Молекулярный механизм функционирования малого белка теплового шока AlIbpA из Acholeplasma laidlawii тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Чернова Лилия Сергеевна

• Чернова Лилия Сергеевна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Чернова Лилия Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Научная новизна полученных результатов

Методология и методы исследования

Достоверность результатов

Теоретическая и практическая значимость работы

Основные положения, выносимые на защиту

Место выполнения работы и личный вклад автора

Связь работы с научными программами

Публикация результатов исследования

Объем и структура диссертации

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Механизмы термальной денатурации белков в живой клетке

1.2 Структура и функции основных шаперонов

1.2.1 Особенности малых белков теплового шока (БТШ20)

1.2.2 Шапероны семейства DnaK (БТШ70)

1.2.3 Шапероны семейства ClpB (БТШ100)

1.2.4 Молекулярный механизм функционирования мультишапероной системы IbpA - DnaK - ClpB на примере белков E. coli

1.2.5 Характеристика бактериального белка деления клеток FtsZ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Методы работы с бактериальными клетками

2.1.1 Штаммы

2

2.1.2 Питательные среды и условия культивирования бактерий

2.1.3 Трансформация клеток E. coli методом теплового шока

2.1.4 Трансформация клеток E. coli методом электропорации

2.1.5 Определение жизнеспособности клеток дифференциальным флюоресцентным окрашиванием

2.1.6 Подсчет КОЕ

2.2 Методы работы с рекомбинантной ДНК

2.2.1 Плазмидные векторы

2.2.2 Выделение геномной ДНК методом фенол-хлороформной экстракции

2.2.3 Выделение плазмидной ДНК с помощью GeneJET Plasmid Miniprep Kit

2.2.4 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2.2.5 Рестрикция ДНК

2.2.6 Дефосфорилирование ДНК

2.2.7 Метод энзиматической сборки фрагментов ДНК по Гибсону

2.2.8 Электрофорез ДНК

2.2.9 Очистка ДНК из агарозного геля

2.3 Схемы получения рекомбинантных конструкций

2.3.1 Клонирование генов ibpA A. laidlawii в экспрессионный вектор pET-15b

2.3.2 Клонирование генов dnaK и clpB в экспрессионный вектор pET-28a(+)

2.3.3 Получение штаммов E. coli с инактивированными генами белков теплового шока

2.4 Методы работы с белками

2.4.1 Скрининг рекомбинантных штаммов на сверхпродукцию белков

2.4.2 Сверхпродукция белков в клетках E. coli и получение клеточных экстрактов

2.4.3 Очистка белков на Ni-NTA сефарозе

2.4.4 Очистка белков на Strep-tactin сефарозе

2.4.5 Эксклюзионная хроматография (гель-фильтрация)

2.4.6 Диализ белков

2.4.7 Определение концентрации белка

2.4.8 Электрофорез белков в денатурирующих условиях

2.4.9 Окрашивание белковых гелей кумасси синим

2.4.10 Окрашивание белковых гелей нитратом серебра

2.4.11 Осаждение белков с помощью трихлоруксусной кислоты

2.4.12 Вестерн-блоттинг

2.4.13 Ковалентная поперечная сшивка глутаровым альдегидом очищенных белков

2.4.14 Оценка степени денатурации белков красителем SYPRO Orange

2.5 Методы анализа взаимодействия макромолекул

2.5.1 Анализ взаимодействия белков методом коэлюции

2.5.2 Анализ взаимодействия белков с помощью бактериальной двугибридной системы

2.5.3 Исследование взаимодействия белков методом плазмонного поверхностного резонанса (ППР)

2.5.4 Исследование взаимодействия белков методом биослойной интерферометрии (BLI)

2.6 Аналитические методы

2.6.1 Оценка жизнеспособности клеток с помощью МТТ-теста

2.6.2 Определение активности в-галактозидазы

2.7 Информационные и математические методы

2.7.1 Биоинформатика

2.7.2 Статистический анализ

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3. 1 Определение функциональной роли N- и С-концевых мотивов БТШ20 AlIbpA

3.1.1 Анализ аминокислотной последовательности белка AlIbpA

3.2 Оценка способности белка AlIbpA к олигомеризации

3.2.1 Оценка способности белка AlIbpA к олигомеризации in vivo

3.2.2 Роль N- и С-концевых мотивов AlIbpA в олигомеризации белка in vitro

3.2.3 Роль N- и C-концов в связывании субстратов и проявлении шапероноподобной активности AlIbpA

3.2.4 Влияние N- и С-концевых мотивов AlIbpA на структуру олигомеров белка

in vitro

3.2.5 Оценка влияния повышенной экспрессии AlIbpAHis6 на выживаемость рекомбинантных штаммов E. coli BL21(DE3) в условиях температурного стресса

3.3 Определение роли N-концевого мотива AlIbpA в функциях БТШ20, как молекулярного шаперона

3.3.1 Значение N-концевого мотива AlIbpAHis6 для перехода белка из глобулярной формы олигомеризации в фибриллярную

3.4 Идентификация субстратов БТШ20 AlIbpA в клетках микоплазмыA. laidlawii методом коэлюции с рекомбинантным белком AlIbpAHis6

3.5 Характеристика роли AlIbpA в регуляции деления клеток A. laidlawii

3.6 Исследование взаимодействия между белками AlIbpA - DnaK - ClpB мультишаперонной системы A. laidlawii

3.6.1 Анализ аминокислотных последовательностей AlDnaK и AlClpB

3.6.2 Клонирование и очистка AlDnaK и AlClpB

3.6.3 Оценка взаимодействия шаперонов AlIbpA с AlDnaK и AlClpB in vitro

3.6.4 Оценка эффективности комплекса шаперонов AlIbpA - DnaK - ClpB в модели предотвращении температурной денатурации инсулина in vitro

3.6.5 Оценка способности AlIbpA компенсировать отсутствие собственных БТШ

E. coli в условиях теплового шока

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение

1.2 Получение плазмид для сверхпродукции рекомбинантных белков AlDnaKsT и AlClpBsT

1.2.1 Оптимизация генетического кода dnaK и clpB Acholeplasma laidlawii

2.3 Получение штаммов E. coli с инактивированными генами белков теплового шока

3 Определение температуры денатурации различных белков

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДГ Алкоголь дегидрогеназа

АДФ Аденозиндифосфат

АМФ Аденозинмонофосфат

АТФ Аденозинтрифосфат

БСА Бычий сывороточный альбумин

БТШ Белок теплового шока

ВЭЖХ Высокоэффективная жидкостная хроматография

ГА Глутаровый альдегид

ГТФ Гуанозинтрифосфатаза

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

ДТТ Дитиотреитол

ИПТГ Изопропил-Р^-1-тиогалактопиранозид

Кд Константа диссоциации

кДа Килодальтон

КОЕ Колониеобразующая единица

мБТШ Малый белок теплового шока

МЕ Миллиопоглощающая единица

ОП Оптическая плотность

ОРЕ Относительные резонансные единицы

ПААГ Полиакриламидный гель

ППР Поверхностный плазмонный резонанс

ПСЭ Питательная среда Эдварда

ПЦР Полимеразная цепная реакция

ПЭГ Полиэтиленгликоль

РЕ Резонансные единицы

т. п. о. Тысячи пар оснований

Трис 2-амино-2-гидроксиметилпропан-1, 3 -диол

ТХУ Трихлоруксусная кислота

ЭДТА Этилендиаминтетрауксусная кислота

АА Акриламид

ВК-АА Бис-акриламид

СТАВ Бромид цетилтриметиламмония

dcw Кластер генов деления

DMSO Диметилсульфоксид

DTT Дитиотреитол

FtsZ Филаментный термочувствительный белок Z

His6 Гексагистидиновый пептид

LB Питательная среда Лурия-Бертани

NBD Нуклеотид-связывающий домен

ОТА Нитрилотриуксусная кислота

NTD N-концевой домен

ONPG Орто-нитрофенил-Р-галактозид

PBS Фосфатно-солевой буфер

PSА Персульфат аммония

PSS Краситель Понсо С

SB Буфер разделения нуклеиновых кислот

SDS Додецилсульфат натрия

ST Стрептавидиновый аффинный полипептид (StrepП-tag)

TEMED Тетраметилэтилендиамин

TGB Трис-глициновый буфер

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярный механизм функционирования малого белка теплового шока AlIbpA из Acholeplasma laidlawii»

Актуальность темы исследования

Нарушение структуры белков и их агрегация являются серьезной проблемой для живой клетки и приводят к ее гибели. Нативные белки структурно динамичны, и различные факторы могут вызвать частичное или полное нарушение их третичной и вторичной структур, что, в свою очередь, приводит к аберрантным взаимодействиям и образованию токсичных агрегатов. Например, прионные заболевания и миопатии с тельцами включения являются примерами патологических состояний, возникающих в результате накопления поврежденных и агрегированных белков в клетках [Bakthisaran et al., 2015; Vendredy et al., 2020]. Поэтому клеточный протеом находится под постоянным контролем и конформация частично денатурированных белков восстанавливается с участием белков-шаперонов, а белки с необратимыми повреждениями подвергаются расщеплению протеолитическими ферментами [Balchin et al., 2016; Gershenson et al., 2014].

Малые белки теплового шока (мБТШ, БТШ20) выполняют роль АТФ-независимых молекулярных шаперонов: они связывают белки с частично нарушенной конформацией и предотвращают их дальнейшую агрегацию [Haslbeck et al., 2015]. Молекулы БТШ20 большинства организмов состоят из трех структурных доменов: высоко консервативного центрального а-кристаллинового домена, фланкированного вариабельным N-концевым и коротким C-концевым доменами [Montfort et al., 2002; Delbecq and Klevit, 2013; Giese et al., 2005; Bakthisaran et al., 2015]. N-концевой домен обычно менее консервативен, не имеет выраженной третичной структуры и содержит один или два (W/F)(D/F)PF-подобных мотива, которые участвуют в олигомеризации БТШ20 и необходимы для их шапероноподобной активности [Basha et al., 2012]. С-концевой домен зачастую содержит консервативный мотив V/IXI/V, необходимый для сборки субъединиц путем взаимодействия с а-кристаллиновым доменом соседнего БТШ20 в процессе олигомеризации [Delbecq et al, 2013; Pasta et al., 2004].

Малые БТШ проявляют свою шапероноподобную активность в клетках в виде крупных олигомеров, состоящих в основном из 24 субъединиц [Lambert et al.,1999; Montfort et al., 2001; Poulain et al., 2010]. Олигомерные БТШ20, образуя комплексы с некорректно свёрнутыми белками, выступают в роли «молекулярной губки», поддерживая агрегирующие белки в фолдинг-компетентном состоянии до

последующей их дезагрегации АТФ-зависимыми шаперонами DnaK (БТШ70) и ClpB (БТШ100) [Haslbeck et al, 2019; Mogk et al, 2019; Obuchowski et al, 2019].

Наиболее изученной является мультишаперонная система Escherichia coli, состоящая из двух гомологичных БТШ20 IbpA и IbpB, и высокомолекулярных шаперонов DnaK и ClpB [Bepperling et al., 2012]. EclbpA и EclbpB физически взаимодействуют друг с другом в процессе связывания субстрата (денатурированных белков) и далее передают его для рефолдинга белкам EcDnaK и EcClpB. При этом EclbpA, находясь в фибриллярной форме, связывается с поврежденными белками, которые требуют рефолдинга, и предотвращает их дальнейшую агрегацию. EclbpB приводит к трансформации четвертичной структуры EcIbpA из фибриллярной в глобулярную, чем обеспечивает диссоциацию последнего от поврежденного субстрата и его передачу EcDnaK и EcClpB [Veinger et al., 1998; Mogk et al., 2003; Matuszewska et al., 2005; Obuchowski et al, 2019].

Бактерии из класса Mollicutes являются уникальными бактериями, характеризующиеся полным отсутствием клеточных стенок и значительно редуцированным геномом. Как правило, это внутриклеточные паразиты, поражающие животные и растительные клетки и способные существовать только в организме-хозяине [Benedetti et al., 2020; Oshima et al., 2013].

Mollicutes - класс микроорганизмов, которые располагают минимальным для клетки количеством генетической информации среди автономно живущих организмов. Размеры геномов молликут колеблются в пределах 564 — 2200 т.п.о. [Barré et al., 2004; Do Nascimento et al., 2013]. Самыми маленькими геномами обладают Mycoplasma genitalium (580 076 п. о.) [Fraser et al., 1995] и Mycoplasma parvum (564 395 п. о.) [Do Nascimento et al., 2013]. Геном Acholeplasma laidlawii длиной 1 496 992 пю. является самым длинным аннотированным геномом среди микоплазм [Lazarev et al., 2011], в то время как размер генома у других фирмикут, для которых растения также являются средой обитания, составляет 1721 - 3100 т.п.о. для Lactobacillus [Kant et al., 2011] и 4105 т.п.о. для Bacillus subtilis [Kamada et al., 2014]. У условно-патогенных фирмикут размеры генома составляют 2793 т.п.о. для Staphylococcus aureus [Wang et al., 2012] и 2145 т.п.о. для Streptococcus pneumoniae [Li et al., 2012].

A. laidlawii была идентифицирована как распространенный контаминант питательной среды для клеточных культур и является возбудителем микоплазменных

инфекций у растений и животных. A. laidlawii является первой микоплазмой, для которой было показано существование вне организма хозяина, и она обладает самой высокой адаптивной способностью к различным стрессовым условиям среды среди микоплазм [Борхсениус и др., 2016]. Одним из инструментов для выживания в экстремальных условиях является экспрессия БТШ20 A/IbpA, количество которого в условиях теплового шока в клетках этой бактерии возрастает до 7 % от общего количества клеточных белков [Вишняков и др., 2011]. На сегодняшний день описано более 600 заболеваний растений, вызываемых микоплазмами [Борхсениус и др., 2002]. Среди них, предположительно, только те виды, которые способны выживать в окружающей среде, содержат ген, кодирующий БТШ20-подобный белок с классическим а-кристаллиновым доменом [Vishnyakov et a/., 2012].

