Убиквитин-протеасомная система губок в становлении механизмов регуляции обмена железа у эукариот тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Финошин Александр Дмитриевич

• Финошин Александр Дмитриевич
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Финошин Александр Дмитриевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Внутриклеточный гомеостаз железа

1.2 Факторы, индуцированные гипоксией (HIFs)

1.3 Гомеостаз железа

1.4 Общая характеристика убиквитин-протеасомной системы

1.5 20S коровая частица протеасомы

1.6 Особенности структурной организации 20S протеасом эукариот

1.7 Особенности структурной организации 26S протеасом эукариот

1.8 Функции 20S и 26S протеасом у эукариот

1.9 Убиквитин-протеасомная система и метаболизм железа у беспозвоночных

1.10 Губки как важнейший объект биологии

1.11 Регенеративные процессы в губках

1.12 Механизмы реагрегации клеток у губок

1.13 Заключение

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Животные и схема эксперимента

2.1.1 Сбор материала

2.1.2 Опыты по диссоциации и реагрегации морских губок Halisarca dujardinii и Halichondriapanicea, собранных на разных стадиях жизненного цикла (зима, лето, осень)

2.1.3 Клеточная линия Sf9

2.2. Транскриптомы H.dujardinii и H.panicea. Методы подготовки, сборки и работы с траскриптомными данными

2.2.1 Подготовка библиотек и их секвенирование

2.2.2 Определение качества РНК, создание библиотек кДНК, и секвенирование РНК на платформе Illumina

2.2.3 Сборка и аннотация целевых генов губок с последующим анализом дифференциальной экспрессии по одноконцевым прочтениям для трех сезонов

2.2.4 Аннотация белков и расчёт относительных скоростей дивергенции

2.3 Протеомные методы

2.3.1 Электрофоретическое разделение белков

2.3.2 Вестерн-блоттинг нативных гелей

2.3.3 Определение активностей протеасом

2.3.4 Жидкостная хроматография и тандемная масс спектрометрия

2.4 Методы микроскопии и иммуногистохимии

2.5 Статистическая обработка данных

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Характеристика метаболизма железа у губок

3.1.1 Идентификация белков участников метаболизма железа у Н. йщатйти и их особенности экспрессии

3.1.2 Оценка экспрессии белков метаболизма железа губки Н. йщатйти и поиск высоко экспрессирующихся генов

3.1.3 Анализ нативных комплексов ферритина губок Н. йщатйти и Н. ратееа

3.1.4 Оценка экспрессии изоформ ферритина губки Н. йщатйти, собранных в разные периоды жизненного цикла

3.1.5 Субклеточная локализация ферритина Н. йщатйти

3.1.6 Установление состава бактериального сообщества симбионтов Н. йщагйти

3.1.7 Идентификация и реконструкция белков-регуляторов метаболизма железа

83

3.2 Характеристика убиквитин-протеасомного комплекса H. dujardinii

3.2.1 Анализ дифференциальной экспрессии генов убиквитин-протеасомного комплекса

3.2.2 Формы протеасом H. dujardinii

3.2.3 Активность протеасом губки H. dujardinii

3.2.4 Субклеточная локализация протеасом H.dijardinii

3.2.5 Активность протеасом и экспрессия белков теплового шока класса 70 у губки H. panicea и их связь с микробным сообществом

3.2.6 Формы протеасом клеток Sf9

3.2.7 Эволюционный анализ убиквитин-протеасомного комплекса губок и насекомых

3.3 Влияние ингибиторов протеасом и биосинтеза гема на процесс реагрегации клеток губок

4.1 Особенности метаболизма железа у губок

4.2 Регуляция метаболизма железа белками УПС

4.3 Особенности убиквитин-протеасомной системы губок

4.4 Особенности симбиотического состава H. dujardinii и возможное участие симбионтов в механизмах реализации клеточной пластичности

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальной проблемой биологии и медицины является выяснение молекулярных механизмов адаптаций к воздействию различных внешних стимулов. В ходе эволюции у животных выработана сложная система регуляции адаптационных механизмов, как на уровне низкомолекулярных метаболитов, так и на уровне высокомолекулярных белковых комплексов. Глобальная оксигенизация воды и атмосферы привела к появлению разнообразных по содержанию кислорода экотопов и к расширению диапазонов колебания кислорода в среде. Именно с этим связано возникновение одного из самых ранних и важнейших адаптивных свойств животных - способность их клеток реагировать на гипоксию, обеспечивая стабильность гомеостаза их протеома в условиях нестабильного кислородного окружения. Предполагают, что эта способность формировалась согласованно с развитием факторов гипоксии HIF (Hypoxia-inducible factor) и элементов HIF-пути, регуляции гомеостаза железа и возникновением глобиновых белков. [142]. Губки - древнейшие из ныне живущих многоклеточных организмов. Однако информация о метаболизме железа и его регуляции у губок в настоящий момент весьма ограничена. Известно, что бактериальные симбионты губок используют запасенное клетками губок железо, обеспечивая при этом клетки хозяина вторичными метаболитами [62, 179]. В геноме современных губок выявлены некоторые ключевые компоненты HIF-пути, но связанные с ним регуляторные факторы мало изучены. Известно, что морские губки развиваются только в присутствии ионов железа [117] и устойчивы к гипоксии. Поэтому они могут служить хорошей моделью для исследования ранней эволюции метаболизма железа у многоклеточных животных, которая происходила на фоне глобальной оксигенизации.

Факторы гипоксии и белки, связанные с биосинтезом гема и обменом железа, участвуют в регуляции иммунных реакций, эмбриогенеза, пролиферации и трансформации клеток у высших животных. Клеточная пластичность у губок проявляется в процессе регенерации их тела и реагрегации диссоциированных клеток, при которой происходит восстановление исходной структуры губки [47]. Трансформации клеток губки в этих процессах могут быть аналогичны процессам, происходящим в стволовых клетках высших животных [190]. Особенности клеточной пластичности у губок, связанные с работой фактора гипоксии HIF, белков биосинтеза гема и белков обмена железа, не изучены.

Исследование процессов, связанных с обменом железа, свидетельствует об их неразрывной взаимосвязи с работой убиквитин-протеасомной системы (УПС). Интересен тот факт, что обе системы -метаболизма железа и УПС - сформировались у архей, а некоторые консервативные белки, участвующие в метаболических путях этих систем, сохранились у эволюционно продвинутых потомков практически неизменными [188]. Протеасомы гидролизуют поврежденные или меченые убиквитином белки, обеспечивая таким образом специфичность адаптивной реакции [164]. Участие УПС в механизмах адаптации к гипоксии и клеточной пластичности у животных, находящихся на ранней ступени эволюции, не исследовано.

Цель настоящей работы: выявление особенностей убиквитин-протеасомной системы клеток губок, связанных с регуляцией гомеостаза железа.

Для достижения этой цели были исследованы особенности УПС двух эволюционно удалённых групп беспозвоночных. Первая группа - морские губки (кл. Demospongia, тип Porifera), представляющие ранние этапы эволюции Metazoa. У губок клеточный метаболизм, в том числе обмен железа, реализуется с участием симбионтов, состав и численность которых

они контролируют, и который может различаться в зависимости от состояния клеток в целом организме. Поэтому метаболизм железа был изучен на разных этапах жизненного цикла губки, а также при клеточных трансформациях в ходе реагрегации клеток губок. Вторая группа -насекомые отряда чешуекрылых Spodoptera frugiperda. Исследовали культуру клеток Sf9 из яичников S. frugiperda. Эти опыты позволили выявить особенности пула протеасом клеток органа с особым иммунным статусом у насекомых. Исходя из цели работы были поставлены следующие задачи:

1. Выявить молекулярные механизмы устойчивости к гипоксии губок Halichondria panicea и Halisarca dujardinii и установить сходство и отличия факторов обмена железа с таковыми у других животных.

• Реконструировать пути метаболизма железа у губок и его протеасомные белки-регуляторы. Описать процесс биосинтеза гема у губок и охарактеризовать его эволюционные особенности.

• Оценить экспрессию ферритина на протеомном и транскриптомных уровнях у губки Halisarca dujardinii в период роста в разные сезоны, определить его клеточную локализацию, а также найти экспрессирующиеся ферритины бактериальных симбионтов губки.

2. Выявить особенности функционирования системы контроля протеома у беспозвоночных, находящихся на разных этапах эволюционного развития.

• Реконструировать de novo компоненты убиквитин-протеасомной системы у губок. Определить формы протеасом, экспрессию субъединиц протеасом и их регуляторов в период роста в разные сезоны и активность в процессе диссоциации и реагрегации клеток губки Halisarca dujardinii. Установить связь между составом бактериальных сообществ губок, активностью протеасом и экспрессией белков теплового шока семейства HSP70.

• Определить особенности пула 20S протеасом клеточной линии Sf9.

• Выявить различия в пуле 20S протеасом у губок и насекомых. Изучить закономерности эволюции структурных компонентов протеасом многоклеточных животных

Научная новизна: Молекулярные механизмы клеточной пластичности активно изучаются на моделях млекопитающих, однако подобные работы на беспозвоночных практически отсутствуют. В данной работе впервые у губок идентифицированы древние гомологи факторов гипоксии (НШ-1-Нке, Н1Р-2-Нке, НШ-З-Нке), реконструирован путь биосинтеза гема и идентифицированы его продукты (NGB, ADGB), важнейшие гомологи белков метаболизма железа ртН, FPN, NAALAD2, MTFR, DMT1), компоненты УПС (20S коровая частица, 19S регулятор, шапероны протеасомного комплекса, ядерные регуляторы и другие белки УПС). Впервые получены данные о возможной регуляции метаболизма железа с участием УПС (убиквитинлигазы HERC2 и FBLX5, система 1ЯР/1ЯЕ). Получены транскриптомные и биохимические данные, указывающие на важнейшую роль пути биосинтеза гема, метаболизма железа и активности протеасом в процессах диссоциации/реагрегации клеток морских губок. Методами протеомного анализа (нативный электрофорез с последующей масс спектрометрией) выявлены различия в формах протеасом губок и насекомых (на примере клеточной линии Sf9). Установлена связь между особенностями состава микробных сообществ губок с экспрессией ферритина, белков теплового шока и активностью протеасом. Впервые проведен расчёт относительных скоростей дивергенции аминокислотных последовательностей белков биосинтеза гема и их продуктов, а также белков убиквитин-протеасомной системы. Работа выполнена на основе опубликованных оригинальных транскриптомных и протеомных данных, полученных при участии диссертанта.

Практическая значимость заключается в разработке и усовершенствовании методов нативного электрофореза для разделения

комплексов ферритина и форм протеасом у беспозвоночных (губок и насекомых). Данные о структуре, эволюционных особенностях белков метаболизма железа и УПС губок прояснили их роль в регуляции гомеостаза клеточного протеома и реализации пластичности у многоклеточных. Реконструированные de novo белки метаболизма железа и убиквитин-протеасомной системы, а также полученные транскриптомы губок H. dujardinii и H. panicea, по которым проведена реконструкция и последующий эволюционный анализ, опубликованы в международной базе данных NCBI. Эти результаты формируют научный задел для дальнейших транскриптомных исследований ранних представителей многоклеточных животных.

Методология и методы исследования. Исследование морфологических особенностей губок (клеток и агрегатов) проводили при помощи современных методов микроскопии (конфокальной, флуоресцентной и световой). Белки и РНК для данной работы выделялитрадиционными методами. Транскриптомы получали с помощью секвенирования нуклеиновых кислот на платформе Illumina HiSeq 2000. Анализ транскриптомных данных проводили с помощью методов биоинформатики. Биохимические эксперименты проводили как с использованием стандартных методов, таких как денатурирующий электрофорез, вестерн-блоттинг, измерения активностей протеасом in vitro и в геле, так и оригинального метода нативного электрофореза, условия которого были подобраны для соответствующих белковых комплексов.

Степень достоверности результатов проведённых исследований. Работа соответствует современным требованиям. Достоверность полученных результатов подкреплена всеми необходимыми требованиями к процедурам проведения экспериментов (биологические реплики, воспроизводимость результатов, статистические погрешности).

