Генетическая характеристика хромосомной области пигментации штаммов пяти подвидов возбудителя чумы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Зудина, Ирина Витальевна

• Зудина, Ирина Витальевна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Зудина, Ирина Витальевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структурно-функциональная организация области пигментации иерсиний.

1.1.1. Область пигментации хромосомы Y. pestis.

1.1.2. Область пигментации хромосомы энтеропатогенных иерсиний.

1.1.3. Нестабильность "островов высокой патогенности" возбудителя чумы и энтеропатогенных иерсиний.

1.2. Фенотипическое проявление признаков, кодируемых генами хромосомной области пигментации, у природных штаммов пяти подвидов Y. pestis.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Бактериальные штаммы.

2.2. Питательные среды, препараты и реактивы.

2.3. Методы исследований.

Глава 3. ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРИРОДНЫХ

ШТАММОВ ПЯТИ ПОДВИДОВ Y. PESTIS.

3.1. Конструирование полу синтетической среды для определения признака пигментации у штаммов пяти подвидов Y. pestis.

3.2. Изучение состава клеточной популяции природных штаммов Y. pestis по признаку пигментации.

3.3. Рост природных штаммов пяти подвидов Y. pestis на питательных средах с дефицитом свободных ионов железа.

3.4. Проявление признака чувствительности к пестицину у природных штаммов пяти подвидов чумного микроба.

Глава 4. СОЗДАНИЕ КОЛЛЕКЦИИ И ХАРАКТЕРИСТИКА

ИЗОГЕННЫХ HMS"- И Р SN'-МУТАНТОВ ШТАММОВ ПЯТИ ПОДВИДОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ.

4.1. Получение pPst"-вариантов типовых и референтных штаммов пяти подвидов Y. pestis.

4.2. Создание коллекции изогенных клонов штаммов пяти подвидов Y. pestis, мутантных по признакам пигментации и чувствительности к пестицину.

4.3. Выявление структурных изменений в pgm-области хромосомы мутантных клонов штаммов Y. pestis.

4.4. Рост мутантных клонов штаммов возбудителя чумы на питательных средах с пониженным содержанием свободных ионов железа.

4.5. Определение вирулентности изогенных мутантных клонов штаммов чумного микроба.

Глава 5. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ НЕСТАБИЛЬНОСТИ PGM-ОБЛАСТИ ХРОМОСОМЫ У pPST-КЛОНОВ ШТАММОВ ПЯТИ ПОДВИДОВ К PESTIS.

5.1. Определение частоты возникновения мутаций по признаку пигментации.

5.2. Определение частоты возникновения мутаций по признаку чувствительности к пестицину.

5.3. Определение частоты встречаемости Hms"- и Psn'-мутантов в популяциях pPsf-клонов штаммов пяти подвидов чумного микроба в процессе хранения.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генетическая характеристика хромосомной области пигментации штаммов пяти подвидов возбудителя чумы»

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В последние годы в микробиологии интенсивно развивается научное направление, связанное с изучением строения, функционирования и распространенности в геномах бактерий так называемых "островов па-тогенности", или PAIs (pathogenicity islands) (Hacker et al., 1990; Blum et al., 1994; Hacker et al., 1997; Buchrieser et al., 1998). У многих грамнегативных и грампозитив-ных патогенных микроорганизмов в PAIs сконцентрированы гены, кодирующие токсины, адгезины, инвазины и другие факторы вирулентности.

Патогенные для человека виды иерсиний Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia enterocolitica также обладают очень близкими по строению "островами высокой патогенности" - HPI (hight pathogenicity islands) (Buchrieser et al., 1998, 1998a; Rakin et al., 1999). Отличительной особенностью этих микроорганизмов является то, что в обнаруженных у них HPI находятся не гены патогенности как таковые, а оперон Ybt-зависимой (Ybt - yersiniabactin) системы ассимиляции железа. Гены HPI отвечают за чувствительность штамма к действию пестицина (Рзп+-фенотип определяют после удаления плазмиды pPst), его способность к росту в условиях дефицита ионов железа при 37 °С и, как следствие этого, вирулентность для биопробных животных (Perry, 1993; Rakin et al., 1994a).

У возбудителя чумы "остров высокой патогенности" расположен в пределах хромосомной области пигментации (pgm-область, -102 т.п.н.) (Fetherston et al., 1992) в непосредственной близости от hmsFHRS оперона, гены которого обеспечивают экспрессию признака пигментации (Нш8+-фенотип) (Lillard et al., 1997; Buchrieser et al., 1998). Последовательность HPI существенно отличается показателем ГЦ-пар нуклеиновых оснований (56 % - 59%) от ДНК hmsFHRS оперона и остальной хромосомы (49 % - 50 %) (Fetherston, Perry, 1994; Buchrieser et al., 1999). В связи с этим в пределах pgm-области выделяют два региона: hms-регион (регион пигментации) и ybt-регион, содержащий гены HPI.

Область пигментации нестабильна: обширные делеции этого участка хромосомы (Адат-мутации) (Fetherston et al., 1992) возникают с частотой 10"5 (Brubaker, 1969) в процессе гомологичной рекомбинации между двумя фланкирующими копиями ISI00 элементов (Portnoy, Falkow, 1981; Fetherston, Perry, 1994). В результате этого 6 мутационного события клетки чумного микроба сочетанно утрачивают признак пигментации и все признаки, кодируемые генами "острова высокой патогенности". До недавнего времени считалось, что у возбудителя чумы обширная делеция области пигментации является едва ли не единственным типом мутации, приводящим к возникновению Hms'-штаммов.

В природных очагах чумы на территории России и сопредельных государств помимо штаммов основного подвида Y. pestis циркулируют штаммы алтайского, гис-сарского, кавказского и удэгейского подвидов (в соответствии с классификацией, принятой на Совещании по таксонамии и номенклатуре чумного микроба в Саратове в 1985 г.), для которых характерен целый ряд отличительных признаков, в числе которых - избирательная вирулентность и низкая эпидемическая значимость (Кокуш-кин, 1995). В отечественной литературе имеются отдельные сообщения, что у штаммов кавказского и алтайского подвидов утрата признака пигментации не сопровождается сочетанной потерей чувствительности к пестицину и вирулентности для белых мышей (Пак, Шашаев, 1971; Кутырев, 1992). Установлено также, что для штаммов кавказского подвида Y. pestis свойственна более низкая, чем у штаммов основного подвида, частота возникновения непигментированных мутантов (Классовский, Пей-сахис, 1974; Мартиневский, Павличенко, 1978; Мартиневский, 1988; Кутырев, 1992). Было высказано предположение, что разный характер изменчивости Hms- и Psn-признаков у штаммов этих подвидов обусловлен существованием отличий в генетической организации hms- и у/^-регионов хромосомной области пигментации (Кутырев, 1992). Выявление изменений в структуре этих участков хромосомы может позволить получить дополнительные сведения о роли отдельных генов hmsFHRS-оперона и HPI в проявлении патогенности возбудителем чумы. Кроме того, эти данные могут оказаться ценными для установления вертикальных и горизонтальных эволюционных связей не только между подвидами Y. pestis, но и между другими видами рода Yersinia.

Все вышеизложенное свидетельствует об актуальности изучения организации pgm-области хромосомы возбудителя чумы. Однако до настоящего времени большинство исследований в этом направлении проводилось на модели штаммов основного подвида. Информация об изменчивости признаков, кодируемых генами хромосомной области пигментации, у четырех неосновных подвидов Y. pestis крайне ограничена. В частности, не известно, является ли необычный характер изменчивости Psn7 и Hms-признаков особенностью только штаммов алтайского и кавказского подвида, или он свойственен и для штаммов других неосновных подвидов. Не установлены типы мутаций, приводящие к утрате признака пигментации и вирулентности у штаммов пяти подвидов чумного микроба. Неизученным также остается один из интереснейших вопросов, касающийся характера взаимоотношений признаков пигментации, чувствительности к пестицину и способности к потреблению ионов железа при 37 °С с вирулентностью у штаммов пяти подвидов Y. pestis, циркулирующих в природных очагах на территории стран СНГ и Монголии.

ЦЕЛЬЮ РАБОТЫ явилось проведение сравнительного изучения признаков, кодируемых генами хромосомной области пигментации, для получения генетической характеристики этого участка хромосомы у штаммов пяти подвидов возбудителя чумы.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Разработать питательную среду для проведения поклонального анализа штаммов пяти подвидов возбудителя чумы по признакам пигментации и способности к росту в условиях дефицита железа.

2. Охарактеризовать фенотипические признаки природных штаммов чумного микроба различного происхождения, кодируемые генами области пигментации.

3. Создать и охарактеризовать коллекцию изогенных спонтанных мутантов типовых и референтных штаммов пяти подвидов чумного микроба по признакам пигментации, чувствительности к пестицину, способности к росту в условиях дефицита железа при 37 °С и вирулентности.

4. Методом ПЦР-анализа выявить у полученных мутантов чумного микроба возможные изменения в структуре области пигментации хромосомы.