В геноме A. /aid/awii также присутствуют гены, кодирующие A/DnaK и A/ClpB, что позволяет предположить совместную работу этих трех белков в процессе рефолдинга частично денатурированных белков. Однако молекулярные механизмы функционирования белков теплового шока, вероятно, определяющего фактора высокой адаптивной возможности A. /aid/awii, на сегодняшний день остаются неизученными. Понимание роли и молекулярных механизмов функционирования и регуляции шаперонной активности БТШ20 A/IbpA, а также его взаимодействия с шаперонами A/DnaK и A/ClpB в процессе рефолдинга субстратных белков позволит охарактеризовать механизмы адаптации микоплазмы Acho/ep/asma /aid/awii к неблагоприятным условиям и могут стать фундаментальной основой разработки подходов для подавления ее роста.

Цели и задачи исследования

Цель работы - охарактеризовать роль и молекулярный механизм функционирования малого белка теплового шока A/IbpA в мультишаперонной системе белков A/IbpA-DnaK-ClpB Acho/ep/asma /aid/awii.

В работе решались следующие задачи:

1) Охарактеризовать роль N- и С-концевых доменов и функциональных мотивов в их составе в БТШ20 A/IbpA в процессе олигомеризации этого белка в

фибриллярную и глобулярную форму и проявлении субстрат-связывающей и шапероноподобной активности.

2) Оценить влияние гетерологичной сверхпродукции БТШ20 AlIbpA Acholeplasma laidlawii в Escherichia coli на термотолерантность клеток, в том числе в условиях инактивации собственных БТШ IbpA/IbpB-DnaK-ClpB кишечной палочки.

3) Идентифицировать белки-субстраты для взаимодействия с AlIbpA в клетке Acholeplasma laidlawii при различных температурах.

4) Исследовать in vitro взаимодействие белков AlIbpA-DnaK-ClpB из Acholeplasma laidlawii и определить роль этого взаимодействия в супрессии агрегации белков-субстратов.

Научная новизна полученных результатов

Впервые охарактеризована роль N- и С-концевых доменов и функциональных мотивов в их составе в БТШ20 AlIbpA из A. laidlawii. N-концевой домен AlIbpA необходим для выполнения функций отсутствующего у A. laidlawii белка IbpB, который в других бактериях необходим для диссоциации субстрата от IbpA и его передачи к белкам DnaK и ClpB. Так, N-концевой домен обеспечивает образование 24-мерных олигомеров AlIbpA в виде глобул (неактивная форма белка), а также ведет себя как аутоингибитор функционала C-концевого домена. C-концевой домен необходим для проявления шапероноподобной активности белка и его олигомеризации в форме фибрилл (активная форма белка). Основная роль в субстрат-связывающей функции принадлежит С-концевому LEL-мотиву. N-концевой двойной (W/F)(D/F)PF-мотив не участвует в связывании субстрата и играет основную роль в процессе трансформации четвертичной структуры в фибриллярную или глобулярную формы.

Впервые показано, что сверхэкспрессия AlIbpA способна как повышать устойчивость клеток E. coli к высоким температурам, так и компенсировать отсутствие собственного EcIbpA микроорганизма. При этом больший эффект наблюдается при сверхэкспрессии AlIbpA с нарушением N-концевого (W/F)(D/F)PF-мотива, благодаря чему белок находится преимущественно в фибриллярной форме.

Впервые показано in vivo и количественно охарактеризовано in vitro взаимодействие AlIbpA с белком клеточного деления AlFtsZ и белками теплового шока AlDnaK и AlClpB из A. laidlawii. AlIbpA стабилизирует структуру филаментов AlFtsZ

при неблагоприятных температурах и таким образом участвует в регуляции клеточного деления клеток A. laidlawii в условиях стресса. Присутствие A/IbpA повышает шапероноподобную активность A/DnaK, но ингибирует активность комплекса A/DnaK-ClpB. A/IbpA в фибриллярной форме ингибирует связывание A/DnaK с субстратом, однако не влияет на рефолдинг белков шапероном A/ClpB.

Методология и методы исследования

Экспериментальное решение задач исследования осуществлено с применением молекулярно-генетических, биохимических, физико-химических и

микробиологических методов, включая методы биоинформатики и средства обработки данных. Для экспрессии исследуемых белков в клетках кишечной палочки использовали современные приемы создания генетических конструкций, включая мутагенез, оптимизацию генетической последовательности и получению рекомбинантных штаммов бактерий. Для получения исследуемых белков в электрофоретически гомогенном состоянии использовали метод аффинной хроматографии. Для исследования белок-белковых взаимодействий использовали методы поверхностного плазмонного резонанса, интерферометрии, бактериальной двугибридной системы и эксклюзионной хроматографии.

Достоверность результатов

Описанные в диссертационной работе результаты являются воспроизводимыми, получены с использованием современных и общепризнанных молекулярно-генетических, биохимических, физико-химических и микробиологических методов и поэтому являются воспроизводимыми. Представленные в работе результаты экспериментов являются достоверными, что подтверждается соответствующим статистическим анализом и совпадением результатов при повторении экспериментов. Большая часть полученных результатов диссертации опубликована в журналах, индексируемых Web of Science, Scopus и РИНЦ, и доложена на всероссийских и международных научных конференциях.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные результаты демонстрируют роль малого белка беплового шока в

процессе функционирования системы шаперонов A/IbpA-DnaK-ClpB в микоплазме

13

Acholeplasma laidlawii, которая, в отличие от хорошо изученной мультишаперонной системы IbpA/IbpB-DnaK-ClpB E. coli, содержит лишь один БТШ20, что вносит вклад в блок фундаментальных знаний о механизмах адаптации микоплазм к неблагоприятным условиям среды. Полученные результаты описывают новое и критически важное участие БТШ20 в работе мультишаперонной системы микоплазменной бактерии, и могут быть экстраполированы на остальных

и /-Ч и _

представителей микоплазм. С практической точки зрения, полученные данные по функционированию системы адаптации A. laidlawii к стрессовым условиям могут стать фундаментальной основой разработки подходов для подавления ее роста.

Основные положения, выносимые на защиту

1) N-концевой домен AlIbpA обеспечивает образование 24-мерных глобул белка AlIbpA и необходим для выполнения функций отсутствующего у A. laidlawii белка IbpB, а именно передачи субстрата от AlIbpA (БТШ20) к AlDnaK (БТШ70). Механизм заключается в поведении N-концевого домена как аутоингибитора C-концевого домена, который, в свою очередь, необходим для шапероноподобной активности и олигомеризации белка в форме фибрилл - активной форме белка.

2) Сверхпродукция AlIbpA A. laidlawii в клетках E. coli повышает устойчивость последних к высоким температурам, а также компенсирует недостаточную активность собственных EcIbpA и EcIbpB кишечной палочки.

3) БТШ20 AlIbpA взаимодействует с ключевым белком деления AlFtsZ in vivo и in vitro независимо от температуры, при этом AlIbpA способствует формированию филаментов AlFtsZ в неблагоприятных условиях.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертационной работы представлены на 13 международных и российских конференциях, таких как Всероссийская с международным участием школа-конференция молодых ученых «Биосистемы: организация, поведение, управление» (Нижний Новгород, 2018; 2020), III международная школа-конференция студентов и аспирантов «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2018), Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2019» (Москва, 2019), 57-я международная научная студенческая

конференция (Новосибирск, 2019), Международная конференция The FEBS Congress: From molecules to living systems (Краков, 2019; Любляна, 2021), 2й Всероссийский микробиологический конгресс (Саранск, 2019), The Annual Meeting of the European Society of Gene & Cell Therapy ESGCT (Барселона, 2019; Брюссель, 2021), 7th International School and Conference «Saint Petersburg OPEN 2020» (Санкт-Петербург, 2020), 3-й Российский микробиологический конгресс (Псков, 2021), The 56th Annual Scientific Meeting ESCI (Бари, 2022).

Место выполнения работы и личный вклад автора

Работа выполнена на кафедре генетики и в научно-исследовательской лаборатории "Молекулярная генетика микроорганизмов" Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВО Казанский (Приволжский) федеральный университет. Автором диссертации совместно с научным руководителем разработаны главные направления научного исследования, сформулирована цель, поставлены задачи исследовательской работы. Диссертантом лично выполнены экспериментальные исследования, проведен анализ и статистическая обработка полученных данных, сформулированы выводы. Обсуждение и подготовка статей к публикации (написание и редактирование) проводились совместно с научным руководителем и соавторами.

Анализ белковых образцов с помощью трансмиссионной электронной микроскопии был проведен к.б.н., с.н.с. Института Цитологии РАН И. Е. Вишняковым.

Плазмиды для исследования взаимодействия белков в бактериальной двугибридной системе были получены к.б.н., с.н.с. Института Цитологии РАН А. Д. Ведяйкиным.

Эксперименты по исследованию взаимодействия A/IbpA-DnaK-ClpB методами интерферометрии слоя биомолекул Blitz и получению нокаут-мутаций генов БТШ в клетках кишечной палочки проводились совместно с профессором К. Торманном в Университете Гиссена, Германия.

Связь работы с научными программами

Работа выполнена в рамках Программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета и Программы стратегического академического лидерства «Приоритет 2030» Министерства науки и высшего

образования Российской Федерации. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РНФ 17-74-20065 (2017-2020) «Стрессовые белки и белки бактериального цитоскелета микоплазм - возбудителей заболеваний сельскохозяйственных растений и животных как факторы вирулентности и персистенции бактерий и потенциальные мишени для контроля микоплазменных инфекций» (исполнитель), РФФИ 20-34-90066 (2020-2022) «Адаптация микоплазмы Acholeplasma laidlawii к тепловому стрессу: молекулярные механизмы функционирования систем белков теплового шока БТШ20-БТШ70-БТШ100» (исполнитель), стипендии Президента Российской Федерации молодым ученым и аспирантам, осуществляющих перспективные научные исследования и разработки по приоритетным направлениям модернизации российской экономики № СП-4650.2021.4 (2021-2023) «Стрессовые белки возбудителей заболеваний сельскохозяйственных растений и животных как факторы вирулентности и персистенции бактерий и потенциальные мишени для контроля микоплазменных инфекций», РНФ № 22-24-01150 (2022-2023) «Стресс-защита фитопатогенных молликут».

Публикация результатов исследования

По материалам работы опубликовано 19 работ, в том числе 4 научные статьи в международных журналах, индексируемых в базах данных Web of Science, Scopus и РИНЦ. Опубликовано 6 тезисов в приложениях к журналам, индексируемым в Web of Science.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, обсуждения результатов, выводов, приложений и списка цитируемой литературы. Текст изложен на 143 страницах, проиллюстрирован 48 рисунками, включает 5 таблиц, список литературы содержит 189 библиографических источника.

Приложение 1 включает данные о получении генетических конструкций и очистке рекомбинантных белков.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. 1 Механизмы термальной денатурации белков в живой клетке

Нативные белки структурно динамичны, и различные внешние и эндогенные стрессы могут вызвать частичное или полное разворачивание белков, что может привести к аберрантным взаимодействиям и образованию потенциально токсичных агрегатов. Поэтому клеточный протеом требует постоянного контроля и восстановления конформации частично денатурированных белков с помощью интегрированной сети шаперонов и протеолиза белков с необратимыми повреждениями [Ва1Л & а1., 2008; Ва1сЫп & а1., 2016; Gershenson & а1., 2014].

Молекулярные шапероны - это белки, которые связывают и стабилизируют нестабильный конформер другого клеточного белка и, контролируя связывание и высвобождение белка-субстрата, определяют его состояние т у\уо: обеспечивают корректный фолдинг полипептида и сборку олигомеров, перенос в отдельный субклеточный компартмент или контролируемое переключение между активной и неактивной конформациями [Масо§ек в1 а1., 2021; Saibil а а1., 2013; Shan & а1., 2020; SuCec а1., 2021]. Молекулярные шапероны составляют до 10% протеома клетки и играют важную роль в протеостазе в нормальных условиях, а также во время стрессовых воздействий на клетку [Kastle а1., 2012]. Большинство молекулярных шаперонов называются белками теплового шока (БТШ), поскольку они индуцируются различными стрессами, такими как тепловой шок, окислительный стресс, токсичные химические вещества и воспаления [Garrido а а1., 2001; Lubkowska а а1., 2021]. Все известные на сегодняшний день молекулярные шапероны представляют собой белковые молекулы, трехмерная структура которых, как полагают, играет ключевую роль в механизме распознавания субстрата и его последующего рефолдинга [ВегеАа а а1., 2022; Bhattacharyya а а1., 1999]. В зависимости от размеров и механизмов функционирования БТШ делят на несколько классов: БТШ70, БТШ90, БТШ60, БТШ40 (DnaJ) и малые БТШ (БТШ20). Хотя большинство молекулярных шаперонов имеет схожий механизм распознавания субстратов и связывания с ними, они различаются по субстратной специфичности, локализации и механизму рефолдинга [Bakthisaran а1., 2015; Ciechanover а а1, 2017; De Maio а а1., 2021; Moutaoufik et а1., 2021].

