Структурная и функциональная характеристика PII-подобного белка PotN из Lentilactobacillus hilgardii тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Исхакова Залина Ильгамовна

• Исхакова Залина Ильгамовна
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Исхакова Залина Ильгамовна

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Цели и задачи исследования

Научная новизна полученных результатов

Методология и методы исследования

Достоверность результатов

Теоретическая и практическая значимость работы

Основные положения, выносимые на защиту

Апробация работы и публикации

Место выполнения работы и личный вклад автора

Связь работы с научными программами

Публикация результатов исследования

Объем и структура диссертации

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 История изучения PII белков - от передачи сигналов доступности источников азота до глобального контроля метаболизма

1.1.1 Структурные свойства PII белков

1.1.2 Основная функция PII белков: связывание адениновых нуклеотидов

1.1.3 PII белки координируют центральный метаболизм

1.1.4 PII белки регулирует биосинтез НАД

1.2 Регуляция метаболизма азота факторами транскрипции семейства MerR27

1.2.1 GlnR-регуляция кислотоустойчивости у Lactobacillus brevis

1.2.2 Регуляция азотфиксации у бактерий рода Paenibacillus

1.3 Полиамины. Транспорт и утилизация

1.3.1 Транспортные системы полиаминов

1.3.1.1 Системы PotABCD/PotFGHI

1.3.2 Ассимиляция полиаминов в бактериях

1.4 Система ацетоиндегидрогеназы AoDH ES

1.4.1 Ферменты AoDH ES и соответствующие гены

1.4.2 Восстановление AoDH ES E1, E2 и E3

1.4.3 Регулирование пути AoDH ES

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Методы работы с бактериальными клетками

2.1.1 Штаммы

2.1.2 Питательные среды и условия культивирования бактерий

2.1.3 Трансформация клеток E. coli методом электропорации

2.2 Методы работы с нуклеиновыми кислотами

2.2.1 Плазмидные векторы

2.2.2 Выделение геномной ДНК лактобацилл методом фенол-хлороформной экстракции

2.2.3 Выделение плазмидной ДНК с помощью GeneJET Plasmid Miniprep Kit 64 2.2.4. Выделение РНК из клеток бактерий с помощью набора Blue Kit

2.2.5 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2.2.6 Метод энзиматической сборки фрагментов ДНК по Гибсону

2.2.7 Электрофорез ДНК

2.3 Схемы получения рекомбинантных конструкций

2.4 Методы работы с белками

2.4.1 Получение клеточных экстрактов E. coli

2.4.2 Очистка белков на Ni-NTA сефарозе

2.4.3 Очистка белков на стрептактин сефарозе

2.4.4 Эксклюзионная хроматография

2.4.5 Диализ белков

2.4.6 Определение концентрации белка

2.4.7 Электрофорез белков в денатурирующих условиях

2.4.8 Окрашивание белковых гелей кумасси синим

2.4.9 Окрашивание белковых гелей нитратом серебра

2.4.10 Осаждение белков с помощью трихлоруксусной кислоты

2.4.11 Иммуноблоттинг (Western Blot)

2.4.12 Иммунодетекция

2.4.13 Кристаллическая структура белка

2.5 Методы анализа взаимодействия макромолекул

2.5.1 Анализ взаимодействия белков методом ко-элюции (Pull Down)

2.5.2 Иммунопреципитация

2.5.3 Исследование взаимодействия белков методом микромасштабного термофореза

2.5.4 Метод задержки в геле

2.6 Аналитические методы

2.6.1 Изотермальная титрующая калориметрия

2.6.2 Определение активности ß-галактозидазы

2.6.3 Определение АТФазной активности

2.6.4 Определение уровня АТФ в клетках

2.7 Математические методы

3

2.7.1 Биоинформатика

2.7.2 Обработка и анализ данных

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Анализ аминокислотной последовательности и филогенетического положения белка PotN относительно других PII белков

3.2 Структурная характеристика PotN

3.2.1 Оценка способности белка PotN к олигомеризации

3.2.2 Получение кристалла и трехмерной структуры белка PotN

3. 3 Идентификация низкомолекулярных эффекторов для белка PotN

3.4 Определение белков-партнеров для взаимодействия с белком PotN и характер их взаимодействия in vivo и in vitro

3.4.1 Определение белков-партнеров для взаимодействия с белком PotN методом ко-элюции и иммунопреципитации

3.4.2 Определение характера взаимодействия белка PotN с белками партнерами in vivo

3.4.3 Определение характера взаимодействия белка PotN с белками партнерами in vitro

3.5 Оценка экспрессии гена potN в клетках L. hilgardii и определение физиологической роли белка PotN

3.5.1 Определение уровня экспрессии гена potN в клетках L. hilgardii при постепенном истощении среды в процессе культивирования бактерий на селективной среде

3.5.2 Определение уровня экспрессии гена potN в клетках L. hilgardii при переносе клеток из богатой среды в условия недостатка питательных веществ с добавлением различных источников азота

3.5.3 Определение уровня экспрессии гена potN в клетках L. hilgardii при переносе клеток из богатой среды в условия недостатка питательных веществ с добавлением в различных соотношениях источников азотного и энергетического питания

3.6 Определение функциональной роли белка PotN в клетках L. hilgardii в различных условиях

3.6.1 Определение влияния белка PotN на АТФазную активность белка PotAc

3.6.2 Конкурентное связывание PotAc и GlnR c PotN в различных физиологических условиях

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГТ Ангидротетрациклин

АДФ Аденозиндифосфат

АКК Ацетил-КоА-карбоксилаза

АЛДК а-ацетолактатдекарбоксилаза

АЛС а-ацетолактатсинтаза

АМФ Аденозинмонофосфат

АТФ Аденозинтрифосфат

АФК Активные формы кислорода

БНБК Биотинкарбоксил

БСА Бычий сывороточный альбумин

ВЭЖХ Высокоэффективная жидкостная хроматография

ГАМК Гамма-аминомасляная кислота

GS (ГС) Глутаминсинтетаза

ДМСО Диметилсульфооксид

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

ДТТ Дитиотреитол

ДЭПК Диэтилпирокарбонат

ЖХ-МС Жидкостная хроматография с тандемной масс-

спектрометрией

ИПТГ Изопропил-^-О-1 -тиогалактопиранозид

Кд Константа диссоциации

кДа Килодальтон

КоА Кофермент А

КЭ Клеточный экстракт

мРНК Матричная рибонуклеиновая кислота

НАД Никотинамидадениндинуклеотид

ПААГ Полиакриламидный гель

ПДГ Пируватдегидрогеназа

ПЦР Полимеразная цепная реакция

РНК Рибонуклеиновая кислота

рРНК Рибосомальная рибонуклеиновая кислота

ц-ди-АМФ Циклический димерный аденозинмонофосфат

ц-ди-ГМФ Циклический димерный гуанозинмонофосфат

СТАВ Бромид цетилтриметиламмония

ФАД Флавинадениндинуклеотид

цАМФ Циклический аденозинмонофосфат

ЭДТА Этилендиаминтетраацетат

ЭСБ Энхансер-связывающий белок

2-ОГ 2-оксоглутарат

AA Акриламид

ACP Путь ацетилирования полиаминов

AMTBP Аминотрансферазный путь биосинтеза полиаминов

AoDH ES Ферментная система ацетоиндегидрогеназы

BIS-AA Бис-акриламид

CcpA Катаболитный контрольный белок А

CCR Путь репрессии углеродного катаболита

dNTP Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты

DOP путь прямого окисления полиаминов

emPAI Экспоненциально модифицированный индекс

содержания белков

GAD Глутаматдекарбоксилаза

GGP Путь гамма-глутамилирования полиаминов

HABA 2-[4-гидроксибензенеазо] бензойная кислота

HTH Петля-поворот-петля (helix-turn-helix)

ITC Изотермальная титрующая колориметрия

LB (LA) Питательная лизогенная среда Лурия-Бертани (агаризованная)

MP Метод максимальной экономии построения

филогенетического дерева

MRS Питательная среда Де Мана, Рогозы и Шарпа

MST Микромасштабный термофорез

NAGK ^ацетил^-глутаматкиназа

ONPG Орто-нитрофенил^-галактозид

PBS Фосфатно-солевой буфер

PMSF Фенилметилсульфонил фторид

PSA Персульфат аммония

SAM S-аденозилметионин

SD Последовательность Шайна-Дальгарно

SDS Додецил сульфат натрия

SMM Синтетическая минимальная среда

SPDP Дегидрогеназный спермин/спермидин путь

биосинтеза полиаминов

TEMED Тетраметилетилендиамин

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурная и функциональная характеристика PII-подобного белка PotN из Lentilactobacillus hilgardii»

Актуальность темы исследования

PII белки представляют собой глобальные регуляторы, встречающиеся в клетках бактерий, архей и в пластидах растений. PII белки реагируют на изменения в метаболическом состоянии клетки путем конкурентного связывания в различных соотношениях и комбинациях ключевых метаболитов (нуклеотиды, 2-оксоглутарат, глутамин). Связываясь с лигандами, PII белки меняют свою конформацию, что дает им возможность обратимо взаимодействовать с широким спектром белков-мишеней и тем самым изменять их активность, обеспечивая оптимальный уровень азотного и углеродного обмена в зависимости от доступности питательных веществ [Lüddecke, Forchhammer, 2013]. Среди белков-мишеней для связывания PII белками широко распространены факторы транскрипции, АВС-транспортеры, ферменты ассимиляции азота и углерода [Xu et al, 2020, Selim et al, 2020, Grau et al., 2021]. Связываясь со своими мишенями, PII белки модулируют их активность и за счет этого управляют интенсивностью ключевых этапов метаболизма, транспорта в клетку источников азота, а также могут регулировать выработку сигнальных молекул (ц-ди-ГМФ) и кофакторов (НАД+) [Gerhardt et al, 2020, Santos et al, 2020]. Таким образом, PII белки являются основными регуляторными центрами клеточного метаболизма, «молекулярными процессорами», обеспечивающими оптимальный уровень обмена веществ клетки в ответ на доступность питательных веществ [Forchammer et al, 2022].

Лактобактерии широко используются в качестве пробиотических бактерий для поддержания гомеостаза кишечника и производства ферментированных и функциональных пищевых продуктов и биоконсервантов. В естественной среде обитания (ротовая полость и ЖКТ человека и животных, сырые и ферментированные молочные и растительные продукты) лактобациллы подвержены множественным стрессовым воздействиям [Hussain et al., 2013], в том числе из-за несбалансированности легко метаболизируемых источников

7

энергии, азота и углерода и должны иметь инструменты для регуляции обменных процессов в ответ на доступность питательных веществ. Ранее в нашей лаборатории при анализе аминокислотных последовательностей лактобацилл было обнаружено, что PII-подобный белок встречается только у 5 из более чем 400 видов семейства Lactobacillaceae, идентифицированных к сегодняшнему дню. К ним относятся Lentilactobacillus hilgardii, выделенный из вина [Zhuravleva et al., 2020], Lentilactobacillus farragines выделенный из компостного материала [Yuki et al., 2014], Lentilactobacillus buchneri из ротовой полости человека [Qin et al., 2013], Loigolactobacillus bifermentans выделенный из кисломолочных продуктов [Kim, 2019], Liquorilactobacillus ghanensis выделенный из ферментированного какао [Sun et al., 2015]. Более того, в клетках этих бактерий ген, кодирующий гомолог PII белка, расположен внутри оперона АВС-транспортера полиаминов potABCD, что не характерно для генов других описанных PII белков [Iskhakova et al., 2016].

На сегодняшний день остается открытым вопрос почему только у данных видов лактобактерий, при этом живущих в различных экологических нишах, возникло адаптационное преимущество в виде PII-подобного регулятора. Регуляция метаболизма посредством PII белков в молочнокислых бактериях остается неисследованной и открывает новые горизонты для создания принципиально новых подходов к контролю метаболизма лактобактерий, широко используемых в биотехнологических процессах. И поэтому анализ молекулярных механизмов регуляции метаболизма в клетках лактобацилл посредством PII-подобного белка является актуальной задачей.

Цели и задачи исследования

Целью работы являлось дать биохимическую, структурную и функциональную характеристику новому PII-подобному белку PotN из L. hilgardii и определить его физиологическую роль в регуляции метаболизма в клетках этих бактерий.

В работе решались следующие задачи:

1) На основе in silico анализа аминокислотной последовательности определить филогенетическое положение белка PotN относительно других PII белков и оценить возможность его функционирования как PII белка.

2) Охарактеризовать четвертичную структуру рекомбинатного белка PotN и оценить способность образовывать стабильный тример в растворе.

3) Определить лиганды для связывания с белком PotN методом изотермальной титрующей калориметрии, рассчитать их равновесные константы диссоциации и определить количество сайтов связывания в белке.

4) Определить белки-партнеры для взаимодействия с PII белком PotN и оценить влияние АТФ и АДФ на их связывание с PotN in vitro и in vivo.

