Исследование функциональной активности рН 6 антигена Yersinia pestis с помощью наборов изогенных мутантов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат медицинских наук Бахтеева, Ирина Викторовна

• Бахтеева, Ирина Викторовна
• кандидат медицинских наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Бахтеева, Ирина Викторовна

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ,

ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. АДГЕЗИЯ КАК ЭТАП ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА.

1.2. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ПИЛЕВЫХ АДГЕЗИНОВ.

1.3. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ФАКТОРЫ ИНВАЗИИ.

1.4. АНТИФАГОЦИТАРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БАКТЕРИАЛЬНЫХ 23 ПАТОГЕНОВ.

1.5. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ФАКТОРАХ ПАТОГЕННОСТИ ИЕРСИНИЙ

1.5.1. АДГЕЗИНЫ ЭНТЕРОПАТОГЕННЫХ ИЕРСИНИЙ.

1.5.2. АДГЕЗИНЫ, ИНВАЗИНЫ И АНТИФАГОЦИТАРНЫЕ ФАКТОРЫ 33 Y. PESTIS.

1.5.3. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА рН 6 АНТИГЕНА.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование функциональной активности рН 6 антигена Yersinia pestis с помощью наборов изогенных мутантов»

Актуальность проблемы

Возбудитель чумы, Yersinia pestis, является одним из наиболее вирулентных микроорганизмов и относится к грам-отрицательным бактериям рода Yersinia [Хоулт Дж. с соавт., 1997]. В патогенезе инфекций, вызываемых грамм-отрицательными микроорганизмами, одну из первостепенных ролей играет адгезия бактерий к поверхности клеток хозяина. У иерсиний известно несколько белков, обеспечивающих прикрепление патогена к мембране эукариотических клеток: адгезин YadA, инвазин, белок Ail и рН 6 антиген. рН 6 антиген (пили адгезии, белок PsaA - рН six antigen) является общим для двух видов Yersinia поверхностным белком, синтезирующимся в виде субъединиц с молекулярной массой 15 кДа, которые затем агрегируют с образованием макромолекулярной капсулы [L.E. Lindler etal. 1990]. Экспрессия PsaA кодируется psaEFABC опероном, включающим пять генов: psaA, кодирующий синтез структурной субъединицы; psaB и psaC, кодирующие шаперонный и ашерный белки, обеспечивающие доставку структурных субъединиц из цитоплазмы на поверхность бактериальной клетки; psaE и psaF, отвечающие за температурную и рН-регуляцию синтеза белка PsaA [Yang, Isberg, 1997; Price et al., 1995; Панферцев и др., 1991; Lindler etal, 1990 и др.].

К моменту начала настоящих исследований рН6 антиген наряду с белками внешних мембран Yops, липополисахаридом, V антигеном и др. расценивался как один из обязательных факторов патогенности Y. pestis, так как его экспрессия необходима для вирулентности чумного микроба. Утрата продукции рН6 антигена в результате делеции гена psaA приводили к 200-кратному снижению вирулентности штамма Y.pestis KIM5 [Lindler etal., 1990], а делеции гена psaF - к полной потере вирулентности штамма Y. pestis 231 [Панферцев и др., 1991].

Одним из свойств рН6 антигена, привлекшим к нему внимание исследователей, была зависимость его синтеза от рН и температуры окружающей среды - его продукция начиналась при температуре 37 °С и значениях рН ниже 6,4, близких к рН фаголизосом макрофагов или некротического содержимого абсцессов [Ben-Efraim et al., 1961]. Эксперименты по активной иммунизации лабораторных животных препаратами PsaA показали, что его выраженная способность индуцировать антителогенез не приводила к протективному эффекту при последующем заражении животных Y.pestis [Черепанов и др., 1991; Водопьянов и др., 1995]. Высказывались предположения, что отсутствие протективности может быть связано с особенностями рН регуляции этого фактора: его синтез внутри фаголизосом макрофагов или в центре некротизированных тканей абсцессов делает невозможным контакт покрытых рН6 антигеном бактериальных клеток с антителами и иммунокомпетентными клетками макроорганизма [Анисимов, 2002]. Однако до сих пор не было приведено доказательств этой гипотезы.

