«Субъединица PBAF комплекса, ремоделирующего хроматин, PHF10 опосредует транскрипционную активность онкогена MYC» тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Татарский Евгений Вячеславович

• Татарский Евгений Вячеславович
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Татарский Евгений Вячеславович

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и степень проработанности темы

Цели и задачи

Научная новизна и практическая значимость

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту:

Степень достоверности и апробация результатов

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Устройство хроматина

1.1.1. Нуклеосомы

1.1.2. Хроматиновые петли

1.1.3. Топологически ассоциированные домены (TADs)

1.1.4. Хроматиновые компартменты

1.1.5. Регуляция организации хроматина

1.2. Модифицирующие комплексы

1.2.1. Ремоделирующие комплексы (ISWI, CHD, INO80, SWI/SNF)

1.2.2. SWI/SNF комплекс млекопитающих

1.2.3. Комплекс PBAF

1.2.4. Огруктура PBAF комплекса

1.2.5. Устройство АТФазного модуля

1.2.6. Устройство ARP модуля

1.2.7. Устройство Base модуля

1.2.8. SMARCB1 (BAF47)

1.2.9. ARID2 (BAF200)

1.2.10. Сборка PBAF комплекса

1.2.11.Принципы ремоделирования хроматина (модели)

1.2.12. Роль PBAF комплекса в развитии организмов

1.2.13. Роль PBAF комплекса в онкогенезе

1.3. Онкоген MYC

1.3.1. Структура MYC

1.3.2. Взаимодействие гетеродимера MYC-MAX с последовательностью E-box

1.3.3. Регуляция MYC

1.3.4. Роль MYC в регуляции экспрессии генов

1.3.5. Роль МУС в онкогенезе

1.3. PHF10 - субъединица SWI/SNF комплекса

1.3.1. Структура и изоформы PHF10

1.3.2. Устройство PHD домена

1.4. Регуляция PHF10

1.4.1. Фосфорилирование

1.4.2. Роль PHF10 в регуляции экспрессии генов

2.1. Материалы, использованные в работе

2.1.1. Бактериальные среды

2.1.2. Клеточные линии

2.1.3. Ферменты и реактивы

2.1.4.Антител а

2.1.5. Праймеры

2.2. Методы, использованные в работе

2.2.1. Работа с клетками

2.2.2. Получение стабильных линий

2.2.3. Анализ клеточного цикла

2.2.4. Окрашивание SA-0-gal

2.3. Работа с нуклеиновыми кислотами

2.3.1. Приготовление компетентных клеток

2.3.2. Трансформация бактерий

2.3.3. Щелочное выделение плазмидной ДНК

2.3.4. Обработка ферментами рестрикции

2.3.5. Лигирование

2.3.6. Гель-электрофорез ДНК

2.3.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2.3.8. Клонирование

2.3.9. Генетическая инактивация PHF10 или MYC

2.3.10. Выделение РНК

2.4. Работа с белками

2.4.1. Получение белковых экстрактов из клеток

2.4.2. Осаждение белков антителами (иммунопреципитация)

2.4.3. Белковый гель-электрофорез

2.4.5. Вестерн-блот анализ

2.4.6. Люциферазный репортер

2.4.7. Иммунопреципитация хроматина(СЫР)

2.4.8. Проксимальный лигирующий анализ (PLA)

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Экспрессия онкогена MYC коррелирует с экспрессией PHF10

3.2. MYC-ассоциированные PBAF комплексы клеток меланомы содержат PHF10

3.3. PHF10 способствует взаимодействию MYC с PBAF комплексом

3.4. PHF10 взаимодействует с MYC через MBI, MBII и CTD домены

3.5. PHF10 участвует в MYC-зависимой транскрипции

3.6. Взаимодействия MYC и PHF10 происходят в ядре клетки на хроматине

3.7. PHF10 и MYC регулируют экспрессию схожего набора генов

3.8. PHF10 локализуется на промотрах MYC-зависимых генов и необходим для активации их транскрипции

3.9. Истощение PHF10 вызывает клеточное старение и задержку G0/G1 фазу клеточного цикла в клетках меланомы

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ТЕРМИНОВ

АДФ - аденозиндифосфат

АТФ - аденозинтрифосфат

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

BAF - (BRG1- или BRM-ассоциированные факторы) - человеческий аналог комплекса SWI / SNF; подсемейство АТФ-зависимых комплексов ремоделирования хроматина

CRISPR-Cas9 - метод направленного редактирования геномов

CTCF (CCCTC-binding factor) - инсуляторный высоко консервативный

белок

E-box (enhancer box) - последовательность ДНК, узнаваемая гетеродимером MYC-MAX

FBS (fetal bovine serum) - эмбриональная телячья сыворотка

Hi-C - метод идентификации фрагментов ДНК находящихся близко в

пространстве

ncBAF - non-canonical BAF PBAF - polybromo-associated BAF

PDSM (phosphorylation-dependent sumoylation motif) - мотив

сумоилирования, зависящий от фосфорилирования

PEI (polyethylenimine) - полиэтиленимин

siРНК - small interfering РНК, малые интерферирующие РНК

smFRET (single molecule fluorescence resonance energy transfer) - это

биофизический метод , используемый для измерения расстояний в

масштабе 1-10 нанометров в отдельных молекулах.

mQ - деионизированная вода (H2O)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему ««Субъединица PBAF комплекса, ремоделирующего хроматин, PHF10 опосредует транскрипционную активность онкогена MYC»»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность и степень проработанности темы

Генетическая информация млекопитающих зашифрована в молекулах ДНК, которые находятся в ядрах клеток сильно компактизованы благодаря белкам и в первую очередь, гистонам. Гистоны не только позволяют эффективно упаковать молекулу ДНК, но также несут эпигенетические метки, которые позволяют регулировать экспрессию генов. Считывание данных меток осуществляется с помощью хроматин -ремоделирующих комплексов. В ответ на внешние и внутренние сигналы эти комплексы изменяют структуру хроматина и доступность генетического материала в ядре клетки и, соответственно, контролируют многие жизненно важные процессы, такие как пролиферация, рост и дифференцировка клеток. Нарушения в хроматин-ремоделирующих комплексах часто происходят в опухолевых заболеваниях, поэтому понимание механизмов действия комплексов, ремоделирующих хроматин, позволит лучше понять не только фундаментальные аспекты регуляции транскрипции в нормальных и опухолевых клетках, но и разрабатывать новые лекарства для борьбы с опухолевыми заболеваниями.

Меланома, является злокачественным опухолевым заболеванием, происходящим из пигментных клеток, меланоцитов. В мире ежегодно выявляется более 300 тысяч случаев меланомы, из них более 4800 случаев в России[1]. Лечение меланомы значительно улучшилось в последние годы, благодаря развитию иммунотерапии и таргетной терапии, но прогноз для пациентов с метастатической меланомой остается неблагоприятным.

В развитии метастатической меланомы большую роль играет онкоген МУС (белок MYC). Увеличенное количество MYC наблюдается в 60-70% злокачественных опухолей человека[2]. MYC является общим

транскрипционным активатором, который стимулирует транскрипцию более 3000 генов, и особенно генов клеточного цикла. MYC взаимодействует с разнообразными эпигенетическими факторами и ремоделирующими комплексами хроматина, привлекая их к ДНК и гистонам. Уровень MYC значительно увеличен в меланомах, особенно при метастазировании[3].

В клетках эукариот ремоделирование нуклеосом осуществляется комплексами семейства SWI/SNF. В клетках млекопитающих в это семейство входят комплексы PBAF, ВЛБ и псВЛБ. Регуляция работы SWI/SNF комплекса часто нарушена в меланомах. Например, повышение уровня коровой субъединицы BRG1 в метастатической меланоме способствует выживанию клеток при действии химиотерапии [4]. В состав PBAF комплекса входит субъединица РОТ10 (BAF45a). РОТ10 играет важную роль в поддержании пролиферации стволовых клеток и дифференцировке. Ранее нами было показано что уровень РОТ10 увеличен в образцах меланомы пациентов [5].

Цели и задачи

Целью данной работы было изучение взаимодействий с белком MYC и определение роли РОТ10 в транскрипции MYC-зависимых генов. Для этого были сформулированы следующие задачи:

1. Установить взаимодействие между MYC и комплексом PBAF, содержащим РОТ10;

2. Установить взаимодействие между MYC и изоформами РОТ10, определить домены MYC, необходимые для этих взаимодействий;

3. Определить роль РОТ10 в транскрипции MYC-зависимых генов в линиях меланомы А375;

4. Определить влияние РОТ10 на клеточный цикл и проявление

фенотипа старения клеток в линиях меланомы.

Научная новизна и практическая значимость

До начала этой работы нами были получены предварительные данные о взаимодействии MYC и РНР10. В связи с этим было запланировано изучить их взаимодействие и влияние на регуляцию друг друга. В этой работе были впервые показаны эти взаимодействия, и выявлены домены MYC, необходимые для такого взаимодействия. Было впервые показано, что РОТ 10 необходим для связывания MYC с РВЛБ комплексом и опосредует транскрипцию части MYC - зависимых генов в клеточных культурах меланомы, особенно генов клеточного цикла. Было показано что нокдаун РОТ10 вызывает индукцию фенотипа клеточного старения в клетках меланомы, такой же фенотип развивается в клетках при нокдауне МУС.

Установление взаимодействия между белками MYC и РОТ10 является практически значимым не только для фундаментальной науки, но и для потенциальной разработки новых препаратов. Ингибиторы активности MYC находятся в доклинических и клинических испытаниях, но их внедрение в клинику затрудняется большой токсичностью. Таргетных ингибиторов BAF и PBAF комплексов до сих пор не существует. Данные, представленные в работе могут помочь разработать ингибиторы этих взаимодействий, снижающих MYC зависимую транскрипцию.

Методология и методы исследования

Работа выполнена с использованием современных методов молекулярной и клеточной биологии и биоинформатического анализа.

Положения, выносимые на защиту:

1. MYC взаимодействует с PBAF комплексом, содержащим PHF10

2. Изоформы PHF10 взаимодействуют с MBI, MBII и CTD доменами MYC. Взаимодействия MYC с изоформами PHF10 происходят в ядре клетки на хроматине

3. PHF10 участвует в MYC-зависимой транскрипции и локализуется на MYC-зависимых промоторах

4. PHF10 как и MYC подавляет экспрессию генов клеточного цикла и репарации в клеточных линиях меланомы А375. Снижение экспрессии PHF10 и снижение экспрессии MYC приводят к накоплению клеток в G0/G1 фазе клеточного цикла и развитию фенотипа «клеточного старения» в клеточных линиях меланомы

Степень достоверности и апробация результатов

Публикации в рецензируемых журналах: 1. Татарский Е.В., Георгиев Г.П., Сошникова Н.В. Онкоген c-MYC контролирует экспрессию PHF10, субъединицы ремоделирующего хроматин комплекса PBAF, в клеточной линии SW620. Доклады Академии наук. 2019. Т. 484. №5. C. 633-636. doi: 10.31857/S0869-56524845633-636

1. Soshnikova NV, Tatarskiy EV, Tatarskiy VV, Klimenko NS, Shtil AA, Nikiforov MA, Georgieva SG. PHF10 subunit of PBAF complex mediates transcriptional activation by MYC. Oncogene. 2021 doi: 10.1038/s41388-021-01994-0

Основные результаты данной работы представлены на конференциях: 1. E. Tatarskiy, A. Sheinov, N. Soshnikova. Mutual regulation of oncogene c-MYC and subunits of PBAF chromatin remodeling complex. FEBS

OPEN BIO. Krakow. Poland. 06/07/2019 - 11/07/2019. - V.9(1), P. 21. doi:10.1002/2211-5463.12674

1. Е.В. Татарский, А.А. Шейнов, С.Г. Георгиева, Н.В. Сошникова. Взаимная регуляция субъединиц PBAF хроматин -ремоделирующего комплекса и CMYC. VI молодежная конференция по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН. Санкт-Петербург. Россия. 25/04/2018 - 27/04/2018. с.112.

