Структурно-функциональная и генетическая характеристика V антигена Yersinia pestis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Светоч, Татьяна Эдуардовна

• Светоч, Татьяна Эдуардовна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Светоч, Татьяна Эдуардовна

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ,

ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Открытие V антигена, условия биосинтеза, выделение, очистка и физико-химические свойства

1.2 V Антиген как фактор патогености

1.2.1 Регуляторная функция V антигена

1.2.2 Иммуномодулирующая функция

1.2.3 Функция контроля транслокацииУор эффекторов

1.3 Генетическое разнообразие и трехмерная структура белка ЬсгУ

1.4 Иммуногенная активность V антигена

1.5 V антиген и вакцинопрофилактика чумы

1.6 Заключение по обзору литературы

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Штаммы микроорганизмов

2.2 Плазмиды

2.3 Лабораторные животные

2.4 Среды и условия культивирования

2.5 Секвенирование гена 1сгУ

2.6 Генно-инженерные манипуляции

2.6.1 Молекулярное клонирование гена 1сгУ

2.7 Аналитическая индукция синтеза V антигена в клетках штамма-продуцента

2.8 Выделение и очистка ЬсгУ

2.9 Изучение физико-химических свойств V антигена

2.10 Структурный анализ V антигена

2.11 Вестерн - б лот анализ V антигена

2.12 Иммуноферментный анализ

2.13 Изучение вирулентности штаммов Y. pestis с различными структурными вариантами V антигена

2.14 Изучение иммуногенной активности препаратов V антигена

Y. pestis с различной аминокислотной последовательностью

Глава 3 ПОЛИМОРФИЗМ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОВ IcrV И СООТВЕТСТВУЮЩИХ ИМ ПОЛИПЕПТИДОВ Y. pestis

3.1 Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей IcrV генов и кодируемых ими аминокислотных последовательностей белков

Y. pestis

3.2 Компьютерное моделирование трехмерной структуры различных вариантов V антигена Y. pestis

3.3 Влияние замены аминокислотных остатков на структуру LcrV

Y. pestis

3.4 Вирулентность штаммов Y. pestis с различными структурными вариантами V антигена

3.5 Обсуждение

Глава 4 КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ V АНТИГЕНА Y. pestis

4.1 Молекулярное клонирование IcrV тепа в Е. coli

4.2 Аналитическая индукция синтеза, выделение и очистка рекомби-нантного V антигена

4.3 Изучение некоторых физико-химических свойств V антигена

4.4 Обсуждение

Глава 5 ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ V

АНТИГЕНА Y. pestis С РАЗЛИЧНОЙ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ

5.1 Способность препаратов V антигена Y pestis с различной аминокислотной последовательностью индуцировать продукцию антител

5.2 Изучение протективной активности препаратов рекомбинантного V антигена Y.pestis с различной аминокислотной последовательностью

5.3 Обсуждение

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ПРИЛОЖЕНИЯ

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

а.о. аминокислотный остаток

БСА бычий сывороточный альбумин

ФБУН ГНЦ Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный

ПМБ научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии

ДСН додецилсульфат натрия

ИИ индекс иммунитета - отношение LD50 вирулентного штамма

для иммунизированных к LD5o для интактных животных

ИФА иммуноферментный анализ

ИПТГ изопропилтиогалактопиранозид

кДа (kDa) килодальтон, единица измерения молекулярной массы макромолекул

КОЕ (cfu) колониеобразующая единица (colony forming unit)

ЛПС Липополисахарид

МкАТ моноклональные антитела

МНТЦ Международный научно-технический центр

ОП оптическая плотность

ОФД Ортофенилендиамин

ПААГ полиакриламидный гель

п/к Подкожно

п.н.(Ьр) пары нуклеотидов (base pair)

ПЦР полимеразная цепная реакция

РАН Российская Академия Наук

РКПБ РНИПЧИ Российская коллекция патогенных бактерий при Российском

«Микроб» научно-исследовательском противочумном институте «Микроб»

РНК рибонуклеиновая кислота

РФФИ Российский фонд фундаментальных исследований

ЭДТА этилендиаминтетраацетат натрия

ApR ампициллинрезистентность

bv Биовар

С Цистеин

CD 14 специфический рецептор из семейства CD на поверхности

иммунокомпетентных клеток F1 капсульный антиген - фракция I (fraction I)

GST глютатион-Б-трансфераза

G Глицин

IL10 интерлейкин

INF-y интерферон -у

in vitro эксперимент в пробирке, без использования животных

in vivo эксперимент на животных

К Лизин

LB среда Luria-Bertani

Lcr-эффект low calcium response - подавление синтеза V антигена в при-

сутствии даже небольших количеств ионов кальция в среде культивирования LcrV белок LcrV - V антиген

IcrV структурный ген V антигена

LD50 доза, летальная для 50% экспериментальных животных (dosis

letalis 50) MDa Мегадальтон

N Аспарагин

NCBI База данных Национального центра биотехнологической ин-

формации (National Center for Biotechnology Information) PA протеин A Staphylococcus aureus

pCad(pCDl, 45-47 мегадальтонная плазмида, определяющая зависимость pLcr) роста Y.pestis от ионов кальция, кодирующая систему секре-

ции третьего типа, синтез V антигена, белков внешней мембраны

pFra(pMTl) 60-65 мегадальтонная плазмида, кодирующая синтез капсуль-ного антигена и мышиного токсина

pPst (pPCPl) R

subsp. S

Syc-белки

T3SS TLR

TNF-a

USP

Yop

Ysc - белки

6 мегадальтонная плазмида, кодирующая синтез пестицина,

активатора плазминогена и белка иммунности к пестицину

Аргинин

Подвид

Серин

Specific Yop chaperon белки - белки - шапероны для Yop белков

type 3 secretion system - система секреции третьего типа Toll-like receptors - класс толл-подобных клеточных рецепторов с одним трансмембранным фрагментом, распознающих консервативные группы (лиганды) микроорганизмов и активирующих клеточный иммунный ответ tumor necrosis factor - фактор некроза опухоли United State Pharmacopeia - фармокопея США Yersinia outer-membrane proteins - белки наружной мембраны Yersinia secretion белки - белки, необходимые для секреции белков Yop

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональная и генетическая характеристика V антигена Yersinia pestis»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. V антиген (LcrV) - полифункциональный фактор вирулентности и один из основных протективных антигенов иерсиний [224]. Он представляет собой полипептид с молекулярной массой 37 кДа [181], кодируемый геном IcrV, расположенным на плазмиде вирулентности (кальцийзависимости) патогенных для человека представителей рода Yersinia: Y.pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica.

Установлено, что V антиген ингибирует хемотаксис нейтрофилов и запускает механизм супрессии провоспалительных цитокинов [230, 150]. Этот белок регулирует работу многокомпонентной системы секреции белков третьего типа (type 3 secretion system -T3SS) путем прямого влияния на собственно секрецию эффекторных белков Yop (Yersinia outer proteins) и опосредованно - на транскрипцию их генов, а также на перенос белков-эффекторов внутрь эукариотической клетки-мишени [35, 180].

Нуклеотидную последовательность гена IcrV из штамма Y. pestis KIM в 1989 г. опубликовал коллектив авторов из Университета Кентукки (США) [181]. Позднее шведские исследователи из Университета Умеа секвенировали аналогичный ген из штамма Y. pseudotuberculosis YPIII, а российские ученые из НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи - из штамма Y. pseudotuberculosis 995 [35, 147].

По полиморфизму структуры гипервариабельной области на N-конце молекулы в пределах 40-61 а.о. (TLR2 - активный район) V антигены делят на семь классов. Первый из них составляют последовательности белка Y pestis и Y. pseudotuberculosis, остальные шесть вариантов найдены только у Y. enterocolitica, причем отдельные структурные варианты отличались по своей иммуносупрессионной активности [199].

V антиген является высококонсервативным белком в эпидемически значимых штаммах Y. pestis, то есть штаммах основного подвида subsp. pestis [20, 147]. Вариации в нуклеотидных последовательностях гена IcrV были описаны для штаммов неосновного подвида Y.pestis ("полевочьи" штаммы): Pestoides F [20] и 91001 [210, 244], циркулирующих в популяциях полевок в закавказском высокогорном очаге (Азербайджан, Грузия или Армения) и степях Внутренней Монголии (Китай), соответственно.

