Механизм регуляции активности фактора транскрипции TnrA - основного регулятора азотного метаболизма Bacillus subtilis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Федорова, Ксения Павловна

• Федорова, Ксения Павловна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Федорова, Ксения Павловна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Азотный обмен в клетках бактерий

1.2 Белки азотного обмена Bacillus subtilis

1.2.1 Нитрат- и нитритредуктазы

1.2.2 Глутаматсинтаза и глутаминсинтетаза

1.2.3 Белки AmtB и GlnK

1.2.4 Фактор транскрипции ТпгА

1.3 Регуляция генов белков азотного метаболизма с участием факторов

транскрипции TnrA, GlnR, CodY, GltC

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Активность и локализация фактора транскрипции ТпгА в условиях избытка или недостатка восстановленного азота

3.1.1 Активность фактора транскрипции ТпгА в штаммах, мутантных

по белкам GS, GlnK и AmtB

3.1.2 Исследование локализации фактора транскрипции ТпгА в зависимости от доступности азота

3.2 Идентификация домена сигнальной трансдукции фактора транскрипции ТпгА

3.2.1 Получение факторов транскрипции ТпгА с делециями С-концевого домена

3.2.2 Изучение влияния С-концевого домена фактора транскрипции ТпгА на активность ДНК-связывающего домена

3.2.3 Определение участков С-концевого домена ТпгА, ответственных

за взаимодействие с регуляторными белками GS и GlnK

3.2.4 Влияние эффекторных молекул на взаимодействие ТпгА с GlnK и

GS

3.2.5 Исследование конкурентного взаимодействия GlnK и GS с ТпгА

в условиях in vitro

3.2.6 Изучение влияния белков GlnK и GS на ДНК-связывающую активность фактора транскрипции ТпгА в условиях in vitro

3.3 Участие фактора транскрипции ТпгА в регуляции активности глутаминсинтетазы в клетках Bacillus subtilis

3.3.1 Исследование влияния фактора транскрипции ТпгА на активность GS в условиях in vitro

3.3.2 Изучение участия фактора транскрипции ТпгА в регуляции активности GS в условиях in vivo

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1 Активность и локализация фактора транскрипции ТпгА в условиях избытка или недостатка восстановленного азота

4.2 Идентификация домена сигнальной трансдукции фактора транскрипции ТпгА

4.3 Участие фактора транскрипции ТпгА в регуляции активности глутаминсинтетазы в клетках Bacillus subtilis

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизм регуляции активности фактора транскрипции TnrA - основного регулятора азотного метаболизма Bacillus subtilis»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Бактерии в ходе эволюции выработали сложные механизмы адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды и способны использовать широкий спектр источников питания. Общие принципы регуляции метаболизма клеток универсальны, поэтому большинство биохимических процессов, задействованных в процессах реализации генетической информации и поддержания клеточного гомеостаза высоко консервативны. Понимание молекулярно-генетических механизмов адаптации микроорганизмов к стрессовым условиям актуально как для разработки новых принципов подавления роста и размножения патогенных бактерий, так и для повышения продуктивности и жизнеспособности промышленно значимых бактерий.

Азот является одним из важнейших макроэлементов, участвующих в построении клеток живых организмов и составляет до 10% сухого вещества клетки. В природных экосистемах азот встречается в окисленной, восстановленной и молекулярной формах, но в конструктивном клеточном метаболизме азот используется только в восстановленной форме в виде аминогрупп. Соли аммония, мочевина, органические соединения (аминокислоты или пептиды) являются наиболее предпочтительными и легко усваиваемыми источниками азота для клеток. Однако многие микроорганизмы способны потреблять и окисленные формы азота в виде нитратов и нитритов. В анаэробных условиях некоторые микроорганизмы способны использовать нитрат в качестве конечного акцептора электронов, восстанавливая его до нитрита и газообразных форм азота (N20, N0, N2) в процессе диссимиляционной нитратредукции. Наряду с большинством растений многие бактерии используют окисленный азот для синтеза азотсодержащих клеточных компонентов. Этот процесс протекает как в аэробных, так и в анаэробных условиях, сопровождается затратами клеточной энергии и получил название ассимиляционной нитратредукции.

