Структурно-функциональные различия HMS-области генома Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат медицинских наук Сухоносов, Илья Юрьевич

• Сухоносов, Илья Юрьевич
• кандидат медицинских наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Сухоносов, Илья Юрьевич

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14 1.1 .Современные классификации патогенных иерсиний: возбудителей чумы и псевдотуберкулеза

1.2.Область пигментации патогенных иерсиний: структура и функции

1.2.1 .Организацияpgm области Yersiniapestis

1.2.2,Организация pgm области Yersinia pseudotuberculosis 25 1.2.3 .Мутации, возникающие в пределах pgm области хромосомы у природных штаммов Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis 27 1.3.Полимеразная цепная реакция как метод молекулярной индикации и идентификации чумного микроба

1.3.1 .Полимеразная цепная реакция и её модификации 31 1.3.2.Индикация и идентификация Yersinia pestis методом полимеразной цепной реакции

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2 .МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 .Бактериальные штаммы

2.2.Питательные среды, препараты и реактивы

2.3.Методы исследований

ГЛАВА 3.ХАРАКТЕРИСТИКА КОЛЛЕКЦИИ ШТАММОВ

ЧУМНОГО И ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗНОГО МИКРОБОВ РАЗНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ПО ПРИЗНАКАМ, АССОЦИИРОВАННЫМ С

ОСНОВНЫМИ ДЕТЕРМИНАНТАМИ ВИРУЛЕНТНОСТИ 59 3.1.Характеристика штаммов чумного микроба, использованных для изучения распространения аллелей вариабельных локусов hutG—

YP01950 региона области пигментации

3.2.Характеристика штаммов псевдотуберкулезного микроба, использованных для изучения распространения аллелей вариабельных локусов /ш?0-УР01950 региона области пигментации

ГЛАВА 4.ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВАРИАЦИИ РЕГИОНА /шЮ-УР01950 ОБЛАСТИ ПИГМЕНТАЦИИ У ШТАММОВ ЧУМНОГО И ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗНОГО МИКРОБОВ РАЗНОГО

ПРОИСХОЖДЕНИЯ

4.1.Тактика поиска и выявление различий в регионе /шЮ-УР01950 у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов разного происхождения

4.2.ПЦР - анализ вариабельных областей 1 и 2 /шЮ—УР01950 региона у штаммов чумного микроба разного происхождения и штаммов псевдотуберкулезного микроба

4.3.ПНР - анализ вариабельной области 3 /шЮ - УР01950 региона у штаммов чумного микроба разного происхождения

4.4.ПЦР - анализ вариабельной области 3 /шЮ-УР01950 региона штаммов псевдотуберкулезного микроба из разных географических регионов

4.5.ПЦР - анализ вариабельной области 4 /шЮ-УР01950 региона у штаммов чумного микроба разного происхождения

ГЛАВА 5.ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ВАРИАБЕЛЬНЫХ ОБЛАСТЕЙ

РЕГИОНА \iutQ - УР

5 Л .Определение и сравнение нуклеотидных последовательностей гена порина УР01967 чумного и псевдотуберкулёзного микробов, выделенных в разных географических регионах

5.1.1.Нуклеотидная последовательность интактного гена порина и первичная структура порина чумного и псевдотуберкулёзного микробов

5.1.2.Нуклеотидная последовательность трункированных генов порина порина чумного и псевдотуберкулёзного микробов

5.2.0пределение и сравнение нуклеотидных последовательностей hms оперона штаммов Yersinia pest is, выделенных в разных географических регионах

ГЛАВА 6 .РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ПЦР СИСТЕМ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВИРУЛЕНТНЫХ И АВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ ЧУМНОГО МИКРОБА РАЗНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ 143 6 Л .Мультиплексная ПЦР система для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов чумного микроба разного происхождения

6.2.Разработка ПЦР для дифференциации авирулентных вследствие потери области пигментации и вирулентных штаммов (клонов) чумного микроба

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональные различия HMS-области генома Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis»

Актуальность проблемы. Три патогенных для человека вида иерсиний — Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia enterocolitica вызывают разные по тяжести и эпидемической значимости заболевания. Возбудитель чумы вызывает быстротечное заболевание с генерализацией процесса и летальным исходом и явился причиной нескольких пандемий, унесших миллионы человеческих жизней. Два других вида микроорганизмов вызывают энтериты разной степени тяжести. Патогенные штаммы всех трех видов содержат ведущие факторы вирулентности: хромосомную область пигментации (pgm) и плазмиду кальцийзависимости (pCad) [108]. У возбудителей чумы и псевдотуберкулеза эти генетические структуры имеют высокую степень гомологии, но при этом выявлены небольшие как видовые, так и внутривидовые различия в их структурной организации и фенотипическом проявлении [143]. Учитывая исключительную важность этих детерминант для проявления вирулентных свойств микробов, выявление и характеристика даже небольших структурных и функциональных различий может приблизить нас к пониманию причин высокой патогенности возбудителя чумы, поможет в разработке систем молекулярного типирования и идентификации этого патогена. Основные сведения о структуре и функциональной активности ведущих детерминант патогенности получены на зарубежных штаммах. Однако на территории стран СНГ существует 42 природных очага чумы, в которых циркулируют различающиеся по фенотипу и вирулентности штаммы. Исследование геномов этих штаммов находится на начальном этапе. Поэтому сравнительное изучение структурно-функциональной организации детерминант патогенности штаммов разного происхождения с неодинаковой эпидемической значимостью и штаммов псевдотуберкулезного микроба, особенно 01 серотипа - наиболее близкой к чумному микробу эволюционной ветви, будет еще долгое время актуальным.

Область pgm Yersinia pestis (102 т.п.н.) состоит из двух регионов: «острова высокой- патогеиности» - оперона сидерофорзависимой системы утилизации; железа и hms региона, обеспечивающего сорбцию гемина на поверхности; микробной клетки: [125]. Оба региона участвуют в обеспечении чумного микроба необходимым для» жизни микроэлементом - железом. «Острова высокой патогенности»- у иерсиний • высококонсервативны. Гены,: расположенные на «острове1 высокой патогенности»¡j не кодируют белки;-агрессии,, но необходимы для выживания и нормального размножения; в организме теплокровных животных [139,153J.

Регион hms включает три функциональные области:, кластер генов, мембранных белков, hms оперон и- ast оперой, отвечающий за утилизацию аргинина. Экспрессию- hms генов, обеспечивающих сорбцию, гемина, связывают, со способностью чумного;' микроба- к образованию блока преджелудка у блох, и относят к факторам, способствующим трансмиссивному пути передачи патогена [142]. 13 настоящее время, основным биологическим, свойством, детерминируемым' этим регионом'; считается образование биопленки^ способствующей блокообразованию: Интересно; что бйопленку образуют как штаммы чумного, так и штаммы псевдотуберкулезного микроба, но способность, блокировать преджелудок блох отмечается только у штаммов чумного; микроба. Причины этого; пока-не ясны. Штаммы биоваров orientalis, medievalis, antiqua и microtias в зависимости от географического происхождения имеют некоторые различия в структурной организации: pgm области, что выражается; в различной- стабильности признаков пигментации (Hms) и; чувствительности к пестицину (Psn), ассоциированных с pgm областью, а также в различных типах мутаций- по этим признакам [149]. У штаммов- псевдотуберкулезного микроба выявлены структурные особенности pgm - области, отличающие их от классических штаммов чумного - микроба,. но сближающих со штаммами биовара microtias; с. ослабленной вирулентностью; > Примером этого может служить отсутствие IS 100 элемента, ограничивающего pgm область со стороны hms оперона, приводящее к отсутствию образования Дpgm мутантов, у штаммов псевдотуберкулезного микроба [103] и авирулентных для человека штаммов биовара microtus [207]. В то время как, у высоковирулентных штаммов биоваров orientalis, medievalis и antiqua pgm область фланкирована двумя IS 100 элементами, вызывающими рекомбинационный процесс с утратой всей области [125, 177].