Апробация работы. Полученные данные представлены на отечественных и зарубежных конференция и школах:

1) Финошин А.Д., Кравчук О.И., Люпина Ю.В. Влияние микробного сообщества на экспресиию белков теплового шока HSP/HSC70 в клетках холодноводных морских губок Halichondria panicea // Сборник тезисов 22-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых Биология Наука XXI века. Пущино

2) Финошин А.Д., Кравчук О.И., Люпина Ю.В. Влияние микробного сообщества на экспрессию белков теплового шока HSP/HSC70 в клетках холодноводных морских губок Halichondria panicea // Сборник Тезисов XXX Зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва 201S с

3) Lyupina Y.V., Kravchuk O.I, Geo^iev A.A., Gomostaev N.G., Finoshin A.D. Molecu^ mechanisms of cell re-aggregation of sea cold-water sponge Halichondria panicea // Animal Biology Abstracts Annual Meeting Florence 201S. p

4) Финошин А. Д., Адамейко К.И., Кравчук О.И., Михайлов В. С., Гусев O.A., Люпина Ю.В. Роль сообществ микроорганизмов в жизнедеятельности холодноводной губки Halisarca dujardini // XVIII Конференция-школа с международным участием «Актуальные проблемы биологии развития», 14-19 октября 2019 г. — М. Издательство Перо, 2019. — С. 98 - 99. ISBN 97S-5-00150-53S-9

5) Финошин А.Д., Адамейко К.И., Георгиев А.А., Кравчук О.И., Михайлов В.С., Люпина Ю.В., Шагимарданова Е.И. Исследование факторов адаптационной пластичности холодноводных морских губок //II Объединенный научный форум, включающий VI Съезд физиологов СНГ, VI Съезд биохимиков России и IX Российский симпозиум «Белки и

пептиды». Сочи, Дагомыс. 2019. СПЕЦВЫПУСК том 2 ACTA NATURAE с

6) Cherkasov A. V., Ryabova A. V., Kozlova O.S., Finoshin A.D., Kravchuk O.I., Khrameeva E.E. The Spatial Organization of the genome of sea sponge Halisarca dujardini. 10th Moscow Conference on Computational Molecular Biology МССМВ'21 Moscow, July 30th — August 2nd, 2021,

7) Adameyko K. I., Finoshin A. D., Lyupina Y. V., Kravchuk O. I., Shagimardanova E. I., Gazizova G. R., Gusev O. A. Regulation of ferritin and globin genes in cold-water sea sponges Halisarca dujardini and Halichondria panicea and its role during reaggregation//FEBS Open Bio. 2021. p

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 7 работ в журналах, входящих в международные реферативные базы данных и систем цитирования и, соответственно, в Перечень ВАК.

Личное участие соискателя в получении результатов, изложенных в диссертации. Соискателем проведен анализ данных литературы, на основе которых было спланировано исследование и подобраны подходящие методы исследования. Эксперименты были проведены соискателем лично или при его непосредственном участии. Полученные данные проанализированы и интерпретированы при участии автора и представлены на всероссийских и международных конференциях, а также опубликованы в рецензируемых журналах.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Убиквитин-протеасомная система губок в становлении механизмов регуляции обмена железа у эукариот»

Место проведения работы.

Основная работа по диссертационному исследованию выполнена в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (лаборатория биохимии процессов онтогенеза), а именно: выделение РНК для секвенирования, различные техники электрофоретического разделения белков и другие протеомные методы, а также микроскопия (ЦКП ИБР

РАН) под руководством Люпиной Юлии Вячеславовны. Сбор экспериментального материала, эксперименты по реагрегации и фиксирование образцов были проведены как на Беломорской биологической станции МГУ, так и в лаборатории биохимии процессов онтогенеза ИБР РАН. Секвенирование РНК выполнено в Казанском Федеральном Университете (лаборатория Экстремальной биологии под руководством Гусева Олега Александровича и Шагимардановой Елены Ильясовны. Масс-спектрометрия белков с тандемной ВЭЖХ была выполнена в ЦКП Института Биохимической Физики им. Н.М. Эмануэля РАН.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение, Заключение, Выводы, Список литературы. Диссертация изложена на 155 страницах, содержит 35 рисунков, 9 таблиц и 237 ссылок на цитируемые источники.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 1.1 Внутриклеточный гомеостаз железа

Кислород и железо являются одними из самых распространенных элементов в земной коре, и оба элемента играют важную роль в биологии всего живого [154]. Железо необходимо для транспорта кислорода и является компонентом простетических групп множества белков, переносящих 02, таких как гемоглобин, миоглобин, цитоглобин, нейроглобин и андроглобин, но как амфотерный металл, участвует в реакциях восстановления и окисления, включая перенос одного электрона между его трехвалентным (Ре (III)) и двухвалентным (Ре (II)) состояниями [78, 116]. Химические свойства железа определяют не только его биологическое значение, но и его токсичность [163]. Двухвалентная форма свободного железа реагирует в реакциях Фентона с перекисью водорода с образованием как гидроксильных радикалов, так и радикалов с различной степенью окисления железа. Радикалы железа могут вызывать в клетках повреждения ДНК, белков и липидов, так что избыток железа для клеток вреден [217].

На ранних этапах эволюции живого уровень свободного железа был высоким, а атмосфера в своем современном состоянии еще не сформировалась. Постепенная оксигенизация планеты связана с деятельностью цианобактерий и зеленых водорослей. Первоначально 02 был токсичен для живых организмов; однако позже кислород начал использоваться в качестве конечного акцептора электронов в биохимических реакциях, генерирующих энергию в митохондриях. Митохондриям требуется значительное количество железа для синтеза гема и созревания белков железо-серного кластера. Также в их функционировании требуется кислород в качестве акцептора электронов

при окислительном фосфорилировании. Следовательно, правильный баланс между доступностью железа и физиологией гипоксических реакций имеет решающее значение для поддержания клеточного гомеостаза в живых клетках. В ходе эволюции сложилась система для строгого и тонкого регулирования концентрации как свободного железа, так и O2. Данные о метаболизме железа и его регуляции свидетельствуют о том, что факторы гипоксии запускают работу большого числа генов (ответ на гипоксию) и вся эта система является внутриклеточным сенсором не только концентрации кислорода, но и концентрации железа.

1.2 Факторы, индуцированные гипоксией (HIFs)

У млекопитающих HIF содержат а-субъединицу (HIF-а) и Р-субъединицу (HIF-1P), имеющие домен спираль-петля-спираль (HLH) и домен Per-Arnt-SIM (PAS), соединенные гидрофобной связью. Во время активации гетеродимеры переносятся в ядро клетки, где они связываются с элементом ответа на гипоксию (HRE) генов-мишеней, способствуя их экспрессии [210]. Регуляция внутриклеточной экспрессии белка а-субъединицы чрезвычайно важна во время этого события. В условиях культивирования клеток млекопитающих, когда концентрация атмосферного O2 поддерживается на уровне 20%, экспрессия белка HIF-1а подавляется до очень низкого уровня, но в ответ на снижение парциального давления кислорода ниже 5% количество экспрессируемого HIF-1a резко увеличивается [94]. Транскрипционная активность (способность активировать транскрипцию) HIF-1 повышается по мере снижения парциального давления кислорода независимо от концентрации этого белка [95]. Таким образом, накопленный в клетках HIF-а образует димер с HIF-ip, а активированные гетеродимеры HIF перемещаются в ядро клетки и связываются с чувствительными элементами, способствуя экспрессии генов-мишеней.

Понимание молекулярных механизмов работы НШ-1 открыло возможности для исследований механизмов чувствительности к гипоксии [197]. Белок НШ-а, транслируемый с мРНК, в присутствии достаточного количества кислорода подвергается убиквитинированию, которое зависит от гидроксилированного пролильного остатка, что приводит к его протеолизу в 26Б протеасоме [86]. При этом способность НШ-а к активации транскрипции контролируется гидроксилированием аспарагинильного остатка [110]. При низкой концентрации кислорода ингибируется гидроксилирование пролиловых и аспарагинильных остатков, белок не метится убиквитином, и НШ-а накапливается в клетке, обеспечивая ассоциацию с основным фактором транскрипции р300 (Рис.

Рис. 1. Фактор, индуцируемый гипоксией (НШ-а) при нормальных и гипоксических условиях у млекопитающих. В нормоксических условиях

HIF-а гидроксилирован. Опухолевый супрессор (VHL) связывается с гидроксилированным HIF-а, содержащим Pro-OH, и рекрутирует убиквитин E3 лигазу. Полиубиквитинирование HIF-а метит белок для деградации протеасомой 26S. В условиях гипоксии HIF-а не подвергается деградации, а перемещается в ядро, где связывается с HIF-P, а затем рекрутирует коактиваторы (HRE), инициируя транскрипцию целевого гена. ОН: гидроксил; Р: пролиловый остаток; N: аспарагинильный остаток; ТФ: трансферрин; TFR1: рецептор трансферрина 1; DMT1: переносчик двухвалентного металла 1; FPN1; ферропортин; DCYTB; 51 дуоденальный цитохром B; CP: церулоплазмин; HMOX1: гемоксигеназа 1; ЭПО: эритропоэтин. [82]

Было показано, что у млекопитающих три гена кодируют соответственно три варианта субъединицы HIF-а. Эти варианты, по-видимому, регулируются сходным образом [83, 97]. Белок ИШ^а повсеместно экспрессируется во всех тканях, тогда как его паралоги, HIF-2а (также известный как эндотелиальный белок PAS-домена 1 (EPAS1), HIF-1-подобный фактор, HIF-родственный фактор и член суперсемейства PAS 2) и HIF-За имеют более ограниченные паттерны тканевой экспрессии [44]. Стоит отметить, что преобладающая 02-зависимая регуляция ИШ^а опосредуется посттрансляционными механизмами [83]. ИИ^а и IRP имеют общие гены-мишени, включая FPN и SLC11A2 (Dmt1), а сам HIF^ контролируется IRP.

Уровни экспрессии а-субъединиц HIF резко возрастают в ответ на гипоксию[94, 210]. Иным образом эта зависимость выражена у HIF-1P -HIF-1P нечувствителен к изменениям доступности кислорода.

1.3 Гомеостаз железа

На клеточном уровне большинство клеток живых организмов строго регулируют пул внутриклеточного железа за счет эффективного контроля

усвоения железа (экспрессия TfR1) и за счет повышения уровня экспрессии ферритина [101]. Избыток токсичного двухвалентного железа инактивируется и хранится в ферритине в трехвалентной форме [119]. Ферритин млекопитающих представляет собой белковый комплекс, состоящий из 24 мономеров двух подтипов: тяжелой и легкой цепей ферритина. Относительная доля этих ферритиновых цепей в комплексе варьирует в зависимости от типа ткани. У ферритина есть фероксидазные центры, которые переводят железо в трехвалентное состояние. Система IRE-IRP (реагирующий на железо элемент - регуляторный белок железа) увеличивает трансляцию мРНК ферритина в ответ на увеличение концентрации клеточного железа [6, 170]. Таким образом, избыток железа переводится в неактивную форму. Функция и структура ферритина различаются в разных типах клеток [101, 181].

Железо высвобождается из ферритина для нужд клетки в ходе его деградации, которая осуществляется в основном лизосомами. Концентрация цитозольного железа распознается РНК-связывающими белками (RBP) и регулирующими железо белками 1 и 2 (IRP1 и IRP) (рис. 2). В цитоплазме железо используется различными Fe(II) -зависимыми белками вместе с поли(гС)-связывающими белками (PCBP) 1 и 2. PCBP действуют как шапероны железа, которые облегчают попадание железа в фактор гипоксии HIF-a.

Рис. 2. Железо- и кислород-зависимая регуляция белков IRP, контролирующих концентрацию железа у млекопитающих. При высоком содержании железа собираются кластеры 4Fe-4S, активируя цитозольную аконитазу. При этом IRP1 теряет свою способность связывания цис-действующего элемента (IRE). Напротив, в условиях недостатка железа и кислорода IRP полиубиквитинируется и разрушается протеасомой. В условиях низкого содержания железа IRP взаимодействуют со специфическими мРНК. В таких условиях IRP способны связывать IRE в 5'- или З'-нетранслируемой области (UTR) мРНК генов, вносящих вклад в гомеостаз железа. Связывание IRP в этих областях, в свою очередь, блокирует инициацию трансляции или деградацию мРНК соответственно. FTH: тяжелая цепь ферритина; FTL: легкая цепь ферритина; EPAS1: эндотелиальный белок 1, содержащий домен PAS, или HIF-2a; mACO: аконитаза; TFRC: рецептор трансферрина; DMT1: переносчик двухвалентного металла 1. [82]

Аконитазы, железосернистые белки, которые катализируют конверсию цитрата в изоцитрат в цикле трикарбоновых кислот (TCA). IRP1 (или аконитаза 1 обозначается ACO1) - это цитозольный белок. Он взаимодействует с мРНК, контролируя концентрацию внутриклеточного железа. Когда уровень клеточного железа высокий, IRP1 связывается с кластером 4Fe-4S и действует как аконитаза в митохондриях. Когда уровни клеточного железа низкие, белок связывается с так называемыми железо-чувствительными элементами (IRE). Они представляют собой петлевые структуры в 5'-UTR мРНК ферритина и в З'-UTR мРНК TfR1. Связывание IRP1 с IRE на 5'-UTR мРНК ферритина приводит к репрессии его трансляции. Напротив, связывание IRP1 с IRE на З'-UTR мРНК TfR1 приводит к ингибированию деградации мРНК рецептора трансферрина. С другой стороны, IRP-2, кодируемый геном IREB2, не связывает кластеры

железо-серы и, очевидно, не обладает аконитазно-подобной активностью. ГОР-2, по-видимому, является преобладающим регулятором гомеостаза железа в клетках при меняющихся уровнях кислорода. Протеасомная деградация 1КР требует 2-оксоглутарат-зависимых оксигеназ, которые используют железо, кислород и аскорбат в качестве основных кофакторов, и имеет сходство с деградацией НШ-а.