Условия дефицита источника восстановленного азота являются неблагоприятными для роста и развития микроорганизмов. При низком

содержании восстановленного азота в среде (например, ионы аммония или глутамин в концентрациях менее 2 мМ) или в присутствии только окисленных форм азота (нитраты и нитриты независимо от концентрации) в клетках бактерий запускается каскад регуляторных процессов, направленных на утилизацию азота из различных соединений.

В клетках Bacillus subtilis фактор транскрипции ТпгА контролирует гены, продукты которых вовлечены в процессы ассимиляции различных азотсодержащих соединений в условиях недостатка азота в среде: транспорт ионов аммония, ассимиляция мочевины, нитрата и нитрита и других соединений азота (Wray et al., 1996, Yoshida et al., 2003). Взаимодействуя с промоторной областью генов-мишеней (TnrA-регулона), он активирует, или, наоборот, подавляет их транскрипцию в ответ на изменение условий окружающей среды (Yoshida et al., 2003). В отличие от других регуляторов транскрипции, фактор ТпгА не подвержен ковалентной модификации и не имеет сайтов для взаимодействия с низкомолекулярными эффекторными молекулами (лигандами) (Fisher, 1999). Это свидетельствует об уникальных механизмах передачи сигнала на этот регуляторный белок, которые на сегодняшний день остаются мало изученными. Ряд работ демонстрирует, что активность фактора ТпгА контролируется путем взаимодействия с другими белками. Белками-партнерами фактора транскрипции ТпгА являются глутаминсинтетаза (GS) и белок GlnK. Гомологи белка GlnK в клетках многих бактерий регулируют активность белка AmtB, который осуществляет активный транспорт ионов аммония в клетки (Wray et al., 2001, Heinrich et al., 2006, Tremblay, Hallenbeck, 2009). Возможно, белки AmtB, GlnK и GS образуют молекулярную систему трансдукции сигнала о доступности азота на фактор транскрипции ТпгА (Wray et al., 2001, Detsch, Stulke, 2003, Heinrich et al., 2006, Tremblay, Hallenbeck, 2009, Gunka, Commichau, 2012).

Цель работы - выяснение молекулярного механизма регуляции активности фактора транскрипции ТпгА у Bacillus subtilis в условиях дефицита и избытка источника восстановленного азота.

В работе решали следующие задачи:

1. Определить участие глутаминсинтетазы и белков AmtB и GlnK в регуляции активности фактора транскрипции ТпгА у Bacillus subtilis в условиях дефицита и избытка восстановленного азота.

2. Выявить изменение локализации фактора транскрипции ТпгА при смене условий культивирования Bacillus subtilis (от дефицита источника восстановленного азота к его избытку).

3. Исследовать влияние белка GlnK и глутаминсинтетазы на ДНК-связывающую активность фактора транскрипции ТпгА в условиях in vitro.

4. Создать генетические конструкции на основе плазмиды рЕТ15Ь для гиперпродукции в клетках E.coli рекомбинантных белков ТпгА с укороченным С-концевым доменом и гексагистидиновой последовательностью на N-конце белка и получить эти белки в электрофоретически гомогенном состоянии.

5. Установить сайты взаимодействия белка GlnK и глутаминсинтетазы с С-концевым доменом фактора ТпгА, выявить регуляторную роль С-концевого домена в димеризации фактора транскрипции ТпгА и связывании N-концевого домена с ДНК.

6. Изучить влияние фактора транскрипции ТпгА на биосинтетическую активность глутаминсинтетазы при взаимодействии этих белков in vitro и внутриклеточно в штаммах Bacillus subtilis дикого типа и мутантных по белкам AmtB и GlnK.