5) Определить влияние условий культивирования на экспрессию гена potN в клетках Lentilactobacillus hilgardii и установить физиологическую роль белка PotN в этих бактериях.

Научная новизна полученных результатов

Охарактеризован новый белок PotN, который является первым представителем нового подсемейства PII белков - PotN (Pot белок, связывающий нуклеотиды (N)). Данное подсемейство белков в процессе эволюции сформировало обособленную группу и имеет низкую идентичность с PII белками из других подсемейств. Гены данных белков расположены в опероне АВС-транспортера полиаминов potABCD, что является уникальным для данного подсемейства PII белков генетическим окружением, тогда как гены всех других известных PII белков являются либо моноцистронными, либо ассоциированы с транспортером аммония AmtB.

Был получен кристалл белка PotN и методом рентгеноструктурного анализа установлена его структура. В растворах PotN формирует стабильный тример, имеет классическую ферредоксин-подобную укладку, характерную для других PII белков, и способен связывать только АТФ и АДФ.

В работе впервые в качестве белков-партнеров для взаимодействия с PII белком идентифицированы белки GlnR (фактор транскрипции семейства MerR), PotA (АТФазная субъединица транспортера полиаминов), а также AcoB (в-субъединица ацетоиндегидоргеназы). При этом сродство PotN к GlnR повышается в присутствии АТФ, тогда как сродство к PotA увеличивается в присутствии АДФ. В свою очередь, образование комплекса с PotN приводит к репрессии АТФазной активности белка PotA.

В работе показана физиологическая роль белка PotN в клетках L. hilgardii: в условиях недостатка энергетического питания PotN переходит в АДФ-связанное состояние и преимущественно взаимодействует с субъединицей PotA АВС-транспортера полиаминов и подавляет его АТФазную активность, а также открепляется от GlnR, что дает возможность GlnR связывать ДНК и активировать транскрипцию генов GlnR-регулона. В АТФ-связанном состоянии PotN взаимодействует с GlnR и тем самым снижает уровень транскрипции регулона.

Методология и методы исследования

Экспериментальное решение задач исследования осуществлено с применением молекулярно-генетических, биохимических, физико-химических и микробиологических методов, включая методы биоинформатики, средства обработки данных. Для получения исследуемых белков в электрофоретически гомогенном состоянии использовали метод аффинной хроматографии. Для определения лигандов для связывания с белком использовали метод изотермальной титрующей калориметрии. Для исследования белок-белковых взаимодействий использовали методы аффинной хроматографии, микромасштабного термофореза и бактериальной дигибридной системы. Для определения экспрессии генов использовали метод ПЦР в режиме реального времени с обратной транскрипцией. Для исследования ДНК-белковых взаимодействий использовали метод задержки в геле.

Достоверность результатов

Описанные в диссертационной работе результаты получены с использованием современных молекулярно-генетических, биохимических и микробиологических методов, подтверждены несколькими экспериментами, основанными на разных принципах и сериями измерений в нескольких биологических повторах. Представленные в работе результаты экспериментов проанализированы методами статистического анализа и являются достоверными. Большая часть полученных результатов диссертации опубликованы в журналах, индексируемых РИНЦ, WoS и Scopus, и представлены на международных и всероссийских научных конференциях.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные результаты вносят вклад в блок фундаментальных знаний о механизмах регуляции азотного и энергетического обмена в клетках бактерий. Регуляция работы факторов транскрипции и транспортера полиаминов PII-подобными белками на сегодняшний день представлена единичными работами, полученные результаты расширяют представления о функциях PII белков в клетках микроорганизмов. Понимание молекулярных механизмов контроля клеточного метаболизма PII белками, модуляции центрального метаболизма, может быть реализована в метаболической инженерии биотехнологических штаммов микроорганизмов, а также в синтетической биологии для разработки клеточных биосенсоров.

Основные положения, выносимые на защиту

1) Белок PotN имеет характерную для PII белков четвертичную структуру и способен связывать АТФ и АДФ, но максимум 46% идентичности с каноническими PII белками, формируя отдельную кладу на филогенетическом дереве, и его ген расположен в опероне АВС транспортера полиаминов potABCD, что позволяет отнести PotN к новому подсемейству PII подобных белков.

2) Белками-партнерами для взаимодействия с PotN являются фактор транскрипции GlnR, АТФазная субъединица транспортера полиаминов PotA и в-субъединица пируват/2-оксоглутарат/ацетоиндегидоргеназы AcoB. Белок PotN связывается с GlnR преимущественно в условиях избытка АТФ, тогда как взаимодействие PotN-PotA происходит при избытке АДФ.

3) Экспрессия гена potN повышается в условиях энергетического голодания при достатке азотного питания. При этом в ответ на высокий уровень АТФ PotN блокирует ДНК-связывающую активность GlnR, а в ответ на избыток АДФ PotN подавляет АТФазную активность белка PotA.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертационной работы представлены на 25 международных и российских конференциях, таких как Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2015, 2016, 2017, 2018), Международная школа-конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2015, 2016, 2018, 2021), Международная конференция The FEBS Congress (Кушадасы, 2016; Краков, 2019), Трансляционная медицина 2016 (Казань, 2016), Всероссийская конференция с международным участием «Актуальные проблемы современной генетики», посвященная 40-летию кафедры генетики КФУ (Казань, 2016), Международный молодежный научный форум «ЛОМОНОСОВ» (Москва, 2018, 2019), Всероссийская школа-конференция молодых ученых «Биосистемы: организация, поведение, управление» (Нижний Новгород, 2019, 2020, 2021, 2022), XII Всероссийский конгресс молодых ученых-биологов с международным участием (Пермь, 2020), Международная научно-практическая конференция «Биотехнология: наука и практика» (Ялта, 2020), Европейский биотехнологический конгресс 2020 (Прага, 2020), Международная конференция The International Conference on Agriculture and Rural Development (ICARD) (Индонезия, 2021), Международная конференция European Society for clinical investigation (ESCI)

12

(Онлайн собрание, 2021; Бари, 2022), 3-й Российский микробиологический конгресс (Псков, 2021).

Место выполнения работы и личный вклад автора

Работа выполнена на кафедре генетики Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета и НИЛ Молекулярная генетика микроорганизмов. Автором диссертации совместно с научным руководителем разработаны главные направления научного исследования, сформулирована цель, поставлены задачи исследовательской работы. Диссертантом лично или с коллективом коллег выполнены экспериментальные исследования, проведен анализ и статистическая обработка полученных данных, сформулированы выводы. Обсуждение и подготовка статей к публикации (написание и редактирование) проводилось совместно с научным руководителем и соавторами.

Планирование экспериментов по исследованию взаимодействий белка PotN методами микромасштабного термофореза и изотермальной титрующей калориметрии проводились совместно с профессором Карлом Форшхаммером в Университете Тюбингена (Германия).

Кристаллография была проведена сотрудниками лаборатории «Белковая эволюция» Института Макса Планка, Кристофером Хейманом и Маркусом Хартманном. Жидкостная хроматография с тандемной масс-спектрометрией была проведена сотрудником НИЛ Мультиомиксные технологии живых систем, Казанского (Приволжского) федерального университета, Лайковым Александром Владимировичем.

Связь работы с научными программами

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ 14-0432317 мол_а (2014-2015) «Регуляция азотного метаболизма в клетках молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum» (исполнитель), РФФИ 15-04-02583А (2015-2017) «Сигнальная роль глутамина у микроорганизмов:

13

молекулярные механизмы регуляции азотного обмена и сигналинга в клетках грамположительных бактерий» (исполнитель), гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых -докторов наук № МД-572.2020.4 (2020-2021) «Мультифункциональная роль PII-подобных регуляторных белков в клетках бактерий класса Bacilli» (исполнитель), гранта Минобрнауки России и Германской службы академических обменов (DAAD) по программе «Михаил Ломоносов» - Линия A 2019(57447858) «PII подобный белок PotN из Lactobacillus brevis -представитель нового подсемейства регуляторов азота PII» и Программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета.

Публикация результатов исследования

По материалам работы опубликовано 34 работ, в том числе 4 научные статьи в международных журналах, индексируемых в базах данных Web of Science и Scopus, и 4 тезисов в приложении к журналам, индексируемыми в Web of Science и Scopus.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, обсуждения результатов, выводов, приложений и списка цитируемой литературы. Текст изложен на 170 странице, проиллюстрирован 47 рисунками, включает 10 таблиц, список литературы содержит 200 библиографических источника.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 История изучения PII белков - от передачи сигналов доступности источников азота до глобального контроля метаболизма

Первый сигнальный PII белок был идентифицирован в конце 1960-х годов как небольшой регуляторный белок, влияющий на ковалентную модификацию активности глутаминсинтетазы в Escherichia coli. Долгое время этот белок считался специализированным модулем передачи сигнала у протеобактерий, который реагирует на баланс углерода/азота, определяя уровни клеточного глутамина [Arcondeguy et al., 2001] и 2-оксоглутарата (2-ОГ) [Truan et al., 2010]. Спустя более 20 лет после первого описания PII белка стало очевидно, что гомологи PII белков широко распространены в бактериальном домене, а также присутствуют у некоторых архей и у эукариотических фототрофов [Leigh et al., 2007, Selim et al., 2020]. Кроме того, было установлено, что множественные паралоги PII белков могут присутствовать у прокариот. В дополнение к первым исследованиям у E. coli [Huergo et al., 2013], гомологи PII белков широко изучались у азотфиксирующих [Dixon, Kahn, 2004] и цианобактерий [Forchhammer, Selim, 2020]. К середине первого десятилетия нового тысячелетия было признано, что PII белки контролируют различные реакции анаболического метаболизма азота, от поглощения аммиака и фиксации азота до биосинтеза аргинина, а также контролируют азотзависимую экспрессию генов. В связи с этим их назвали «сенсорами 2-оксоглутарата, регулирующими азотистый обмен» [Ninfa, Jiang, 2005]. Филогенетический анализ [Selim et al., 2020] расширил представление о белках PII, показав, что гомологи PII составляют одно из наиболее широко распространенных семейств белков трансдукции сигналов в природе. Быстрый рост интенсивности секвенирования генов в 1990-х годах привел к распознаванию многих других генов, кодирующих членов семейства PII белков, но аннотация этих генов была довольно случайной, в результате чего возникла сложная и запутанная ситуация. В 2001 году Аркондеги с коллегами предложили новую

15

номенклатуру [Arcondéguy et al., 2001] в попытке создать рациональную основу для описания членов семейства PII белков. Они предложили три основные подгруппы, glnB, glnK и nifI, на основе двух основных критериев, а именно сохранения генетического сцепления с другими генами и сходства на уровне первичной аминокислотной последовательности. Предложенные гены glnB были преимущественно связаны с glnA (структурный ген глутаминсинтетазы) или nadE (кодирующий НАД-синтетазу); обозначение glnK использовали для тех генов PII белков, которые были связаны с AmtB (структурный ген белка аммиачного канала); и новое обозначение nifI было предложено для PII белков, гены которых связаны со структурными генами нитрогеназы (nifH,, nifD и nifK). Гены nifI обычно представлены двумя близкородственными генами, обозначенными nifI1 и nifI2 [Leigh, Dodsworth, 2007]. С достижениями в определении трехмерной структуры белка стало очевидно, что семейство сигнальных PII белков должно быть расширено, чтобы включить PII-паралогичные белки, которые имеют сильную структурную гомологию с каноническими PII белками, хотя и с очень ограниченным сохранением аминокислотной последовательности [Forchhammer, Lüddecke, 2016]. Эти новые члены надсемейства PII белков с низким сходством последовательностей с первоначально описанными PII белками называются PII-подобными белками (Рисунок 1) [Forchhammer et al., 2022].

Связанный с карбоксисомой PII-подобный белок, который был назван CPII, был недавно охарактеризован из протеобактерии Thiomonas intermedia. Было обнаружено, что CPII связывает АДФ/АМФ и бикарбонат, и было предположено, что он способен контролировать углеродный метаболизм посредством определения доступности бикарбоната [Wheatley et al., 2016]. Интересно отметить, что у цианобактерий другой PII-подобный сигнальный белок, названный SbtB, также контролировал центральный углеродный метаболизм, регулируя переносчик бикарбонатов SbtA и фермент, разветвляющий гликоген, GlgB [Fang et al., 2021, Selim et al., 2021]. Белки SbtB могут связывать несколько адениновых нуклеотидов, включая АТФ, АДФ,

16

АМФ и нуклеотиды второго мессенджера цАМФ и ц-ди-АМФ [Gundlach et al., 2015, Kaczmarski et al., 2019]. Сходным образом другие PII-подобные белки, называемые PstA или DarA, были идентифицированы у фирмикут как связывающие только ц-ди-АМФ; однако точные функции этих белков остаются неясными [Choi et al., 2015, Müller et al., 2015]. Первый PII-подобный белок с ферментативной активностью был идентифицирован у бактериофага, и было показано, что он катализирует лизис S-аденозилметионина (SAM). Каталитический сайт этой PII-подобной SAMазы расположен в латеральных щелях между субъединицами, напоминая нуклеотидсвязывающие карманы канонических PII белков [Guo et al., 2021]. Способность различных PII-подобных белков связывать/гидролизовать нуклеотиды на основе аденина согласуется с гипотезой о том, что изначальной функцией предковых белков суперсемейства PII, вероятно, было взаимодействие с адениновыми нуклеотидами, которое позже было расширено в большинстве канонических белков PII, путем дополнительного взаимодействия 2-ОГ с Mg^-АТФ-лигированным PII белком [Forchhammer, Selim, 2020, Selim et al., 2021].

