Конструирование аттенуированных штаммов Yersinia Pestis с пониженной реактогенностью тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Агеев, Сергей Андреевич

• Агеев, Сергей Андреевич
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Агеев, Сергей Андреевич

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Молекулярные механизмы патогенеза чумы

1.2 Особенности формирования специфического иммунитета при чуме

1.3 Чумные вакцины

1.3.1 Краткая история вакцинопрофилактики чумы

1.3.2 Коммерческие чумные вакцины

1.3.3 Основные направления конструирования чумных вакцин нового поколения

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Конструирование аттенуированных штаммов Yersinia Pestis с пониженной реактогенностью»

Актуальность проблемы

За двести лет своего существования вакцинология достигла поразительных успехов - возбудитель оспы сохранился только в коллекциях двух лабораторий, заболеваемость целым рядом инфекций (полиомиелит, дифтерия и др.) удалось снизить до такой степени, что можно также надеяться на их полное искоренение, а сотни опаснейших болезней взяты здравоохранением под контроль благодаря классическим вакцинам, полученным методами инактивации и аттенуации. Способы получения вакцин с тех пор значительно изменились. Сегодня развитие методов молекулярной биологии, генной медицины, органической химии и иммунологии позволяет выделять очищенные нативные и получать синтетические антигены, направленно конструировать продуценты рекомбинантных протективных антигенов с заданными свойствами на основе технологичных штаммов бактерий или высших растений ("съедобные вакцины") и прецизионно аттенуированные мутанты и живые векторы на основе бактерий и вирусов, экспрессирующих протективные антигены in situ; использовать ДНК, РНК и полисахариды для индукции запрограммированного релевантного иммунного ответа [27; 127; 181].

Основные требования, предъявляемые к современным вакцинным препаратам, включают: безупречный уровень безопасности для всех слоев населения, в том числе лиц с измененной иммунной реактивностью (младенцы, беременные, пожилые, лица с нарушениями иммунного статуса); создание напряженного и долгосрочного уровня защиты, развивающегося не позднее чем через 2-3 недели после однократного введения вакцинного препарата; безынъекционный способ введения в организм (через рот, нос, слизистые); возможность комбинирования с другими вакцинами; устойчивость к внешним воздействиям и отсутствие специальных требований для хранения; и, наконец, экономичность и простоту изготовления [127]. Однако до сих пор не существует "идеальной вакцины", полностью соответствующей всем перечисленным требованиям. Большинство вакцинных препаратов обладает лишь частью из этих характеристик, и каждый из них имеет свои недостатки и ограничения.

В последние годы наибольшее внимание в разработке препаратов для вакцинопрофилактики чумы уделяется созданию субъединичных вакцин, содержащих лишь протективные антигены и неспособных вызывать инфекционный процесс даже у лиц с нарушениями иммунного статуса. Однако и они не являются идеальными, т.к. слабо индуцируют клеточное звено иммунитета и не могут предохранять от гибели после заражения штаммами, полностью утратившими способность к продукции антигена, используемого для иммунизации, либо продуцирующими серовары антигена, нераспознаваемые поствакцинальным иммунитетом. Так, чумные субъединичные вакцины на основе капсульного антигена F1 не способны стимулировать формирование напряженного поствакцинального иммунитета в отношении вирулентных бес-капсульных штаммов Y. pestis, а препараты на основе V антигена неэффективны в отношении штаммов, продуцирующих серологически отличающиеся варианты белка [48]. В то же время, применяемая в настоящее время в странах СНГ чумная живая вакцина на основе аттенуированного G. Girard'oM и J. Robic'oM в начале 30-х годов прошлого столетия [100] штамма Y. pestis EV лишена этих недостатков — она не только стимулирует напряженный и эффективный поствакцинальный иммунитет, но и предохраняет от гибели после заражения атипичными вариантами возбудителя чумы за счет индукции иммунного ответа на целый ряд антигенов, расположенных на клеточной поверхности как типичных, так и измененных бактерий [1]. Однако следует признать, что на настоящий момент эта вакцина морально устарела, прежде всего, из-за ее высокой реактогенности и способности вызывать тяжелые местные и системные реакции у здоровых вакцинируемых и даже генерализованный инфекционный процесс у лиц со сниженным иммунным статусом [29; 138; 154]. Поэтому снижение реактогенности живой чумной вакцины является одной из важных задач современной системы противочумной защиты населения.