Штаммы чумного микроба пяти подвидов: основного и неосновных — кавказского, алтайского, гиссарского, улэгейского и таласской группы, циркулирующие на территории стран СНГ и Монголии, имеют фенотипические различия, связанные с генами pgm области. Штаммы неосновных подвидов у редко образуют Hms" мутанты (10" ). Штаммы основного подвида образуют такие мутанты в результате делеции всей области пигментации с частотой 10"5 [33]. Структурная организация hms региона штаммов основного и неосновных подвидов чумного микроба не изучена. Выявление областей вариабельных для чумного микроба разных подвидов и псевдотуберкулезного микроба с одной стороны, даст новые сведения об эволюции патогенных иерсиний, с другой стороны, послужит основой при разработке тест-систем для идентификации и молекулярного типирования этих патогенов. С этой точки зрения представляется важным провести видовое и внутривидовое сравнительное изучение структурной организации hms региона у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов.

Цель работы - провести сравнительный структурно-функциональный анализ hms — областей Yersiniapestis и Yersinia pseudotuberculosis.

Задачи исследования:

1. Подобрать и;охарактеризовать штаммы чумного и псевдотуберкулезного микробов разного происхождения по основным? признакам, ассоциированным , с вирулентностью, и их генетическим детерминантам. Создать коллекцию штаммов : Yersinia pestis ■ и Yersinia- pseudotuberculosis для сравнения хромосомного^ сегмента пигментации;

2. Выявить, и охарактеризовать вариабельные: области на сегменте пигментации для штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов разного происхождения с помощью метода ПЦР.

3. Определить и сравнить нуклеотидные. последовательности./мил оперонов и вариабельных , концевых частей сегмента: пигментации (ген пори на) у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микроба: разного происхождения.:

4. Разработать экспериментальную ПЦР систему для, дифференциации» вирулентных ' и авирулентных штаммов чумного микроба разного происхождения и для выявления авирулентных штаммов (клонов), утративших область пигмеитации.

5. Установить механизмы I-Ims" Psn" мутаций у вакцинного штамма Yesinia pestis EV линии 11ИИЭГ. . .

Научная новизна работы

Выявлены видовые и внутривидовые различия в стабильности" сохранения признаков, ассоциированных с детерминантами вирулентности-(pgm областью и pCad) у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов. Установлено, что частота мутаций по Hmsy Psn и Cad признакам у штаммов псевдотуберкулезного микроба на два - четыре порядка выше, чем у штаммов чумного микроба. Эти данные свидетельствуют о том, что у штаммов чумного микроба в процессе-эволюции произошла стабилизация основных детерминант вирулентности - генов области пигментации и плазмиды pCad. Обнаружена группа штаммов чумного микроба основного подвида с частотой мутаций по

Hms признаку, характерной для штаммов неосновных подвидов. Показано, что снижение частоты и тип мутаций по Hms признаку у этой группы штаммов связаны со структурными особенностями краевого региона области пигментации — отсутствием одного из фланкирующих IS 100 элементов. Впервые было показано, что у штаммов псевдотуберкулезного микроба 01 и 03 серотипа к Psn" фенотипу приводят разные типы мутаций. Впервые выявлены и охарактеризованы штаммы псевдотуберкулезного микроба 01 серотипа с областью пигментации, фланкированной IS 100 элементами. Установлено, что ориентация IS 100 элемента и сайт встраивания его в ген порина, различны у штаммов чумного микроба основного подвида и группы штаммов псевдотуберкулезного микроба 01 серотипа. Впервые установлено, что концевая часть области пигментации штаммов псевдотуберкулезного микроба 03 серотипа не содержит последовательности гена порина и гена сукцинилглютаматдесукцинилазы агиЕ аргининового оперона.

Впервые выявлены четыре области перспективные для разработки системы типирования методом мультилокусного секвенировапия вариабельные для штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов. Три из них расположены в межгенных пространствах и одна - в области гена порина (YP01967). Впервые выявлена область, проявляющая для чумного микроба вариабельность на видовом и подвидовом уровнях. Эта область локализована между генами hutG и YP01967.

Получены новые сведения о высокой консервативности нуклеотидных последовательностей hms оперонов у штаммов чумного микроба пяти подвидов и таласской группы, что свидетельствует о важной биологической роли этой структуры.

Впервые на молекулярно-генетическом уровне получены доказательства делегирования области пигментации у вакцинного штамма Yersinia pestis EV линии НИИЭГ и его лабораторных вариантов, а, следовательно, невозможности спонтанной реверсии вирулентных свойств.

Положения, выносимые на защиту

1. Создана коллекция штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов, пригодная для проведения сравнительного анализа их hms областей.

2. Возбудители чумы и псевдотуберкулеза имеют выраженные отличия по частоте наследования основных признаков,' связанных с вирулентностью. Частота- потери этих признаков в 100 — 1000 раз выше у штаммов псевдотуберкулезного микроба, чем у штаммов чумного микроба.

3. Структурная организация сегмента пигментации (hutG - YP01950 регион) у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов -' имеет существенные видовые и* внутривидовые различия. Выявлены четыре вариабельные области, которые могут быть использованы для усовершенствования, методов идентификации и типирования штаммов чумного микроба.

4. Области пигментации у штаммов псевдотуберкулезного1 микроба ОЗ серотипа- содержат полноценный уЫ регион. Psn" мутанты у штаммов псевдотуберкулезного микроба образуются в результате трех типов мутаций.

5. Разработанные экспериментальные ПЦР системы пригодны для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов чумного микроба и для выявления авирулентных штаммов, утративших область пигментации.

6. Вакцинный штамм Yersinia pestis EV линии НИИЭГ утратил область пигментации, что исключает у него спонтанную реверсию вирулентности.

Практическая значимость работы

По результатам работы получены патенты на изобретения зарегистрированные в государственном реестре интеллектуальной собственности Российской Федерации: «Способ определения утраты вирулентности штаммами чумного микроба вследствие потери области пигментации» №2288275 и «Способ дифференциации- чумного и псевдотуберкулёзного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба» №2332464. Составлены методические рекомендации: «Способ дифференциации авирулентных вследствие потери области пигментации и потенциально вирулентных штаммов (клонов) чумного микроба», «Выделение и очистка геномной ДНК Yersinia pestis, пригодной для тонких молекулярно-биологических экспериментов», «Мультиплексная ПЦР для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов Yersinia pestis разного происхождения», одобренные Учёным советом Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» (протокол №1 от 16.03.2007г., протокол №2 от 17.04.2007г., протокол №5 от 22.06.2007г. - соответственно) и утвержденные директором Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» по учрежденческому уровню внедрения.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены и доложены на ежегодных итоговых конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2005, 2006 и 2007 гг.), а так же на конференции «Молодые учёные в медицине», (IX Всероссийская научно-практическая конференции Молодые учёные в медицине посвящённая 190-летию Казанского государственного медицинского университета, Казань 2004г.) и симпозиуме «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», Москва 2004г. Выступления на конференциях (Казань, 2004 и Москва, 2004) были высоко оценены оргкомитетами с присуждением дипломов за лучший доклад. Так же результаты исследования были представлены на следующих конференциях: II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием, «Инфекции, обусловленные иерсиниями» Санкт-Петербург 2006; IX съезд Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов Москва 2007; VI Всероссийского научно-практическая. конференция Москва 2007; X Всероссийская медикобиологическая конференция молодых исследователей "Человек и его здоровье" Санкт-Петербург, 2007; VIII Межгосударственная научно-практическая конференции государств участников СНГ Саратов 2007; Экофорум Санкт-Петербург 2008, IX Межгосударственная научно-практическая конференция государств участников СНГ Волгоград, 2008.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, одна - в изданиях рекомендованных ВАК и две оформлены в виде патентов на изобретения «Способ определения утраты вирулентности штаммами чумного микроба вследствие потери области пигментации» №2288275 и «Способ дифференциации чумного и псевдотуберкулёзного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба» №2332464.

Структура и объём диссертации

Диссертация представлена на 201 странице машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, пяти глав собственных исследований (в том числе, одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 40 рисунками. Библиографический указатель содержит 208 отечественных и зарубежных источников.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Сухоносов, Илья Юрьевич

ВЫВОДЫ

1. Создана коллекция, включающая штаммы чумного микроба характерные для пяти подвидов и таласекой группы из всех типов очагов, и штаммы псевдотуберкулезного микроба, представленные в основном 01 и ОЗ серотипом. Выборка штаммов охарактеризована по признакам, ассоциированным с вирулентностью.

2. Частота мутаций по Hms, Psn и Cad признакам у штаммов псевдотуберкулезного микроба на два - четыре порядка выше, чем у штаммов чумного микроба.