Исследования функциональной активности PsaA продемонстрировали, что он обладает целым рядом биологических свойств, каждое из которых может обеспечивать его вклад в вирулентность чумного микроба. PsaA+ клетки Y. pestis и препараты белка PsaA обладали цитотоксической активностью по отношению к перитонеальным [Bichowsky-Slonimsky, Ben-Efraim, 1963] и альвеолярным [Степаншина с соавт., 1993; Водопьянов с соавт., 1995] макрофагам. Однако в экспериментах с мутантным по собственным пилевым белкам штаммом Pseudomonas aeruginosa клонированные гены Y. pestis psaABC восстанавливали доставку цитотоксичного экзоэнзима S в цитоплазму клеток хозяина благодаря восстановлению дефекта пилей, но не кодировали дополнительную цитотоксическую активность [Sundin et al., 2002].

Публиковались данные об адгезивной активности PsaA. Многие исследователи отмечали способность PsaA агглютинировать эритроциты различных видов животных [Bichowski-Slonimski, Ben-Efraim, 1963; Водопьянов, Мишанькин, 1985; Lindler et al., 1990 и др.]. Кроме того, при развитии псевдотуберкулезной инфекции PsaA выполняет функцию адгезина, способствуя связыванию клеток Y. pseudotuberculosis с мембраной эпителиальных клеток [Yang et al., 1996; Marra, Isberg, 1997]. Однако позже были опубликованы данные об отсутствии влияния PsaA на способность Y.pestis связываться с мембраной макрофагов [2004]. В то же время рН6 антиген обладает антифагоцитарной активностью и препятствует захвату клеток чумного микроба макрофагами [Huang , Lindler , 2004].

Таким образом, несмотря на всестороннее изучение функциональной активности PsaA, до настоящего времени нет единого мнения о том, какое из его свойств является определяющим вклад этого фактора в вирулентность Y. pestis. Анализ опубликованных работ показал противоречивость данных о цитотоксической активности и влиянии рН6 антигена на вирулентность Y. pestis. Адгезивные свойства PsaA установлены для Y. pseudotuberculosis, но не для Y.pestis. До настоящего времени не изучены механизмы отсутствия протективной активности PsaA. В связи с вышеизложенным для уточнения роли рН 6 антигена в иммунопатогенезе чумы сохраняется актуальность изучения цитотоксических, митогенных и адгезивных свойств белка PsaA, а также определение его вклада в вирулентность чумного микроба.

Цель исследования - чголучеш!^—н^ьк-данньгх о ^функциональной /> тт ^ —^^ активности рН 6 антигена и его вкдад%#вИрул£нТНость возбудителя чумы. Задачи исследования:

1. Создать на основе штаммов Yersinia spp. коллекцию изогенных нокаутных мутантов по генам оперонаpsa.

2. На основе созданной коллекции провести комплексную сравнительную оценку биологических свойств PsaA+ и PsaA" штаммов Yersinia spp in vitro.

3. Оценить цитотоксические, митогенные и адгезивные свойства белка

PsaA.

4. Из учить протективные свойства PsaA и его вклад в вирулентность Yersinia spp в экспериментах in vivo.

Научная новизна.

Доказано, что PsaA не обладает цитотоксичностью. Установлено, что PsaA не относится к обязательным факторам патогенности Y. pestis. Показано, что PsaA обеспечивает адгезию возбудителя чумы к эпителиальным клеткам. Выявлена митогенная активность PsaA, а также его влияние на адгезию и дифференцировку макрофагов. Получены штаммы Y. pestis со способностью к независимому от рН и температуры среды (конститутивному) синтезу рН 6 антигена и с их помощью проверена и опровергнута гипотеза о том, что отсутствие протективных свойств PsaA определяется особенностями рН-регуляции его синтеза. Выявлено, что PsaA+ клетки Y. pestis в организме теплокровного хозяина имеют селективные преимущества перед PsaA-бактериями.

Практическая значимость. Полученные данные о селективных преимуществах PsaA+ клеток Y. pestis в организме теплокровного хозяина, объясняющие факт выделения в природных очагах чумы только PsaA+ штаммов, являются основанием для разработки диагностических препаратов, направленных на выявление генов, кодирующих рН 6 антиген возбудителя чумы.