Рисунок 1 - Структурные суперпозиции канонического PII белка с неканоническими членами (PII-подобные белки), демонстрирующие сохранение ферредоксиноподобной складки и связывающего кармана среди различных членов суперсемейства PII [Forchammer et al., 2022] Другим представителем подсемейства PII-подобных белков с очень низкой идентичностью последовательностей с каноническими белками PII, является

T-loop B-ioop c-di-AMP (Veihjlat T-toop) Hairpin-loop

двухвалентный белок устойчивости к ионам, CutA [Arnesano et al., 2003, Forchhammer, Lüddecke, 2016]. CutA повсеместно распространен во всех сферах жизни [Selim et al., 2021]. Первоначально было предложено, что продукт гена cutA придает E. coli устойчивость к тяжелым металлам [Fong et al., 1995]. Однако такая функция остается под вопросом, т. к. сходный фенотип для мутантов cutA не наблюдается у других организмов [Burkhead et al., 2003, Selim, Haffner, 2020]. Интересно, что связывающий карман CutA, который соответствует аденил-связывающему карману PII белков, образован высококонсервативными остатками, но заметно отличается от канонических PII белков, указывая на измененную сигнальную функцию CutA [Selim et al., 2021].

Первые указания на то, что канонические PII белки не только различными способами регулируют реакции ассимиляции азота, но и участвуют в глобальной регуляции центрального метаболизма, были получены в результате идентификации ацетил-КоА-карбоксилазы (АКК, ключевого фермента биосинтеза жирных кислот) в качестве мишени регуляции PII белка у Arabidopsis thaliana [Feria-Bourrellier et al., 2010]. Первоначально рассматриваемая как специфическая особенность передачи сигналов PII белков у растений, вскоре стало ясно, что АККаза также является мишенью регуляции PII белков у многих бактерий [Rodrigues et al., 2014, Gerhardt et al., 2015, Hauf et al., 2016].

В последние годы круг описанных мишеней PII белков значительно расширился и выявил способность PII белков взаимодействовать со всеми видами клеточных мишеней (Рисунок 2 А). Исходя из текущего понимания сигнальных систем PII белков, предполагается, что передача сигналов этими белками возникла на ранней стадии эволюции, чтобы контролировать набор высококонсервативных белков, которые играют центральные роли в анаболических реакциях и, таким образом, широко распространены во всех областях жизни [Forchammer et al., 2022].

Рисунок 2 - PII-структура и общие мишени PII белков у бактерий. (A) Общая схема работы PII белков, напоминающая функцию центрального процессора [Ninfa, Atkinson 2000]. Белки-мишени, специфичные для цианобактерий, написаны зеленым цветом, универсальные мишени — красным. Серым цветом обозначены мишени PII белков за пределами цианобактерий. (Б) Щели между субъединицами образуют сайты связывания метаболитов.

Дистальная часть большой Т-образной петли, подверженной воздействию растворителя, неупорядочена и, следовательно, не рассасывается. Пунктирные линии соединяют проксимальные части Т-образной петли.

PTM - посттрансляционная ковалентная модификация кончика Т-петли [Forchhammer et al., 2020]

Высококонсервативные мишени PII белков включают транспортный канал аммония (AmtB), который был описан у ряда бактерий [Conroy et al., 2007, Watzer et al., 2019] и архей [Müller et al., 2021], и комплекс PII-АККаза [Gerhardt et al., 2015 Selim et al., 2020]. Взаимодействие PII белков с N-ацетил-L-глутаматкиназой (NAGK, ферментом, контролирующим синтез аргинина) долгое время считалось ограниченным оксигенными фототрофами (цианобактериями и растениями) [Forchhammer, Selim 2020], но недавно

взаимодействие PII-NAGK было обнаружено у разных видов бактерий [Xu et al., 2020, Gerhardt et al., 2020]. Несмотря на то, что нельзя отбросить гипотезу о более поздних событиях горизонтального переноса генов, более вероятно, что эти комплексы появились у глубоко разветвленных общих предков и сохранялись в ходе эволюции. Предполагается, что PII белки эволюционировали одновременно с большинством метаболических путей, известных на сегодняшний день, и что во время адаптации к разному образу жизни сигнальные свойства PII белков также были адаптированы для специализированных функций, таких как фиксация азота в определенных филогенетических линиях. Таким образом, PII белки были преобразованы в основные узлы регуляции метаболизма в различных бактериальных линиях.

Первоначально открытая классическая функция PII белков как регуляторов глутаминсинтетазы посредством взаимодействия с двухкомпонентной системой NtrB-NtrC и ферментом, модифицирующим глутаминсинтетазу GlnE в клетках Proteobacteria является к специализированной функцией белков PII, так как она отсутствует у других филогенетических групп. Ввиду глобальной роли PII белков для клеточного метаболизма определение их как регуляторов азотного метаболизма больше не является актуальным [Forchhammer et al., 2022].

1.1.1 Структурные свойства PII белков

PII белки - это небольшие гомотримерные белки, мономер которых состоит из 112 аминокислот и демонстрирует ферредоксин-подобную складку (ß-aß)2, за которой следует бета-шпилька [Xu et al., 2003]. Очень заметными структурными особенностями PII белков являются длинные гибкие Т-образные петли (Рисунок 2 Б), образованный 18-20 остатками аминокислот, которые заканчиваются шпилькой ß2-ß3 каждой субъединицы [Xu et al., 2003]. Эти петли являются ключевыми элементами для взаимодействия PII белков с их мишенями [Conroy et al., 2007, Chellamuthu et al., 2014]. Все PII белки,

охарактеризованные на сегодняшний день, способны связывать

20

аденилнуклеотиды (АТФ и АДФ), и большинство PII белков, кроме того, могут связывать 2-ОГ [Forcada-Nadal et al., 2018]. Связывание эффекторных молекул происходит в щелях, образующихся в местах контакта субъединиц. Две маленькие В- и С-петли из противоположных субъединиц образуют зажим, который координирует фосфаты аденилнуклеотидов. Связанный нуклеотид встраивается в расщелине и частично связывает базальную часть большой Т-петли. Тонкие различия в способе связывания нуклеотидов приводят к различным контактам, в итоге изменяется конформация структуры Т-петли в зависимости от того, какой нуклеотид был связан [Zeth et al., 2014]. Во всех изученных до сих пор случаях на структурном уровне, при связывании 2-ОГ требуется присутствие Mg^-АТФ в кармане связывания. Ион Mg2+, частично координируемый фосфатами АТФ, завершает свою гексагональную координационную сферу, взаимодействуя с атомами кислорода карбонильной и карбоксильной частей 2-ОГ [Fokina et al., 2010, Truan et al., 2010]. Кроме того, 2-ОГ образует солевой мостик с высококонсервативным остатком лизина, расположенным на заднем конце Т-петли. Связывание 2-ОГ вызывает значительное конформационное изменение в структуре Т-петли, которая становится более плотной при связывании с этим эффектором. В результате связывания различных метаболитов в различном соотношении Т-петля принимает различные конформации, в зависимости от связанного метаболита, и, таким образом, ее конформация отражает информацию о фактической концентрации эффекторных молекул. Чтобы передать эту информацию к сигнальным мишеням, Т-петля действует как универсальный контактный модуль, эволюционировавший для взаимодействия с различными рецепторными белками [Selim et al., 2021]. В целом, индуцируемая 2-ОГ конформация Т-петли отменяет большинство взаимодействий PII белков с мишенями, так как разные рецепторы могут взаимодействовать с PII белком в состояние, связанном только с АТФ или АДФ. Во многих случаях PII белки могут быть модифицированы на кончике Т-петли с помощью посттрансляционной ковалентной модификации, такой как фосфорилирование,

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Исхакова Залина Ильгамовна, 2023 год

Источник

pASK-IBA3plus

Сайт для множественного клонирования расположен под контролем ¿^-промотора. Получение рекомбинантного белка с С-концевой стрептавидиновой

аффинной меткой

«1Ьа

Lifesciences», Германия

pASK-IBA5C

Сайт для множественного клонирования расположен под контролем tet-промотора. Получение рекомбинантного белка с N концевой стрептавидиновой

аффинной меткой

«1Ьа

Lifesciences», Германия

рЕТ15Ь

Сайт для множественного клонирования расположен под промотор фага Т7 под контролем 1ас-оператора. Получение рекомбинантного белка с К-концевым гексагистидиновым пептидом

«Novagen», Германия

рЕТ15ЬСТегтН8

Сайт для множественного клонирования расположен под промотор фага Т7 под контролем 1ас-оператора. Получение рекомбинантного белка с С-концевым октогистидиновым пептидом

et а1.

2020]

риТ18С

Создан на основе риС19; при клонировании экспрессируется фьюжен-конструкция

исследуемого белка с Т18 фрагментом аденилатциклазы на С-конце

«Euromedex», Франция

Плазмида Описание Источник

pKT25 Создан на основе pSU40; при клонировании «Euromedex»,

экспрессируется фьюжен-конструкция Франция

исследуемого белка с T25 фрагментом

аденилатциклазы на С-конце

pUT18 zip Создан на основе pUT18C. «Euromedex»,

Последовательность кодирует область Франция

лейциновой молнии дрожжевого белка GCN4

и служит положительным контролем

pKT25 zip Создан на основе pKT25. Последовательность «Euromedex»,

кодирует область лейциновой молнии Франция

дрожжевого белка GCN4 и служит

положительным контролем

pASK3-PotN pASK-IBA3plus несет генpotNL. hilgardii [Каюмов, 2018]

pASK3-PotN91 pASK-IBA3plus несет ген potN L. hilgardii [Каюмов,

кодирующий белок PotN91 с заменой G91A 2018]

pASK3-AcoB pASK-IBA3plus несет ген acoB L. hilgardii. acoB амплифицировали методом ПЦР с использованием праймеров pASK3_AcoB_up - pASK3_AcoB_lw Эта работа

pASK-EcCutA pASK-IBA3 несет ген cutA E. coli ^еНт et al., 2021]

pASK5-GlnR pASK-IBA5C несет ген glnR L. hilgardii [Журавлева, 2021]

pASK5-PotAc pASK-IBA5C несет ген potAc L. hilgardii. potAc амплифицировали методом ПЦР с использованием праймеров pASK5_PotAc_For - pASK5_PotAc_Rev Эта работа

pET15-GlnR pET15b несет ген glnR L. hilgardii [Журавлева, 2021]

pET15-PotAc pET15b несет ген potAc L. hilgardii [Каюмов, 2018]

pET15-AcoB pET15b несет ген acoB L. hilgardii. acoB амплифицировали методом ПЦР с использованием праймеров pet AcoB for -pet_AcoB_rev Эта работа

Плазмида Описание Источник

pET15C-PotN pET15bCTermH8 несет ген potN L. hilgardii. potN амплифицировали методом ПЦР с использованием праймеров pET15C_PotN_for - pET 15C_PotN_rev Эта работа

pET15C-PotN91 pET15bCTermH8 несет ген potN L. hilgardii. potN91 амплифицировали методом ПЦР с использованием праймеров pET 15C_PotN_for - pET 15C_PotN_rev Эта работа

pUT181 pUT18 несет ген potN L. hilgardii [Журавлева, 2021]

pUT182 pUT18 несет ген potN L. hilgardii кодирующий белок PotN91 с заменой G91A. potN91 амплифицировали методом ПЦР с использованием праймеров pUT 18_PotN_for -pUT 18_PotN_rev Эта работа

pKT25GlnR pKT25 несет ген glnR L. hilgardii [Журавлева, 2021]

pKNT25GlnR pKT25N несет ген glnR L. hilgardii [Журавлева, 2021]

pKT25PotA pKT25 несет ген potA L. hilgardii. potA амплифицировали методом ПЦР с использованием праймеров PotA25 for -PotA25 rev Эта работа

pKNT25PotA pKT25N несет ген potA L. hilgardii. potA амплифицировали методом ПЦР с использованием праймеров PotA25n for -PotA25n rev Эта работа

pKT25AcoB pKT25 несет ген acoB L. hilgardii. acoB амплифицировали методом ПЦР с использованием праймеров AcoB25 for -AcoB25 rev Эта работа

pKNT25AcoB pKT25N несет ген acoB L. hilgardii. acoB амплифицировали методом ПЦР с использованием праймеров AcoB25n for -AcoB25n rev Эта работа

2.2.2 Выделение геномной ДНК лактобацилл методом фенол-хлороформной экстракции

Пять миллилитров ночной культуры центрифугировали в течение 1 мин при 13 тыс. об/мин. Осадок ресуспендировали в 500 мкл раствора I (25 мМ трис-HCl, 50 мМ глюкозы, 10 мМ ЭДТА, pH 8,0) и добавляли лизоцим до конечной концентрации 6 мг/мл. Суспензию инкубировали 2 ч при температуре 37 °C с качанием 200 об/мин. К смеси добавляли SDS до конечной концентрации 0,1-0,5%. Затем смесь осторожно перемешивали до полного разрушения клеток. Затем добавляли 500 мкл смеси фенол:хлороформ:изоамиловый спирт в соотношении 25:24:1. Смесь интенсивно перемешивали встряхиванием и центрифугировали в течение 10 минут при 13 тыс. об/мин. Верхнюю фазу смеси переливали в 1 мл изопропанола. Преципитированную ДНК наматывали на пластиковый наконечник, затем промывали в 1 мл 96% этанола, просушивали на воздухе и ресуспендировали в 100 мкл дистиллированной воды.