3. На сегменте пигментации (hutG- YP01950 регион) у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов обнаружены четыре вариабельные области (одна - в области гена порина, три - в межгенных пространствах), которые могут быть использованы для усовершенствования методов идентификации и типирования штаммов чумного микроба.

4. Показано наличие полноценного уЫ региона в области пигментации у штаммов псевдотуберкулезного микроба ОЗ серотипа. Выявлено три типа Psn" мутаций у штаммов псевдотуберкулезного микроба: утрата всего уЫ региона; протяженная делеция, включающая ген psn; внутригенные мутации.

5. Показано, что две разработанные ПЦР позволяют дифференцировать вирулентные и авирулентные штаммы чумного микроба разного происхождения. Мультилокусная ПЦР с праймерами на ген порина YP01967 и IcrH плазмиды pCad обладает способностью дифференцировать вирулентные и авирулентные штаммы чумного микроба всех подвидов и таласской группы; ПЦР с праймерами, ограничивающими область пигментации, выявляет авирулентные штаммы чумного микроба, утратившие область пигментации.

6. Получены молекулярно-генетические доказательства того, что вакцинный штамм Yersinia pestis EV линии НИИЭГ утратил область пигментации, и как следствие возможность реверсии вирулентности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Молекулярно-генетические исследования - двух генетически близких микроорганизмов; Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis позволяют говорить о том, что дивергенция этих видов произошла сравнительно недавно^ — 1,5-20 тыс. лет назад [87]. Геномы-чумного и псевдотуберкулезного микроба имеют очень высокую степень гомологии — более 90% [95]. В тоже время . клинические проявления- чумы и псевдотуберкулеза: и способы передачи инфекции резко отличаются. Несмотря на то, что в зависимости от особенностей ферментативных: , систем штаммы чумного микроба подразделяются на четыре биовара: antiqua, medievalis, orientalis, microtus и пять подвидов: pestis, altaica, hissarica, caucasica и ulegeica, клиническая картина при заражении; всеми; вариантами; штаммов чумного микроба практически не отличается и характеризуется сепсисом,. быстрой генерализацией процесса и быстрым;. летальным, исходом. Заражение происходит либо трансмиссивным способом, либо воздушно-капельным. Для штаммов, псевдотуберкулезного микроба характерен алиментарный ' путь заражения. Но при этом различают несколько форм болезни:' скарлатиноподобная, абдоминальная, желтушная, артралгическая и генерализованная [3 0]; Разнообразие клинической картины псевдотуберкулеза и значительные различия по антигенным, биохимическим, генетическим признакам возбудителя говорят о высоком полиморфизме таксона. Штаммы псевдотуберкулезного микроба 01 серотипа относят к предшественникам чумного микроба [87]; Эти штаммы в структуре генома содержат детерминанты вирулентности, которые для чумного микроба считают основными — остров высокой, патогенности и плазмиду кальцийзависимости. Но несмотря на это штаммы 01 серотипа вызывают не самую тяжелую клинику. Наиболее, тяжелое течение заболевания , отмечается при скарлатиноподобной форме (Дальневосточная скарлатиноподобная

•'■• . . . .166 лихорадка). Геном штаммов, вызывающих ДСГШ не "содержит ни острова высокой' патогенности, ни; плазмиды; кальцийзависимости. Вирулентность; возбудителя ДСПЛ определяется: другими генетическими"структурами; [123]. Сравнение ! экспрессии , и структурной организации основных детерминант вирулентности у штаммов разного происхождения чумного микроба й наиболее, близкой; эволюционной ветви штаммов псевдотуберкулезного микроба может внести ясность в вопрос о том, какие- эволюционные , изменения детерминант способствовали; трансформации из сапрофитного паразита в облигатный.

Настоящая-i работа посвящена, изучению полиморфизма сегмента hms (YP01937 - YP01967 - обозначение, дано по хромосоме Y pestis С092) области пигментации патогенных иерсиниШ (одной; из основных детерминант; . вирулентности) у штаммов. Yersinia, pestis и Yersinia pseudotuberculosis, циркулирующих на:территории России, стран СНГ и Монголии.

Для работы были: отобраны иохарактеризованыпоосновным признакам, ассоциированным, с вирулентностью и детерминируемым; областью пигментации' и плазмидой кальцийзависимости,. 47 штаммов чумного и 68 штаммов псевдотуберкулезного микробов: Выборка; штаммов чумного микроба включает штаммы пяти подвидов и таласской группы. Штаммы псевдотуберкулезного микроба, использованные в работе; практически не были-охарактеризованы до настоящего- момента. Самая многочисленная, группа выборки из 28 штаммов относится к 01 серотипу. Это наиболее близкая? к возбудителю чумы эволюционная; ветвь ■ псевдотуберкулезного микроба. Следующая большая группа представлена шестнадцатью «бадхызскими» штаммами ОЗ серотипа, которые по-некоторым признакам проявляют большое сходство с возбудителем чумы. Довольно- большая группа штаммов (16), серотип которых не определен, дополняет основную группу штаммов по "географическим регионам, времени и источнику выделения. Три штамма псевдотуберкулезного микроба, выделенные в городе Иркутске интересны тем, что выделены из крови человека (И-199, 02 серотип), от блохи (И-406, серотип не определен) и из комара (И-270, Ol серотип). Источники выделения, свидетельствуют о том, что данные штаммы вызывали генерализованный инфекционный процесс. Мы надеялись выявить большее сходство основных детерминант вирулентности этих штаммов псевдотуберкулезного микроба с детерминантами чумного микроба, чем у других штаммов псевдотуберкулезного микроба.

Изучение фенотипа, плазмидного состава" и ПЦР — анализ hms оперона и ybt региона показали, что основные генетические детерминанты вирулентности - гены области пигментации и плазмида кальцийзависимости у штаммов чумного микроба- проявляют более высокую степень стабильности, чем у штаммов^ псевдотуберкулезного микроба. Среди. 47 исследованных штаммов чумного микроба выявлено-только' 15% атипичных: апигментированных, либо лишенных плазмид pFra или pGad. Штаммы с полноценным набором детерминант вирулентности, обладали соответствующим фенотипом.

RecA зависимые мутации, приводящие к делеции области .пигментации и одновременной утрате Hms и Psn признаков, у штаммов чумного микроба

О с происходят с частотой 1(Г-10 . Такой тип мутаций мы наблюдали у 19'из 24 исследованных штаммов чумного микроба основного подвида. Ранее аналогичные результаты по частоте мутаций на Y. pestis 231 (708) штамме основного подвида из Аксайского высокогорного очага были получены И.В. Зудиной- (2000) [33]. Это первый тип Hms мутаций, охарактеризованный у возбудителя-чумы биовара medievalis [125, 137]. RecA независимый тип Hms мутаций происходит с частой в сорок раз меньшей у штаммов данного биовара и, обычно не сопровождается утратой Psn признака [137]. Изучение Hms фенотипа у штаммов чумного микроба, циркулирующих, на территории России, стран СНГ и Монголии показало, что не все штаммы основного подвида утрачивают признак пигментации с высокой частотой. Группа штаммов основного подвида из Кызылкумского пустынного очага и единичные штаммы из Приаральско-Каракумского пустынного и Прикаспийского СевероЗападного степного очагов образуют Hms мутанты с частотой 10" . Впервые низкую частоту Hms мутаций и реверсию этого признака с такой же частотой у штаммов основного подвида описал Мартиневский И.Л. с соавт. (1978) и подтвердил данный феномен Кутырев В.В. (1992) [47, 52]. Но в этих работах не была установлена причина низкой частоты Hms мутаций у штаммов* Кызылкумского пустынного очага. Такая же частота Hms мутаций проявляется у штаммов чумного микроба всех неосновных подвидов и таласской группы. В нашей работе представлены доказательства, что у всех штаммов с частотой Hms мутаций 10"7как основного, так и неосновных подвидов отсутствует один из IS 100 элементов, фланкирующих область пигментации. RecA зависимые делеции области пигментации возникают только при наличии двух IS 100 элементов, обеспечивающих процесс рекомбинации, поэтому штаммы, не имеющие одного из этих IS 100 элементов, лишены возможности* проявлять такой тип мутаций. У большинства1 штаммов^ псевдотуберкулезного микроба IS 100, ограничивающий hms сегмент также отсутствует и делеций области пигментации у них не происходит, что согласуется с результатами Buchrieser С. с соавторами (1998) [103]. Однако штаммы псевдотуберкулезного микроба,

1 О утрачивают Hms признак с частотой от 10" до 10" . Более того, даже штаммы Y. pseudotuberculosis, способные к сорбции кислых красителей проявляют этот признак неодинаково и во всех случаях хуже, чем штаммы чумного микроба. Большая часть штаммов псевдотуберкулезного микроба отчетливо проявляет этот признак только на модифицированной нами среде Hmsdpstbc. Многие штаммы псевдотуберкулезного микроба были лишены этого признака при проверке высевов лиофилизированных музейных культур. Экспериментальные результаты свидетельствуют о том, что утрата признака пигментации у штаммов псевдотуберкулезного микроба не связана с крупными делециями или вставками. Hare and McDonough (1999) [137], также говорят о неидентифицированнь1х небольших по протяженности или точковых мутациях во всех генах Hms оперона, характерных для возбудителя псевдотуберкулеза.