Примечательно, что система ГОР-ГОЕ не единственный регулятор гомеостаза клеточного железа, и метаболизм железа регулируется также другими факторами. Одним из примеров является фактор БРК [39]. Экспрессия FPN регулируется на нескольких уровнях - уровне транскрипции (посредством ВАСН1 / N^2 и НШ2) [73, 132], посттранскрипционном уровне (через miR-485-3p), уровне трансляции (посредством ГОР) и посттрансляционном уровне (посредством гепсидина)[143]. Гепсидин является ключевым регулятором поступления железа в кровообращение у млекопитающих. Когда уровень гепсидина аномально низкий, например, при гемохроматозе, возникает перегрузка железом из-за повышенного оттока железа, опосредованного ферропортином из ферритина, и увеличения абсорбции железа в кишечнике [59].

Понимание того, как УПС контролирует гомеостаз железа посредством регуляции ГОР, пришло с открытием Е3 убиквитинлигазы для ГОР. Эта Е3 лигаза является белком ББХЬ5, содержащим Б-бокс и богатым лейциновыми повторами, была независимо идентифицирована в двух лабораториях [84, 106]. Образование комплекса ГОР с белком ББХЬ5 было показано двумя независимыми способами. Во-первых, методами протеомики [106]. Второй подход включал скрининг интерферирующих РНК на регуляторы железо-зависимой деградации ГОР [84].

Молекулярные подходы раскрыли механизмы регуляции ББХЬ5[8]. Мутация в домене Нг, связывающем железо, приводит к конститутивной дестабилизации FBXL5, что показывает необходимость связывания Fe для правильной регуляции FBXL5. В условиях избытка железа, когда белок накапливается в значительном количестве, ББХЬ5 показывает низкие уровни полиубиквитинирования. Напротив, когда количество железа ограничено, FBXL5 демонстрирует выраженное полиубиквитинирование и последующую деградацию, которая зависит от функционального Е1 фермента, активирующего убиквитин, и протеасомы. Остатки 77-81 в домене Нг, по-видимому, составляют часть регуляторного элемента или дегрона, определяющего дифференциальную стабильность FBXL5. На основе этих наблюдений можно предположить, что К-концевой домен Нг детектирует уровень железа и регулирует стабильность FBXL5 (Рис. 3). Согласно этой модели, когда уровни внутриклеточного железа высоки, домен Нг связывает железо и принимает конформацию, в которой его дегрон менее доступен. Это приводит к стабилизации FBXL5, к образованию комплекса Е3 лигазы SCFFBXL5 и ГОР2, полиубиквитинированию ШР2 с последующей протеасомной деградацией. Напротив, при низком уровне биодоступного железа домен Нг не может образовывать дижелезный центр, что приводит к структурным изменениям, которые в конечном счете вызывают деградацию ББХЬ5 протеасомой. Предполагается, что критическим элементом в этих процессах является железо-зависимая регуляция FBXL5, поскольку она контролирует уровни экспрессии ШР, а он, в свою очередь, регулирует ключевые гены гомеостаза железа.

Таким образом, FBXL5 через его домен Нг позволяет клеткам детектировать уровни биодоступного железа и соответственно

контролировать накопление IRP и путь регуляции, направленный на поддержание гомеостаза железа.

Рис. 3. Модель того, как N-концевой домен Hr контролирует гомеостаз железа посредством регуляции стабильности FBXL5 с сопутствующим контролем деградации IRP2 [200].

FBXL5 является членом семейства белков, содержащих консервативный F-бокс-домен из ~ 40-50 аминокислот [96]. Белки с F-боксом собираются в комплексы Е3 убиквитинлигаз Skp1/Cul1/F-box (SCF), состоящие из каркасных белков CUL1, RBX1 и SKP1. SKP1 рекрутирует F-бокс-содержащую субъединицу комплекса Е3 лигазы. Белок с F-боксом имеет решающее значение для активности комплекса, поскольку в нем имеются дополнительные сайты для связывания субстратов для полиубиквитинирования. RBX1 представляет собой Ringbox белок, который связывает активированный фермент, конъюгированный с E2 лигазой, который переносит убиквитин в комплексный белок-мишень SCF [29, 142]. Нарушение экспрессии FBXL5 в клетках человека вызывает накопление белка IRP с сопутствующей неправильной регуляцией IRE-содержащих генов в условиях избытка железа [175, 207]. Показано, что в клетках человека FBXL5 взаимодействует с IRP, а исследования in vitro демонстрируют , как

рекомбинантный 8СЕЕБХЬ5 полиубиквитинирует ШР [175, 207]. Эти наблюдения позволяют предполагать, что ББХЬ5 является подлинной Е3 лигазой ГОР, необходимой для правильной регуляции и поддержания гомеостаза клеточного железа.

ГОР1 может аналогичным образом регулироваться посредством ББХЬ5 железо-зависимым образом, когда сборка кластеров 4Бе-48 нарушается [32, 54, 175, 207]. Интересно, что ББХЬ5 накапливается в условиях избытка железа [175, 207]. Как железо-, так и кислород-зависимый контроль стабильности ББХЬ5 опосредован его К-концом, который содержит железо-связывающий гемэритрин-подобный домен [175, 207].

Гемэритриновые (Нг) домены морских беспозвоночных и бактерий хорошо охарактеризованы, хотя Нг-домены позвоночных к настоящему времени не идентифицированы [91, 99]. У беспозвоночных Нг-содержащие белки часто действуют как транспортные и запасные белки доставки 02, подобные гемоглобину и миоглобину у млекопитающих [55]. В дополнение к этим функциям белки с Нг действуют как сенсоры железа и/или 02 [11, 91, 218]. Канонические домены Нг характеризуются спиральными складками из четырех а-спиралей и 02-связывающего дижелезного центра. Этот центр обычно формируется семью аминокислотами, состоящими из пяти гистидинов, одной аспарагиновой кислоты и одной глутаминовой кислоты. Первый атом железа (Ре1) дижелезного центра координирован тремя гистидинами, а второе железо (Бе2) координируется двумя гистидинами с кислотными остатками, соединяющими оба атома. Домены Нг могут обратимо связывать кислород на сайте Бе2. Связанный 02 восстанавливается, и последующие виды пероксидов образуют водородную связь с образующейся ^-оксогруппой и

дополнительно стабилизируются гидрофобными остатками, выстилающими связывающий карман [55, 147].

Доказана критическая роль фактора гипоксии НШ и белков метаболизма железа, в частности, ГОР и ферритина, в морфогенезе млекопитающих. Повышенная стабилизация НШ-1а в результате делеции гена УНЬ является летальной на Е10.5 - Е12.5 из-за дефектов развития плаценты [65]. Нокаут эмбрионов мышей по тяжелой цепи ферритина является летальным [53]. Во время внутриутробного развития, эмбрион мыши особенно уязвим к гипоксии во время септации сердца (эмбриональные дни Е12.5 - Е14.5 ) [159], что приводит к снижению пролиферации и дальнейшей гипоплазии миокарда. Другое исследование обозначает критическое окно развития пороков сердца как Е10.5 - Е13.5 [102]. В этот момент дефицит кислорода связан, наряду с истончением миокарда, с дефектами перегородки желудочков и предсердий. Эмбрионы с нарушенной работой НШ1а демонстрируют повышенную восприимчивость к диабетической эмбриопатии[53].

1.4 Общая характеристика убиквитин-протеасомной системы

Убиквитин-протеасомная система отвечает за селективный и контролируемый протеолиз внутриклеточных белков [173, 214]. Протеасома - это мультисубъединичный протеазный комплекс, который связывает, деубиквитинирует и разворачивает субстрат перед его поступлением в протеолитическую камеру, где он подвергается протеолизу. Согласованное действие ряда ферментов добавляет один или несколько мономеров убиквитина к белку-мишени. Фермент, активирующий убиквитин (Е1), запускает процесс убиквитинирования (рис. 4). Фермент Е1 вместе с АТФ связывается с убиквитином. Затем фермент Е1 передает убиквитин второму белку, который называется

белком конъюгации убиквитина (Е2). Белковые комплексы Е2 затем связываются с протеинлигазой убиквитина (Е3). Эта убиквитиновая протеинлигаза распознает, какой белок необходимо пометить, и катализирует перенос убиквитина к этому белку. Этот процесс присоединения убиквитина повторяется до тех пор, пока к целевому белку не присоединится цепь из убиквитинов. Присоединение нескольких в среднем 7, молекул убиквитина к белку маркирует его как субстрат для 268-308 протеасом, а форма 208 протеасомы расщепляет поврежденные, устаревшие и неправильно собранные белки без модификации убиквитином [125, 172].

Рис. 4. Присоединение убиквитина к субстрату каскадом ферментов Е1, Е2, Е3 [217]

Протеасомы обнаружены у эукариот, архей и некоторых бактерий. Для выполнения протеасомами различных функций протеасомные активаторы связываются с одним или обоими концами коровой частицы протеасомы (CP) [203]

На сегодняшний день известны следующие активаторы: 19S (RP), ответственный за АТФ-зависимое разрушение полиубиквитинированных субстратов, активатор протеасомы PA28 (а+в - комплекс участвует в сборке иммунных протеасом и необходим для эффективного процессинга антигенов; у - активатор ядерной формы протеасомы 20S-PA28 у, играет ключевую роль в стабилизации хромосом во время митоза, в организации ядерных спеклов, во взаимодействии с лимфотропным вирусом человека типа I (HTLV-1), а также доказана его роль при канцерогенезе, так как эта форма протеасом разрушает в ядре раковый супрессор p53 [223] и PA200/Blm10 тоже является активатором ядерной формы протеасомы 20 S-PA200, которая участвует в распознавании ацетилированных гистонов и способствует убиквитин - и АТФ - независимой деградации гистонов во время сперматогенеза, а также участвует в реакции на повреждение ДНК в соматических клетках, способствуя деградации гистонов после двухцепочечных разрывов ДНК [156]. Кроме того, были найдены гибридные формы протеасом с разными активаторами на обоих концах 20S субчастицы [108]. 19S регулятор можно разделить на два больших подкомплекса, называемых основанием и крышкой [63]. Основание и крышка являются основными промежуточными продуктами сборки, которые образуются на пути к полному формированию протеасомы 26 S протеасомы. Основная роль крышки заключается в координации деубиквитинирования субстрата с последующим его разворачиванием и перемещением полипептидных субстратов с помощью основания. Основание представляет собой гетерогексамерное кольцо АТФаз AAA-

типа (субъединицы Rpt1-6), которое использует энергию гидролиза АТФ для индукции конформационного ремоделирования белков-субстратов [224].

Интересно, что сборка CP и основания 19S регулятора нуждается в экзогенных факторах сборки или шаперонах, контролирующих сборку, но шаперонов, обеспечивающих и стабилизирующих сборку крышки 19S регулятора на сегодняшний день не найдено [92, 98]. Идентифицированы пять шаперонов, участвующих в сборке основания, в то время как для CP были найдены 4 шаперона сборки - PAC1-4 (proteasome assembly chaperones 1-4) [141].

1.5 20S коровая частица протеасомы

20S CP представляет собой высококонсервативный комплекс, состоящий из четырех колец, уложенных друг на друга в форме бочонка [108]. Узкие каналы входа в каталитический центр протеасомы создаются двумя внешними кольцами, каждое из которых образовано семью а-субъединицами. Два внутренних кольца образуют внутреннюю камеру, в которой находятся протеолитические активные центры, ответственные за расщепление белка. Каждое из этих колец состоит из семи Р-субъединиц. Субъединицы а имеют высоко консервативные N-концевые удлинения, которые отсутствуют у субъединиц р. Эти N-концы образуют ворота, которые контролируют прохождение субстрата через центральный канал а-кольца [69].

Протеасомы архей и бактерий обычно имеют один тип а-субъединиц и один тип Р-субъединиц, каждая из которых присутствует в 14 копиях в каждой CP. Таким образом, прокариотические протеасомы имеют 14 активных сайтов, расположенных в их центральных камерах [36]. У эукариот семь различных паралогов а-субъединиц образуют два

гептамерных внешних кольца, а семь различных паралогов Р-субъединиц образуют два внутренних кольца, уложенных друг на друга. Удлиненный К-концевой участок пептида эукариотической а3-субъединицы является ключевым фактором регуляции ворот а-кольца [69]. Эти ворота обычно закрыты в отсутствие активаторов [149]. Только три из семи эукариотических Р-субъединиц (Р1, р2 и Р5) обладают протеолитическими активностями (т.е. сохраняют интактный активный сайт), поэтому каждая эукариотическая СР имеет шесть протеолитических активных сайтов. Субъединицы р1, р2 и Р5 обладают соответственно каспазоподобной (гидролиз пептидилглутамилпептида), трипсиноподобной и химотрипсиноподобной активностями. Это дает протеасомам способность расщеплять пептидные связи на С-концевой стороне кислых, основных и гидрофобных аминокислотных остатков.