Большинство исследований V антигена, включая оценку его протективной активности [50, 224, 127, 143, 146], способности образовывать олигомеры [43, 53, 179, 220], иммуносупрессивной активности [179, 146, 201, 208] и определения трехмерной

структуры [74] проведены с использованием молекул LcrV «классического» (описываемого нами как D) типа.

В тоже время единичные эксперименты по оценке свойств препаратов V антигена Y. pestis, отличающихся по аминокислотным последовательностям, свидетельствуют об отсутствии перекрестной протективности. Оба описанных серовара V антигена обладали выраженной протективной активностью в отношении штаммов с гомологичным вариантом V антигена, но не обеспечивали защиты животных при заражении штаммами Y. pestis другого серовара [105, 190].

Анализ генетического и структурно-функционального полиморфизма V антигена возбудителя чумы с привлечением комплекса методов микробиологии, генной инженерии, биохимии, иммунологии и компьютерного моделирования позволит получить новые сведения о роли различных структурных вариантов V антигена в патогенезе и иммуногенезе чумы, а также о степени его изменчивости в ходе микроэволюции Y. pestis у представителей различных внутривидовых групп. Это создаст основу для разработки методологии получения технологичных штаммов-продуцентов с максимальным уровнем продукции высокопротективных вариантов V антигена, необходимую для конструирования экспериментальных вакцин нового поколения.

Цель исследования - структурно-функциональный и генетический анализ V антигена Y. pestis для рационального конструирования субъединичных противочумных вакцин.

Задачи исследования:

1. Изучить полиморфизм нуклеотидных последовательностей IcrV генов и аминокислотных последовательностей соответствующих им полипептидов у представителей различных внутривидовых групп Y. pestis и оценить влияние структуры V антигена на избирательную вирулентность "полевочьих" штаммов возбудителя чумы.

2. Провести компьютерное моделирование трехмерной структуры различных вариантов V антигена Y. pestis.

3. Осуществить молекулярное клонирование генов различных структурных вариантов V антигена Y. pestis, провести выделение и очистку рекомбинантных белков.

4. Изучить иммуногенность различных структурных вариантов V антигена Y. pestis.

Научная новизна

Приоритет в определении нуклеотидной последовательности, кодирующей им-муногенный полипептид LcrY(G113), вызывающий защитный иммунный ответ против Y. pestis, и в конструировании рекомбинантного штамма бактерий Escherichia coli BL21(DE3)/pETV 13455 - продуцента иммуногенного полипептида LcrV(G113) защищен патентом на изобретение №2439155 С1 РФ от 02.06.2010 г. Заявка №2010120197/10(028733). Опубликовано 10.01.2012.

Выявлены три новых структурных типа V антигена Y. pestis. Показано, что LcrV типа D, характерный для эпидемически значимых штаммов Y pestis subsp. pestis, также широко распространен среди наиболее филогенетически древних штаммов различных биоваров subsp. microtus. Только 39 % от изученных "полевочьих" штаммов обладают вариантными структурами LcrV (отличными от типа D).

Установлено, что структурный полиморфизм V антигена Y. pestis не является причиной избирательной вирулентности "полевочьих" штаммов.

Проведено компьютерное моделирование трехмерной структуры V антигена типа А и проведена оценка влияния выявленного структурного полиморфизма V антигена Y. pestis на структуру молекулы.

Показано влияние полиморфизма по отдельным аминокислотным остаткам V антигена на способность белка к олигомеризации и его протективную активность.

Практическая ценность диссертации

Депонированы в GenBank последовательности IcrV гена 18 штаммов Y. pestis (номера доступа: EF645809.1, DQ489557.1, EF645806.1, GQ468417.1, DQ489552.1, GQ468423.1, EF645807.1, EF645808.1, DQ489556.1, DQ489555.1, GQ468422.1, GQ468421.1, GQ468420.1, GQ468419.1, DQ489554.1, DQ489553.1, GQ468416.1, GQ468415.1) (международный уровень внедрения).

Депонирован в коллекции "ГКПМ-Оболенск" ФБУН ГНЦ ПМБ охраноспособный штамм Е. coli BL21(DE3)pETV 13455 - продуцент V антигена с повышенной способностью к агломерации и повышенной протективной активностью (федеральный уровень внедрения).

Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов Пущинско-го государственного университета и аспирантов ГНЦ ПМБ.

Препараты V антигена, выделенные из сконструированных нами продуцентов,

были использованы для получения моноклональных антител сотрудниками группы иммунохимии филиала Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Пущино) и лаборатории молекулярной биологии ГНЦ ПМБ, а также в качестве одного из компонентов экспериментальных чумных вакцин, разрабатываемых в рамках Госконтрактов № 124-Д от 11.06.2009 г. (№ гос. регистрации 01200905859), № 52-Д от 29.06.2010 г. (№ гос. регистрации 01201002280) и № 62-Д от 22.07.2011 г. (№ гос. регистрации 01201174793) с Роспотребнадзором и № Н/3/7/50ф-11-ДГОЗ от 15.04.2011 г. (№ гос. регистрации 01201162945) с Министерством обороны. Кроме того, препараты V антигена применяются сотрудниками лаборатории биологических испытаний ГНЦ ПМБ для оценки динамики продукции антител у лабораторных животных (мышей, крыс, хомяков и морских свинок), инфицированных Y. pes tin.

Основные положения, выносимые на защиту:

Избирательная вирулентность "полевочьих" штаммов не обусловлена структурной вариабельностью V антигена.

Аминокислотный тип D - широко распространенный и наиболее древний из структурных вариантов V антигена Y. pestis.

Рекомбинантный штамм бактерий Е. coli BL21(DE3)/pETV 13455 - продуцент иммуногенного полипептида LcrV(G113), вызывающего защитный иммунный ответ против У. pestis.

Работа выполнена в лаборатории микробиологии чумы отдела особо опасных инфекций ФБУН ГНЦ ПМБ по планам НИР в рамках проекта МНТЦ № 2426 (научный руководитель - к.м.н. C.B. Дентовская); проекта РФФИ № 08-04-00405-а (научный руководитель - д.м.н., проф. А.П. Анисимов), договора № 74-Д от 31 декабря 2005 г. (НИР 001-2, № гос. регистрации 01200904237, научный руководитель -д.м.н., проф. И.А. Дятлов) с Роспотребнадзором и Госконтрактов № 124-Д от 11.06.2009 г. (№ гос. регистрации 01200905859), и № 52-Д от 29.06.2010 г. (№ гос. регистрации 01201002280) и № 62-Д от 22.07.2011 г. (№ гос. регистрации 01201174793) с Роспотребнадзором (научный руководитель - д.м.н., проф. А.П. Анисимов).

Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве, главным образом, с П.Х. Копыловым (ГНЦ ПМБ) и В.Л. Мотиным (Медицинское отделение Техасского

университета, Галвестон, Техас, США). На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей. В исследованиях также принимали участие сотрудники ГНЦ ПМБ Е.А. Панферцев и М.Е. Платонов. Компьютерное моделирование трехмерной структуры различных вариантов V антигена на основании определенных автором нуклеотидных последовательностей проводили B.W. Segelke и A. Zemla из Ливерморской национальной лаборатории им. Э. Лоуренса Министерства энергетики США (Ливермор, Калифорния, США).

