдатовна, 2008 год

1. Абгарян Г.П. Характеристика некоторых штаммов чумного микроба, выделенных на Армянском нагорье от обыкновенных полевок: Автореф. дисс. канд. мед. наук. Саратов, 1966. - 16 с

2. Анисимов А.П. Молекулярно-генетические механизмы образования и функциональная значимость капсулы Yersinia pestis: Дисс. . докт. мед. наук. Саратов, Оболенск, 1999. - 326 с.

3. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Сообщение 1. // Молекул, генетика. 2002. - № 3. - С. 3-23.

4. Апарин Г.П., Голубинский Е.П. Микробиология чумы. Руководство. -Иркутск, Иркутский государственный университет, 1989. 92 с

5. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. JL: Государственное издательство медицинской литературы, 1962. - С. 85-104.

6. Беспалова И.А. Иммунохимическая и биологическая характеристика модифицированных производных липополисахарида чумного микроба: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Ростов-на-Дону. - 1995. - 23 с.

7. Беспалова И.А., Васильева Г.И., Г нчарова Л.А., Мишанькин Б.Н., Дорошенко Е.П., Иванова И.А. Влияние ферментативного дефосфорилирования липополисахарида Yersinia pestis на его. токсичность in vitro и in vivo. II Биотехнология. 2006. - № 3. - С. 42-46.

8. Боровикова Т. А. Характеристика специфических полисахаридсодержащих комплексов субкультур штамма ЕВ чумного микроба: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Саратов, 1972. - 13 с.

9. Галазка А. Общая иммунология. Иммунологические основы иммунизации. Женева: Всемирная организация здравоохранения, 1993. -28 с.

10. Гончаров А.Ю., Гончаров Е.К., Алутин И.М. и др. Локализация ответственного за синтез фракции I участка ДНК на плазмиде pYTчумного микроба // Молекул, генетика. 1992. - № 11-12. - С. 10-14.

11. Гремякова Т. А., Анисимов А.П., Захарова Н.М. Взаимосвязь способности к экспрессии различных серовариантов капсульного антигена Yersinia pestis со степенью редуцированности липополисахарида бактериальных клеток // Журн. микробиол. 1995. -№ 1. - С. 3-6.

12. Гремякова Т.А., Волковой К.И., Шайхутдинова Р.З., Степанов A.B. Температурозависимые изменения иммунохимических свойств липополисахарида Yersinia pestis // Вестн. РАМН. 1999. - № 12. -С. 32-34.

13. Дентовская C.B., Шайхутдинова Р.З., Книрель Ю.А., Иванов С.А., Анисимов А.П. Конструирование вакцинных штаммов грамотрицательных бактерий со сниженной реактогенностью // Молекул, генетика. 2006. - № 2. - С. 3-8.

14. Дмитровский A.M. // Профилактика и меры борьбы с чумой. Материалы межгосударственной научной конференции, посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы (6-7 сентября 1994 г., Алматы). Алматы, 1994.-С. 15-16.

15. Захарова И. Я., Варбанец JI. Д 1983 Углеводсодержащие биополимеры мембран бактерий / Захарова И. Я., Варбанец JI. Д.- Киев: Наукова думка, 1983.-428 с - .

16. Изучение молекулярных основ патогенности возбудителей особо опасных и социально значимых инфекций: Отчет о НИР (заключительный) / ГНЦ прикладной микробиологии УДК 578.76; 616.9; № ГР 0120.0 409071"; Инв. № 0220.0 405040". - Оболенск, 2003. -55 с.

17. Инструкция по контролю специфической стерильности экспериментальных препаратов, приготовленных из культур чумного и холерного микробов. Саратов. - 1992

18. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридовграмотрицательных бактерий. // Биохимия. 1994. - Т. 59, вып. 12. -С. 1784-1851.

19. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. // Биохимия. 1993. - Т. 58. - Вып. 2. -С. 166-181.

20. Красикова И. Н., Бахолдина С.И., Соловьева Т.Ф. Синтез липополисахаридов у бактерий Yersinia pseudotuberculosis: влияние плазмиды pVM82 и температуры роста // Биохимия. 2000. - Т. 65. -Вып. 11.-С. 1507-1515.

21. Лившиц Ю.И. Требования к качеству лабораторных грызунов и условия их содержания // Руководство по вакцинному и сывороточному делу. -М.: Медицина, 1978. С. 24-36.

22. Медуницын Н.В. Вакцинология. М. Триада-Х, 1997. 272 с.