Научная новизна

Впервые показано, что смена аффинности глутаминсинтетазы и белка GlnK к ТпгА определяет локализацию фактора ТпгА и регулирует его активность в зависимости от условий дефицита или избытка восстановленного азота в среде. Белок AmtB, ответственный за транспорт ионов аммония в клетку и формирующий сигнал о доступности азота в клетках многих организмов, не участвует в передаче сигнала на фактор ТпгА у бацилл. Впервые установлено, что in vivo глутаминсинтетаза подавляет активность фактора транскрипции ТпгА не только в условиях избытка восстановленного азота, как сообщалось ранее (Wray

et al., 2001), но и в условиях его недостатка. Эксперименты in vitro показали, что белок GlnK не подавляет ДНК-связывающую активность ТпгА, в то время как активная и ингибированная формы глутаминсинтетазы в разной степени снижают способность ТпгА взаимодействовать с ДНК. Впервые продемонстрировано, что С-концевая область ТпгА не участвует в димеризации белка, но контролирует ДНК-связывающую активность N-концевого домена. Установлено, что за взаимодействие с белком GlnK и глутаминсинтетазой отвечают разные участки С-концевого домена фактора транскрипции ТпгА. Впервые охарактеризован ингибирующий эффект фактора транскрипции ТпгА на ферментативную активность глутаминсинтетазы.

Практическая значимость

Полученные результаты представляют собой новый блок фундаментальных знаний о регуляции азотного метаболизма в клетках бактерий. Примеры регуляции активности факторов транскрипции путем взаимодействия с ферментом представлены на сегодняшний день единичными случаями, полученные результаты расширяют представления о способах контроля активности ДНК-связывающих белков в клетке. Учитывая значение азотного питания для жизнедеятельности микроорганизмов, полученные данные могут быть применены в биотехнологических процессах, требующих особого внимания к регуляторным механизмам микроорганизмов, связанных с культивированием генномодифицированных бактерий для продукции целевых белков и азотсодержащих метаболитов, а также в биомедицине для поиска ингибиторов азотного обмена клетки.

На защиту выносятся следующие положения:

1. В клетках бацилл активность фактора транскрипции ТпгА зависит от количественного соотношения его комплекса с белком GlnK (активная форма белка ТпгА) и глутаминсинтетазой (неактивная форма белка ТпгА) и определяется изменением аффинности белка GlnK и глутаминсинтетазы к

фактору TnrA в зависимости от условий дефицита или избытка восстановленного азота.

2. С-концевой домен фактора TnrA является регулятором активности ДНК-связывающего N-концевого домена и конкурентно взаимодействует с глутаминсинтетазой на участке Phel05 - Arg 110 и белком GlnK на участке Leu75 - Рго90.

3. Биосинтетическая активность глутаминсинтетазы подавляется при ее связывании с фактором TnrA: этот уникальный механизм является одним из основных путей регуляции активности фермента в ответ на изменение доступности источников азота для клетки.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), Международной конференции «Развитие междисциплинарных исследований: перспективные направления и вклад DAAD» (Казань, 2009), XIII европейском симпозиуме студентов-биологов «SymBioSE 2009», Международных конференциях аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009, 2011), Российской школе молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии» (Казань, 2010), Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010), Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2010, 2011, 2013), Всероссийской научно-практической (заочной) конференции «Естественные науки и современность: проблемы и перспективы исследований» (Москва, 2011), Международной конференции молодых ученых «Молодежь в науке - 2011» (Минск, 2011), III Международной научной конференции по биологии (Тбилиси, 2011), Ежегодной международной конференции «Ассоциация общей и прикладной микробиологии» (Тюбинген, 2012), III Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012).

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Азотный обмен в клетках бактерий

Бактерии выработали сложные механизмы адаптации, которые позволяют им использовать широкий ассортимент источников энергии и таких жизненно необходимых элементов как углерод, азот, фосфор и сера. Азот необходим бактериям для синтеза аминокислот (белков), пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, а также некоторых витаминов. В качестве источников азота микроорганизмы способны усваивать различные вещества, отличающиеся как по концентрации в окружающей среде, так и по степени доступности для ассимиляции, например, возможность транспорта в клетку, энергетические затраты на усвоение и включение в метаболизм.