В коллекции живых культур ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» депонированы пять авторских штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis с мутациями по генам psaA и psaEFABC , которые будут использованы для изучения роли рН 6 антигена Y. pestis в патогенезе чумы.

Депонированы в GenBank нуклеотидные последовательности четырех генов, кодирующих белки Y. pestis с предполагаемой адгезивной активностью -YP01387-YP01388, YP01708, YP01709-YP01711 и YPO 4044 (№№ доступа EU637081; EU637083; EU637082 и EU637084 соответственно) [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez]

Внедрение результатов работы

Результаты исследований послужили основой для составления методических рекомендаций «Оценка влияния рН 6 антигена на адгезию и фагоцитоз Y. pestis» (Оболенск, 2007) и методических рекомендаций «Оценка степени клеточной дифференцировки человеческой моноцитарной линии клеток ТНР-1, стимулированной очищенным препаратом рН 6 антигена» (Оболенск, 2007).

Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов факультета биологической и экологической безопасности Путинского государственного университета.

Положения, выносимые на защиту:

1. рН 6 антиген Y. pestis не обладает цитотоксической активностью в отношении различных типов эукариотических клеток.

2. рН 6 антиген не является обязательным фактором патогенности Y. pestis. Утрата способности к его продукции не приводит к снижению вирулентности возбудителя чумы, но его присутствие дает селективные преимущества PsaA+ бактериям в организме теплокровного хозяина на ранних стадиях инфекции.

3. Большинство присущих белку PsaA биологических эффектов определяется именно его адгезивной активностью. В зависимости от концентрации PsaA либо стимулирует дифференцировку и адгезию макрофагов, либо вызывает их аутоагглютинацию.

4. Отсутствие протективности рН 6 антигена не связано с его синтезом внутри фаголизосом и некротических очагов и недоступностью для антител и иммунокомпетентных клеток. Отсутствие протективности PsaA в совокупности с феноменом селекции PsaA+ бактерий в организме теплокровного хозяина объясняют факт выделения в природных очагах чумы только PsaA+ штаммов Y. pestis, что позволяет рассматривать PsaA или кодирующие его гены как перспективную мишень для лабораторной диагностики.

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ФГУН ГНЦ ПМБ 2 апреля 2008 года. Материалы диссертации доложены и представлены на 5 международных научных конференциях: II-й Международной научной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (20-21 октября 2005 г., Москва, Россия); VII-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств» (3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.); 9-ом международном симпозиуме по иерсиниям (10-14 октября, 2006, Lexington, Kentucky, USA); межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и, реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (25-26 сентября 2007 г., Саратов); 5th International Conference on Emerging Zoonoses (Limassol, Cyprus, November 15-18, 2007).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 10 научных публикациях.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 56 работ отечественных и 194 работы зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 26 рисунками и 17 таблицами.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Бахтеева, Ирина Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Доказано, что рН 6 антиген не обладает цитотоксической активностью.

2. Установлено, что утрата способности продуцировать рН 6 антиген не снижает вирулентность Y. pestis 231.

3. Установлено, что рН6 антиген обеспечивает адгезию Y.pestis к эпителиальным клеткам и предотвращает бактериальный захват Y.pestis макрофагами, однако не вносит существенного вклада в процесс связывания Y. pestis с поверхностью макрофагов.

4. Выявлено, что рН 6 антиген в зависимости от концентрации стимулирует либо процессы адгезии и дифференцировки макрофагов, либо их аутоагглютинацию, а также обладает митогенной активностью.

5. Выявлены селективные преимущества PsaA+ штаммов Y.pestis в организме теплокровного хозяина, которые проявляются в стабилизации наследования плазмид с генами оперона psa и ускорении сроков генерализации инфекции.

6. Установлено, что отсутствие протективности рН 6 антигена не связано с недоступностью PsaA+ бактериальных клеток для антител и иммунокомпетентных клеток. Отсутствие протективности белка PsaA в совокупности с феноменом положительной селекции PsaA+ бактерий в организме теплокровного хозяина объясняют факт выделения в природных очагах чумы только PsaA штаммов Y. pestis, что позволяет рассматривать PsaA или кодирующие его гены как перспективную мишень для лабораторной диагностики.