5. Определить частоты возникновения и встречаемости спонтанных мутантов по признакам пигментации и чувствительности к пестицину у штаммов пяти подвидов возбудителя чумы.

6. На основе полученных данных провести сравнительный анализ процессов популяционной изменчивости по признакам, кодируемым генами области пигментации, у штаммов пяти подвидов возбудителя чумы. 8

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые с привлечением статистических методов проведены исследования изменчивости признаков, кодируемых генами хромосомной области пигментации штаммов пяти подвидов чумного микроба. Установлены достоверные различия в частотах возникновения и встречаемости мутантов по признакам пигментации и чувствительности к пестицину у штаммов основного и неосновных подвидов возбудителя чумы. Показано, что у штаммов основного подвида наиболее часто происходят обширные делеции области пигментации и мутации в генах ^/-региона. У штаммов неосновных подвидов, наоборот, более часто возникают мутации в генах /шя-региона. Получены новые сведения о различном характере накопления мутантных клеток в популяциях штаммов разных подвидов в процессе хранения при пониженных температурах. На основании этих данных можно заключить, что штаммы основного и четырех неосновных подвидов представляют собой две обособленные группы в пределах вида Y. pestis.

Впервые создана коллекция изогенных мутантных по Hms- и Psn-признакам вариантов типичных штаммов пяти подвидов чумного микроба. В результате использования этой изогенной системы у штаммов неосновных подвидов возбудителя чумы был определен характер взаимоотношения признаков пигментации, чувствительности к пестицину и способности к росту при 37 °С на железо-хелатированных средах с вирулентностью для белых мышей. Показано, что у штаммов трех неосновных подвидов (гиссарского, алтайского и удэгейского), как и у штаммов основного подвида, вирулентность для белых мышей коррелирует с Psn-признаком и со способностью к росту на средах с дефицитом ионов железа при 37 °С. У отдельных штаммов кавказского подвида отсутствует четкая корреляция между экспрессией Psn-признака и вирулентностью.

С помощью сравнительного ПЦР-анализа впервые показано, что у штаммов, циркулирующих в природных очагах чумы на территории стран СНГ и Монголии, утрата одного из признаков (пигментации или чувствительности к пестицину), как правило, обусловлена не обширными делениями hms- или ^-регионов, а более мелкими мутационными событиями, возникающими в генах HPI и hmsFHRS-оиероиа. области пигментации. Новыми также являются данные о возможности возникновения непиг-ментированных пестицинрезистентных авирулентных мутантов чумного микроба в 9 результате сочетания независимых мутаций в генах hms- или ^-регионов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

В Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ "Микроб" депонирована коллекция изогенных спонтанных мутантов по признакам пигментации и чувствительности к пестицину, выделенных из популяций pPsf-клонов типовых и референтных штаммов пяти подвидов чумного микроба (20 штаммов).

По результатам работы составлены "Методические рекомендации по приготовлению и использованию полусинтетической среды для дифференциации колоний Y. pestis по признаку пигментации", которые одобрены Ученым советом Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб" (протокол № 3 от 26 марта 1996 г.) и утверждены директором РосНИПЧИ "Микроб" [по учрежденческому уровню внедрения].

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации представлены и доложены на "Научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России" (Саратов, 1997), научной конференции учреждений по борьбе и изучению природно-очаговых инфекций Министерства Здоровья и Социальной Защиты (Улан-Батор, Монголия, 1999), итоговой научной конференции Рос.НИПЧИ "Микроб" (Саратов, 2000) и на международном конгрессе "Microbiology 2000" (Мюнхен, Германия, 2000).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, четырех глав собственных исследований (в т.ч. одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 17 рисунками. Библиографический указатель содержит 106 отечественных и 110 зарубежных источников.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Зудина, Ирина Витальевна

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что процессы изменчивости признаков пигментации и чувствительности к пестицину у штаммов основного и четырех неосновных подвидов Y. pestis имеют разнонаправленный характер. Преобладание того или иного типа мутантов в популяции штамма зависит от происхождения штамма и от условий его культивирования.

2. Созданная на модели типовых и референтных штаммов пяти подвидов Y. pestis коллекция изогенных мутантов, имеющих мутации в различных генах хромосомной области пигментации, и разработанная на основе казаминовых кислот полусинтетическая среда с Конго красным или ЭДДА могут быть использованы при проведении генетического анализадат-области возбудителя чумы.

3. У штаммов основного подвида Y. pestis с высокой частотой (n х 10"5) образуются непигментированные пестицинрезистентные авирулентные мутанты; у штаммов алтайского, гиссарского, кавказского и улэгейского подвидов частота возникновения таких мутантов на 2-3 порядка ниже. В популяциях штаммов основного подвида возникновение непигментированных чувствительных к пестицину вирулентных мутантов является чрезвычайно редким событием, тогда как в популяциях штаммов неосновных подвидов мутанты с таким фенотипом образуются наиболее часто (пх Ю"4- их 10"6).

4. Хранение штаммов основного подвида Y. pestis на искусственных питательных средах в течение 1 года вызывает накопление в популяции непигментированных, пестицинрезистентных клеток. В популяциях штаммов алтайского, гиссарского, улэгейского и кавказского подвидов в этих условиях увеличивается количество пигментированных пестицинрезистентных и непигментированных пестицинчувстви-тельных мутантов.

5. С помощью сравнительного ПЦР-анализа 6 парами праймеров для детекции генов, находящихся в разных регионах /^m-области хромосомы, установлено, что пигментированные пестицинрезистентные и непигментированные чувствительные к пестицину мутанты штаммов пяти подвидов Y. pestis, по всей видимости, образуются в результате локальных нарушений генов pgm-области. Непигментированные пести

96 цинрезистентные мутанты возникают, как правило, в результате обширной делении д^т-области у штаммов основного подвида возбудителя чумы с частотой nx 10"5, у штаммов четырех неосновных подвидов - с частотой n х 10"7 - n х Ю"8. Возможно возникновение мутантов с таким фенотипом в результате сочетания мутаций в генах двух регионов этого участка хромосомы.

6. Способность пестицинрезистентных мутантов Y. pestis к росту при 37 °С на среде с 0,2 мМ ЭДДА зависит от характера генетических изменений в pgm-области. Рост пестицинрезистентных пигментированных мутантов, имеющих локальные мутации в генах ybt-региона, в этих условиях ухудшается, а рост пестицинрезистентных непигментированных мутантов, возникших в результате делеции всей области пигментации, подавляется полностью.

7. Утрата чувствительности к пестицину у штаммов пяти подвидов Y. pestis, как правило, приводит к потере вирулентности. У пестицинрезистентных пигментированных мутантов отдельных штаммов кавказского подвида возможно сохранение вирулентности для белых мышей.

97

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что у большинства вирулентных микроорганизмов "острова патогенности" нестабильны: точная эксцизия PAIs происходит с частотой 1(Г - 10° (Fetherston et al., 1992; Blum et al., 1994, 1995; Carniel et al., 1996; Censini et al., 1997; Buchrieser et al., 1998). Предполагается, что благодаря этому свойству "острова патогенности", подобно фагам и плазмидам, могут принимать участие в рекомбинацион-ном процессе бактерий (Arber, 1993) и тем самым способствовать образованию новых патотипов (Rajahumar et al., 1996; Hacker et al., 1997; Hacker, Kaper, 1999).

В последние годы было установлено, что у штаммов возбудителя чумы в процессе эволюции "остров высокой патогенности" утерял подвижность (Buchrieser et al., 1998, 1998а; Bach etal., 1999). Тем не менее, его последовательность может утрачивается штаммами Y. pestis с частотой ~Ю"5 (Brubaker, 1969) в результате обширной (102 т.п.н.) делеции хромосомной области пигментации (Fetherston et al, 1992). Клетки чумного микроба при этом становятся непигментированными, нечувствительными к пестицину, неспособными к росту на хелатированных средах при 37 °С и авирулент-ными для биопробных животных при подкожном способе заражения (Perry, 1993). В отечественной литературе имеются отдельные сообщения, что для штаммов ряда неосновных подвидов Y. pestis свойственен иной характер изменчивости признаков, детерминируемых генами дат-области (Гольдфарб, 1968; Классовский, Пейсахис, 1974; Мартиневский, Павличенко, 1978; Кутырев, 1992).

Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение изменчивости признаков, кодируемых генами дат-области, для получения генетической характеристики этого участка хромосомы у штаммов пяти подвидов Y. pestis.

Первый этап настоящего исследования был посвящен проведению скрининга природных штаммов пяти подвидов возбудителя чумы по признакам, кодируемым генами хромосомной д§тя-области. Свои исследования мы начали с разработки рецептуры сред для изучения Hms-признака и способности к росту в условиях дефицита железа. Необходимость такой работы была обусловлена тем, что изучение способности к росту на железохелатированных средах у штаммов четырех неосновных подвидов Y. pestis до настоящего момента не проводилось, а недостатками сред, которые обычно используются для определения признака пигментации, является длительный (4-10 суток) срок формирования пигментированных колоний.