Кристаллическая структура протеасомы 20S показывает, что ворота а-кольца почти полностью закрыты, таким образом, предотвращается проникновение белков во внутреннюю, протеолитически активную, камеру Р-кольца. Таким образом, форма 20S является латентной в клетках. Субстраты могут получить доступ к активным центрам только после прохождения через узкое отверстие ворот в центре а-колец [19]. Модель и криоэлектронная структура 20 Б частицы протеасомы эукариот приведены на рисунке ниже.

Рис. 5. Модель (слева) и криоэлектронная структура (справа) 20Б СР формы протеасомы эукариот [27, 174].

1.6 Особенности структурной организации 208 протеасом эукариот

Субъединицы 20Б СР Р1, Р2 и Р5 являются конститутивными, но у млекопитающих при повышении уровня ШК-у они способны заменяться на иммунные субъединицы - рН, р21 и Р51, соответственно. Протеасомы, в которых произошла полная или частичная замена конститутивных субъединиц на иммунные, называются ШК-у-индуцибельными или «иммунопротеасомами». Такое наименование подчеркивает их специализированные функции в иммунных ответах и отличает их от комплексов, содержащих только конститутивно экспрессируемые субъединицы [198]. Пептиды, генерируемые иммунопротеасомой, с большей вероятностью связываются в пептид-связывающем кармане молекул МНС класса I, поскольку гидрофобные или основные (в меньшей степени) карбоксильные концевые пептидные остатки обычно служат местами заякоривания при связывании именно в комплексах класса I. Этот механизм позволяет цитотоксическим Т-лимфоцитам обнаруживать и уничтожать аномальные клетки, содержащие вирусные или другие чужеродные белки или опухолевые антигены. На сегодняшний день

доказана роль иммунопротеасом как важнейшего компонента клеточно-опосредованного иммунитета. Она заключается в эффективном продуцировании пептидных эпитопов для цитотоксических Т-лимфоцитов и представлении этих пептидов для МНС класса I [198]. Приобретение иммунопротеасом в ходе эволюции позволило организмам использовать лиганды МНС класса I и за счет этого более эффективно бороться с патогенами. Так, у мышей, лишенных рН, p2i или Р5^ обнаруживается дефектный процессинг антигенов и, как следствие, нарушенные иммунные ответы [14, 51]

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Финошин Александр Дмитриевич, 2021 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Adamska M. [и др.]. Wnt and TGF-P Expression in the Sponge Amphimedon queenslandica and the Origin of Metazoan Embryonic Patterning // PLoS ONE. 2007. № 10 (2). C. e1031.

2. Aharoni-Simon M. [и др.]. Bcl-2 Regulates Reactive Oxygen Species Signaling and a Redox-Sensitive Mitochondrial Proton Leak in Mouse Pancreatic p-Cells // Endocrinology. 2016. № 6 (157). C. 2270-2281.

3. Alexander B. E. [и др.]. Cell kinetics during regeneration in the sponge Halisarca caerulea : how local is the response to tissue damage? // PeerJ. 2015. (3). C. e820.

4. Altschul S. F. [и др.]. Basic local alignment search tool // Journal of Molecular Biology. 1990. № 3 (215). C. 403-410.

5. Anderson C. P. [и др.]. Mammalian iron metabolism and its control by iron regulatory proteins // Biochimica Et Biophysica Acta. 2012. № 9 (1823). C. 1468-1483.

6. Arnaud N. [и др.]. The iron-responsive element (IRE)/iron-regulatory protein 1 (IRP1)-cytosolic aconitase iron-regulatory switch does not operate in plants // Biochemical Journal. 2007. № 3 (405). C. 523-531.

7. Ascenzi P. [и др.]. Neuroglobin: From structure to function in health and disease // Molecular Aspects of Medicine. 2016. (52). C. 1-48.

8. Back D. Z. de [и др.]. Of macrophages and red blood cells; a complex love story // Frontiers in Physiology. 2014. (5).

9. Baeyens N., Schwartz M. A. Biomechanics of vascular mechanosensation and remodeling // Molecular Biology of the Cell. 2016. № 1 (27). C. 7-11.

10. Bagby R. M. Formation and differentiation of the upper pinacoderm in reaggregation masses of the sponge Microciona prolifera (Ellis and Solander) // The Journal of Experimental Zoology. 1972. № 2 (180). C. 217-225.

11. Bailly X. [h gp.]. A phylogenomic profile of hemerythrins, the nonheme diiron binding respiratory proteins // BMC Evolutionary Biology. 2008. № 1 (8). C. 244.

12. Bard J. A. M. [h gp.]. Structure and Function of the 26S Proteasome // Annual Review of Biochemistry. 2018. № 1 (87). C. 697-724.

13. Bardag-Gorce F., French S. W. Delta-aminolevulinic dehydratase is a proteasome interacting protein // Experimental and Molecular Pathology. 2011. № 2 (91). C. 485-489.

14. Barton L. F. [h gp.]. Immune Defects in 28-kDa Proteasome Activator y-Deficient Mice // The Journal of Immunology. 2004. № 6 (172). C. 3948-3954.

15. Beck G. [h gp.]. Evolution of the acute phase response: iron release by echinoderm (Asterias forbesi) coelomocytes, and cloning of an echinoderm ferritin molecule // Developmental & Comparative Immunology. 2002. № 1 (26). C. 11-26.

16. Beckwith R. [h gp.]. Reconstitution of the 26S proteasome reveals functional asymmetries in its AAA+ unfoldase // Nature Structural & Molecular Biology. 2013. № 10 (20). C. 1164-1172.

17. Binet M. [h gp.]. Fast and accurate branch lengths estimation for phylogenomic trees // BMC bioinformatics. 2016. (17). C. 23.

18. Blank M., Burmester T. Widespread occurrence of N-terminal acylation in animal globins and possible origin of respiratory globins from a membrane-bound ancestor // Molecular Biology and Evolution. 2012. № 11 (29). C. 35533561.

19. Bochtler M. [h gp.]. THE PROTEASOME // Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 1999. № 1 (28). C. 295-317.

20. Bolger A. M., Lohse M., Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data // Bioinformatics (Oxford, England). 2014. № 15 (30). C. 2114-2120.

21. Bonvini P. [h gp.]. Bortezomib-mediated 26S proteasome inhibition causes cell-cycle arrest and induces apoptosis in CD-30+ anaplastic large cell lymphoma // Leukemia. 2007. № 4 (21). C. 838-842.

22. Borisenko I. E. [h gp.]. Transdifferentiation is a driving force of regeneration in Halisarca dujardini (Demospongiae, Porifera) // PeerJ. 2015. (3). C. e1211.

23. Bowerman B., Kurz T. Degrade to create: developmental requirements for ubiquitin-mediated proteolysis during early C. elegans embryogenesis // Development. 2006. № 5 (133). C. 773-784.

24. Bryant D. M. [h gp.]. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors // Cell Reports. 2017. № 3 (18). C. 762-776.

25. Buchfink B., Xie C., Huson D. H. Fast and sensitive protein alignment using DIAMOND // Nature Methods. 2015. № 1 (12). C. 59-60.

26. Budenholzer L. [h gp.]. Proteasome Structure and Assembly // Journal of Molecular Biology. 2017. № 22 (429). C. 3500-3524.

27. Buneeva O. A., Medvedev A. E. Ubiquitin-independent protein degradation in proteasomes // Biomeditsinskaya Khimiya. 2018. № 2 (64). C. 134-148.

28. Buscema M., De Sutter D., Van de Vyver G. Ultrastructural study of differentiation processes during aggregation of purified sponge archaeocytes // Wilhelm Roux's Archives of Developmental Biology. 1980. № 1 (188). C. 4553.

29. Cardozo T., Pagano M. The SCF ubiquitin ligase: insights into a molecular machine // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2004. № 9 (5). C. 739-751.

30. Chernogor L. I. [h gp.]. Long-Term Cultivation of Primmorphs from Freshwater Baikal Sponges Lubomirskia baikalensis // Marine Biotechnology. 2011. № 4 (13). C. 782-792.

31. Chesnel F. [h gp.]. Cyclin B Dissociation from CDK1 Precedes its Degradation Upon MPF Inactivation in Mitotic Extracts of Xenopus laevis Embryos // Cell Cycle. 2006. № 15 (5). C. 1687-1698.

32. Clarke S. L. [h gp.]. Iron-responsive degradation of iron-regulatory protein 1 does not require the Fe-S cluster // The EMBO Journal. 2006. № 3 (25). C. 544553.

33. Clevers H., Nusse R. Wnt/p-Catenin Signaling and Disease // Cell. 2012. № 6 (149). C. 1192-1205.

34. Colgren J., Nichols S. A. The significance of sponges for comparative studies of developmental evolution // WIREs Developmental Biology. 2020. № 2 (9).

35. Collins G. A., Goldberg A. L. The Logic of the 26S Proteasome // Cell. 2017. № 5 (169). C. 792-806.

36. Darwin K. H. Prokaryotic ubiquitin-like protein (Pup), proteasomes and pathogenesis // Nature Reviews Microbiology. 2009. № 7 (7). C. 485-491.

37. Desai D. K., Desai F. D., LaRoche J. Factors Influencing the Diversity of Iron Uptake Systems in Aquatic Microorganisms // Frontiers in Microbiology. 2012. (3).

38. Ding Z. [h gp.]. High-resolution cryo-EM structure of the proteasome in complex with ADP-AlFx // Cell Research. 2017. № 3 (27). C. 373-385.

39. Drakesmith H., Nemeth E., Ganz T. Ironing out Ferroportin // Cell Metabolism. 2015. № 5 (22). C. 777-787.

40. Eddy S. R. Accelerated Profile HMM Searches // PLoS computational biology. 2011. № 10 (7). C. e1002195.

41. Eerkes-Medrano D., Feehan C. J., Leys S. P. Sponge cell aggregation: checkpoints in development indicate a high level of organismal complexity // Invertebrate Biology. 2015. № 1 (134). C. 1-18.

42. El-Gebali S. [h gp.]. The Pfam protein families database in 2019 // Nucleic Acids Research. 2019. № D1 (47). C. D427-D432.

43. El-Khodor B. F. [h gp.]. The expression of mRNAs for the proteasome complex is developmentally regulated in the rat mesencephalon // Developmental Brain Research. 2001. № 1 (129). C. 47-56.

44. Ema M. [h gp.]. A novel bHLH-PAS factor with close sequence similarity to hypoxia-inducible factor 1 regulates the VEGF expression and is potentially involved in lung and vascular development // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1997. № 9 (94). C. 4273-4278.

45. Erales J. [h gp.]. Functional Asymmetries of Proteasome Translocase Pore // Journal of Biological Chemistry. 2012. № 22 (287). C. 18535-18543.

46. Ereskovsky A. Reproduction cycles and strategies of the cold-water sponges Halisarca dujardini (Demospongiae, Halisarcida), Myxilla incrustans and Iophon piceus (Demospongiae, Poecilosclerida) from the White Sea // The Biological Bulletin. 2000. № 1 (198). C. 77-87.

47. Ereskovsky A. [h gp.]. Whole-Body Regeneration in Sponges: Diversity, Fine Mechanisms, and Future Prospects // Genes. 2021. № 4 (12). C. 506.

48. Ereskovsky A. V. [h gp.]. Oscarella lobularis (Homoscleromorpha, Porifera) Regeneration: Epithelial Morphogenesis and Metaplasia // PLOS ONE. 2015. № 8 (10). C. e0134566.

49. Ereskovsky A. V. [h gp.]. Regeneration in White Sea sponge Leucosolenia complicata (Porifera, Calcarea) // Invertebrate Zoology. 2017. № 1 (14). C. 108113.

50. Ereskovsky A. V. [h gp.]. Transdifferentiation and mesenchymal-to-epithelial transition during regeneration in Demospongiae (Porifera) // Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 2020. № 1 (334). C. 37-58.

51. Fehling H. [h gp.]. MHC class I expression in mice lacking the proteasome subunit LMP-7 // Science. 1994. № 5176 (265). C. 1234-1237.

52. Fernandez-Busquets X. The Sponge as a Model of Cellular Recognition nog peg. P. M. Conn, Totowa, NJ: Humana Press, 2008.C. 75-83.

53. Ferreira C. [h gp.]. Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice // The Journal of Biological Chemistry. 2000. № 5 (275). C. 3021-3024.