В природе атомы минерального азота существуют в различной степени окисления: от И54" (N03", нитраты) до (>ПНЦ+, ионы аммония). Поскольку азот во всех живых организмах содержится в восстановленной форме, все атомы азота с большей степенью окисления, чем К3', должны быть восстановлены. Степень усвояемости минеральных соединений азота бактериями определяется возможностью их превращения в аммонийный азот, так как он является предпочтительным источником восстановленного азота для включения в высокомолекулярные азотсодержащие органические соединения. Соответственно, ионы аммония, мочевина и многие органические вещества (например, пептиды, аминокислоты, нуклеотиды), в которых азот находится уже в восстановленном виде, представляют собой легко усваиваемые и предпочтительные источники азота для клеток. Недостаток источников восстановленного азота неблагоприятно сказывается на росте и развитии микроорганизмов и запускает каскады регуляторных процессов, направленных на ассимиляцию альтернативных источников азота (БопешЬет, 2007). Несмотря на то, что многие микроорганизмы могут использовать и окисленные формы азота в виде нитратов и нитритов, их ассимиляция требует высоких энергетических затрат. Поэтому их потребление бактериями в качестве источников азота, несмотря на концентрацию в среде, создает условия дефицита азота для клеток.

У бактерий возможны два разнонаправленных процесса: ассимиляция (связывание минеральных форм азота в органический материал) и диссимиляция (выделения газообразных форм азота). К ассимиляционным процессам относят связывание минеральных форм азота (N2, NO3", NCV, NH/) в ходе азотфиксации, ассимиляционной нитратредукции и ассимиляции аммиака. К диссимиляционным процессам относят денитрификацию или «нитратное дыхание» - восстановление NO3" через NCVflO газообразной закиси азота (N2O) и азота (N2).

В условиях недостатка восстановленного минерального азота, клетки Bacillus subtilis способны продуцировать целый ряд экзоферментов (протеазы, нуклеазы, уреазы и пр.). Секреция в среду протеаз позволяет бациллам расщеплять белки до низкомолекулярных пептидов и аминокислот и, тем самым, утилизировать белковый азот (Каюмов с соавт., 2009). При участии внеклеточных нуклеаз (ДНКаз и РНКаз) клетки ассимилируют нуклеиновые кислоты и их производные — пуриновые и пиримидиновые основания. Утилизация мочевины и мочевой кислоты происходит при участии фермента группы амид аз - уреазы. Если синтез экзоферментов не решает проблем голодания, клетки бацилл включают программы приобретения генетической компетентности, спорообразования и образования антибиотиков (субтилин, сурфактин, бацилломицин, бацилизин, фенгицин) (Fabret et al., 1999, Sonenshein, 2000).

Бактерии В. subtilis не способны утилизировать газообразный азот (N2), восстанавливая его до ионов аммония в процессе азотфиксации. В отличие от E.coli, неспособных ассимилировать нитраты или нитриты в присутствии кислорода, В.subtilis могут использовать нитрат и нитрит в качестве единственных источников азота в аэробных условиях в процессе ассимиляционной нитратредукции (Nakano, Zuber, 1998). Кроме того, в отсутствии кислорода В.subtilis используют нитраты и нитриты в качестве акцепторов электронов для нитратного дыхания, в процессе диссимиляционной нитратредукции. При этом недавно было показано, что наряду со многими денитрифицирующими бактериями В.subtilis способны восстановливать ионы NO3' не только до нитритов (N02"), но и до газообразных форм азота (N20, NO, N2) (Verbaendert et al., 2011).

1.2 Белки азотного обмена Bacillus subtilis

1.2.1 Нитрат- и нитритредуктазы

В клетках В.subtilis нитрат- и нитритредуктазы катализируют реакции восстановления нитрата и нитрита до аммония. В геноме B.subtilis два оперона кодируют разные нитратредуктазы: нитратредуктаза (narGHI) отвечает за нитратное дыхание, а нитратредуктаза (nasBC) - за ассимиляцию нитратов (Richardson et al., 2001, Luque-Almagro et al., 2011). При этом гены nasDE кодируют НАДФН-зависимую нитритредуктазу, необходимую как для нитратного дыхания, так и для ассимиляционных процессов.

Гены, кодирующие субъединицы ассимиляционных нитрат- (nasB и nasC) и нитрит- (<nasD и nasE) редуктаз образуют единый оперон с геном nasF, кодирующим синтез кофактора нитритредуктазы. Оперон транскрибируется в противоположную сторону от гена nasA, который синтезирует предполагаемый транспортер нитрата - NasA (Рисунок 1) (Ogawa et al., 1995).