90

В результате проведенных экспериментов была разработана полусинтетическая среда, которая включает малое количество компонентов (0,75% казаминовых кислот [Difco Laboratories, США], 0,15% сульфита натрия, 1,35% агар-агара, 1 мкг бромида тиамина), проста в приготовлении и обеспечивает рост штаммов всех подвидов Y. pestis. После добавления к этой среде хелаторов ЭДДА (0,2 мМ) или цитрата натрия (0,1 М) она может быть использована для изучения способности к росту в условиях дефицита ионов железа. После введения в рецептуру данной среды 0,03 г/л Конго красного получается среда HMSD, которая позволяет определить признак пигментации у штаммов пяти подвидов возбудителя чумы через 2-3 суток инкубации посевов. что дает возможность быстрого и массового скрининга популяций природных штаммов Y. pestis, а также в значительной мере ускоряет анализ больших по объему выборок мутантных клонов при постановке генетических экспериментов.

Исследование на среде HMSD изменчивости признака пигментации у природных штаммов чумного микроба, полученных из ГКПБ "Микроб", выявило существование различий между подвидами возбудителя чумы по степени накопления Hms"-клеток в популяциях культур после хранения в лиофилизированном состоянии. Так, например, содержание непигментированных клеток в популяциях штаммов улэгей-ского подвида было очень высоким (от 42,2 % до 93,0 %), тогда как в популяциях штаммов кавказского подвида, наоборот, очень низким (99,4 % - 100 %).

Изучение изменчивости другого признака, кодируемого генами хромосомной pgm-области, - признака чувствительности к пестицину у большинства природных штаммов возбудителя чумы оказалось невозможным из-за иммунности к действию пестицина. Исключение составляли штаммов кавказского подвида, у которых конституционно отсутствует плазмида pPst (Филиппов с соавт, 1989, 1992), и штаммы алтайского подвида, которые проявляют чувствительность к собственному пестицину и к пестицинам штаммов других подвидов при наличии плазмиды pPst (Тимофеева с соавт., 1966; Логачев, 1979; Филиппов с соавт, 1989, 1992). Перед нами встала задача получения чувствительные к пестицину клонов всех пяти подвидов возбудителя чумы путем удаления из генома природных штаммов плазмиды pPst.

Следующим этапом наших исследований было получение pPst'-клонов штаммов пяти подвидов возбудителя чумы; создание на их основе коллекции изогенных мутантов по признакам пигментации и чувствительности к пестицину; и проведение сравнительного анализа изменения у полученных мутантов экспрессии других при

91 знаков, кодируемых генами хромосомной ддш-области, в частности, способности к росту при 37 °С на железодефицитных средах и вирулентности для белых мышей при подкожном способе заражения.

В качестве модельных штаммов были взяты типичные представители пяти подвидов Y. pestis - штаммы основного (231), гиссарского (А-1249), алтайского (И-2359), улэгейского (И-3069) и кавказского (6499) подвидов. После элиминации плазмиды pPst у этих штаммов, нами были получены пигментированные, чувствительные к пестицину, вирулентные pPst'-клоны. В дальнейшем из pPst'-клоны популяций pPstf-клонов на соответствующих селективных средах были выделены спонтанные мутантов с разным сочетанием признаков пигментации и чувствительности к пестицину: Hms+Psn+(№1), Hms+Psn" (№2), Hms"Psn+ (№3) и Hms'Psn" (№4), на основе которых были созданы изогенные системы штаммов 231(№1-4), И-3069 (№1-4), И-2359 (№14), 6499 (№1-4) и А-1249 (№1-4).

При ПЦР-анализе ДНК полученных мутантов с помощью 6 пар праймеров (на гены уЫ - региона: psn, irpl, ybtQ,aybtP, и на гены hms HFRS - оперона: hmsH и hmsR области пигментации) не было зафиксировано ни в одного случая независимой утраты одного из регионов pgm-области. Так, у всех Hms+Psn"-MyTaHTOB, независимо от подвидовой принадлежности исходного штамма, в реакционных смесях присутствовали ПЦР-продукты ожидаемого размера. По всей видимости, у штаммов чумного микроба, циркулирующих в природных очагах на территории России и сопредельных государств, утрата признака чувствительности к пестицину при сохранении признака пигментации происходит не в результате точной эксцизии HPI, а благодаря более мелким мутациям в генах v/tf-региона. Следует отметить, что американским исследователям I. Iteman с сотр. (1993) и С. Buhcrieser с сотр. (1998) также не удалось обнаружить ни одного AHPI-мутанта в популяциях штаммов Y. pestis, циркулирующих на территории стран Азии, Америки и Африки. Сам факт отсутствия случаев эксцизии HPI у штаммов основного и четырех неосновных подвидов, выделенных из разных природных очагов чумы, говорит о том, что стабилизация ^/-региона у возбудителя чумы произошла, скорее всего, после отделения вида Y. pestis от общего с Y. pseudotuberculosis предшественника, но до дифференциации вида Y. pestis на подвиды.

Известно, что основными механизмами образования мутантов с Hms"Psn+-фенотипом у штаммов из Заира, Турции и Кении являются делеции фрагментов pgm

92 области хромосомы в районе hmsHFRS-оперона, размеры которых колеблются от 38 т.п.н. до 70 т.п.н. и более (Buchrieser et al., 1998а). В наших экспериментах при ПЦР-анализе ДНК Hms'Psn+-MyTaHTOB штаммов пяти подвидов возбудителя чумы, циркулирующих в природных очагах чумы на территории стран СНГ и Монголии, не было обнаружено ни одного случая утраты hms-региона. По всей видимости, утрата признака пигментации у этих штаммов происходит в результате более мелких мутационных событий в генах hmsHFRS-оперош.

При ПЦР-анализе ДНК вакцинного штамма EV НИИЭГ и Hms'Psn'-клонов большинства штаммов чумного микроба в реакционных смесях не были обнаружены специфические амплификаты. На основании этого факта мы пришли к выводу, что сочетанная утрата Hms- и Psn-признаков у этих мутантов произошла в результате обширной делеции pgm- области хромосомы, описанной ранее J. Fetherston с соавт. (1992) на модели штамма KIM6+ Y. pestis. В пользу этого вывода также говорят данные, полученные группой отечественных исследователей (Бобров, 1995; Бобров, Филиппов, 1997),что Hms'Psn'-варианты штаммов 231 и 358 основного подвида возбудителя чумы имеют значительные по протяженности генетические повреждения хромосомной области пигментации. Нами впервые показана возможность возникновения Дд^га-мутантов у штаммов четырех неосновных подвидов Y. pestis.

Положительные результаты в ПЦР с ДНК клона А-1249 №4 гиссарского подвида позволили нам выявить существование еще одного, не описанного в литературе, механизма возникновения HmsTsn'-мутантов - в результате сочетания двух независимых мутационных событий, произошедших в генах ybt- и /гиад-регионов области пигментации. Аналогичные мутанты были обнаружены у ряда других штаммов основного, алтайского, улэгейского и гиссарского подвидов Y. pestis.

Таким образом, сравнительный ПЦР-анализ ДНК спонтанных мутантов на присутствие 6 фрагментов генов области пигментации показал, что у штаммов пяти подвидов Y. pestis, циркулирующих в природных очагах на территории стран СНГ и Монголии, утрата Hms- и Psn-признаков происходит либо в результате обширной делеции области пигментации, либо в результате небольших мутаций в генах ybt- и Айм-регионов.

Выращивание природных штаммов возбудителя чумы и их мутантных вариантов на среде с ЭДДА позволило установить, что у нечувствительные к пестицину клоны различаются по способности к росту при 37 °С в условиях дефицита железа. В

93 частности, оказалось, что Hms+Psn"-ioioHbi, в отличие от Дд^/и-мутантов, сохраняют частичную способность к росту при 37 °С на среде с пониженным содержанием железа. Этот факт можно объяснить разными молекулярными механизмами возникновения Psn'-мутаций. Так, делеция да/и-области хромосомы у HmsTsn'-мутантов приводит к полной утрате генов Ybt-зависимой системы железопотребления, что обусловливает прекращение продукции рецептора и сидерофоров. В результате штамм утрачивает пестицинчувствительность и способность ассимилировать ионы железа из хелатов с ЭДДА при 37 °С. У Hms+Psn~-Kri0H0B чувствительность к пестицину утрачивается в результате мелких мутаций в отдельных генах yfo-региона. Судя по тому, что мутанты хотя и слабо, но все-таки растут при 37 °С в условиях железодефицита, эти мутации в генах ^-региона приводят не к прекращению, как у Apgw-мутантов, а только к снижению продукции элементов Ybt-зависимой системы до уровня, способного поддерживать слабый рост штамма на железодефицитной среде, но недостаточного для проявления Psn-признака.