Сотрудниками ФГУН ГНЦ ПМБ были сконструированы мутанты вакцинного штамма EV с нарушенным синтезом лауриновой кислоты, в которых центральная часть гена IpxM была замещена геном, определяющим устойчивость к канамицину [47]. В серии экспериментов на мышах [47; 89] и морских свинках [89] было установлено, что IpxM мутант по сравнению с исходным вакцинным штаммом не только снизил реактогенность, но и обладал повышенной иммуногенностью. Однако использование такого штамма в качестве основы для живой вакцины недопустимо из-за присутствия в его геноме гена лекарственной устойчивости. Конструирование IpxM мутанта вакцинного штамма EV, лишенного маркеров лекарственной устойчивости, позволит получить кандидат в вакцинные штаммы Y pestis - основу для разработки новой живой чумной вакцины со сниженной реактогенностью и повышенной иммуногенностью.

Цель исследования — разработка способа конструирования кандидатов в вакцинные штаммы чумного микроба с пониженной эндотоксической активностью: получение A IpxM производных вакцинного штамма EV линии НИИЭГ и оценка их в качестве кандидатов в вакцинные штаммы.

Задачи исследования:

1. Разработать способ конструирования IpxM мутантов Y. pestis, лишенных маркеров лекарственной устойчивости, и получить AlpxM вариант вакцинного штамма EV линии НИИЭГ.

2. Подтвердить корректность введенной мутации с помощью секве-нирования сконструированной аллели гена IpxM и определения структуры ЛПС, синтезируемого мутантным штаммом.

3. Провести сравнительную комплексную оценку эндотоксических свойств препаратов ЛПС, синтезируемых родительским и мутантным штаммами.

4. Оценить биологические свойства кандидата в вакцинные штаммы, включая реактогеннось, безвредность и иммуногенную активность, в соответствии с методическими указаниями МУ 3.3.1.1113-02 "Основные требования отбора новых вакцинных штаммов чумного микроба".

Научная новизна.

Впервые сконструирован и охарактеризован в соответствии с методическими указаниями "Основные требования отбора новых вакцинных штаммов чумного микроба" [4] A IpxM вариант вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ, лишенный маркеров антибиотикоустойчивости. Установлено, что степень снижения токсичности ЛПС Y. pestis, утратившего шестой жирно-кислотный остаток, зависит от видовой принадлежности клеток — мишеней макроорганизма. Выявлено антагонистическое действие мутантного пен-таацильного ЛПС по отношению к ЛПС дикого типа на модели человеческих, но не мышиных фагоцитирующих клеток. Впервые показано, что повышение иммуногенности штамма может сопровождаться снижением его "остаточной вирулентности"

Практическая значимость и внедрение результатов работы.

Разработана методология направленного конструирования лишенных маркеров антибиотикоустойчивости неревертирующих A IpxM мутантов Y. pestis, сочетающая прямой сайт-направленный мутагенез по методике К.А. Datsenko и B.L. Wanner [78], клонирование мутантной аллели AIpxMv.cat в суицидном векторе pCVD442, гомологичную рекомбинацию in vivo и удаление кассеты устойчивости к антибиотику. В коллекции живых культур ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» депонированы: штамм Е. coli DH5- Xpir/pCVD442-AlpxM\\cat (per. номер B-6512), продуцирующий суицидный вектор pCVD442-АIpxMv.cat, штамм Е. coli SI7- Xpir/pCVD442-AlpxM::cat (per. номер B-6511), предназначенный для конъюгативной передачи суицидного вектора в штаммы чумного микроба. Причем сконструированный штамм может использоваться как донор при создании новых кандидатов в вакцинные штаммы на основе любых аттенуированных штаммов Y. pestis.

В коллекции живых культур ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» депонирован авторский штамм Y. pestis EVAIpxM (per. номер B-6513), сочетающий делецию гена IpxM с отсутствием маркеров лекарственной устойчивости (федеральный уровень внедрения).