Белки теплового шока с молекулярной массой 100, 90, 70 и 60 кДа обладают АТФ-связывающими доменами, и энергия гидролиза АТФ необходима для рефолдинга их белков-субстратов. БТШ100 могут действовать как «дезагрегаторы», поскольку они используют энергию гидролиза АТФ для принудительного разворачивания и солюбилизации предварительно сформированных агрегатов в исходно рефолдированные белки [Arimon et al., 2008; Bianco et al., 2008; DeSantis et al., 2012]. Белки с молекулярной массой 90 кДа обладают низкой АТФазной активностью, и предполагается, что связывание АТФ важно для регуляции взаимодействия БТШ90 с акцессорными белками. БТШ70 и БТШ60 могут использовать АТФ для разворачивания стабильных неправильно свернутых белков и превращения их в исходно рефолдируемые виды [Bracher et al., 2015; Itoh et al., 2002; Ranford et al., 2000; Tutar et al., 2010]. Белки теплового шока с молекулярной массой 40 кДа и малые белки теплового шока не имеют АТФ-связывающего сайта, однако данные свидетельствуют о том, что АТФ каким-то образом влияет на структуру БТШ20 и их взаимодействие с белковым субстратом [Sung et al., 2011; Wang et al., 2001]. Важнейшей функцией взаимодействия БТШ20 с субстратом является поддержание агрегирующих белков в рефолдинг-компетентном состоянии (холдазная активность), что предотвращает необратимую денатурацию до стадии последующей дезагрегации шаперонами БТШ70 (DnaK) и БТШ100 (ClpB) [Haslbeck et al, 2015; Haslbeck et al, 2019; Mogk et al, 2019; Obuchowski et al., 2019 ; Wang et al., 2001]. Таким образом, БТШ20-субстратные комплексы выступают как хранилище денатурированных белков до тех пор, пока клеточные условия не станут благоприятными [Mogk et al., 2017; Reinle et al., 2022].

1.2 Структура и функции основных шаперонов

1.2.1 Особенности малых белков теплового шока (БТШ20)

Группа малых белков теплового шока (мБТШ, БТШ20) объединяет белки с молекулярной массой в диапазоне от 12 до 43 кДа, которые идентифицируются в клетках архей, бактерий, растений и животных [Wang et al., 2001]. БТШ20 предотвращают агрегацию целевых белков, сохраняя их правильно-сложенное состояние, перестраивая их самостоятельно или совместно с другими АТФ-зависимыми шаперонами [Bakthisaran et al., 2015; Yu et al., 2021]. БТШ20 могут функционировать как молекулярные шапероны типа холдазы для защиты клеточных

белков в условиях стресса, а также для защиты клеточной мембраны, когда бактерии находятся в состояние покоя (Рисунок 1) [Chang, 2015; Ramakrishna et al., 2022].

Рисунок 1 - Две основные физиологические роли БТШ20 в бактериальных клетках: холдазы для защиты клеточных белков в условиях стресса и защиты клеточной мембраны в состоянии покоя [Chang, 2015]

Малые БТШ проявляют свою шапероноподобную активность в клетках в виде крупных олигомеров, состоящих в основном из 24 субъединиц (Рисунок 2) [Lambert et al., 1999; Montfort et al., 2001; Poulain et al., 2010]. Олигомеризация БТШ20 чувствительна к различным клеточным условиям, вследствие чего их четвертичные структуры обладают высокой степенью пластичности: крупные олигомеры диссоциируют при высоких температурах на более мелкие, тем самым увеличивая себе доступ для взаимодействия с субстратными белками, при этом скорость сборки коррелирует с шапероноподобной активностью БТШ20. После связывания с субстратами, БТШ20 снова собираются в крупные олигомеры шаровидной формы, образуя стабильный комплекс БТШ20-субстрат [Lambert et al., 1999; Pasta et al., 2003].

Субстрат, находясь в данном комплексе с БТШ20, перестаёт необратимо агрегировать, что увеличивает скорость и эффективность дальнейшей дезагрегации и реактивации опосредованной системой DnaK - С1рВ, благодаря которой снижается потребность ресинтеза важных белков, необходимых для восстановления клетки после стресса [Matuszewska а1, 2005; Mogk а1, 2003; Tyedmers а/., 2010; Vemger а/, 1998].

Дезагрегация

Рисунок 2 - Роль малых белков теплового шока в агрегации белков.

[Tyedmers а/., 2010]

Способность образовывать крупные олигомерные структуры является одной из наиболее ярких особенностей БТШ20, которая зависит от различных факторов, таких как концентрация самого белка, температура, наличие окислителя и ионной силы [Kitagawa а/., 2002; Lentze а/., 2004; Matuszewska а/., 2005]. Кроме того, известно, что даже умеренные изменения температуры в диапазоне от 25 до 35 °С приводят к значительному уменьшению размера олигомеров [Matuszewska а/., 2005].

Все мономеры малых БТШ состоят из консервативного а-кристаллинового домена, содержащего приблизительно 90 аминокислотных остатков, фланкированного

вариабельными К- и С-концевыми участками, мотивы которых выполняют важные роли в активности БТШ20 (Рисунок 3А).

А

Рисунок 3 - (A) доменная организация БТШ20. N-концевая последовательность (NTR) показана коричневым цветом, а-кристаллиновый домен (ACD) серым и С-концевая последовательность (CTR) с консервативным мотивом IX(I/V) зеленым; (Б) «сендвич» иммуноглобулиноподобная структура а-кристаллинового домена за счет укладки ß-тяжей в два ß-листа [Haslbeck et al., 2019]

В целом, N-конец БТШ20 низко консервативен, однако содержит относительно консервативную аминокислотную последовательность, или так называемый WDPF мотив (имеет вид (W/F)(D/F)PF), с помощью которого, как ранее показано, модулируется олигомеризация БТШ20 и его связывание с субстратом. В структуре некоторых БТШ20 присутствуют два WDPF мотива, зачастую разделенных вставкой из 4-8 аминокислотных остатков [Lambert et al., 1999; Sugiyama et al., 2005]. N-конец восприимчив к фосфорилированию и имеет свободную открытую структуру-вторичная структура N-концевой области БТШ20 представлена тремя короткими а-спиралями и значительным количеством неупорядоченных структур [Sun et al., 2005].

С-конец БТШ20 отличается гидрофобностью, вариабельностью и гибкостью, а также содержит функциональный V/IXI/V мотив, который играет важную роль в олигомеризации, участвуя в межсубъединичных связях, и шапероноподобной функции БТШ20 [Панасенко и др., 2003; Strozecka et al., 2012]. Интересно, что мотив IXI/V также обнаружен в N-концевой области некоторых малых БТШ, например, в ленточном черве Tsp36 [Stamler et al., 2005] и человеческом БТШВ6 [Sluchanko et al., 2017].

В центральной части БТШ20 располагается а-кристаллиновый домен. В отличие от N-концевого домена, последовательность а-кристаллинового домена высоко консервативна - например, БТШ27 человека на 78% гомологичен а-кристаллину мыши и на 86% гомологичен aß-кристаллину быка. В состав а-кристаллинового домена входит девять ß-тяжей, собранных в два ß-листа и короткую а-спираль, расположенную между седьмым и восьмым ß-тяжами (Рисунок 3Б). Области содержащие ß-тяжи ответственны за образование димеров- основного строительного блока большинства БТШ20 [Bakthisaran et al., 2015].

Эффективным методом для исследования функциональных мотивов БТШ20 является удаление пептидов определенной длины с его N- и С- концов. Такой метод позволяет сравнивать укороченные и полноразмерные белки, анализируя неспецифические изменения его структуры и функций. Например, при удалении N-конца а-БТШ20 крысы, белок образует димеры и тетрамеры, неспособные защищать субстратные белки от тепловой денатурации. Когда удаление 19 аминокислотных остатков с N-конца не повлияло на структуру и динамичность олигомерных БТШ20, удаление 56 или более уменьшило размер олигомеров до три- и тетрамеров и исключило обменные реакции между их субъединицами, что указывает на важность данного участка N-конца для активности белка. Удаление 42 аминокислот у БТШ16.9 Oryza sativa, привело к образованию более крупных олигомеров, когда делеция N-конца БТШ26 дрожжей снижала олигомерный комплекс до димеров, одновременно нарушая шапероноподобную активность белка. Удаление 11 аминокислотных остатков С-конца БТШ20 IbpB Escherichia coli также привело к уменьшению белкового комплекса до димера и потере шапероноподобной активности. Для сравнения, при удалении С-конца БТШ16.3 M. Tuberculosis олигомер диссоциирует на тримеры [Feil et al., 2001; Kitagawa et al., 2002; Young et al.,1999]. После удаления 11 или более аминокислотных остатков с С-конца БТШ20 крысы и человека молекулярная масса олигомеров уменьшается примерно с 550 до 150 кДа [Klundert et al., 1998]. Удаление 5 или 15 аминокислотных остатков с С-конца БТШ20 B. Japonicum оставляет неизменным V/IXI/V мотив и не влияет на шапероноподобную активность in vitro, хотя при этом укороченные варианты менее растворимы, чем исходный белок. В то же время, когда делеция 5 аминокислотных остатков не повлияла на размер олигомеров, удаление 15 аминокислотных остатков БТШ20 привело к образованию более крупных

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Чернова Лилия Сергеевна, 2022 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1) Борхсениус, С. Н. Механизмы деления бактериальной клетки [Текст] / С. Н. Борхсениус, И. Е. Вишняков // Микробиология. - 2019. - Т. 88. - №. 3. - С. 253271.

2) Борхсениус, С. Н. Микоплазмы в биологии и медицине начала XXI века [Текст] / C. Н. Борхсениус, О. А. Чернова, В. М. Чернов, В. М., И. Е. Вишняков. - СПб.: Наука, 2016. - 333с. - ISBN: 978-5-02-039584-8

3) Борхсениус, С. Н. Микоплазмы [Текст] / С. Н. Борхсениус, О. А. Чернова, В. М.Чернов, М. С. Вонский. - СПб: Наука, 2002. - 320с. - ISBN: 5-02-026177-7

4) Ведяйкин, А. Д. Сравнительная характеристика белков FtsZ Escherichia coli и микоплазм [Текст]: дис. ... канд. биол. наук 03.01.03. Защищена 18.10.2019 / А. Д. Ведяйкин; ФГБУН ин-т цитологии РАН. - Санкт Петербург, 2019. -119 с.

5) Вишняков, И. Е. Олигомерные формы, функции и локализация в клетке белка a-кристаллинового типа из микоплазмы [Текст] / И. Е. Вишняков, С. А. Левицкий, В. Н. Лазарев, Х. А. Айала, В. А. Иванов, Е. С. Снигиревская, С. Н. Борхсениус // Цитология. - 2010. - Т. 52. - №. 11. - С. 938-945.

6) Вишняков, И. Е. Идентификация и характеристика IbpA, малого белка теплового шока микоплазмы (Acholeplasma laidlawii) [Текст]: автореф. дис. ... канд. биол. наук / И. Е. Вишняков; ФГБУН ин-т цитологии РАН. - Санкт Петербург, 2011. -107 с.

7) Маргулис, Б. А. Белки стресса в эукариотической клетке [Текст] / Б. А. Маргулис, И. В. Гужова // Цитология. - 2000. - Т. 42. - №. 4. - С. 323-341.

8) Нагорнев, В. А. Шапероны и их роль в атерогенезе [Текст] / В. А. Нагорнев, П. В. Пигаревский, С. В. Мальцева // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2008. - №. 1. - С. 41-45.

9) Панасенко, О. Структура и свойства малых белков теплового шока [Текст] / О. О. Панасенко, М. В. Ким, Н. Б. Гусев // Успехи биологической химии. - 2003. - Т. 43. - №. 1. - С. 59-98.

10) Adams, D. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring [Text] / D. W. Adams, J. Errington // Nature Reviews Microbiology. - 2009. - V. 7. -№. 9. - P. 642-653.

11) Alarcón, F. Genes involved in cell division in mycoplasmas [Text] / F. Alarcón, A. T. R. D. Vasconcelos, L. Yim, A. Zaha // Genetics and Molecular Biology. - 2007. - V. 30. - №. 1. - P. 174-181.

12) Arimon, M. Hsp104 targets multiple intermediates on the amyloid pathway and suppresses the seeding capacity of Aß fibrils and protofibrils [Text] / M. Arimon, V. Grimminger, F. Sanz, H. A. Lashuel // Journal of molecular biology. - 2008. - V. 384.

- №. 5. - P. 1157-1173.

13) Avellaneda, M. Processive extrusion of polypeptide loops by a Hsp100 disaggregase [Text] / M. J. Avellaneda, K. B. Franke, V. Sunderlikova, B. Bukau, A. Mogk, S. J. Tans //Nature. - 2020. - V. 578. - №. 7794. - P. 317-320.

14) Bakthisaran, R., Tangirala R., Rao C. M. Small heat shock proteins: role in cellular functions and pathology [Text] / R. Bakthisaran, R. Tangirala, C. M. Rao // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. - 2015. - V. 1854. - №. 4. - P. 291-319.

15) Balch, W. E. Adapting proteostasis for disease intervention [Text] / W. E. Balch, R. I. Morimoto, A. Dillin, J. W. Kelly // Science. - 2008. - V. 319. - №. 5865. - P. 916-919.

16) Balchin, D. In vivo aspects of protein folding and quality control [Text] / D. Balchin, M. Hayer-Hartl, F. U. Hartl // Science. - 2016. - V. 353. - №. 6294. - P. aac4354.

17) Ban, H. S. Epigenetic alterations of heat shock proteins (HSPs) in cancer [Text] / H. S. Ban, T. S. Han, K. Hur, H. S. Cho //International Journal of Molecular Sciences. - 2019.