Кроме того, следует отметить вклад в выполнение данной работы к.м.н. С.В. Дентовской (ГНЦ ПМБ) и д.м.н., проф. А.П. Анисимова (ГНЦ ПМБ), осуществлявших научное руководство и оказывавших методическую помощь на всех этапах работы.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на: VI-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ "Санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях' ' (Волгоград, 2005); 2nd FEMS Congress of European Microbiologists (Madrid, Spain, 2006); NIAID Research Conference (Opatija, Croatia, 2006); VII-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств" (Оболенск, Московская обл., 2006); 9th International Symposium on Yersinia (Lexington, Kentucky, USA, 2006); научно-практической конференции "Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России" (Ставрополь, 2007); 5th International Conference on Emerging Zoonoses (Limassol, Cyprus, 2007); 9th Symposium of Analytical Microbiology (Beijing, People's Republic of China, 2007); NATO Science for Peace and Security Programme Advanced Research Workshop "Emerging and Endemic Pathogens: Advances in Surveillance, Detection, and Identification" (Тбилиси, Грузия, 2008); IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными

болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств» (Волгоград, 2008); научно-практической конференции, посвященной 75-летию Иркутского НИПЧИ (Иркутск, 2009); П-й научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» (Московская обл., Оболенск, 2009); International Symposium on Bacterial Evolution and Pathogenesis (Zhenjiang, Jiangsu province, China, 2010), III-м съезде военных врачей «Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия Вооруженных Сил Российской Федерации» (С-Петербург, 2010); Ш-й научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Московская обл., Оболенск, 2011).

План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании ученого совета ГНЦ ПМБ 9 апреля 2010 г. протокол № 4 Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного семинара ГНЦ ПМБ (протокол №21 от 27 декабря 2011 г.).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 12 научных публикациях, в том числе в двух статьях (в международных рецензируемых журналах, реферируемых ISI) и патенте на изобретение № 2439155 С1 от 02.06.2010 (РФ), список которых приведен в автореферате.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 106 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, три главы результатов исследований с их обсуждением, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 16 работ отечественных и 228 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 13 рисунками и 4 таблицами. Приложения состоят из двух статей, опубликованных по теме диссертации, и патента на изобретение № 2439155 С1 от 02.06.2010 РФ.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Светоч, Татьяна Эдуардовна

ВЫВОДЫ

1. Генетический и структурно-функциональный анализ V антигена У. резИя позволил выявить пять типов структурных вариантов белка ЬсгУ (три типа впервые), которые отличаются по группо-специфичному полиморфизму в четырех «горячих точках» аминокислотных последовательностей. В состав отдельных аминокислотных типов входят варианты ЬсгУ с дополнительным штаммо-специфичным полиморфизмом аминокислотных последовательностей.

2. Показано, что вариантные структуры ЬсгУ свойственны лишь части "по-левочьих" штаммов возбудителя чумы, а ЬсгУ типа Б, наиболее близкий по структуре к ЬсгУ возбудителя псевдотуберкулеза, характерен для основного эпидемически значимого подвида и для наиболее филогенетически древних "полевочьих" штаммов.

3. Установлено, что изменчивость структуры V антигена не является причиной избирательной вирулентности "полевочьих" штаммов возбудителя чумы.

4. На основании компьютерного моделирования трехмерной структуры теоретически предсказано, что пять из выявленных нами вариантов аминокислотных замен в V антигене 7. реьНя, не приводят к изменению локальных химических свойств белка (гидрофобности, гидрофильности, амфипатичности, заряда) и, вероятно, оказывают минимальное влияние на его структуру. Замена триптофана в позиции ИЗ на глютаминовую кислоту либо глицин должна оказывать значительное влияние на региональную структуру и, возможно, на функции ЬсгУ возбудителя чумы.

5. Сконструирован набор продуцентов различных структурных вариантов V антигена, проведены выделение и очистка рекомбинантных белков.

6. Экспериментально показано, что замена в аминокислотной последовательности V антигена триптофана на глицин в положении 113 сопровождается повышенной способностью к олигомеризации (агломерации), коррелирующей с усилением протективной активности белка на пять порядков.

Благодарности

Приношу искреннюю благодарность научным руководителям моей кандидатской диссертации д.м.н., проф. А.П. Анисимову (ГНЦ ПМБ) и к.м.н. C.B. Дентовской (ГНЦ ПМБ), осуществлявшим научное руководство и оказывавшим методическую помощь на всех этапах работы.

Считаю своим приятным долгом выразить благодарность всем моим соавторам, принимавшим участие в планировании и проведении экспериментов, обсуждении их результатов и оказывавшим помощь в оформлении диссертации (профессору В.Л. Мотину из Техасского Университета (США), Dr. B.W. Segelke и Dr. A. Zemla из Ливерморской Национальной Лаборатории (США), к.б.н. Ф.А. Бровко из филиала Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Пущино), сотрудникам ФБУН ГНЦ ПМБ к.м.н. Е.А. Панферцеву, к.б.н. П.Х. Копылову, к.х.м. Н.В. Киселевой, к.б.н. С.А. Иванову, к.б.н. М.Е. Платонову, к.м.н. Г.М. Титаревой, к.м.н. И.В. Бахтеевой, Т.И. Комбаровой.

Глубоко признательна директору Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока д.м.н., проф. C.B. Балахонову и директору Ставропольского научно-исследовательского противочумного института д.м.н., проф. А.Н. Куличенко за предоставленные штаммы Y. pestis.

Благодарю директора ФБУН ГЕ1Ц ПМБ чл.-корр. РАМН, д.м.н., проф. И.А. Дятлова за предоставленную возможность защитить диссертацию в диссертационном совете Д 350.002.01 при ФБУН ГНЦ ПМБ.

Признательна и благодарна всем рецензентам настоящей работы за многочисленные замечания, вопросы и поправки, которые, по возможности, были учтены и, в ряде случаев, помогли уточнить, а иногда и пересмотреть некоторые положения и формулировки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Вакцинация - наиболее экономически целесообразный метод борьбы с распространением инфекционных заболеваний. Эпидемиологически обоснованное применение вакцин значительно снизило заболеваемость и смертность от таких наносящих значительный экономический ущерб болезней как корь, полиомиелит, дифтерия, пневмококковые инфекции и др. Триумфом вакцинации явилось искоренение оспы во всем мире. В рамках реализации глобальных программ Всемирной организации здравоохранения эпидемиологи намерены ликвидировать корь и полиомиелит. Быстрое развитие методологии молекулярной биологии и биотехнологии в сочетании с лучшим пониманием механизмов инициации и реализации иммунного ответа ознаменовали начало "Золотого Века" разработки вакцинных препаратов нового поколения [131]. После рассылки по почте спор возбудителя сибирской язвы в США в 2001 г. основное внимание разработчиков вакцинных препаратов обращено на профилактику сибирской язвы, чумы и туляремии, чьи возбудители считаются наиболее вероятными агентами биотерроризма.

Чума - типичный зооноз, а человек лишь случайный хозяин, хотя антропоноз-ное распространение инфекции воздушно-капельным путем может быть причиной серьезных эпидемий. Тем не менее, полная эрадикация чумы, как и любого другого зооноза, маловероятна [141], хотя исследования в этом направлении продолжают проводиться [66; 91].

Несмотря на проверку иммуногенной активности значительного количества белков, синтезируемых чумным микробом [132,133; 228] и доступность методик обратной (реверсивной) вакцинологии [187], только два из них - антигены Fl и V, выявленные еще в середине прошлого века [49], остаются в интактном или модифицированном виде основными компонентами молекулярных чумных вакцин [4].

Цель настоящей работы состояла в проведении структурно-функционального и генетического анализа V антигена Y. pestis для рационального конструирования субъединичных противочумных вакцин.

Для изучения полиморфизма IcrV rem Y. pestis и его продукта - V антигена необходим, прежде всего, набор природных изолятов, представляющий различные внутривидовые группы. В нашей работе мы использовали 12 штаммов subsp. pestis и 61 штамм subsp. microtus, причем наборы изолятов из кавказских и алтайского природных очагов были достаточно представительны. Анализ аминокислотных последовательностей позволил разделить все структурные варианты белка LcrV на пять типов в соответствии с проявлением основного группо-специфичного полиморфизма в четырех «горячих точках» с дополнительным пгтаммо-специфичным полиморфизмом, выявляемым у представителей отдельных групп. Как мы и ожидали, все штаммы основного подвида с универсальной вирулентностью обладали D типом V антигена, наиболее близким к V антигену прародителя чумного микроба - Y. pseudotuberculosis. При планировании диссертации мы собирались оценить влияние структурного полиморфизма V антигена на проявление избирательной вирулентности путем обмена плазмидами "вирулентности" между "полевочьими" штаммами и штаммами с универсальной вирулентностью. Однако воспринятое нами в первый момент выявления как артефакт присутствие в значительной части изолятов неосновного подвида V антигена типа D значительно упростило решение нашей задачи. С учетом того факта, что изменчивость аминокислотной последовательности либо является причиной избирательной вирулентности, либо нет, нам было достаточно сравнить вирулентность для мышей и морских свинок у "полевочьих" штаммов с различными типами V антигена. Результаты наших экспериментов однозначно свидетельствуют о том, что наличие в клетках "полевочьих" штаммов V антигена типа D недостаточно для высокой вирулентности возбудителя чумы в отношении морских свинок. Проблема избирательной вирулентности штаммов Y. pestis subsp. microtus по-прежнему ждет решения.