Bacillus subtilis

А В С D E F

NO,-

NO,-NH/

I

| NAD(P)li

Рисунок 1 - Организация оперона nasABCDEF, кодирующего гены ассимиляционной нитратредуктазы и нитритредуктазы у B.subtilis (Richardson et al., 2001). NasA - предполагаемый транспортер нитрата, NasB - нитратредуктаза, NasC - флавопротеин, NasD NasE - нитритредуктаза, NAD(P)H -никотинамидадениндинуклеотидфосфат, FAD - флавинадениндинуклеотид, MGD - молибдоптерин гуанин динуклеотид

Оперон пазАВСИЕЕ включает гены синтеза нитратредуктазы (паБВ), железосерного белка нитритредуктазы (иш^О) и флавопротеина (,гклбС), выполняющего функцию донора электронов для белков КазБ и КазВ (Рисунок 1) (С^аша е1 а1., 1995). Ген С-концевого фрагмента нитритредуктазы транскрибируется отдельно (<паБЕГ). Транскрипция оперона пазАВСИЕЕ активируется в условиях азотного голодания и в присутствии кислорода и регулируется фактором транскрипции ТпгА. В анаэробных условиях, индукция оперона пазИЕЕ требует присутствия нитрита и двухкомпонентной регуляторной системы ЯезВЕ (Иакапо е1 а1., 1996). Эта система также необходима для экспрессии генов нитратредуктазы (пагОШ), участвующей в нитратном дыхании.

В отсутствии кислорода нитрат является предпочтительным акцептором электронов, поскольку имеет достаточно высокий восстановительный потенциал (Е° = +430 мВ). Фумаратное дыхание и использование других акцепторов электронов в анаэробных условиях роста у В.быЫШз не обнаружено (БсЫгашзкл, ипёеп, 1995, Ыакапо е1 а1., 1997). На сегодняшний день нитратное и нитритное дыхание являются единственными анаэробными способами дыхания клеток В.БиЬиШ (№капо е1 а1., 1997). В условиях высокого содержания нитрата и отсутствия кислорода НАДФН-зависимая нитритредуктаза (пазИЕЕ) функционирует совместно с нитратредуктазой азотного дыхания, кодируемой опероном пагОНЛ и обеспечивает детоксикацию нитрит ионов, восстанавливая их до ионов аммония (Ыакапо е1 а1., 1997).

1.2.2 Глутаматсинтаза и глутаминсинтетаза

Аминокислоты глутамат и глутамин являются универсальными и наиболее предпочтительными источниками восстановленного азота для синтеза всех азотсодержащих веществ в клетках живых организмов. Глутамин легко преобразуется в глутамат, который служит основным донором азота для синтеза аминокислот, пуринов и пиримидинов, а также некоторых витаминов. К примеру, в клетках В.зиЫШэ глутамат является донором аминогрупп для 37 реакций трансаминирования и составляет порядка 40% от общего пула основных

метаболитов в клетках (Bennett et al., 2009). В природе существуют два биосинтетических пути образования глутамата: с участием фермента НАДФН-зависимой глутаматдегидрогеназы (GDH), синтезирующего глутамат путем восстановительного аминирования 2-оксоглутарата, и с помощью фермента глутаматсинтазы (GOGAT), образущего две молекулы глутамата в реакции трансаминирования между молекулами глутамина и 2-оксоглутарата (Рисунок 2). Далее АТФ-зависимый фермент глутаминсинтетаза (GS) синтезирует глутамин из глутамата и ионов аммония. 2-оксоглутарат, один из субстратов цикла GS/GOGAT, образуется в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК) и представляет собой углеродный скелет для синтеза глутамата, глутамина и других аминокислот (аргинин, орнитин, пролин и гистидин), которые катаболизируются до глутамата (Sonenshein, 2007).