Заражение белых мышей мутантными клонами чумного микроба показало, что вирулентность коррелирует только с наличием у клона чувствительности к пестицину, но не признака пигментации. Все пигментированные и непигментированные Psn+-bdioHbi, независимо от их подвидовой принадлежности, проявили способность вызывать гибель белых мышей. Hms+Psn"-boioHbi штаммов основного, алтайского, гиссарского и улэгейского подвидов оказались авирулентными несмотря на то, что они демонстрировали слабый рост на железодефицитной среде с ЭДДА при 37 °С.

Результаты наших экспериментов показали возможность возникновения у возбудителя чумы спонтанных нечувствительных к действию пестицина и слабо растущих при 37 °С в условиях дефицита железа мутантов, проявляющих среднюю по классификации J1.A. Тимофеевой и Т.П. Апарина (1969) вирулентность для белых мышей (LD5o = 1,4 х ю4 КОЕ). По сравнению с исходным вирулентным штаммом 6499 кавказского подвида возбудителя чумы заражение белых мышей его Hms+Psn"-клоном 6499 №2 характеризовалось не только заметным снижением вирулентности и отдалением срока гибели, но и существенными изменениями в патогенезе наблюдаемых форм чумы.

В 1997 году S. Bearden с соавт. опубликовали результаты заражения белых мышей Psn'-клонами штамма Y. pestis KIM5, сконструированными с помощью моле-кулярно-генетических методов. Оказалось, что делеция гена psn, повышала значение

94

LD5o штамма только в 2200 раз; а делеция гена irpl - в 10000 раз, что делало этот штамм практически авирулентным при подкожном способе заражения. На основании этих данных можно предположить, что у штамма 6499 №2, в отличие от авирулент-ных Hms+Psn"-igiohob штаммов других подвидов, произошло нарушение целостности гена psn или гена уЫА, являющегося регулятором транскрипции гена psn, которое не повлекло за собой утрату вирулентности. Мы исключаем участие дополнительного фрагмента гена уЫР, выявленного у штамма 6499 в ПЦР, в проявлении аномальной вирулентности его клона 6499 №2, поскольку при ПЦР-анализе ДНК другого вирулентного Hms+Psn"-MyTaHTa С-526, также принадлежащего к кавказскому подвиду (депонирован Л.И. Грамотиной в 1986 году), аналогичный фрагмент тошуЫР отсутствовал. Выяснение механизма возникновения Hms+Psn"-MyTaHTOB у штаммов кавказского подвида, на наш взгляд, является весьма перспективным, так как это позволит уточнить роль отдельных продуктов иерсиниабактинзависимой системы в вирулентности возбудителя чумы.

Заключительным этапом наших исследований было определение значений частот возникновения и встречаемости мутантов у штаммов пяти подвидов Y. pestis. Установлено, что процессы изменчивости признаков пигментации и чувствительности к пестицину у штаммов основного и четырех неосновных подвидов имеют разнонаправленный характер. Преобладание того или иного типа мутантов в популяции штамма зависит от происхождения штамма и от условий его культивирования. Так, у штамма основного подвида в фазу экспоненциального роста наиболее часто возникают мутации в генах ^/-региона и обширные делеции области пигментации хромосомы, которые приводят к образованию Hms+Psn'- и Hms'Psn'-мутантов. После годового хранения в популяции этого штамма происходит существенное возрастание количества Hms'Psn'-мутантов. У штаммов алтайского, гиссарского и удэгейского подвидов в фазу экспоненциального роста и при хранении в лабораторных условиях наименее стабильны гены /г/ж-региона, поэтому в их популяциях обнаруживаются, как правило, Hms'Ps^-мутанты. Особое положение в группе штаммов неосновных подвидов занимают штаммы кавказского подвида, для которых в фазу экспоненциального роста характерна очень высокая стабильность, как самой области пигментации, так генов ее отдельных регионов. В то же время, после годового хранения при пониженных температурах в популяциях этих штаммов происходит резкое увеличение количества Hms+Psn"- мутантов, что не наблюдается у штаммов других подвидов.

94

Тот факт, что у штаммов неосновных подвидов возникновение Адат-мутантов происходит на 2-3 порядка реже, чем у штаммов основного подвида, и разница в значениях частот возникновения этих мутаций статистически достоверна, говорит о возможности существования разных механизмов образования обширных делеций. Возможно, делеции, которые приводят к утрате области пигментации, у штаммов неосновных подвидов имеют более протяженные размеры, как это наблюдается у ряда патогенных для человека штаммов Y. enterocolitica (Bach et al., 1999). В этом случае механизм возникновения Ддат-мутантов носит характер, не обусловленный рекомбинацией IS 100 элементов, что может происходить, например, из-за отсутствия или инактивации одного из фланкирующих область ZS100 элементов. В этой связи несомненный теоретический интерес представляют исследования, направленные на уточнение размеров делеций и их локализации на хромосоме.

Таким образом, проведенные нами исследования изменчивости признаков, кодируемых генами хромосомной дат-области, позволили установить, что спонтанно возникающие мутанты со сходным сочетанием Hms- и Psn-признаков, как правило, имеют идентичный ПЦР-профиль, проявляют одинаковый характер роста на среде с ЭДДА при 37 °С и вирулентность для белых мышей при подкожном способе заражения. Этот факт говорит о несомненной филогенетической близости пяти подвидов возбудителя чумы. В то же время, установленные нами у штаммов основного и четырех неосновных подвидов различия в характере изменчивости признаков, кодируемых генами области пигментации, свидетельствуют в пользу существования у них генетических отличий в структуре этого участка хромосомы. Выявление и детальное исследование таких измененных последовательностей может быть полезно для дальнейшего изучения факторов патогенности возбудителя чумы, для определения его филогенетических связей с другими видами бактерий, а также при создании различных зондов и тест-систем молекулярно-эпидемиологического мониторинга. В этой связи дальнейшие исследования, направленные на изучение структуры дат-области и HPI у штаммов пяти подвидов Y. pestis, являются весьма перспективными.

95

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Зудина, Ирина Витальевна, 2000 год

1. Аванян ЛА, Губина НЕ., Иванова В.Ф. Влияние железа на вируленгаость и имму-ногенность авирулентных штаммов чумного микроба // Там же. 1963. - №5 - С. 17 - 23.

2. Аванян Л.А., Иванова В.Ф., Губина Н.Е. Влияние железа на вирулентность штаммов чумного микроба // Вопр. микробиол. и лаб. диагн. особо опасных инф. -Саратов, 1965. С. 66 - 70.

3. Авдеева Н.Г., Карасева З.Н., Солодовников Н.С. Характеристика природного штамма чумного микроба М-777 по признаку пигментсорбции // Микробиол., лаб. диагн. и специф. профилакт. карантин, инф. Саратов, 1989. - С. 18-21.

4. Анискина ГЛ. К вопросу пестициногенности и чувствительности к пестицину I штаммов возбудителя чумы // Диагн. и профилакт. особо опасных инф. Саратов, 1983.-С. 22-24.

5. Апарин Г.П., Голубинский Е.П. Микробиология чумы: Руководство. Иркутск: Изд - во Иркут. ун - та, 1989. - 90 с.98

6. Аракелян И.С. Получение и свойства мутантов с пониженными потребностями в факторах роста из Гиссарских штаммов чумного микроба //11 межреспубл. науч.-практ. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. по профилакт. чумы. Алма-Ата, 1981. - С. 13 -15.

7. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. JL: Медгиз.,1962. - 180 с.

8. Балахонов С.В. Результаты скрининга плазмид штаммов Yersinia pestis из разных очагов центрально-азиатской зоны природной очаговости чумы // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1989. - №4. - С. 39 - 42.

9. Бибикова В.А., Классовский JI.H., Мельников И.Ф. К вопросу об эпизоотологи-ческом значении штаммов возбудителя чумы с ослабленной вирулентностью // Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1968. - Вып. 4. - С. 180 - 186.

10. Бобров А Г. Изучение распространенности и локализации мобильных элементов IS2&5 и IS100 в геномах иерсиний: Автореф. дис. канд. мед. наук. Саратов, 1995.- 18с.

11. Бобров А. Г., Филиппов А.А. Распространенность IS285 и IS 100 в геномах Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis II Мол. ген. 1997. - № 2. - С. 36 - 40.

12. Браун В. Генетика бактерий. М.: Наука, 1968. - 447 с.

13. Булгакова Е.Г. Функциональное картирование плазмиды пестициногенности чумного микроба: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1991. -24 с.

14. Быков JT.T., Кукин В.М., Онищенко JUL, Трофименко ИТ. Особенности течения эпизоотии чумы на Северо-Востоке Причуйских Муюнкумов в 1971 -1972 г.г. // Матер. УШнауч. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахсг. Алма-Ата, 1974. - С. 154-156.

15. Быков JI.T., Пошевина Г.О., Красникова JI.B. Характеристика штаммов микроба чумы из Юго-Восточных Кызылкумов // Матер. VII науч. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. Алма-Ата, 1971. - С. 4 - 5.