2.2.3 Выделение плазмидной ДНК с помощью GeneJET Plasmid Miniprep Kit

Выделение плазмидной ДНК проводили с помощью набора GeneJET

Plasmid Miniprep Kit («Thermo Scientific», США). Ночную культуру, выращенную в 5 мл среды LB, центрифугировали в течение 1 мин при 13 тыс. об/мин. Осадок ресуспендировали в 250 мкл раствора для ресуспендирования. К смеси добавляли 250 мкл раствора для лизиса. Содержимое осторожно перемешивали, пока раствор не становился прозрачным. Добавляли 350 мкл раствора для нейтрализации. Смесь центрифугировали в течение 7 мин при 13 тыс. об/мин, после чего осторожно перемешивали и центрифугировали еще раз в течение 8 мин при 13 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость переносили на спин-колонку и центрифугировали в течение 1 мин при 2 тыс. об/мин. Осадок промывали центрифугированием 2 раза по 500 мкл промывающего буфера в течение 1 мин при 13 тыс. об/мин. Плазмидную ДНК элюировали 50 мкл деионизованной воды.

2.2.4. Выделение РНК из клеток бактерий с помощью набора Blue Kit («MP Biomedicals», США)

Культуры клеток центрифугировали в течение 2 мин при 12 тыс. об/мин, удаляли супернатант и добавляли 400 мкл RNApro solution, содержащий ДНКазу I, в концентрации 2 ед/мл. Клетки ресуспендировали и переносили в 1,5 мл микропробирку типа эппендорф, содержащий Lysing Matrix B для последующей гомогенизации на приборе MP FastPrep. Гомогенизацию проводили в три этапа по 40 секунд со скоростью 6,0 м/с, между этапами охлаждали клетки в холодильной камере по 5 минуты. После чего пробы центрифугировали в течение 1 мин при 4 °С 13 тыс. об/мин, далее перемещали супернатант, избегая попадания стекла, в новую микропробирку. В пробирку добавили 120 мкл хлороформа, перемешивали 10 секунд с помощью Vortex и вновь инкубировали 5 минут. Затем центрифугировали в предварительно охлажденной до 4 °C центрифуге в течение 5 мин при 12 тыс. об/мин. Верхнюю фазу перемещали в новый эппендорф и добавили 200 мкл холодного 96% этанола. Затем смесь аккуратно перемешивали и инкубировали 30 минут при -20 °С. Далее смесь центрифугировали в течение 15 минут при 4 °C при 12 тыс. об/мин, и удаляли супернатант. Отмывали осадок с помощью 200 мкл холодного 75% этанола, и просушивали на воздухе 5 минут при комнатной температуре. После чего РНК ресуспендировали в 30 мкл деионизированной воды с добавлением ДЭПК.

2.2.5 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

ПЦР проводили с помощью термоциклера «BioRad С1000» (США) с

использованием Taq-полимеразы («Сибэнзим», Россия) и Q5-полимеразы

(«New England Biolabs», США) в условиях, рекомендованных

производителем. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 0,03-0,04 мкг

матричной ДНК, 10 пМ каждого праймера, 200 мкМ каждого

дезоксирибонуклеозидтрифосфата (dNTP). Программа ПЦР включала

предварительную денатурацию ДНК при 95 °С, затем следовали 20-40 циклов

65

денатурация - отжиг праймеров - элонгация с заключительной элонгацией в течение 10 минут. Температуру отжига праймеров рассчитывали с помощью сервиса Tm Calculator (https://tmcalculator.neb.com). Время элонгации рассчитывали исходя из размера синтезируемого фрагмента и скорости работы ДНК-полимеразы (1000 оснований в минуту для Taq полимеразы и 2000 оснований в минуту для Q5-полимеразы).

Праймеры конструировали с помощью программы OligoExplorer («Gene Link», США). Синтез олигонуклеотидов осуществлялся в компании «Евроген» (Россия). Последовательности использованных в работе олигонуклеотидов приведены в Таблице 3.

Таблица 3 - Синтетические олигонуклеотиды, использованные в работе

Название праймера Последовательность праймера (5'-3')

pASK3_AcoB_up GAA TAG TTC GAC AAA AAT CTA GAT AAC GAG GGC AAA AAA TGA TGG CTA AAT TAA CGT ATA TTA AAG CAA TTA CC

pASK3_AcoB_lw GGT CAA GCT TAT TAT TTT TCG AAC TGC GGG TGG CTC CAA GCG CTT TAG TAG TTT AAA ATT TCG CGT ACT TTT GC

pASK5_PotAc_For GTT CGA AAA AGG CGC CGA GAC CGC GGT CCC GAA TTC GGA ATC CAA TAT TTT TTA CGG CAA GGT GTC CG

pet_AcoB_for CTG GTG CCG CGC GGC AGC CAT ATG CTC GAG GAT CCG ATG GCT AAA TTA ACG TAT ATT AAA GCA ATT ACC

pet_AcoB_rev CCA ACT CAG CTT CCT TTC GGG CTT TGT TAr CAG CCG GAT CCT TAG TAG TTT AAA ATT TCG CGT ACT TTT GC

T7 prom TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG

T7 term GCT AGT TAT TGC TCA GCG G

pET15bCTermH8 fw GGC AGC AGC CAT CAT CAT C

pET15bCTermH8 rev GGT ATA TCT CCT TCT TAA AG

pET 15C_PotN_for CGA ATC GTT ATT TCA AGT TTC TTC ATG GTA TAT CTC CTT CTT AAA G

pET 15C_PotN_rev GAA CGT GGA GAA AAT GCC TTG GGC AGC AGC CAT CAT CAT C

pET 15C_AcoB_for CTT TAA GAA GGA GAT ATA CCA TGG CTA AAT TAA CGT ATA TTA AAG CAA TTA CC

pET 15C_AcoB_rev GAT GAT GAT GGC TGC TGC CGT AGT TTA AAA TTT CGC GTA CTT TTG C

5'-pETС CCG CGA AAT TAA TAC GAC TCA C

3'-pETС GTT TAG AGG CCC CAA GGG G

Название праймера Последовательность праймера (5'-3')

pUT18_PotN_for GTG AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGC TAT GAA GAA ACT TGA AAT AAC GAT TCG

pUT18_PotN_rev GGA TCC TCT AGA GTC GAC CTG CAG GCA TGC AAG CTC AAG GCA TTT TCT CCA CGT TC

pKT25N for CAT AGC TGT TTC CTG TGT GAA ATT GTT ATC C

pKT25N rev ACC ATG CAG CAA TCG CAT CAG GCT GGT TAC G

PotA25 for GCG GAT AAC AAT TTC ACA CAG GAA ACA GCT ATG AAA GAA ATG ATC AAA CTT TCT TCG ATC

PotA25 rev CGT TTG CGT AAC CAG CCT GAT GCG ATT GCT GCA TGG TCG ACT GTT GGT TCA CAG TTG AAA AAT CCG

PotA25n for CGG GCT GCA GGG TCG ACT CTA GAG GAT CCC ATG AAA GAA ATG ATC AAA CTT TCT TCG

PotA25n rev CCG AAT TCT TAG TTA CTT AGG TAC CCG GGG ATC CTC ACG ACT GTT GGT TCA CAG TTG

AcoB25 for GCG GAT AAC AAT TTC ACA CAG GAA ACA GCT ATG ATG GCT AAA TTA ACG TAT ATT AAA GCA ATT ACC

AcoB25 rev CGT TTG CGT AAC CAG CCT GAT GCG ATT GCT GCA TGG TGT AGT TTA AAA TTT CGC GTA CTT TTG C

AcoB25n for CGG GCT GCA GGG TCG ACT CTA GAG GAT CCC ATG GCT AAA TTA ACG TAT ATT AAA GCA ATT ACC

AcoB25n rev CCG AAT TCT TAG TTA CTT AGG TAC CCG GGG ATC CTT AGT AGT TTA AAA TTT CGC GTA CTT TTG C

25N for GTG AGT TAG CTC ACT CAT TAG GC

25N rev GAC CAG GCG GAA CAT CAA TGT GG

25C for GAT TTC GAG GCG GTC AAG GTG AT

25C rev ATT AAG TTG GGT AAC GCC AGG GT

ACT CAT TAG GCA CCC CAG GC

CGC CGT CGT AGC GGA ACT GG

qGyrB for GCA AAT GAA TAT GAT GCC AG

qGyrB rev GGA TAT CCA CAG GAA TTC CA

qPotN for GAT TCG ACC AGA AAA CCT GG

qPotN rev GTA ATC ACG TGA ATT TTC GG

qGlnR for CGT TCA ATG TCA GTT TTG CC

qGlnR rev GCC TGT CGA CAT CAT TAA GC

2.2.5.1 Обратная транскрипция и ПЦР в режиме реального времени одношаговым методом

ПЦР проводили с помощью ПЦР амплификатора BioRad CFX96 («BioRad», США) с использованием qOT-ПЦР SYBR Blue («БиоЛабМикс», Россия) - экстра-микса для обратной транскрипции и количественной ПЦР в режиме реального времени одношаговым методом с использованием

флуоресцентного красителя SYBR Green I в условиях, рекомендованных производителем. Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 1х буфер RT-qPCR SYBR Blue, 0,1 мкМ каждого праймера (Таблица 3), 0,1 мкМ каждого dNTP, 2,5% ДМСО, 5% экстра-микса RT-qPCR и стерильную воду с добавлением ДЭПК. В качестве референсного гена использовали ген Б субъединицы ДНК гиразы gyrB [Marco et al., 2007, Zhao et al., 2011].

Режим ОТ-ПЦР включал в себя этап обратной транскрипции при 45 °C 30 мин, затем предварительная денатурация ДНК при 95 °C в течение 7 мин; затем в течение 40 циклов: денатурация при 95 °C - 30 сек, отжиг олигонуклеотидов при 52 °C - 40 сек, элонгация 72 °C - 35 сек. Температуру отжига праймеров рассчитывали с помощью сервиса Tm Calculator (https://tmcalculator.neb.com). Мониторинг ПЦР в режиме реального времени проводился каждый цикл после завершения этапа элонгации.

Нормализацию проводили в 2 этапа, сначала расчитывали относительную экспрсию гена используя уровень транскрипции гена gyrB в качестве референсного. Далее расчитывали изменения транскрипции гена potN или glnR относительно их экспресии в клетках в момент переноса в условия голодания.

2.2.6 Метод энзиматической сборки фрагментов ДНК по Гибсону

Готовили смесь Мастер Микс (ММ) с добавлением 320 мкл 5Х ISO буфера (500 мМ Трис-HCl pH 7,5, 25% полиэтиленгликоль-8000, 50 мМ MgCl2, 50 мМ ДТТ, 5 мМ НАД и по 1 мМ каждого из dNTP), 0,64 мкл 10 ед/мкл Т5 экзонуклеазы, 20 мкл 2 ед/мкл Q5-полимеразы и 160 мкл 40 ед/мкл Taq-лигазы (все ферменты были получены от «New England Biolabs», США). На одну реакцию Гибсона [Gibson et al., 2009] к 10 мкл ММ добавили 100 нг вектора и 100 нг ДНК в 2,5 мкл деионизованной воды. Далее смесь инкубировали в течение 1 часа при 50 °С и использовали для трансформации.