Работы по конструированию продуцентов V антигена проводили с учетом данных компьютерного моделирования трехмерной структуры LcrV и возможности влияния замен по отдельным аминокислотам на физико-химические, иммунохимические и про-тективные свойства белка. Наибольший интерес был проявлен к вариантам V(Wj V(Eii3) и V(gh3> т.к. полученные данные свидетельствовали о том, что из всех изученных в нашей работе замен аминокислот только одна - в позиции 113, наиболее вероятно, вносит серьезный вклад в формирование локальной структуры LcrV - замена триптофана на глютаминовую кислоту (Е113) или глицин (G113). Действительно, ре-комбинантный антиген V(gh3) резко отличался от других препаратов уже на стадии выделения. Так, при выделении V(wii3) и V(eu3) антигенов, на этапе анионообменной хроматографии целевой белок элюировали буферным раствором с низкой ионной силой (30-40 мМ NaCl), однако при элюции варианта V(G113) этот белок присутствовал в равных долях во фракциях как 30 мМ, так и 80 мМ, 150 мМ, а также 200 мМ NaCl.

Сравнительная оценка протективноети различных структурных вариантов V антигена, как и ожидалось, подтвердила преимущества высокоагрегированной формы антигена. Индекс иммунитета при использовании У(Сш) был на пять порядков выше, чем при иммунизации другими экспериментальными образцами белка.

Учитывая, что протективная активность V антигена в отношении разных видов животных отличается [127], а данные о формировании перекрестного иммунитета к вариантам LcrV, отличающимся по аминокислотным последовательностям, противоречивы [103; 147,143,146; 152; 190; 195], могут возникнуть сомнения в целесообразности использования V(oii3) антигена в составе вакцинных препаратов для иммунизации людей.

Очевидно, что клинические исследования невозможно заменить модельными экспериментами in vitro или даже на лабораторных животных. В то же время любой эксперимент несет в себе больший или меньший элемент риска для подопытного добровольца и должен проводиться с учетом основных этических и правовых принципов, регламентирующих порядок проведения клинических исследований. Эти принципы были сформулированы в Хельсинкской декларации Всемирной ассоциации врачей, принятой 18-й Генеральной ассамблеей Всемирной ассоциации врачей в июне 1964 года [16]. Жизнь и здоровье испытуемых всегда превыше интересов науки и общества, поэтому биомедицинские исследования с участием людей в качестве субъектов не могут проводиться на законных основаниях, если риск для субъекта исследований непропорционально велик по сравнению с важностью целей эксперимента [3]. Соответственно при изучении протективноети чумных вакцин в отношении людей возможна только косвенная оценка -исследование эффективности пассивной иммунизации модельных лабораторных животных, зараженных чумой. С учетом того, что в наших экспериментах по активной иммунизации "полевочий" вариант V(Gii3) антигена значительно превосходил классический D тип LcrV из штаммов с универсальной вирулентностью, с высокой долей вероятности можно предположить, что и при пассивной иммунизации человеческими анти-V антителами он не уступит классическому V(wli3) антигену. Но даже такие косвенные данные можно будет получить только после успешного завершения доклинических испытаний.

Основным практическим итогом настоящей работы является именно конструирование рекомбинантного штамма бактерий Е. coli BL21(DE3)/pETV 13455, несущего плазмидную ДНК pETV 13455 с нуклеотидной последовательностью, кодирующей иммуногенный полипептид LcrV(GU3), вызывающий защитный иммунный ответ против 7 резНэ. После окончания выполнения экспериментальной части настоящей диссертационной работы оптимизация условий культивирования штамма - продуцента и выделения целевого белка, а также его использование в качестве компонента экспериментальных чумных молекулярных вакцин продолжается в рамках выполнения ФЦП «Национальная система химической и биологической безопасности российской Федерации (2009-2013 годы)» (Госконтракты № 124-Д от 11.06.2009 г. (№ гос. регистрации 01200905859), № 52-Д от 29.06.2010 г. (№ гос. регистрации 01201002280) и № 62-Д от 22.07.2011 г. (№ гос. регистрации 01201174793) с Роспотребнадзором и № Н/3/7/50ф-11-ДГОЗ от 15.04.2011 г. (№ гос. регистрации 01201162945) с Министерством обороны). Кроме того, препараты V антигена, выделенные из сконструированных нами продуцентов, были использованы для получения моноклональных антител сотрудниками группы иммунохимии филиала Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Пущино) и лаборатории молекулярной биологии ГНЦ ПМБ, а также сотрудниками лаборатории биологических испытаний ГНЦ ПМБ для оценки динамики продукции антител у лабораторных животных (мышей, крыс, хомяков и морских свинок), инфицированных 7. реяШ.

В заключение следует отметить, что вывод, к которому пришли физики, преодолевая в начале XX века кризис в этой науке, "Нет ничего практичнее хорошей теории" - сохраняет свою актуальность. Именно проведение фундаментальных исследований на первой стадии нашей работы, позволивших теоретически предсказать свойства исследуемых белков ЬсгУ, дали возможность обоснованно сократить объем исследований, и, самое главное, добиться конкретного практического результата.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Светоч, Татьяна Эдуардовна, 2011 год

Литература

I, Burrows T.W., Bacon G.A, 1958. The effects of loss of different virulence determinants on the virulence and immunogenicity of strains of Pasteweila pestis // Br. J, Exp. Pathol. Vol. 39, No. 3, P. 278-291.

j 2. Lawton W.O., Erdman R.L., Surgalla M.J. 1963. Biosynthesis and purification of V and W

antigen in Pasteurellapestisll J. Immunol. Vol. 91, P. 179-184.

3. Motin V.L., Nakajima R., Smirnov G.B., Brubaker R,R, 1994. Passive immunity to yersiniae mediated by anti-recombinant V antigen and protein A-V antigen fusion peptide // Infect. Immun. Vol. 62, No. 10, P. 4192-4201.

4. Perry R.D, Harmon P.A, Bowmer W.S, Straley S.C. 1986. A lo\v-Ca2+ response operon encodes the V antigen of Yersiniapestis // Infect. Immun. Vol. 2, No, 54, P. 428-434.

5. Brubaker R.R. 1991. Factors promoting acute and chronic diseases caused by yersiniae II Clin. Microbiol. Rev. Vol. 4, No. 3, P. 309-324.

6. Burrows T.W. 1956. An antigen determining virulence in Pasteurella pestis // Nature. Vol. 177, No. 4505, P. 426-427.

/•> 7. Carter P.B, Zahorchak R.J, Brubaker R.R. 1980. Plague virulence antigens from Yersinia eri-

terocolitica It Infect. Immun, Vol. 28, No. 2, P. 638-640.

8. Bergman Т., Hakansson S., Forsberg A., Koriander L., Maeellaro A., Backman A., Bolin I.. Wolf-VVatz H. 1991. Analysis of the V antigen ¡crGVH-yopBD operon of Yersinia pseudotuberculosis: evidence for a regulatory role of LcrH and LcrV.//J. Bacteriol. Vol. 173, No. 5, P. 1607-1616.

,0 9. Skrzypek E., Straley S.C. 1995. Differential effects of deletions in IcrV on secretion of V an-

tigen, regulation of the low-Ca2+ response, and virulence of Yersinia pestis // J. Bacteriol. Vol. 177, No. 9, P. 2530-2542.