Результаты исследований послужили основой для составления методических рекомендаций по изучению ингибирующего действия препаратов модифицированного ЛПС Y. pestis на индукцию синтеза TNF-or эукариотиче-скими клетками. (Оболенск, 2010, учрежденческий уровень внедрения).

Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов факультета биологической и экологической безопасности Пущинского государственного университета (учрежденческий уровень внедрения).

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный комплекс методических приемов, препаратов ДНК и бактериальных штаммов обеспечивает контролируемое конструирование лишенных маркеров лекарственной устойчивости IpxM мутантов Y. pestis — кандидатов в вакцинные штаммы со сниженной реактогенностью.

2. Созданный на основе вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ нокаутный мутант по гену IpxM, лишенный маркеров антибиотикоустойчи-вости, синтезирует ЛПС со сниженной способностью стимулировать продукцию TNF-a. Снижение провоспалительной активности ЛПС штамма Ypestis EVA IpxM проявляется в большей степени на моноцитах человека и в меньшей степени на макрофагах мыши.

3. Уменьшение реактогенности (остаточной вирулентности) штамма Ypestis EVAlpxM сопровождается повышением его иммуногенности.

Работа выполнена в лаборатории микробиологии чумы (ЛМЧ) ГНЦПМБ по Государственным контрактам № 124-Д от 11.06.2009 г. и № 52-Д от 29.06.2010 г. в рамках Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 годы)».

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на: 46th Oholo Conference: "The Challenge of Highly Pathogenic Microorganisms - Mechanism of Virulence and Novel Medical Countermeasures" (Eilat, Israel, October 25-29, 2009,); VI-й Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 10-11 ноября 2009); Научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 25-27 мая 2010); Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ФГУН ГНЦ ПМБ 8 сентября 2010 года.

Публикации. Основное содержание работы отражено в 8 научных публикациях (включая 2 статьи в международных научных журналах реферируемых ISI и 1 главу в международной монографии) список которых приведен в конце автореферата.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на. 122 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 42 работы отечественных и 173 работы зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 12 таблицами.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Агеев, Сергей Андреевич

ВЫВОДЫ

1. Разработан способ контролируемого конструирования лишенных маркеров лекарственной устойчивости IpxM мутантов Y. pestis — кандидатов в вакцинные штаммы со сниженной реактогенностью. Методическая схема включает в себя: прямой сайт-направленный мутагенез по методике К.А. Datsenko и B.L. Wanner в клетках Y. pestis, переклонирование мутантной аллели AIpxMv.cat в суицидный вектор pCVD442 в клетках Е. coli, гомологичную рекомбинацию in vivo и удаление кассеты устойчивости к антибиотику в клетках Y.pestis. Разработанные методические подходы могут быть легко адаптированы для других грамотрицательных бактерий.

2. Подтверждена корректность проведения сайт-направленного мутагенеза с помощью секвенирования сконструированной аллели гена IpxM, определения структуры ЛПС, синтезируемого мутантным штаммом Y. pestis

EVA IpxM, а также изучения основных фенотипических характеристик сконструированного штамма.

3. Впервые доказано, что «феномен переживания» Н.Н. Гинсбурга [1969] пригоден для оценки иммуногенности вакцинных штаммов чумного микроба не только с высокой, но и со сниженной "остаточной вирулентностью".

4. Подтверждено, что созданный на основе вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ нокаутный мутант по гену IpxM, лишенный маркеров ан-тибиотикоустойчивости, синтезирует ЛПС со сниженной способностью стимулировать продукцию TNF-a.

5. Показано, что степень снижения провоспалительной активности ЛПС, синтезируемого мутантным штаммом Y. pestis EVAlpxM, значительно выше в тестах на клетках-мишенях человека по сравнению с мышиной моделью.

6. Впервые показано, что снижение "остаточной вирулентности" штамма Y. pestis EVAlpxM не приводит к уменьшению эффективности вакцинации, но, напротив, сопровождается повышением его иммуногенности.