54. Fillebeen C. [h gp.]. A Phosphomimetic Mutation at Ser-138 Renders Iron Regulatory Protein 1 Sensitive to Iron-Dependent Degradation // Molecular and Cellular Biology. 2003. № 19 (23). C. 6973-6981.

55. French C. E., Bell J. M. L., Ward F. B. Diversity and distribution of hemerythrin-like proteins in prokaryotes // FEMS Microbiology Letters. 2008. № 2 (279). C. 131-145.

56. Funayama N. The stem cell system in demosponges: Insights into the origin of somatic stem cells: Stem cell system in demosponges // Development, Growth & Differentiation. 2010. № 1 (52). C. 1-14.

57. Funayama N. [h gp.]. Piwi expression in archeocytes and choanocytes in demosponges: insights into the stem cell system in demosponges: Piwi expression in archeocytes and choanocytes // Evolution & Development. 2010. № 3 (12). C. 275-287.

58. Gaino E., Magnino G. Dissociated cells of the calcareous sponge clathrina: a model for investigating cell adhesion and cell motility in vitro // Microscopy Research and Technique. 1999. № 4 (44). C. 279-292.

59. Ganz T. Hepcidin, a key regulator of iron metabolism and mediator of anemia of inflammation // Blood. 2003. № 3 (102). C. 783-788.

60. Garrido C. [h gp.]. Heat Shock Proteins 27 and 70: Anti-Apoptotic Proteins with Tumorigenic Properties // Cell Cycle. 2006. № 22 (5). C. 2592-2601.

61. Geiser D. L. [h gp.]. The effect of bacterial challenge on ferritin regulation in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: Mosquito immune response and ferritin regulation // Insect Science. 2013. № 5 (20). C. 601-619.

62. Gernert C. [h gp.]. Microbial Diversity of the Freshwater Sponge Spongilla lacustris // Microbial Ecology. 2005. № 2 (50). C. 206-212.

63. Glickman M. H. [h gp.]. The Regulatory Particle of the Saccharomyces cerevisiae Proteasome // Molecular and Cellular Biology. 1998. № 6 (18). C. 3149-3162.

64. Glickman M. H. [h gp.]. A Subcomplex of the Proteasome Regulatory Particle Required for Ubiquitin-Conjugate Degradation and Related to the COP9-Signalosome and eIF3 // Cell. 1998. № 5 (94). C. 615-623.

65. Gnarra J. R. [h gp.]. Defective placental vasculogenesis causes embryonic lethality in VHL-deficient mice // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1997. № 17 (94). C. 9102-9107.

66. Goldberg A. L. Functions of the proteasome: from protein degradation and immune surveillance to cancer therapy // Biochemical Society Transactions. 2007. № 1 (35). C. 12-17.

67. Grabherr M. G. [h gp.]. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome // Nature Biotechnology. 2011. № 7 (29). C. 644-652.

68. Grice L. F. [h gp.]. Origin and evolution of the sponge aggregation factor gene family // Molecular Biology and Evolution. 2017. C. msx058.

69. Groll M. [h gp.]. [No title found] // Nature Structural Biology. 2000. № 11 (7). C. 1062-1067.

70. Gu Z., Eils R., Schlesner M. Complex heatmaps reveal patterns and correlations in multidimensional genomic data // Bioinformatics (Oxford, England). 2016. № 18 (32). C. 2847-2849.

71. Haas A. L. [h gp.]. Coordinated Induction of the Ubiquitin Conjugation Pathway Accompanies the Developmentally Programmed Death of Insect

Skeletal Muscle // Journal of Biological Chemistry. 1995. № 16 (270). C. 94079412.

72. Hamilton A. M., Zito K. Breaking It Down: The Ubiquitin Proteasome System in Neuronal Morphogenesis // Neural Plasticity. 2013. (2013). C. 1-10.

73. Harada N. [h gp.]. Nrf2 regulates ferroportin 1-mediated iron efflux and counteracts lipopolysaccharide-induced ferroportin 1 mRNA suppression in macrophages // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2011. № 1 (508). C. 101 -109.

74. Harrison J. F. [h gp.]. Developmental plasticity and stability in the tracheal networks supplying Drosophila flight muscle in response to rearing oxygen level // Journal of Insect Physiology. 2018. (106). C. 189-198.

75. Havens C. G. [h gp.]. Regulation of Late G1/S Phase Transition and APCCdh1 by Reactive Oxygen Species // Molecular and Cellular Biology. 2006. № 12 (26). C. 4701-4711.

76. He J. [h gp.]. The Structure of the 26S Proteasome Subunit Rpn2 Reveals Its PC Repeat Domain as a Closed Toroid of Two Concentric a-Helical Rings // Structure. 2012. № 3 (20). C. 513-521.

77. Henkart P., Humphreys S., Humphreys T. Characterization of sponge aggregation factor. A unique proteoglycan complex // Biochemistry. 1973. № 16 (12). C. 3045-3050.

78. Hentze M. W. [h gp.]. Two to Tango: Regulation of Mammalian Iron Metabolism // Cell. 2010. № 1 (142). C. 24-38.

79. Herhold H. W., Davis S. R., Grimaldi D. A. Transcriptomes reveal expression of hemoglobins throughout insects and other Hexapoda // PLOS ONE. 2020. № 6 (15). C. e0234272.

80. Hibbing M. E., Fuqua C. Antiparallel and Interlinked Control of Cellular Iron Levels by the Irr and RirA Regulators of Agrobacterium tumefaciens // Journal of Bacteriology. 2011. № 14 (193). C. 3461-3472.

81. Hinz M. [h gp.]. NF-kappaB function in growth control: regulation of cyclin D1 expression and G0/G1-to-S-phase transition // Molecular and Cellular Biology. 1999. № 4 (19). C. 2690-2698.

82. Hirota K. An intimate crosstalk between iron homeostasis and oxygen metabolism regulated by the hypoxia-inducible factors (HIFs) // Free Radical Biology and Medicine. 2019. (133). C. 118-129.

83. Hirota K., Semenza G. L. Regulation of hypoxia-inducible factor 1 by prolyl and asparaginyl hydroxylases // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2005. № 1 (338). C. 610-616.

84. Hirsila M. [h gp.]. Characterization of the Human Prolyl 4-Hydroxylases That Modify the Hypoxia-inducible Factor // Journal of Biological Chemistry. 2003. № 33 (278). C. 30772-30780.

85. Holmes B., Blanch H. Possible taxonomic trends in the success of primary aggregate formation in marine sponge cell cultures // Marine Biotechnology (New York, N.Y.). 2008. № 1 (10). C. 99-109.

86. Huang L. E. [h gp.]. Regulation of hypoxia-inducible factor 1 is mediated by an O2-dependent degradation domain via the ubiquitin-proteasome pathway // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1998. № 14 (95). C. 79877992.

87. Huber E. M. [h gp.]. Immuno- and constitutive proteasome crystal structures reveal differences in substrate and inhibitor specificity // Cell. 2012. № 4 (148). C. 727-738.

88. Humphreys T. Chemical dissolution and in vitro reconstruction of sponge cell adhesions // Developmental Biology. 1963. № 1 (8). C. 27-47.

89. Husnjak K. [h gp.]. Proteasome subunit Rpn13 is a novel ubiquitin receptor // Nature. 2008. № 7194 (453). C. 481-488.

90. Inobe T. [h gp.]. Defining the geometry of the two-component proteasome degron // Nature Chemical Biology. 2011. № 3 (7). C. 161-167.

91. Isaza C. E. [h gp.]. Structural Basis for O 2 Sensing by the Hemerythrin-like Domain of a Bacterial Chemotaxis Protein: Substrate Tunnel and Fluxional N Terminus , // Biochemistry. 2006. № 30 (45). C. 9023-9031.

92. Isono E. [h gp.]. The Assembly Pathway of the 19S Regulatory Particle of the Yeast 26S Proteasome // Molecular Biology of the Cell. 2007. № 2 (18). C. 569-580.

93. Jaffe E. K., Stith L. ALAD porphyria is a conformational disease // American Journal of Human Genetics. 2007. № 2 (80). C. 329-337.

94. Jiang B. H. [h gp.]. Hypoxia-inducible factor 1 levels vary exponentially over a physiologically relevant range of O2 tension // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 1996. № 4 (271). C. C1172-C1180.

95. Jiang B.-H. [h gp.]. Dimerization, DNA Binding, and Transactivation Properties of Hypoxia-inducible Factor 1 // Journal of Biological Chemistry. 1996. № 30 (271). C. 17771-17778.

96. Jin J. Systematic analysis and nomenclature of mammalian F-box proteins // Genes & Development. 2004. № 21 (18). C. 2573-2580.

97. Kaelin W. G., Ratcliffe P. J., Semenza G. L. Pathways for Oxygen Regulation and Homeostasis: The 2016 Albert Lasker Basic Medical Research Award // JAMA. 2016. № 12 (316). C. 1252.

98. Kaneko T. [h gp.]. Assembly Pathway of the Mammalian Proteasome Base Subcomplex Is Mediated by Multiple Specific Chaperones // Cell. 2009. № 5 (137). C. 914-925.

99. Kao W.-C. [h gp.]. Isolation, purification and characterization of hemerythrin from Methylococcus capsulatus (Bath) // Journal of Inorganic Biochemistry. 2008. № 8 (102). C. 1607-1614.

100. Katsuma S. [h gp.]. Role of the ubiquitin-proteasome system in Bombyx mori nucleopolyhedrovirus infection // Journal of General Virology. 2011. № 3 (92). C. 699-705.

101. Kautz L. [h gp.]. Identification of erythroferrone as an erythroid regulator of iron metabolism // Nature Genetics. 2014. № 7 (46). C. 678-684.

102. Kenchegowda D. [h gp.]. Vulnerability of the Developing Heart to Oxygen Deprivation as a Cause of Congenital Heart Defects // Journal of the American Heart Association. 2014. № 3 (3).

103. Kimbell J. R., Koropatnick T. A., McFall-Ngai M. J. Evidence for the Participation of the Proteasome in Symbiont-Induced Tissue Morphogenesis // The Biological Bulletin. 2006. № 1 (211). C. 1-6.

104. Klein U., Gernold M., Kloetzel P. M. Cell-specific accumulation of Drosophila proteasomes (MCP) during early development. // Journal of Cell Biology. 1990. № 6 (111). C. 2275-2282.

105. Kniepert A., Groettrup M. The unique functions of tissue-specific proteasomes // Trends in Biochemical Sciences. 2014. № 1 (39). C. 17-24.

106. Koivunen P. [h gp.]. Catalytic Properties of the Asparaginyl Hydroxylase (FIH) in the Oxygen Sensing Pathway Are Distinct from Those of Its Prolyl 4-Hydroxylases // Journal of Biological Chemistry. 2004. № 11 (279). C. 98999904.

107. Komander D., Rape M. The Ubiquitin Code // Annual Review of Biochemistry. 2012. № 1 (81). C. 203-229.

108. Kunjappu M. J., Hochstrasser M. Assembly of the 20S proteasome // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 2014. № 1 (1843). C. 2-12.

109. Lambert L. A., Mitchell S. L. Molecular evolution of the transferrin receptor/glutamate carboxypeptidase II family // Journal of Molecular Evolution. 2007. № 1 (64). C. 113-128.

110. Lando D. Asparagine Hydroxylation of the HIF Transactivation Domain: A Hypoxic Switch // Science. 2002. № 5556 (295). C. 858-861.

111. Langmead B., Salzberg S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2 // Nature Methods. 2012. № 4 (9). C. 357-359.

112. Lavrov A. I. [h gp.]. Sewing up the wounds : The epithelial morphogenesis as a central mechanism of calcaronean sponge regeneration // Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 2018. № 6-7 (330). C. 351-371.

113. Lavrov A. I. [h gp.]. Intraspecific variability of cell reaggregation during reproduction cycle in sponges // Zoology. 2020. (140). C. 125795.

114. Lavrov A. I., Kosevich I. A. Sponge cell reaggregation: Mechanisms and dynamics of the process // Russian Journal of Developmental Biology. 2014. № 4 (45). C. 205-223.

115. Lavrov A. I., Kosevich I. A. Sponge cell reaggregation: Cellular structure and morphogenetic potencies of multicellular aggregates: SPONGE CELL REAGGREGATION: CELLULAR STRUCTURE // Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological Genetics and Physiology. 2016. № 2 (325). C. 158177.

116. Lawen A., Lane D. J. R. Mammalian Iron Homeostasis in Health and Disease: Uptake, Storage, Transport, and Molecular Mechanisms of Action // Antioxidants & Redox Signaling. 2013. № 18 (18). C. 2473-2507.

117. Le Pennec G. [h gp.]. Cultivation of primmorphs from the marine sponge Suberites domuncula: morphogenetic potential of silicon and iron // Journal of Biotechnology. 2003. № 2 (100). C. 93-108.