23. Оводов Ю.С., Горшкова Р.П. Липополисахариды псевдотуберкулезного микроба. // Химия природных соединений. 1988. - № 2. — С. 163-171.

24. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Наука, 1981.-288 с.

25. Проценко О.А., Анисимов П.И., Можаров О.Т. и др. Выявление и характеристика плазмид чумного микроба, детерминирующих синтез пестицина 1, антигена фракция 1 и экзотоксина "мышиного" токсина // л Генетика. 1983. - Т. 19. - № 7. - С. 1081-1090;

26. Руководство по профилактике чумы / Под ред. А.В. Наумова, Л.В. Самойловой. Саратов, 1992. — 278 с.

27. Руководство по биологической безопасности в лабораторных условиях".- ВОЗ. 2006. - Женева.

28. Тынянова В. И., Зюзина В.П. Демидова Г. В. и др. Токсичность препаратов липополисахаридов из культуры Yersinia pestis EV 76, выращенной при 28 ° и 37 // Биотехнология. 2003. - №6. - С. 10-16.

29. Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. М.: Мир. - 1980. - 582 с.

30. Amura C. Silverstein R., Morrison D. The role of polyamines in the , neutralization of bacteriophage deoxyribonucleic acid. // Infect. Immun. -1998.-V. 66.-P. 5372-8.

31. Anisimov A.P., Lindler L.E., Pier G.B. Intraspecific diversity of Yersinia pestis // Clin. Microbiol. Rev. 2004. - V. 17. - P. 434-464.

32. Anisimov A.P., Panfertsev E.A., Svetoch Т.Е., Dentovskaya S.V. Variability . of the protein sequences of LcrV between epidemic and atypical rhamnose-positive strains of Yersinia pestis II Adv. Exp. Med. Biol. 2007. - V. 603. -P. 23-27.

33. Aussel L., Therisod H., Karibian D., Perry M.B., Bruneteau M., Caroff M. Novel variation of lipid A structures in strains of different Yersinia species. I I FEBS Lett. 2000. - V. 465. - P. 87-92.

34. Austin E., Graves J., Hite L., Parker C., Schnaitman C. Genetic analysis of lipopolysaccharide core biosynthesis by Escherichia coli K-12: insertion mutagenesis of the rfa locus. // J Bacterid. 1990. - V. 172. - P. 5312-25.

35. Bacot A., Martin C. Observations on the mechanism of the transmission of plague by fleas. // J.Hygiene Plague Suppl.3. 1914. -V. 13. - P. 423-39.

36. Baker E., Sommer H., Foster L., Meyer E., Meyer K. Studies on immunization against plague. I. The isolation and characterization of the soluble antigen of Pasteurella pestis. // J. Immunol. 1952. - V. 68. - P. 13145.

37. Bengoechea J.-A., Lindner B., Seydel U., Diaz R., Moriyon I. Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia pestis are more resistant to bactericidal cationic peptides than Yersinia enterocolitica II Microbiology 1998. - V. 144. -P. 1509-1515.

38. BeutlerB., Cerami A. The common mediator of shoch cachexia, and tumor necrosis. //Adv. Immunol. 1988. - V. 42.-P. 213-31.

39. Birnboim H.C., Doly I. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucl. Acids Res. 1979. - V. 7. - P. 1515-23.

40. Bligh E., Dyer W. // A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. - 1959. - V. 37. - № 8. - P. 911-23.

41. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for quantification ofimicrogramm quantities of protein. Utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - V. 72. - P. 248-254.

42. Brandenburg K., Seydel U. Investigatios into the fluidity of lipopolysaccharide and free lipid A membrane systems by Fourier-transform infrared spectroscopy and differential scanning calorimetry. // Eur. J. Biochem. 1990.-V. 191.-P. 229-236.

43. Brandenburg K., Andra J., Miiller M., Koch M., Garidel P. Physicochemical properties of bacterial glycopolymers in relation to bioactivity. // Carbohydrate Research. 2003. - V. 338. - P. 2477-2489.

44. Brozek K.A., Raetz C.R.H. Biosynthesis of lipid A in Escherichia coli. Acyl carrier protein-dependent incorporation of laurate and myristate. // J. Biol. Chem. 1990.-V. 265.-P. 15410-15417

45. Brubaker R. The genus Yersinia: biochemistry and genetics of virulence. //

46. Curr Top Microbiol Immunol. 1972. -V. 57. - P. 111-158.

47. Brubaker R.R., Beesley E.D, Surgalla M.J. Pasteurella pestis: role of pesticin I and iron in experimental plague // Science. 1965. - V. 149. - P. 422-424.