БЛАГОДАРНОСТИ

Приношу глубокую благодарность моему научному руководителю д.м.н. А.П. Анисимову за неизменно высокий интерес к нашим результатам и помощь в формировании научной концепции работы.

Приношу искреннюю благодарность заведующей лабораторией микробиологии чумы С.В. Дентовской за идейное руководство и большую помощь в генетической части работы.

Считаю своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность всем моим соавторам и сотрудникам ФГУН ГНЦ ПМБ, принимавшим участие в планировании и проведении экспериментов, обсуждении их результатов и оказывавшим помощь в оформлении диссертации.

Приношу искреннюю признательность официальным и неофициальным рецензентам настоящей работы за замечания, вопросы и поправки, которые были учтены при ее написании.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Каждый из этапов циклического существования Y. pestis обеспечивается множеством уже установленных или еще не известных факторов, которые могут действовать совместно или индивидуально. При этом каждая из бактериальных биомолекул может обладать несколькими активностями, направленными на противодействие различным звеньям системы защиты макроорганизма, однако только в совокупности факторы патогенности обеспечивают "полную" вирулентность Y. pestis, каким бы значительным или незначительным не был их индивидуальный эффект [Анисимов, 2002а, 20026].

К моменту начала наших исследований рН 6 антиген наряду с белками- -внешних мембран (Yop's), V антигеном и другими факторами расценивался как один из обязательных факторов патогенности Y. pestis, опосредующих. ( вирулентность этой бактерии [Perry, Fetherston, 1997; Анисимов, 2002а, 20026; Brubaker, 2006]. рН 6 антиген по совокупности всех сведений о нем * , представляет собой поверхностный адгезин Y. pestis с антифагоцитарными и цитотоксическими свойствами, синтезирующийся при закислении среды [Dubos et al, 1954; Bichowsky-Slomnicki, Ben-Efraim, 1963, Straley et al., 1993]. Оказывая влияние на вирулентность, он, тем не менее, не обладает иммунопротективными свойствами [Водопьянов с соавт., 1995; Titball, Williamson, 2001; Гремякова, 2004]. Анализ опубликованных к моменту начала наших исследований работ по изучению рН 6 антигена показал значительное несовпадение данных по влиянию на вирулентность мутаций по различным генам psa оперона, полученных с использованием отличающихся по вирулентности и выделенных в географически удаленных природных очагах чумы штаммов Y. pestis при различных способах заражения [Lindler et al., 1990; Панферцев с соавт. 1991]. Более того, мы отметили также неоднозначность результатов оценки его цитотоксичности [Bichowsky-Slonimsky, Ben-Efraim, 1963; Водопьянов с соавт., 1995; Sun din et al., 2002]. Были описаны адгезивные свойства рН 6 антигена для Y.pseudotuberculosis [Yang etal., 1996], но не было единого мнения о том, какой адгезин (или адгезины) обеспечивают взаимодействие Y. pestis с клетками хозяина. Не были изучены причины отсутствия у рН 6 антигена протективной активности. Кроме того, в доступной нам литературе мы не нашли публикаций о комплементации данных мутаций и восстановлении вирулентности.

Поэтому в рамках настоящего исследования для определения роли рН 6 антигена в патогенезе чумы мы планировали исследовать цитотоксическую, адгезивную и митогенную активности высокоочищенных препаратов рН 6 антигена, сконструировать изогенные наборы мутантов по отдельным генам, оперона psa на основе аттенуированных и вирулентных штаммов и провести их сравнительную оценку вирулентности , а также уточнить протективность анти-рН 6 антител, с целью определения возможности использования этого фактора патогенности в качестве молекулярной мишени для диагностики, специфической профилактики и терапии чумы.

Чтобы исключить возможное влияние неидентифицированных мутаций на вирулентность Y. pestis, было проведено секвенирование участков хромосомы штамма Y. pestis 231, отвечающих за синтез рН 6 антигена и 16 других предполагаемых фимбриальных адгезинов Y. pestis, и показано, что определенные нами последовательности полностью гомологичны соответствующим фрагментам геномов всех шестнадцати секвенированных к настоящему моменту штаммов Y. pestis.