Рисунок 2 - Метаболические пути биосинтеза глутамата и глутамина в клетках большинства микроорганизмов (Сипка, СоттісЬаи, 2012). ООН -глутаматдегидрогеназа, ОСЮАТ - глутаматсинтаза, 05 - глутаминсинтетаза

Помимо этого, 2-оксоглутарат является субстратом (или продуктом реакции) для большинства аминотрансфераз, которые участвуют в процессе взаимопревращения аминокислот и их кетокислот. Таким образом, 2-оксоглутарат выступает в качестве важнейшего метаболита, который связывает

биосинтетические пути углеродного и азотного метаболизма (Sonenshein, 2007, Gunka, Commichau, 2012).

Многие бактерии используют оба пути биосинтеза глутамата (Reitzer, 2003, Rehm, Burovski, 2010). Фермент GDH имеет меньшую аффинность к ионам аммония, чем GS и активен только при их высоких концентрациях (Reitzer, 2003). Цикл GS/GOGAT напротив, функционирует в условиях низкой концентрации ионов аммония, но в отличие от GDH нуждается в молекулах АТФ.

В отличие от клеток E.coli и многих других организмов, энергозависимый метаболический путь GS/GOGAT является единственным способом ассимиляции аммиака клетками B.subtilis (Fisher, 1999). Несмотря на наличие гена, кодирующего глутаматдегидрогеназу (rocG) этот фермент практически не активен в клетках B.subtilis, поскольку обладает в семь раз меньшей аффинностью к ионам аммония по сравнению с GDH E.coli (Gunka et al., 2010).

Глутаматсинтаза (GOGAT, ЕС 1.4.1.13 глутамин-2-оксоглутарат-аминотрансфераза) клеток B.subtilis состоит из субъединиц GltA и GltB, кодируемых опероном gltAB (Deshpande, Капе, 1980). Из глутамина и 2-оксоглутарата GOGAT синтезирует две молекулы глутамата (Рисунок 2), при этом одна молекула глутамата выступает в качестве субстрата для GS, вторая молекула является донором аминогрупп в реакциях трансаминирования. Экспрессия генов gltAB подвержена контролю со стороны углеродного и азотного метаболизма и зависит от факторов транскрипции GltC и TnrA (Belitsky et al., 2000, Belitsky, Sonenshein, 2004). В присутствии глюкозы, клетки начинают быстрее расти, потребность в глутамате возрастает и GltC активирует транскрипцию оперона gltAB (Wacker et al., 2003). В отсутствии глутамина, потребность в GOGAT снижается и фактор транскрипции TnrA, связываясь с промотором gltAB, препятствует активации экспрессии генов gltAB белком GltC (Gunka, Commichau, 2012). В присутствии избытка источника восстановленного азота активность TnrA подавляется глутаминсинтетазой и ингибирование оперона gltAB снижается. Поскольку GOGAT является железосодержащим ферментом, его

синтез дополнительно контролируются доступностью ионов железа (Miethke et al., 2006).

Таким образом, биосинтез глутамата в клетках Bacillus subtilis регулируется со стороны углеродного и азотного метаболизма и нуждается в присутствии ионов железа в среде культивирования (Gunka, Commichau, 2012).

Глутаминсинтетаза играет ключевую роль в ассимиляции ионов аммония и регуляции генов азотного метаболизма в клетках В.subtilis. Глутаминсинтетаза (GS; ЕС 6.3.1.2, L-глутамат: аммиак лигаза АДФ- образующая) катализирует АТФ-зависимое присоединение ионов аммония (NH4+) к у-карбоксильной группе глутамата с образованием глутамина в присутствии ионов Mg2+ или Mn2+ (Deuel, Stadtman, 1970). В бактериальных клетках обнаружены различные изоформы фермента GS: GSI, GSII, GSIII, при этом самой широко распространенной формой фермента является GSI, кодируемая геном glnA (Merrick, Edwards, 1995). В клетках В.subtilis обнаружен только один тип GS, относящийся к семейству GSI-a (Strauch et al., 1988). Молекула GSI представляет собой додекамерный фермент, состоящий из 12 идентичных субъединиц размером приблизительно 55 кДа, организованных в два гексамера (Рисунок 3) (Eisenberg et al., 2000). Высокая степень гомологии GSI S.typhimurium и В. subtilis позволяет использовать кристаллическую структуру белка S.typhimurium для моделирования четвертичной структуры глутаминсинтетазы в клетках бацилл (Fisher et al., 2002). Фермент GS В.subtilis имеет 12 каталитических центров, каждый из которых образован из двух ß-цепей N-конца одной субъединицы и шести ß-цепей С-концевого участка соседней субъединицы (Yamashita et al., 1989). Активные центры располагаются внутри гексамерных колец и формируют цилиндрические структуры, при этом взаимодействие с субстратами GS - глутаматом и АТФ - происходит на противоположных участках цилиндра, а связывание с ионами Mg2+ или Мп2+ - в центральной части цилиндра (Рисунок 3) (Liaw et al., 1994).