2.2.7 Электрофорез ДНК

Электрофорез ДНК проводили в горизонтальном агарозном геле с концентрацией агарозы 0,7-2% в зависимости от размера разделяемых фрагментов. В качестве электродного буфера использовали 0,04 М трис-ацетатный буфер (рН 7,5-7,8), содержащий 0,002М ЭДТА, рН 8,0. Буфер для нанесения проб: 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксилолцианола, 30% глицерина в воде. Пробу смешивали с буфером для внесения в соотношении 5:1. Для визуализации фрагментов ДНК в гель вносили краситель Midori Green («Nippon Genetics», Германия). Электрофорез проводили при напряжении 6 В на 1 см геля. По окончании гель просматривался в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе.

2.3 Схемы получения рекомбинантных конструкций

Схемы получения рекомбинантных конструкций представлены на Рисунке 13. Ген дикого типа белка PotN, а гены белков GlnR, PotA, PotAc, AcoB получали с помощью ПЦР с геномной ДНК L. hilgardii, ген белка PotN91 получали с помощью ПЦР с ранее полученной плазмидной ДНК pASK3-PotN91. Отбор клонов проводили с помощью ПЦР используя праймеры представленный в Таблице 3. В ходе проведенного анализа отбирались клоны бактерий, которые несут в себе плазмиды, содержащие вставки генов. Проверяли отсутствие мутаций в генах белков путем их секвенирования с прямого и обратного праймеров с дальнейшим построением единого контига и выравниванием с исходной последовательностью гена.

Рисунок 13 - Схемы получения рекомбинантных конструкций: (А) pET15C-PotN и pET15C-PotN91. (Б) pET15-AcoB. (В) pASK5-PotAc. (Г) pASK3-AcoB. (Д) pKT25AcoB и pKT25PotA. (Е) pKNT25AcoB и pKNT25PotA. (Ж) pUT18PotN и pUT18PotN91

2.4 Методы работы с белками

2.4.1 Получение клеточных экстрактов E. coli

Перед получением клеточных экстрактов E. coli BL-21(DE3), проводили

отбор штаммов на способность к гиперэкспрессии белка. Для этого штаммы

способные к гиперэкспрессии белка выращивали в 500 мл среды LB с

70

соответствующим антибиотиком. При достижении ОП600 = 0,8 к культуре добавляли ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ либо АГТ до конечной концентрации 0,2 мкг/мл, и культивировали 4 ч при 30 °С с качанием. Клетки из культуральной жидкости собирали путем центрифугирования в 2 этапа, сначала клетки центрифугировали в течение 15 мин при 4,4 тыс. об/мин при 4 °С, после чего переносили надосадочную жидкость в микроцентрифужные пробирки и центрифугировали в течение 15 мин при 14 тыс. об/мин при 4 °С ресуспендировали в 15 мл буфера DB (50 мМ трис-НС1, 100 мМ КаС1, 5 мМ Mga2, 0,5 мМ PMSF, рН 8,0) для последующей очистки на №-ЫТА сефарозе либо в 15 мл StW буфера (100 мМ трис-НС1, 150 мМ №С1, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) для последующей очистки на стрептактин сефарозе и разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗД-2 при 22 кГц во льду (3-7 озвучиваний по 1 мин с перерывами по 2-3 мин для охлаждения). Полученный лизат центрифугировали в течение 15 мин с охлаждением до 4 °С при 13 тыс. об/мин для удаления остатков клеточной стенки и использовали для аффинной хроматографии.

2.4.2 Очистка белков на №-ЫТА сефарозе

Хроматографию белков, содержащих гистидиновый аффинный пептид проводили на №-ЫТА сефарозе на колонках объемом 1 -5 мл («1Ьа LifeScience», Германия). Колонку уравновешивали путем промывания пятью объемами буфера HisW (50 мМ трис-НС1, 500 мМ КаС1, 50 мМ имидазол, рН 8,0). Затем наносили подготовленный клеточный экстракт со скоростью 0,5 мл/мин. Колонку промывали буфером HisW до снижения оптической плотности элюата до значения 0,01 при длине волны X = 280. Элюцию проводили буфером HisE (50 мМ трис-НС1, 500 мМ КаС1, 500 мМ имидазол, рН 8,0) при скорости 0,5 мл/мин. Элюат собирали фракциями по 1 мл и анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

Для регенерации Ni-NTA сефарозы колонку отмывали 2 объемами дистиллированной H2O, 5 объемами 0,2 М ЭДТА (pH 8,0). Затем промывали раствором 6М гуанидина гидрохлорида для удаления неспецифически сорбированных белков. Сорбент отмывали 10 объемами дистиллированной воды и заряжали 2 объемами 0,2 М NiSO4, снова промывали 2 объемами дистиллированной H2O и уравновешивали 10 объемами буфера HisW.

2.4.3 Очистка белков на стрептактин сефарозе

Очистку белков со стрептовидинновой аффинной меткой проводили на стрептактин сефарозе на колонках объемом 1-5 мл («Iba LifeScience», Германия). Стрептактин сефарозу уравновешивали пятью объемами буфера StW (100 мМ трис-HCl, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0) и наносили подготовленный клеточный экстракт со скоростью 0,5 мл/мин. Колонку промывали буфером StW до снижения оптической плотности элюата до значения 0,01 при длине волны X = 280. Элюцию проводили буфером StE (100 мМ трис-HCl, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 2,5 мМ дестиобиотин, pH 8,0) со скоростью 0,5 мл/мин. Элюат собирали фракциями по 1 мл и анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

Для регенерации стрептактин сефарозы колонку промывали 15 объемами буфера StE, содержащего дополнительно 20 мМ 2-[4-гидроксибензенеазо] бензойной кислоты (HABA) («IBA», Германия), затем отмывали 30 объемами буфера StW.

2.4.4 Эксклюзионная хроматография

Хроматографию проводили на колонке SuperDex 200 10/300 GL («Cytiva», США) в системе высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) («Waters breeze 2», США) в буфере R (50 мМ трис-HCl, 50 мМ NaCl, 50 мМ KCl, pH 7,4), которые перед использованием фильтровали через нитроцеллюлозный фильтр с размером пор 0,22 мкм и дегазировали.

Скорость подачи буфера составляла 0,5 мл/мин, поглощение детектировали при длине волны 280 нм.

2.4.5 Диализ белков

Диализ белков проводили в диализных мешках с пределом отсечения 6 кДа («Karl Roth», Германия), предварительно вымоченных в деионизованной воде в течении 20 мин. Растворы белков заливали в мешки и погружали в холодный буфер. Буфер меняли 2 раза каждые 3 часа с конечной инкубацией в течение 12 часов при 4 °С. Буфер для белков PotN и PotN91 включал в себя 50 мМ трис-HCl, 100 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 50% глицерин pH 7,4; для белков PotAc и AcoB - 20 мМ трис-HCl, 300 мМ NaCl, 1мМ ДТТ, 50% глицерин pH 8,0; для белка GlnR - 20 мМ трис-HCl, 500 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 50% глицерин pH 8,0.

2.4.6 Определение концентрации белка

Количество белка определяли по методу Брэдфорда [Bradford, 1976]. Для приготовления раствора Брэдфорда 100 мг кумасси G-250 растворяли в 50 мл этилового спирта, добавляли 100 мл ортофосфорной кислоты, и доводили объем до 1 л дистиллированной водой. Полученный раствор фильтровали через бумажный фильтр. Для определения концентрации белка 1 мкл исследуемой пробы белка растворяли в 0,5 мл дистиллированной воды и затем вносили 0,5 мл реагента Брэдфорда. Через 5 минут измеряли поглощение образцов при длине волны 595 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см. Концентрацию белка рассчитывали по калибровочной кривой, построенной по БСА (концентрации в 2х кратном разведении 16 - 0,5 мг/мл) («Sigma», США).

2.4.7 Электрофорез белков в денатурирующих условиях

Электрофорез белков в денатурирующих условиях проводили по методу

Лэммли [Laemmli, 1970] в 10-15%-ном полиакриламидном геле в зависимости

от размеров разделяемых молекул. Пластинки геля имели размер 6 х 8,5 см.

73

Электрофорез проводили при напряжении 100 В в концентрирующем геле (5% AA (29:1 AA:BIS-AA), 130 мМ трис-HCl pH 6,8, 0,1% SDS, 0,1% PSA, 0,08% TEMED), при 180 В в разрешающем геле (10-15% АА (29:1 АА:ВВ-АА), 375 мМ трис-HCl pH 8,8, 0,1% SDS, 0,1% PSA, 0,08% TEMED,), в буфере TGB (25 мМ трис-HCl, 200 мМ глицин, 0,1% SDS, pH 8,3). Перед внесением пробы смешивали с 4-кратным буфером для внесения SB (400 мМ трис-HCl, pH 6,8, 400 мМ ДТТ, 8% SDS, 0,1% бромфеноловый синий, 40% глицерин) и инкубировали в течение 5 мин при 95 °С.

2.4.8 Окрашивание белковых гелей кумасси синим

Гель после электрофореза помещали в красящий раствор (50% этанол, 10% уксусная кислота и 0,22% Coomassie brilliant blue R250) и инкубировали ночь при комнатной температуре с качанием. На следующий день гель споласкивали водой и отмывали осветляющим раствором (10% этанол, 10% уксусная кислота) до полного удаления цвета фона.

2.4.9 Окрашивание белковых гелей нитратом серебра

Гель после электрофореза помещали в фиксирующий раствор (50 % этанола и 5 % уксусной кислоты) и инкубировали в течение 30 мин с качанием. Далее гель последовательно отмывали 30 минут в 50 % этаноле и 2 раза по 5 мин в деионизированной воде. Затем гель выдерживали 2 мин в растворе тиосульфата натрия (0,2 г/л) и ополаскивали деионизированной водой. Окрашивали холодным раствором нитрата серебра (2 г/л) в течение 25 мин и промывали 2 раза деионизированной водой. Гель проявляли раствором карбоната натрия (30 г/л), содержащего 0,05 % формальдегида. Реакцию останавливали раствором ЭДТА (14 г/л).

2.4.10 Осаждение белков с помощью трихлоруксусной кислоты

Для осаждения в раствор белка вносили ТХУ до конечной концентрации

10% и инкубировали 20 минут во льду для преципитации белка. Преципитат

74

осаждали центрифугированием (в течение 5 мин при 14 тыс. об/мин). Супернатант удаляли, осадок 3 раза промывали ацетоном и высушивали 5-10 мин при 95 °C. Высушенный осадок растворяли в 25 мкл деионизованной воды и вносили 25 мкл четырехкратного буфера для внесения. Пробы анализировали с помощью ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях.

2.4.11 Иммуноблоттинг (Western Blot)

Белки разделяли в полиакриламидном геле и переносили на нитроцеллюлозную мембрану методом полусухого переноса. Для этого собирали «сэндвич», для чего на аноде располагали последовательно 1 бумажный фильтр, смоченный в буфере для анода I (300 мМ трис-HCl, 20% этанол), 1 фильтр в буфере для анода II (25 мМ трис-HCl, 20% этанол) и нитроцеллюлозную мембрану, смоченную водой. На ее поверхность помещали гель и закрывали «сэндвич» двумя фильтрами в буфере для катода (25 мМ трис-HCl, 20% этанол, 40 мМ аминокапроновая кислота). Сила тока составляла 2 мА/см2, перенос проводился в течение 30 минут. Эффективность переноса белков на мембрану оценивали с помощью обратимого окрашивания мембраны красителем Понсо С красным (2% Ponceau S, 3% трихлоруксусная кислота, 3% сульфосалициловая кислота). После документации мембрану отмывали от красителя раствором PBS (фосфатно-солевой буфер pH 7,2-7,6, «Эко-сервис», Россия). Затем мембрану анализировали с помощью иммунодетекции.

2.4.12 Иммунодетекция

Чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител мембрану обрабатывали 10% раствором сухого обезжиренного молока (СОМ) в PBS (фосфатно-солевой буфер pH 7,2-7,6, «Эко-сервис», Россия) 1 час на лабораторной качалке с интенсивностью перемешивания 50 об/мин. Затем мембрану помещали в 1% раствор СОМ в PBS, вносили первичные поликлональные кроличьи антитела к белку и инкубировали при 4 °С в течение

ночи. Мембрану трижды отмывали в PBS и инкубировали в 1%-ном растворе

75

сухого молока в PBS, содержащем вторичные антитела против антител кролика («Sigma», США), в течение 1,5 ч при 50 об/мин. После этого трижды отмывали в PBS буфере. Для проявления мембраны обрабатывали в равном соотношении растворами ECL1 (100 мМ трис-HCl рН 8,5, 2,5 мМ люминол, 0,4 мМ паракумаровая кислота) и ECL2 (100 мМ трис-HCl рН 8,5, 5,4 мМ H2O2) и фиксировали результат на установке для гель-документации Bio-RAD ChemiDoc XRS+ («BioRad», США).