48. Brubaker R. R. Factors promoting acute and chronic disease caused by yersiniae. // Clin. Microbiol. Rev. 1991. - V. 4. - P. 309-24.

49. Butler T. Plague and other Yersinia infections. // New York: Plenum Press. -1983.

50. Caron E., Gross A., Liautard J.-P., Dornand J. Brucella species release a specific, protease-sensitive, inhibitor of TNF-or expression, active on human macrophage-like cells. // J. Immunol. 1996. - V. 257. - P. 2885-93.

51. Carty S. M., Sreekumar K.R., Raetz C.R.H. Effect of cold shock on lipid A biosyntesis in Escherichia coli: Induction at 12 °C of an acyltransferase specific for palmitoleoyl-acyl carrier protein. // J. Biol. Chem. 1999. -V. 274.-P. 9677-9685.

52. Chart, H., T. Cheasty. and B. Rowe. Differentiation of Yersinia pestis and Y. pseudotuberculosis by SDS-PAGE analysis of lipopolysaccaride. // Lett. Appl. Microbiol. 1995. - V. 20. - P. 369-370.

53. Chen T.H., Elberg S.S., Boyles J. et al. Yersinia pestis\ correlation of ultrastructure and immunological status // Infect. Immun. 1975. - V. 11. -P. 1382-90.

54. Chen P., Toribara T., Warner H. Estimation of organic phosphorus. // Anal. Chem. 1956.-V. 28.-P. 1756-1761.

55. Clementz T. The gene coding for 3-deoxy-manno-octulosonic acid ransferase and the rfaQ gene are transcribed from divergently arranged promoters in Escherichia coli. IIJ Bacteriol. 1992. -V. 174. - P. 7750-76.

56. Clementz T., Bednarski J. J., Raetz C.R.H. Function of the htrB high temperature requirement gene of Escherichia coli in the acylation of lipid A: HtrB catalyzed incorporation of laurate. // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. -P. 12095-12102.

57. Clementz T., Zhou Z., Raetz C.R.H. Function of the Escherichia coli msbB gene, a multicopy suppressor of htrB knockouts in the acylation of lipid A. 11 J. Biol. Chem. 1997. -V. 272. - P. 10353-10360.

58. Cohen, S., Chang, A., Boyer H., Heling, R. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. II Proc. Natl. Acad. Sei. 1973. - V. 70.-P. 3240-4.

59. Coleman J., Raetz C. First committed step of lipid A biosynthesis in Escherichia coli: sequence of the IpxA gene. // J Bacterid 1988. - V. 170. -P.1268-74.

60. Darveau R. P., Hancock R. E. W. Procedure for isolation of bacterial lipopolysaccharides from both smooth and rough Pseudomonas aeroginosa and Salmonella typhimurium strains. // J. Bacteriol. — 1983a. — V. 155. P. 831-838.

61. Das U. Critical advances in septicemia and septic shock. // Crit. Care 2000. -V. 4.-P. 290-6.

62. Davies D. A specific polysaccharide of Pasteurella pestis. II Biochem J. -1956.-V. 63.-P. 105-116.

63. Delude R.L., Savedra R., Zhao Jr.H., Thieringer R., Yamamoto S., Fenton M.J., Golenbock D.T. Cdl4 enhances cellular responses to endotoxin without imparting ligand-specific recognition. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. -V. 92.-P. 9288-9292.

64. Dentovskaya, S. V., R. Z. Shaikhutdinova, Y. A. Knirel, S. A. Ivanov, and A. P. Anisimov. Construction of attenuated vaccine strains of Gram-negative bacteria. // Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. 2006. - V. 2. - P. 3-8.

65. Dinarello C. The proinflammatory cytokines interleukin-1 and tumor necrosis factor and treatment of the septic shock syndrome.// J.infect. Dis. 1991. -Vol. 163. - P. 1177-84.

66. Ding J., Zhu Y., Ho B. High-perfomance affinity capture-removal of bacterial pyrogen from solution. // J. of chromatography 2001. - V. 759. - P. 237246.

67. Donnenberg M. S., Kaper J. B. Construction of an eae deletion mutantenteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector // Infect. Immun. 1991 - V. 59. - P. 4310-4317

68. Dower W., Miller J., Ragsdale C.,High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. // Nucl. Acids res. 1988. - V. 16. - P. 6127.