Очевидно, что блокирование раннего (врожденного) иммунного ответа макроорганизма имеет решающее значение для патогена, так как дает ему возможность адаптироваться и начать успешную интервенцию макроорганизма. Поэтому стратегия Y. pestis при внедрении в теплокровный организм, заключающаяся в модификации своей клеточной стенки на менее "узнаваемую" макрофагами, является абсолютно логичной. Однако для "переодевания", то есть для перехода на синтез менее ацилированных форм липидаА чумному микробу требуется некоторое время для запуска температуро-зависимых регуляторных механизмов. В то время как мутантный по гену IpxM штамм У. pestis с его независимым от температуры перманентным синтезом менее ацилированного липида А не нуждается в подобной lag-фазе, поэтому он с момента попадания в макроорганизм более надежно по сравнению с родительским штаммом прикрыт от рокового внимания фагоцитов. В свете этого механизма повышение иммуногенности менее реактогенного штамма EVAlpxM абсолютно укладывается в. схему, поведения Y. pestis в организме теплокровных животных. Способность мутантного штамма благодаря синтезу пентаацилированного ЛПС снизить агрессивность макрофагов на этапе внедрения позволяет ему несколько успешнее, чем исходному штамму размножиться внутри них и диссеминировать по организму, что и приводит в конечном итоге к более высокому уровню протективного противочумного иммунитета. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на то, что нынешнее столетие называют временем господства вирусов, когда наибольшую эпидемическую опасность для населения представляют вирусные инфекции, чума продолжает оставаться одной из немногих бактериальных инфекций, которая до сих пор представляет глобальную угрозу для человечества, благодаря своей способность к молниеносному течению и распространению в случае перехода ее во вторичную легочную форму. Эпидемические вспышки чумы продолжают регистрироваться ежегодно. Применяемая в Российской Федерации живая чумная вакцина, разработанная в 30-40-е годы прошлого столетия [29], до сих пор является наиболее надежным средством защиты от этой опаснейшей бактериальной инфекции. Однако применение чумной вакцины сопровождается достаточно большим количеством случаев поствакцинальных осложнений, обусловленных ее высокой реактогенностью. Поэтому снижение реактогенности живой чумной вакцины при полном сохранении ее протективных свойств остается задачей, актуальной для российского здравоохранения.

Биологической основой реактогенности живых вакцин на основе гра-мотрицательных бактерий является входящий в их состав эндотоксин (ЛПС). Поскольку на данный момент многочисленными исследованиями установлено, что токсичность ЛПС определяется степенью ацилирования липида А, то одним из способов снижения его токсичности является генно-инженерная модификация ЛПС, заключающаяся в нарушении последнего этапа ацилирования липида А и обеспечивающая образование пентаацильных. молекул ЛПС со сниженной эндотоксической активностью.

Ранее сотрудниками ФГУН ГНЦ ПМБ были сконструирован штамм ЫрхМ\\кап - производный,вакцинного штамма EV линии НИИЭГ с нарушенным присоединением лауриновой кислоты, в котором центральная часть гена IpxM была замещена геном, определяющим устойчивость к канамицину [47]. В серии предварительных экспериментов было показано, что снижение его токсичности сопровождалось повышением протективной активности [40; 47; 87; 89], что давало основание рассматривать аттенуированные IpxM мутанты чумного микроба в качестве кандидатов в вакцинные штаммы. Поскольку присутствие в геноме EVAIpxMwkan маркера лекарственной устойчивости не позволяло нам использовать ранее полученный штамм в качестве основы для живой вакцины, в рамках настоящего исследования была разработана технология получения мутантных по гену IpxM штаммов Y. pestis, лишенных генов лекарственной устойчивости. Конструирование LpxM" варианта штамма

Y. pestis EV заключалось в инактивации гена IpxM с помощью замены его на кассету устойчивости к антибиотику и последующем удалением кассеты из хромосомы. С помощью сайт-направленного мутагенеза на основе вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ нами были получены клоны с делети-рованным геном IpxM, лишенные генов антибиотикоустойчивости.