Признак чувствительности к пестицину штаммы кавказского подвида в. наших экспериментах утрачивали с частотой 10"7 - 10"9. Штаммы- других подвидов по этому признаку не. тестировались, так как: содержали плазмиду пестициногенности и были резистентны, к пестицину. Наши- данные по частоте Psn мутаций хорошо согласуются с данными Зудиной,- полученными для единичных представителей штаммов: чумного микроба разных, подвидов; и результами Hare and: McDonough, 1999 [137], полученными на штамме'биовара medievalis. Поэтому мы не проводили эксперименты по элиминации1 плазмиды пестициногенности из?, штаммов; представленных в данной работе. Мы показали, что штаммы псевдотуберкулезного микроба утрачивают признак • гчувствительности к пестицину с. частотой Г0: - 107 . Staggs T.M:', Perry R.E)t . ' (1992).; BuchrieserG. с соавторами (1998) и Martins C.H.G. с соавторами; (200,7)' i .■•;' считают, что полноценный, остров патогенности присутствует только у штаммов 01 серотипа [103, 160, 197]. У штаммов ОЗ серотипа. jyZtf 'регион

I лишен фрагмента около 9 т.п.н., включающего гены ybtE, psn и IS 100 элемента, а штаммы ©2, 04 и. Об серотипов» вообще не содержат остров высокой патогенности. Нами, установлено, что штаммы как О Г, так и ОЗ серотипов {; содержат остров высокой патогенности. Но штаммы псевдотуберкулезного

I микроба 01 серотипа- легко утрачивают ybt регион, а с ним* и; признак чувствительности к пестицину, а у штаммов; ОЗ серотипа делетирует только; | часть региона;, захватывающая psn ген (вероятно, описанные; выше делеции 9 t т.п.н.). То; что зарубежные исследователи не обнаружили штаммы ОЗ: серотипа с полноценным островом патогенности, говорит о высокой частоте: возникновения 9 т.п.н. делеций1 в; этом регионе: По нашим данным ; штаммы обоих серотипов могут утрачивать.признак чувствительности к пестицину еще f и в результате неидентифицированных точечных или небольших мутаций. У

I двух исследованных нами штаммов псевдотуберкулезного микроба 02 и Об р. • ' . ■ • * серотипов остров высокой патогенности отсутствовал. Но, в связи с малым количеством наблюдений, это не может служить подтверждением мнения об отсутствии острова у всех штаммов этих серотипов. Сочетанная утрата Hms и Psn признаков у штаммов псевдотуберкулезного микроба происходит с частотой - околоЮ"5 в результате независимых неидентифицированных мутаций в области hms оперона и ybt региона.

Стабильность второго обязательного фактора вирулентности патогенных иерсиний - плазмиды кальцийзависимости также оказалась выше у штаммов чумного микроба, чем у штаммов псевдотуберкулезного микроба. Лишь единичные штаммы чумного микроба, присутствующие в выборке были лишены плазмиды pCad. Другая картина наблюдалась при исследовании высевов лиофилизированных культур штаммов псевдотуберкулезного микроба. Все штаммы псевдотуберкулезного микроба по паспортным данным были выделены от больных людей, грызунов или переносчиков, а, значит, изначально обладали вирулентными свойствами. Но более половины из них при скрининге не содержали плазмиду pCad, а 37 % штаммов, содержащих плазмиду, утратили признак кальцийзависимости.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что в процессе эволюции патогенных иерсиний у штаммов чумного микроба произошла стабилизация основных детерминант вирулентности: генов области пигментации и плазмиды pCad. Стабилизация детерминант вирулентности, несомненно, способствовала увеличению патогенных свойств чумного микроба и, вероятно, оказалась важной при освоении новых экологических ниш. Стабилизация острова высокой патогенности и плазмиды кальцийзависимости обеспечивает лучшую приживаемость микроба в организме теплокровного хозяина и более эффективное уклонение от защитных сил макроорганизма, а стабилизация hms оперона и признака пигментации - эффективное блокирование преджелудка блох.

Поиск- структурных различий /шЮ-УР01950 региона области пигментации у штаммов* чумного микроба разного происхождения и вирулентных штаммов псевдотуберкулезного микроба выявил четыре вариабельные области, хорошо различающиеся при ПЦР скрининге. Три области расположены в межгенных пространствах и одна - в области гена порина (УР01967). Вариабельность областей межгенных пространств, вероятно, связана с расположенными в них локусами вариабельных тандемных повторов. Изучение нуклеотидных последовательностей, депонированных в ОепВапк, показало, что в регионе /шЮ — УР01967 область 1 включает локус тандемных повторов (СААОТААТ)п, область 2 включает локус тандемных повторов (АТАОАААО)п (ОепВапк - АЬ590842, ВисМевег С. ег а1., 1999) [105]. В агарозном геле ампликоны штаммов чумного микроба разных подвидов и псевдотуберкулезного микроба, образованные с праймерами на эти области имеют различную подвижность. Сравнение депонированных в ОепВапк нуклеотидных последовательностей штаммов чумного микроба разных биоваров и псевдотуберкулезного микроба- выявило межбиоварную вариабельность аллелей областей тандемных повторов. Перспективность использования этих областей в качестве ДНК мишеней при разработке системы; типирования штаммов чумного микроба методом мультилокусного секвенирования не вызывает сомнений. Альтернативно может быть разработана ПЦР для идентификации и внутривидового типирования штаммов чумного микроба. Таким образом, нами впервые выявлена область, локализованная между генами /шЮ и УР01967 и проявляющая для чумного микроба вариабельность на видовом и подвидовом уровнях.

Вариабельная область 4 расположена в межгенном пространстве УР01960 (ген гипотетического мембранного белка) - УР01961 (ген регулятор семейства в^Я) и содержит локус тандемных повторов (АТСААС). Дифференциирующие способности этой области оказались ниже, чем у первых двух, но могут дополнять их в системе мультилокусного секвенирования.

Третья вариабельная- область связана с геном; порина УРО 1967. Ранее было- показано,, что в штаммах биоваров апйциа, тесЦеуаНз и опе^аНБ ген порина; инактивирован 18100 элементом. У штаммов биовара писгоШб- ген порина;находится в интактном состоянии. По многим; признакам штаммы этого1 биовара близки штаммам; неосновных подвидов: и таласской; группе; В наших экспериментах показано; что у штаммов всех неосновных подвидов и таласской группы ген порина также; интактен. У подавляющего большинства-, штаммов основного подвида, как и у штаммов: трех биоваров ген порина; нарушен 18100 элементом. Но нами впервые, обнаружены штаммы; основного подвида из Кызылкумского пустынного очага и единичные штаммы из Приаральско-Каракумского пустынного и Прикаспийского Северо-Западного степного, очагов с интактным теном* порина. До/ сих пор считалось, что все штаммы псевдотуберкулезного микроба: несут интактный ген порина. [115]. Мы установили, что штаммы; псевдотуберкулезного * микроба; ©1г серотипа, как; правило; содержат интактный» ген; порина; но существуют штаммы; псевдотуберкулезного микроба ©1 серотипа с геном; порина;. нарушенным; 18100 элементом. У штаммов псевдотуберкулезного микроба ОЗ серотипа; концевая часть. области пигментации; штаммов- не содержит последовательностей гена порина и гена; сукцинилглютаматдесукцинилазы; агиЕ аргининового оперона. ' ' . .