Личный вклад соискателя

Автор внес существенный вклад в получение изложенных в работе научных данных и их анализе. Все эксперименты, представленные в данной работе выполнены автором или при его участии. Полногеномное секвенирование библиотек мРНК выполнено компанией «Евроген», биоинформатический анализ выполнен Натальей Клименко (ИБГ РАН). Автор принимал участие в написании статей и представление их результатов на конференциях.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, четырех разделов («Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение»,) и выводов. Работа изложена на 107 страницах, содержит 35 рисунка. Список литературы включает 159 источников.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Устройство хроматина

ДНК эукариот локализована в ядре клетки и находится в сильно компактизированном состоянии в виде хромосом. Самые большие хромосомы содержат сотни миллионов пар нуклеотидов, которые упакованы и упорядочены с помощью белков, и имеют несколько уровней компактизации (рис. 1). Доступ транскрипционных факторов к ДНК зависит от степени компактизации хроматина [6]. В зависимости от компактизации различают конденсированный и эухроматин.

А/В

компартменты

БиЬ-ТАОы

\

стся

ДНК

о

Когезиновое кольцо

Рис.1 Схема уровней компактизации ДНК. [7]

1.1.1. Нуклеосомы

Первым уровнем компактизации хроматина является нуклеосома -структура 6,5 нм в диаметре образована октамером гистонов, который обвивает 146 пара оснований ДНК, делая 1,6 витка.

ДНК в нуклеосоме поддерживает B - структуру, в которой пары оснований скручены и наклонены в разной степени вдоль нуклеосомы. Октамер гистонов взаимодействует в основном с фосфатным скелетом, и позитивно заряженные остатки аргинина и лизина входят в малые бороздки ДНК в суперскрученных участках. В сумме у ДНК есть более 100 контактирующих точек вдоль пути обертывания нуклеосомы. Данные взаимодействия стабилизируют искривление изначально прямой B-формы ДНК. Различные структуры нуклеосомы делают возможным удлинение ДНК на 1 пару оснований около SHL(superhelical locations) +-2 и SHL +-5, что свидетельствует о том что нуклеосома может вмещать ДНК различной длины в данных позициях, что может играть роль при транслокации ДНК вдоль нуклеосомы[8].

Октамер гистонов образован двумя гетеродимерами гистонов H3 и H4, который окружен двумя гетеродимерами H2A и H2B гистонов. Данная структура называется гистоновым кором и она имеет фиксированные 8 N-концевых и 2 C-концевых конца, которые могут пост-трансляционно модифицироваться и узнаются многими белковыми комплексами [9].

1.1.2. Хроматиновые петли

Следующим уровнем компактизации являются хроматиновые петли. В среднем их длина составляет 1000 пар нуклеотидов. Хроматиновые петли важны для регуляции, так как позволяют сближаться регуляторным элементам, таким как энхансеры, сайленсеры, промоторы и инсуляторы, в пространстве.

У позвоночных хроматиновые петли формируются и стабилизируются через взаимодействие с архитектурным белком CCCTC -binding factor (CTCF) и когезиновыми комплексами. Данные Hi-C секвенирования (метод идентификации фрагментов ДНК находящихся близко в пространстве) показали, что CTCF-связывающие мотивы находятся в противоположных ориентациях и, таким образом, связывают CTCF, четко позиционируя его в пространстве [10]. Нахождение когезина в геноме зависит от наличия CTCF, что означает что CTCF привлекает когезин на таргетные участки, более того было показано что N-концевой участок CTCF необходим для удержания когезина [11], а C-концевой участок CTCF необходим для его димеризации [12]. CTCF содержит 11 цинковых пальцев и использует различные их сочетания для связывания ДНК с различными белками [13].

Существует несколько гипотез относительно того, как формируются хроматиновые петли. Одна из гипотез предполагает, что экструзия ДНК происходит из-за градиента когезина[14]. Согласно другой гипотезе когезиновый комплекс пропускает ДНК через себя за счёт энергии гидролиза АТФ[15]. Еще одна гипотеза предполагает что экструзия происходит за счёт активности РНК-полимеразы II (RNApol II) [16-19].

1.1.3. Топологически ассоциированные домены (TADs)

Следующим уровнем организации являются топологически ассоциированные домены. С помощью 5C и Hi-C методов было показано что хромосомы пространственно разделены на участки размером около 900 тысяч пар нуклеотидов [20-22] (рис. 2). Элементы внутри TAD активно взаимодействуют друг с другом, и почти не взаимодействуют с элементами вне TAD. CTCF на границах TAD располагаются в противоположных ориентациях и изменение ориентации или удаление CTCF может сместить границу TAD или даже убрать ее [23,24].

С помощью метода с последующим секвенированием высокого разрешения было выявлено существование доменов меньшего размера (около 200кб) которые были названы sub-TADы. Эти домены обогащены специфическими хроматиновыми маркерами, которые связаны с активацией транскрипции или с транскрипционной репрессией[25].

10 kb Resolution

H3K27me3 -— i iM.m___ it I... i M

НЗКЗбтеЗ _____■*- ' I | || .At. Ш - -

65.5 Mb chr2 73.2 Mb

Рис. 2 Hi-C карта с обозначенными топологически ассоциированными

доменами. 10kb resolution - разрешение 10 тысяч пар нуклеотидов, mb -

миллион пар нуклеотидов.[6]

Границы TAD доменов обогащены инсуляторными белками, такими как CTCF (детектируются в ~76% всех границ), активными транскрипционными маркерами, такими как H3K4me3 и H3K36me3, зарождающимися транскриптами, генами домашнего хозяйства (присутствуют в границах ~34% TAD), а также повторяющимися элементами [22].

Считается, что TAD консервативны между клеточными линиями и между разными видами [22,26], однако степень консервативности до конца не ясна. Многие TAD млекопитающих могут быть подразделены на несколько более маленьких subTAD доменов [27,28]. В результате

получается иерархическая организация доменов, классификация которых зависит от разрешения метода Hi-C. Из-за этого многие авторы используют разную номенклатуру для хромосомных доменов. Ранние исследования, которые использовали меньшее разрешение Hi-C нашли 2200 доменов, из которых 50-72% консервативны между разными клеточными линиями и 54-76% консервативны между человеком и мышью[22]. Использование более высокого разрешения Hi-C выявило наличие 9274 доменов в клеточной линии GM12878, из которых 54% консервативны с другими клеточными линиями[26].

1.1.4. Хроматиновые компартменты

Исследования организации хроматина с помощью Hi-C и с помощью секвенирования спаренных концов (paired end tags PET) (ChiA-PET) выявили более высокий уровень компактизации хроматина, называемый "хроматиновые компартменты". Хроматиновые компартменты разделяют на компартменты A, которые присущи открытому хроматину, и компартменты B, которые свойственны для закрытого состояния хроматина[29][30][10]. Компартменты типа A характеризуются высоким содержанием транскрипционно активных генов, высоким GC составом, чувствительностью к ДНКазе I и наличием гистоновых маркеров, таких как H3K9ac и H3K27ac. Компартменты типа B имеют обратные характеристики, для них характерно высокое содержание «молчащих» генов, слабая чувствительность к ДНКазе I и репрессирующие гистоновые маркеры, такие как H3K9me2, H3K9me3 и H3K27me3[31].

Некоторые ученые предполагают, что A и B компартменты содержат разные наборы мультивалентных белков, которые взаимодействуют с белками своего класса и образуют разные фазы, вследствие чего не наблюдается контактов между компартментами из разных фаз [32].

Например, фазовое отделение гетерохроматинового белка 1а (НР1а) можно наблюдать in vivo[33].

Также можно наблюдать фазовые капли в активном хроматине, там они образуются с помощью белков, содержащих внутренние неупорядоченные домены (домены без фиксированной 3D структуры) (intrinsically disordered domains), которые часто присутствуют в транскрипционных факторах и в RNApol II [34-36]. Образование фазовых капель у RNApol II зависит от гиперфосфорилирования С-концевого домена, из чего следует что фазовое разделение активного хроматина зависит от активации транскрипции [36].

На более высоком уровне хроматин организуется в хромосомные территории (по одной на каждую хромосому), которые редко смешиваются. С помощью полногеномного Hi-C анализа было показано, что взаимодействия между локусами одной и той же хромосомы происходят чаще, чем взаимодействия между разными хромосомами [29].

1.1.5. Регуляция организации хроматина

Многоуровневая компактизация хроматина позволяет клетке держать большую часть неиспользуемой генетической информации в сжатом виде, а активные гены в более открытой, доступной для транскрипционных факторов форме.

Реструктуризация хроматина происходит за счёт активности мультибелковых комплексов, ремоделирующих хроматин, и комплексов, модифицирующих хроматин. Они способны изменять плотность нуклеосом в локальном сегменте, делая участок более доступным для других белков или, наоборот, компактизируя хроматин в данном месте, закрывая его от транскрипционных факторов.

1.2. Модифицирующие комплексы

Комплексы, модифицирующие хроматин способны метилировать, ацетилировать, убиквитинировать, фосфорилировать, сумоилировать, АДФ-рибозилировать, деиминировать и изомеризовать пролин N-концевых хвостов гистонов. Существует более 60 различных аминокислотных остатков гистонов, по которым может проходить модификация[37]. Более того метилирование существует в вариантах моно-, ди- и триметил для лизинов и в виде моно- и диметил (асимметричное или симметричное) для аргининов, что еще больше расширяет спектр различных вариантов модификации гистонов. Данные модификации влияют на способность ДНК связываться с нуклеосомой, а также на доступность ДНК для регуляторных белков. Белки привлекаются и связываются с модифицированными гистонами с помощью специализированных доменов. Метилирование распознается с помощью хромо-подобных доменов Royal семейства и PHD доменами. Ацетилирование распознается бромодоменами, фосфорилирование распознается доменами белков 14-3-3[37]. Совокупность модификаций гистонов часто называют эпигенетическим или гистоновым кодом.

Метилирование лизинов гистонов H3 и H4 способствует конденсации ДНК вокруг гистонов и препятствует связыванию транскрипционных факторов с ДНК. Триметилирование H3K9, H3K27 и H4K20 чаще встречается в гетерохроматине и ассоциировано с транскрипционной репрессией, в то время как метилирования H3K4, H3K36 и H3K79 встречаются в эухроматине и связаны с транскрипционной активацией[38].