69. Dubois M., Gilles K., Hamilton J., Rebers P., Smith F. Colorimetric methods for determination of sugars and related substances. // Anal. Chem. 1956. - V. 28. - P. 350-8.

70. Eisen R., Bearden S., Wilder A., Montenieri J., Antolin M., Gage K. Early-phase transmission of Yersinia pestis by unblocked fleas as a mechanism explaining rapidly spreading plague epizootics // Proc Natl Acad Sci USA 2006.-V. 103.-P. 15380-15385.

71. Erridge C., Bennett-Guerrero E., Poxton I. Structure and function of lipopolysaccharides. // Microbes and Infection. 2002. - V. 4. - P. 837-85.

72. Evans J. S., Maiden C. J. Purification of meningococcal lipooligosaccharide by FPLC techniques // Microbiology. 1996. - V. 142. - P. 57-62.

73. Galanos C., Luderitz O., Westphal O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides // European J. Biochem. 1969. - V. 9. - P. 245-249.

74. Galanos C, Freudenberg M.A. Mechanisms of endotoxin shock and endotoxin hypersensitivity // Immunobiology. 1993. V. 187. — P. 346-356.

75. Gay P.', Lecog D., Steimetz M. et al., Cloning structural gene sacB, which codes for exoenzyme levansucrase of Bacillus subtilis: expression of the gene in Escherichia coli J. Bacterid// 1983.-V. 153.-p. 1424-1431.

76. Glauser et al., 1998 TNF alpha глава 3.2

77. Golenbock D.T., Hampton R.Y., Qureshi N. Takayama K., Raetz C.R.H. -Lipid A-like molecules that antagonize the effects of human monocytes // J. Biol. Chem. 1991. - V. 266. - P. 19490-19498.

78. Griffin К., Hill J., Murray K. et al. Protective efficacies of the V antigen variants in Yersinia II Medische Microbiologic (Nederlands Tijdschrift voor). 1998. - V. 6 (Suppl. П). - P. 535.

79. Gunn J., Lim K., Krueger J., Kim K., Guo 1., Hackerr M., Miller S. PmrA-PmrB- regulated genes necessary for 4-aminoarabinose lipid A modification and polymixin resistance. // Mol. Microbiol. 1998. - V. 27. - P. 1171-82.

80. Hiimebush B. Transmission factors: Yersinia pestis genes required to infect the flea vector of plague. II Adv Exp Med Biol. 2003. - V. 529. - P. 55-62.

81. Hinnebusch В J. Interactions of Yersinia pestis with its flea vector that lead to the transmission of plague. // In: Gillespie S, Smith G,

82. Osbourn A, eds. Microbe-vector interactions in vector-bourne diseases. Cambridge. 2004. - P. 331-44.

83. Hirayama C., Sakata M:, Nakamura M., Ihara H., Kunitaka M., Todokoro M. J. Chromatogr. B, 1999, V.721 P.187.

84. Hitchcock P.J., Brown T.M. Preparation of proteinase K-treated cell lysates for SDS-PAGE // J. Bacterid. 1983. - V. 154. - P. 269-277.

85. Hofer M, Hampton R., Raetz C., Yu H. Aggregation behavior of lipid ГУд in aqeous solutions at physiological pH. 1: Simple buffer solutions. // Chem. Phys. Lipids.-1991.-V. 59.-P. 167-181.

86. Hoist O., Chemical structure of the core region of lipopolysaccharides. // В книге Endotoxin in health and disease. Под ред Brade H.et al. New-York Basel. 1999.-P. 115-154.

87. Ikawa M, Koepfli J., Mudd S., Niemann С An agent from E. coli causinghemorrage and regression of an experimental mouse tumor. III. The component fatty acids of the phospholipid moiety. // J Am Chem Soc. 1953. -V. 75.-P. 1035-1038.

88. Imoto M., Shiba T., Naoki H., Iwashita T., Rietschel ET., Wollenweber H-W., Galanos C., Lüderitz O. Chemical structure of E. coli lipid A: linkage site of acyl groups in the disaccharide backbone. // Tetrahedron Lett. 1983. -V. 24.-P. 4017-20.

89. Israelachvili J., Marcelja S., HormR. Physical" principles of membrane organization. // Rev Biophys 1980. - V. 13. - P. 121-200.

90. Johns M.A., Bruins S.C., McCabe W.R. Immunization with R mutants of Salmonella minnesota. II. Serological response to lipid A and thr. lipopolysacchrides of Re-mutants // Inf. Immun. 1977. - V. 17. - P 9-15.