- V. 20. - №. 19. - P. 4758.

18) Barnett, M. E. Structure and activity of ClpB from Escherichia coli: role of the amino-and carboxyl-terminal domains [Text] / M. E. Barnett, A. Zolkiewska, M. Zolkiewski // Journal of Biological Chemistry. - 2000. - V. 275. - №. 48. - P. 37565-37571.

19) Barré, A. MolliGen, a database dedicated to the comparative genomics of Mollicutes [Text] / A. Barré, A. de Daruvar, A. Blanchard // Nucleic acids research. - 2004. - V. 32. - №. suppl_1. - P. D307-D310.

20) Basha, E. Small heat shock proteins and a-crystallins: dynamic proteins with flexible functions [Text] / E. Basha, H. O'Neill, E. Vierling // Trends in biochemical sciences.

- 2012. - V. 37. - №. 3. - P. 106-117.

21) Battesti, A. The bacterial two-hybrid system based on adenylate cyclase reconstitution in Escherichia coli [Text] /A. Battesti, E. Bouveret // Methods. - 2012. - V. 58. - №. 4. - P. 325-334.

22) Begg, K. J. A new Escherichia coli cell division gene, ftsK [Text] / K. J. Begg, S. J. Dewar, W. D. Donachie // Journal of bacteriology. - 1995. - V. 177. - №. 21. - P. 6211-6222.

23) Belete, T. M. Novel targets to develop new antibacterial agents and novel alternatives to antibacterial agents [Text] / T. M. Belete // Human Microbiome Journal. - 2019. - V. 11. - P. 100052.

24) Benedetti, F. Mycoplasmas-host interaction: mechanisms of inflammation and association with cellular transformation [Text] / F. Benedetti, S. Curreli, D. Zella // Microorganisms. - 2020. - V. 8. - №. 9. - P. 1351.

25) Bepperling, A. Alternative bacterial two-component small heat shock protein systems [Text] / A. Bepperling, F. Alte, T. Kriehuber, N. Braun, S. Weinkauf, M. Groll, M. Haslbeck, J. Buchner // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2012. - V. 109. - №. 50. - P. 20407-20412.

26) Beretta, G. Impact of Heat Shock Proteins in Neurodegeneration: Possible Therapeutical Targets [Text] / G. Beretta, A. L. Shala // Annals of Neurosciences. -2022. - P. 09727531211070528.

27) Bhandari, V. Substrate interaction networks of the Escherichia coli chaperones: trigger factor, DnaK and GroEL [Text] / V. Bhandari, W. A. Houry // Prokaryotic Systems Biology. - 2015. - P. 271-294.

28) Bi, E. FtsZ regulates frequency of cell division in Escherichia coli [Text] / E. Bi, J. Lutkenhaus // Journal of bacteriology. - 1990. - V. 172. - №. 5. - P. 2765-2768

29) Bianco, C. L. Hsp104 antagonizes a-synuclein aggregation and reduces dopaminergic degeneration in a rat model of Parkinson disease [Text] / C. L. Bianco, J. Shorter, E. Régulier, H. Lashuel, T. Iwatsubo, S. Lindquist, P. Aebischer // The Journal of clinical investigation. - 2008. - V. 118. - №. 9. - P. 3087-3097.

30) Bisson-Filho, A. W. Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division [Text] / A. W. Bisson-Filho, Y.-P. Hsu, G. R. Squyres, E. Kuru, F. Wu, C. Jukes, Y. Sun, C. Dekker, S. Holden, M. S. VanNieuwenhze, Y. V. Brun, E. C. Garner // Science. - 2017. - V. 355. - №. 6326. - P. 739-743.

31) Bissonnette, S. A. The IbpA and IbpB small heat-shock proteins are substrates of the AAA+ Lon protease [Text] / S. A. Bissonnette, I. Rivera-Rivera, R. T. Sauer, T. A. Baker // Molecular microbiology. - 2010. - V. 75. - №. 6. - P. 1539-1549.

32) Blum, P. Physiological consequences of DnaK and DnaJ overproduction in Escherichia coli [Text] / P. Blum, J. Ory, J. Bauernfeind, J. Krska // Journal of bacteriology. - 1992.

- V. 174. - №. 22. - P. 7436-7444.

33) Bodzek, P. Heat shock protein 27 (hsp27) in patients with ovarian cancer [Text] / P. Bodzek, A. Damasiewicz-Bodzek, I. Janosz, L. Witek, A. Olejek // Ginekologia Polska.

- 2021. - V. 92. - №. 12. - P. 837-843.

34) Bogachev, M. I. Fast and simple tool for the quantification of biofilm-embedded cells sub-populations from fluorescent microscopic images [Text] / M. I. Bogachev, V.Y. Volkov, O.A. Markelov, E. Y. Trizna, D. R. Baydamshina, V. Melnikov, R. R. Murtazina, P. V. Zelenikhin, I. S. Sharafutdinov, A.R. Kayumov // PLoS One. - 2018.

- V. 13. - №. 5. - P. e0193267.

35) Bracher, A. The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones [Text] / A. Bracher, J. Verghese // Frontiers in molecular biosciences. - 2015. - V. 2. - P. 10.

36) Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [Text] / M. Bradford // Analytical Biochemistry. - 1976. - V. 7 (72). - P. 248-254.

37) Brownell, S. E. The protective and therapeutic function of small heat shock proteins in neurological diseases [Text] / S. E. Brownell, R. Becker, L. Steinman // Frontiers in immunology. - 2012. - V. 3. - P. 74.

38) Bukau, B. Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism [Text] / B. Bukau, G. C. Walker // Journal of bacteriology. - 1989. - V. 171. - №. 5. - P. 2337-2346.

39) Bukau, B. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines [Text] / B. Bukau, A. L. Horwich // Cell. - 1998. - V. 92. - №. 3. - P. 351-366.

40) Carroni, M. Head-to-tail interactions of the coiled-coil domains regulate ClpB activity and cooperation with Hsp70 in protein disaggregation [Text] / M. Carroni, E. Kummer, Y. Oguchi, P. Wendler, D. K. Clare, I. Sinning, J. Kopp, A. Mogk, B. Bukau, H. R. Saibil // Elife. - 2014. - V. 3. - P. e02481.

41) Chang, Z. Understanding what small heat shock proteins do for bacterial cells [Text] / Z. Chang // The Big Book on Small Heat Shock Proteins. - Springer, Cham, 2015. - P. 511-525.

42) Chernova, O. A. Mycoplasmas and their antibiotic resistance: The problems and prospects in controlling infections [Text] / O. A. Chernova, E. S. Medvedeva, A. A. Mouzykantov, N. B. Baranova, V. M. Chernov // Acta Naturae. - 2016. - V. 8. - №. 2 (29). - P. 24-34.

43) Ciechanover, A. Protein quality control by molecular chaperones in neurodegeneration [Text] / A. Ciechanover, Y. T. Kwon // Frontiers in neuroscience. - 2017. - V. 11. - P. 185.

44) Clerico, E. M. How hsp70 molecular machines interact with their substrates to mediate diverse physiological functions [Text] / E. M. Clerico, J. M. Tilitsky, W. Meng, L. M. Gierasch // Journal of molecular biology. - 2015. - V. 427. - №. 7. - P. 1575-1588.

45) Cloward, J. M. Mycoplasma pneumoniae J-domain protein required for terminal organelle function [Text] / J. M. Cloward, D. C. Krause // Molecular microbiology. -2009. - V. 71. - №. 5. - P. 1296-1307.

46) Corbin, B. D. Interaction between cell division proteins FtsE and FtsZ [Text] / B. D. Corbin, Y. Wang, T. K. Beuria, W. Margolin // Journal of bacteriology. - 2007. - V. 189. - №. 8. - P. 3026-3035.

47) Daryaei, H. Heat inactivation of Shiga toxin-producing Escherichia coli in a selection of low moisture foods [Text] / H. Daryaei, W. Penaloza, I. Hildebrandt, K. Krishnamurthy, P. Thiruvengadam, J. Wan // Food Control. - 2018. - V. 85. - P. 48-56.

48) De Maio, A. The interaction of heat shock proteins with cellular membranes: A historical perspective [Text] / A. De Maio, L. Hightower // Cell Stress and Chaperones. - 2021. - V. 26. - №. 5. - P. 769-783.

49) De Maio, A. Heat shock proteins and the biogenesis of cellular membranes [Text] / A. De Maio, L. E. Hightower //Cell Stress and Chaperones. - 2021. - V. 26. - №. 1. - P. 15-18.

50) Do Nascimento, N. C. Genome sequence of Mycoplasma parvum (formerly Eperythrozoon parvum), a diminutive hemoplasma of the pig [Text] / N. C. do Nascimento, A. P. Dos Santos, Y. Chu, A. M. Guimaraes, A. Pagliaro, J. B. Messick // Genome announcements. - 2013. - V. 1. - №. 6. - P. e00986-13.

51) Dordet-Frisoni, E. Mycoplasma chromosomal transfer: a distributive, conjugative process creating an infinite variety of mosaic genomes [Text] / E. Dordet-Frisoni, M. Faucher, E. Sagne, E. Baranowski, F. Tardy, L. X. Nouvel, C. Citti //Frontiers in microbiology. - 2019. - P. 2441.

52) Doyle, S. M. Asymmetric deceleration of ClpB or Hsp104 ATPase activity unleashes protein-remodeling activity [Text] / S. M. Doyle, J. Shorter, M. Zolkiewski, J. R. Hoskins, S. Lindquist, S. Wickner // Nature Structural & Molecular Biology. - 2007. -V. 14. - P. 114-122.

53) Doyle, S. M. Hsp104 and ClpB: protein disaggregating machines [Text] / S. M. Doyle, S. Wickner //Trends in biochemical sciences. - 2009. - V. 34. - №. 1. - P. 40-48.

54) Edelmann, D. Type I toxin-dependent generation of superoxide affects the persister life cycle of Escherichia coli [Text] / D. Edelmann, B. A. Berghoff // Scientific reports. -2019. - V. 9. - №. 1. - P. 1-10.

55) Feil, I. K. A novel quaternary structure of the dimeric a-crystallin domain with chaperone-like activity [Text] / Feil, I. K., Malfois, M., Hendle, J., van der Zandt, H., & Svergun, D. I. // Journal of Biological Chemistry. - 2001. - V. 276, №. 15. - P. 1202412029.

56) Franzmann, T. M. Activation of the chaperone Hsp26 is controlled by the rearrangement of its thermosensor domain [Text] / T. M. Franzmann, P. Menhorn, S. Walter, J. Buchner // Molecular cell. - 2008. - V. 29, №. 2. - P. 207-216.

57) Fraser, C. M. The minimal gene complement of Mycoplasma genitalium [Text] / C. M. Fraser, J. D. Gocayne, O. White, M. D. Adams, R. A. Clayton, R. D. Fleischmann, C. J. Bult, A. R. Kerlavage, G. SUTTON, J. M. Kelley, J. L. Fritchman, J. F. Weidman, K. V. Small, M. Sandusky, J. Fuhrmann, D. Nguyen, T. R. Utterback, D. M. Saudek, C. A. Phillips, J. M. Merrick, J. Tomb, B. A. Dougherty, K. F. Bottping-chuan Hu, T. S. Lucier, S. N. Peterson, H. O. Smith, C. A. Hutchison, J. C. Venter // Science. - 1995. -V. 270. - №. 5235. - P. 397-404.

58) Friedrich, K. L. Interactions between small heat shock protein subunits and substrate in small heat shock protein-substrate complexes [Text] / K. L. Friedrich, K. C. Buan, N. R. Giese, E. Vierling // Journal of Biological Chemistry. - 2004. - V. 279. - №. 2. - P. 1080-1089.

59) Garrido, C. Heat shock proteins: endogenous modulators of apoptotic cell death [Text] / C. Garrido, S. Gurbuxani, L. Ravagnan, G. Kroemer // Biochemical and biophysical research communications. - 2001. - V. 286. - №. 3. - P. 433-442.

60) Gershenson, A. Deciphering protein stability in cells [Text] / A. Gershenson // Journal of molecular biology. - 2014. - V. 426. - №. 1. - P. 4.

61) Giese, K. C. Evidence for an essential function of the N terminus of a small heat shock protein in vivo, independent of in vitro chaperone activity [Text] / K. C. Giese, E. Basha, B. Y. Catague, E. Vierling // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2005.

- V. 102. - №. 52. - P. 18896-18901.

62) Glass, J. I. The complete sequence of the mucosal pathogen Ureaplasma urealyticum [Text] / J. I. Glass, E. J. Lefkowitz, J. S. Glass, C. R. Heiner, E. Y. Chen, G. H. Cassell //Nature. - 2000. - V. 407. - №. 6805. - P. 757-762.

63) Gomes, S.L. Stress Responses: Heat [Text] / S.L. Gomes // Encyclopedia of Microbiology. -2009.-V.3

64) Guan, W. Heat shock protein 70 (HSP70) promotes air exposure tolerance of Litopenaeus vannamei by preventing hemocyte apoptosis [Text] / W. Guan, X. Wei, W. Nong, Y. Shao, L. Mao // Developmental & Comparative Immunology. - 2021. - V. 114. - P. 103844.

65) Hanson, P. I. AAA+ proteins: have engine, will work [Text] / P. I. Hanson, S. W. Whiteheart // Nature reviews Molecular cell biology. - 2005. - V. 6. - №. 7. - P. 519529.

66) Haranahalli, K. Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ / K. Haranahalli, S. Tong, I. Ojima // Bioorganic & medicinal chemistry. - 2016. - V. 24. - №. 24. - P. 6354-6369.