16. Вершинина Т.И. О популяционной изменчивости возбудителя чумы из природных очагов Горного Алтая и Северо-Западной Монголии: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1986. - 16 с.

17. Воротников И.А., Толмачева JI.P. К характеристике штаммов чумного микроба, изолированных в период оздоровления Тянь-Шаньского природного очага // Актуал. вопр. эпиднадзора в природных очагах чумы. Ставрополь, 1985. - С. 174 - 176.

18. Головко Э.Н., Гуляко Л.Ф., Дегтярева В.И. Некоторые особенности штаммов возбудителя чумы, выделенных в Гиссарском очаге в 1970 -1987 гг. // Тез. XIII конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. Алма-Ата, 1990. - С. 62 - 65.99

19. Головко Э.Н., Пейсахис JI.A., Дерлятко К.И., Юсупов А.К., Сагимбеков У.А. Характеристика штаммов микроба чумы, выделенных в Гиссаре летом 1970 года // Матер. VH науч. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахсг.-Алма-Ата, 1971. С. 6-7.

20. Гольдфарб JI.M. Некоторые особенности чувствительных к пестицину I культур возбудителей чумы и псевдотуберкулеза и их диагностическое значение // Пробл. особо опасных инф. 1968. - №1. - С. 86 - 88.

21. Гольдфарб JI.M., Дальвадянц С.М., Земцова И.Н., Пономарев И.Г. Некоторые особенности культур, выделенных на территории Северо-Западного Прикаспия в 1972 г. // Профилакт. особо опасных инф. Саратов, 1977. - Вып. 3. - С. 46 - 50.

22. Гольдфарб J1M, Шанина JLH. О связи между пестициногенностью, фибриноли-тической активностью и плазмокоагулирующей способностью возбудителя чумы // Генетика, биохимия и иммунохимия особо опасных инф.-Росг. ун-т, 1967.- Вып. 1.- С. 10 -12.

23. Джафаров Н.И., Юндин Е.В. Характеристика штаммов чумного микроба из Терско-Сунженского природного очага чумы // Особо опасные инф. на Кавказе. -Ставрополь, 1974. Вып.1. - С. 36 - 37.

24. Дробышева Т.М. Повышение вирулентности у штамма чумного микроба ЕВ-5пг/443 в организме крольчонка и изучение его свойств // Пробл. особо опасных инф. -1971.-Вып. 1 (17). С. 71 - 74.

25. Елкин Ю.М., Михайлова Р.С., Розанова Г.Н., Тарасова В.Е., Лалазарова И.Г., Грамотина Л.И., Осипова С.П., Быкова З.А., Калмыкова Л.И. Возбудитель чумы очага Центрального Кавказа // Пробл. особо опасных инф. 1977.- Вып. 3 (55). - С. 9 - 12.

26. Захаров А.И. Изучение биологии возбудителя чумы из Урало-Эмбенского автономного очага: Дис. канд. мед. наук. Саратов, 1988. - 163 с.

27. Захаров А.И. Основные свойства штаммов возбудителя чумы, выделенных в Урало-Эмбенском автономном очаге в 1973 1983 гг. // XII Межреспубл. науч.-практ. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. - Алма-Ата, 1985. - С. 16-18.

28. Зундуй Чимит, Апарин Г.П., Головачева В.Я., Тимофеева Л.А., Васюхина Л.В. О биологических свойствах культур чумного микроба, выделенных в МНР // Особо опасные инф. в Сибири и на Дальн. Востоке. Кызыл, 1966.- Вып. 7. - С. 103 - 106.100

29. Иванова B.C. Характеристика пестицина I и изучение механизма его действия: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1981. - 23 с.

30. Иннокентьева Т.И. Особенности экологии Yersinia pestis altaica: Автореф. дис. в виде науч. докл. . мед. наук. Саратов, 1997.- 59 с.

31. Классовский JI.H., Мельников И.Ф., Терентьева Л.И. К изучению динамики изменений клеточного состава популяций возбудителя чумы на искусственных питательных средах // Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1971. - Вып. 5 (21).- С. 71 - 73.

32. Классовский Л.Н., Пак Г.Ю., Осадчая Л.М. К вопросу о связи вирулентности возбудителя чумы с пестициногенностью. // Матер. VI науч. конф. противочум. уч-режд. Ср. Азии и Казахст. Алма-Ата, 1969. - Вып.1. - С. 39 - 41.

33. Классовский Л.Н., Пейсахис Л.А. О некоторых особенностях пигментации колоний возбудителя чумы на среде с гемином // Пробл. особо опасных инф. 1974. -Вып. 5 (39). -С. 12- 77.

34. Кокушкин A.M.: Социальные и биологические аспекты эпидемиологии чумы: Автореф. дис. . д-ра. мед. наук. Саратов, 1995. - 46 с.

35. Кондрашкова ТВ., Донская ТД, Зимарина Л.С., Ведяпина ВД Влияние солей железа на рост чумного микроба. Саратов, 1983,- 12с. Д. во ВНИИМИ МЗ СССР№6275-83.

36. КошеновУА О свойствах возбудителя чумы из Зааральского автономного очага // Тез.ХШ конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст.- Алма-Ата, 1990.- С. 72-74.

37. Кошенов У.А. Свойства штаммов возбудителя чумы, выделенных в Заараль-ском автономном очаге в 1982 1983 гг. // XII Межреспубл. науч. - практ. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. - Алма-Ата, 1985. - С. 18-20.

38. Кудинова ТЛ. Свойства штаммов чумного микроба, выделенных осенью 1963 года в Или-Каратальском Междуречье: Автореф.дис. .д-ра мед. наук-Алма-Ата, 1968. 17с.

39. Кудинова Т.П., Архангельская Н.П., Гражданов А.К. О вирулентности микробов чумы, не пигментирующихся на среде с гемином // Матер. VII науч. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. Алма-Ата, 1971.-С. 130 - 131.

40. Куличенко А.Н. Генетические исследования возбудителя чумы с использованием индуцированного мутагенеза: Автореф. дис. канд. мед. наук. Саратов, 1983.-20 с.101

41. Кутырев В.В. Генетический анализ факторов вирулентности возбудителя чумы: Автореф. дис. д-ра мед. наук. Саратов, 1992. - 16 с.

42. Кутырев В.В., Куличенко А.Н., Проценко О.А. Вирулентные Pgm" мутанты чумного микроба//Профилакт. природноочаг. инф. Ставрополь, 1983. - С. 304.

43. Кутырев В.В., Проценко О.А. Классификация и молекулярно-генетические исследования Yersinia pestis II Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1998. - С. 11 - 22.

44. Кутырев ВВ., Проценко OA, Синичкина АА Чувствительность к пестицинам полевочьего штамма чумного микроба 1146 (409) // Там же. Саратов, 1977. - Вып.4 (56). - С. 16 - 19.

45. Кутырев В.В., Филиппов А.А., Проценко О.А. Изучение плазмидного состава донорного штамма возбудителя чумы // Вопр. генетики, молекул, биол. и микробиол. чумы и холеры. Саратов, 1985. - С. 15 - 21.

46. Логачев А.И. Биологические свойства штаммов чумного микроба, выделенных в Горном Алтае: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1979. - 17 с.

47. Логачев Л.И, Ивженко Н.И. Характеристика штаммов чумного микроба, выделенных в Горном Алтае в 1972 году // Докл. Иркут. противочумн. ин-та. Чита, 1974. -Вып. 10.-С. 113-115.

48. Логачев Л.И., Михайлов Е.П. К характеристике вирулентности штаммов чумного микроба, выделенных в Горном Алтае // Совр. аспекты профилакт. зоонозных инф. Иркутск, 1984. - Ч. 2. - С. 50.

49. Логачев Л.И., Тимофеева Л.А. О пестицинах культур чумного микроба // Докл. Иркут. противочумн. ин-та. Чита, 1966. - Вып. 7. - С. 123 - 126.

50. Лясоцкий ЛЛ., Васюхина ЛВ. Пигментсорбция и потребность в ионах кальция тесты, характеризующие состояние вирулентности коллекционных штаммов возбудителя чумы У/ Эпид. и профилакт. особо опасных инф. в МНР и СССР.- Улан-Батор, 1978.-С. 74 -75.102

51. Маевский М.П. Экспериментальное изучение возможного эпизоотологического значения атипичных штаммов чумного микроба в Сайлюгемском очаге: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1981.- 23 с.

52. Маевский М.П., Иннокентьева Т.И., Калиновский А.И. Биологические свойства штаммов чумного микроба, выделенных из почвы в Сайлюгемском очаге // Совр. аспекты профилакт. зоонозных инф. Иркутск, 1984. - С. 58 - 59.

53. Малинина З.Е. Изучение возбудителя чумы с различным набором детерминант вирулентности в организме белых мышей, обработанных сернокислым закисным железом// Там же. Саратов, 1972. - №3. - С. 99-103.