91. Kadrmas J. Brozek KA, Raetz CR Lipopolysaccharide core glycosylation in Rhizobium leguminosarum. An unusual mannosyl transferase resembling the heptosyl transferase I of Escherichia coli. II J Biol Chem. 1996. - V. 271. -P. 32119-25.

92. Kalupahana R, Emilianus A., Maskell D., Blacklaws B. Salmonella enterica serovar Typhimurium expressing mutant lipid A with decreased endotoxicity causes maturation of murine dendritic cells // Infect. Immun. 2003 — V. 70-P. 6132-6140.

93. Kauffmann F, Lüderitz O, Stierlin H, Westphal O. Zur Immunchemie der O-Antigene der Enterobacteriaceen. I. Analyse der Zuckerbausteine von &zWze//a-0-Antigenen. // Zentralbl Bact I orig- 1960. 178:442-458

94. Kawahara K., Tsukano H., Watanabe H., Lindner B., Matsuura M. Modification of the structure and activity of lipid A in Yersinia pestis lipopolysaccharide by growth temperature. // Infect. Immun. 2002. — V. 70. -P. 4092-4098

95. Kenne L., Lindberg B., Madden J., Lindberg A., Gemski P. Structural studies of the Escherichia coli O-antigen. // Carbohydr Res. 1983. V. 122. - P. 249256.

96. Khan S.A., Everest P., Servos S., Foxwell N., Zäringer U., Brade H., Rietschel E.Th., Dougan G., Charles I.G., Maskell DJ. A lethal role for lipid A in Salmonella infections // Mol. Microbiol. 1998. - V. 29. - P. 571-579.

97. Kim S., Jia W., Bishop R., Gyles G. An msbB homologue carried in plasmid p0157 encodes an acyltransferase involved in lipid A biosynthesis in Escherichia coli 0157:H7. // Infect Immun. 2004. - V. 72. - P. - 1174-80.

98. Knirel Y., Dentovskaya S., Senchenkova S., Shaikhutdinova R., Kocharova N., Anisimov A. Structural features and structural variability of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis, the cause of plague// J of Endotoxin Research 2006. - V. 12. - P.

99. Kohara J., Tsuneyoshi N., Kimoto M., Gauchat J., Nakatake H., Fukudome K. Comparison.of lipopolysaccharide-binding functions of CD14 and MD-2.- - // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 2005. - V. 12. - P. 1292-7.

100. Kohara J., Tsuneyoshi N., Gauchat J., Kimoto M., Fukudome K., Preparation and characterization of truncated human lipopolysaccharide-binding protein in Escherichia coli. II Protein Expr. Purif. 2006. - V. 49. - P. 276-83.

101. Konkel M., Tilly K. Temperature-regulated expression of bacterial virulence genes // Microbes and Infection 2000. - V. 2. - P. 157-166.

102. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature 1970. - V. 227. - P. 680-685.

103. Lenaz G., Parenti Castelli G. Membrane fluidity, molecular basis and, physiological significance. // in: Benga G, ed. Stucture and Properties of cell

104. Membranes. Boca Raton, FL: CRC Press. 1985. - P. 93-136.

105. Lorange, E., Race B., Sebbane F., Hinnebusch B. Poor vector competence of fleas and the evolution of hypervirulence in Yersinia pestis. II J. Infect. Dis. -2005.-V. 191.-P. 1907-12.

106. Lowry O.H., Rosenbrough N.R., Farr A.L. et al. Protein measurement with the folin phenol // J. Biol. Chem. 1951. - V. 193.-P. 115-119.

107. Luchl M., Morrison D. Comparable endotoxic properties of lipopolysaccharides are manifest in diverse clinical isolates of gram-negative bacteria. II Infect. Immun. 2000. - V. 68. - P. 1899-1904.

108. Liideritz O, Staub AM, Westphal O. Immunochemistry of O and R antigens ' of Salmonella and related Enterobacteriaceae. II Bacterid Rev 1966a. -V. 30.-P. 192.

109. Liideritz O. Galanos C., Risse HJ., Ruschmann E., Schlecht S., Schmidt G., Schulte-Holthausen H., Wheat R., Westphal O., J. Structural relationships of Salmonella O and R antigens. // Ann NY Acad Sci 1966b. - V. 133. - ' P. 349-374.

110. Luderitz O., Galanos C., Rietschel E. Endotoxins of Gram-negative bacteria. // Pharmacol Ther. 1982. - V. 15. - P. 383-402.