67) Haslbeck, M. Small heat shock proteins: simplicity meets complexity [Text] / M. Haslbeck, S. Weinkauf, J. Buchner // Journal of Biological Chemistry. - 2019. - V. 294.

- №. 6. - P. 2121-2132.

68) Haslbeck, M. Some like it hot: the structure and function of small heat-shock proteins [Text] / M. Haslbeck, T. Franzmann, D. Weinfurtner, J. Buchner // Nature structural & molecular biology. - 2005. - V. 12. - №. 10. - P. 842-846.

69) Haslbeck, M. Hsp26: a temperature-regulated chaperone [Text] / M. Haslbeck, S. Walke, T. Stromer, M. Ehrnsperger, H. E. White, S. Chen, H. R. Saibil, J. Buchner // The EMBO journal. - 1999. - V. 18, №. 23. - P. 6744-6751.

70) Heyde, M. Acid shock proteins of Escherichia coli [Text] / M. Heyde, R. Portalier // FEMS microbiology letters. - 1990. - V. 69. - №. 1-2. - P. 19-26.

71) Hodson, S. Mapping the road to recovery: the ClpB/Hsp104 molecular chaperone [Text] / S. Hodson, J. J. T. Marshall, S. G. Burston // Journal of structural biology. - 2012. -V. 179. - №. 2. - P. 161-171.

72) Itoh, Y. Induction of HSP 70 of vascular endothelial cells under oxidative stress [Text] / Y. Itoh, T. Ishiguchi, Y. Ayakawa, Y. Itoh // Thermal Medicine (Japanese Journal of Hyperthermic Oncology). - 2002. - V. 18. - №. 2. - P. 65-73.

73) Iryani, M. T. M. Effects of heat shock protein 70 knockdown on the tolerance of the brine shrimp Artemia franciscana to aquaculture-related stressors: Implications for aquatic animal health and production [Text] / M. T. M. Iryani, I. K. R. Tiong, T. Nagappan, M. E. A. Wahid, T. S. T. Muhammad, T. Tatsuki, W. H. Satyantini, Y. Y. Sung // Aquaculture. - 2022. - V. 550. - P. 737872.

74) Jaffe, J. D. Proteogenomic mapping as a complementary method to perform genome annotation [Text] / J. D. Jaffe, H. C. Berg, G. M. Church // Proteomics. - 2004. - V. 4. - №. 1. - P. 59-77.

75) Jiang, F. Elongation factor Tu and heat shock protein 70 are membrane-associated proteins from Mycoplasma ovipneumoniae capable of inducing strong immune response in mice [Text] / F. Jiang, J. He, N. Navarro-Alvarez, J. Xu, X. Li, P. Li, W. Wu // PloS one. - 2016. - V. 11. - №. 8. - P. e0161170.

76) Jiao, W. The essential role of the flexible termini in the temperature-responsiveness of the oligomeric state and chaperone-like activity for the polydisperse small heat shock protein IbpB from Escherichia coli [Text] / W. W. Jiao, M. D. Qian, P. L. Li, L. Zhao and Z. Y. Chang // Journal of molecular biology. - 2005. - V. 347. - №. 4. - P. 871884.

77) Jorge, S. The Mycoplasma hyopneumoniae recombinant heat shock protein P42 induces an immune response in pigs under field conditions [Text] / S. Jorge, N. R. de Oliveira, S. B. Marchioro, A. Fisch, C. K. Gomes, C. P. Hartleben, F. R. Concei?äo, O. A.

Dellagostin // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - 2014.

- V. 37. - №. 4. - P. 229-236.

78) Kaestle, M. Interactions of the proteasomal system with chaperones: protein triage and protein quality control [Text] / M. Kaestle, T. Grune // Progress in molecular biology and translational science. - 2012. - V. 109. - P. 113-160.

79) Kamada, M. Whole genome complete resequencing of Bacillus subtilis natto by combining long reads with high-quality short reads [Text] / M. Kamada, S. Hase, K. Sato, A. Toyoda, A. Fujiyama, Y. Sakakibara // PloS one. - 2014. - V. 9. - №. 10. - P. e109999.

80) Kannan, T. R. Characterization of a unique ClpB protein of Mycoplasma pneumoniae and its impact on growth [Text] / T. R. Kannan, O. Musatovova, P. Gowda, J. B. Baseman // Infection and immunity. - 2008. - V. 76. - №. 11. - P. 5082-5092.

81) Kant, R. Comparative genomics of Lactobacillus [Text] / R. Kant, J. Blom, A. Palva, R. J. Siezen, W. M. de Vos //Microbial biotechnology. - 2011. - V. 4. - №. 3. - P. 323332.

82) Karimova, G. A bacterial two-hybrid system based on a reconstituted signal transduction pathway [Text] / G. Karimova, J. Pidoux, A. Ullmann, D. Ladant // PNAS.

- 1998. - V. 95 (10). - P. 5752-5756.

83) Katikaridis, P. ClpG provides increased heat resistance by acting as superior disaggregase [Text] / P. Katikaridis, L. Meins, S. M. Kamal, U. Römling, A. Mogk, // Biomolecules. - 2019. - V. 9. - №. 12. - P. 815.

84) Kayumov, A. Interaction of the general transcription factor TnrA with the PII-like protein GlnK and glutamine synthetase in Bacillus subtilis [Text] / A. Kayumov, K. Heinrich, K. Fedorova, O. Ilinskaya, K. Forchhammer // The FEBS Journal. - 2011. -V. 278. - №. 10. - P. 1779-1789.

85) K^dzierska, S. DnaK/DnaJ chaperone system reactivates endogenous E coli thermostable FBP aldolase in vivo and in vitro; the effect is enhanced by GroE heat shock proteins [Text] / S. K^dzierska, G. Jezierski, A. Taylor // Cell Stress & Chaperones. - 2001. - V. 6. - №. 1. - P. 29.

86) K^dzierska-Mieszkowska, S. Hsp100 molecular chaperone ClpB and its role in virulence of bacterial pathogens [Text] / S. K^dzierska-Mieszkowska, M. Zolkiewski // International Journal of Molecular Sciences. - 2021. - V. 22. - №. 10. - P. 5319.

87) Kitagawa, M. Escherichia coli small heat shock proteins, IbpA and IbpB, protect enzymes from inactivation by heat and oxidants [Text] / M. Kitagawa, M. Miyakawa, Y. Matsumura, T. Tsuchido // European Journal of Biochemistry. - 2002. - V. 269. -№. 12. - P. 2907-2917.

88) Klundert, F. A. The mammalian small heat-shock protein Hsp20 forms dimers and is a poor chaperone [Text] / F. A. van de Klundert, R. H. Smulders, M. L. Gijsen, R. A. Lindner, R. Jaenicke, J. A. Carver, W. W. de Jong // The FEBS Journal. - 1998. - V. 258, №. 3. - P. 1014-1021.

89) Kohler, V. Hsp70-mediated quality control: should I stay or should I go? [Text] / V. Kohler, C. Andréasson // Biological Chemistry. - 2020. - V. 401. - №. 11. - P. 12331248.

90) Krajewska, J. Characterization of the molecular chaperone ClpB from the pathogenic spirochaete Leptospira interrogans [Text] / J. Krajewska, A. Modrak-Wójcik, Z. J. Arent, D. Wiçckowski, M. Zolkiewski, A. Bzowska, S. Kçdzierska-Mieszkowska // PLoS One. - 2017. - V. 12. - №. 7. - P. e0181118.

91) Kravats, A. N. Interaction of E. coli Hsp90 with DnaK involves the DnaJ binding region of DnaK [Text] / A. N. Kravats, S. M. Doyle, J. R. Hoskins, O. Genest, E. Doody, S. Wickner // Journal of molecular biology. - 2017. - V. 429. - №. 6. - P. 858-872.

92) Kukekova, A. V. Characterization of Acholeplasma laidlawii ftsZ gene and its gene product [Text] / A. V. Kukekova, A. Y. Malinin, J. A. Ayala, S. N. Borchsenius // Biochemical and biophysical research communications. - 1999. - V. 262. - №. 1. - P. 44-49.

93) Kuzma-Mroczkowska, E. Mycoplasma pneumoniae as a trigger for Henoch-Schönlein purpura in children [Text] / E. Kuzma-Mroczkowska, M. Panczyk-Tomaszewska, A. Szmigielska, H. Szymanik-Grzelak, M. Roszkowska-Blaim // Central-european Journal of Immunology. - 2015. - V. 40. - №. 4. - P. 489.

94) Laemmli, U. K. Denaturing (SDS) discontinuous gel electrophoresis [Text] / U. K. Laemmli // Nature. - 1970. - V. 277. - P. 680-685.

95) Lambert, H. HSP27 multimerization mediated by phosphorylation-sensitive intermolecular interactions at the amino terminus [Text] / H. Lambert, S. J. Charette, A. F. Bernier, A. Guimond, J. Landry // Journal of Biological Chemistry. - 1999. - V. 274. - №. 14. - P. 9378-9385.

96) Lang, B. J. The functions and regulation of heat shock proteins; key orchestrators of proteostasis and the heat shock response / B. J. Lang, M. E. Guerrero, T. L. Prince, Y. Okusha, C. Bonorino, S. K. Calderwood // Archives of toxicology. - 2021. - V. 95. -№. 6. - P. 1943-1970.

97) Lazarev, V. N. Complete genome and proteome of Acholeplasma laidlawii [Text] / V. N. Lazarev, S. A. Levitskii, Y. I. Basovskii, M. M. Chukin, T. A. Akopian, V. V. Vereshchagin, E. S. Kostrjukova,1 G. Y. Kovaleva, M. D. Kazanov, D. B. Malko, A. G. Vitreschak, N. V. Sernova, M. S. Gelfand, I. A. Demina,1 M. V. Serebryakova, M. A. Galyamina, N. N. Vtyurin, S. I. Rogov, D. G. Alexeev, V. G. Ladygina, V. M. Govorun // Journal of bacteriology. - 2011. - V. 193. - №. 18. - P. 4943-4953.

98) Lee, J. Heat shock protein (Hsp) 70 is an activator of the Hsp104 motor [Text] / J. Lee, J. H. Kim, A. B. Biter, B. Sielaff, S. Lee, F. T. Tsai // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2013. - V. 110. - №. 21. - P. 8513-8518.

99) Lee, S. The structure of ClpB: a molecular chaperone that rescues proteins from an aggregated state [Text] / S. Lee, M. E. Sowa, Y. H. Watanabe, P. B. Sigler, W. Chiu, M. Yoshida, F. T. Tsai // Cell. - 2003. - V. 115. - №. 2. - P. 229-240.

100) Lentze, N. Temperature and concentration-controlled dynamics of rhizobial small heat shock proteins [Text] / N. Lentze, J. A. Aquilina, M. Lindbauer, C. V. Robinson, F. Narberhaus // The FEBS Journal. - 2004. - V. 271, №. 12. - P. 2494-2503.

101) Li, G. Complete genome sequence of Streptococcus pneumoniae strain ST556, a multidrug-resistant isolate from an otitis media patient [Text] / G. Li, F. Z. Hu, X. Yang, Y. Cui, J. Yang, F. Qu, G. F. Gao, J. Ren // Journal of Bacteriology. -2012.- V. 194. -№. 12. -P.3294-3295.

102) Li, Z. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division [Text] / Z. Li, M. J. Trimble, Y. V. Brun, G. J. Jensen // The EMBO journal. -2007. - V. 26. - №. 22. - P. 4694-4708.

103) Lubkowska, A. Role of heat shock proteins (HSP70 and HSP90) in viral infection [Text] / A. Lubkowska, W. Pluta, A. Stronska, A. Lalko // International Journal of Molecular Sciences. - 2021. - V. 22. - №. 17. - P. 9366.

104) Lum, R. Evidence for an unfolding/threading mechanism for protein disaggregation by Saccharomyces cerevisiae Hsp104 [Text] / R. Lum, J. M. Tkach, E. Vierling, J. R. Glover // Journal of Biological Chemistry. - 2004. - V. 279. - №. 28. - P. 29139-29146.

105) Lutkenhaus, J. F. Individual proteins are synthesized continuously throughout the Escherichia coli cell cycle [Text] / J. F. Lutkenhaus, B. A. Moore, M. Masters, W. D. Donachie //Journal of Bacteriology. - 1979. - V. 138. - №. 2. - P. 352-360.

106) Macosek, J. Redefining Molecular Chaperones as Chaotropes [Text] / J. Macosek, G. Mas, S. Hiller // Frontiers in Molecular Biosciences. - 2021. - T. 8. - P. 514.

107) Martínez-Torró, C. Functional characterization of the cell division gene cluster of the wall-less bacterium Mycoplasma genitalium [Text] / C. Martínez-Torró, S. Torres-Puig, M. Marcos-Silva, M. Huguet-Ramón, C. Muñoz-Navarro, M. Lluch-Senar, L. Serrano, E. Querol, J. Piñol, O. Q. Pich // Frontiers in microbiology. - 2021. - V. 12.

108) Matuszewska, M. The small heat shock protein IbpA of Escherichia coli cooperates with IbpB in stabilization of thermally aggregated proteins in a disaggregation competent state [Text] / M. Matuszewska, D. Kuczynska-Wisnik, E. Laskowska, K. Liberek // Journal of Biological Chemistry. - 2005. - V. 280, №. 13. - P. 12292-12298.

109) Mayer, M. P. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism [Text] / M. P. Mayer, B. Bukau // Cellular and molecular life sciences. - 2005. - V. 62. - №. 6. - P. 670-684.

110) Mayer, M. P. Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones [Text] / M. P. Mayer, L. M. Gierasch // Journal of Biological Chemistry. - 2019. - V. 294. - №. 6. - P. 2085-2097.