С помощью сайт-направленного мутагенеза оперона psa были сконструированы изогенные наборы мутантов по генам оперона psa на основе аттенуированных и вирулентных штаммов Y. pestis. Были получены штаммы, мутантные по гену psaA и полному оперону psaEFABC и показано, что оба типа полученных делеций приводили к прекращению синтеза рН 6 антигена. Последующая транс-комплементация мутантов с делецией оперона psaEFABC с помощью рекомбинантных плазмид, несущих либо полный оперон psaEFABC, либо локус структурных генов psaABC, восстанавливала синтез рН 6 антигена. Кроме того, в ходе исследований были подтверждены данные С. Sundin et al. [2002] о том, что psa оперон, лишенный генов psaE и psaF, обеспечивает температуро- и рН-независимый синтез рН 6 антигена в пределах тестируемых температур (от 28 °С до 37 °С) и рН (от 5,8 до 7,2).

На следующих этапах настоящего исследования были изучены цитотоксическая, адгезивная, антифагоцитарная и митогенная активности рН 6 антигена.

Изучение цитотоксических свойств рН 6 антигена показало, что он не обладает собственно цитотоксичностью. Сравнительный анализ "грубых" экстрактов от изогенных PsaA+ и PsaA- штаммов показал, что за их цитотоксичность ответственны другие содержащиеся в клеточном экстракте белки. Однако в высоких концентрациях рН 6 антиген индуцировал агглютинацию эукариотических клеток и тем самым нарушал распластывание и прикрепление клеток к поверхности, что приводило к нарушению условий нормальной жизнедеятельности клеток, и, как следствие, к цитопатическому, (но не цитотоксическому) эффекту.

Было установлено, что при взаимодействии Y. pestis с эпителиальными клетками рН 6 антиген проявляет себя как адгезии, а при взаимодействии с макрофагами - как антифагоцитарный фактор, но не адгезии. Возможно, что вклад рН 6 антигена в связывание клеток Y. pestis с поверхностью макрофагов невелик, так как макрофаг обладает большим количеством рецепторов для неспецифического связывания с патогенами.

В процессе исследованией было обнаружено, что штаммы Y.pestis, утратившие способность к синтезу двух основных фимбриальных белков — F1 и рН 6 антигена - тем не менее не теряют своих адгезивных и антифагоцитарных свойств. Мы полагаем,, что высокий уровень адгезивной и антифагоцитарной активности бактериальной клетки Y.pestis, утратившей способность к синтезу рН 6 антигена и капсулы F1, сохраняется благодаря экспрессии другого(их) фактора(ов), комплементирующего(их) функцию рН 6 антигена. При этом фенотип PsaA+ являлся доминирующим адгезивным и антифагоцитарным фенотипом Y. pestis. Наши результаты совпали с данными F. Liu et а/[2006], которые также подтверждают существование в Y.pestis неохарактеризованного ранее адгезина.

Мы установили, что в зависимости от концентрации рН 6 антиген вначале способствует, а затем препятствует процессам распластывания и дифференцировки макрофагов, необходимым для их дальнейшего функционирования. По нашему мнению, такая двойственная активность играет важную роль в регуляции локального моноцит-медиированного воспаления в месте первичного накопления возбудителя, что обеспечивает его дальнейшее беспрепятственное размножение. рН 6 антиген обладал выраженными митогенными свойствами, сравнимыми с конканавалином А. Вкупе с его способностью агглютинировать эритроциты, это свойство позволяет отнести рН 6 антиген к лектиноподобным веществам бактериального генеза, как и многие из известных бактериальных пилевых и непилевых адгезинов [Finegold etal'., 1968; Goldhar, 1994; Meng etal., 1998; Mitchell etal., 2002]. В дополнение к известным данным относительно гемагглютинирующей активности рН 6 антигена, наши результаты о PsaA-медиированной агрегации макрофагов и моноцитов, предполагают потенциальную роль рН 6 антигена в тромбообразовании и индукции синдрома диссеминированной внутрисосудистой коагуляции, которая является характерной для чумного сепсиса [Finegold et al., 1968].