111. Luzzati V., Mariani P., Gulik-Krzywicki T., The cubic phases of liquid-containing systems: physical structure and biological implications. // In: Mennier J. Langevin D. Boccara N, eds. Physics of Amphiphilic Layers. -1987.-V. 21.-P. 131-137.

112. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. N.Y., Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

113. Mariani P., Luzzati V., Delacroix H. Cubic phases of liquid-containing systems. Structure analysis and biological implications. // J. Mol. Biol., 1993, 204, P. 165-189.

114. Martin G., Ghabrial H. High-performance liquid chromatographic method to resolve and determine lipopolysaccharide sub-groups of Escherichia coli endotoxin in isolated perfused rat liver perfusate // J. of Chromatography.1992,-V. 574.-P. 205-211.

115. Miller J. H. Experiments in Molecular Genetics. 1972. - P. 280.

116. Minka S., Bruneteau M. Isolation and chemical characterization of type R lipopolysaccharides of a hypovirulent strain of Yersinia pestis. II Can J Microbiol. 1998. - V. 44. - P. 477-81.

117. Muck A., Ramm M., Hamburger. Efficient method for preparation of highly purified lipopolysaccharides by hydrophobic interaction chromatography // J of Chromatography B 1999. - V. 732. - P. 39-46.

118. Murray S.R., Bermudes D., de Felipe K., Low K. Extragenic suppressors of growth defects in msbB Salmonella.// J. Bacteriol. 2001. - V. 183. -P. 5554-5561.

119. Nikaido H. Biosynthesis and assembly of lipopolysaccharides and the outer membrane layer of gram-negative cell wall.-Bacterial membranes and walls // Ed. L. Leive. New York: Dekker Inc. 1973. - V. 1. - P. 131-3.

120. Oertelt C., Lindner B., Skurnik M., Hoist O. Isolation and structural characterization of an R-form lipopolysaccharide from Yersinia enterocolitica 0:8 //Eur. J. Biochem. -2001. -V. 268. P. 554-564.

121. Whitehead,S., Barrell,B.G. Genome sequence of Yersinia pestis, the causative agent of plague // Nature 2001 - V. 413. - P. 523-527.

122. Perry R., Fetherston J. Yersinia pestis—Etiologic Agent of Plague // Clin Microbiology 1997.-V. 10. -№ l.-P. 35-66.

123. Perry R., Abney J., Mier I., Lee Y., Bearden S., Fetherston J. Regulation of the Yersinia pestis Yfe and Ybt iron transport systems. // Adv Exp Med Biol. 2003. - V. 529. - P. 275-83.

124. Porat R., McCabe W., Brubaker R. Lipopolysaccharide-associated resistance to killing of Yersinia by complement // J. Endotoxin. Res. 1995. - V. 2. -P. 91-97.

125. Portnoy D.A., Martiner RJ. Role of a plasmid in the pathogenicity of Yersinia species // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1985. - V. 118. P. 29-51.

126. Post D.M.B., Phillips N.J., Shao J.Q., Entz D.D., Gibson B.W., Apicella M.A. Intracellular survival of Neisseria gonorrhoeae in male urethral epithelial cells: importance of a hexaacyl lipid A // Infect. Immun. 2002 - V. 70-P. 909-920.

127. Prentice M., Rahalison L. Plague. // Lancet. 2007. - V. 369. - P. 1196-207.

128. Prior J.L., Hitchen P.G., Williamson E.D., Reason A.J., Morris H.R., Dell A. Wren B.W., Titball R.W. Characterization of the lipopolysaccaride of Yersinic pestis. II Microb. Pathog. 2001b. - V. 30. - V. 49-57.

129. Radziejewska-Lebrecht. J., Shashkov A. S., Stroobant V., Wartenberg K., Warth C., Mayer H. The inner core region of Yersinia enterocolitica Ye 75 R(0:3) lipopolysaccharide. // Eur. J. Biochem. 1994. - V. 221. - P. 343351.

130. Raetz C.R.H. Biochemistry of endotoxins // Aniiu. Rev. Biochem. 1990. -V. 59.-P. 129-170.

131. Raetz C.R.H. Escherichia coli and Salmonella In Cellular and moleculai biology // Edited by F. Niedhardt. American Society of Microbiology. 1996 -P. 1035-1063.