111) McCarty, J. S. DnaK mutants defective in ATPase activity are defective in negative regulation of the heat shock response: expression of mutant DnaK proteins results in filamentation [Text] / J. S. McCarty, G. C. Walker // Journal of bacteriology. - 1994. -V. 176. - №. 3. - P. 764-780.

112) McCormick, J. R. Growth and viability of Streptomyces coelicolor mutant for the cell division gene ftsZ [Text] / J. R. McCormick, E. P. Su, A. Driks, R. Losick // Molecular microbiology. - 1994. - V. 14. - №. 2. - P. 243-254.

113) Miller, J. H. Galactosidase assay. In J. H. Miller (ed.), Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory [Text] / J. H. Miller // Cold Spring Harbor. -1972. - P. 352-355.

114) Mingorance, J. Genomic channeling in bacterial cell division [Text] / J. Mingorance, J. Tamames, M. Vicente // Journal of molecular recognition. - 2004. - V. 17. - №. 5. -P. 481-487.

115) Miot, M. Species-specific collaboration of heat shock proteins (Hsp) 70 and 100 in thermotolerance and protein disaggregation [Text] / M. Miot, M. Reidy, S. M. Doyle, J. R. Hoskins, D.M. Johnston, O. Genest, M. C. Vitery, D. C. Masison, S. Wickner // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2011. - V. 108. - №. 17. - P. 69156920.

116) Mishra, S. Engineering of a polydisperse small heat-shock protein reveals conserved motifs of oligomer plasticity [Text] / S. Mishra, S. A. Chandler, D. Williams, D. P. Claxton, H. A. Koteiche, P. L. Stewart, J. L. P. Benesch, H. S. McHaourab // Structure. - 2018. - V. 26. - №. 8. - P. 1116-1126. e4.

117) Miwa, T. Escherichia coli small heat shock protein IbpA is an aggregation-sensor that self-regulates its own expression at posttranscriptional levels [Text] / T. Miwa, Y. Chadani, H. Taguchi // Molecular Microbiology. - 2021. - V. 115. - №. 1. - P. 142156.

118) Mogk, A. Role of sHsps in organizing cytosolic protein aggregation and disaggregation [Text] / A. Mogk, B. Bukau // Cell Stress and Chaperones. - 2017. - V. 22. - №. 4. - P. 493-502.

119) Mogk, A. Small heat shock proteins, ClpB and the DnaK system form a functional triade in reversing protein aggregation [Text] / A. Mogk, E. Deuerling, S. Vorderwülbecke, E. Vierling, B. Bukau // Molecular microbiology. - 2003. - V. 50. - №. 2. - P. 585-595

120) Mogk, A. Cellular Functions and Mechanisms of Action of Small Heat Shock Proteins [Text] / A. Mogk, C. Ruger-Herreros, B. Bukau // Annual Review of Microbiology. -2019. - №73. -P. 89-110

121) Moutaoufik, M. T. Analysis of insect nuclear small heat shock proteins and interacting proteins [Text] / M. T Moutaoufik, R. M. Tanguay // Cell Stress and Chaperones. -2021. - V. 26. - №. 1. - P. 265-274.

122) Mukherjee, A. Dynamic assembly of FtsZ regulated by GTP hydrolysis [Text] / A. Mukherjee, J. Lutkenhaus //The EMBO journal. - 1998. - T. 17. - №. 2. - C. 462-469.

123) Nillegoda, N. B. Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms [Text] / N. B. Nillegoda, B. Bukau // Frontiers in molecular biosciences. -2015. - V. 2. - P. 57.

124) Obuchowski, I. Duplicate divergence of two bacterial small heat shock proteins reduces the demand for Hsp70 in refolding of substrates [Text] / I. Obuchowski, A. Pirog, M.

Stolarska, B. Tomiczek, K. Liberek, // PLoS Genetics. - 2019. - V. 15. - №. 10. - P. e1008479.

125) Obuchowski, I. The Small Ones Matter—sHsps in the Bacterial Chaperone Network [Text] / I. Obuchowski, P. Karas, K. Liberek // Frontiers in Molecular Biosciences. -2021. - V. 8. - P. 412.

126) Oshima, K. Genomic and evolutionary aspects of phytoplasmas [Text] / K. Oshima, K. Maejima, S. Namba // Frontiers in microbiology. - 2013. - V. 4. - P. 230.

127) Pasta, S. Y. The IXI/V motif in the C-terminal extension of alpha-crystallins: alternative interactions and oligomeric assemblies [Text] / S. Y. Pasta, B. Raman, T. Ramakrishna, C. M. Rao // Mol Vis. - 2004. - V. 10. - №. 78. - P. 655-662.

128) Peters, P. C. A new assembly pathway for the cytokinetic Z ring from a dynamic helical structure in vegetatively growing cells of Bacillus subtilis [Text] / P. C. Peters, M. D. Migocki, C. Thoni, E. J. Harry // Molecular microbiology. - 2007. - V. 64. - №. 2. - P. 487-499.

129) Poulain, P. Detection and architecture of small heat shock protein monomers [Text] / P. Poulain, J. C. Gelly, D. Flatters //PloS one. - 2010. - V. 5. - №. 4. - P. e9990.

130) Pucci, M. J. Identification and characterization of cell wall-cell division gene clusters in pathogenic gram-positive cocci [Text] / M. J. Pucci, J. A. Thanassi, L. F. Discotto, R. E. Kessler, T. J Dougherty // Journal of Bacteriology - 1997.- V. 179. - P. 5632-5635.

131) Ramakrishna, G. Genome wide identification and characterization of small heat shock protein gene family in pigeonpea and their expression profiling during abiotic stress conditions [Text] / G. Ramakrishna, A. Singh, P. Kaur, S. S. Yadav, S. Sharma, K. Gaikwad // International Journal of Biological Macromolecules. - 2022. - V. 197. - P. 88-102.

132) Ranford, J. C. Chaperonins are cell-signalling proteins: the unfolding biology of molecular chaperones [Text] / J. C. Ranford, A. R. M. Coates, B. Henderson // Expert reviews in molecular medicine. - 2000. - V. 2. - №. 8. - P. 1-17.

133) Ratajczak, E. Distinct activities of Escherichia coli small heat shock proteins IbpA and IbpB promote efficient protein disaggregation [Text] / E. Ratajczak, S. Zi^tkiewicz, K. Liberek // Journal of molecular biology. - 2009. - V. 386. - №. 1. - P. 178-189.

134) Ratajczak, E. IbpA the small heat shock protein from Escherichia coli forms fibrils in the absence of its cochaperone IbpB [Text] / E. Ratajczak, J. Strozecka, M.

Matuszewska, S. Zi^tkiewicz, D. Kuczynska-Wisnik, E. Laskowska, K. Liberek // FEBS letters. - 2010. - V. 584. - №. 11. - P. 2253-2257.

135) Reid, B. G. ClpA mediates directional translocation of substrate proteins into the ClpP protease [Text] / B. G. Reid, W. A. Fenton, A. L. Horwich, E. U. Weber-Ban // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2001. - V. 98. - №. 7. - P. 37683772.

136) Reinle, K. The diverse functions of small heat shock proteins in the proteostasis network [Text] / K. Reinle, A. Mogk, B. Bukau // Journal of molecular biology. - 2022. - V. 434. - №. 1. - P. 167157.

137) Rosenzweig, R. ClpB N-terminal domain plays a regulatory role in protein disaggregation [Text] / R. Rosenzweig, P. Farber, A. Velyvis, E. Rennella, M. P. Latham, L. E. Kay // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2015. - V. 112. - №. 50. - P. E6872-E6881.

138) Saibil, H. Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation [Text] / H. Saibil // Nature reviews Molecular cell biology. - 2013. - V. 14. - №. 10. - P. 630642.

139) Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual [Text] / J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis // Cold Spring Harbor Laboratory Press. -1989.

140) Scheffers, D. J. GTP hydrolysis of cell division protein FtsZ: evidence that the active site is formed by the association of monomers [Text] / D. J. Scheffers, J. G. de Wit, T. den Blaauwen, A. J. Driessen // Biochemistry. - 2002. - V. 41. - №. 2. - P. 521-529

141) Schlee, S. A chaperone network for the resolubilization of protein aggregates: direct interaction of ClpB and DnaK [Text] / S. Schlee, P. Beinker, A. Akhrymuk, J. Reinstein // Journal of molecular biology. - 2004. - V. 336. - №. 1. - P. 275-285.

142) Schlieker, C. Substrate recognition by the AAA+ chaperone ClpB [Text] / C. Schlieker, J. Weibezahn, H. Patzelt, P. Tessarz, C. Strub, K. Zeth, A. Erbse, J. Schneider-Mergener, J. W. Chin, P. G. Schultz, B. Bukau, A. Mogk // Nature structural & molecular biology. - 2004. - V. 11. - №. 7. - P. 607-615.

143) Seyffer, F. Hsp70 proteins bind Hsp100 regulatory M domains to activate AAA+ disaggregase at aggregate surfaces [Text] / F. Seyffer, E. Kummer, Y. Oguchi, J. Winkler, M. Kumar, R. Zahn, V. Sourjik, B. Bukau, A. Mogk // Nature structural & molecular biology. - 2012. - V. 19. - №. 12. - P. 1347-1355.

144) Shan, Q. Physiological functions of heat shock proteins [Text] / Q. Shan, F. Ma, J Wei, H. Li, H. Ma, P. Sun // Current Protein and Peptide Science. - 2020. - V. 21. - №. 8. -P. 751-760.

145) Sluchanko, N. N. Structural basis for the interaction of a human small heat shock protein with the 14-3-3 universal signaling regulator [Text] / N. N. Sluchanko, S. Beelen, A. A. Kulikova, S. D. Weeks, A. A. Antson, N. B. Gusev, S. V. Strelkov // Structure. - 2017. - V. 25. - №. 2. - P. 305-316.

146) Sogawa, H. Binding sites of Zantrin inhibitors to the bacterial cell division protein FtsZ: Molecular docking and ab initio molecular orbital calculations [Text] / H. Sogawa, R. Sato, K. Suzukia, S. Tomioka, T. Shinzato, P. Karpov, S. Shulga, Y. Blumeb, N. Kurita // Chemical Physics. - 2020. - V. 530. - P. 110603.

147) Squires, C. L. ClpB is the Escherichia coli heat shock protein F84. 1[Text] / C. L. Squires, S. Pedersen, B. M. Ross, C. Squires // Journal of bacteriology. - 1991. - V. 173. - №. 14. - P. 4254-4262.

148) Stamler, R. Wrapping the a-crystallin domain fold in a chaperone assembly [Text] / R. Stamler, G. Kappé, W. Boelens, C. Slingsby // Journal of molecular biology. - 2005. -V. 353. - №. 1. - P. 68-79.

149) Stetler, R. A. Heat shock proteins: cellular and molecular mechanisms in the central nervous system [Text] / R. A. Stetler, Y. Gan, W. Zhang, A. K. Liou, Y. Gao, G. Cao, J. Chen // Progress in neurobiology. - 2010. - V. 92. - №. 2. - P. 184-211.

150) Strozecka, J. Importance of N-and C-terminal regions of IbpA, Escherichia coli small heat shock protein, for chaperone function and oligomerization [Text] / Strozecka, J., Chrusciel, E., Gorna, E., Szymanska, A., Ziçtkiewicz, S., & Liberek, K. // Journal of Biological Chemistry. - 2012. - V. 287, №. 4. - P. 2843-2853.

151) Studer, S. Chaperone activity and homo-and hetero-oligomer formation of bacterial small heat shock proteins [Text] / S. Studer, F. Narberhaus // Journal of Biological Chemistry. - 2000. - V. 275. - №. 47. - P. 37212-37218.

152) Sucec, I. How do Chaperones Bind (Partly) Unfolded Client Proteins? [Text] / I. Sucec, B. Bersch, P. Schanda // Frontiers in Molecular Biosciences. - 2021. - V. 8.

153) Sugiyama, H. Successful treatment of progressive Henoch-Schönlein purpura nephritis with tonsillectomy and steroid pulse therapy [Text] / H. Sugiyama, N. Watanabe, T.

Onoda, Y. Kikumoto, M. Yamamoto, M. Maeta, N. Ohara, Y. Maeshima, Y. Yamasaki, H. Makino // Internal medicine. - 2005. - V. 44. - №. 6. - P. 611-615.

154) Sun, Y. Small heat shock proteins: molecular structure and chaperone function [Text] / Y. Sun, T. H. MacRae // Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. - 2005. - V. 62. - №. 21. - P. 2460-2476.

155) Sung, Y. Y. Heat shock proteins and disease control in aquatic organisms [Text] / Y. Y. Sung, T. H. MacRae // Journal of Aquaculture Research & Development S. - 2011. -V. 2. - №. 006.

156) Tao, J. Heat shock proteins IbpA and IbpB are required for NlpI-participated cell division in Escherichia coli [Text] / J. Tao, Y. Sang, Q.H. Teng, J.J. Ni, Y. Yang, S.K.W. Tsui, Y.F. Yao // Frontiers in microbiology. - 2015. - V. 6. - P. 51.

157) Thanedar, S. FtsZ exhibits rapid movement and oscillation waves in helix-like patterns in Escherichia coli [Text] / S. Thanedar, W. Margolin // Current Biology. - 2004. - V. 14. - №. 13. - P. 1167-1173.

158) Tripathi, P. ClpB is an essential stress regulator of Mycobacterium tuberculosis and endows survival advantage to dormant bacilli [Text] / P. Tripathi, L. K. Singh, S. Kumari, O. R. Hakiem, J. K. Batra // International Journal of Medical Microbiology. -2020. - V. 310. - №. 3. - P. 151402.