Ацетилирование гистонов сильно связано с транскрипционной активацией за счет нейтрализации заряда нуклеосом, что способствует потере их связывания с ДНК. Кроме того, ацетилированные гистоны привлекают многие коактиваторные и медиаторные белки, содержащие бромодомены. Ацетилирование хроматина происходит с помощью

гистонацетилаз (HAT), а деацетилирование с помощью гистондеацетилаз (HDAC).

Существует три главных семейства гистонацетилаз: семейство GCN5-связанных N-ацетил трансфераз (GNAT), MOZ/YBF2/SAS2/TIP60(MYST) семейство и CBP/p300 семейство [38].

Данные ацетилазы модифицируют некоторые лизины коровых гистонов, а также некоторые негистоновые белки, такие как p53, pRb и E2F и, таким образом, модулируют транскрипционную активность таргетных генов.

Гистондеацетилазы разделены на 4 класса: класс I (HDAC1-3, 8), класс II (HDAC 4-7, 9-10), класс III (сиртуины 1-7), класс IV (HDAC11).

Кроме регуляции транскрипции, модификации хроматина также регулируют и другие клеточные процессы такие как репарация повреждений ДНК, хромосомная стабильность и апоптоз. Важную роль в данных процессах играет фосфорилирование серинов гистонов [38].

Фосфорилирование серина H2A.X, варианта гистона H2A, играет важную роль в устойчивости клетки к радиации и привлечении белков ответа на повреждение ДНК [38].

1.2.1. Ремоделирующие комплексы (ISWI, CHD, INO80, SWI/SNF)

Все ремоделирующие комплексы используют энергию АТФ для реструктурирования хроматина. Филогенетический и функциональный анализы позволяют классифицировать все ремодилирующие АТФазы в РНК/ДНК хеликазном суперсемействе 2. Членов этого семейства можно разделить на 4 подсемейства хроматин-ремоделирующих комплексов: imitation switch (ISWI), chromodomain helicase DNA-binding (CHD), switch/sucrose non-fermentable (SWI/SNF) и INO80(INOsitol requiring 80). Все эти комплексы способны передвигать ДНК с помощью работы

АТФазного домена, который разрывает контакт ДНК-гистон и позволяет перемещать ДНК относительно поверхности гистона.

1. SWI/SNF комплексы облегчают доступ к хроматину для транскрипционных факторов посредством репозиционирования, скольжения или выброса нуклеосом[39]. Двумя основными комплексами являются BAF и PBAF. Недавно был идентифицирован новый неканонический комплекс, ncBAF[40]. Комплекс SWI/SNF представляет собой многосубъединичный комплекс, включающий ДНК-связывающую субъединицу (ARID1A, ARID1B или PBRM1), ферментативную субъединицу АТФазы (BRM/SMARCA2 или BRG1/SMARCA4), три основные субъединицы (SMARCB1, SMARCC1 и SMARCC2). , вспомогательные субъединицы и BRM- или BRG1-ассоциированные факторы (BAF), которые необходимы для связывания с ДНК или белками. Гетерогенность комплексов SWI/SNF связана с развитием и тканеспецифичными подтипами [41 ].

2. Комплексы ISWI участвуют в организации нуклеосом после репликации и транскрипции ДНК. В частности, они участвуют в созревании комплексов ДНК-гистон в нуклеосомы, скольжении нуклеосом и регулярном расположении нуклеосом [42]. К настоящему времени описано семь различных комплексов ISWI млекопитающих: WICH, NoRC, RSF, ACF, CHRAC, NURF и CERF. Каждый содержит одну из двух консервативных субъединиц АТФазы (SMARCA5 или SMARCA1) и вспомогательную субъединицу (субъединицы) [43]. Различные комбинации АТФаз и вспомогательных субъединиц могут влиять на ремоделирование хроматина, в частности на расстояние между нуклеосомами, и нацеливать комплекс ISWI на разные наборы генов[43][44]. Большинство комплексов подсемейства ISWI участвуют в репрессии доступности хроматина, тогда как NURF (nucleosome remodeling factor), участвует в доступе к хроматину и активации генов [43].

Кроме того, комплексы ISWI участвуют в реакции на повреждение ДНК (DDR), что делает их потенциальной мишенью в лечении рака.

3. Подсемейство CHD включает несколько комплексов, которые имеют различные функции, такие как размещение нуклеосом, экспонирование промоторов и редактирование нуклеосом [42,45]. Большинство членов CHD образуют мультисубъединичные комплексы и участвуют в ремоделировании хроматина. CHD3, CHD4 и CHD5 являются компонентами комплекса деацетилаз ремоделирования нуклеосом (NuRD), который является репрессором транскрипции и является наиболее охарактеризованным членом этого подсемейства. Комплекс NurD и метилирование ДНК работают совместно, демонстрируя, что как репрессивные гистоновые метки, так и гиперметилирование ДНК участвуют в подавлении транскрипции генов-супрессоров опухолей[46,47], подчеркивая, что в рак вовлечены множественные уровни эпигенетической регуляции.

4. Мультисубъединичные комплексы INO80 выполняют разнообразные функции, включая регуляцию транскрипции, репликацию ДНК и репарацию ДНК. Они участвуют в смещении нуклеосом и обмене димеров гистонов или вариантов гистонов. Подсемейство INO80 включает комплексы INO8O, p400 и SRCAP. Комплексы подсемейства INO80 образуют большие мультисубъединичные комплексы, которые включают каталитическую АТФазу (INO8O, p400 или SRCAP), хеликазы (RUVBL1, RUVBL2), родственные актину белки (ACTL6A, ACTR5 и ACTR8) и другие субъединицы[48]. Высокая частота изменений в субъединицах INO80 и mTORCl наблюдалась при аденокарциноме протоков поджелудочной железы и других видах рака, что позволяет предположить, что нарушение этих путей может способствовать метаболической дисрегуляции, связанной с онкогенезом[49].

1.2.2. SWI/SNF комплекс млекопитающих

Snf (sucrose nonfermenting) и swi (switch) гены впервые были обнаружены у дрожжей, с помощью скрининга, целью которого было обнаружение генов, которые контролируют индукцию suc2 гена, который кодирует энзим инвертазы или гены, которые индуцируют HO эндонуклеазу, которая нужна для смены типа спаривания (mating-type).

Был обнаружен большой блок генов, образующих комплекс, который был назван SWI/SNF по фенотипам связанным с его открытием.

Человеческий SWI/SNF содержит одну АТФазу, BRM(SMARCA2) или BRG1 (SMARCA4) и три главных коровых субъединицы - BAF155 (SMARCC1), BAF170 (SMARCC2) и BAF47 (SMARCB1). Комплексы SWI/SNF были разделены на три типа в зависимости от субъединичного состава - BRG1-associated factor (BAF) комплексы, которые содержат BAF250a(ARID1A) или BAF250b (ARID1B) субъединицы, polybromo BRG1-associated factor (PBAF) комплексы, которые содержат BAF180(PBRM1) и BAF200 (ARID2) субъединицы, и неканонические BAF (ncBAF/GBAF) комплексы.

Многие субъединицы SWI/SNF кодируются паралогами. Это позволяет комплексу SWI/SNF варьировать субъединичный состав комплекса в зависимости от типа клеток и условий[50] [51] (рис. 3).

Рис. 3 Общие комбинаторные возможности для семейств комплекса mSWI / SNF (включая тканеспецифические субъединицы) [52].

АТФ-зависимые ремоделирующие комплексы работают, напрямую нарушая гистон-ДНК контакты за счет энергии, высвобождающейся при гидролизе АТФ. В результате ремоделинга может происходить смещение, диссоциация или замена нуклеосомы [53].

Белки SWI/SNF комплекса содержат домены, взаимодействующие с модификациями «хвостов» гистонов: chromo-, bromo-, SANT, PHD домены. Наличие различных доменов у паралогичных субъединиц определяет специфичность связывания SWI/SNF комплекса с хроматином.

Для многих генов, в том числе и для генов дрожжей, на которых был открыт SWI/SNF комплекс (ho и suc2), комплекс связывается с ДНК вблизи промотора и помогает связываться с ДНК другим

транскрипционным факторам. Однако у млекопитающих комплекс может связываться на большем расстоянии от промотора [54].

1.2.3. Комплекс PBAF

Человеческими аналогами комплекса SWI/SNF являются BRG1 - или BRM-ассоциированные факторы, или Polybromo-associated BAF - PBAF. PBAF - polybromo-associated BRG1/BRM-associated factor - является АТФ-зависимым хроматин-ремоделирующим комплексом, состоящим из множества белков. Комплекс играет важную роль в регуляции хроматина, и его работа часто нарушена при развитии онкологических заболеваний[52]. Комплексы способны регулировать состояние компактизации хроматина с помощью перемещения или удаления модификации гистонов, открывая доступ к ДНК для транскрипционных факторов [42].

1.2.4. ^руктура PBAF комплекса

Комплексы BAF и PBAF содержат до 15 субъединиц в своем составе, кодируемых более чем 29 генами, что позволяет сгенерировать более 1400 вариантов комплекса[55].

Структурные исследования SWI/SNF ограничены малым разрешением электронной микроскопии комплексов дрожжей и структурами изолированных доменов. Недавнее исследование показало разрешение 7 Ä на структуре PBAF-гомологе дрожжей RSC, связанным с нуклеосомой и substrate recruitment модулем c улучшенным до 3.4 Ä[56]. Однако молекулярные механизмы организации субъединиц BAF комплекса в основном неизвестны.

Комплекс BAF/PBAF состоит из трех модулей: АТФазы, actin -related protein (ARP), и Base модуль[55] (рис. 4).

Рис. 4 Схема устройства модулей BAF/PBAF комплекса. [55]

1.2.5. Устройство АТФазного модуля

Большая часть каталитической субъединицы SMARCA4 (SWI/SNF Related, Matrix Associated, Actin Dependent Regulator Of Chromatin Subfamily C Member) (BRG1/BAF190) (521-1647 аминокислотные остатки) образует АТФазный модуль, который охватывает нуклеосому и частично обхватывает нуклеосомную ДНК (рис. 5). Две доли модуля могут находиться в открытой конформации- угол между ними более 90*, и закрытой конформации - угол около 70 градусов и существуют контакты с нуклеосомной ДНК.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Татарский Евгений Вячеславович, 2022 год

— - — -

— ^ ^ ^ ^ ^ ^ ь ^ _

^ - ——ы«« — —----- —-----

Рис. 17 Иммунопреципитация эндогенного MYC антителами против коровых и специфических субъединиц PBAF комплекса из клеток Sk-Ме129.

Для дальнейшего изучения взаимодействий между MYC и субъединцами РВЛБ комплекса нами были получены клетки другой мелономальной линии Л375 с индуцируемой экспрессией FLAG-MYC.

Антитела против субъединиц комплекса PBAF в том числе и против РОТ10 были способны копреципитировать рекомбинантный FLAG-MYC, экспрессия которого была индуцирована в меланомных клетках Л375 (рис. 18).

Рис. 18 Иммунопреципитация FLAG-меченого MYC антителами против коровых и специфических субъединиц PBAF комплекса из экстрактов клеток A375, стабильно трансфецированных с К-концевой FL-MYC конструкцией.