118. Lehman N. L. The ubiquitin proteasome system in neuropathology // Acta Neuropathologica. 2009. № 3 (118). C. 329-347.

119. Leimberg M. J. [h gp.]. Macrophages function as a ferritin iron source for cultured human erythroid precursors // Journal of Cellular Biochemistry. 2008. № 4 (103). C. 1211-1218.

120. Leys S. P., Degnan B. M. Embryogenesis and metamorphosis in a haplosclerid demosponge: gastrulation and transdifferentiation of larval ciliated cells to choanocytes // Invertebrate Biology. 2005. № 3 (121). C. 171-189.

121. Leys S. P., Hill A. The Physiology and Molecular Biology of Sponge Tissues Elsevier, 2012.C. 1-56.

122. Li B., Dewey C. N. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome // BMC bioinformatics. 2011. (12). C. 323.

123. Liu G. [h gp.]. Heme biosynthesis depends on previously unrecognized acquisition of iron-sulfur cofactors in human amino-levulinic acid dehydratase // Nature Communications. 2020. № 1 (11). C. 6310.

124. Lowry O. H. [h gp.]. Protein measurement with the Folin phenol reagent // The Journal of Biological Chemistry. 1951. № 1 (193). C. 265-275.

125. Lu Y. [h gp.]. Substrate degradation by the proteasome: A single-molecule kinetic analysis // Science. 2015. № 6231 (348). C. 1250834-1250834.

126. Luan B. [h gp.]. Structure of an endogenous yeast 26S proteasome reveals two major conformational states // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2016. № 10 (113). C. 2642-2647.

127. Lyupina Y. V. [h gp.]. Proteotoxic stress induced by Autographa californica nucleopolyhedrovirus infection of Spodoptera frugiperda Sf9 cells // Virology. 2013. № 1 (436). C. 49-58.

128. Lyupina Y. V. [h gp.]. Proteomics of the 26S proteasome in Spodoptera frugiperda cells infected with the nucleopolyhedrovirus, AcMNPV // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 2016. № 6 (1864). C. 738-746.

129. Magni M. [h gp.]. Chk2 and REGy-dependent DBC1 regulation in DNA damage induced apoptosis // Nucleic Acids Research. 2014. № 21 (42). C. 13150-13160.

130. Mandilaras K., Missirlis F. Genes for iron metabolism influence circadian rhythms in Drosophila melanogaster // Metallomics. 2012. № 9 (4). C. 928.

131. Marblestone J. G. [h gp.]. Analysis of ubiquitin E3 ligase activity using selective polyubiquitin binding proteins // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 2012. № 11 (1823). C. 2094-2097.

132. Marro S. [h gp.]. Heme controls ferroportin1 (FPN1) transcription involving Bach1, Nrf2 and a MARE/ARE sequence motif at position -7007 of the FPN1 promoter // Haematologica. 2010. № 8 (95). C. 1261-1268.

133. McCarthy D. J., Chen Y., Smyth G. K. Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation // Nucleic Acids Research. 2012. № 10 (40). C. 4288-4297.

134. McNaught K. St. P. [h gp.]. Proteasomal dysfunction in sporadic Parkinson's disease // Neurology. 2006. № Issue 10, Supplement 4 (66). C. S37-S49.

135. Michonneau F., Brown J. W., Winter D. J. rotl: an R package to interact with the Open Tree of Life data // Methods in Ecology and Evolution. 2016. № 12 (7). C. 1476-1481.

136. Mills D. B. [h gp.]. The last common ancestor of animals lacked the HIF pathway and respired in low-oxygen environments // eLife. 2018. (7).

137. Mirdita M. [h gp.]. Uniclust databases of clustered and deeply annotated protein sequences and alignments // Nucleic Acids Research. 2017. № D1 (45). C. D170-D176.

138. Mole D. R. Iron Homeostasis and Its Interaction with Prolyl Hydroxylases // Antioxidants & Redox Signaling. 2010. № 4 (12). C. 445-458.

139. Moriya Y. [h gp.]. KAAS: an automatic genome annotation and pathway reconstruction server // Nucleic Acids Research. 2007. № Web Server issue (35). C. W182-185.

140. Morozov A. V., Karpov V. L. Proteasomes and Several Aspects of Their Heterogeneity Relevant to Cancer // Frontiers in Oncology. 2019. (9). C. 761.

141. Murata S., Yashiroda H., Tanaka K. Molecular mechanisms of proteasome assembly // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2009. № 2 (10). C. 104115.

142. Nakayama K. I., Nakayama K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer // Nature Reviews Cancer. 2006. № 5 (6). C. 369-381.

143. Nemeth E., Ganz T. Regulation of Iron Metabolism by Hepcidin // Annual Review of Nutrition. 2006. № 1 (26). C. 323-342.

144. Neves J. V., Wilson J. M., Rodrigues P. N. S. Transferrin and ferritin response to bacterial infection: The role of the liver and brain in fish // Developmental & Comparative Immunology. 2009. № 7 (33). C. 848-857.

145. Nichols S. A. [h gp.]. Early evolution of animal cell signaling and adhesion genes // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2006. № 33 (103). C.12451-12456.

146. Nocker S. van [h gp.]. The multiubiquitin-chain-binding protein Mcb1 is a component of the 26S proteasome in Saccharomyces cerevisiae and plays a nonessential, substrate-specific role in protein turnover. // Molecular and Cellular Biology. 1996. № 11 (16). C. 6020-6028.

147. Nordlund P., Eklund H. Di-iron—carboxylate proteins // Current Opinion in Structural Biology. 1995. № 6 (5). C. 758-766.

148. OpenTreeOfLife [h gp.]. Open Tree of Life Synthetic Tree 2019.

149. Osmulski P. A., Hochstrasser M., Gaczynska M. A Tetrahedral Transition State at the Active Sites of the 20S Proteasome Is Coupled to Opening of the aRing Channel // Structure. 2009. № 8 (17). C. 1137-1147.

150. Parmley R. T., Spicer S. S., Alvarez C. J. Ultrastructural localization of nonheme celluar iron with ferrocyanide. // Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 1978. № 9 (26). C. 729-741.

151. Pasten C. [h gp.]. Characterization of proteolytic activities during intestinal regeneration of the sea cucumber, Holothuria glaberrima // The International Journal of Developmental Biology. 2012. № 9 (56). C. 681-691.

152. Pham D. Q. D., Winzerling J. J. Insect ferritins: Typical or atypical? // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 2010. № 8 (1800). C. 824-833.

153. Popham H. J. R. [h gp.]. Iron levels change in larval Heliothis virescens tissues following baculovirus infection // Biological Trace Element Research. 2012. № 3 (148). C. 356-362.

154. Pozzolini M. [h gp.]. Insights into the evolution of metazoan regenerative mechanisms: roles of TGF superfamily members in tissue regeneration of the marine sponge Chondrosia reniformis // Journal of Experimental Biology. 2019. № 17 (222). C. jeb207894.

155. Puig S. [h gp.]. The elemental role of iron in DNA synthesis and repair // Metallomics: Integrated Biometal Science. 2017. № 11 (9). C. 1483-1500.

156. Qian M.-X. [h gp.]. Acetylation-Mediated Proteasomal Degradation of Core Histones during DNA Repair and Spermatogenesis // Cell. 2013. № 5 (153). C. 1012-1024.

157. Rapozzi V., Umezawa K., Xodo L. E. Role of NF-KB/Snail/RKIP loop in the response of tumor cells to photodynamic therapy // Lasers in Surgery and Medicine. 2011. № 7 (43). C. 575-585.

158. Rastogi N., Mishra D. P. Therapeutic targeting of cancer cell cycle using proteasome inhibitors // Cell Division. 2012. № 1 (7). C. 26.

159. Ream M. [h gp.]. Early fetal hypoxia leads to growth restriction and myocardial thinning // American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 2008. № 2 (295). C. R583-595.

160. Renard E. [h gp.]. Understanding Animal Evolution: The Added Value of Sponge Transcriptomics and Genomics: The disconnect between gene content and body plan evolution // BioEssays. 2018. № 9 (40). C. 1700237.

161. Retief J. D. Phylogenetic analysis using PHYLIP // Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 2000. (132). C. 243-258.

162. Richard K. L., Kelley B. R., Johnson J. G. Heme Uptake and Utilization by Gram-Negative Bacterial Pathogens // Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2019. (9). C. 81.

163. Richardson D. R., Ponka P. The molecular mechanisms of the metabolism and transport of iron in normal and neoplastic cells // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Biomembranes. 1997. № 1 (1331). C. 1-40.

164. Rivett A. J. Proteasomes: multicatalytic proteinase complexes // Biochemical Journal. 1993. № 1 (291). C. 1-10.

165. Rock K. L. [h gp.]. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules // Cell. 1994. № 5 (78). C. 761-771.

166. Roe K. L., Hogle S. L., Barbeau K. A. Utilization of Heme as an Iron Source by Marine Alphaproteobacteria in the Roseobacter Clade // Applied and Environmental Microbiology. 2013. № 18 (79). C. 5753-5762.

167. Roesner A. [h gp.]. A globin gene of ancient evolutionary origin in lower vertebrates: evidence for two distinct globin families in animals // Molecular Biology and Evolution. 2005. № 1 (22). C. 12-20.

168. Rosenzweig R. [h gp.]. The central unit within the 19S regulatory particle of the proteasome // Nature Structural & Molecular Biology. 2008. № 6 (15). C. 573-580.

169. Rosin F. C. P. [h gp.]. Resistance of oral cancer cells to 5-ALA-mediated photodynamic therapy // Journal of Cellular Biochemistry. 2018. № 4 (119). C. 3554-3562.

170. Rouault T. A. The role of iron regulatory proteins in mammalian iron homeostasis and disease // Nature Chemical Biology. 2006. № 8 (2). C. 406414.

171. Rousseau A., Bertolotti A. Regulation of proteasome assembly and activity in health and disease // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2018. № 11 (19). C. 697-712.

172. Saeki Y. Ubiquitin recognition by the proteasome // Journal of Biochemistry. 2017. C. mvw091.

173. Saeki Y., Tanaka K. Assembly and Function of the Proteasome Methods in Molecular Biology / nog peg. R. J. Dohmen, M. Scheffner, Totowa, NJ: Humana Press, 2012.C. 315-337.

174. Sahu I., Glickman M. H. Structural Insights into Substrate Recognition and Processing by the 20S Proteasome // Biomolecules. 2021. № 2 (11). C. 148.

175. Salahudeen A. A. [h gp.]. An E3 Ligase Possessing an Iron-Responsive Hemerythrin Domain Is a Regulator of Iron Homeostasis // Science. 2009. № 5953 (326). C. 722-726.

176. Sawada H. [h gp.]. Localization and roles in fertilization of sperm proteasomes in the ascidianHalocynthia roretzi // Molecular Reproduction and Development. 2002. № 2 (62). C. 271-276.

177. Schippers K. J., Nichols S. A. Evidence of Signaling and Adhesion Roles for ß-Catenin in the Sponge Ephydatia muelleri // Molecular Biology and Evolution. 2018. № 6 (35). C. 1407-1421.

178. Schmitt S. M. [h gp.]. Involvement of ALAD-20S Proteasome Complexes in Ubiquitination and Acetylation of Proteasomal a2 Subunits // Journal of Cellular Biochemistry. 2016. № 1 (117). C. 144-151.

179. Schröder H. C. [h gp.]. Stress response in Baikalian sponges exposed to pollutants // Hydrobiologia. 2006. № S1 (568). C. 277-287.

180. Sebé-Pedros A. [h gp.]. Early metazoan cell type diversity and the evolution of multicellular gene regulation // Nature Ecology & Evolution. 2018. № 7 (2). C. 1176-1188.

181. Shah Y. M., Xie L. Hypoxia-Inducible Factors Link Iron Homeostasis and Erythropoiesis // Gastroenterology. 2014. № 3 (146). C. 630-642.

182. Sharma N. [h gp.]. a-Synuclein Budding Yeast Model: Toxicity Enhanced by Impaired Proteasome and Oxidative Stress // Journal of Molecular Neuroscience. 2006. № 2 (28). C. 161-178.

183. Shi Y. [h gp.]. Rpn1 provides adjacent receptor sites for substrate binding and deubiquitination by the proteasome // Science. 2016. № 6275 (351). C. aad9421-aad9421.

184. Siebert S. [h gp.]. Stem cell differentiation trajectories in Hydra resolved at single-cell resolution // Science. 2019. № 6451 (365). C. eaav9314.

185. Sievers F., Higgins D. G. Clustal omega // Current Protocols in Bioinformatics. 2014. (48). C. 3.13.1-16.

186. Simpson T. L. The Cell Biology of Sponges / T. L. Simpson, New York, NY: Springer New York, 1984.

187. Sipkema D. [h gp.]. Primmorphs from seven marine sponges: formation and structure // Journal of Biotechnology. 2003. № 2 (100). C. 127-139.