Определение нуклеотидных последовательностей гена; порина у типичных штаммов пяти подвидов, таласской группы чумного микроба и шести штаммов псевдотуберкулезного микроба 01 серотипа, показало, что штаммы всех неосновных подвидов,, таласской? группы, штамм; основного подвида из; Кызылкумского пустынного; очага и штамм: псевдотуберкулезного микроба с интактным геном порина; несут идентичную функционально активную; открытую рамку считывания гена порина. Предполагаемый: полипептидный продукт состоит из 360 ак. Рассчитанная молекулярная масса порина - 39561 Да: Это кислый белок с рГ- 5,53. Вторичная структура порина характерна для: белков этого класса и содержит множество тяжей, образующих бета — складчатую структуру.

У штаммов псевдотуберкулезного микроба с трункированным геном порина встраивание IS 100 элемента произошло в сайт интеграции AGAAAG (у чумного микроба в сайт ТСТСТ), в ориентации обратной по сравнению с IS 100, ограничивающим ybt регион. Выявление штаммов псевдотуберкулезного микроба с трункированным геном порина свидетельствует о том, что образование псевдогенов, характерных для чумного микроба, свойственно и псевдотуберкулезному микробу, с другой стороны не у всех штаммов чумного микроба эти гены нарушены. Поэтому роль-псевдогенов в становлении Y. pestis как вида, может оказаться несколько преувеличенной. Скорее образование псевдогенов отражает процесс адаптации штаммов патогенных иерсиний к определенному комплексу эколого-географических и климатических факторов.

Впервые нами определена нуклеотидная последовательность hms оперона (7651 п.н.) у штаммов чумного микроба основного подвида (Y. pestis 231 (708), Y. pestis КМ803 (А-1822)), кавказского подвида (Г. pestis 1146), алтайского подвида (Y. pestis КМ683 (И-2359)), улэгейского подвида (Y. pestis И-3069), гиссарского подвида (Y. pestis А-1249) и штамма из Таласского высокогорного очага - Y. pestis А-1802 (21/10). Blast - сравнение hms оперона показало, что hms оперон чумного микроба отличается единичными нуклеотидными заменами во всех генах от hms оперона псевдотуберкулезного микроба, при этом почти все замены не приводят к замене аминокислоты. Поэтому не могут отражаться на функции кодируемого белка. Структурные различия hms оперона штаммов чумного микроба разного происхождения минимальны, но во всех случаях выражаются в замене одной нейтральной аминокислоты на другую. Однако, и эти замены аминокислот не приводят к нарушению или изменению способности чумного микроба сорбировать кислые красители. На сегодняшний день вопрос о том, что приводит к слабой пигментсорбирующей способности у штаммов псевдотуберкулезного микроба и высокой частоте мутаций, приводящих к утрате Hms фенотипа и отсутствию способности блокировать преджелудок блох, остается- открытым.

На основе полученных новых теоретических знаний нами определены вариабельные области hutG—YP01950 региона, которые можно использовать при создании системы типирования штаммов чумного микроба методом мультилокусного секвенирования, а одна из вариабельных областей перспективна для ПЦР1типированияг штаммов чумного микроба. Кроме этого, разработана мультилокусная ПНР для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов чумного5 микроба по двум основным детерминантам вирулентности.

С помощью разработанной ПЦР, выявляющей делецию области пигментации, впервые получено неоспоримое доказательство делетирования области пигментации у вакцинного штамма Y. pestis ЕV линии НИИЭГ и его лабораторных вариантов, а, следовательно, невозможности спонтанной реверсии вирулентных свойств. Специфичность ампликона, образованного праймерами, фланкирующими область пигментации, подтверждена* определением его нуклеотидной последовательности. Кроме того, нами исследован-один из штаммов, заявленных в качестве вирулентных ревертантов-вакцинного штамма EV линии НИИЭГ. По фенотипическим признакам (способность ферментировать глицерин, способность редуцировать нитраты) вирулентный штамм EV НИИЭГ 131 не может быть отнесен к биовару orientalis. Среди всех вариантов вакцинных штаммов EV только этот штамм обладал способностями ферментировать глицерин и редуцировать нитраты. Дополнительно разные варианты лабораторных штаммов EV, включая EV НИИЭГ 131, исследованы праймерами на вариабельную область с подвидовой дифференцирующей способностью (HSI75-HSI78). То, что штамм EV НИИЭГ 131 отличался по размеру ото всех вариантов авирулентных штаммов EV, также свидетельствует о разном происхождении авирулентных вакцинных штаммов EV и вирулентного штамма EV НИИЭГ 131. Вероятно, сообщения о выделении вирулентных ревертантах вакцинного штамма EV линии НИИЭГ вызваны контаминацией вакцинных штаммов, использованных экспериментаторами, природными штаммами другого происхождения.

Таким образом, нами показано, что в процессе эволюции патогенных иерсиний произошла стабилизация генов основных детерминант вирулентности — области пигментации и плазмиды кальцийзависимости, которая нашла выражение в снижении частоты мутаций по признакам, ассоциированным с детерминантами вирулентности, частоты элиминации острова высокой патогенности и pCad и образования нарушений в их структурной организации. Выявлены вариабельные для штаммов псевдотуберкулезного и чумного микроба разного происхождения области сегмента пигментации. Показана перспективность их использования для создания молекулярно-генетических типирующих систем. Разработаны варианты ПЦР для идентификации вирулентных и авирулентных штаммов чумного микроба разного происхождения. Доказана безопасность применения штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ для вакцинации людей.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Сухоносов, Илья Юрьевич, 2009 год

1. Апарин Г.П., Ролубинский: Е.П. Микробиология чумы: Руководство. -Иркутск Текст. / Изд во Иркут. ун - та, 1989. — 90 с.

2. Балахонов С.В. Результаты скрининга плазмид штаммов Yersinia pestis из разных очагов центрально-азиатской зоны природной очаговости чумы Текст. // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1989; - №4. - С: 39 — 42.

3. Балахонов C.B., Воронова Г.А.,. Базанова Л.П., Шестопалов М.Ю. Обнаружение Y pestis в блохах методом . направленной ферментативной амплификации генов плазмидной локализации Текст. // Chin. J. Contr. Endein. Dis: 1999. - V. 14, Spec. - P. 185-187.

4. Балахонов C.B., Воронова Г. А., Шестопалов; М.Ю., Базанова Л.П.,Токмакова Е.Г. К использованию полимеразной цепной; реакции длядетекции чумного микроба в блохах Текст. // Мед. паразитол. ипаразитар. бол. 2000.-N3'.-С. 29-31.

5. Бибикова\ В.А., Классовский JI.H., Мельников И.Ф. К вопросу об эпизоотологическом значении штаммов возбудителя чумы с ослабленной вирулентностью Текст. // Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1968. - Вып. 4.-С. 180-186.

6. Быков JI.T., Пошевина Г.О., Красникова JI.B. Характеристика штаммов микроба чумы из Юго-Восточных Кызылкумов Текст. // Матер. VII научг. конфер: противочумн: учрежд. Ср. Азии и Казахст. Алма-Ата, 1971. - С. 4 - 5.

7. Вершинина Т.И. О популяционной изменчивости возбудителя чумы из природных очагов Горного Алтая и Северо-Западной Монголии Текст. / Автореф: дис. канд. мед. наук. — Саратов, 1986: 16 с.

8. Воротников^ И.А., Толмачева JI.P. К характеристике штаммов чумного микроба, изолированных в период оздоровления Тянь-Шаньского природного очага Текст. // Актуал. вопр. эпиднадзора в природных очагах чумы. -Ставрополь, 1985. С. 174 -'176.

9. Гаранина С.Б., Самойлова JI.B., Подсвиров A.B., Санджиев В.Б.-Х., Величко JI.H:, Топорков В.П., Куличенко А.Н. Выявление некультивируемых форм возбудителя Y.pestis в полевом материале, собранном в Прикаспийском

10. Головко Э.Н., Пейсахис Л!А., Дерлятко К.И., Юсупов А.К., Сагимбеков У.А. Характеристика штаммов микроба' чумы, выделенных в Гиссаре летом 1970 года Текст. // Матер. VII науч. конфер. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. Алма-Ата, 1971. - С. 6 - 7.