В реципрокных экспериментах по иммунопреципитации в клетках НЕК293Т мы продемонстрировали способность эндогенного и рекомбинантного MYC соосаждать все исследуемые субъединицы PBAF комплекса, в том числе и РОТ10. Результаты данных экспериментов показывают, что РОТ10 присутствует в комплексах PBAF, взаимодействующих с MYC.

3.3. PHF10 способствует взаимодействию МУС с PBAF комплексом

Чтобы проверить, взаимодействует ли РОТ10 напрямую с MYC, мы подавили эндогенный РОТ10 с помощью транзиентной трансфекции siРНК-I и siРНК-II PHF10 в клетках линии А375 (рис. 19).

Рис. 19 Нокдаун РОТ10 с помощью siPHF10-I и вгРШЧО-П.

Далее мы провели соосаждение субъединиц комплекса при нокдауне и в норме из лизатов клеток А375 и показали, что истощение РОТ10 не приводило к разрушению комплекса PBAF. (рис. 20).

Рис. 20 Соосаждение специфическими антителами различных субъединиц PBAF(указаны сверху) из клеток дикого типа (-) и клеток с нокдауном PHF10 (+). Указаны коровые и специфические субъединицы PBAF комплекса.

Однако нокдаун PHF10 существенно нарушил взаимодействие между PBAF и MYC (рис. 21), о чем свидетельствует тот факт, что в клетках с нокдауном PHF10 количество MYC, соосажденного с 4 антителами против BAF200 или против BAF150, было значительно меньше, чем соответствующие количества в клетках, обработанных siControL

Рис. 21 Истощение РОТ10 приводит к уменьшению взаимодействий между MYC и субъединицами PBAF

Таким образом, мы установили, что РОТ10 в составе PBAF комплекса напрямую взаимодействует с MYC.

3.4. РОТ10 взаимодействует с МУС через МВ1, МВ11 и CTD домены

Для того чтобы понять каким именно доменом белок MYC взаимодействует с РНР10 мы получили мутантные формы MYC (рис. 22).

NTD central region CTD

1

MYC-wt .

MYC-MBI , MYC-MBII ■ MYC-MBIII ■ MYC-MBIV < MYC-CTD ■

Рис. 22 Схема полученных мутантов MYC. MYC-wt - дикий тип белка MYC.

Затем мы транзиентно коэкспрессировали HA-PHF10-P1 и HA-PHF10-Sl c полным FLAG-MYC и с FLAG-MYC делеционными мутантами в клеточной линии HEK293T с последующей иммунопреципитацией антителами против НА и иммуноблоттингом c антителами против FLAG эпитопа.

PHF10 эффективно осаждал MYC дикого типа. Напротив, делеция доменов MYC Box I и II (MBI и MBII, соответственно), которые, как известно, взаимодействуют с медиаторами транскрипционных кофакторов, TRRAP, p300 / CBP, GCN5 и другими[100], а также делеция C-концевого домена bHLH-Zip, необходимого для связывания с MYC-ассоциированным фактором X (MAX), влияет на взаимодействие PHF10 -MYC (рис. 23).

Рис. 23 Взаимодействие делеционных мутантов MYC с РНР10-Р1.

Изоформа PHF10-Sl также аналогично связывается с FLAG-MYC, из чего можно сделать вывод что DPF-домены изоформы PHF10-Pl не участвуют во взаимодействии РОТ10 -МУС (рис. 24).

Рис. 24 Взаимодействие HЛ-PHF10-Sl с МУС.

3.5. PHF10 участвует в МУС-зависимой транскрипции

Чтобы определить, влияет ли взаимодействие MYC с PHF10 на MYC-зависимую активацию транскрипции, мы провели репортерный анализ на основе экспрессии люциферазы. Конструкцию, содержащую ген люциферазы под промотором MYC-зависимого гена CDK4, котрансфецировали контрольными siРНК или siРНК PHF10 в клетки HEK293T с последующим измерением активности люциферазы через 48 часов после трансфекции. Значительное снижение репортерной активности было обнаружено в клетках, обработанных siРНК PHF10, по сравнению с клетками, обработанными контрольной siРНК, что позволяет предположить, что PHF10 коактивирует MYC-зависимую транскрипцию (рис. 25).

Рис. 25 Уровень экспрессии люциферазы репортера MYC в норме и при нокдауне PHF10.

3.6. Взаимодействия MYC и PHF10 происходят в ядре клетки на хроматине

Для подтверждения прямых взаимодействий между изоформами PHF10 и онкогена MYC на хроматине были проведены эксперименты проксимального лигирующего анализа (Proximal Ligation Assay PLA) с помощью кита DuoLink® PLA Technology, Sigma-Aldrich. DuoLink® PLA позволяет детектировать и измерять взаимодействия между белками, расстояние между которыми не превышает 40нм с помощью специфических антител, соответствующих зондов и последующей флуоресцентной микроскопии [155].

Для этого мы получили дважды стабильные линии клеток А375, позволяющие коэкспрессировать каждую из изоформ F1-PHF10 и HA-MYC с помощью доксициклина в клетках А375. В ходе дальнейшего изучения взаимодействий с помощью PLA эссея мы идентифицировали наличие сигнала между белками F1-PHF10 и HA-MYC, которые индуцированно экспрессировали в клетках A375 (рис. 26).

Рис. 26 Детекция взаимодействия Flag-PHF10i с НА-МУС с помощью DuoLink PLA. Изображения являются максимальными проекциями 10 z -срезов. Ядра показаны синим ^АР1), сигнал DuoLink красным.

Количество сигналов взаимодействия между Fl-PHF10i с НА-МУС на ядро различалось при экспрессии различных изоформ Fl-PHF10i (PL, PS, SL, SS) (рис. 27).

од

Рис. 27 Количество сигналов взаимодействия белка HA-MYC с различными изоформами Fl-PHF10i в ядре.

Таким образом мы показали, что все четыре изоформы PHF10 взаимодействуют с MYC. Полученные интенсивность и количество сигнала для разных изоформ PHF10 различается, что может быть связано с их функцией.

3.7. PHF10 и MYC регулируют экспрессию схожего набора генов

Чтобы оценить важность влияния PHF10 на транскрипционную регуляцию эндогенного MYC мы сравнили эффекты, вызванные истощением PHF10 или MYC, на глобальную экспрессию генов. Полногеномное секвенирование библиотек мРНК проводили на клетках меланомы A375 трансфицированных контрольной siРНК или PHF10 siРНК-I и siРНК-II или MYC siРНК-I и siРНК-П. В результате анализа данных РНК секвенирования было показано, что большинство дифференциально экспрессируемых генов (DEG) между контрольными и истощенными по PHF10 клеточными популяциями значительно перекрываются с DEG между контрольными и MYC-истощенными популяциями клеток (FDR<0.05; рис. 28).

Рис. 28 Диаграммы Венна для генов регуляция которых зависит от истощения МУС и РОТ10. А. Гены с пониженной регуляцией при истощении МУС и РОТ10. Б. Гены с повышенной регуляцией при истощении МУС и РОТ10. В. Гены с пониженной регуляцией при истощении МУС и повышенной регуляцией при истощении РОТ10. Г. Гены с повышенной регуляцией при истощении МУС и пониженной регуляцией при истощении РОТ10

В частности, 61,8% всех DEG, подавляемых с помощью нокдауна РОТ10, перекрываются с генами, которые подавляются с помощью нокдауна МУС. Соответственно, 56% генов, активируемых в клетках с нокдауном РОТ10 (по сравнению с контрольными клетками), также активируются с помощью нокдауна МУС. Напротив, только 20,8% генов, активированных нокдауном РНР10, снижались после нокдауна МУС.

Всего лишь 10,4% генов, экспрессия которых была повышена в результате нокдауна PHF10, подавлялись в клетках с нокдауном MYC (рис. 28).

Таким образом, паттерны генов, активируемых или подавляемых либо PHF10, либо MYC, полностью совпадают, указывая на то, что PHF10 кооперирует с MYC в регуляции транскрипции. Кроме того, анализ обогащения набора генов (GSEA) с использованием базы данных Reactome выявил значительно обогащенные пути в клетках с нокдауном MYC и PHF10 (рис. 29).

МУС

Репликация ДНК Удлинение цепи ДНК Пре-инициация репликации ДНК Синтез ДНК G2/M чекпоинты Обслуживание хромосом Процессинг рРНК Процессинг рРНК ц цитозоле ядра Удаление Огс1 из хроматина Сборка пререпликативного комплекса Основной луть процессинга рРНК Удлинение теломер Переход G1/S Активация ATR в ответ на стресс Чекпоинты клеточного цикла Метаболизм РНК S фаза

Регуляция митотического клеточного цикла АРС/С-опосредованная деградация белков Переключение в пост-состояние Нейронная система Нейрексины и нейролигины Белок-белковые взаимодействия в синапсах

-I-Г"

о -

Основные сигнальные пути

контролируемые PHF10 и МУС

по базе REACTOME клеточный цикл Клеточный цикл, митотический Обслуживание хромосом Митотическая прометазафа Репликация ДНК Расхождение клеточных хроматид Homology Directed Repair Чекпоинты клеточного цикла HDR посредством гомологичной рекомбинации (HRR) Активация пререпликационного комплекса Отжигание одной нити Удлинение цепи ДНК Переход G1/S Усиление сигнала Усиление сигнала от т-кинетохор S-фаза Синтез ДНК

Восстановление двухцепочечных разрывов ДНК Гомологичное спаривание ДНК Активация ATR в ответ на стресс Ламинин взаимодействия Формирование ороговевшей оболочки Кератинизация

общие сигнальные пути для МУС и PHF10

PHF10

Нормализованная оценка обогащения

Нормализованная оценка обогащения

Рис. 29 Двадцать наиболее обогащенных путей базы Reactome (отсортированных, по нормализованной оценке, обогащения) для MYC и РБШ0-зависимых генов согласно GSEA. Красные рамки указывают пути, связанные с клеточным циклом в классификации сигнальных путей Яеас1юте.

Среди двадцати основных сигнальных путей, обогащенных нокдауном MYC или PHF10, большинство имеет отношение к регуляции

клеточного цикла. Двести сорок три гена, подавляемых посредством нокдауна PHF10 или MYC, были проанализированы с помощью анализа избыточного представления (Overrepresentation analysis ORA) с использованием базы данных Reactome. Все обогащенные пути использовались для построения сети с использованием информации о взаимосвязи иерархии путей Reactome и были сгруппированы в кластеры, названные по родительскому узлу в иерархии. Чаще всего гены, общие для обоих сравнений (PHF10 siPHK/Control siPHK и MYC siPHK/Control siPHK) принадлежали к путям, которые регулируют клеточный цикл, репликацию ДНК или пути репарации ДНК, что совпадает с функциями MYC в клетке (рис. 30).