132. Raetz C.R.H., Whitfield C. Lipooligosaccaride endotoxins // Annu. Rev.

133. Biochem. 2002. - V. 71. - P. 635-700.

134. Rebeil R., Ernst R.K., Gowen B.B., Miller S.I., Hinnbush BJ. Variation in lipid A structure in the pathogenic Yersinia. II Mol. Microbiol. 2004. -V. 52.-P. 1363-1373.

135. Rebeil R. Ernst R.K., Jarrett C.O., Adams K.N., Miller S.I., Hinnebush BJ. Characterization of late acyltransferase genes of Yersinia pestis and their role in temperature-dependent lipid A variation. // J. Bactenol. 2006. - V. 188. -P. 1381-1388.

136. Reeves P.R., Hobbs M., Valvano M.A., Skurnik M., Whitfield C., Coplin D., Kido N., Klena J., Maskell D., Raetz C.R.H., Rick P.D. Bacterial polysaccharide synthesis and gene nomenclature // Trends Microbiol. 1996. -V. 4.-P. 495-503.

137. Rietschel E., Kirikae T., Schade F., Ulmer A., Holst O., Brade H., Schmidt G., Mamat U., Grimmecke H., Kusumoto S., Zahringer U. The chemical structure of bacterial endotoxin in relation to bioactivity. Immunobiology // ■ 1993.-V. 187.-P. 169-190

138. Rietschel E. T., Krikae T., Schade F.U., Mamat U., Schmidt G., et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. // FASEB J 1994. - V. 8. - P. 217-225.

139. Rietschel E., Westphal O. Endotoxin: historical perspectives. // In Endotoxin in health and disease. Marcel Dekker Inc., New York. 1999. - P. 1-30.

140. Roggenkamp A., Geiger A.M., Leitrritz L. et al. Passive immunity to infection with Yersinia spp. mediated by anti-recombinant V antigen isdependent on polymorphism of V antigen // Infect. Immun. 1997. - V. 65. -P. 446-451

141. Sandstrom G. Sjostedt A, Johansson T, Kuoppa K, Williams JC Immunogenicity and toxicity of lipopolysaccharide from Francisella tularensis LVS. // FEMS Microbiol Immunol. 1992. - V. 5. - P. 201-210.

142. Scerra A.phosphorothionate primers imrove the amplification of DNA sequences by DNA polymerases with proofreading activity. // Nucleic Acids res. 1992. - V. 20. - P. 3551-3554.

143. Sebbane F., Jarrett C., Linkenhoker J., Hinnebusch B. Evaluation of the role of constitutive isocitrate lyase activity in Yersinia pestis infection of the flea vector and mammalian host. // Infect Immun. 2004. - V. 72. - P. 7334-7.

144. Seiberth H., Schmidt-Gayk H., Hackental E. Toxicity, clearance and distribution of endotoxin in mice as influenced by actinomycin D, cycloheximide, a-amanitin and lead acetate. // Toxicon. 1972. - V. 10. -P. 491-500.

145. Seydel, U., Labischinski M., Kastowsky K., Brandenburg K. Phase behaviour, supramolecular structure and molecular conformation of lipopolysaccharide. // Immunobiology 1993. - V. 187 - P. 191-211.

146. Shepherd A., Hummitzsch D., Leman P., Swanepoel R., Searle LA. Comparative tests for detection of plague antigen and antibody in experimentally infected wild rodents. // J Clin Microbiol. 1986. - V. 24. P. 1075-8.

147. Shiba T, Naoki H, Iwashita T, Rietschel ET, Wollenweber H-W, Galanos C, Liideritz O. Chemical structure of E. coli lipid A: linkage site of acyl groupsin the disaccharide backbone. // Tetrahedrron Lett. 1983. V. 24. - P. 40174020.

148. Simon R., Priefer U., Pulher A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in Gram negative bacteria // Biotechnology- 1983. -V. 1. -P. 784-791.

149. Skurnik M., Bolin I., Heikkenen H. etal. Virulence plasmid associated autoagglutination in Yersinia species // J. Bacterid. 1984. - V. 158. -P. 1033-6

150. Sodeinde O., Subrahmanyam Y., Stark K., Quan T., Bao Y., Goguen J. A surface protease and the invasive character of plague // Science. — 1992. -V. 258.-P. 1004-7.

151. Somerville J. E., Cassiano L., Bainbridge B., Cunningham M.D., Darveau R.P. A novel Escherichia coli lipid A mutant that produces an antiinflammatory lipopolysaccharide // J. Clin. Invest. 1996. - V. 97. - P. 359365.