10. "Weikos S., Friedlander A., McDowell D„ Weeks J., Tobery S. 1998. V antigen of Yersinia pestis inhibits neutrophil Chemotaxis// Microb. Pathog. Vol. 24, No. 3, P. 185-196.

II, Nakajima R., Brubaker R.R. 1993. Association between virulence of Yersinia pestis and suppression ofy interferon and tumor necrosis factora// infect. Immun. Vol. 61, No. 1, P. 23-31.

12. Nedialkov Y.A., Motin V.L., Brubaker R.R. 1997. Resistance to lipopolysaccharide mediated by Lhe Yersinia pestis V amigen-polyhistidine fusion peptide: amplification of interleukin-10 // Infect. Immun. Vol. 65, No. 4, P. 1196-1203.

13. Price S.B, Leung K.Y., Barveand S.S., Straley S.C. 1989. Molecular analysis of krGVH,

V) the V antigen operon of Yersinia pestis It J. Bacteriol. Vol, 171, No. 10, P. 5646-5653.

14. Pouliot K., Pan N., Wang S., Lu S„ Lien E., Goguen ID. 2007. Evaluation of the role of LcrV-Toll-like receptor 2-mediated immunomodulation in the virulence of Yersinia pestis II Infect, Immun. Vol. 75, No. 7, P. 3571-3580.

15. Tito M.A., Miller J., Walker N., Griffin K.F., Williamson E.D., Despeyroux-Hill D., Titball R.W., Robinson C.V. 2001. Probing molecular interactions in intact antibody: antigen complexes, an electrospray time-of-flight mass spectrometry approach // Biophysical Journal, Vol. 81, No. 6, P. 35033509.

16. Wang S., Heilman D., Liu F., Giehl Т., Joshi S., Huang X., Chou Т., Goguen J., Lu S. 2004. A DNA vaccine producing LcrV antigen in oligomers is effective in protecting mice from lethal mucosal challenge of plague И Vaccine. Vol. 22, No. 25-26. P. 3348-3357.

17. Патент США номер 6,638,510 В1, опубл. 28/10/ 2003

18. Motin V.L., Pokrovskaya M.S., Telepnev M.V.. Kutyrev V.V., Vidyaeva N.A., Filippov AA„ Smirnov G.B. 1992, The difference in the lerVsequences between Y. pestis and Y.

10 pseudotuberculosis and its application for characterization of Y. pseudotuberculosis strains //

Microb. Pathog. Vol. 12, No. 3, P. 165-175.

19. Ilakansson S., Bergman Т., Vanooteghem J.C., Cornells G., Wolf-Watz H. 1993. YopB and YopD constitute a novel class of Yersinia Yop proteins // Infect. Immun. Vol. 61. No. 1, P. 71—80.

20. Sing A., Reithmeier-Rost D„ Granfors K., Hill J., Roggenkamp A., Heesemann J. 2005. A /f hypervariable N-terminai region of Yersinia LcrV determines Toll-like receptor 2-mediated IL-10 induction and mouse virulence // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. Vol. 102, No. 44, P. 16049-16054.

21. Anisimov A.P., Panfertsev F..A., Svetoch Т.Е., Dentovskaya S.V. 2007. Variability of the protein sequences of LcrV between epidemic and atypical rhamnose-positive strains of Yersinia pestis !! Adv. Exp. Med. Biol. Vol. 603, P. 23-27.

22. Anisimov A.P., Lindler L.E., Pier G.B. 2004. Intraspecific diversity of Yersinia pestis H 20 Clin. Microbiol. Rev. Vol. 17, No. 2, P. 434-464.

23. Anisimov A.P., Dentovskaya S.V., Pantertsev E.A., Svetoch Т.Е., Kopylov P.Kh., Segelke B.W., Zemla A., Telepnev M.V., Motin V.L. 2010. Amino acid and structural variability of Yersinia pestis LcrV protein // Infect. Genet. Evol. Vol. 10, No. 1, P. 137-145.

24. Brubaker R.R., Sample A.K., Yu D.2., Zahorchak R.J., Hu P.C., Fowler J.M. 1987. Prote-olysis of V antigen from Yersinia pestis // Microb. Pathog. Vol. 2, No. 1, P. 49-62.

25. Leary S.E.C., Williamson E.D., Griffin K.F., Russell P., Eley S.M., Titball R.W. 1995. Active immunization with recombinant. V antigen from Yersinia pestis protects mice against plague // Infect. Immun. Vol. 63, No. 8, P. 2854-2858.

26. Motin V.L., Nedialkov Y.A., Brubaker R.R. 1996. V antigen-polyhistidine fusion peptide: binding to LcrH and active immunity against plague//Infect. Immun. Vol. 64, No. 10, P. 4313-4318.

v' 27. Li J, Li В., Li G., Ren J, Zhang J., Xu C., Yang X, Liu S., Fu L., Chen W. 2008. Design

and preparation of non-tagged Yersinia pestis LcrV antigen in Escherichia coli and its immunogenicity in BALB/c mice // Protein Expr. Purif. Vol. 57, No. 2, P. 136-142.

28. Ашмарин И.А., Воробьёв A.A. 1962. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Государственное изд-во медицинской литературы. 180 с.

ъ

Формула изобретения 1. Нуклеотидная последовательность, кодирующая иммуногенный полипептид LcrV(G113), приведена на рис.2. и, 2. Рекомбинаитная плазмидная ДНК pETV-i-3455, имеющая размер 6538 пл., кодирующая иммуногенный полипептид LcrV (Gl 13) и состоящая из следующих элементов:

репликон плазмиды pBR322.

ген ß-лактамазы. определяющий устойчивость к ампициллину, 4> Т7-промотор, I ас-оператор. П-репликон,

фрагмент ДНК, фланкированный сайтами для рестриктаз Ndel и Hindlll, s,; кодирующий синтез белка LcrViGl 13). начинающегося с инициирующего колона A'I'G.

3. Рекомбинантный штамм бактерий Е. coli BL21 (DE3)/pETV-1-3455 - продуцент иммуногешюго полипептида LerV(GI 13), депонированный в ФГУН ГНЦ ПМ.Б

(каталожный номер В-6527).

4. Иммуногенный полипептид LcrV(Gl 13), продуцируемый рекомбииантным штаммом Е. coli BL21 (DE3)/pETV-I-3455. имеющий аминокислотную последовательность, приведенную на рис.З, в которой произведена замена триптофана в позиции 113 (W113) на глицин.

5. Способ получения рекомбинантного полипептида LcrV(Gl 13) путем культивирования штамма Е. coli с последующим выделением полипептида, отличающийся тем, что культивируют штамм Е. coli BL21 (ОЕЗ)/рЕТУ-1-3455, а

ю культивируемые клетки разрушают в буферном растворе ультразвуком, причем выделение целевого продукта начинают с этапа гель-проникающей хроматографии с использованием носителя TSK HW-40 и завершают последовательно анионообменной и гидрофобной хроматографией.

1 /-и-типжя

/

1 Кт^п >' <>п1егой»и.*8е

Ыа

4« ? |

Т ,'.р г и: > кДуг |;»>о|>ег« т

• ( I

он - - )ас!