Regulation of TPS3 A cu sitv through Phosphorylation

О

TP53 Regulates Transcription оI Genrs Involved in G1 Cell Cycle Amu

Regulation of IPS3 ActtvMy TPS3 Regulates Iramcnption of Oil Cyde On«

Anchoring of the bawl body ю ihr plasma membrane

Lau of Nip from it

О TP53 RtguUn liiiDMilpiMin of DNA Керчи Ones I ranscriptinrui Regulation by TPS3

iKlun iminved in megakaryocyte development «id putrw production

Lou of proteins required for Interphase mk muftt I«- organization from the centrosome

RecnOtment of oModc centrosome proteins «id complexes Separation of J^rr Chromatid

• О

ГлМлмш .luiühMji

ALRKA Activation by TPX2

О

Kmesins

Cellular Senescence

Щ , ф Omogw Induced Senescence

Имюии> □ Signal Transduction

Generic Transcription Pathway

— Cell Cycle И DNA Replication О Cellular responses to Ытл

■ < ilium Assembly

О Inua-Golgi and retrograde <»olgi-io-ER traffic

■ DNA Repair

-.l'MTWiw» ^ Mitotic G2-G2/M phases Tl mi rilpilnilll HlplMlfM tlj ГТП Mum Uniphase Cycltn A/BWB2 assnciaccd events dunng и/-M transition ®

Mitotic Metapl^fc and Anaphase

Pol? like k.Ese mediated event* I ranslesim synthesis by POLK

■A,

м ЯШ* Mitotic Prophase

oJH

— WW ГттН^в Ua^dnvtn

Regulation of PI.КI Activity« G2/M Tramitkin

Termination of translesion DNA synthesis

RHO GTPases Activate Formim

ORIRT GTPase Effectors

____________ . • _

у 11 are» les I on synthesis by POLI

Condmwiion of Pmmrtaphav i hramгЩф/ ^ О

Depolymrrisation ul the Nuclear Lamina

Signaling by Rho СI Posts

Translesion synthese by Y family DNA poly met as«-» bypasses leswns an DNA template

Mismatch repair (MMR) directed bv MSH2.MSH3 (MulSbeta) _. ж, Iraiislesiun Synthesis bv POLH Recognition ol DNA damage by PCNA conuining replication complex

Synthesis Dependent Strand Anneal mg (SDSA) у С Dual incision In TC-NER

Recruitment of NuM.^b Riit-it>> A:iasomes Resolution of D-loop Stnictures through Hullkitv Junction Intermediates

Resolution of Sister Chicmatld Cohesion HDR through Slngk-Stnimf Annealing (SSA) DNA Danur Bypass j , Mismatch .ерам (MMR) directed by MSH2 MSH6 (MutSalpha)

Resolution Ы D-l nop SftOcütrr ^ Рпхпи1Щ fceak ends Mismatch Repair < .ap-f,lllng DNA repair synthesis and ligation In TC-NER

Remos'oJ of the Hap Intermedíale . , ' __*

OIIDRthrough Homology Recombiatonn liansci|ptW.n-4.oupkd Nucleotide Excision Repair (TC-NER)

(HK)uc Single Strand Annealing (SSA| nrv . «..„„ ^ ^

Twncnption of E2f targrts under negative control bv \ ___. .. , . ______iKNAHapair

plQ7(RBLI) and р1Э0 (RB1.2I in complex with HI) AC I \ HDR through Homologous Rfcnrnhinaiuin (IfRRj ^ Nucleotide Excision Repair

О ProtTMive хущЬеыф the lagging strand Homoltig) Directed Repair jfggfag^ Bre^K Repair Gap-flUlhg DNA repair symhesh and ligation in GG-NER

•rn^Miv

Transcription of E2F targrts under nt^uivr сuntrol by DREAM complex Рсймф.14- switching

Homologous DNA Pairing and Strand Exchange

GOandyriyGI

О logging Strand Swthes*'

Inhibition of repflutton initiation ^ w a^

of damaged DNA bvRBli^FI T . . v W . ,

l eading Strand Synthesis presynaptic pbMe ol homologous Mitotic GI-GI/S phases ф ^ DNA sir andigo. Ion Vм* and y,ind

E2F mediated i^ptatmn of D* replication a

> GlnM «.enome Nucleotkfe Е*гкИп Repair (GG-NER)

f anconi Anemia Pathway fije* txciskm RejMir

Gl.'S-Specific Transcription Q f GI S Transition^

Unwinding of DNA Activation of AIR in response to replication sties» ф t ptl^clr ^

G2M Qieckpmnts^^

Dual Incision Mi GG-NER

V

Resnhitmn ol Ahas»c Sues (AP sites) Resolution of AP sites vu ф? multtpk-nucleotide patch replacement pathway l'( N A-Dependent Long Patch Base Excision Repair

^itutK Spindle Checkpoint

Q Amplification of signal from the kinetochores

О Amplifkaiinn of signal fmm unattached к I net och ores via a MAD/ inhibitory signal

DNA Replication Pre-lnitionl

ActivalMin ol the pre rrpltcalive limpio WB DNA

A DNARe^^nn ^^ Q

^^kmhingaf ungimTOapmt-repluatisr stale A

• fi) I immilim ctetimatin G2-M DNA damage checkpmm _________

^^^ Depotiuon of new CENPA-conuimng nucleosomes at the centromere

Removal ol % flap Intermediate from the С-strand Q

Assembly of thrprAfplicativecompiev Proc*«s«ve synthesis on Ar C-strand of the telomere A ® Nucleosnme assembly

О _ w (hramusome Maintenance

CP! 1 association! v. ith iM^DCe.ORC.urigin complex * Г)

a. ~ 'I etomerv Мапиепапсе COC6 ммкУЦай Mllh^v ORC:a1gln complex g »t««»!«. ol Tek-n««

Golgi-to-ER r^g,qd^irartsport COPI -dependent Golgi-to-ER retrograde traffic

wTelomere C-strand (Lagging Strand) Synthesis

О

Polymerase switching on the С -strand of the telomere

Рис. 30 Схема взаимодействия сигнальных путей из базы Reactome, обогащенных генами экспрессия которых была понижена или повышена как при нокдауне MYC, так и при нокдауне PHF10 в соответствии с анализом ORA. Сеть была построена с использованием классификации путей Reactome.

Аналогичным образом PHF10 регулирует экспрессию генов, контролирующих вышеупомянутые процессы.

Таким образом, кооперация PHF10 и MYC в активации транскрипции была дополнительно подтверждена глобальным анализом экспрессии генов после нокдауна MYC или PHF10.

3.8. PHF10 локализуется на промотрах MYC-зависимых генов и необходим для активации их транскрипции

Далее мы изучили уровень PHF10 и MYC на сайтах связывания MYC рядом с промотором MYC-зависимых генов с помощью хроматин иммунопреципитации (рис. 31).

Рис. 31 Уровень PHF10 и MYC на регуляторных участках промоторов МУС-зависимых генов. Обогащение было подсчитано как процент от общего количества ДНК соответствующих генов во внесенном материале.

Затем мы изучили роль PHF10 в активации транскрипции MYC-зависимых генов. Клетки A375 дикого типа в норме и с нокдауном PHF10 культивировали в бессывороточной среде с последующим добавлением сыворотки для активации ответов MYC (рис. 32).

Рис. 32 Слева: уровни мРНК PHF10 и MYC в контроле^^^) и при нокдауне PHF10 (siPHF10) после до добавления сыворотки (-FBS) и после добавления сыворотки (+FBS). Справа: добавление сыворотки не изменяет уровень мРНК PHF10 после нокдауна PHF10.

Как и ожидалось, в клетках дикого типа сыворотка значительно увеличила содержание мРНК всех изученных генов. Однако в клетках с нокдауном PHF10 эти гены стимулировались сывороткой в значительно меньшей степени (рис. 33).

Рис. 33 При нокдауне РОТ10 активация МYC-зависимых генов снижена на 8-47%.

Эти результаты подтверждают, что РОТ10 действует как коактиватор МУС-зависимой транскрипции.

3.9. Истощение PHF10 вызывает клеточное старение и задержку G0/G1 фазу клеточного цикла в клетках меланомы

Ранее было показано, что истощение MYC в клетках меланомы вызывает фенотип, подобный клеточному старению [3]. Мы попытались понять, может ли подавление РОТ10 приводить к развитию такого же фенотипа, как и при истощении MYC. Действительно, подавление РОТ10 с помощью siРНК в клетках А375 сопровождалось изменениями в клеточной морфологии и повышенной активностью, связанной с клеточным старением, в-галактозидазы (рис. 34).

Рис. 34 Оценка активности в-галактозидазы. Нокдаун РОТ10 и MYC вызывают клеточное старение клеток А375.

Соответственно, истощение MYC и РОТ10 вызывает сходные фенотипы. Кроме того, нокдаун MYC или РОТ10 в клетках меланомы Sk -Mel-28, Sk-Mel-29 и А375 приводил к накоплению в G1 и сопутствующему снижению фаз S и G2 / М клеточного цикла, демонстрируя аналогичную роль MYC и PHF10 в регуляции клеточного цикла (рис. 35).

Рис. 35 Анализ клеточного цикла клеток А375 при нокдауне MYC и PHF10.

Эти фенотипические изменения подтверждают роль РОТ10 как партнера MYC и совместную роль при регуляции экспрессии одинаковых MYC-зависимых генов.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В данной работе мы показали механизмы взаимодействия SWI/SNF и онкогена MYC, реализующиеся для регуляции транскрипции генов в клеточных линиях меланомы.

Комплексы SWI/SNF млекопитающих - BAF и PBAF - одни из ключевых участников ремоделирования хроматина, осуществляющих перемещение нуклеосом. Несмотря на их важнейшую роль в регуляции транскрипции, их влияние на каждый из клеточных и физиологических процессов, в которых они участвуют трудно определима, из-за того, что в их состав входит множество субъединиц специфичных для различных тканей, клеток и этапов развития. Процесс онкогенной трансформации еще больше усложняет интерпретацию их активности, так как мутации в субъединицах комплекса (встречающиеся в более чем 20%) опухолей меняют его функцию. Сведения о про- и антионкогенной роли SWI/SNF комплексов одновременно встречаются в литературе, как и для других эпигенетических белков, например, гистонметилтрансфераз[156].

MYC является не только одним из важнейших онкогенов, но и общим регулятором транскрипции. Множество исследований показали, что MYC привлекает разнообразные модификаторы хроматина, их ко-факторы и ко-активаторы, такие как гистон ацетилазы, гистон метилтрансферазы, комплекса Медиаторы и другие [100]. Ремоделирование нуклеосом является важнейшим компонентом регуляции транскрипции, поэтому не удивительно, что MYC и комплексы SWI/SNF взаимодействуют друг с другом. Ранее было показано, что коровый компонент PBAF, субъединица BAF47 (INI) привлекается вместе с MYC на промоторы и взаимодействует с его C-концевым доменом. Это взаимодействие ингибирует MYC-зависимую транскрипцию[129].

В этой работе мы показали, что MYC также взаимодействует с PHF10, специфической субъединицей PBAF комплекса. Ранее, в нашей

лаборатории и другими группами было показано РНБ10 необходим для пролиферации множества типов клеток, таких как фибробласты, НЕК293, нейробласты и миелобласты - предшественники клеток крови. Однако механизм поддержания клеточной пролиферации, опосредованный РНБ10, остается неясным. Мы показали, что кроме физического взаимодействия РНБ10 необходим для транскрипции MYC-зависимых генов, и что нокдаун РНР10 существенно снижает MYC-зависимую активацию транскрипции. Согласно полученным в настоящей работе данным РНБ10 необходим для взаимодействия MYC со всем PBAF комплексом, то есть без данной субъединицы сила такого взаимодействия существенно падает. Взаимодействие осуществляется через МВ1, МВ11, и ЬНЬН домены MYC. МВ1 и МВ11 домены необходимы для взаимодействия и с другими эпигенетическими факторами, такими как BRD4, р400, GCN5 и TRRAP[100]. Таким образом взаимодействие между РНБ10 и MYC осуществляется похожим образом с другими белками.