152. Somerville J.E., Cassiano L., Darveau R.P. Escherichia coli msbB gene as i virulence factor and a therapeutic target. I I Infect. Immun. 1999. - V. 67. -P. 6583-6590.

153. Takayama K., Din Z., Mukeijee P., Cooke P., Kirkland T Physicocheical properties of the lipopolysaccharide unit that activates B lymphocytes. // J. Biol. Chem. 1990. -V. 265. - P. 14023-29.

154. Tan N. S., Ho B., Ding J. L. High-affinity LPS binding domain(s) in recombinant factor C of a horseshoe crab neutralizes LPS-induced lethality // FASEB J. 2000. - V. 14. - P. 859-70.

155. Tian L., White J., Lin H. et al. Induction of Mn SOD in human monocytes without inflammatory cytokine production by a mutant endotoxin. // Am. J. Physiol. 1998. - V. 275. - P. 740-7.

156. Tsai C.M., Frash C.E. A sensitive silverstain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels. // Anal. Biochem. 1982. -V. 119.-P. 115-119.

157. Tsuneyoshi N., Fukudome K., Kohara J., Tomimasu R., Gauchat JF.,

158. Nakatake H., Kimoto M. The functional and structural properties of MD-2 required for lipopolysaccharide binding are absent in MD-1. // J Immunol. -2005.-V. 174.-P. 340-4.

159. Vaara M. Agents that increase the permeability of the outer membrane. // Microbiol. Rev. 1992.-V. 56.-P. 395-411.

160. Vaara M., Nurminen M. Outer membrane permeability barrier in Escherichia coli mutants that are defective in the late acyltransferases of lipid A biosynthesis. //Antimicrob. Agents Chemother. 1999. -V. 43. - P. 145962.

161. Van Alphen L, Lugtenberg B, Rietschel ET, Mombers C. Architecture of the outer membrane of Escherichia coli K12. Phase transitions of the bacteriophage K3 receptor complex. 11 Eur J Biochem. 1979. - V. 101. -P. 571-9.

162. Van Amersfoort ES, Van Berkel TJ, Kuiper J. Receptors, mediators, and mechanisms involved in bacterial sepsis and septic shock. // Clin Microbiol Rev. 2003. - V. 16. - P. 379-414.

163. Van der Poll, Van Deventer. Cytokines and anticytokines in the pathogenesis of sepsis. // Infect Dis Clin North Am. 1999.* V. 13. - P. 413-426.

164. Vogelstein B., Gillespie D., Preparative and analytical purification of DNA from agarose //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979.- P. 615-619.

165. Weisbach A., Hurwitz J. The formation of 2-keto-3- . of Escherichia coli. Identification. // J. Biol. Chem. 1959 - V. 234. - P. 705-12.

166. Welkos S., Friedlander A., Davis K. Studies on the role of plasminogen activator in systemic infection by virulent Yersinia pestis strain C092. // MicrobPathog.- 1997.-V. 23.-P. 211-23.

167. Westphal O., Jann K. Bacterial lipopolysaccharides: extraction with phenol-water and further application of the procedure // Methods in carbohydrate chemistry / Roy L. Whistler (ed.). New York: Academic Press. Inc., 1965. -V. 5.-P. 83-91.

168. Wetmur J. G., Davidson N. J. Kinetics of renaturation of DNA. // Mol. Biol. -1968.-V. 31. P. 349-370.

169. Worsham P.L., Hunter M. Characterization of pestoides F, an atypical strain of Yersinia pestis II Medische Microbiologie (Nederlands Tijdschrift voor).1998. V. 6 (Suppl. II). - P. S34-35

170. Wyckoff T.J., Lin S., Cotter R.J., Dotson G.D., Raetz C.R. Hydrocarbon rulers in UDP-N-acetylglucosamine acyltransferases // J. Biol. Chem. 1998. -V. 273. 32369-32372.

171. Yanping H., Dongsheng Z., Xin P., etal. DNA microarray analysis of the heat- and cold-shock stimulons in Yersinia pestis // Microbes and Infection.— -2005.-V. 7.-P. 335-348

172. Zahringer U., Lindner В., Rietschel E. Molecular structure of lipid A, the endotoxic center of bacterial lipopolysaccharides. // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1994. - V. 50. - P. 211-276.

173. Zahringer U., Lindner В., Rietschel E. Chemical structure of lipid A: recent advaces in structural analysis of biologically active molecules. // В книге Endotoxin in health and disease. Под ред Brade H.et al. New-York Basel.1999.-P. 93-114.