11. Головко Э.Н., Гуляко Л.Ф., Дегтярева В.И. Некоторые особенности штаммов возбудителя чумы, выделенных в Гиссарском очаге в 1970 1987 г.г. Текст.4// Тез. XIII конфер. противочумн: учрежд. Ср. Азии и Казахст. — Алма-Ата, 1990.-С. 62-65.

12. Гольдфарб Л.М. Некоторые особенности чувствительных к пестицину I культур- возбудителей чумы и- псевдотуберкулеза и их- диагностическое значение Текст. // Пробл. особо опасных инф. 1968. - №1. - С. 86 - 88.

13. Гольдфарб Л.М., Дальвадянц С.М., Земцова И:Н., Пономарев И:Г. Некоторые особенности культур, выделенных на территории Северо-Западного Прикаспия в 1972 г. Текст. // Профилакт. особо опасных инф. Саратов, 1977. -Вып. 3. - С. 46-50.

14. Гольдфарб Л.М., Бурлаченко Т.А., Седина- С.Г. и др. Текст. // Профилакт. Особо опасных инфекций., Тез. докл. Всесоюзной научн.-практю. конф. Ставрополь, 1983.-С. 19-20

15. Трязнова Н.С, Субботина H.A. Текст. / Антибиотики и химиотерапия 1989. Т. 34. №12. . , .; ' . ; ;

16. Джафаров НИ., ТОндин Е.В. Характеристика' штаммов чумного микроба1 из ТерскогСунженского природного, очага чумы Текст. // Особо опасных инф; наКавказе;-Ставрополь, 1974. Вып.Г. -С. 36 - 37. ■'-.

17. Елкин- Ю.М., Михайлова P.C., Розанова Г.Н;, Тарасова В.Е., Лалазарова HiF., Ерамотина Л-И:, ОсиповаС.П;, Быкова:31А., Калмыкова Л;И. Возбудитель чумы очага Центрального Кавказа-Текст. // Пробл. особо опасных инф. 1977. - Вып. 3 (55). - С. 9 -12: ■ : •

18. Захаров А.И. Изучение биологии возбудителя; чумы из-Урало-Эмбенского автономного очага Текст.: Дис. канд. мед. наук. Саратов, 1988. - 163 с.

19. Зудина И.В; Сравнительная характеристика стабильности хромосомной, области пигментации и её отдельных регионов у штаммов пяти подвидов возбудителя чумы Текст.:;Дис.канд. биолог, наук. Саратов, 2000. - 138 с.

20. Зундуй Чимит, Апарин Г.П., Головачева В.Я., Тимофеева Л.А., Васюхина Л.В. О биологических свойствах культур чумного микроба^, выделенных в МНР Текст. // Особо опасные инф. в Сибири и на Д. Востоке.- Кызыл, 1966.- Вып. 7.-С. 103- 106.

21. Инокентьева Т.И;, Тарасова В.Е. Изменение вирулентности чумного-микроба при пассировании на монгольских пищухах Текст. // Изв. Иркутск, н.-и. противочумн. ин-та Сибири и ДВ, Иркутск 1968. - 27 - С. 439 - 450:

22. Кокушкин A.M. Социальные и биологические аспекты; эпидемии чумы Текст.: Дис:доктора мед. наук —Саратов, 1995 —392 с.

23. Кошенов У .А. Свойства штаммов; возбудителя чумы, выделенных в Зааральском автономном очаге в 1982 1983 гг. Текст. // XII Межреспубл. науч. - практ. конфер., противочумн. учрежд. Ср. Азии« и; Казахст.,— Алма-Ата; f 1985.-С. 18-20. : •';•'■:' " ,

24. Кошенов У.А. О свойствах возбудителя; чумы из Зааральского автономного 04ara:TeKCT.i"// Тез. XIII конфер. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. Алма-Ата, 19901-С. 72 -74. ' . ь'-.

25. Куличенко А.Н., 11оркина О.В., Гинцбург А.Л., Попов Ю.А., Дроздов И.Г. Оптимизация способа детекции штаммов чумного микроба при; помощи полимеразной цепной реакцией Текст. // Генетика 1994 - т.ЗО, №2, - с 167171 •-"''' Л 183

26. Кутырев BIB., Проценко O.A. Классификация и молекулярно-генстичсскис исследования Yersinia pestis Текст. // Пробл. особо опасных инф. -Саратов, 1989.- С. 11-22.

27. Кутырев В.В. Генетический анализ факторов вирулентности возбудителя чумы; Текст. ::Дис. докт. мед: наук. Саратов, 1992. - 332 с.'

28. Логачев Л.И., Михайлов Е.П. К характеристике вирулентности штаммов чумного микроба, выделенных в Горном Алтае Текст. // Ооврёмен. аспекты профилакт. зоонозных инф. Иркутск, 1984. - Ч. 2. - С. 50.

29. Мартиневский И.Л. Пигментсорбция у возбудителя чумы и ее роль в проявлении вирулентности. Обзор. Среднеаз. ПЧИ. Текст. Алма-Ата, 1988. -26 с. Деп. в ВИНИТИ 13.10.88. №7376-В88.

30. Мартиневский И.Л., Степанов В.М., Кенжебаев А.Я. Таксономия, мутация и генетика патогенности чумного и родственных ему микробов. Текст. — Нукус: Каракалпакастан, 1990. — С. 89-91.

31. Новикова О. Д. Текст. Автореф. дис. .канд. биол. наук.— Владивосток. 1986.

32. Норкина О.В., Куличенко А.Н., Величко А.Н., Попов Ю.А., Кокушкин A.M., Дроздов И.Г. Обнаружение возбудителя чумы в блохах с использованием полимеразной цепной реакции Текст. // Пробл. ООИ Саратов - 1994 - №4 -158-164 с.

33. Осадчая Л.М., Мисалева О.С., Алексеева О.Е., Егорова Р.П., Чернова В:А. К характеристике возбудителя чумы из Северного Приаралья Текст. // Матер. VII науч. конфер. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. Алма-Ата, 1971. -С. 39-40.

34. Петров В.Н. Физиология и патология обмена железа Текст. Л.: Наука, 1982.-224 с.

35. Портнягина О.Ю., Новикова О.Д., Вострикова О.П., Хоменко В.А., Соловьева Т.Ф. Бактериальные порииы как перспективные антигены для диагностики и- вакцинопрофилактики инфекционных заболеваний Текст. // Вестник ДВО РАН. 2004. № 3 С. 35-44.

36. Сагимбеков У.А., Рапопорт Л.П. Об особенностях штаммов возбудителя чумы, выделенных в различных популяциях больших песчанок в Муюнкумах Текст. // Микробиол., генетика И;иммунол. чумы и холеры. Саратов; 1983'.- С. 11-13.

37. Сагимбеков У.А., Пошевина Г.О., Рапопорт Л.П. О соотношении Р+ и Р" клеток в штаммах чумного микроба в разные фазы эпизоотического процесса

38. Текст. // XII Межреспубл. науч. практ. конфер. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. - Алма-Ата, 1985. - С. 35 - 37.

39. Слудский A.A., К.И. Дерлятко, Э.Н: Головко, B.C. Агеев Гиссарский природный очаг чумы Текст. // Под редакцией доктора биологических наук A.A. Слудского, Саратов: Издательство Саратовского Университета, 2003. -248 с. :

40. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Основы экспериментальной медицинской бактериологии: Текст. — М.: Медгиз. 1958. - 348 с.

41. Тимофеева Л.А., Апарин Г.П. Биологические свойства. штаммов чумного микроба, выделенных в 1961 1966 г.г. в чумных очагах Сибири и Монголии Текст.//Пробл. особо опасн: инф.-1969. - №4 . - С. 13 - 18.

42. Тимофеева JI.A., Жамьян Сурен, Сотникова А.Н., Логачев А.И., Саран Мандалин Биологические свойства штаммов чумного микроба, выделенных в Монголии в 1969 1971 гг. Текст. // Пробл. особо опасных инф. - 1974. - №3 (37). - С. 37 - 42.

43. Тимченко Н.Ф. Патогенетическое значение психрофильности Yersinia pseudotuberculosis Текст.: Автореф. дис. . д-ра мед. наук. Владивосток, 1989.-39с.

44. Филиппов A.A., Солодовников Н.С., Куклева Л.М., Проценко O.A. Изучение плазмидного состава штаммов возбудителя чумы из разных природных очагов Текст. // ЖМЭИ. 1992. - №3 - С. 10 - 13.