По своим культурально-морфологическим свойствам сконструированные IpxM мутанты не отличались от исходного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ. Верификация мутаций методом ПЦР (у всех ЫрхМ штаммов) и сек-венирования (у выбранного для дальнейших исследований клона) подтвердила делецию гена IpxM. Предварительная оценка иммуногенных свойств мутантных LpxM" клонов с использованием «феномена переживания» [13] показала, что их способность индуцировать протективный противочумный иммунитет различна, что, вероятнее всего, связано с неидентифицированны-ми мутациями вне гена IpxM. Клон Y. pestis EVA IpxM, продемонстрировавший максимальный уровень защиты белых мышей от заражения чумой, был отобран в качестве кандидата в вакцинные штаммы. Исследование масс-спектра ЛПС Y. pestis EVA IpxM показало отсутствие остатка лауриновой кислоты в липиде А мутантного штамма Y. pestis EVAlpxM и подтвердило, что введенная нами мутация приводила к прекращению синтеза соответствующей ацилтрансферазы LpxM. Полученный и предварительно охарактеризованный штамм Y. pestis EVAlpxM использовали для сравнительной оценки эндотоксических и иммуногенных свойств и оценки его в качестве кандидата в вакцинные. Продукция TNF-а макрофагами человека и мыши после стимуляции их пентаацильным ЛПС из мутанта Y. pestis EVA IpxM была значительно ниже по сравнению с продукцией TNF-et; индуцированной ЛПС родительского штамма EV НИИЭГ. Сравнение данных, полученных на человеческих и мышиных иммунокомпетентных клетках показало, что различие в способности к стимуляции продукции TNF-a между ЛПС эталонного вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ и ЛПС его LpxM-негативного варианта было гораздо более выражено на человеческих моноцитах по сравнению с мышиными макрофагами.

Более того, в экспериментах in vitro при совместном введении с полноценным ЛПС дикого типа пентаацилированный липид А выступал в качестве антагониста секреции TNF-a, когда тестировался с моноцитами человека, но являлся агонистом для мышиных фагоцитов. Данные отличия связывают с различной специфичностью к ЛПС рецепторов у человека и мыши [79; 101], которая, в свою очередь, вероятнее всего обусловлена разной чувствительностью мыши и человека к ЛПС Y. pestis и особенностям иммуногенеза [36; 37; 51; 69]. Существует мнение, что оптимальная для клеточной активации структура липида А не аналогична оптимальной структуре для связывания с клеточной мембраной, которая представляет собой просто дифосфорилиро-ванный дисахарид, имеющий минимум две жирные кислоты без какого-то специфического расположения. Структуры, которые очень хорошо связываются с клетками, не обязательно индуцируют сильное высвобождение моно-кинов, так как не всякое связывание индуцирует олигомеризацию TLR-4, которая необходима для дальнейшей трансдукции сигнала. Это является дополнительным свидетельством того, что эндотоксическая активность определяется количеством, структурой и распределением жирных кислот, то есть характером ацилирования липида А. Менее токсичные аналоги липида А в то же время могут являться более активными иммуностимуляторами [8]. Данные, полученные нами на мышиной клеточной модели in vitro, согласовались с данными, полученными на мышах линии Balb/C. После введения мышам ЛПС из родительского штамма Y. pestis EV НИИЭГ уровень сывороточного TNF-a у них достигал более высоких значений по сравнению с показателем сывороточного TNF-a мышей, обработанных ЛПС из LpxM клона Y. pestis EV. Кроме того, делеция гена IpxM приводила к пятикратному снижению токсичности синтезируемого мутантными бактериальными клетками ЛПС для мышей. Таким образом, результаты экспериментов in vivo коррелировали с данными экспериментов на клеточных культурах, что говорит о валидности данных, полученных нами in vitro на клеточных культурах.