Далее мы показали, что взаимодействие РНБ10 и MYC имеет функциональное значение. Нокдаун РНР10 снижал MYC зависимую трансактивацию люциферазного репортера, содержащего элементы связывания MYC. Нокдаун РНР10 снижает также эндогенную экспрессию ряда MYC-зависимых генов, таких как TYMS, CYCE2, E2F1, АРЕХ1 и других. MYC и PHF10 вместе находятся на промоторах этих генов. При этом нокдаун РНБ10 не влияет на привлечение MYC на промоторы, но снижает взаимодействие MYC с другими субъединицами PBAF. Таким образом, можно сделать вывод что РНБ10 необходим для привлечения комплекса РВАБ на промоторы MYC-зависимых генов и ремоделирования хроматина на этих сайтах для активации транскрипции.

Нокаут MYC в клетках меланомы приводит к выводу этих клеток из клеточного цикла и инициации терминального клеточного блока -фенотипа клеточного старения[3]. Мы показали, что фенотип клеток нескольких линий меланомы при нокдауне MYC и РНБ10 схожи - при

снижении экспрессии обоих генов происходит увеличение количества клеток в G1 фазе клеточного цикла и последующее развитие клеточного старения (измеренное по окраске на специфический маркер - бета-галактозидазу, ассоциированную с клеточным старением).

Роль индивидуальных компонентов комплексов SWI/SNF в канцерогенезе очень индивидуальна. Например, BRG1 инактивирован в практически всех карциномах яичника[157], но гиперэкспрессирован в остром миелобластном лейкозе[158]. BRG1 также гиперэкспрессирован в меланомах. В данной работе мы показали корреляцию высокого уровня РНБ10 в ряде опухолевых линий с высоким уровнем MYC. Вместе с тем другие исследователи показывают роль РНБ10 в качестве опухолевого супрессора в увеальной меланоме, и его частые делеции в этих опухолях[159]. Можно предположить, что мутации и гиперэкспрессия компонентов SWI/SNF в опухолях зависит от транскрипционного и эпигенетического контекста. В такой модели проонкогенные субъединицы комплекса будут гиперэкспрессироваться и замещать супрессорные компоненты комплекса, которые будут подвергаться отрицательному отбору, и в результате инактивироваться или делетироваться в большинстве опухолевых клетках. SWI/SNF комплекс является привлекательной мишенью для противоопухолевой терапии и для стратегии с синтетической летальностью (при которой инактивация компонентов комплексов делает опухоль более чувствительной к определенным видам таргетной или конвенциональной химиотерапии). Однако, если такие ингибиторы будут созданы, их применение будет определяться индивидуально, в зависимости от роли компонентов SWI/SNF в конкретной опухоли. Показанное в данной работе взаимодействие между MYC и РНБ10 является примером такого взаимодействия.

ВЫВОДЫ

1. MYC взаимодействует с комплексом РВАБ, включающим РНБ10. РНБ10 важен для установления этого взаимодействия;

2. PHF10-Pl и PHF10-Sl изоформы взаимодействуют с MYC напрямую через МВ1, МВ11 и CTD домены. Взаимодействия MYC с изоформами РНБ10 происходят в ядре клетки на хроматине;

3. РНБ10 является коактиватором MYC-зависимой транскрипции и присутствует на промоторах MYC-зависимых генов. Более 60% MYC-зависимых генов в клетках меланомы А375 также зависят от РНБ10. Подавляющее большинство этих генов контролируют клеточный цикл и репарацию ДНК;

4. Истощение MYC и РНБ10 вызывает сходные фенотипы у клеток меланомных линий: приводит к проявлению фенотипа старения и к накоплению клеток в G0/G1 фазе клеточного цикла.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Джамбулатовна Э.Ф., Никифорович П.С. СТАТИСТИКА МЕЛАНОМЫ В РОССИИ И СТРАНАХ ЕВРОПЫ // Медико-социальная экспертиза и реабилитация. Россия, Москва: ОАО «Издательство «Медицина», 2020. Vol. 23, № 1. P. 44-52.

2. MYC as a target for cancer treatment // Cancer Treat. Rev. W.B. Saunders, 2021. Vol. 94. P. 102154.

3. Zhuang D. et al. C-MYC overexpression is required for continuous suppression of oncogene-induced senescence in melanoma cells // Oncogene. 2008. Vol. 27, № 52. P. 6623-6634.

4. Lin H. et al. BRG1 expression is increased in human cutaneous melanoma // Br. J. Dermatol. 2010. Vol. 163, № 3. P. 502-510.

5. Способ диагностики меланомы человека на основании определения уровня экспрессии гена PHF10, диагностический набор. Патент РФ EA201001297. Сошникова Н. В., Бречалов А. В., Набирочкина Е. Н. Георгиева С. Г. МПК C12Q 1/68.30.03.2012 URL:https://patentscope.wipo.int/search/ru/detail.jsf?docId=EA95431096

6. Bonev B., Cavalli G. Organization and function of the 3D genome // Nat. Rev. Genet. 2016. Vol. 17, № 12. P. 772.

7. Magana-Acosta M., Valadez-Graham V. Chromatin Remodelers in the 3D Nuclear Compartment // Front. Genet. 2020. Vol. 11. P. 600615.

8. Yan L., Chen Z. A Unifying Mechanism of DNA Translocation Underlying Chromatin Remodeling // Trends Biochem. Sci. 2020. Vol. 45, № 3. P. 217227.

9. McGinty R.K., Tan S. Nucleosome Structure and Function // Chemical Reviews. 2015. Vol. 115, № 6. P. 2255-2273.

10. Rowley M.J., Corces V.G. Organizational principles of 3D genome architecture // Nat. Rev. Genet. 2018. Vol. 19, № 12. P. 789-800.

11. Pugacheva E.M. et al. CTCF mediates chromatin looping via N-terminal

domain-dependent cohesin retention // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020. Vol. 117, № 4. P. 2020-2031.

12. Hansen A.S. et al. Distinct Classes of Chromatin Loops Revealed by Deletion of an RNA-Binding Region in CTCF // Molecular Cell. 2019. Vol. 76, № 3. P. 395-411.e13.

13. Filippova G.N. et al. An exceptionally conserved transcriptional repressor, CTCF, employs different combinations of zinc fingers to bind diverged promoter sequences of avian and mammalian c-myc oncogenes // Mol. Cell. Biol. 1996. Vol. 16, № 6. P. 2802-2813.

14. Brackley C.A. et al. Nonequilibrium Chromosome Looping via Molecular Slip Links // Phys. Rev. Lett. 2017. Vol. 119, № 13. P. 138101.

15. Terakawa T. et al. The condensin complex is a mechanochemical motor that translocates along DNA // Science. 2017. Vol. 358, № 6363. P. 672-676.

16. Stigler J. et al. Single-Molecule Imaging Reveals a Collapsed Conformational State for DNA-Bound Cohesin // Cell Rep. 2016. Vol. 15, № 5. P. 988-998.

17. Davidson I.F. et al. Rapid movement and transcriptional re-localization of human cohesin on DNA // EMBO J. 2016. Vol. 35, № 24. P. 2671-2685.

18. Busslinger G.A. et al. Cohesin is positioned in mammalian genomes by transcription, CTCF and Wapl // Nature. 2017. Vol. 544, № 7651. P. 503507.

19. Ocampo-Hafalla M. et al. Evidence for cohesin sliding along budding yeast chromosomes // Open Biol. 2016. Vol. 6, № 6.

20. Sexton T. et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome // Cell. 2012. Vol. 148, № 3. P. 458472.

21. Nora E.P. et al. Spatial partitioning of the regulatory landscape of the X-inactivation centre // Nature. 2012. Vol. 485, № 7398. P. 381-385.

22. Dixon J.R. et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions // Nature. 2012. Vol. 485, № 7398. P.

376-380.

23. Guo Y. et al. CRISPR Inversion of CTCF Sites Alters Genome Topology and Enhancer/Promoter Function // Cell. 2015. Vol. 162, № 4. P. 900-910.

24. de Wit E. et al. CTCF Binding Polarity Determines Chromatin Looping // Mol. Cell. 2015. Vol. 60, № 4. P. 676-684.

25. Rowley M.J. et al. Evolutionarily Conserved Principles Predict 3D Chromatin Organization // Mol. Cell. 2017. Vol. 67, № 5. P. 837-852.e7.

26. Rao S.S.P. et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping // Cell. 2014. Vol. 159, № 7. P. 1665-1680.

27. Phillips-Cremins J.E. et al. Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment // Cell. 2013. Vol. 153, № 6. P. 1281-1295.

28. Wijchers P.J. et al. Cause and Consequence of Tethering a SubTAD to Different Nuclear Compartments // Mol. Cell. 2016. Vol. 61, № 3. P. 461473.

29. Lieberman-Aiden E. et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome // Science. 2009. Vol. 326, № 5950. P. 289-293.

30. Fraser J. et al. Hierarchical folding and reorganization of chromosomes are linked to transcriptional changes in cellular differentiation // Mol. Syst. Biol. 2015. Vol. 11, № 12. P. 852.

31. Guelen L. et al. Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions // Nature. 2008. Vol. 453, № 7197. P. 948-951.

32. Hnisz D. et al. A Phase Separation Model for Transcriptional Control // Cell. 2017. Vol. 169, № 1. P. 13-23.

33. Larson A.G. et al. Liquid droplet formation by HP1 a suggests a role for phase separation in heterochromatin // Nature. 2017. Vol. 547, № 7662. P. 236-240.

34. Lin Y., Currie S.L., Rosen M.K. Intrinsically disordered sequences enable modulation of protein phase separation through distributed tyrosine motifs // Journal of Biological Chemistry. 2017. Vol. 292, № 46. P. 19110-19120.

35. van der Lee R. et al. Classification of intrinsically disordered regions and proteins // Chem. Rev. 2014. Vol. 114, № 13. P. 6589-6631.

36. Lu H. et al. Phase-separation mechanism for C-terminal hyperphosphorylation of RNA polymerase II // Nature. 2018. Vol. 558, № 7709. P. 318-323.

37. Kouzarides T. Chromatin modifications and their function // Cell. 2007. Vol. 128, № 4. P. 693-705.

38. Wang G.G., Allis C.D., Chi P. Chromatin remodeling and cancer, Part I: Covalent histone modifications // Trends Mol. Med. 2007. Vol. 13, № 9. P. 363-372.

39. Hasan N., Ahuja N. The Emerging Roles of ATP-Dependent Chromatin Remodeling Complexes in Pancreatic Cancer // Cancers . 2019. Vol. 11, № 12.

40. Michel B.C. et al. A non-canonical SWI/SNF complex is a synthetic lethal target in cancers driven by BAF complex perturbation // Nat. Cell Biol. 2018. Vol. 20, № 12. P. 1410-1420.