Схема организации реконбмшштугай плазмиды рЕТУ-1-3455, где: 1,сг¥.....клонированный фрагмент, включающий' полный геи белка !хг¥((}]13); уникальные сайты эидонукяеаз рестрикции.....Н»ш1Ш и Мс1е1, использованные при создании данной конструкции; '17- промотор и 17.....терминатор, присутствующие в рекомбншштной «яшмаде; /яе/

..... ген /?-лтсгамазы. обеспечивающий трансформированным' бактериальным клеткам устойчивость к ампициллину,

ФигЛ

ооо'гооаасаасттастсстсатооттсттсаоттттасаасааттссттсаоттастс

а а ас ат а а лаататааата'птссаттааататсатсссаоаааасаттссоасот'гт

ттсссаатасаотаа'пастсатсататсоааттсстсаооаааатсстаосттатттт

стассссасоатоссаттсттаааоосоотсаттатоасаассаастссаааатсоса

тсаассоастааааоасттсст1х]аатсатсссссаатасасааосгссааттссссго

соттсатсасастаатссатттстстттаасссссоатсотатсоатсатсататтттс

АААСТОАТТСТТСАТТСААТаАА'ГСАТСАТСОТСАТССССОТАОСААСТТОССТСААа

ааттаостоаосттассоссоааттаааоатттаттсаоттаттсааоссоаааттаат

ааосатстстстастастсссассатааататссатсатааатссатталтстсатсоа

тааааатттататсоттатасасатоааололтттттааасссассссасастасааа

аттстсоас1аааатссстсалассасс:аг1саоотоса1,сосаассас1ааааааата

СТСТССАТАААООАСТТТСТТаОААОТСАОААТААААОААССООООСОТТСОСТААТС

тсааааастсатастсттатаатааасатаатаатсааттатстсастттсссассасс

аостсссатаастссасссссстсаассасттсоттасссаааааасаастсаостот

стоачаттас:атсасстт1тааттсасстаттоааосасл'оаассотт1,саггтсасааа

татсаттсаотсатссаасстстсстаоатсасасстстсотааатоа

Нуклеотидная последовательность гена !сгУ, кодирующего синтез иммуноген-ного полипептида ЬсгУ (б 113).

Фиг. 2

MЖAYEQNPQHFIEDLENVRVEQLTGHGSSVLEELVQLVKDKNIDISIKYDPRKDSEVFANR

VTTDDIELLRKiLAYFLPEDAILKGGHYDNQLQNGIKRVKEFLESSPNTQGELRAFMAVMHF

SLTADRIDDDILKVÍVDSMNHHGDARSKLREELAELTAELKIYSV1QAE1NKHLSSSGTINШ

DKSINL^'ГОKNLYGYTDEEIFKASAEYKILEKMPQTTIQVDGSEKK1VSIKDFLGSEЖRTGA

LGNLKNSYSYNKDNNELSHFATTSSDKSRPLNDLVSQKTTQLSDITSRFNSAffiALNRFlQK

¥08УМ<ЗН][ХВ0Т$СК

Аминокислотная последовательность иммуногенного полипептида ЬсгУ(ОПЗ)

Фиг.З

1Шач.чы У рел;-* 1 посияй* ¡СО

и5 5 АТС АТГА <; ЛГ.КХТ АСС ААСЛ ЛЛЛССС АС Л леА1'ГП\^ГЧ>АОалТСТУЛЛЛАлтОТТЛСК.НЖ.ЮЛЛ С А АСП'АСТО ОТСАТССТТСТТСЛС ТТТ1 ЛОЛЛО

и-?'1?!) ЛТС;---а<:АО:.:СГАСа/АСЛЛАЛСС<^ХЛЛСАЧТ]ТАТТаАСОА^

лтоа1тас ао сст асо л л с а ааасссаса аслттттаггоаскглтстло а а а ат< п'гаооотоо.^асалсттастос гслтс к vi i с/пса оi) 1 la.ga.ao а-1723 ататтлолосс1у^соааса/и^.сссасааса п'аоалсг

ЛТСАГГАОАСгаГ.ТАСОЛЛСАААЛСС^ЛСЛЛСАЧ"! Г1 АГШАСЗС^АТСТАСАААААСГГГАСХг^^^^ Апто!;- АТйА !'1А(;л1.КЛЛАСиААСААА\.СССЛСЛЛСЛ1ТП.ЛЧ^^

Кокс«кудагал ккмтхг.иыьносгк ЛТОЛ'! I АСА<*ХЧГАССгААСААААСОЖЛАСА 1Ч1ТАГША(ХтАТСТлОАААААОТТАОССтГОУААО^ А<т

Ш пялиии* 2№

и-з-ш ла1тооттсаотта1т1х'а^\лоагаа.а/^\т,атаоататттссл1!'.\ла гашатоссаслааа^заттсоолсстттттсс^

«•2*59 ЛЛТОСПГГСЛОТГлаТСАЛАСЛТАЛЛЛЛОД^

С-5Кг ААТТО СТТС АО 'Л' АО') 'С А А А.Ст А Т АААА А ГА Ч ЛОЛ'] А) 11ССА11,АААГЛТОАТСССАСААААОАТТа'К";Л<!<У1 1ТПХЗССААТАОАШЛА1ТЛСТ<ЗЛТОА

Л-1728 ЛЛТТСг П ГТ'С А С- ТТ АС IС АААСЛТАЛ АЛ А ТАТАОАТ А'1 Т.Г (X АТТААА Г АТ0ЛТСССЛС5 Л Л Л АС? ЛТТСОСтАООТ Ч' П'ГОСН.'. А АТЛО АС «ТА А ТТЛИУГОЛ ТС л

ССЯ2 ААПСтШТСАСгТТАОТСАААСЛТЛЛЛАи^^

лат юштса(хттаотсаааоатллалл'гл 1 аоачаг1тссл?тлллтатсатссса.сааааоаггсх;сасст7ттт^ Коясс«сунснаапо.Д1?аОБа1-ыи,<«1)ст1. ААТгГ.КОТСЛОТТЛПТОАЛАОАТЛААААГАТАаА^^

20? гсопидкч ЗСО

к.я455 тлтсгтааттостсас^аа^тсстассггатггтотас^

татаиап(кггсасх>ааллтсстлсс1таптгш <>582 татс^алт юсчгаоъ аа.члтг.с т лоси а1 11 д."! асссоаос;а.тоссл1т<: п'ла л.о<х:сд|'1'Слп'ашасллссллст<»сллаатгссаТ1":ааос<уА

а-1725 та т соалттс стслао алллч со' асч" г г атгп'стасссоас) и а то ссагтст т аа аоосо с<ч'с а ч т атс асалссалсти са л л а' ю о олтс а. аосоа

сом татсхзаашсгсласлаа.агатас-сттаттттсг^

апсоь татго а ЛТТССГСМ<;0АА-\АТСС1'АССТТа'ТТГТГ.ТаССС0 а<3ал госсаттстт ал.\'зссоотсаттатолса аССААСТ(х.:А а алтос слтсалоси л

Коголнсу чей«* наддам оздтеть татсо алттск: ГС лаоааа атсстассттЛ Г П тсчасгху а<*затссса ттстта а аосссс ТС а'/ татоасаассчастсГса ааатсс сагс аайогГа

.1-01 «лтд и иг 41>'1 Ио-155 .С>?ЛАААаСОТТСОГШЛЛТСА1ГС1Се^ 1'Ш5ь» иТААА4,ОАиП'<ХГТаААТСАТСОСиМ^

с-5$ 2 сп' аааа-мопсстто а атс атс x; с/д.¡ал глсаслл'кя'.о ал 1 т< кхкчк'оттсатсюсаотаатосл'п'тстсттталс.СГИХС лч (л'г('«ат«ато

Фш\4(щчало)

A-172X U«2 Angola

linn

И-2359 С-.'32 А-1728

i'отелов ателс! m с i

И-3455 И-Я359 С-5Й2 A-172S С092 Angola

С-562 А-1728

Angola

KoKCàHCytlCHÎM» IWKailBill-AllWtDCTi

И-3455

C-5Í2 А-1728

со у:

л nao h

11-345 S И -2.3 59 COBZ

A-172s СОК

KüH WJ lcyiwirjä

И-5455 И-2359 С-582 А-172К COW

НЛ'НСУНСИМ ПОСЛС ДОИКЛ L JIOC11,

G'-'AAAAG AGTTCC Г TCiAATCATCGCCG Л ЛТ АС AÉ' АA TGGG А<\Т TGCGGGÍ '< »ПС ;aTGGC л <jT AATGC АТТТСТ СГ TT АЛСС О COG A l СОТАТС С ATG ATG GT AAA AG-AG'ITCíTl' 1 íiAATOATCCCCCAAVACACA.VlTiGGAATTGCOGOCtn г СATÍ ЮСлОТАЛТОСАТТТСТСТТТА АССОCCG,VI СШАТСО ATOA'Ki