Завершающим этапом нашей работы была сравнительная оценка вирулентности полученных изогенных штаммов "дикого" типа, вариантов с рН 6~ фенотипом и штаммов с восстановленным синтезом рН 6 антигена зависимым или независимым от температуры культивирования и рН питательной среды на моделях интактных и иммунизированных рН 6 антигеном мышах. Было установлено, что в организме хозяина происходит отбор PsaA+ клеток рекомбинантных штаммов Y. pestis, что свидетельствует о селективных преимуществах бактериальных клеток, продуцирующих этот адгезин. Об определенном преимуществе PsaA+ клеток Y. pestis в организме теплокровных говорит и тот факт, что PsaA+ штамм Y. pestis на ранних сроках инфекции был способен к более эффективному размножению в регионарном лимфоузле по сравнению с PsaA" штаммом, хотя и терял это преимущество на более поздних стадиях инфекционного процесса (см. раздел 6.6).

Тем не менее, утрата способности продуцировать рН 6 антиген не влияла на вирулентность Y.pestis при подкожном заражении мышей. В наших исследованиях на двух изогенных наборах штаммов Y.pestis было показано, что абсолютные величины LD50 и средние сроки жизни зараженных животных не зависели от способности клеток Y. pestis синтезировать рН 6 антиген, даже когда этот синтез не зависел от температуры культивирования и рН питательной среды. В то же время, эксперименты по определению роли рН 6 антигена в патогенезе инфекции, вызванной другим представителем рода Yersinia, Y. pseudotuberculosis, продемонстрировали более высокую вирулентность культуры, выращенной' в условиях синтеза рН 6 антигена.

По нашему мнению, в случае утраты рН 6 антигена, оставшихся факторов патогенности Y. pestis, включая, возможно, и другие пилевые адгезины, может быть достаточно для поддержания величин LD50 на уровне единичных бактериальных клеток. На наш взгляд, в штаммах высоковирулентных патогенов, таких как Y.pestis, именно избыточность механизмов и детерминант вирулентности до какого-то времени компенсирует отдельные мутации, потенциально снижающие способность эффективно размножаться в организме хозяина. В пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что у умеренно вирулентного энтеропатогена Y. pseudotuberculosis, не обладающего столь широким набором факторов вирулентности, экспрессия оперона psa (настоящее исследование) или cafl [Бывалов с соавт., 2008] не только обеспечивает селективные преимущества в организме инфицированных животных, но и приводит к увеличению вирулентности [Бывалов с соавт., 2008; настоящее исследование] То же касается и аттенуированного штамма Y. pestis KIM5 [Lindler et al., 1990].

В рамках нашей работы была проверена гипотеза о том, что отсутствие протективности рН 6 антигена может быть связана с экспрессией psa оперона только в тех местах, где бактерии недоступны для антител и иммунокомпетентных клеток (фагосома, бубон). Однако полученные нами данные свидетельствуют, что иммунный ответ на рН 6 антиген не защищает мышей от летальной инфекции даже при полной доступности PsaA+ бактерий для контакта с антителами и рецепторами иммунокомпетентных клеток, как это происходит в случае инфицировании животных штаммами,, обладающими способностью к синтезу белка PsaA независимо от рН среды и температуры культивирования. При заражении иммунизированных рН 6 антигеном животных Y. pseudotuberculosis иммунные мыши были более чувствительны к инфекции, чем интактные мыши. Возможно, опсонизация клеток Y. pseudotuberculosis анти-рН 6 антителами потенцирует контакт бактериальной клетки с макрофагом путем взаимодействия антител с Fc рецепторами макрофагов, что, в свою очередь, облегчает "впрыскивание" в макрофаг эффекторных Уор белков с помощью системы секреции III типа и приводит к повышению вирулентности. Во всяком случае, было показано, что отсутствие протективности рН 6 антигена не связано с его недоступностью для антител и иммунокомпетентных клеток.

Завершая обсуждение представленных нами результатов, следует подчернуть, что представленные в настоящей работе данные о необязательности наличия рН 6 антигена в клетках чумного микроба для "полной" вирулентности Y. pestis, а также данные об отсутствии протективного эффекта к рН 6 антигену даже в случае его конститутивного синтеза предполагают неперспективность использования рН 6 антигена в качестве молекулярной мишени для терапии и иммунопрофилактики чумы. Однако, учитывая данные Е.А. Панферцева с соавт. [1991] о полной утрате вирулентности psaF мутантами Y. pestis и отсутствие жизнеспособных psaF мутантов в наших исследованиях, не исключено, что использование гена psaF в качестве мишени для ингибирования вирулентности Y.pestis может быть веема перспективным, но для этого необходимы дополнительные исследования.