54. Малинина З.Е. Изучение стойкости утраты вирулентности у измененных в эксперименте штаммов чумного микроба // Микробиол. и иммунол. особо опасных инф. Саратов, 1968. - Вып. 3. - С. 123 -132.

55. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. - 479 с.

56. Мартиневский И.Л. Пигментсорбция у возбудителя чумы и ее роль в проявлении вирулентности. Обзор. Среднеаз. ПЧИ. Алма-Ата, 1988. - 26 с. - Деп. во ВИНИТИ 13.10.88. №7376-В88.

57. Мартиневский И.Л., Кенжебаев А.Я., Асенов Г.А. Устюртский очаг чумы (эпи-зоотологические аспекты и лейцинзависимость возбудителя). Нукус: Каракалпака-стан, 1987.-С. 61-62.

58. Мартиневский И.Л., Павличенко Л.Ф. Влияние температурных и некоторых других условий на количество Pgm+ клеток у различных штаммов чумного микроба // Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1978. - №1. - С. 5 - 8.

59. Мартиневский И.Л., Степанов В.М., Кенжебаев А.Я. Таксономия, мутация и генетика патогенности чумного и родственных ему микробов. Нукус: Каракалпака-стан, 1990. - С. 89 - 91.

60. Мельников И.Ф., Никитина Т.А., Бочкарев В.М. О возможности восстановления признака Р+ у чумного микроба в организме больших песчанок и блох // Пробл. особо опасных инф. 1971. - Вып. 3 (19) - С. 73 - 77.

61. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.:Мир. - 1976. - 440 с.

62. Михайлова Р.С., Юндин Е.В. Характеристика штаммов чумого микроба, выделенных в Приэльбрусье// Пробл. особо опасных инф.-1973.-Вып.5(33) С. 14-19.

63. Нейландс Дж. Б. Транспорт соединений железа микробами (сидерохромы)// Неорганическая биохимия/ Под ред. Эйхгорна Г. Л.-М.:Мир, 1978. Т.1. - С. 205 - 243.

64. Никитина Г.П. Изучение вирулентности штамма чумного микроба № 586 с неоднородным клеточным составом // Микробиол. и иммунол. особо опасных инф. -Саратов, 1968. Вып. 3. - С. 139 - 143.

65. Осадчая Л.М., Мисалева О.С., Алексеева О.Е., Егорова Р.П., Чернова В.А. К характеристике возбудителя чумы из Северного Приаралья // Матер. VII науч. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. Алма-Ата, 1971. - С. 39 - 40.

66. Пак Г.Ю. Пестицин-фибринолизин-коагулазная система у чумного и родственных ему микробов: Автореф. дис. канд. мед. наук. Алма-Ата, 1969. - 20 с.

67. Пак Г.Ю., Мартиневский И.Л., Качурина А.Г., Осадчая Л.М. Изучение пести-циногенности и чувствительности к пестицинам штаммов чумного микроба // Матер. VI науч. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. Алма-Ата, 1969а. - Вып.1. - С.78 - 79.

68. Пак ГД, Шашаев МА Пестицинчувствительные Р" варианты возбудителя чумы //Матер. W науч. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. -Алма-Ата, 1971.-С. 41- 43.104

69. Петров В.Н. Физиология и патология обмена железа JL: Наука, 1982. -224 с.

70. Пошевина Г.О., Пейсахис JI.A., Степанов В.М. О вирулентности и ее детерминантах у штаммов возбудителя чумы из Муюнкумов и Зачуйской саксауловой дачи // Матер. УП науч. конф. противочумн. учрежд- Ср. Азии и Казахст. Алма-Ата, 1971.-С.46 - 48.

71. Пунский ЕЕ., Адаменко НИ., Меницкая JIE. Изучение штаммов чумного микроба, выделенных в Туркмении в 1976 -1980 г.г. // Межреспубл. науч.-практ. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. по профилакт. чумы. Алма-Ата, 1981.- С. 89- 93.

72. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск, 1973. - 320 с.

73. Сагимбеков У.А., Пошевина Г.О., Асылбекова Н.Н., Степанов В.М. Изучение особенностей штаммов чумного микроба, выделенных весной 1976 года в Восточных и Западных Причуйских муюнкумах// Пробл. особо опасных инф. 1979. - Вып. 1 (65). - С. 61 - 63.

74. Сагимбеков УА, Пошевина Г.О., Рапопорт ЛИ О соотношении Р+ и F клеток в штаммах чумного микроба в разные фазы эпизоотического процесса// ХИ Межреспубл. науч-практ. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. Алма-Ата, 1985.- С. 35-37.

75. Сагимбеков У.А., Рапопорт Л.П. Об особенностях штаммов возбудителя чумы, выделенных в различных популяциях больших песчанок в Муюнкумах // Микробиол., генетика и иммунол. чумы и холеры. Саратов, 1983.- С. 11 - 13.

76. Самойлова С.В. Влияние условий культивирования на популяционный состав штаммов чумного микроба, обладающих различным плазмидным профилем.: Дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1991. - 157с.

77. Соорбеков О.С., Тюлембаев МА, Мартиневский ИЛ., Классовский ЛИ, Атчаба-ров Б.Б. Свойства штаммов чумного микроба, выделенных в 1979-1980 гг. в Таласском Алатау // Микробиол., генетика и иммунол. чумы и холеры. Саратов, 1983.-С.8 -11.

78. Тарасова В.Е., Иннокентьева Т.И., Трофименко Н.З. Пигментообразование, кальцийзависимость, отношение к глицерину и рамнозе слабовирулентных штаммов105чумного микроба, пассированных на монгольских пищухах // Пробл. особо опасных инф.-1969. №4.-С. 19-23.

79. Тарасова В.Е., Петров С.П. Пестициногенность и чувствительность штаммов к пестицинам чумного микроба из Горного Алтая// ЖМЭИ. -1982. №2.- С. 56 - 59.

80. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Основы экспериментальной медицинской бактериологии. М.: Медгиз, 1958. - 348 с.

81. Тимофеева JI.A., Апарин Г.П. Биологические свойства штаммов чумного микроба, выделенных в 1961 1966 г.г. в чумных очагах Сибири и Монголии // Пробл. особо опасных инф. -1969. - №4 . - С. 13 - 18.

82. Тимофеева Л.А., Жамьян Сурен, Сотникова А.Н., Логачев А.И., Саран Манда-лин Биологические свойства штаммов чумного микроба, выделенных в Монголии в 1969 1971 гг. // Пробл. особо опасных инф. - 1974. - №3 (37). - С. 37 - 42.

83. Тимофеева Л.А., Логачев А.И. Новый подвид чумного микроба, выявленный в МНР // Эпидемиол. и профилакт. особо опасных инф. в МНР и СССР. ГОСИЗДАТ. -Улан-Батор, 1978. - С. 64 - 67.

84. Фердман Д.Л., Сопин Е.Ф. Практикум по биологической химии. М.: Сов. наука, 1957. - 293 с.

85. Филиппов А.А., Солодовников Н.С., Куклева Л.М., Проценко О.А. Изучение плазмидного состава штаммов возбудителя чумы из разных природных очагов // ЖМЭИ. 1992. - №3 - С. 10 - 13.

86. Фурсов В.В., Попов Ю.А. Исследование штаммов микроба чумы полевочьей разновидности методом электрофореза в агарозном геле // Профилакт. природнооча-говых инф. Ставрополь, 1983. - С. 326 - 327.

87. Хайдаров Т.Б., Хакимов М.М., Мартиневский И.Л. О первых случаях выделения штаммов чумного микроба в Каршинской степи и их свойствах // Эпизоотол. и профилакт. природноочаг. инф. Саратов, 1982.- С. 37-39.

88. Шведун Г.П., Проценко О.А. Получение клонов чумного микроба, утративших плазмиду пестициногенности // Информ. бюл. изобретения, рац. предложения и метод. рекомендации. Саратов, 1983,- №18.

89. Aasa R., Malmstrom B.G., Saltman P., Vanngard J. // Biochim. Biophys. Acta. -1963.-V.75.-P. 203-222.

90. Arber W. Evolution of prokaryotic genomes // Gene. 1993. - V. 135. - P.49-53.

91. Archibald F.S., De Voe I.W. Removal of iron from human trasferrin by Neisseria meningitidis IIFEMS Microbiol. Lett. 1979. - V.6. - P. 159 - 162.

92. Baggs A., Neilands J.B. Ferric uptake regulation protein acts as a repressor, employing iron (II) as a cofactor to bind the operator of an iron transport operon in Escherichia coli II Biochem. 1987. - V. 26. - P. 5471 - 5477.

93. Bearden S.W., Fetherston J.D., Perry R.D. Genetic organization of the yersiniabactin biosynthetic region and construction of avirulent mutants in Yersinia pestis II Infect. Immun. 1997. - V. 65, № 5. - P. 1659 - 1668.

94. Bearden S.W., Perry RD. The Yfe system of Yersinia pestis transports iron and manganese and is required for full virulence of plague// Mol. Microbiol.-1999.-V. 32, №2.-P. 403-414.