45. Филиппов A.A. Мобильные генетические элементы патогенных иерсиний Текст.: Дис. докт. мед. наук. Саратов, 2001. - 370 с.

46. Фурсов В.В., Попов Ю.А. Исследование штаммов микроба чумы полевочьей разновидности методом электрофореза в агарозном геле Текст. // Профилакт. природноочаговых инф. Ставрополь, 1983. — С. 326 — 327.

47. Хайдаров Т.Б., Хакимов М.М., Мартиневский И.Л. О первых случаях выделения штаммов чумного микроба в Каршинской степи и их свойствах Текст. // Эпизоотол. и профилакт. природноочаг. инф. — Саратов, 1982. — С. 37 -39.

48. Aasa R., Malmstrom B.G., Saltman P., Vanngard J. Text. // Biochim. Biophys. Acta. 1963. - V.75. -P. 203-222.

49. Achtman, M., K. Zurth, G. Morelli, G. Torrea, A. Guiyoule, and E. Carniel. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis Text. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1999 - V.96 - P. 1404314048.

50. Bearden S.W., Fetherston- J:D., Perry R.D. Genetic organization of the yersiniabactin biosynthetic region and construction- of avirulent mutants, in Yersinia pestis Text. // Infect. Immun. V. 65, № 5. - 1997. - P. 1659 - 1668.

51. Bearden S.W., Staggs T.M., Perry RD. An ABC transporter system of Y. pestis allows utilization of chelated iron by Escherichia coli SAB 11 Text. // J.Bacteriol. 1998. - Mar; 180(5): 1135-1147.

52. Bearden- S.W., Perry R.D. The Yfe system of Yersinia pestis transports iron and manganese and is required for full virulence of plague Text. // Mol. Microbiol. -1999. V. 32, N 2. - P. 403-414.

53. Belgrader P., Benett W., Hadley D., Long G., Mariella R Jr., Milanovich F., Nasarabadi S., Nelson W., Richards J., Stratton P! Rapid" pathogen detection using a microchip PCR array instrument // Clin. Chem. 1998. - V. 44, N 10. - P. 2191-2194.

54. Brubaker R.R: Mutation rate to nonpigmentation in P. pestis Text. // J. Bacteriol: 1969. - V. 98, N 3. - P. 1404 - 1406.

55. Buchrieser C., Brosch R., Bach S., Guiyoule A., Carniel- E. The high-pathogenicity island of Yersinia pseudotuberculosis can be1 insertedt into any of the three chromosomal1 asn /RNA genes Text.:// Mol; Microbiol. 1998. - V. 30. -P; 965-978.■ 190

56. Bullen J.J., Rogers I-I.J;, Griffiths E. Role of iron in bacterial infections: Text. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1978. - V. 80. - P. 1 - 35.

57. Bullen J.J. The significance of iron in infection Text. // Rev. Infect. Dis. -1981.-V.3.-P. 1127-1138.

58. Burrows T.W., Bacon- G;A. The basis of virulence in: Pasteurellaipestis; an* antigen determining virulence Text. // Brit. J. Exp. Pathol. 1956. - V. 37. - P. 481-■493-. • "

59. Carniel E., Mazigh D., Mollaret H.H. Expression of iron-regulated proteins in Гегаш/а species and their relation to virulence Text. // Infect. Immun. 1987. — V. 55.-P. 277-280;

60. Carniel E., Guiyoule A., Prentice M. Characterization of a large chromosomal . «high-pathogenicity island» in biotype 1В Yersinia enterocolitica Text. // J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - P. 6743 - 6751. ;

61. Darby;C,:Ji W.,Hsu, N; Ghorij.S^Falkow- Plague bacteria biofïlmv blocks fbodv intake Text. // Nature 2002 : Vol; 417 - P: 243 .

62. Darby C Uniquely insidious: Yersinia pestis biofilms Text., // Trends« Microbiol. 2008.

63. Efremenko V.l., Tyumentseva I.S., Song Zhizhong, Afanasiev E.N. Combined application of magnetoimmunosorbents and PGR a new method for the indication' of Yersinia pestis Text.,// Chin. J. Contr. Endem. Dis. 1999. - V. 14, Spec. - P. 72.

64. Engelthaler D.M., Gage K.Ü., Montenieri J.A;,. Chu* M., Carter L.G. PCR detection of yersinia pestis in fleas: comparison; with mouse inoculation Text. // J; Clin. Microbiol. 1999. - V. 37, N 6. - P.1980-1984.

65. Ferber D.M., Brubaker R.R. Plasmids in Yersinia pestis Text. // Infect. Immun. 1981. - V. 31. - P. 839 - 841.

66. Fetherston J.D:, Perry R.D. The pigmentation locus of Yersinia pestis KIM6+ is flanked by an insertion sequence and includes the structural genes for pesticin sensitivity and HMWP2 Text.// Mol. Microbiol. 1994. - V. 13, №4. - P. 697 - 708.

67. Fetherston J.D., Lillard J.W., Jr., Perry R.D. Analisis of the pesticin receptor from Yersinia pestis: role in iron-deficient growth and, possible regulation by its siderophore Text. // J. Bacteriol. 1995. - V. 177. - P. 1824 - 1833.

68. Fetherston J.D., Bearden S.W., Perry R.D: YbtA, an AraC type regulator of the Yersinia pestis pesticin/yersiniabactin receptor Text. // Mol. Microbiol.- 1996. V. 22.-P. 315-325.

69. Fetherston J.D., Bertolino V.J., Perry R.D. YbtP and YbtQ: two ABC transporters required for iron uptake in Yersinia pestis Text. // Mol. Microbiol. -1999. V. 32, N 2. - P. 289-299.

70. Filippov A.A., Solodovnikov N.S., Kookleva L.M., Protsenko O.A. Plasmid content in Yersinia pestis strains of different origin Text. // FEMS Microbiol. Lett. -1990.-V. 67.-P. 45-48.

71. Fredericq P. Collicins Text. //Ann. Rev. Microbiol. 1957. -V 11. - P. 7-22

72. Gemski P., Lazere J.R., Casey T. Plasmid associated with pathogenicity and calcium dependency Yersinia enterocolitica Text. //Infect. Immun. 1980. - V. 27. -P. 682-685.

73. Gong S., Bearden S.W., Geoffroy V.A., Fetherston J.D:, Perry R.D. Characterization of the Yersinia pestis Yfu ABC inorganic iron transport system Text. // Infect. Immun. 2001. - V. 69, N 5. - P. 2829-2837.

74. Haag H., Hanke K., Drechsel H., Stojiljkovic I., Jung G., Zähner H. Purification of yersiniabactin: a siderophore and possible virulence factor of Yersinia enterocolitica Text. // Gen. Microbiol. 1993. - V.139. - P! 2159 - 2165.

75. Hacker J., Blum-Oehler G., Mühldorfer I., Tschäpe H. Pathogenicity islands of virulent bacteria: structure, function and impact on microbial evolution Text. // Mol. Microbiol:- 1997.- V. 23.-P. 1089 1097.

76. Hare J.M., McDonough K.A. High-frequency RecA-dependent and*4 -independent mechanisms of Congo red binding mutations in Yersinia pestis Text.// J. Bacteriol. 1999: - V. 181, N 16. - P. 4896-4904.

77. Heesemann J., Schubert S., Rakin A. Ecological aspects of evolutionary development of bacterial pathogens Text. // Nova Acta Leopoldina NF. 1999. - V. 78,№307.-P. 23 -38.

78. Higuchi K., Smith J1L. Studies on the nutrition and phisiology of Pasteurella pestis. VI. A different plating medium for estimation of the mutation rate to aviru-lence Text. // Ibid. 1961. - V. 81. -P. 605-608.

79. Hinnebush B.J., Perry R.D., Schwan T.G. Role of the hemin storage (hms) locus of Yersinia,pestis in the transmission of plague by fleas Text. // Science. — 1996. V. 273. -P: 367 - 370.

80. Hinnebusch B.J: Bubonic plague: a molecular genetic case history of the emergence of an infectious disease Text.'// J. Mol. Med. 1997. - Sep;75(9):645-652.

81. Hongwei Z. J. L. The detection of a sputum sample from a patient of plague pneumonia'with polymerase chain reaction (PCR) method Text. // Scient. J. 2000. -N8.-P. 191-193.