2.4.13 Кристаллическая структура белка

Для кристаллизации раствор белка PotNsT концентрировали до 15 мг/мл в PBS, pH 7,4. Испытания на кристаллизацию проводили методом диффузии паров при 20°C в сидячих каплях. 400 нл раствора белка смешивали с 400 нл резервуарного раствора (NeXtal Classics II Suite Solution 28 («Qiagen», Германия), состоящего из 0,56 М Трис-натрия цитрата, pH 7,0) с помощью робота Honeybee 963 (Genomic Solutions Ltd). Кристаллы дифракционного качества были получены с помощью раствора NeXtal Classics II Suite Solution 28 («Qiagen», Германия). Кристаллы собирали через 28 дней и подвергали криозащите резервуарным раствором с добавлением 30% глицерина. Данные были обработаны и масштабированы до 1,65 А в пространственной группе P6322 с использованием XDS (PMID: 20124692). Структура была определена путем молекулярной замены с помощью MOLREP (PMID: 20057045) и PDB 2EG1 в качестве модели поиска, обнаружив один мономер в асимметричной единице. Структура была перестроена с помощью Coot (PMID: 15572765) и завершена с помощью циклического моделирования в Coot и уточнения с использованием REFMAC5 (PMID: 15299926). Молекулярные фигуры были созданы с использованием PyMOL версии 1.8.0.5 (Schrodinger, LLC). Структура была депонирована в Protein Data Bank под кодом доступа 7O4X.

2.5 Методы анализа взаимодействия макромолекул 2.5.1 Анализ взаимодействия белков методом ко-элюции (Pull Down) Для идентификации потенциальных белков партнеров для взаимодействия проводили анализ методом ко-элюции очищенного рекомбинантного белка с клеточным экстрактом бактерий на колонках объемом 0,5 мл.

Клеточный экстракт готовили из клеток, находящихся в

экспоненциальной фазе роста, собранных из 500 мл среды

центрифугированием в течение 13 мин при 4,4 тыс. об/мин. Клетки

ресуспендировали в 10 мл буфера StW (50 мМ трис-HCl, 50 мМ NaCl, 5 мМ

MgCl2*6H2O, pH 8,0) и добавляли лицозим в концентрации 3 мг/мл и PMSF до

конечной концентрации 1 мМ. Далее клетки инкубировали 1 час с качанием

при 37 °С и разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗД-2 при 22 кГц в

течение 10 мин во льду. Полученный лизат центрифугировали в течение 15

мин c охлаждением до 4 °С при 13 тыс. об/мин для удаления остатков

клеточной стенки.

К осветленному клеточному экстракту добавляли 1 мг рекомбинантного

белка и инкубировали 20 минут при комнатной температуре. Далее пробы

наносили на колонки с аффинным носителем объемом 0,5 мл, предварительно

уравновешенные 5-ю объемами буфера StW. Колонку промывали 10 объемами

буфера StW буфера и элюировали в 4 мл StE. Белки из фракций элюции

осаждали с помощью трихлоруксусной кислоты и анализировали путем ПААГ

электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

Анализ взаимодействия очищенных белков проводили на Ni-NTA

сефарозе или стрептактин сефарозе («Iba LifeScience», Германия) на колонках

объемом 0,05 мл. Очищенные белки смешивали в пропорциях 1:3, где 1 -

белок с аффинной меткой. Белки инкубировали 1 час при комнатной

температуре с качанием, затем к пробам добавляли 50 мкл аффинного

сорбента и инкубировали еще 30 мин в тех же условиях. Пробы наносили на

колонки, промывали 2 мл буфера HisW или StW и элюировали 1 мл буфера

77

HisE или StE. Белки из фракций элюции переосаждали с помощью трихлоруксусной кислоты и анализировали путем ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях с последующей окраской нитратом серебра или иммуноблоттингом.

2.5.2 Иммунопреципитация

Иммунопреципитацию белков проводили согласно Bonifacino et al.,

2001. 20 мг протеин А-сефарозы инкубировали 2 часа при комнатной

температуре в 50 мкл PBS (фосфатно-солевой буфер pH 7,2-7,6, «Эко-сервис»,

Россия), после чего промывали 100 мкл NET-буфера 1 (50 мМ трис-HCl, 150

мМ NaCl, 0,1% NP-40, 1 мМ ЭДТА, pH 7,4). Клетки, предварительно

обработанные в течение часа лизоцимом (5 мг/мл) разрушали путем

ультразвуковой дезинтеграции в буфере NET I (0,05 М трис HCl, 0,15 М NaCl,

0,1% NP-40, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ PMSF, pH 7,4) на приборе УЗД-2 при 22 кГц

в течение 10 мин во льду. Клеточный экстракт с содержанием общего белка 3

мг доводили до объема 1 мл буфером NET I, и вносили 20 мкл сыворотки с

антителами и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Затем

добавляли к пробе 50 мкл протеин А-сефарозы и инкубировали 1 час при 4 °С

с качанием. После чего центрифугировали в течение 30 сек при 14 тыс. об/мин,

супернатант переносили в другой эппендорф (проба 1). Осадок

ресуспендировали в 1 мл NET-буфера 1, инкубировали 1 мин и

центрифугировали в течение 30 сек при 14 тыс. об/мин, после чего действие

повторили еще 3 раза, после каждого раза супернатант переносили в другой

эппендорф (пробы 2-5). Далее осадок ресуспендировали в NET-буфере 2 (50

мМ трис-HCl, 500 мМ NaCl, 0,1% NP-40, 1 мМ ЭДТА, pH 7,4), инкубировали

5 мин и центрифугировали в течение 30 сек при 14 тыс. об/мин, после чего

повторяли еще раз, каждый супернатант переносили в другой эппендорф

(пробы 6-7). Затем осадок ресуспендировали в 1 мл IP-буфера (10 мМ трис-

HCl pH 7,4, 0,1% NP-40), инкубировали 5 мин и центрифугировали при 14 тыс.

об/мин в течение 30 сек, супернатант переносили в другой эппендорф (проба

78

8). В осадок добавили 100 мкл однократного буфера для внесения (SB) и инкубировали 10 мин при 95 °С, после чего центрифугировали в течение 30 сек при 14 тыс. об/мин (проба 9). С полученными пробами проводили электрофорез в денатурирующих условиях

2.5.3 Исследование взаимодействия белков методом микромасштабного термофореза

Белок с гистидинновой аффинной меткой был помечен с использованием набора для мечения белков His-Tag Labeling Kit RED-tris-NTA («NanoTemper Technologies», Германия), белок со стрептавидиновой аффинной меткой метили с помощью красителя BODIPY [Ksenofontova et al., 2022]. Реакцию мечения с помощью His-Tag Labeling Kit проводили в соответствии с инструкциями производителя в прилагаемом буфере для мечения с применением белка в концентрации 20 мкМ (молярное соотношение краситель:белок ~ 3:1) в течение 30 мин при комнатной температуре. Степень мечения определяли с помощью УФ/видимой спектрофотометрии при 650 и 280 нм. Работу проводили с белками со степенью мечения 0,8.

Реакцию мечения с использованием красителя NHS-Ph-BODIPY проводили согласно протоколу авторов [Ksenofontova et al., 2022], подбор массы красителя осуществляли исходя из молярной массы и количества белка для мечения. Раствор NHS-Ph-BODIPY (9 экв.) в диметилсульфоксиде (ДМСО) медленно добавляли к раствору белка (1 экв.) в бикарбонатном или фосфатном буфере с рН 8,3. После тщательного перемешивания смесь инкубировали при 4 °С в течение 24 часов. После завершения реакции смесь подвергали диализу против 70%-ного этанола (трижды), а затем буфера MST (трижды) с получением чистого раствора меченого белка.

Концентрацию меченого белка доводили до 4 нМ с помощью буфера

MST с добавлением 0,05% Tween 20. Лиганд растворяли в буфере MST с

дополненным 0,05% Tween 20, до конечной концентрации 214 мкМ и готовили

серию из 16 разведений 1:1 с использованием того же буфера, получая

79

концентрации лиганда в диапазоне от 214 мкМ до 6,53 нМ. Для измерения каждое разведение лиганда смешивали с одним объемом меченого белка, что приводило к конечной концентрации белка 2 нМ и конечным концентрациям лиганда в диапазоне от 107 мкМ до 3,27 нМ. После 10-минутной инкубации с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 10 тыс. об/мин образцы загружали в стандартные капилляры Monolith NT.115 («NanoTemper Technologies», Германия). MST измеряли с помощью прибора Monolith NT. 115 («NanoTemper Technologies», Германия) при температуре окружающей среды 25 °C. Параметры прибора были настроены на мощность светодиода 50 % и среднюю мощность MST. Данные трех независимых пипетированных измерений были проанализированы (программное обеспечение MO.Affinity Analysis, версия 2.1.3, «NanoTemper Technologies», Германия) с использованием сигнала от времени включения MST, равного 5 с.

2.5.4 Метод задержки в геле

Для анализа были сконструированы пары комплементарных праймеров, которые после гибридизации образовывали ДНК-дуплексы с флуорофором на одном 5' конце.

ДНК-дуплексы получали путем гибридизации взаимно комплементарных олигонуклеотидов. Один из нуклеотидов содержал модификацию в виде флуорофора Cy3 на 5' конце (Таблица 4). Гибридизацию олигонуклеотидов проводили в буфере GB (10 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, pH 7,4), смешивая меченые и немеченые олигонуклеотиды в эквимолярных концентрациях путем охлаждения с 98 °C до комнатной температуры в течение часа.

В качестве специфической ДНК был использован фрагмент промоторной области гена GlnR, содержащий последовательность для связывания с GlnR. Фрагменты ДНК (1 нмоль) смешивали с чистым белком GlnR (взятым в концентрации 6 мкМ - 0,05 мкМ) в буфере, содержащем 20

мМ трис-HCl, 5 мМ MgCl2, 2 мМ ДТТ, 300 мМ KCl, pH 8,0 и инкубировали 1

80

ч при комнатной температуре. Разделение смеси белок-нуклеиновая кислота проводили с помощью электрофореза в 6% ПААГ (6% АА, 0,375 М трис-HCl pH 8,8, 0,1% PSA, 0,08% TEMED) в нативных условиях в трис-боратном электродном буфере (0,04 М трис-HCl, борная кислота 0,04 М, ЭДТА 0,002 М, pH 8,0). Электрофорез проводили при силе тока 35 В в течение 90 мин. Результат визуализировали на установке для гель-документации Bio-RAD ChemyDoc XRS+ («BioRad», США).

Таблица 4 - Синтетические олигонуклеотиды, использованные для получения ДНК дуплексов*

Разновидность ДНК-дуплекса Последовательности олигонуклеотидов (5'-3')

Специфические ДНК-дуплексы, распознаваемые GlnR GlnR /Cy3/-TGAAAAAATGATGTCATAAAACATGACAT TTGCTCTTGA TCAAGAGCAAATGTCATGTTTTATGACATCATTTTTTCA PotD / Cy3/-CAATAAATAAATGT TACCTAATC T TACAT TGAATGCTAC G TArCATTCAATGTAAGAT TArGTAACATTTATTTATTG

*Примечание: сайты узнавания фактором транскрипции подчеркнуты, консенсусные нуклеотиды выделены жирным

2.6 Аналитические методы

2.6.1 Изотермальная титрующая калориметрия

Эксперименты по анализу взаимодействия белков с различными лигандами методом изотермальной титрующей калориметрии проводили на микрокалориметре VP-ITC («MicroCal, LCC», США) в буфере ITC (10 мМ Hepes-NaOH, 50 мМ KCl, 100 мМ NaCl, pH 7,4) при 20 °C. Раствор белка (40 мкМ олигомера) титровали 2 мМ растворами нуклеотидов и метаболитов как указано в соответствующих разделах.

Лиганд вводился 45 раз порциями по 6 мкл в ячейку объемом 1,4285 мл при постоянном перемешивании со скоростью 155 об/мин. Полученные

изотермы анализировали с помощью программы MicroCal ORIGIN software («MicroCal, LCC», США).

2.6.2 Определение активности ß-галактозидазы

Определение активности ß-галактозидазы проводили по модифицированному методу [Miller, 1972]. 5 мл культуры клеток центрифугировали в течение 2 мин при 12 тыс. об/мин. Супернатант выливали, клетки ресуспендировали в 800 мкл буфера Z (K2HPO4*3H2O - 14,5 г/л, KH2PO4 - 5,4 г/л, KCl - 0,75 г/л, MgSO4*7H2O - 0,250 г/л), содержащего лизоцим с концентрацией 1 мг/мл, и инкубировали в течение 20 мин при температуре 37 °С с качанием 200 об/мин. Затем вносили СТАВ («Sigma», США) до конечной концентрации 0,1% и 80 мкл хлороформа. Смесь интенсивно перемешивали и центрифугировали при 12 тыс. об/мин в течение 2 мин. Затем добавляли 160 мкл субстрата (4 мг/мл ONPG («Sigma», США) в буфере Z). Реакционную смесь инкубировали при 30 °С. После появления желтой окраски останавливали реакцию внесением 400 мкл 1 М раствора N2CO3 и измеряли поглощение при длине волны 410 нм. Активность ß-галактозидазы выражали в нМоль-мин-1-мг-1 и рассчитывали по следующей формуле:

ОП405 1 нмоль

Активность = ---X---

ОП600 X время X объем 0,0045 X мл X см

X 1 17НмОЛЬ/ л /мин X мл

где:

ОП600 - Оптическая плотность культуры при длине волны 600 нм время - время реакции в мин. объем - объем пробы в кювете в мл

0,0045 ОППш/нмоль - коэффициент экстинции е405 о-нитрофенола 1,7мл - общий объем, мл

2.6.3 Определение АТФазной активности

Для определения уровня АТФазной активности был использован модифицированный метод Lanzetta et al., 1979. Метод основан на обнаружении неорганического фосфата (Pi) в пробе.