95. Bearden S.W., Staggs T.M., Perry R.D. An ABC transporter system of Yersinia pes-feallows utilization of chelated iron by Escherichia coli SAB 11// J. Bacteriol. 1998. - V. 180, №5,- P. 1135- 1147.107

96. Brubaker R.R. Mutation rate to nonpigmentation in Ppestis II J. Bacteriol. 1969. -V. 98, N3.-P. 1404- 1406.

97. Brubaker R.R., Beesley E.D., Surgalla M.J. Pasteurella pestis: Role of pesticin I and iron in experimental plague // Science. 1965. - V. 149. - P. 422 - 424.

98. Brubaker R.R., Surgalla MJ. Pesticins. I. Pesticin-bacterium interrelationships and environmental factors influencing activity. // J. Bacteriol. 1961. -V. 82, №6.- P. 940-949.

99. Buchrieser C., Brosch R., Bach S., Guiyoule A., Carniel E. The high-pathogenicity island of Yersinia pseudotuberculosis can be inserted into any of the three chromosomal asn mNA genes // Mol. Microbiol. 1998. - V. 30. - P. 965 - 978.

100. Bullen J. The significance of iron in infection // Rev. Infect. Dis. 1981. - V.3. - P. 1127-1138.

101. Bullen J., Rogers H.J., Griffiths E. Role of iron in bacterial infections // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1978. - V. 80. - P. 1 - 35.

102. Burrows T.W. Virulence of Pasteurella pestis and immunity to plague // Ergebn. Microbiol. Immunitatsforschung und exp. Therapie. 1963. - V. 37. - P. 59 - 106.

103. Carniel E., Guiyoule A., Prentice M. Characterization of a large chromosomal "high-pathogenicity island" in biotype IB Yersinia enterocolitica II J. Bacteriol. 1996. - V. 178. -P. 6743 -6751.

104. Carniel E., Mazigh D., Mollaret H.H. Expression of iron-regulated proteins in Yersinia species and their relation to virulence // Infect. Immun.-1987. V. 55.- P.277- 280.

105. Cavalieri S., Bohach G., Snyder G., Snyder L. Escherihia coli a-hemolysin: Characteristics and probable role in pathogenicity// Microbiol. Rev. -1984.-V. 48.-P. 326 343.

106. Cheetham B.F., Katz M.E. A role for bacteriophages in the evolution and transfer of bacterial virulence determinants // Mol. Microbiol. 1995. - V. 18. - P. 201 - 208.

107. Cowan R, Foster B. Differential effects of iron the growth of L. monocytogenes: minimum requirements and mechanism of acquisition 11 J. Infect Dis.-1985.-V. 151.- P. 721-730.

108. Crosa J.H. Signal transduction and transcriptional and posttranscriptional control of iron-regulated genes in bacteriaII Microbiol. Mol. Biol. Rev.-1997.-V.61,№3.-P.319-336.

109. Crosa J.H. The relationship of plasmid-mediated iron transport and bacterial virulence // Ann Rev. Microbiol. 1984. - V. 38. - P. 69 - 89.

110. Escolar L., Perez-Martin J., Lorenzo de V. Opening the iron box: transcriptional met-alloregulation by the Fur protein // Ibid. 1999. - V. 181, №20. - P. 6223 - 6229.

111. Fetherston J., Bearden S., Perry R. YbtA, an AraC type regulator of the Yersinia pestis pesticin/yersiniabactin receptor//Mol. Microbiol.- 1996. V. 22. - P. 315 - 325.

112. Fetherston J.D., Lillard J.W., Jr., Perry R.D. Analisis of the pesticin receptor from Yersinia pestis: role in iron-deficient growth and possible regulation by its siderophore // J. Bacteriol. 1995. - V.177. - P. 1824 - 1833.

113. Fetherston J.D., Perry R.D. The pigmentation locus of Yersinia pestis KIM6+ is flanked by an insertion sequence and includes the structural genes for pesticin sensitivity and HMWP2 // Mol. Microbiol. 1994. - V. 13, №4. - P. 697 - 708.

114. Fetherston J.D., Schuetze P., Perry R.D. Loss of the pigmentation phenotype in Yersinia pestis is due to spontaneous deletion of 102 kb of chromosomal DNA which is flanked by a repetitive element // Ibid. V. 6. - 1992. - P. 2693 - 2704.

115. Filippov A.A., Solodovnikov N.S., Kookleva L.M., Protsenko O.A. Plasmid content in Yersinia pestis strains of different origin // FEMS Microbiol. Lett -1990.-V. 67.- P. 45 48.109

116. Finkelstein R.A., Sciorlino C.V., Mcintosh M.A. Role of iron in microbe-host interactions // Rew. Infect. Dis. 1983. - V.5. - P. 759 - 777.

117. Ford A., Hayhoe J. An invastigation of alternatives to hog gastric mucin as virulence-enhancing agents in cholera vaccine potency assay // J. Biol. Stand. -1976. -V. 4. -P. 353 366.

118. FredericqP. // Soc. Biol. 1960. - V. 154, № 11.-P. 2150.

119. Gehring A., DeMolI E., Fetherston J., Mori I., Mayhew G., Blattner F., Walsh C., Perry R. Iron acquisition in plague: modular logic in enzymatic biogenesis of yersiniabactin by Yersinia pestis II Chem. Biol. 1998. -V. 5. - P. 573 - 586.

120. Goebel W., Kathariou S., Kuhn M., Sokovich Z., Kreft J., Kohler S., Funke D., Leimeister-Wachter M. Hemolysin from Listeria biochemistry, genetics and function in pathogenesis//Infect. - 1988.-V. 16.-P. 149- 156.

121. Haag H., Hanke K., Drechsel H., Stojiljkovic I., Jung G., Zahner H. Purification of yersiniabactin: a siderophore and possible virulence factor of Yersinia enterocolitica // Gen. Microbiol. 1993,-V. 139.-P. 2159-2165.

122. Hacker J., Blum-Oehler G., Mtthldorfer I., Tschape H. Pathogenicity islands of virulent bacteria: structure, function and impact on microbial evolution // Mol. Microbiol. -1997.-V. 23.-P. 1089- 1097.

123. Hacker J., Kaper J.B. The concept of pathogenicity islands // Pathogenicity islands and other mobile virulence elements. American Society for Microbiol., 1999. - P. 1-11.

124. Hare J.M., McDonough K.A. High frequency RecA-dependent and - independent mechanisms of Congo red binding mutation in Yersinia pestis II J. Bacteriol. - 1999. - V. 181, № 16.-P.4896- 4904.

125. Heesemann J., Schubert S., Rakin A. Ecological aspects of evolutionary development of bacterial pathogens// Nova Acta Leopoldina NF. -1999. V. 78,№307. - P. 23 - 38.

126. Higuchi K., Smith J.L. Studies on the nutrition and physiology of Pasteurella pestis. IV. A different plating medium for the estimation of the nutrition rate to avirulence // J. Bacteriol. 1961. - V. 81, №4. - P. 605 - 608.

127. Hinnebush В., Perry R., Schwan T. Role of the hemin storage (hms) locus of Yersinia pestis in the transmission of plague by fleas // Science. 1995. - V. 273. - P. 367 - 370.

128. Holbien B.F., Jerico K.W.F., Likes G.C. Neisseria meningitidis infection in mice: influence of iron, variations in virulence among strains and pathology // Infect. Immun. -1979.-V. 24.-P. 545 -551.

129. Hornung J., Jones H., Perry R. The hmu locus of Yersinia pestis is essential for utilization of free haemin and haem-protein complexes as iron sources // Mol. Microbiol. -1996.-V. 20.-P. 725-739.

130. Jackson S., Burrows T. The virulence-enhancing effect of iron on non-pigmented mutants of virulent strains of Pasteurella pestis // Br. J. Exp. Pathol. -1956. -V. 37. P. 577 - 583.

131. Kado C., Liu S.T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids // J. Bacteriol. 1981. - V. 145, №3. - P. 1365 - 1373.

132. Jones H., Lillard J., Perry R. HmsT, a protein essential for expression of the haemin storage (Hms4) phenotype of Yersinia pestis!I Microbiology.- 1999. V. 145.- P. 2117-2128.о

133. Kojima N., Bales G. The reduction and release of iron from Fe transferrin - C03 // J. Biol. Chem. - 1979. - V. 254. - P. 8847 - 8854.

134. Kovach M.E., Shaffer M.D., Peterson K.M. A putative integrase gene defines the distal en of a large cluster of ToxR-regulated colonization genes in Vibrio cholerae II Microbiol. 1996. - V. 142. - P. 2165 - 2174.

135. McDaniel Т.К., Jarvis K.G., Donnenberg M.S., Kaper J.B. A genetic locus of entero-cyte effacement conserved among diverse enterobacterial pathogens // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1995.-P. 1667-1668.