188. Smith J. L. The Physiological Role of Ferritin-Like Compounds in Bacteria // Critical Reviews in Microbiology. 2004. № 3 (30). C. 173-185.

189. Smith-Unna R. [h gp.]. TransRate: reference-free quality assessment of de novo transcriptome assemblies // Genome Research. 2016. № 8 (26). C. 11341144.

190. Sogabe S. [h gp.]. Pluripotency and the origin of animal multicellularity // Nature. 2019. № 7762 (570). C. 519-522.

191. Song L., Florea L. Rcorrector: efficient and accurate error correction for Illumina RNA-seq reads // GigaScience. 2015. (4). C. 48.

192. Soubigou A. [h gp.]. Regeneration in the sponge Sycon ciliatum partly mimics postlarval development // Development. 2020. № 22 (147). C. dev193714.

193. Srivastava M. [h gp.]. The Amphimedon queenslandica genome and the evolution of animal complexity // Nature. 2010. № 7307 (466). C. 720-726.

194. Stadtman E. R. Metal ion-catalyzed oxidation of proteins: Biochemical mechanism and biological consequences // Free Radical Biology and Medicine. 1990. № 4 (9). C. 315-325.

195. Tanaka K. The proteasome: Overview of structure and functions // Proceedings of the Japan Academy, Series B. 2009. № 1 (85). C. 12-36.

196. Tang X., Zhou B. Iron homeostasis in insects: Insights from Drosophila studies // IUBMB life. 2013. № 10 (65). C. 863-872.

197. Tanimoto K. Mechanism of regulation of the hypoxia-inducible factor-1alpha by the von Hippel-Lindau tumor suppressor protein // The EMBO Journal. 2000. № 16 (19). C. 4298-4309.

198. Tanoka K., Kasahara M. The MHC class I ligand-generating system: roles of immunoproteasomes and the interferon-4gMY-inducible proteasome activator PA28 // Immunological Reviews. 1998. № 1 (163). C. 161-176.

199. Tarrason Risa G. [h gp.]. The proteasome controls ESCRT-III-mediated cell division in an archaeon // Science. 2020. № 6504 (369). C. eaaz2532.

200. Thompson J. W., Bruick R. K. Protein degradation and iron homeostasis // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 2012. № 9 (1823). C. 1484-1490.

201. Thul P. J. [h gp.]. A subcellular map of the human proteome // Science. 2017. № 6340 (356). C. eaal3321.

202. Tian G. [h gp.]. An asymmetric interface between the regulatory and core particles of the proteasome // Nature Structural & Molecular Biology. 2011. № 11 (18). C. 1259-1267.

203. Tomko R. J., Hochstrasser M. Molecular Architecture and Assembly of the Eukaryotic Proteasome // Annual Review of Biochemistry. 2013. № 1 (82). C. 415-445.

204. Unverdorben P. [h gp.]. Deep classification of a large cryo-EM dataset defines the conformational landscape of the 26S proteasome // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2014. № 15 (111). C. 5544-5549.

205. Ustrell V. [h gp.]. Purification and Assay of Proteasome Activator PA200 Elsevier, 2005.C. 321-329.

206. Valisano L. [h gp.]. Primmorphs formation dynamics: a screening among Mediterranean sponges // Marine Biology. 2006. № 5 (149). C. 1037-1046.

207. Vashisht A. A. [h gp.]. Control of Iron Homeostasis by an Iron-Regulated Ubiquitin Ligase // Science. 2009. № 5953 (326). C. 718-721.

208. Verma R. Role of Rpn11 Metalloprotease in Deubiquitination and Degradation by the 26S Proteasome // Science. 2002. № 5593 (298). C. 611615.

209. Wang B. [h gp.]. Application of synthetic biology in cyanobacteria and algae // Frontiers in Microbiology. 2012. (3). C. 344.

210. Wang G. L. [h gp.]. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1995. № 12 (92). C. 5510-5514.

211. Wang Z., Wu M. A Phylum-Level Bacterial Phylogenetic Marker Database // Molecular Biology and Evolution. 2013. № 6 (30). C. 1258-1262.

212. Waterhouse R. M. [h gp.]. BUSCO Applications from Quality Assessments to Gene Prediction and Phylogenomics // Molecular Biology and Evolution. 2018. № 3 (35). C. 543-548.

213. Wehmer M. [h gp.]. Structural insights into the functional cycle of the ATPase module of the 26S proteasome // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2017. № 6 (114). C. 1305-1310.

214. Wehmer M., Sakata E. Recent advances in the structural biology of the 26S proteasome // The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2016. (79). C. 437-442.

215. Weng T. [h gp.]. Gene expression profiling identifies regulatory pathways involved in the late stage of rat fetal lung development // American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 2006. № 5 (291). C. L1027-L1037.

216. Wilson H. V. On some phenomena of coalescence and regeneration in sponges // Journal of Experimental Zoology. 1907. № 2 (5). C. 245-258.

217. Wooten M. W. [h gp.]. Signaling, Polyubiquitination, Trafficking, and Inclusions: Sequestosome 1/p62's Role in Neurodegenerative Disease // Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2006. (2006). C. 1-12.

218. Xiong J. [h gp.]. A Hemerythrin-like Domain in a Bacterial Chemotaxis Protein // Biochemistry. 2000. № 17 (39). C. 5117-5125.

219. Yao T. [h gp.]. Proteasome recruitment and activation of the Uch37 deubiquitinating enzyme by Adrm1 // Nature Cell Biology. 2006. № 9 (8). C. 994-1002.

220. Yao T., Cohen R. E. A cryptic protease couples deubiquitination and degradation by the proteasome // Nature. 2002. № 6905 (419). C. 403-407.

221. Yokota N., Sawada H. Sperm proteasomes are responsible for the acrosome reaction and sperm penetration of the vitelline envelope during fertilization of

the sea urchin Pseudocentrotus depressus // Developmental Biology. 2007. № 1 (308). C. 222-231.

222. Yu Y., Kovacevic Z., Richardson D. R. Tuning cell cycle regulation with an iron key // Cell Cycle (Georgetown, Tex.). 2007. № 16 (6). C. 1982-1994.

223. Zannini L. [h gp.]. REGy proteasome activator is involved in the maintenance of chromosomal stability // Cell Cycle. 2008. № 4 (7). C. 504-512.

224. Zhang G. [h gp.]. AAA ATPases as therapeutic targets: Structure, functions, and small-molecule inhibitors // European Journal of Medicinal Chemistry. 2021. (219). C. 113446.

225. Zhang X. [h gp.]. Primmorphs from archaeocytes-dominant cell population of the spongehymeniacidon perleve: improved cell proliferation and spiculogenesis // Biotechnology and Bioengineering. 2003. № 5 (84). C. 583590.

226. Zhang Z., Zhang R. Proteasome activator PA28y regulates p53 by enhancing its MDM2-mediated degradation // The EMBO Journal. 2008. № 6 (27). C. 852-864.

227. Zheng L. [h gp.]. Ferritin has an important immune function in the ark shell Scapharca broughtonii // Developmental & Comparative Immunology. 2016. (59). C. 15-24.

228. Zhong L., Belote J. M. The testis-specific proteasome subunit Prosa6T of D. melanogaster is required for individualization and nuclear maturation during spermatogenesis // Development. 2007. № 19 (134). C. 3517-3525.

229. Molecular cell biology nog peg. H. F. Lodish, 4th ed-e H3g., New York: W.H. Freeman, 2000. 1084 c.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Приложение 1. Таблица бактериальных белков, вовлеченных в метаболизм и транспорт железа, идентифицированные по транскриптому H. dujardinii

Group Protein Best blastp hit's organism Class

Fe-S cluster proteins iron-sulfur protein oxidoreductase Rhodospirillaceae bacterium Alphaproteobacteria

Fe-S cluster proteins 2Fe-2S iron-sulfur cluster binding domain-containing protein Adenylate cyclase 1 Alphaproteobacteria bacterium MarineAlpha3 Bin3 Alphaproteobacteria

Fe-S cluster proteins Sulfite reductase [ferredoxin] Rhodospirillales bacterium Alphaproteobacteria

Fe-S cluster proteins Adenylate cyclase 2 Alphaproteobacteria bacterium MarineAlpha3 Bin3 Alphaproteobacteria

Fe-S cluster proteins ubiquinol-cytochrome c reductase iron-sulfur subunit Alphaproteobacteria bacterium Alphaproteobacteria

Fe-S cluster proteins Succinate dehydrogenase iron-sulfur subunit Alphaproteobacteria bacterium MarineAlpha3 Bin4 Alphaproteobacteria

Fe-S cluster proteins iron-sulfur cluster assembly accessory protein Rhodospirillales bacterium Alphaproteobacteria

Fe-S cluster proteins iron-sulfur cluster carrier protein ApbC Alphaproteobacteria bacterium HT1-32 Alphaproteobacteria

Fe-S cluster proteins ferredoxin--NADP(+) reductase Rhodospirillaceae bacterium Alphaproteobacteria

Fe-S cluster proteins iron-sulfur cluster insertion protein ErpA Rhodobacteraceae bacterium Alphaproteobacteria

Fe-S cluster proteins aldehyde ferredoxin oxidoreductase Magnetovibrio sp. Alphaproteobacteria

Fe-S cluster proteins electron transfer flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase (4Fe-4S) Oceanibaculum nanhaiense Alphaproteobacteria

Fe-S cluster proteins aldehyde ferredoxin oxidoreductase Gammaproteobacteria bacterium Gammaproteobacteria

Fe-S cluster proteins electron transfer flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase (4Fe-4S) Alphaproteobacteria bacterium Alphaproteobacteria

Fe-S cluster proteins Fe-S cluster assembly protein SufB Gammaproteobacteria bacterium RBG 16 51 14 Gammaproteobacteria

Fe-S cluster proteins succinate dehydrogenase/fumarate reductase iron-sulfur subunit Chryseolinea flava Cytophagia

Fe-S cluster proteins iron-sulfur cluster-binding protein Rhodospirillaceae bacterium Alphaproteobacteria

Fe-S cluster proteins iron-conraining bifunctional acetaldehyde-CoA/alcohol dehydrogenase Oceanospirillales bacterium Gammaproteobacteria

Fe-S cluster proteins ferredoxin Rhodospirillaceae bacterium Alphaproteobacteria

Fe-S cluster proteins iron-sulfur cluster insertion protein ErpA Xanthomonadaceae bacterium Gammaproteobacteria

Fe-S cluster proteins ferredoxin (4Fe-4S cluster protein) Rhodospirillales bacterium Alphaproteobacteria

Fe-S cluster proteins 4Fe-4S dicluster domain-containing protein Oceanibacterium hippocampi Alphaproteobacteria

Fe-S cluster proteins Fe-S oxidoreductase Rhodospirillales bacterium Alphaproteobacteria

Fe-S cluster proteins iron-containing alcohol dehydrogenase Notoacmeibacter marinus Alphaproteobacteria

Fe-S cluster proteins aldehyde ferredoxin oxidoreductase Alphaproteobacteria bacterium MarineAlpha3 Bin4 Alphaproteobacteria

Fe-S cluster proteins 4Fe-4S dicluster domain-containing protein Thiotrichaceae bacterium Gammaproteobacteria

Fe-S cluster proteins glycolate oxidase iron-sulfur subunit Alphaproteobacteria bacterium MarineAlpha3 Bin3 Alphaproteobacteria

Transcriptional factors ferric iron uptake transcriptional regulator Endozoicomonas sp. OPT23 Gammaproteobacteria

Transcriptional factors ferric iron uptake transcriptional regulator Proteobacteria bacterium unclassified Proteobacteria

Transcriptional factors Rrf2 family transcriptional regulator, iron-sulfur cluster assembly transcription factor Rhodospirillales bacterium Alphaproteobacteria

Transcriptional factors Fe-S cluster assembly transcriptional regulator IscR Oceanospirillales bacterium Alphaproteobacteria

Heme metabolism protoheme IX farnesyltransferase Magnetovibrio sp. Alphaproteobacteria

Heme metabolism ferrochelatase Gammaproteobacteria bacterium Gammaproteobacteria

Heme metabolism ferrochelatase Legionellales bacterium Gammaproteobacteria

Heme ferrochelatase Varunaivibrio sulforoxidans Alphaproteobacteria

metabolism

Heme metabolism ferrochelatase Alphaproteobacteria bacterium Alphaproteobacteria

Heme metabolism heme lyase NrfEFG subunit NrfE Magnetovibrio sp. Alphaproteobacteria

Heme metabolism heme lyase NrfEFG subunit NrfE Rhodobacteraceae bacterium Alphaproteobacteria

Heme metabolism heme A synthase Oceanibaculum nanhaiense Alphaproteobacteria

Heme metabolism sulfoxide reductase heme-binding subunit YedZ Rhodospirillaceae bacterium Alphaproteobacteria