159) Tripathi, P. Heat Shock Proteins in the Pathogenesis of Mycobacterium tuberculosis [Text] / P. Tripathi, J. K. Batra // Mycobacterium Tuberculosis: Molecular Infection Biology, Pathogenesis, Diagnostics and New Interventions. -2019. - P. 221-240.

160) Tripathi, P. The amino-terminal domain of Mycobacterium tuberculosis ClpB protein plays a crucial role in its substrate disaggregation activity [Text] / P. Tripathi, P. Parijat, V. K. Patel, J. K. Batra // FEBS open bio. - 2018. - V. 8. - №. 10. - P. 1669-1690.

161) Tutar, L. Heat shock proteins; an overview [Text] / L. Tutar, Y. Tutar // Current Pharmaceutical Biotechnology. - 2010. - V. 11. - №. 2. - P. 216-222.

162) Tyedmers, J. Cellular strategies for controlling protein aggregation [Text] / J. Tyedmers, A. Mogk, B. Bukau // Nature reviews Molecular cell biology. - 2010. - V. 11. - №. 11. - P. 777-788.

163) Urban-Chmiel, R. Characterization of heat-shock proteins in Escherichia coli strains under thermal stress in vitro [Text] / F. Awan, Y. Dong, N. Wang, J. Liu, K. Ma, Y. Liu // Journal of medical microbiology. - 2013. - V. 62. - №. 12. - P. 1897-1901.

164) Van Montfort, R. Structure and function of the small heat shock protein/a-crystallin family of molecular chaperones [Text] / R. Van Montfort, C. Slingsby, E. Vierlingt // Advances in protein chemistry. - 2001. - V. 59. - P. 105-156.

165) Van Montfort, R. Structure and function of the small heat shock protein/a-crystallin family of molecular chaperones [Text] / R. Van Montfort, C. Slingsby, E. Vierlingt // Advances in protein chemistry. - 2001. - V. 59. - P. 105-156.

166) Vedyaykin, A. D. Recombinant FtsZ proteins from Mollicutes interact with Escherichia coli division machinery [Text] / A. D. Vedyaykin, A. V. Sabantsev, M. A. Khodorkovskii, A. R. Kayumov, I. E. Vishnyakov // BioNanoScience. - 2016. - V. 6. -№. 4. - P. 443-446.

167) Veinger, L. The small heat-shock protein IbpB from Escherichia coli stabilizes stress-denatured proteins for subsequent refolding by a multichaperone network [Text] / L. Veinger, S. Diamant, J. Buchner, P. Goloubinoff // Journal of Biological Chemistry. -1998. - V. 273. - №. 18. - P. 11032-11037.

168) Vendredy, L. Small heat shock proteins in neurodegenerative diseases [Text] / L. Vendredy, E. Adriaenssens, V Timmerman //Cell Stress and Chaperones. - 2020. - V. 25. - №. 4. - P. 679-699.

169) Vishnyakov, I. E. The identification and characterization of IbpA, a novel a-crystallin-type heat shock protein from mycoplasma [Text] / I. E. Vishnyakov, S. A. Levitskii, V. A. Manuvera, V. N. Lazarev, J. A. Ayala, V. A. Ivanov, E.S. Snigirevskaya; Y.Y. Komissarchik, S. N. Borchsenius // Cell Stress and Chaperones. - 2012. - V. 17. - №. 2. - P. 171-180.

170) Völker, U. Analysis of the induction of general stress proteins of Bacillus subtilis [Text] / U. Völker, S. Engelmann, B. Maul, S. Riethdorf1, A. Völker, R. Schmid, H. Mach, M. Hecker // Microbiology. - 1994. - V. 140. - №. 4. - P. 741-752.

171) Walker, B. Transient membrane-linked FtsZ assemblies precede Z-ring formation in Escherichia coli [Text] / B. E. Walker, J. Männik, J. Männik // Current Biology. - 2020. - V. 30. - №. 3. - P. 499-508. e6.

172) Wang, X. FtsZ ring: the eubacterial division apparatus conserved in archaebacteria [Text] / X. Wang, J. Lutkenhaus // Molecular microbiology. - 1996. - V. 21. - №. 2. -P. 313-320.

173) Wang, K. ATP causes small heat shock proteins to release denatured protein [Text] / K. Wang, A. Spector // European Journal of Biochemistry. - 2001. - V. 268. - №. 24. - P. 6335-6345.

174) Wang, J. Whole-genome sequence of Staphylococcus aureus strain LCT-SA112 [Text] / J. Wang, Y. Liu, D. Wan, X. Fang, T. Li, Y. Guo, D. Chang, L. Su, Y. Wang, J. Zhao, C. Liu // Journal of Bacteriology. -2012.- T. 194. -№. 15. - C. 4124-4124

175) Webster, J. M. Small heat shock proteins, big impact on protein aggregation in neurodegenerative disease [Text] / J. M. Webster, A. L. Darling, V. N. Uversky, L. J. Blair // Frontiers in pharmacology. - 2019. - P. 1047.

176) Weibezahn, J. Thermotolerance requires refolding of aggregated proteins by substrate translocation through the central pore of ClpB[Text] / J. Weibezahn, P. Tessarz, C. Schlieker, R. Zahn, Z. Maglica, S. Lee, H. Zentgraf, E. U. Weber-Ban, D. A. Dougan, F. T. F. Tsai, A. Mogk, B. Bukau // Cell. - 2004. - V. 119. - №. 5. - P. 653-665.

177) Wendler, P. Structure and function of the AAA+ nucleotide binding pocket [Text] / P. Wendler, S. Ciniawsky, M. Kock, S. Kube // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. - 2012. - V. 1823. - №. 1. - P. 2-14.

178) Yang, X. GTPase activity-coupled treadmilling of the bacterial tubulin FtsZ organizes septal cell wall synthesis [Text] / X. Yang, Z. Lyu, A. Miguel, R. McQuillen, K. C. Huang, J. Xiao // Science. - 2017. - V. 355. - №. 6326. - P. 744-747.

179) Yeh, C. H. Expression of a gene encoding a 16.9-kDa heat-shock protein, Oshsp16. 9, in Escherichia coli enhances thermotolerance [Text] / C. H. Yeh, P. F. L. Chang, K. W. Yeh, W. C. Lin, Y. M. Chen, C. Y. Lin // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1997. - V. 94. - №. 20. - P. 10967-10972.

180) Young, L. S. Molecular characterization of Oryza sativa 16 9 kDa heat shock protein [Text] / L. S. Young, Y. E. H. Ching-Hui,C. H. N. Yih-Ming, L. I. N. Chu-Yung // Biochemical journal. - 1999. - V. 344, №. 1. - P. 31-38.

181) Yu, C. Structural basis of substrate recognition and thermal protection by a small heat shock protein [Text] / C. Yu, S. K. P. Leung, W. Zhang, L. T. F. Lai, Y. K. Chan, M. C. Wong, S. Benlekbir, Y. Cui, L. Jiang, W. C. Yu Lau // Nature communications. - 2021. - V. 12. - №. 1. - P. 1-11.

182) Yuan, J. W. Identification, expression analysis and functional verification of two genes encoding small heat shock proteins in the western flower thrips, Frankliniella

occidentalis (Pergande) [Text] / J. W. Yuan, H. X. Song, Y. W. Chang, F. Yang, H. F. Xie, W. R. Gong, Y. Z. Du // International Journal of Biological Macromolecules. -2022. - V. 211. - P.74-84

183) Yusof, N. A. Can heat shock protein 70 (HSP70) serve as biomarkers in Antarctica for future ocean acidification, warming and salinity stress? [Text] / N. A. Yusof, M. Masnoddin, J. Charles, Y. Q. Thien, F. N. Nasib, C. M. V. L. Wong, A. M. A. Murad, N. M. Mahadi, I. Bharudin // Polar Biology. - 2022. - P. 1-24.

184) Zhang, H. Glutathionylation of the bacterial Hsp70 chaperone DnaK provides a link between oxidative stress and the heat shock response [Text] / H. Zhang, J. Yang, S. Wu, W. Gong, C. Chen, S. Perrett // Journal of Biological Chemistry. - 2016. - V. 291. - №. 13. - P. 6967-6981.

185) Zhang, T. Aggregate-reactivation activity of the molecular chaperone ClpB from Ehrlichia chaffeensis [Text] / T. Zhang, S. Kedzierska-Mieszkowska, H. Liu, C. Cheng, R. R. Ganta, M. Zolkiewski // PLoS One. - 2013. - V. 8. - №. 5. - P. e62454.

186) Zhao, L. The Hsp70 chaperone system stabilizes a thermo-sensitive subproteome in E. coli [Text] / L. Zhao, G. Vecchi, M. Vendruscolo, R. Körner, M. Hayer-Hartl, F. U. Hartl // Cell reports. - 2019. - V. 28. - №. 5. - P. 1335-1345. e6.

187) Zhu, X. et al. Structural analysis of substrate binding by the molecular chaperone DnaK [Text] // Science. - 1996. - V. 272. - №. 5268. - P. 1606-1614.

188) Zolkiewski, M. Aggregate reactivation mediated by the Hsp100 chaperones [Text] / M. Zolkiewski, T. Zhang, M. Nagy // Archives of biochemistry and biophysics. - 2012. -V. 520. - №. 1. - P. 1-6.

189) Zwirowski, S. Hsp70 displaces small heat shock proteins from aggregates to initiate protein refolding [Text] / S. Zwirowski, A. Klosowska, I. Obuchowski, N. B. Nillegoda, A. Pirog, S. Zi?tkiewicz, B. Bukau, A. Mogk, K. Liberek // The EMBO journal. - 2017. - V. 36. - №. 6. - P. 783-796.

Приложение 1

1 Получение плазмид

1.1 Получение плазмид для сверхпродукции рекомбинантных белков AlIbpAHis6, AlIbpAAN12His6, AlIbpAAN25Ks6, AlIbpAAC14Ks6, AlIbpAAN12C14His6, AlIbpAAN25C14His6, AlIbpAN11N12His6, AlIbpASEPHis6, AlIbpASEPAN12His6, AlIbpASEPAN25His6

С геномной ДНК A. laidlawii клонировали фрагменты ДНК, содержащие полноразмерный и укороченные гены ibpA, используя праймеры IbpA_N For/IbpA_C Rev, IbpA_N12 For/IbpA_C Rev, IbpA_N25 For/IbpA_C Rev, IbpA_N For/IbpA_C14 Rev, IbpA_N12 For/IbpA_C14 Rev, IbpA_N25 For/IbpA_C14 Rev, IbpA_2F For/IbpA_C Rev, IbpA_N For/IbpA_SEP Rev, IbpA_N12 For/IbpA_SEP Rev, IbpA_N25 For/IbpA_SEP Rev (Таблица 1). Полученные фрагменты выделяли из геля после электрофореза (Рисунок 1).

Ml М 2 34 56 М 7 8 9 10

Ш

Рисунок 1 - ПЦР-продукты амплификации с праймеров: IbpA_N For/IbpA_C Rev, 2 -IbpA_N For/IbpA_C14 Rev, 3 - IbpA_N12 For/IbpA_C Rev, 4 - IbpA_N25 For/IbpA_C Rev, 5 - IbpA_N12 For/IbpA_C14 Rev, 6 - IbpA_N25 For/IbpA_C14 Rev, 7 - IbpA_2F For/IbpA_C Rev, 8 - IbpA_N For/IbpA_SEP Rev, 9 - IbpA_N12 For/IbpA_SEP Rev, 10 -IbpA_N25 For/IbpA_SEP Rev в 1% агарозном геле, М - ДНК маркер молекулярного веса

Для получения конструкций pET15b-AlIbpA, pET15b-AlIbpAAN12, pET15b-

AlIbpAAN25, pET15b-AlIbpAAC14, pET15b-AlIbpAAN12C14, pET15b-AlIbpAAN25C14,

132

рЕТ15Ь-ЛЛЬрЛШШ12, рЕТ15Ь-АЛЬрАЗЕР, pET15b-AЛbpASEPAШ2, рЕТ15Ь-AЛbpASEPAN25 использовали плазмиду рЕТ15Ь. Вектор рЕТ15Ь рестрицировали по сайту ВатН1 и дефосфорилировали. Рестрицированную плазмиду рЕТ15Ь очищали из геля после электрофореза (Рисунок 2).

Рисунок 2 - Рестрицированная плазмида pET15b. М - ДНК маркер молекулярного веса, 1 - плазмида pET15b, 2 - рестрицированная плазмида pET15b

Выделенные фрагменты, содержащие гены ibpA, лигировали в рестрицированный вектор pET15b с получением конструкций pET15b-A/IbpA, pET15b-A/IbpAAN12, pET15b-A/IbpAAN25, pET15b-A/IbpAAC14, pET15b-A/IbpAAN12C14, pET 15b-A/IbpAAN25 С14, pET15b-A/IbpAN11N12, pET15b-A/IbpASEP, pET15b-A/IbpASEPAN12, pET15b-A/IbpASEPAN25. Лигазными смесями трансформировали штамм E. co/i XLI-Blue, рекомбинантные клетки высевали на LA с ампициллином.

После трансформации, наряду с клонами, несущими плазмиду со вставкой гена, могли образоваться клоны, несущие исходный вектор. Это связано с тем, что при лигировании вектор мог замкнуться по липким концам сам на себя. Для того, чтобы определить произошла ли вставка в векторе, проводили ПЦР-анализ используя праймеры T7 prom / T7 term. Негативным контролем служили исходные плазмиды (Рисунок 3).