Анализ проводили в 96-луночном планшете. В лунку вносили 20 мкл образца для анализа, состоящего из фермента и 2 мМ MgАТФ. В качестве положительного контроля в соседнюю лунку вносили 0,2 мМ стандартный раствор Pi (K2HPO4). В качестве холостой пробы использовали 2 мМ MgАТФ без фермента. Пробы инкубировали при комнатной температуре в течение 15, 30, 60, 120 и 240 мин. После инкубации одновременно в каждую лунку добавляли 80 мкл окрашивающего реагента MG-AM, и сразу же перемешивали, чтобы инактивировать фермент. Через 1-2 мин вносили 10 мкл 34% цитрата, и сразу же перемешивали и инкубировали 5 мин для развития цвета, и замеряли поглощение при длине волны 650 нм на планшетном спектрофотометре TECAN 100 plus («Tecan», Швейцария).

Для приготовления окрашивающего реагента MG-AM смешивали 1 объем раствора молибдата аммония (4,2% (NHi)2MoO4 в 4 N HCl) с 3 объемами 0,045% раствора малахитового зеленого, и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре (до прозрачности), добавляли 0,1 мл 2% Nonidet P-40 на каждые 5 мл смеси, перемешивали и фильтровали через бумажный фильтр. Раствор стабилен при хранении в темноте при 4 °C в течение месяца.

2.6.4 Определение уровня АТФ в клетках

Определение уровня АТФ в клетке проводилось с помощью набора ATP determination kit («Invitrogen life technologies», США) методом биолюминесцентного анализа с помощью рекомбинантной огненной люциферазы и ее субстрата Д-люциферина. Анализ основан на необходимости АТФ для получения свечения люциферазой (максимум излучения при длине волны 560 нм при pH 7,8) в реакции:

Мд2+, люцифераза

люциферин + АТФ + О2 -> оксилюциферин + АМФ + PPi

+СО2 + свет

Подготовку проб для измерения АТФ проводили путем нагревания-заморозки. Суспензию анализируемых штаммов разливали в эппендорфы по 1,5 мл, помещали в термомиксер, нагревали до 99 °С с перемешиванием при 1400 об/мин, затем погружали в жидкий азот. Шаг нагрев-охлаждение повторяли три раза. Затем полученные клеточные лизаты центрифугировали в течение 1 мин при 14 тыс. об/мин, надосадочную жидкость использовали для измерения уровня АТФ.

Для измерений готовили реакционную смесь (8,9 мл H2O, 0,5 мл 20-кратный реакционный буфер, 0,1 мл 0,1 мМ ДТТ, 0,5 мл 10 мМ Д-люциферин, 25 мкл 5 мг/мл огненная люцифераза) и растворы АТФ (1 мкМ, 100 нМ, 10 нМ, 1 нМ) для построения калибровочной кривой. Затем измеряли фоновое свечение реакционного микса (500 мкл) и свечение исследуемых проб (50 мкл пробы и 450 мкл реакционного микса) с помощью люминометра. Измерения проводили на 10 и 30 секунде реакции. Концентрацию АТФ рассчитывали по калибровочной кривой, построенной по растворам АТФ.

2.7 Математические методы

2.7.1 Биоинформатика

Поиск и оценка идентичности первичных белковых последовательностей была осуществлена с помощью программы BLAST [https://Mast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE TYPE=Blast Search&LINK LOC=blasthome]. Выравнивание аминокислотной

последовательности белка производилось при помощи Clustal Omega [https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/]. Филогенетический анализ был проведен с помощью программы MEGA11 [Tamura et al., 2021]. Попарное

выравнивание структур было выполнено с помощью программы RCSB PDB Pairwise Structure Alignment [https://www.rcsb.org/alignment].

Анализ первичной последовательности белков проводили с помощью программы BLAST.Последовательности PII белков взяты из базы GenPept: PotN из Lentilactobacillus hilgardii (QIR10170), PotN из Lentilactobacillus farraginis (GAF37981), PotN из Loigolactobacillus bifermentans (QGG59904), PotN из Liquorilactobacillus ghanensis (KRM06086), PotN из Lactococcus lactis (AIS03498), GlnK из Lactococcus lactis (SBW30903), GlnK из Bacillus subtilis (CAB15669), GlnK из Enterococcus cecorum (SQE56252), GlnB из Enterococcus cecorum (SQE53929), GlnK из Escherichia coli (AAC73553), GlnB из Escherichia coli (AAC75606), GlnZ из Azospirillum brasilense (QEL89073), GlnB из Neisseria meningitides (AAF42322), GlnK1 из Haloferax mediterranei (AFK17834), GlnK2 из Haloferax mediterranei (AFK17836), GlnK из Pyrodictium delaneyi (ALL01038), GlnK1 из Archaeoglobus veneficus (AEA46711), GlnK2 из Archaeoglobus veneficus (AEA46717), GlnK3 из Archaeoglobus veneficus (AEA47998), GlnB из Synechococcus elongates (BAD79382), GlnB из Arabidopsis thaliana (AEE8209).

Выравнивание белковых последовательностей проводили с помощью программы ClustalOmega. Последовательности PII белков взяты из базы GenPept: PotN из Lentilactobacillus hilgardii (QIR10170), PotN из Lactococcus lactis (AIS03498), GlnK из Lactococcus lactis (SBW30903), GlnK из Bacillus subtilis (CAB15669), GlnK из Enterococcus cecorum (SQE56252), GlnK из Escherichia coli (AAC73553), GlnB из Escherichia coli (AAC75606), GlnB из Neisseria meningitides (AAF42322), GlnK1 из Haloferax mediterranei (AFK17834), GlnK2 из Haloferax mediterranei (AFK17836), GlnK из Methanobrevibacter wolinii (WP_042707534), GlnK из Archaeoglobus veneficus (AEA46717), GlnB из Synechococcus elongates (BAD79382), GlnB из Arabidopsis thaliana (AEE8209).

Для построения филогенетического дерева эволюции PII белков были использованы аминокислотные последовательности PII белков взятые из базы

85

GenPept: PotN H3 Lentilactobacillus hilgardii (QIR10170), PotN H3 Lentilactobacillus buchneri (EEI19347), PotN H3 Lentilactobacillus farragini (GAF37981), PotN H3 Liquorilactobacillus ghanensis (KRM06086), PotN H3 Loigolactobacillus bifermentans (QGG59904), PotN H3 Lactococcus lactis (AIS03498), PotN H3 Clostridium tyrobutyricum (AND85836), PotN H3 Lactobacillus rogosae (SFE84216), PotN H3 Liquorilactobacillus uvarum (WP_057738800), GlnK H3 Lactococcus lactis (SBW30903), GlnK H3 Enterococcus cecorum (SQE56252), GlnK H3 Bacillus subtilis (CAB15669), GlnK H3 Clostridium tyrobutyricum (AND83978), GlnK H3 Desulfitobacterium hafniense (EHL06080), GlnB H3 Desulfitobacterium hafniense (EHL06083), PII.2 H3 Clostridium tyrobutyricum (AND85348), NifI2 H3 Clostridium tyrobutyricum (AND86262), NifI2 H3 Desulfitobacterium hafniense (EHL06065), NifI2 H3 Heliobacterium chlorum (BAD95752), NifI2 H3 Methanococcus maripaludis (CAF30411), NifI1 H3 Methanococcus maripaludis (CAF30410), PII.1 H3 Clostridium tyrobutyricum (AND85349), NifI1 H3 Clostridium tyrobutyricum (AND86263), NifI1 H3 Desulfitobacterium hafniense (EHL06064), NifI1 H3 Heliobacterium chlorum (BAD95751), GlnK2 H3 Archaeoglobus veneficus (AEA46717), GlnK3 H3 Archaeoglobus veneficus (AEA47998), GlnKl H3 Archaeoglobus veneficus (AEA46711), GlnKl H3 Haloferax mediterranei (AFK17834), GlnK2 H3 Haloferax mediterranei (AFK17836), GlnKl ro Methanococcus maripaludis (CAF29620), GlnB H3 Methanococcus maripaludis (CAF29622), GlnK2 H3 Methanococcus maripaludis (CAF29623), GlnK H3 Methanobrevibacter wolinii (WP_042707534), MtbPII H3 Mycobacterium tuberculosis (NP_217435), GlnK H3 Corynebacterium glutamicum (QJS16232), Glnk H3 Edaphobacter acidisoli (WP_188758347), GlnB H3 Synechococcus elongates (BAD79382), GlnB ro Paulinella chromatophora (YP_002048850), GlnB H3 Wildemania schizophylla (YP_009237350), GlnB H3 Arabidopsis thaliana (AEE8209), GlnB ro Rhodospirillum rubrum (WP_011389838), GlnB H3 Neisseria meningitides (AAF42322), GlnB H3 Escherichia coli (AAC75606), GlnB H3 Beauveria bassiana (KGQ13703), GlnK H3 Escherichia coli (AAC73553), GlnJ H3

86

Rhodospirillum rubrum (WP_011388885), GlnZ из Azospirillum brasilense (QEL89073), GlnK из Rhodospirillum rubrum (WP_011388313).

Для анализа генетического соседства PII белков были использованы последовательности геномов, взятые из базы данных NCBI: Lentilactobacillus hilgardii (CP050262), Lactococcus lactis (CP009472), Bacillus subtilis (AL009126), Enterococcus cecorum (LS483306), Escherichia coli (U00096), Azospirillum brasilense (CP033312), Neisseria meningitidis (AE002098), Haloferax mediterranei (CP001868), Pyrodictium delaneyi (CP013011), Archaeoglobus veneficus (CP002588), Synechococcus elongatus (AP008231), Arabidopsis thaliana (CP002687); Lentilactobacillus buchneri (ACGH01000114), Lentilactobacillus farraginis (BAKI01000059), Loigolactobacillus bifermentans (CP045872), Liquorilactobacillus ghanensis (AZGB01000016), Clostridium tyrobutyricum (CP014170).

Для построения филогенетического дерева по 16S рРНК семейства Lactobacillaceae были использованы нуклеотидные последовательности 16S рРНК взятые из базы GenBank: 16S рРНК из Lentilactobacillus hilgardii (CP050262), 16S рРНК из Levilactobacillus brevis (М58810), 16S рРНК из из Lacticaseibacillus casei (AF469172), 16S рРНК из Lentilactobacillus buchneri (CP043615), 16S рРНК из Lentilactobacillus farraginis (AB262732), 16S рРНК из Loigolactobacillus bifermentans (JN175330), 16S рРНК из Liquorilactobacillus ghanensis (DQ523489), 16S рРНК из Lactobacillus acidophilus (CP020620), 16S рРНК из Lactiplantibacillus plantarum (MW693210), 16S рРНК из Lacticaseibacillus rhamnosus (D16552), 16S рРНК из Limosilactobacillus reuteri (OM763693), 16S рРНК из Limosilactobacillus fermentum (CP047584).

Для получения суперпозиций белковых структур были использованы модели белков из базы RCSB PDB: PotN из Lentilactobacillus hilgardii (7O4X), GlnK из Escherichia coli (1PIL), GlnK из Bacillus subtilis (4R25), GlnB из Synechococcus elongates (4C3M), GlnZ из Azospirillum brasilense (4CO5).

2.7.2 Обработка и анализ данных

Оценку кинетических характеристик после изотермальной титрующей калориметрии проводили с помощью программ MicroCal Origin, MicroCal PEAQ-ITC Analysis Software («MicroCal, LCC», США). Оценку кинетических характеристик после микромасштабного термофореза с помощью программы MO. Affinity Analysis («NanoTemper Technologies», Германия). Обработку результатов ВЭЖХ проводили при помощи программы Waters Breeze («Waters breeze 2», США). Экспрессию генов оценивали с помощью программы BioRad CFX Manager («BioRad», США). Анализ результатов гель-электрофорезов и иммуноблоттинга производили с помощью программы Image Lab Ver. 4.0 («BioRad», США). Количество жизнеспособных клеток оценивали путем их подсчета клеток с зеленой флуоресценцией среди всех клеток в объединенных изображениях, полученных путем наложения зеленых и красных флуоресцентных микрофотографий (10 изображений на каждый образец) с помощью программного обеспечения BioFilmAnalyzer [Bogachev et al., 2018].