ста алло agttcct голлтел ¿cgccgaatacacaagggga at с gox»úgc>tttcatggcaotaatüc атгастспт aaccg ccg атса-тлтсялтоат ü

ОТ AAA AG ACTTC ОТТОАЛТС АТСО С СО Л Л 'Г'А С AC A AT OQQ ЛЛТХОСС Kí СтССг 1 Н.;АЧЧДОС^АОТААТССЛТТГСТСТТ1^ЛСС(К!'<ХТАТСОТАТССАТОАТО

<101

500

ЛТЛПТГС-ААЛСТСЛГЦ; rCM'riX'CCGTAöC-AAGTTGCG rGAAGAATfAGCTGAGCTTACCGCCGAATTAAAGATTTA

ЛТАТТПЧ5 АЛ AGTC5 АТТОITG All CAATCîA АТС A';'£ÏA'14K?TG.\TGCCCGT KGC A AGTTGCO'í "G AAG AATTAGCTÖAfiC Г ГЛСО(К-CGAATTAAACrATTTA АТАТТПСААЛШ(.ШЧ\ПТОАГ1СА/аОА^^

A1'A1441üAiVvCTGA1"l4'>TTXrATTCAATGA/iTCATCArG('fT(iA ITjCCCCTAnCAA04TGCGTG.^AG<^ATTAGCTGAGC1TACC<K;CGA/iTl AAAGAÏTI'A АТЛТТТГОАДАО!13АТТОТТСАТГСЛЛТРААТСАГСАТиС^

ЛТЛТ'П TGA A AGTG ATTGT ÏG ЛТ1С AATGA ATCATCATGGTGATÜCCCÜTAOCAAGTTGCGTG AAG A ATIAGCTGAGCn>CC<4?CGA ATTAAAO ATJf'f A Al Aï J J l'GAAAGTGAI 1 'GTTG AT7CA AT G AAT CAT CAÏCÎGTOATGCCC.ITIAÎÏCAWÏ ГОС'СГОАЛОЛАТТАССТСАбСГГАСХХ'а^АА'! ТЛЛАОАТТГЛ 501 шяшки /«ló

ЗТеЛоПАТТСААССССгЛЛАТГААТААСЧГАТС ттслсттлгг€ллс*х&аааттааталсслтст^^^^

TTCAGTTAT ТСА\0СССЛЛЛТТ.ААТ.ААССАТСТПТС7Л<гГЛ(.'г rC^irACCATAA-VrArCCAlViA'rAAArCCATTA^TCTCATGGA'l'AAAAAl'ri'A'l AÏGGT ITJAGITATTCA AGCCGA A AITAATAAGC ATCTGTCÏAOÏ AGTOGCACCATAA АТЛТССДТО АТАААТССЛТТАЛТСГСА'К'Ю АТАА ААЛТТТАТ ATGGT ТТСЛОТТлТГС AAGÇCGAAATTaATA А(Х : А' ГСТ GTC Т A<j TAC TGü CA СС A T A A -Vi'ATCC ATO АТЛЛ лТССЛ'П'ААТСПХ'АТООАТ AAA AATT TAT ATGGT

rr CAon Апч;лАса: ол ллг гллтл agcatctc^

ТГОАОТГлТТСааОСсОаллч I AA'rAAOCATCTO'iC-i АОГЛ<>ТСКтСлССАТАААТЛ'|'С"САЧ'иА'ГАЛЛ1ССЛТ1'ЛА ГС- í'CA I G'jA í AAAAATTTATATGGT

№Ш

T AT A CAG A L САЛ (тЛ Ол ITПТА A AGCCAGCGCAGA(Y;ACAAA ATJ'GTCGAG АчАА'ИКХП'С А А АССАССАТТСАССТОСАШСЭДАОССЛОАААААААТАО ГаТ AC АП AT G AAGAGA 1ТГГТАААОСС AGCGCaGAG 1 ACAAA ATTCTCG AO А АЛАТСССТСАЛАСС АССЛТТС ACKYtTíOA TGGGAGCG AG АААЛА АЛТЛСт Г ЛТ Л Г AGA' I f i AAG Ai j A' Г 1ТГТ ЛАЛ G CC A CjCG С AG AGT A С Л Л .л A TTC t С CjA Ci A A А АТС СС ТС' А А ACO Л СС А7 IС AGGTGG Л ТОО С-А G CG A G A A A A A A AT AG TATACAÜATGAAGAOATTTTTAAAGCX'AGCGCAGAGTACAAAA ПСТССЛС A IGGGAGCGAGAAAAAAATAG

Т/чТ АС A G ATG А АОлО А ÏTT 'П'ЛЛЛССС A GC OCA l »A Ш A t ААЛЛ T ГС ГСОАО.АА A A TtíCCl САААССАССАТТСЛ <. tGTGG AT G CKJ AGCGAGAAAAAAA1A (.5 TATACArrA'lT¿AAGAGAriTIIAAAGCCAOCGCAGAGTAOAAAAT АССО Ai? A AAA AAA Г AG

lAVACAGATOAAOAGATTT'l I' A A AGCX'AG CG CAOAGT AC AAAATFCTCG AGA А А Л' G ССЛСаААССАССАТТС а С GTGG AT'GGKj AGCG AGAAAAAAA? AG

■?01

SÛ0

С С GATAAAGCACTTTCT IGGAAGÏGAGAA7AA A AG A ACCGOGGC UTTGG GTA ATCTG A A A A AO'CAYA CTCTTATAA TA A A G AT AA1 AA'l G AAT )'АТС < Cf / rAVAn(;ACTTTCTU^AAüTGAGAAlV^A.AGAACCC-GGCCGTTGGGTAAIf.'i{rA.HAAA^^ ТСТа"АГЛЛлдиА^1ГК_ТТСтС(ЛАГ,1Г|А(1ААТААААйЛ,\ГСаСгСнК:аГ5-СйОГ,^ TCTL'GATAAAGGACTTrCTTGí?;AAt;3'£;AGAATAAAAGAACCGGCííjC4rTTG<>^

ТСТСОЛТЛЛ \«"^ACTTTCriXiGAA<iTGA«AATAAA4GA\CCCC.GGCCi-í-;'GGi.i-i'AATCTGAAAAACTCATACrcriVVi'AATAAAGATAATAATC/\A-lTAIC ТС'ГСОА^АААС'ОАСГПХ^ТТГтСтЛЛОГОАйДАТААААСМАССООООСХ^гГйСКтТЛАТСГОЛАА^

K'I'i.'OATA.-ViGGACTTiCïH;« rAAü4,OAOJ\ATAAAA<>A^!;cCKJtKXGTTOriCiTAATClGAAAAAC''iCAMC3C3"JA'rAAlAy\AGATíVAT/^

SOI

ÍÜUC4

yoo

TCACrilGCCACC-ACCACÏCTCûaATAAGlCCACKXCGt:Ti4.AAV:GACiTÛGÏl\AGCCAAAAAACAAC

'í CACT7TTG CCACC АССЛ G Ci"(X ¡KtA'I ' AA<tTCC AGGC.XX К ' "í (; AACG ACTTG GTT Al'fC?C. AAAAAACAACTCA GCTGTCTG АТЛ1 ' Г A С ATCACGT 'ГП'ААТ ТС A ICACT1ir«'CAa:AC:<:A<3CTCGGATAACrTCCAGGCïX^C,UaJACTr(i<TTrAGCC.^