Рисунок 3 - Модель пространственной структуры молекулы GSI на основе кристаллической структуры глутаминсинтетазы Salmonella typhimurium (Yamashita et al., 1989, Gill, Eisenberg 2001). В середине активных центров розовым цветом выделены аминокислоты, с которыми взаимодействуют ионы двухвалентных металлов (Mg2+ или Мп2+)

Поскольку глутамин является одним из ключевых метаболитов азотного обмена микробной клетки, регуляция синтеза и активности GS подвержена строгому контролю, который позволяет сохранить количество фермента на необходимом уровне в разных условиях роста. Максимальная активность фермента наблюдается в условиях недостатка восстановленного азота, в то время как в условиях его избытка активность GS находится на низком уровне (Pan, Coote, 1979, Amon et al., 2010). При этом ферментативная активность GS в клетках разных бактерий регулируется различными способами. В отличие от клеток E.coli, где активность GS контролируется ковалентной модификацией фермента путем аденилирования, энзиматическая активность глутаминсинтетазы в клетках B.subtilis регулируется ингибированием по типу обратной связи - глутамином, конечным продуктом реакции (Deuel, Prusiner, 1974). Для каталитической активности GS в клетках B.subtilis помимо глутамата, АТФ и аммония, необходимо присутствие ионов двухвалентных металлов: Mg2+ или Mn2+ (Deuel,

Stadtman, 1970). Глутамин и АМФ являются эффективными ингибиторами Mg2+-зависимой биосинтетической активности GS, в то время как аланин, глицин, серин и триптофан частично подавляют Мп2+-зависимую биосинтетическую реакцию (Deuel, Prusiner, 1974). Для определения ферментативной активности GS в условиях in vitro используют как Mg2+- так и Мп2+-зависимые реакции, однако физиологически релевантным способом измерения активности GS является Mg2+-зависимая биосинтетическая реакция (Wray, Fisher, 2005).

Глутаминсинтетазу B.subtilis также называют триггерным или бифункциональным белком. Помимо участия в метаболических реакциях, фермент контролирует экспрессию генов азотного обмена (Wray, Fisher, 2010, Gunka, Commichau, 2012), образуя белковые комплексы с ключевыми транскрипционными факторами ТпгА и GlnR, тем самым модулируя их ДНК-связывающие активности (Wray et al., 2001, Fisher, Wray, 2008). Ингибированная GS, с одной стороны, выступает в роли шаперона, стабилизируя взаимодействие регуляторного белка GlnR с промоторами генов (Fisher, Wray, 2008). С другой стороны, она подавляет ДНК-связывающую активность белка TnrA (Fisher, 1999, Wray et al., 2001).

Известно, что глутамин, глицин и аланин связываются непосредственно с глутамат-связывающими сайтами GS, что приводит к конформационным изменениям фермента и усилению взаимодействия GS с белком TnrA (Fisher et al., 2002). При этом молекулы АМФ взаимодействуют с АТФ-связывающими сайтами, но не так значительно способствуют взаимодействию TnrA с GS, как глутамин (Wray et al., 2001). На сегодняшний день показано, что белки TnrA и GlnR взаимодействуют с глутаминсинтетазой в области глутамат-связывающего сайта, однако остается неясным, почему ингибированная GS оказывает различное воздействие на ДНК-связывающую активность этих факторов транскрипции (Wray, Fisher, 2010).