Рисунок 3 - ПЦР-скрининг на наличие вставок генов ibpA в вектор pET15b. ПЦР-продукты амплификации с праймеров T7 prom / T7 term в 1% агарозном геле. ПЦР-продукты с клонов, трансформированных: 1-8 - pET15b-A/IbpA, К- с исходной плазмиды pET15b, М - ДНК маркер молекулярного веса

Из 46 проанализированных клонов все 46 несли плазмиды, имеющие вставку-фрагмент, по молекулярной массе соответствующую генам ibpA. Для получения сверхпродуцентов белков A/IbpA, выделяли плазмиды и трансформировали ими лабораторный штамм E. co/i BL21(D3).

1.2 Получение плазмид для сверхпродукции рекомбинантных белков

A/DnaKsT и A/ClpBsT

1.2.1 Оптимизация генетического кода dnaK и c/pB Acho/ep/asma /aid/awii

Для экспрессии белков A/DnaK и A/ClpB в клетках E. co/i стала необходимость

провести оптимизацию генетического кода генов dnaK и c/pB A. /aid/awii. Данные по

оптимизации были получены с помощью программы GenSmart Codon Optimization,

134

которая позволяет оптимизировать последовательность гена для максимальной экспрессии в клетках Е.соН, с сохранением его аминокислотной последовательности.

В результате выравнивания нами было выявлены триплеты, требующие замены. Результаты выравнивания оптимизированной и неоптимизированной последовательностей ДНК, кодирующих белки АЮпаК и А/С1рВ представлены на рисуноках 4 и 5, соответственно.

Рисунок 4 - Выравнивание оптимизированной и неоптимизированной последовательностей ДНК, кодирующих белки АШпаК. Красными рамками показаны

кодоны требующие замены

Рисунок 5 - Выравнивание оптимизированной и неоптимизированной последовательностей ДНК, кодирующих белки A/ClpB. Красными рамками показаны

кодоны требующие замены

2 Очистка рекомбинантных БТШ20, БТШ70 и БТШ100 A. /aid/awii

2.1 Очистка рекомбинантных белков A/IbpAHis6, A/IbpAAN12His6, A/IbpAAN25His6,

A/IbpAAC14His6, A/IbpAAN12C14His6, A/IbpAAN25C14His6, A/IbpAN11N12His6,

A/IbpASEPHis6, A/IbpASEPAN12His6, A/IbpASEPAN25His6

Для препаративной очистки белков в 500 мл среды LB с соответствующим

антибиотиком засевали 25 мл ночной культуры рекомбинантного штамма E. co/i и

инкубировали с качанием при 37 °С до ОП6оо=0.8. Далее к культуре добавляли ИПТГ

136

до конечной концентрации 1 мМ, и культивировали 4 ч с качанием при 30 °С. Клетки из культуральной жидкости собирали путем центрифугирования и готовили клеточные экстракты как описано в Материалах и методах, а затем использовали для аффинной хроматографии.

Хроматографию белков, содержащих гис-tag проводили на №-ЭТА сефарозе на колонках объемом 1-5 мл. Колонку уравновешивали путем промывания пятью объемами буфера HisW. Затем наносили подготовленный клеточный экстракт со скоростью 0.5 мл/мин. Колонку промывали буфером HisW до снижения оптической плотности элюата до значения 0.01 при длине волны Х=280. Элюцию проводили буфером при скорости 0.5 мл/мин. Элюат собирали фракциями по 1 мл и анализировали с помощью ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях (Рисунок 6).

Рисунок 6 - Очищенные рекомбинантные белки АЛЬрА^б: М - маркер белкового веса, 1 - АЛЬрА^б, 2 - АЛЬрАДШ2шб, 2 - АЛЬрАДШ5шб, 4 -АЛЪрАДШ2С14н«б, 5 - АЛЬрАДШ5С14н^б, б - АЛЬрАДС14н^б, 7 -АЛЬрАШШШ^б, 8- АЛЪрАйЕРн^, 9 - АЛЬрАйЕРДШ2н^, 10 -АЛЬрАйЕРДШ5н^б

Белки были очищены в среднем в 10 раз до электрофоретической гомогенности (Таблица 1).

Таблица 1 - Очистка белков АЛЬрА^б, АЛЬрАДШ2кэб, АЛЬрАДШ5шэб, АЛЬрАДСМ^б, АЛЬрАДШ2С14ш8б, АЛЬрАДШ5С14^б, A/IbpAN11N12нlsб, АЛЬрАйЕР^б, AЛbpASEPДN12нisб, AЛbpASEPДN25нisб при помощи хроматографии на №-ЭТА сефарозе.

Белок Концент Общее Общее Степень

рация количество количество очистки

белка экстракта/эл белка (мг) белка

(мг/мл) юата (мл)

I* II* I II I II I II

АЛЪрАшзб б 4 5 2 30 8 1 б

AЛbpAДN12нisб 7 5 5 2 35 10 1 б

AЛbpAДN25нisб б 4 5 2 30 8 1 б

А ЛbpAДN 12С14нisб 13 9 5 2 б5 18 1 б

AЛbpAДN25С14нisб 14 10 5 2 70 20 1 б

AЛbpAДС14нisб 11 8 5 2 55 1б 1 б

АЛЬрАШ1Ш2^б 9 7 5 2 45 14 1 б

AЛbpASEPнisб б 4 5 2 30 8 1 б

AЛbpASEPДN12нisб б 4 5 2 30 8 1 7

AЛbpASEPДN25нisб 9 7 5 2 45 8 1 7

* I - Клеточный экстракт II* - Элюция

2.2 Очистка рекомбинантных белков АШпаКйт и А/С1рВйт

Для получения штаммов-продуцентов белков АЮпаКйт и А/С1рВйт штамм Е. со/1 BL21(DE3) был трансформирован плазмидами: рЕТ28а-АШпаК и рЕТ28а-А/С1рВ, обеспечивающими сверхпродукцию рекомбинантных белков. Рекомбинантные белки были очищены до электрофоретической гомогенности с помощью аффинной хроматографии на стреп-тактин сефарозе (Рисунок 7, Таблица 2).

10075-

63-

Рисунок 7 - Очищенные рекомбинантные рекомбинантные белки А/С1рВйт и A/DnaKsт. Бенды соответствуют молекулярным массам ~б5,б83 кДа для АШпаК (АВХ811б8.1) и ~80,107 кДа для А/С1рВ (АВХ81733.1)

Таблица 2 - Очистка белков АЮпаКйт и А/С1рВйт при помощи хроматографии на стреп-тактин сефарозе.

Белок Концентрация белка (мг/мл) Общее количество экстракта/элюата (мл) Общее количество белка (мг) Степень очистки белка

*! II* I II I II I II

АШпаКйт 10 8 10 4 100 32 1 б

А/С1рВйт б 4 10 4 б0 1б 1 7

* I - Клеточный экстракт II - Элюция

2.3 Получение штаммов Е. со/1 с инактивированными генами белков теплового

шока

Нокаутирование генов БТШ (¡ЬрА, 1ЬрВ, ¡ЬрАВ, dnaK и с/рВ) в клетках Е. соН проводили путем замены целевого гена на кассету устойчивости к антибиотику (Рисунок 14). Генетическая конструкция состояла из гена устойчивости к антибиотику, фланкированного 5' и 3' областями целевого гена. На первом этапе, используя праймеры из таблицы 1, отдельно амплифицировали все три фрагмента ДНК, которые затем сшивали за счет наличия запланированого участка гомологии в праймерах (Рисунок 15). Полученной конструкцией трансформировали клетки Е. со/1 BL21(DE3)

содержащие вектор pSIM5-tet [Edelmann & Berghoff, 2019]. Отбор клонов с нокаутированным геном проводили путем высева на селективную среду с антибиотиком и дальнейшим ПЦР трансформантов с использованием фланкирующих генетическую конструкцию праймеров IbpA L For/ IbpB R Rev, DnaK L For/ DnaK R Rev, ClpB L For/ ClpB R Rev (Таблица 1), комплементарных к 5' и 3' концам нокаутирующей конструкции (Рисунок 8В, 9Г).

Для нокаутирования гена ibpA, с геномной ДНК E. coli первый фрагмент синтезировали используя праймеры IbpA L For/ IbpA L Rev; вторым фрагментом являлся ген устойчивости к канамицину синтезированный из плазмиды PDG1661 используя праймеры Km for/ rev, третий фрагмент синтезировали с геномной ДНК E. coli используя праймеры IbpA R For/ IbpB R Rev (Рисунок 8А). Синтезированные фрагменты сшивали с помощью ПЦР с использованием пары праймеров IbpA L For/ IbpB R Rev (Рисунок 8Б).

Для нокаутирования гена ibpB, с геномной ДНК E. coli первый фрагмент синтезировали используя праймеры IbpA L For/ IbpA L Rev; вторым фрагментом являлся ген устойчивости к канамицину синтезированный из плазмиды PDG1661 используя праймеры Km for/ rev, третий фрагмент синтезировали с геномной ДНК E. coli используя праймеры IbpB R For/ IbpB R Rev (Рисунок 8А). Синтезированные фрагменты сшивали с помощью ПЦР с использованием пары праймеров IbpA L For/ IbpB R Rev (Рисунок 8Б).

Для нокаутирования генов ibpAB, с геномной ДНК E. coli первый фрагмент синтезировали используя праймеры IbpA L For/ IbpB L Rev; вторым фрагментом являлся ген устойчивости к канамицину синтезированный из плазмиды PDG1661 используя праймеры Km for/ rev, третий фрагмент синтезировали с геномной ДНК E. coli используя праймеры IbpB R For/ IbpB R Rev (Рисунок 8А). Синтезированные фрагменты сшивали с помощью ПЦР с использованием пары праймеров IbpA L For/ IbpB R Rev (Рисунок 8Б).

Нокаутирование генов clpB и dnaK в клетках E. coli проводили путем замены целевого гена на кассету устойчивости к антибиотику спектиномицину (Sp) и хлорамфениколу (Cm) соответственно, фланкированного 5' и 3' областями целевого гена. На первом этапе отдельно амплифицировали три фрагмента ДНК (Рисунок 15).

Для нокаутирования гена dnaK, с геномной ДНК E. coli первый фрагмент синтезировали используя праймеры DnaK L For/ DnaK L Rev; вторым фрагментом являлся ген устойчивости к канамицину синтезированный из плазмиды PDG1661 используя праймеры Sp for/ rev, третий фрагмент синтезировали с геномной ДНК E. coli используя праймеры DnaK R For/ DnaK R Rev (Рисунок 9А). Синтезированные фрагменты сшивали с помощью ПЦР с использованием праймеров праймеров DnaK L For/ DnaK R Rev (Рисунок 9В).

Для нокаутирования гена clpB, с геномной ДНК E. coli первый фрагмент синтезировали используя праймеры ClpB L For/ ClpB L Rev; вторым фрагментом являлся ген устойчивости к канамицину синтезированный из плазмиды PDG1661 используя праймеры Cm for/ rev, третий фрагмент синтезировали с геномной ДНК E. coli используя праймеры ClpB R For/ ClpB R Rev (Рисунок 9Б). Синтезированные фрагменты сшивали с помощью ПЦР с использованием праймеров праймеров Синтезированные фрагменты сшивали с помощью ПЦР с использованием праймеров праймеров DnaK L For/ DnaK R Rev (Рисунок 9B).

Рисунок 8 - Получение генетических конструкции для нокаутирования генов IbpA и IbpB в клетках E. coli. Амплифицировали ген устойчивости к канамицину (А) и 5' и 3' области генов IbpA и IbpB : IbpA L for/ IbpA L rev (1), IbpB R for /IbpB R rev (2), IbpA R for /IbpB R rev (3), IbpA L for/ IbpB L rev (4), и синтезировали полные фрагменты (Б), которыми трансформировали E. coli. Клоны с нокаутированным генами отбирали

методом ПЦР: B - с использованием пар праймеров IbpA L For/ IbpB R Rev, в качестве отрицательного котроля гДНК E. coli BL21(DE3); Г - с использованием пар праймеров Km for/ Km rev, в качестве положительного контроля пДНК pKT25

А В

DL Sp

-1020

Б Г

Рисунок 9 - Получение генетических конструкции для нокаутирования генов clpB и dnaK в клетках E. coli. (A, Б) Амплифицированные гены устойчивости к спектиномицину и хлорамфениколу и 5' и 3' области генов clpB и dnaK, (В) синтезировали полные фрагменты, которыми трансформировали E. coli BL21(DE3) (Г) ПЦР -скрининг трансформантов на вставку

3 Определение температуры денатурации различных белков

Температуру денатурации (Tmso) белков Таблицы 3 исследовали с точки зрения скорости денатурации белков при нагревании от 10 °C до 95 °C в присутствии красителя SYPRO Orange, как описано в Материалах и методах.

Таблица 3- температура денатурации (Tmso) предполагаемых субстратных белков AllbpA.

Белок Каталожный номер (Sigmaaldrich) Tm50, 0C

Алкогольдегидрогеназа 55689 57±1.1

Бычий инсулин I6634 48±5.1

Человеческий трансферрин T3705 58±2.3

Ингибитор трипсина 10109886001 73±1.2

Каталаза C9322 53±2.5

AlIbpAHis6 - 56±2.5

Рисунок 10 - Конформация A/FtsZsт в отсутствии ГТФ при термообработке в одиночку (А) или в присутствии АЛЬрАшб (Б). Белки инкубировали в течение 10 мин при 4 °С, 30 °С, 37 °С или 42 °С, сшивали глутаровым альдегидом и анализировали с помощью трансмиссионной электронной микроскопии.