Фиг, 4( продолжение 1)

lCV\Crri'GCCACCACCAO0TCr^ATAAGTCCALKiC<:C4';ii:'AA(.'<iACri<Kri1A(K;CAAA ACATO ACGTIl TA АГГСА

ТСАСТТТОССЛ GCACCTGCITCtG A1Л АС Л CC.:AíKK.:CGCl'CAA{XiACTTG UTT.4GCCAAAAAACAACTC AGCTGT CT GATAT ТАСАТСАСОП TTAATIC к

ГСЛСГГЛПССЛССЛ^СТ<ХТГССОЛ IAAG3 (ЗАСЛТСЛССГП'ТЛЛТГСА

901 иаишАЧ 531

GGTATrOAAGCACTGAjVCCGTlTCAl TCAGA!\ATATGATTC"AGTGATnrAACGTCTGCTAGA'rGACACGTCTGGTAAA'l'GA GCTATT<TAAGí;ACTGAACCG-TTTCATTCAG.AWrATGA"I'-ГС^(г;'<>АТ{.ЗС.:ААС:0 iCIXKl'TAGA'ltjACACGTClXJGTAAATGA vK.i ATiG.AAbCACrtiAACCG IllCA'l'f CAGAAAI'A'1üAÍ'I'CAG'1'GATGC/\ACGTCTCK.TaGATGACACG-AGGTAA— G<TATTGA\GCACTGAACCrrTTTCATTCAOAAA'iA'¡'GA'i"rCAG'rGATGCA\CCTCTGCTAGA'rGACACG-AGC-TA^ GCi^TTGAiVGCACK'iAA<:(;ürrr(;ATTCAGA.V^TATGAm\AGTGATnC^CC/l'ClOC

GGIATTCMAGC ACTG AACCGTTTCATTCAG ААЛТ ЛТОАТГСАГ.7ГтАТССААССТСТ<5СТ AO AT GACAf.Xi ICI G GiAAATOA ¿.К -I'ATTG-AAGCaCTG А АССО ПТС АТТС AG Aí\AT Л 1"G Л' ГI 'САйТО А'П i( ; A ACCrTC Т(.КГ Т AG ATG AC ACG TCTGGTaaatga

Сравиеиие последовательностей генов LcrV различных штаммов У. pesíix

Фиг.4(продолжение '

СО42

ЦЕтамкм У. partit H ?4SJ

C-3S2 A-172? СО»2 Angrtl*

чгдоадтслмк»;"*

(-1-3155

Г.5ЯЭ Л-372* СП4?. Ал poli

Kcitcencyuciiax irocii'îjvDinc.tufovri»

ИО-ПЗ M-2.15V C-«2 Л-172Х С<У2 An.îOte

И-М55 11-2.359

An&ota

uiiyiiCiii* последователи m ers.

1 ПОЗИЦИЯ 100

MIRAYEQKPQil?lEDLbW&VEÇLTSiKSSSVL^ RVMÛ3îBL1RXIU LJUVL. 3LPG II U ICN Г

MTRAYKQNPOHI;IJïPI<EKyj\y££.LïG-M^ H.K H< 4 4^1 l t

fc IPE r-IT KU H ! P

ÎCRAYEQNI^HFIFiDbTîKVRVEQT-TÎHGSSVT.^KLVCÎiVKDKNIDISIXYDP.4K0S2Vt'AivRVITDD"E1Л-KX17. A iTT PF IT РГ H/DMOI F iUx ПОЗИЦИЯ 200

LEt_._ -PNljG-L -irt- / il BwL^Ofî.u DI i " EGM^WyGCft&SiivLÎXELASLTAELEIY^ V i EF - S t")1"1 E~L-C-F 4 Ml Го 'L* u UiLf > v L J МЫ ilJi'J DA^SKl IY £4' QAï i К Ы i L5 S 3G'£ IMIH ПК G IN T,K ПКК IA'G

' F GF * N U f lAf a MM г >0 Lt- ' , I INT.^DfU'J.VG

"¿EF -^^Г-тК'-Г m -If-P- -ÎF T i j*"T "vil ,.Mf3H4<30AÎ<SKI<^EEJX.AïïLTA,SLKTV3VTQA?.T.>*KRr.S?îSGTT?nfiRXSÏNLMDKNLYG VKEFT.-ftft-MrC.WK^P.tP'VA^Ibî^^^ADS.ÏCDD-

v IX LaVJSl^ri QAÏI N KHLGSSGTIiJI KDXJ3 lîJLKDKNLïG

VKE F L E 3 SPNTQWE L BI-. FliAVUiiJS LTAD?» IDDDILKVIVDS MHHHCDARSKLaE ELA3LTASLKIY3VI ©?,2 ISEHLS SSGTIN2 HPKS JÎÎLMDK M L Y G 2QZ ШЗШШ* 300

YTHEirr

YTHr-KT >-'KA*JAiïYKIL7J;M?Q7TTQVnG3F.TCKT73IKn^^

yTPSBIFK?^ASYKI LSlMX'QTriQVDG ЗЕККГ.У:?ХКГ)РГ;С8РЛКТ.ТС^ЪаМ1;КМ8У SVNTONN RT.33 EMraSWCftlTO« 0*V3QircTQ&3 0Ш?чШ

ï'i'DH S1 ?Kfi S AEYK ILEra PQTTTQV BGSEKKIVSIК 0 FIGS EWKÎlTGîsîiGXI-KN'S Y3 YKEOHSRLS H ГАТТ Я 3 DF.S RPLN DLV3 QKTTQ13 OIT Ь Ki'M 2

YTDSErrKfiS^YEILEK-ÎPC'TT^

YCi'DEîîli'jOiSAJÏYKILÊ'^^C'TTTQVDir.'îKîCîfry.T

Y. DEZIIT™ 5ЛНГ.Ш LEI<M?GTT^ PAT? С S DES RPL^DLVSQKI'ÎQLS DITSP.F1-1S

3C1 поуицля 32c

ЛI ЕЛ Ll.-ft FIOKY DSVTiCn ЬЬ&ГУГ SGK A Г ?;-Л !.. À' R УIQK Y D S'.'MQR ¡..i.or/?R— AX&Al.tJRS'IQKVOSVMQMfLDDTR--hlZS'.Lï! fi FIQKYDSVHQB^LU DVB GK A ni.ALNft'-TQKYOiJVKQR^LDDTaQK ^I^AUHRri-ÎMYDOVKOK-LOO'fSSr

Сравнение аминокислотных последоватеяь костей белка ЬсгУ из разных штаммов }'.

Фи г.5

12 3 4 6 1 ? 8 $ I* 11 14 13 14 К Г/ <Ь ^ 21 П

14 те д Б

Злс1сгрофоретическмя анализ V антигенов после термообработки.

Линии: 1, 2, 9, Ю, 11, 12, 21, 22 - полшкптид 1сгУ(\¥113); 3, 4, 7, Е, 13, 14, 19, 20.....поди-

метггад 1 !3); 2, 4, 7, 12, 14, 19. 21 ангпг-ены прогреты перед иммунизацией при

45 °С в течение 20 ч; I - маркеры молекулярных масс; 15 - бычий сыворотчный альбумин. Гель Б не содержит додецилсульфш: натрия.

Фиг.6

« н

т

-

А Б

Электрофорепиески,') ;ч,алнi чдамишн и цтисшолнза V антигенов. Линии: 1 маркеры мо.и'ку.пфнич \uicu: ?. 3. 4, 5, ». 7, 8 - полинехпнд 1„сг¥(СШЗ); 9, 10, 11. 12.......полииеггащ 1 »VI 13 У ,/д<ншя проюолц .а, дншш: 2, 9 - антигены прогреты перед протсоли:юм при 41 "{ п к-чсшн '.о ч гри гепн не добшшен; 3, 6, 10 ■ продолжи-

тслыгость дротеоянзн мин; 4, 7, ]\ ш яии: х 8, 12 ...... 120 мин. Соотношение

трипсин/У антиген (м;гсо:<м<; чо пи. иппш 14. I . 100, 6, 7, В, 10, П, 12 .....1 : 200.

Фиг.7

1

1,6 1,4

1,2

I10

< е.в 0,6 0,4 0,2-! о,в ••;

■игУ(вПЗ)

игУ (№1131 ■ исгУ <6113}

а

1хг\/ (\АЖЗ)

1-сгУ(С113}

1сгУ (Ё113)

Ретедшше оьш©!

иг

Титры антител в сшоротках мышей после иммунизации. 1.,ег\'(\У]13) - полны» V антиген с триптофаном в положении 113; 1хгУ(СН 13) - иммуногенный жгантептяд с тшином в положении 113; У антиген Т,егУ(Е! 13) с глутамш-ювой кислотой в положении 113,

Фиг. 8