41. Lessard J. et al. An essential switch in subunit composition of a chromatin remodeling complex during neural development // Neuron. 2007. Vol. 55, № 2. P. 201-215.

42. Clapier C.R. et al. Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. Nature Publishing Group, 2017. Vol. 18, № 7. P. 407-422.

43. Aydin Ö.Z., Vermeulen W., Lans H. ISWI chromatin remodeling complexes in the DNA damage response // Cell Cycle. 2014. Vol. 13, № 19. P. 30163025.

44. Oppikofer M. et al. Expansion of the ISWI chromatin remodeler family with new active complexes // EMBO Rep. 2017. Vol. 18, № 10. P. 1697-1706.

45. Mills A.A. The Chromodomain Helicase DNA-Binding Chromatin Remodelers: Family Traits that Protect from and Promote Cancer // Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2017. Vol. 7, № 4.

46. Cai Y. et al. The NuRD complex cooperates with DNMTs to maintain silencing of key colorectal tumor suppressor genes // Oncogene. 2014. Vol. 33, № 17. P. 2157-2168.

47. Xia L. et al. CHD4 Has Oncogenic Functions in Initiating and Maintaining Epigenetic Suppression of Multiple Tumor Suppressor Genes // Cancer Cell. 2017. Vol. 31, № 5. P. 653-668.e7.

48. Poli J., Gasser S.M., Papamichos-Chronakis M. The INO8O remodeller in transcription, replication and repair // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 2017. Vol. 372, № 1731.

49. Beckwith S.L. et al. The INO8O chromatin remodeler sustains metabolic stability by promoting TOR signaling and regulating histone acetylation // PLoS Genet. 2018. Vol. 14, № 2. P. e1007216.

50. Mohrmann L., Verrijzer C.P. Composition and functional specificity of SWI2/SNF2 class chromatin remodeling complexes // Biochim. Biophys. Acta. 2005. Vol. 1681, № 2-3. P. 59-73.

51. Wang W. et al. Purification and biochemical heterogeneity of the mammalian SWI-SNF complex // The EMBO Journal. 1996. Vol. 15, № 19. P. 5370-5382.

52. Mashtalir N. et al. Modular Organization and Assembly of SWI/SNF Family Chromatin Remodeling Complexes // Cell. 2018. Vol. 175, № 5. P. 1272-1288.e20.

53. Whitehouse I. et al. Nucleosome mobilization catalysed by the yeast SWI/SNF complex // Nature. 1999. Vol. 400, № 6746. P. 784-787.

54. Masliah-Planchon J. et al. SWI/SNF chromatin remodeling and human malignancies // Annu. Rev. Pathol. 2015. Vol. 10. P. 145-171.

55. He S. et al. Structure of nucleosome-bound human BAF complex // Science. 2020. Vol. 367, № 6480. P. 875-881.

56. Ye Y. et al. Structure of the RSC complex bound to the nucleosome // Science. 2019. Vol. 366, № 6467. P. 838-843.

57. van Holde K., Yager T. Models for chromatin remodeling: a critical comparison // Biochem. Cell Biol. 2003. Vol. 81, № 3. P. 169-172.

58. Zhang Y. et al. DNA translocation and loop formation mechanism of chromatin remodeling by SWI/SNF and RSC // Mol. Cell. 2006. Vol. 24, № 4. P. 559-568.

59. Ho L., Crabtree G.R. Chromatin remodelling during development // Nature. 2010. Vol. 463, № 7280. P. 474-484.

60. Banga S.S. et al. PHF10 is required for cell proliferation in normal and SV40-immortalized human fibroblast cells // Cytogenet. Genome Res. 2009. Vol. 126, № 3. P. 227-242.

61. Wu J.I. et al. Regulation of dendritic development by neuron-specific chromatin remodeling complexes // Neuron. 2007. Vol. 56, № 1. P. 94-108.

62. Chi T.H. et al. Reciprocal regulation of CD4/CD8 expression by SWI/SNF-like BAF complexes // Nature. 2002. Vol. 418, № 6894. P. 195-199.

63. Chi T.H. et al. Sequential roles of Brg, the ATPase subunit of BAF chromatin remodeling complexes, in thymocyte development // Immunity. 2003. Vol. 19, № 2. P. 169-182.

64. de la Serna I.L., Carlson K.A., Imbalzano A.N. Mammalian SWI/SNF complexes promote MyoD-mediated muscle differentiation // Nat. Genet. 2001. Vol. 27, № 2. P. 187-190.

65. Hodges C., Kirkland J.G., Crabtree G.R. The Many Roles of BAF (mSWI/SNF) and PBAF Complexes in Cancer // Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2016. Vol. 6, № 8.

66. Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours // Nature. 2012. Vol. 490, № 7418. P. 61-70.

67. Network T.C.G.A.R., The Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma // Nature. 2014. Vol. 511, № 7511. P. 543-550.

68. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular characterization of gastric adenocarcinoma // Nature. 2014. Vol. 513, № 7517. P. 202-209.

69. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular characterization of urothelial bladder carcinoma // Nature. 2014. Vol. 507, № 7492. P. 315-322.

70. Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer // Nature. 2012. Vol. 487, № 7407. P. 330337.

71. Wong A.K. et al. BRG1, a component of the SWI-SNF complex, is mutated in multiple human tumor cell lines // Cancer Res. 2000. Vol. 60, № 21. P. 6171-6177.

72. Ramos P. et al. Small cell carcinoma of the ovary, hypercalcemic type, displays frequent inactivating germline and somatic mutations in SMARCA4 // Nat. Genet. 2014. Vol. 46, № 5. P. 427-429.

73. Shain A.H. et al. Exome sequencing of desmoplastic melanoma identifies recurrent NFKBIE promoter mutations and diverse activating mutations in the MAPK pathway // Nat. Genet. 2015. Vol. 47, № 10. P. 1194-1199.

74. Imielinski M. et al. Mapping the hallmarks of lung adenocarcinoma with massively parallel sequencing // Cell. 2012. Vol. 150, № 6. P. 1107-1120.

75. Rizvi N.A. et al. Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer // Science. 2015. Vol. 348, № 6230. P. 124-128.

76. Le Loarer F. et al. SMARCA4 inactivation defines a group of undifferentiated thoracic malignancies transcriptionally related to BAF-deficient sarcomas // Nat. Genet. 2015. Vol. 47, № 10. P. 1200-1205.

77. Hodis E. et al. A landscape of driver mutations in melanoma // Cell. 2012. Vol. 150, № 2. P. 251-263.

78. Pugh T.J. et al. Medulloblastoma exome sequencing uncovers subtype-specific somatic mutations // Nature. 2012. Vol. 488, № 7409. P. 106-110.

79. Dykhuizen E.C. et al. BAF complexes facilitate decatenation of DNA by topoisomerase IIa // Nature. 2013. Vol. 497, № 7451. P. 624-627.

80. Jones S. et al. Frequent mutations of chromatin remodeling gene ARID1A in ovarian clear cell carcinoma // Science. 2010. Vol. 330, № 6001. P. 228231.

81. Cancer Genome Atlas Research Network et al. Integrated genomic characterization of endometrial carcinoma // Nature. 2013. Vol. 497, № 7447. P. 67-73.

82. Gui Y. et al. Frequent mutations of chromatin remodeling genes in transitional cell carcinoma of the bladder // Nat. Genet. 2011. Vol. 43, № 9. P. 875-878.

83. Wang K. et al. Exome sequencing identifies frequent mutation of ARID1A in molecular subtypes of gastric cancer // Nat. Genet. 2011. Vol. 43, № 12. P. 1219-1223.

84. Jiao Y. et al. Exome sequencing identifies frequent inactivating mutations in BAP1, ARID1A and PBRM1 in intrahepatic cholangiocarcinomas // Nat. Genet. 2013. Vol. 45, № 12. P. 1470-1473.

85. Sausen M. et al. Integrated genomic analyses identify ARID1A and ARID1B alterations in the childhood cancer neuroblastoma // Nat. Genet. 2013. Vol. 45, № 1. P. 12-17.

86. Biankin A.V. et al. Pancreatic cancer genomes reveal aberrations in axon guidance pathway genes // Nature. 2012. Vol. 491, № 7424. P. 399-405.

87. Rando O.J. et al. Phosphatidylinositol-dependent actin filament binding by the SWI/SNF-like BAF chromatin remodeling complex // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002. Vol. 99, № 5. P. 2824-2829.

88. Zhao K. et al. Rapid and Phosphoinositol-Dependent Binding of the SWI/SNF-like BAF Complex to Chromatin after T Lymphocyte Receptor Signaling // Cell. 1998. Vol. 95, № 5. P. 625-636.

89. Chandler R.L. et al. Coexistent ARID1A-PIK3CA mutations promote ovarian clear-cell tumorigenesis through pro-tumorigenic inflammatory

cytokine signalling // Nat. Commun. 2015. Vol. 6. P. 6118.

90. Varela I. et al. Exome sequencing identifies frequent mutation of the SWI/SNF complex gene PBRM1 in renal carcinoma // Nature. 2011. Vol. 469, № 7331. P. 539-542.

91. Versteege I. et al. Truncating mutations of hSNF5/INI1 in aggressive paediatric cancer // Nature. 1998. Vol. 394, № 6689. P. 203-206.

92. Jagani Z. et al. Loss of the tumor suppressor Snf5 leads to aberrant activation of the Hedgehog-Gli pathway // Nat. Med. 2010. Vol. 16, № 12. P. 14291433.

93. Mora-Blanco E.L. et al. Activation of P-catenin/TCF targets following loss of the tumor suppressor SNF5 // Oncogene. 2014. Vol. 33, № 7. P. 933-938.

94. Roberts C.W.M., Biegel J.A. The role of SMARCB1/INI1 in development of rhabdoid tumor // Cancer Biol. Ther. 2009. Vol. 8, № 5. P. 412-416.

95. Prensner J.R. et al. The long noncoding RNA SChLAP1 promotes aggressive prostate cancer and antagonizes the SWI/SNF complex // Nature Genetics. 2013. Vol. 45, № 11. P. 1392-1398.

96. Jahromi M.S. et al. Molecular inversion probe analysis detects novel copy number alterations in Ewing sarcoma // Cancer Genet. 2012. Vol. 205, № 78. P. 391-404.

97. Blackwood E.M., Eisenman R.N. Max: a helix-loop-helix zipper protein that forms a sequence-specific DNA-binding complex with Myc // Science. 1991. Vol. 251, № 4998. P. 1211-1217.

98. Dang C.V. MYC on the Path to Cancer // Cell. 2012. Vol. 149, № 1. P. 2235.

99. Tu W.B. et al. Myc and its interactors take shape // Biochim. Biophys. Acta. 2015. Vol. 1849, № 5. P. 469-483.

100. Poole C.J., van Riggelen J. MYC—Master Regulator of the Cancer Epigenome and Transcriptome // Genes. 2017. Vol. 8, № 5. P. 142.

101. Amati B. et al. Oncogenic activity of the c-Myc protein requires dimerization with Max // Cell. 1993. Vol. 72, № 2. P. 233-245.

102. Zeller K.I. et al. Global mapping of c-Myc binding sites and target gene networks in human B cells // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2006. Vol. 103, № 47. P. 17834-17839.