Heme metabolism heme biosynthesis protein HemY Rhodospirillaceae bacterium Alphaproteobacteria

Heme metabolism radical SAM family heme chaperone HemW Oceanospirillales bacterium Alphaproteobacteria

Fe2+/3+ transporters extracellular solute-binding protein Halovulum dunhuangense Alphaproteobacteria

Fe2+/3+ transporters polyamine ABC transporter permease Rhizobiaceae bacterium Alphaproteobacteria

Fe2+/3+ transporters sulfoxide reductase heme-binding subunit YedZ Rhodospirillaceae bacterium Alphaproteobacteria

Fe2+/3+ transporters sulfoxide reductase heme-binding subunit YedZ Xanthomonadales bacterium Gammaproteobacteria

Fe2+/3+ transporters iron ABC transporter substrate-binding protein Rhizobiales bacterium Alphaproteobacteria

Fe2+/3+ transporters iron ABC transporter permease Loktanella sp. Alg231-35 Alphaproteobacteria

Fe2+/3+ transporters heme ABC transporter permease Rhodospirillales bacterium Alphaproteobacteria

Fe2+/3+ transporters ABC transporter ATP-binding protein Albidovulum inexpectatum Alphaproteobacteria

Fe2+/3+ transporters ABC transporter permease subunit Ruegeria pomeroyi Alphaproteobacteria

Fe2+/3+ transporters ATP-binding cassette domain-containing protein [Alphaproteobacteria bacterium] Alphaproteobacteria

Fe2+/3+ transporters outer membrane efflux protein Rhodospirillales bacterium Alphaproteobacteria

Fe2+/3+ transporters ABC transporter substrate-binding protein Labrenzia sp. EL143 Alphaproteobacteria

Fe2+/3+ transporters hypothetical_protein TolC family outer membrane protein Rhodospirillales bacterium Alphaproteobacteria

Fe2+/3+ transporters TonB-dependent receptor, partial Endozoicomonas sp. OPT23 Gammaproteobacteria

Fe2+/3+ transporters TonB-dependent receptor [Gammaproteobacteria bacterium Gammaproteobacteria

Fe2+/3+ transporters energy transducer TonB Proteobacteria bacterium unclassified Proteobacteria

Fe2+/3+ transporters Biopolymer transport protein ExbD/protein TolR Rhodospirillaceae bacterium Alphaproteobacteria

ferritin superfamily DNA starvation/stationary phase protection protein Candidatus Methylopumilus universalis Betaproteobacteria

ferritin superfamily DNA starvation/stationary phase protection protein Rhodospirillaceae bacterium SYSU D60009 Alphaproteobacteria

ferritin superfamily DNA starvation/stationary phase protection protein Zhongshania aliphaticivorans Gammaproteobacteria

ferritin superfamily DNA starvation/stationary phase protection protein Hyella patelloides Cyanobacteria

ferritin superfamily rubrerythrin Gammaproteobacteria bacterium Gammaproteobacteria

ferritin superfamily DNA starvation/stationary phase protection protein Fulvivirga imtechensis Bacteroidetes

ferritin superfamily rubrerythrin Alphaproteobacteria bacterium Alphaproteobacteria

ferritin superfamily ferritin-like domain-containing protein Tepidicaulis sp. EA10 Alphaproteobacteria

ferritin superfamily bacterioferritin Uliginosibacterium gangwonense Betaproteobacteria

ferritin superfamily bacterioferritin Oceanospirillaceae bacterium Alphaproteobacteria

ferritin non-heme ferritin Candidatus Omnitrophica bacterium

superfamily

ferritin superfamily rubrerythrin Halothiobacillaceae bacterium Gammaproteobacteria

ferritin superfamily rubrerythrin Bryobacteraceae bacterium Acidobacteriia

ferritin superfamily bacterioferritin Methylophilaceae bacterium Betaproteobacteria

ferritin superfamily bacterioferritin Oceanospirillaceae bacterium Alphaproteobacteria

ferritin superfamily rubrerythrin Deltaproteobacteria bacterium RIFOXYA12 FULL 58 15 Deltaproteobacteria

ferritin superfamily non-heme ferritin Vibrio cyclitrophicus Gammaproteobacteria

other proteins cobalamin B12-binding domain-containing protein Nisaea denitrificans Alphaproteobacteria

other proteins catalase/peroxidase HPI Cytophagia bacterium Cytophagia

other proteins iron-containing alcohol dehydrogenase Ferrovibrio sp. Alphaproteobacteria

other proteins iron-containing alcohol dehydrogenase Notoacmeibacter marinus Alphaproteobacteria

Приложение 2. Выравнивание по TFR1 и его гомологам вместе со вторичной структурой человеческого TFR1 hd, H.dujardini; hp, H.panicea; aqu, A. queenslandica (идентификаторы NCBI: XP_019859732, XP_019850918); hsa, H. sapiens (идентификаторы UniProt: P02786, Q9UP52, Q04609, NP_710163, Q9Y3Q0, Q9UQQ1, NP_996898; идентификатор PDB: 1SUV).

hsa_TFRl

hsaTFRl hsa__TFR2

hsa_PSMAL

h s a_NAALAD1 hsa_NAALADL2 h s a_NAALAD 2 hs a_N AALADLl aqu_NAALAD2L aqu_NAALAD2 hp_NAALAD 2 hd NAALAD2

TT

■a oo

FVE RSE AVE

: ve j

| A V K j

she ;

IT ME ;

|gv

Iqee

vvv

VVI VI L VIL IIV VIL VLY VLL VLL

420 430 440

GlFGlAAKSR'/ r: rg

SAAKSAVGrp ggidpqsgaC GG IDPQSGAg NGQEWASSTg GAIDPTSGVg G A|V D P S S G T@ GAVDPNSGTC SGVDPNSATg GAVDPMSGrl CGADP^SGrr

¡¡¡ILL

£ VVH

11 T

VLQ rjJv I T, @ VI L LI L I1 I M T K L

KLAQ ELVR ETVR EIVR AFI R E I AR FII.SR EVAR EVAR •JMAR EVVR

MFSDMVLKD TFSSMV. S N S FGTLKKE. | g FGTLKKE ALMSKVKR. I SFGKLMSK. VLGTLLKKG VIDQLRST. VIDQLRST. S FS1LftQN . SLELLRET.

G W R GWR

4 5 0

S I IFlfl SLLFI TILFS TILFfi T IV F C TIIFS SIVFi T IV L C TIVLC TLVLC TMMFC

SLZSL SiQJiGJLSJlJULP. 4 6 0 4 7 0

:-df

EE7?

EEF» L]

i E FS EEF?

hsa_TFRl hsa_TFR2 hsa_PSMAL h s a_NAALAD1 hsa_NAALADL2 hs a_NAALAD 2 hsa_NAALADLl aqu_NAALAD2L aqu_NAALAD 2 hp_NAALAD 2 hd NAALAD2

¿UUJlSlJLSlSi.....

5 0 0 5 10

LS S HL K A FT INLD KA VL ' T S FK V SA s LL YT LI E . . . . K TMQ N V SH i VT . . NHS . ......G 0 LYQDS .....N WAS S V* LK j T L

LS V HL K A VV VST.D N A VL G DD F H A KT s LL T S LI E . , . . S V L K 0 DS . GQTT. VF 0 V V F T N P V T RP ",P A

SRL QERG V A INAD SS IE G X Y T LR V DC LM Y S LV L TK E KS DEGFEGKSLYE s TKK. . SPSPEFSGM P R 1 SK LG S

SRL QERG VA I NAD SS IE G NY r LR V r L y. YS LV H . . . . N LTK E L SS DEGFEGKSLYE s TKK . . SPSPEFSGM ? ^ I SK JG S

QKNV QERS QQ YC QC PS I Q LG

VKI IA IN £ D SS I E X Y J LR V DC r LL LV Y . . . . K LTK E I DDGFESKSLYE 3 •A LEK . . DPS PENKKL P R I N K s

FNK QE R T VA IN V D I S VF A XA T LR V QG r PV QS VV F . . . . s ATK E I RS GPG . . D L S I Y D y IRYFNRS S PVYGLV ? S 1 GS j G A

EKb' VANA V A LN VD EA VA G MD s L h V SS s LL Y D VL Y . . . . N A TK 0 V QC CDD . . Y STLYD K w KSQ Y . .....T S D E P R 1/ YN LG A

EKV GAR V VT LNVD S A V3 G MD F I A 3S 3 LL FD VI Y . . . . E A TK 9 V sc CND . . YPfTLYD •i A SSQT . .....TTDE ? R V GX j G 3

GWL GAM r VA LNVD VA VS G SE : E V S S A LL FV PL W . . . . R AAE M V sc DP G . . FD|TVYD 0 w LHYTPHTYKNGGSK ? L : tfN j G S

SK Q LLNA V A LNVD VA |v|G y I D H LR |v KA I P |a f| Y . , . - c ft TK E k TS |X D ? , .S LT V YE £ y Q L E T G .....A P G E J? D k GG LG S

hsa TFR1

hsa_TFRl hsa_TFR2 hsa_PSMAL hs a_NAALAD1 hsa_NAALADL2 h s a_NAALAD 2 hs a_NAALADL1 aqu_NAALAD 2 L aqu_NAALAD2 hp_NAALAD2 hd NAALAD2

DNA AFPF :■ AY s PAVSFC F Y T, GTT M DT Y KE IERI P S Ti N KVARA A A E AGO FVT K TH D V LLNL DYER

DS S A Y£ F T AF V PAVEFS F MED.... . DQAY P F L HTK E DT Y EN HKVL 3 G R L F AV A Q A V AO L AG Q LL I R L SH D R jLFL DFGR

GND F E VF F OR T T AS GRAR Y TKNWETN KFSGYP L Y [I S V Y 2T Y EL V 2KFY ? y F SYIILT V AO V 1GG -1VF L L AN s I VLPF 3CRD

GN D FEV1- F OR 1 ASGRAR Y TKNWETN KFSGY P L v HS V Y ETY EL V EKFY : ' M H SYHLT V AQ V RGG MVt U AN S I VL P F }CRD

QG D ADYF I SH L V PIVQFA Y EDIKTLE . . . . G P S F LS EAR F STR AT K IE EM ? s ? STLHET I TK L SGE VIL 0 : AN E ? VLPF XALD

GS D FEAY F OR T I ASGRAR Y TKMKKTD KYSSYP V HT T Y ETF EL V EKFY D P T F KKQLS V AO L RG A LV Y E VD 3 K I I P F NIQD

GS D YAPt V H Y 1 • SSMD1A Y TYDRSKT SARIY P T v HTA K D T F D Y V DKFL : r1 G J SSHQA V AR r AGS VIL 3 S D S T i'LPL K.VS D

GTD HAAF V OR A V 7 C 5 G K A Y .VGDYP V Y :i s v i JNY Y K y. T N FA p s Si KY S VA GE KTTO IAN A " AT T ? I I P Y STPVR

G 3 D FT Y F 01 1 V SSFS T S Y V v 43 v ")NF Y W ^ THFG N H I Y N A A I GE V WAQ VAN A i AT T I I P Y iPVR

GS D FTMF OG Y _ SCTS SG Y ..... . TTAYA V Y HS V H DHF Y W yi SNFG D p s F AH H VA V GL V WLK TAM L L V T N p LLP Y DPRL

GS D YTGF F yv T TSGDLS III TSTFNATDFFAGYP V 1 HS T H DT F QK T KTSL |E n f] F |ahhla t GK ; PaTLR TAL N |l] ST fcj p VLPF G WE

hsa_TFRl

hsa_TFRl hsa_TFR2 hsa_PSMAL hs a_NAALAD1 hsa_NAALADL2 h s a_NAALAD 2 hs a_NAALADL 1 aqu_NAALAD2L aqu_NAALAD2 hp_NAALAD 2 hd NAALAD2

JLCJLCJLa € 3 o

YNSQL.........

YGDVV.........

YAVVLR......KY

YAVVLR......KY

IALE VQ........

YAEALK......NY

YSETLR......SF

.........YYERL

YYXXXXPVRYYERL

YAE.........VV

YG.........EHL

SFVRD RHIGN DKI YN DKIY5 ... N N AS I YN QAAQ . EMYNQ ELYNQ NNFDD MLVQD

LNQ.Y RAD L N E , F S G D :SMKHPQE ISMKHPQE LKGDQPNT LSKKHDQQ .QDLGAL LESEHGSA LESEHGSA LSKLNSDL

IJN sthnqt

KEMG KARG KTYS KTYS

TDHG EQHS KQNN KQNN KEQD GREN

LSLQK 1 Y 3 ARGD F FRAT SRL T TD

L T L Q W V YS ARGD r 1 RAA EKLRQE

LSFDS :, FS AVKN r TEIA SKFSER

V S F D S i FS AVKN ? TEIA SKFSER