82. Hornung J.M., Jones H.A., Perry R.D. The hmu locus of Yersinia pestis is essential for utilization of free haemin and haem-protein complexes as iron sources Text. I I Mol. Microbiol. 1996. - V. 20. - P. 725 - 739.

83. Hu P.C., Brubaker R.R. Characterization of pesticin: separation of antibacterial activities Text. // J. Biol. Chemi- 1974. V. 249, № 15. - P: 4749 - 4753.

84. Iqbal S.S., Chambers J.P., Brubaker R.R., Goode M.T., Valdes J.J. Detection of Yersinia pestis using branched DNA Text. // Mol. Cell. Probes. 1999. - V. 13, N 4.-P. 315-320.

85. Jackson S., Burrows T.W. The virulence-enhancing effect of iron; on non-pigmented mutants of virulent strains of Pasteurella pestis Text. // Br. J. Exp. Pathol.- 1956.-V. 37.-P. 577- 583.

86. Kutyrev V.V., Filippov A.A., Oparina O.S., Protsenko O.A-. Analisis of Yersinia pestis chromosomal determinants Pgm+ and Psts associated with virulence Text. // Microb. Pathog. 1992. - V. 12. - P. 177 - 186.

87. Leal N.C., Almeida A.M. Diagnosis of plague and identification of virulence markers in Yersinia pestis by multiplex-PCR Text. // Rev. Inst. Med. Trop. Sao. Paulo. 1999. - V. 41, N6.-P! 339-342.

88. Lillard J.W., Fetherston J.D., Pedersen L., Pendrak., Perry R.D. Sequence and genetic analysis of the hemin storage (hms) system of Yersinia pestis Text. // Gene. 1997.-V. 193.-P. 13-21.

89. Lowe T., Sharefkin J., Yang Sh., Dieffenbach C.W. A computer program for selection of oligonucleotide primers for polymerase chain reaction Text. // Nucl. Acids Res. 1990.-V. 18.-P. 1157- 1161.

90. Lucier T.S., Fetherston J.D., Brubaker R.R., Perry R.D. Iron uptake and iron-repressible polypeptides in Yersinia pestis Text. // Infect. Immun. 1996. - V. 64. -P. 3023-3031.

91. Martins C.H.G, T.M. Bauab, C.Q.F. Leite; D.P! Falcao Ribotyping and virulence, markers of Yersinia pseudotuberculosis strains isolated from, animals, in Brazil Text. // Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 2007. - V.102(5) - P.587592 ' . • . ,

92. Neubauer H., Meyer Hi, Prior; J'., Aleksic'S.,.Hensel A., Splettstosser W. A combinatiomof: different polymerasexh^^identification^ of Yersiniarpiestisr Text. // J. Vet. Medí B; Infect. Dis. Vet. Public. Health. 2000. - V. 47, N 8. - P. 573-580: .

93. Norkina O.V., Kulichenko AN., Gintsburg A.L. et al; Development of a: diagnostic test for Yersinia:pestis by the polymerase chain reaction Text. // J'. Appl. Bacteriol. 1994,- V. 76. - P. 240-245. . , 4 . "

94. Pelludat C., Rakin A., Jacobi C.A., Schubert S., Heesemann J: The yersiniabactin biosynthetic gene cluster of Yersinia enterocolitica: organization and siderophore-dependent regulation. Text. // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 538 -546.

95. Pendrak M.L., Perry R.'D: Characterization of a hemin-storage locus of Yersinia pestis Text.;// Biol. Metals 1991. - V. 4. - P; 41 - 47.

96. Perry R.D., Straley S.G., Fetherston J.D., Rose D.J:, Gregor J:, Blattrier F.R; DNA sequencing and analysis of the low-Ca2+-response plasmid pCDl of Yersinia pestis KIM5 Text. // Infect. Immun; 1998. - V. 6, N 10. - P. 4611-4623. . '

97. Portnoy. D.A., Falkow S. Virulence-associated plasmids from Yersinia enterocolitica and Yersinia pestis Text. // J-. Bacterid. 1981. - V. 148. - P: 877 — 883:

98. Portnoy D.A:, Moseley S.L., Falkow S;. Characterization' of plasmids. and plasmid-associatedi determinants of Yersinia enterocolitica pathogenesis Text. // Infect. Immun. 1981. - V. 31. - P. 775-782.

99. Rakin A., Saken E., Harmsen D., Heesemann J. The pesticin receptor of Yersinia enterocolitica: a novel virulence factor with dual function Text. // Mol. Microbiol. 1994a. - V. 13. - P: 253 - 263.

100. Rakin A., Schubert S., Pelludat C., Brem D., Heesemann Jt The high-pathogenicity island of Yersiniae Text. // Pathogenicity islands and other mobile virulence elements. Amer. Soc. Microbiol., 1999. - P. 77 - 90.'

101. Rossi M.S., Feterston J.D., Letoffe S., Carniel E., Perry R.D., Ghigo J.M. Identification and characterization of hemophore-dependent heme acquisition system of Yersinia pestis Text. // Infect. Immun. 2001. - V. 69, N 11. - P. 6707-6717. •

102. Sanger F., Nicklen S., Goulson A.R. Text. //Proc. Natl. Acad:Sci. USA. -1977. Vol.74: -P.5463-5467.

103. Scarlato V., Arico B., Prugnola A., Rappuoli R. Sequential activation and enviromental regulation of virulence genes in Bordetella pertussis Text. // EMBO J.- 1991.-V. 10.-P. 3971 -3975.

104. Schubert S The Yersinia high-pathogenicity island (HPI): evolutionary and functional aspects Text. // Int J Med Microbiol 2004. - 294:83-94.

105. Sikkema D.J., Brubaker R.R. Resistance to pesticin, storage- of iron, and invasion of HeLa cells by Yersiniae Text. // Infect. Immun. 1987. - V.55. - P. 572 — 578.

106. Sikkema D.J., Brubaker R.R. Outer membrane peptides of Yersinia pestis mediating siderophore-independent assimilation of iron Text. // Biol. Metals. 1989.- V. 2.-P. 174-184.

107. Sodeinde O.A., Goguen J.D. Genetic analysis of the 9,5-kilobase virulence plasmid of Yersinia pestis Text. // Infect. Immun. 1988. - V. 56. - P. 2743 - 2748.

108. Song Y., Tong Z., Wang J., Wang I., Guo Z., et al. Complete genome sequence of Yersinia pestis strain 91001 an isolate avirulent of humans Text.'// DNA Res. — 2003.-V. 11.-P. 179- 197.••' " 200 .

109. Souza G, Abath F, Leal N, Farias A, Almeida A. Development and evaluation-of ä single tube nested PCR based approach (STNPCR) for the diagnosis of plague. Text. // Adv Exp Med Biol. 2007;603:351-9.

110. Staggs T.M., Perry R.D. Fur regulation in Yersinia species Text. // Mol. Microbiol. 1992. - V.6. - P. 2507 - 2516.

111. Stojiljkovicr Ii, Hantke^ R. Transport of haemim across the; ;cytoplasmic membrane: through a- heamin-specific peripiasmic binding-protein-dependent transport system in Yersinia enterocolitica. Text. // Mol. Microbiol: 1994. - V. 13. -P. 719-732.

112. Thompson J.M., Jones H.A., Perry R.D. Molecular characterization of the hemin uptake locus (hmu) from Yersinia pestis and analysis of hmu mutants for hemin and hemoprotein utilization Text. // Infect. Immun. 1999* - V. 67, N 8. - P. 3879-3892. \

113. Wu DY, Wallace RB. The ligation amplification reaction (LAR) -amplification of specific DNA sequences using: sequential rounds of template-dependent ligation Text. // Genomics. 1989 May;4(4):560-9.

114. Zharnikova I.V., Tyumentseva I.S., Afanasiev E.N. Development of magnetoimmunosorbent diagnosticums for the detection of Yersinia pestis using rapid methods Text. // Chin. J. Contr. Endem. Dis. 1999. - V. 14, Spec. - P. 73.

115. Zhou D., Qin L., Han Y., Qiu J., Chen Z., Li B., Song Y., Wang J., Guo Z., Zhai J., Du Z., Wang X., Yang R. Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis Text. // FEMS Microbiol. Lett. 2006. - V. 258, N 1. -P. 9-17.