С другой стороны, отсутствие протективности рН 6 антигена и селекция PsaA+ клеток Y. pestis в организме теплокровного хозяина объясняют факт выделения в природных очагах чумы только PsaA+ штаммов Y. pestis, позволяет считать рН 6 антиген и кодирующие его гены перспективной мишенью для лабораторной диагностики. Особенно это может быть актуально для очагов чумы, где выделяются бескапсульные штаммы и диагностика по F1 антигену невозможна.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Бахтеева, Ирина Викторовна, 2008 год

1. Абрамов В.М., Косарев И.В., Васильев A.M. и др. // Проблемы биологиче-ской и экологической безопасности: Международная конференция (Обо-ленск, 22-25 мая 2000 г.). Оболенск, 2000. С. 10.

2. Адо А.Д. Вопросы общей нозологии. М.,1985 - 239 с.

3. Анисимов, А.П.(а)Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Сообщение 1. // Молекулярная генетика. 2002. - № 3. - С. 323.

4. Анисимов А.П., Малахаева А.Н., Черновская Т.В. и др. // Эрдем шинжилгээний бутээл (Байгалийн голомтот халдварт цвчнийг эсэргууцэн судлах тцв). Улаанбаатар, 1999. Дугаар 7. - С. 169-171.

5. Анисимов А.П. Молекулярно-генетические механизмы образования и функциональная значимость капсулы Yersinia pestis: Дисс. докт. мед. наук. Саратов, Оболенск, 1999. - 326

6. Анисимов, А.П. (б)Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Сообщение 2 // Молекулярная генетика. 2002. - № 4. - С. 311.

7. Асеева Л.Е., Мишанькин М.Б., Гончаров Е.К. и др. // БЭБМ. 1995, -№2.-С. 193-195.

8. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Государственное издательство медицинской литературы, 1962. - С. 85-104.

9. Бондаренко В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса. // Журн. Микробиол. 1999. № 5 - С. 34-9.

10. Бухарин О.В. Биомедицинские аспекты персистенции бактерий. // Журн. микробиол. 1994. Приложение - С. 4-13.

11. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. Бактерионосительство. Екатеринбург, 1996-208 с.

12. Величко Л.Н., Кокушкин A.M. // Материалы научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (16-18 сентября 1997 г.). Саратов, 1997. - Т. 1. - С. 21,

13. Водопьянов С.О., Мишанькин Б.Н. Пили адгезии у Yersinia pestis II Журн. микробиол. — 1985. — .№ 6. — С. 13-17

14. Водопьянов С.О., Попова Г.О., Васильева Г.И. Мишанькин Б.Н. Феномен пилеобразования при взаимодействии Yersinia pestis с макрофагами экспериментальных животных // Журн. микробиол. -1990. № 3. - С. 3-6

15. Водопьянов С.О., Рыбянец А.А., Веркина Л.М. и др. // Журн. микробиол. 1995. - № 5. - С. 26-29

16. Водопьянов С.О., Атарова Г.Т., Олейников И.П. и др. Фибронектинсвязывающая способность Yersinia pestis II Журн. микробиол. 1993. - № 3. - С. 6-12.

17. Галактионов В.Г., Хромых Л.М., Василенко Р.Н. и др. // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций. Материалы Российской научной конференции (Волгоград, 21-22 октября 1992 г.): Тез. докл. Волгоград, 1992. - С. 85

18. Гремякова Т.А. Структурно-функциональная вариабельность антигенов Yersinia pestis и методология конструирования противочумных иммунопрофилактических препаратов: Дисс. . докт. мед. наук. Москва, 2004. - 320 с.

19. Домарадский И.В. Чума. М.: Медицина, 1998. - 176 с.

20. Захаров А.И. // 12 межреспубликанская научно-практическая конференция противочумных учреждений Средней Азии и Казахстана по профилактике чумы. Алма-Ата, 1985. - С. 16-18

21. Каграманов B.C., Асеева Л.У., Варивода Т.Ю. // Журн. микробиол. -1999. -№3.- С. 13-16.