Полученный нами штамм Y. pestis EVA IpxM обладал меньшей остаточной вирулентностью для мышей по сравнению с родительским штаммом Y. pestis EV НИИЭГ. Несмотря на это, мутантный штамм в первые сутки после заражения мышей был способен к более эффективному размножению в лимфоузлах по сравнению с родительским штаммом, но при этом вызывал менее выраженное воспаление. Отметим, что кинетика размножения в селезенке была сходна у мутантного и исходного штаммов Y. pestis. Считается, что более выраженная остаточная вирулентность вакцинного штамма обеспечивает формирование более эффективного противочумного иммунитета. Однако в наших исследованиях иммунизация мутантным штаммом Y. pestis EVAlpxM приводила к индукции более высокого специфического антительного ответа на иммунодоминантные антигены Y. pestis F1 и V по сравнению с исходным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ. Кроме того, штамм Y. pestis EVAlpxM предохранял белых мышей от подкожного заражения вирулентной культурой чумного микроба в 2,5 раза более успешно по сравнению с эталонным штаммом EV НИИЭГ и индуцировал у животных формирование более напряженного иммунитета. По нашему мнению, синтез пентаацильного ЛПС приводит к модификации клеточной стенки бактерии на менее "узнаваемую" макрофагами, что снижает их воспалительный ответ на этапе внедрения инфекции и позволяет кандидату в вакцинные штаммы успешнее преодолевать фагоцитарный барьер и диссеминировать по организму, что и приводит в конечном итоге к более высокому уровню протективного иммунитета. Завершая обсуждение наших исследований, нельзя не согласиться с мнением С.В. Дентовской с соавт. [16] - "принимая во внимание то, что одни и те же структурные варианты липида А могут вызывать эндотоксические эффекты разнонаправленного действия у человека и мыши или отличаться по степени токсичности для этих видов на несколько порядков, можно прогнозировать, что наиболее выраженный эффект снижения реактогенности будет проявляться при клиническом применении подобных вакцин, а не при их испытаниях на лабораторных животных".

Развитие генной инженерии, позволяющей манипулировать с отдельными генами, значительно расширило возможности реорганизации микробных геномов. Перспективным направлением дальнейших исследований может быть получение A IpxM мутантов на основе других высокоиммуногенных штаммов Y.pestis, прецизионно аттенуированных за счет делеции существенных для вирулентности генов, не связанных с pgm локусом, отсутствующим у вакцинного штамма EV. Особенный интерес могут представлять эксперименты со снижением эндотоксической активности штаммов Y.pestis, лишенных способности синтезировать липопротеин. Делеция гена nlpD, отвечающего за синтез NlpD-липопротеина, приводила к неспособности Г. pestis колонизировать организм мышей. Показано, что A nlpD мутант обладал на два порядка большей протективностью, чем вакцинный штамм EV [190]. Разработанная нами методика мутагенеза гена IpxM делает возможным получение необходимых мутантов Y.pestis на основе любых родительских штаммов чумного микроба.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Агеев, Сергей Андреевич, 2010 год

1. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов // Молекул. Генетика. 2002а. - № 3. - С. 3-23.

2. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов // Молекул, генетика. 20026. - № 4. - С. 3-11.

3. Анисимова Т.И., Саяпина Л.В., Сергеева Г.М. Основные требования к вакцинным штаммам чумного микроба: МУ 3.3.1.1113-02. Саратов, 20021

4. Анисимова Т.И., Свинцова Е.М. «Феномен переживания» при чуме у морских свинок и испытание безвредности новых вакцинных штаммов чумного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. 1976. -№47.-С. 32-35.

5. Апарин Т.И., Вершинина Т.И. Способ определения степени иммуно-генности авирулентных штаммов чумного микроба // 1986. — Авторское свидетельство SU 1100304 А.

6. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях II — Л.: Государственное издательство медицинской литературы, 1962. С. 85-104.

7. Беспалова И. А., Пустовалов В. Л., Львов В. Л:, Вернер И.К., Васильева Г.И. Получение и некоторые свойства модифицированного1 липопо-лисахарида Yersina pestis // Биотехнология. 1995. - № 910. - С. 31 -34.

8. Бывалов А.А., Паутов В.Н., Чичерин Ю.П., Лебединский В.А., Евстигнеев В.И. Эффективность ревакцинации павианов гамадрилов чумной живой сухой вакциной НИИС и фракцией 1 чумного микроба // Журн. микробиол. 1984. - № 4. - С. 74-76.

9. Вогачева Н.В., Дармов И.В., Борисевич И.В., Крючков А.В., Печенкин Д.В. Динамика показателей клеточного иммунитета на фоне введения чумной живой сухой вакцины // Клинич. лаб. диагн. 2009. - № 8. -С. 24-27.

10. Воробьев А.А., Лебединский В.А. Массовые способы иммунизации // Медицина, Москва, 1977. - 254 с.13