136. McDaniel Т.К., Ying Kang, Kaper J.B. The EPEC locus of enterocyte effacement:five more sep genes and genetic reconstruction of the attaching and effacing phenotype inth

137. E.coli K-12 // Abstracts of the 96 General Meeting of the American Society for Microbiology. Washington, DC: American Soc. Microbiol. - 1996. - P. 170.

138. Mickelsen P.A., Blackman E., Sparling P.F. Ability of Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis and commensal Neisseria species to obtain iron from lactoferrin // Infect. Immun. 1982. - V. 35. - P. 915 - 920.

139. Mickelsen P.A., Sparling P.F. Ability of Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, and commensal Neisseria species to obtain iron from transferrin and iron compounds // Ibid. 1981. - V. 33. - P. 555 - 564.

140. Miles A. A., Khimji P.L., Maskell J. The variable response of bacteria to excess ferric iron in host tissues // J. Med. Microbiol. 1979. - V. 12. - P. 17 - 28.

141. Mills D.M., Bajaj V., Lee C.A. A 40kb chromosomal fragment encoding Salmonella typhimurium invasion genes is absent from the corresponding region of the Escherichia coli K-12 chromosome // Mol. Microbiol. 1995. - V. 15. - P. 749 - 759.

142. Nassif X., Mazert M., Mounier J., Sansonetti P.J. Evoluation with an iuc: TnlO mutant of role of aerobactin production in virulence of Shigella Jlexneri II Infect. Immun. -1987.-V. 55.-P. 1963- 1969.112

143. Neilands J. Iron absorption and transport in microorganisms // Annu. Rev. Nutr. -1981.-V.l.-P. 27-46.

144. Neilands J. Molecular aspects of regulation of high affinity iron absorption in microorganisms I I Adv. Inorg. Biochem. 1990. - V.8. - P. 63 - 90.

145. Payne S.M. Iron and virulence in the family Enterobacteriaceae II C.R.C. Crit. Rev. Microbiol.- 1988.-V. 16.-P. 81-111.

146. Pelludat C., Rakin A., Jacobi C.A., Schubert S., Heesemann J. The yersiniabactin biosynthetic gene cluster of Yersinia enterocolitica: organization and siderophore-dependent regulation // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 538 - 546.

147. Pendrak M.L., Perry R.D. Characterization of a hemin-storage locus of Yersinia pestis /I Biol. Metals 1991. - V. 4. - P. 41 - 47.

148. Pendrak M.L., Perry R.D. Proteins essential for expression of the Hms+ phenotype of Yersinia pestis II Mol. Microbiol. 1993. - V.8. - P. 857 - 864.

149. Perry R. Acquisition and storage of inorganic iron and hemin by the Yersiniae II Trends Microbiol. 1993. - V.l. - P. 142 - 147.

150. Perry R., Balbo P., Jones H., Fetherston J., DeMoll E. Yersiniabactin from Yersinia pestis: biochemical characterization of the siderophore and its role in the transport and regulation //Microbiol. 1999.-V. 145 - P. 1181 - 1190.

151. Perry R., Brubaker R. Accumulation of iron by yersiniae // J. Bacteriol. 1979. - V. 137.-P. 1290- 1298.

152. Perry R., Pendrak M., Schuetze P. Identification and cloning of a hemin storage locus involved in the pigmentation phenotype of Yersinia pestis II Ibid. 1990. - V. 172. - P. 5929 -5937.

153. Portnoy D.A., Falkow S. Virulence-associated plasmids from Yersinia enterocolitica and Yersinia pestis II J. Bacteriol. 1981. - V. 148. - P. 877 - 883.

154. Rajahumar K., Sasakawa C., Alder B. A spontaneous 99kb chromosomal deletion results in multi-antibiotic susceptibility and an attenuation of contact hemolysis in Shigella flexneri 2a // J. Med. Microbiol. 1996. - V. 45. - P. 64 - 75.

155. Rakin A., Boolgakowa E., Heesemann J. Structural and functional organization of the Yersinia pestis bacteriocin pesticin gene cluster //J. Microbiol.-1996.-V. 142.-P. 3415 -3424.

156. Rakin A., Heesemann J. Virulence-associated fyuA/irp2 gene cluster of Yersinia enterocolitica biotype IB carries a novel insertion sequence IS 1328 // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - V.129. - P. 287 - 292.113

157. Rakin A., Heesemann J. Yersiniabactin / pesticin receptor a component of an irontbuptake system of highly pathogenic yersiniae // 6 International symposium on yersinia, 2628 sept., 1994, Rome, Italy.

158. Rakin A., Saken E., Harmsen D., Heesemann J. The pesticin receptor of Yersinia enteroco-litica: a novel virulence factor with dual function // Mol. Microbiol. 1994a-V. 13.-R253 -263.

159. Rakin A., Schubert S., Pelludat C., Brem D., Heesemann J. The high-pathogenicity island of Yersiniae II Pathogenicity islands and other mobile virulence elements. Amer. Soc. Microbiol., 1999. - P. 77 - 90.

160. Robins-Browne R.M., Prpic J.K. Effect of iron and desferoxamine on infections with Yersinia enterocolitica//Infect. Immun. 1985. - V. 47. - P. 774 - 779.

161. Scarlato V., Arico В., Prugnola A., Rappuoli R. Sequential activation and enviromental regulation of virulence genes in Bordetella pertussis IIEMBO J.-1991.-V. 10.-P. 3971-3975.

162. Schubert S., Fischer D., Heesemann J. Ferric enterochelin transport in Yersinia enterocolitica: molecular and evolutionary aspects // J. Bacteriol. -1999.-V. 181, № 20. P. 6387 - 6395.

163. Shea J.E., Hesel M., Gleeson C., Holder D.W. Identification of a virulence locus encoding a second type III secretion system in Salmonella typhimurium II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93. - P. 2593 - 2597.

164. Sikkema D.J., Brubaker R.R. Outer membrane peptides of Yersinia pestis mediating siderophore-independent assimilation of iron // Biol. Metals. 1989. - V. 2. - P. 174 - 184.

165. Sikkema D.J., Brubaker R.R. Resistance to pesticin, storage of iron, and invasion of HeLa cells by Yersiniae 11 Infect. Immun. 1987. - V.55. - P. 572 - 578.

166. Simonson C., Brener D., De Voe I.W. Expression of a high-affinity mechanism for acquisition of transferrin iron by Neisseria meningitidis II Ibid. -1982. V. 36. - P. 107 -113.

167. Smith L.D.S. Virulence factors of Clostridium perfringens II Rev. Infect. Dis. -1979.-V. l.-P. 254-260.

168. Sodeinde O.A., Goguen J.D. Genetic analysis of the 9,5-kilobase virulence plasmid of Yersinia pestis И Infect. Immun. 1988. - V. 56. - P. 2743 - 2748.

169. Staggs T.M., Fetherston J.D., Perry R.D. Pleiotropic effects of a Yersinia pestis fur mutation II J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - P. 7614 - 7624.

170. Staggs T.M., Perry R.D. Fur regulation in Yersinia species // Mol. Microbiol. 1992.- V.6. P. 2507 - 2516.

171. Stibitz S., Aaronson W., Monak D., Falkow S. Phase variation in Bordetella pertussis by frameshift mutation in a gene for a novel two-component system // Nature. 1989.- V. 38. P. 266 - 269.114

172. Stoebner J.A, Payne S.M. Iron-regulated hemolysin production, and utilization of heme and hemoglobin by Vibrio cholerae // J. Bacteriol. 1988. - V. 56. - P. 2891 - 2895.

173. Stojiljkovic I., Hantke K. Hemin uptake system of Yersinia enterocolitica: similarities with other Ton B-dependent systems in Gram-negative bacteria // EMBO J. 1992. - V. 11.-P. 4359-4367.

174. Stojiljkovic I., Hantke K. Transport of haemin across the cytoplasmic membrane through a heamin-specific periplasmic binding-protein-dependent transport system in Yersinia enterocolitica II Mol. Microbiol. 1994. - V. 13. - P. 719 - 732.

175. Sword C.P. Mechanism of pathogenesis in Listeria monocytogenes infection. I. influence of iron // J. Bacteriol. 1966. - V. 92. - P. 536 - 542.

176. Theil B. Ferritin. Structure, gene regulation and cellular function in animal, plant and microorganisms // Ann. Rev. Biochem. 1987. - V. 56. - P. 289 - 315.

177. Thompson J.M., Hearther A.J., Perry R.D. Molecular characterization of the hemin uptake locus (hmu) from Yersinia pestis and analysis of hmu mutants for hemin and hemo-protein utilization // Infect. Immun. 1999. - V. 67, № 8. - P. 3879 - 3892.

178. Une Т., Brubaker R.R. In vivo comparison of avirulent Vwa" and Pgm" or Pstr phe-notypes of yersiniae // Ibid. 1984. - V.133. - P. 2226 - 2230.

179. Ward C.G., Hammond J.S., Bullen J.J. Effect of iron compounds on antibacterial function of human polymorphs and plasma // Ibid. 1986. - V. 51. - P. 723 - 730.