Статистическую обработку данных проводили с использованием программ GraphPad Prism, MS Excel. Для числовых данных рассчитывали средние значения и среднее квадратическое отклонение. Оценку возможности исключения выпадающих значений проводили по критерию Смирнова. Оценку достоверности разности средних оценивали по t-тесту Стьюдента при сравнении двух независимых групп или по однофакторному ANOVA-тесту Крускала-Уоллеса для трёх и более групп. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Анализ аминокислотной последовательности и филогенетического положения белка PotN относительно других PII белков

PII белки обнаруживаются почти во всех живых организмах, представляют собой внутриклеточные сенсоры энергетического, азотного и углеродного состояния клетки, обрабатывающие метаболические сигналы и передающие эту информацию на различные регуляторные мишени. На сегодняшний день PII белки разделяют на канонические PII белки, к которым относят такие белки как GlnB, GlnK, NifI, и PII-подобные белки, которые структурно сходны с каноническими PII белками с ферредоксиноподобной укладкой, но имеют низкую консервативность аминокислотной последовательности, и количество таких белков с каждым годом увеличивается.

Большинство представителей семейства Lactobacillaceae не несут генов PII белков, по-видимому, из-за существования в богатых питательными веществами экологических нишах. Но несмотря на то что PII белки, как правило, выступают регуляторами клеточного метаболизма в условиях голодания по азоту или источнику энергии в геноме штамма L. hilgardii LMG 7934, при анализе геномных последовательностей лактобацилл, был обнаружен ген, который кодирует PII-подобный белок, имеющий ограниченное сходство с PII белками из других организмов. Более того, ген PII белка из L. hilgardii имеет уникальное генетическое соседство и связан с опероном potABCD, кодирующим ABC-переносчик полиаминов, что предполагает принадлежность к новому подсемейству PII-подобных регуляторов [Zhuravleva et al., 2020]. На этом основании белок был обозначен как PotN (Pot-белок связывающий N-нуклеотиды, связывание с АТФ и АДФ была показана с помощью изотермальной титрующей калориметрии).

Выравнивание аминокислотной последовательности белка PotN из L. hilgardii с другими подобными белками показало максимальную

идентичность с белками из четырех представителей семейства

89

Lactobacillaceae — L. buchneri, L. farraginis, L. bifermentas и L. ghanesis (Таблица 5). Идентичность аминокислотной последовательности с PII белками из микроорганизмов других классов не превышает 50%, что говорит о том, что первичная структура PII белков семейства Lactobacillaceae уникальна для данного вида бактерий.

Таблица 5 - Сравнительный анализ первичной последовательности белка PotN из L. hilgardii с PII белками из других организмов

Белок Идентичность, % Номер GenPept

Lentilactobacillus buchneri PotN 100 QIR10170

Lentilactobacillus farraginis PotN 93 GAF37981

Loigolactobacillus bifermentans PotN 74 QGG59904

Liquorilactobacillus ghanensis PotN 73 KRM06086

Lactococcus lactis PotN 56 AIS03498

Lactococcus lactis GlnK 42 SBW30903

Bacillus subtilis GlnK 34 CAB15669

Enterococcus cecorum GlnK 46 SQE56252

Enterococcus cecorum GlnB 24 SQE53929

Escherichia coli GlnK 36 AAC73553

Escherichia coli GlnB 36 AAC75606

Azospirillum brasilense GlnZ 37 QEL89073

Neisseria meningitidis GlnB 39 AAF42322

Haloferax mediterranei GlnKl 34 AFK17836

GlnK2 33 AFK17834

Pyrodictium delaneyi GlnK 37 ALL01038

Archaeoglobus veneficus GlnKl 43 AEA46711

GlnK2 42 AEA46717

GlnK3 42 AEA47998

Synechococcus elongatus GlnB 40 BAD79382

Arabidopsis thaliana GlnB 38 AEE8209

Clostridium tyrobutyricum PotN 55 AND85836

Clostridium tyrobutyricum GlnK 36 AND83978

Clostridium tyrobutyricum Nifl 1 30 AND86262

NifI_2 31 AND86263

Clostridium tyrobutyricum PII 1 30 AND85348

PII_2 30 AND85349

При этом аминокислотная последовательность белка PotN сохраняет консервативные сайты для связывания эффекторных молекул. Так, в PII белках в связывании АДФ участвуют остатки глицина в позиции 87, лизина в позиции 90 и аргининов в позициях 101 и 103, для связывания АТФ дополнительно нужны глутамин в позиции 39 и глицин в позиции 89, связывание 2-ОГ происходит при участии АТФ-связывающего сайта и лизина в позициях 40 и 58. В аминокислотной последовательности белка PotN присутствуют все эти аминокислоты, следовательно, белок PotN, по всей видимости, должен проявлять свойства PII белков и связывать основные эффекторные молекулы (Рисунок 14). Однако в последовательности не был обнаружен остаток тирозина в позиции 51, который отвечает за посттрансляционную модификацию PII белков в Proteobacteria [Merrick, 2015]. Здесь он заменен на фенилаланин, это указывает на то, что белок не подвергается ковалентной модификации.

Поскольку взаимодействие PII белков с их белками-партнерами в большинстве описанных случаев зависит от определенного статуса связывания нуклеотидов, ранее был сконструирован мутантный вариант белка PotN с подавленной возможностью связывания нуклеотидов, обозначенный как PotN91 [Каюмов, 2018]. Данное свойство белка было достигнуто за счет замены в белке PotN91 универсального консервативного остатка глицина в позиции 91 в АТФ-связывающем мотиве (эквивалентный глицину в позиции 89 в E. coli GlnB) на аланин (Gly91Ala) для предотвращения связывания нуклеотидов, аналогично тому, как это было показано для белка GlnB из E. coli [Jiang et al., 1997].

Рисунок 14 - Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей

PII белков различных организмов. Оранжевым цветом показаны консервативные аминокислоты, участвующие в связывании нуклеотидов и 2-ОГ. Нумерация позиций аминокислот соответствует большинству канонических PII белков. На аминокислотной последовательности PotN91 обозначена мутация белка PotN из L. hilgardii Gly91Ala

Для определения эволюционной взаимосвязи белка PotN с другими PII белками был проведен филогенетический анализ методом максимальной экономии (MP) в программе MEGA11 [Tamura et al., 2021]. Анализ показал, что белки PotN образуют отчетливую кладу на дереве с бутстрэп поддержкой 56-99% (Рисунок 15). На Рисунке 15 также показана самая экономичная длина дерева = 0. Индекс согласованности равен 0,498 (0,487), индекс удержания равен 0,536 (0,536), а составной индекс равен 0,267 (0,261) для всех сайтов.

Рядом с ветвями показан процент повторяющихся деревьев, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в бутстрэп-тесте (100 повторов) [Felsenstein, 1985]. MP-дерево было получено с использованием алгоритма Subtree-Pruning-Regrafting (SPR) [Masatoshi, Kumar, 2000] с уровнем поиска 1, в котором исходные деревья были получены путем случайного добавления последовательностей (10 повторений). В анализе участвовало 50 аминокислотных последовательностей.

Анализ генома L. hilgardii показал, что ген PII-подобного белка PotN имеет нехарактерное для PII белков генетическое окружение. В то время как гены канонических PII белков GlnB и GlnK являются моноцистронными или объединены в оперон с геном транспортера аммония в клетку, ген PII-подобного белка PotN находится в опероне potABCD, который кодирует транспортер полиаминов (спермидина и путресцина) в клетку (Рисунок 16). Данное генное окружение позволяет предположить, что белок PotN способен взаимодействовать с данным переносчиком полиаминов в клетку. Следует отметить, что данное генетическое соседство характерно в основном для бактерий типа Firmicutes. Подобное расположение генаpotN было обнаружено только у 5 из более 400 видов семейства Lactobacillaceae, а также у L. lactis и C. tyrobutyricum, которые также относятся к Firmicutes; за пределами данной филы такое расположение гена не было обнаружено (Рисунок 17). Наличие PotN у C. tyrobutyricum может быть следствием горизонтального переноса, т.к. в ее геноме обнаруживается 4 различных семейства PII белков, что является ее уникальным свойством.

Таким образом, высокая идентичность между белками внутри подсемейства PotN (не менее 55%) и низкая идентичность за пределами данного подсемейства (менее 45%), а также идентичность в 100% по ключевым аминокислотам, участвующих в выполнении основных функций PII белков позволяет отнести гомологи PotN к новому подсемейству PII белков.

19

21

Lentilactobacillus hilgardii PotN Lentilactobacillus buchneri PotN Lentilactobacillus farraginis PotN LiguoriiactoJbaciiius ghanensis PotN Loigolactobacillus bifermentans PotN Lactococcus lactis PotN CJoatridiam tyrobutyricum PotN Lactobacillus rogosae PotN Liguorilacfcobacillus uvarum PotN Lactococcus lactis GlnK Enterococcus cecorum GlnK Bacillus subtilis GlnK Clostridium tyrobutyricum GlnK Desulfitobacterium hafniense GlnK Desulfitobacterium hafniense GlnB Clostridium tyrobutyricum PII.2 Clostridium tyrobutyricum NifI2 Desulfitobacterium hafniense NifI2 Heliobacterium chlorum NifI2 Methanococcus maripaludis NifI2 Methanococcus maripaludis Nifll Clostridium tyrobutyricum PII.l Clostridium tyrobutyricum Nifll Desulfitobacterium hafniense Nifll Heli©bacterium chlorum Nifll Archaeoglobus veneficus GlnK2 Archaeoglobus veneficus GlnK3 Archaeoglobus veneficus GlnKl Haloferax mediterranei GlnKl Haloferax mediterranei GlnK2 Methanococcus maripaludis GlnKl Methanococcus maripaludis GlnB Methanococcus maripaludis GlnK2 Methanobrevibacter wolinii GlnK Mycobacterium tuberculosis MtbPII Corynebacterium glutamicum GlnK Edaphobacter acidisoli GlnK Synechococcus elongatus GlnB Paulinella chromatophora GlnB ffildemania schizophylla GlnB Arabidopsis thaliana GlnB Azospirillum brasilense GlnB Rhodospirillum rubrum GlnB Neisseria meningitidis GlnB Escherichia coli GlnB Beauveria bassiana GlnB Escherichia coli GlnK Rhodospirillum rubrum GlnJ Azospirillum brasilense GlnZ Rhodospirillum rubrum GlnK

V4 Ф Л 4J

О

см

h

<n

*rl

И

s

.4 СЭ

tc с

I—I

о

о См

Рисунок 15 - Филогенетическое дерево разных подсемейств PII-подобных

белков из различных организмов. Филогенетический анализ был проведен методом максимальной экономии (MP) в программе MEGA11 [Tamura et al., 2021]. Анализ показал, что белки PotN образуют отчетливую кладу на дереве

с бутстрэп поддержкой 56-99%

cd Ч_

ф о cd _Q О Ш

-4—»

О

ГО

а> си

о

Lactobacillus hilgardii Lactococcus lactis

Bacillus subtilis Enterococcus cecorum Pelosinus fermentans

Escherichia coli

Azospirillum brasilense Neisseria meningitidis Haloferax mediterranei

potD potN potA "X potB ~4' potC ¡>

potD

У1

potN

glnK

potA potB potC

amtB

amtB ;> glnK >

amtB glnK

nifH nifl2 I antD antK

glnK amtB >

ginB >

ginz >

ginB

amtB > glnK amtB glnK

Methanobrevibacter wolinii | amtB glnK > Archaeoglobus veneficus amtB > glnK

Synechococcus elongatus Arabidopsis thaliana

ginB

ginB

Рисунок 16 - Генетическое соседство генов Р11 белков различных организмов

Рисунок 17 - Генетическое соседство генов ^о^ из различных организмов

Было выдвинуто предположение, что факт наличия гена Р11 белка в геноме лактобацилл связан с эволюцией их геномов. Поэтому было

построено филогенетическое дерево генов 16S рРНК из различных представителей лактобацилл (Рисунок 18). Однако филогенетический анализ не выявил формирования клад для видов LactobacШaceae, имеющих в своем геноме ген РП-подобного белка. Следовательно, причиной наличия гена Р11-подобного белка в геноме, по всей вероятности, может быть особенность места обитания данных видов бактерий, однако анализ источников, откуда были выделены микроорганизмы, не подтвердил данную гипотезу (Рисунок 18). Таким образом, причины нахождения гена белка PotN в данных организмах остаются неизвестными.

67

66

100

S9

- Limosilactobacillus fermentum

- Limosilactobacillus reuteri

- Lactobacillus acidophilus

- Loigolactobacillus bifermentans

- Liquorilactobacillus ghanensis

- Lacticaseibacillus rhamnosus

- Lacticaseibacillus casei

- Lactiplantibacillus plantarum