103. Miller D.M. et al. c-Myc and Cancer Metabolism // Clinical Cancer Research. 2012. Vol. 18, № 20. P. 5546-5553.

104. Adhikary S., Eilers M. Transcriptional regulation and transformation by Myc proteins // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. Vol. 6, № 8. P. 635-645.

105. Sears R. et al. Multiple Ras-dependent phosphorylation pathways regulate Myc protein stability // Genes Dev. 2000. Vol. 14, № 19. P. 2501-2514.

106. Yeh E. et al. A signalling pathway controlling c-Myc degradation that impacts oncogenic transformation of human cells // Nat. Cell Biol. 2004. Vol. 6, № 4. P. 308-318.

107. Welcker M. et al. A nucleolar isoform of the Fbw7 ubiquitin ligase regulates c-Myc and cell size // Curr. Biol. 2004. Vol. 14, № 20. P. 1852-1857.

108. Sears R.C. The Life Cycle of C-Myc: From Synthesis to Degradation // Cell Cycle. 2004. Vol. 3, № 9. P. 1131-1135.

109. Bouchard C. et al. Myc-induced proliferation and transformation require Akt-mediated phosphorylation of FoxO proteins // EMBO J. 2004. Vol. 23, № 14. P. 2830-2840.

110. Soucie E.L. et al. Myc Potentiates Apoptosis by Stimulating Bax Activity at the Mitochondria // Molecular and Cellular Biology. 2001. Vol. 21, № 14. P. 4725-4736.

111. Zindy F. et al. Myc signaling via the ARF tumor suppressor regulates p53-dependent apoptosis and immortalization // Genes Dev. 1998. Vol. 12, № 15. P. 2424-2433.

112. Sander S., Bullinger L., Wirth T. Repressing the repressor: a new mode of MYC action in lymphomagenesis // Cell Cycle. 2009. Vol. 8, № 4. P. 556559.

113. Sampson V.B. et al. MicroRNA Let-7a Down-regulates MYC and Reverts MYC-Induced Growth in Burkitt Lymphoma Cells // Cancer Research.

2007. Vol. 67, № 20. P. 9762-9770.

114. Wierstra I., Alves J. The c-myc Promoter: Still MysterY and Challenge // Advances in Cancer Research. 2008. P. 113-333.

115. Gombert W.M. et al. The c-myc insulator element and matrix attachment regions define the c-myc chromosomal domain // Mol. Cell. Biol. 2003. Vol. 23, № 24. P. 9338-9348.

116. Gartel A.L. et al. Myc represses the p21(WAF1/CIP1) promoter and interacts with Sp1/Sp3 // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001. Vol. 98, № 8. P. 4510-4515.

117. McMahon S.B. et al. The novel ATM-related protein TRRAP is an essential cofactor for the c-Myc and E2F oncoproteins // Cell. 1998. Vol. 94, № 3. P. 363-374.

118. McMahon S.B., Wood M.A., Cole M.D. The essential cofactor TRRAP recruits the histone acetyltransferase hGCN5 to c-Myc // Mol. Cell. Biol. 2000. Vol. 20, № 2. P. 556-562.

119. Frank S.R. et al. MYC recruits the TIP60 histone acetyltransferase complex to chromatin // EMBO Rep. 2003. Vol. 4, № 6. P. 575-580.

120. Fuchs M. et al. The p400 Complex Is an Essential E1A Transformation Target // Cell. 2001. Vol. 106, № 3. P. 297-307.

121. Kenneth N.S. et al. TRRAP and GCN5 are used by c-Myc to activate RNA polymerase III transcription // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007. Vol. 104, № 38. P. 14917-14922.

122. Faiola F. et al. Dual Regulation of c-Myc by p300 via Acetylation-Dependent Control of Myc Protein Turnover and Coactivation of Myc-Induced Transcription // Molecular and Cellular Biology. 2005. Vol. 25, № 23. P. 10220-10234.

123. Utley R.T. et al. Transcriptional activators direct histone acetyltransferase complexes to nucleosomes // Nature. 1998. Vol. 394, № 6692. P. 498-502.

124. Korzus E. et al. Transcription factor-specific requirements for coactivators and their acetyltransferase functions // Science. 1998. Vol. 279, № 5351. P.

703-707.

125. Yang J. et al. The role of histone demethylase KDM4B in Myc signaling in neuroblastoma // J. Natl. Cancer Inst. 2015. Vol. 107, № 6. P. djv080.

126. Zippo A. et al. PIM1-dependent phosphorylation of histone H3 at serine 10 is required for MYC-dependent transcriptional activation and oncogenic transformation // Nat. Cell Biol. 2007. Vol. 9, № 8. P. 932-944.

127. Ivaldi M.S., Karam C.S., Corces V.G. Phosphorylation of histone H3 at Ser10 facilitates RNA polymerase II release from promoter-proximal pausing in Drosophila // Genes Dev. 2007. Vol. 21, № 21. P. 2818-2831.

128. Zhang Y. et al. Pim kinase-dependent inhibition of c-Myc degradation // Oncogene. 2008. Vol. 27, № 35. P. 4809-4819.

129. Cheng S.W. et al. c-MYC interacts with INI1/hSNF5 and requires the SWI/SNF complex for transactivation function // Nat. Genet. 1999. Vol. 22, № 1. P. 102-105.

130. Stojanova A. et al. MYC interaction with the tumor suppressive SWI/SNF complex member INI1 regulates transcription and cellular transformation // Cell Cycle. 2016. Vol. 15, № 13. P. 1693-1705.

131. Ayer D.E., Kretzner L., Eisenman R.N. Mad: a heterodimeric partner for Max that antagonizes Myc transcriptional activity // Cell. 1993. Vol. 72, № 2. P. 211-222.

132. Dang C.V., Le A., Gao P. MYC-induced cancer cell energy metabolism and therapeutic opportunities // Clin. Cancer Res. 2009. Vol. 15, № 21. P. 64796483.

133. Elbadawy M. et al. Emerging Roles of C-Myc in Cancer Stem Cell-Related Signaling and Resistance to Cancer Chemotherapy: A Potential Therapeutic Target Against Colorectal Cancer // Int. J. Mol. Sci. 2019. Vol. 20, № 9.

134. Brechalov A.V., Georgieva S.G., Soshnikova N.V. Mammalian cells contain two functionally distinct PBAF complexes incorporating different isoforms of PHF10 signature subunit // Cell Cycle. 2014. Vol. 13, № 12. P. 19701979.

135. Brechalov A.V. et al. PHF10 isoforms are phosphorylated in the PBAF mammalian chromatin remodeling complex // Molecular Biology. 2016. Vol. 50, № 2. P. 278-283.

136. Kwan A.H.Y. et al. Engineering a protein scaffold from a PHD finger // Structure. 2003. Vol. 11, № 7. P. 803-813.

137. Sanchez R., Zhou M.-M. The PHD finger: a versatile epigenome reader // Trends Biochem. Sci. 2011. Vol. 36, № 7. P. 364-372.

138. Musselman C.A., Kutateladze T.G. Handpicking epigenetic marks with PHD fingers // Nucleic Acids Res. 2011. Vol. 39, № 21. P. 9061-9071.

139. Jain K. et al. Characterization of the plant homeodomain (PHD) reader family for their histone tail interactions // Epigenetics Chromatin. 2020. Vol. 13, № 1. P. 3.

140. Morrison E.A., Musselman C.A. The Role of PHD Fingers in Chromatin Signaling // Chromatin Signaling and Diseases. 2016. P. 127-147.

141. Soshnikova N.V. et al. The DPF Domain As a Unique Structural Unit Participating in Transcriptional Activation, Cell Differentiation, and Malignant Transformation // Acta Naturae. 2020. Vol. 12, № 4. P. 57-65.

142. Ullah M. et al. Molecular architecture of quartet MOZ/MORF histone acetyltransferase complexes // Mol. Cell. Biol. 2008. Vol. 28, № 22. P. 6828-6843.

143. Klein B.J. et al. Crosstalk between epigenetic readers regulates the MOZ/MORF HAT complexes // Epigenetics. 2014. Vol. 9, № 2. P. 186193.

144. Wu J.I. Diverse functions of ATP-dependent chromatin remodeling complexes in development and cancer // Acta Biochim. Biophys. Sin. . 2012. Vol. 44, № 1. P. 54-69.

145. Ali M. et al. Tandem PHD fingers of MORF/MOZ acetyltransferases display selectivity for acetylated histone H3 and are required for the association with chromatin // J. Mol. Biol. 2012. Vol. 424, № 5. P. 328-338.

146. Dreveny I. et al. The double PHD finger domain of MOZ/MYST3 induces

a-helical structure of the histone H3 tail to facilitate acetylation and methylation sampling and modification // Nucleic Acids Res. 2014. Vol. 42, № 2. P. 822-835.

147. Tan M. et al. Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification // Cell. 2011. Vol. 146, № 6. P. 1016-1028.

148. Tatarskiy V.V. et al. Stability of the PHF10 subunit of PBAF signature module is regulated by phosphorylation: role of ß-TrCP // Sci. Rep. 2017. Vol. 7, № 1. P. 5645.

149. Soshnikova N.V. et al. PHF10 subunit of PBAF complex mediates transcriptional activation by MYC // Oncogene. 2021. Vol. 40, № 42. P. 6071-6080.

150. Krasteva V., Crabtree G.R., Lessard J.A. The BAF45a/PHF10 subunit of SWI/SNF-like chromatin remodeling complexes is essential for hematopoietic stem cell maintenance // Exp. Hematol. 2017. Vol. 48. P. 58-71.e15.

151. Brechalov A.V. et al. [PHF10 isoforms are phosphorylated in the PBAF mammalian chromatin remodeling complex] // Mol. Biol. . 2016. Vol. 50, № 2. P. 320-326.

152. Stewart S.A. et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells // RNA. 2003. Vol. 9, № 4. P. 493-501.

153. Shin K.-J. et al. A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006. Vol. 103, № 37. P. 13759-13764.

154. Hermeking H. et al. Identification of CDK4 as a target of c-MYC // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000. Vol. 97, № 5. P. 2229-2234.

155. Alam M.S. Proximity Ligation Assay (PLA) // Curr. Protoc. Immunol. 2018. Vol. 123, № 1. P. e58.

156. Mittal P., Roberts C.W.M. The SWI/SNF complex in cancer - biology, biomarkers and therapy // Nat. Rev. Clin. Oncol. 2020. Vol. 17, № 7. P. 435-

157. Lu B., Shi H. An In-Depth Look at Small Cell Carcinoma of the Ovary, Hypercalcemic Type (SCCOHT): Clinical Implications from Recent Molecular Findings // Journal of Cancer. 2019. Vol. 10, № 1. P. 223-237.

158. Buscarlet M. et al. Essential role of BRG, the ATPase subunit of BAF chromatin remodeling complexes, in leukemia maintenance // Blood. 2014. Vol. 123, № 11. P. 1720-1728.

159. Anbunathan H. et al. Integrative Copy Number Analysis of Uveal Melanoma Reveals Novel Candidate Genes Involved in Tumorigenesis Including a Tumor Suppressor Role for PHF10/BAF45a // Clinical Cancer Research. 2019. Vol. 25, № 16. P. 5156-5166.