1.2.3 Белки AmtB и GlnK

В отсутствии наиболее предпочтительного источника азота - глутамина, клетки бацилл способны утилизировать ионы аммония в качестве источника азота. В клетках B.subtilis оперон nrgAB (amtBglnK), кодирует белки, гомологичные AmtB и GlnK (Detsch, Stulke, 2003). Трансмембранный белок AmtB транспортирует в клетку ионы аммония в условиях их низкой концентрации (Detsch, Stulke, 2003, Javelle et al., 2004, Khademi, Stroud, 2006). Микроорганизмы, мутантные по гену amtB, плохо растут на среде с низкой концентрацией аммония в качестве источника азота (Detsch, Stulke, 2003). До конца остается неизвестным, каким образом происходит регуляция активности белка AmtB: является ли транспорт аммония активным или нет (Boogerd et al., 2011). В щелочных условиях среды большая часть ионов аммония (NH44") представлена в виде газообразного аммиака (NH3), который, в отличие от ионов аммония, легко проникает в клетки через цитоплазматическую мембрану путем простой диффузии (Detsch, Stulke, 2003). Поскольку пассивный транспорт аммония в клетку является недостаточным для обеспечения высокой скорости роста клеток, вероятнее всего, транспорт ионов аммония белком AmtB подвержен активной регуляции (Boogerd et al., 2011). Предполагается, что модуляция активности AmtB белком GlnK необходима для предотвращения нецелесообразного поступления и утечки ионов аммония через белок AmtB (Radchenko et al., 2010, Boogerd et al., 2011). Однако эта гипотеза по-прежнему нуждается в экспериментальных подтверждениях (Gunka, Commichau, 2012).

Ген nrgB кодирует регуляторный белок GlnK, принадлежащий семейству PII белков (Wray et al., 1994). В клетках бактерий PII белки участвуют в передаче сигнала об углеродном, азотном и энергетическом статусе клеток на ключевые ферменты метаболических путей ассимиляции азота (Javelle, Merrick, 2005, Forchhammer, 2008). Эффекторами белков семейства PII являются АТФ, АДФ, 2-оксоглутарат и ионы Mg2+ (Ninfa, Jiang, 2005). Большинство PII белков подвержено ковалентной модификации путем уридилирования или фосфорилирования (Forchhammer, 2008). Однако белок GlnK в клетках B.subtilis

не регулируется уровнем 2-оксоглутарата и концентрацией молекул АДФ (Heinrich et al., 2006, Forchhammer, 2008). Также, в отличие от остальных белков PII, GlnK B.subtilis не имеет консервативных сайтов уридилирования или фосфорилирования, но, как и в клетках E.coli GlnK связан с белком AmtB и имеет мембранную локализацию (Detsch, Stulke, 2003, Dyrand, Merrick, 2006). Мембранная локализация белка GlnK в клетках B.subtilis до конца еще не изучена и до сих пор остается неясным участвует ли GlnK в регуляции активности AmtB, как это показано в клетках E.coli (Conroy et al., 2007). Тем не менее, ранее было показано влияние GlnK на использование клеткой нитрата в качестве источника азота (Detsch, Stulke, 2003). По всей видимости, он выполняет регуляторную роль, которая пока остается не ясной (Detsch, Stulke, 2003). Кроме того, белок GlnK способен связываться с фактором регуляции азотного метаболизма ТпгА, при этом высвобождая ТпгА из комплекса с GS и переводя его в мембраносвязанное состояние (Forchhammer, 2008). Комплекс белков TnrA-GlnK высокочувствителен к присутствию АТФ в среде и in vitro диссоциирует уже при концентрации 4 мМ АТФ (Heinrich et al., 2006).

1.2.4 Фактор транскрипции ТпгА

Фактор транскрипции ТпгА относится к семейству белков MerR, которые участвуют в регуляции экспрессии генов, вовлеченных в ассимиляцию, удаление или детоксикацию тех или иных химических соединений в клетке (Brown et al., 2003, Newberry, Brennan, 2004, Hobman, 2007). На сегодняшний день известно более 500 белков этого семейства, обнаруженных у различных бактерий и, несмотря на общность строения, ответственных за узнавание и взаимодействие с различными соединениями (Brown et al., 2003; Permina et al., 2006). Описаны факторы транскрипции, регулирующие экспрессию генов устойчивости к цинку (ZntR), меди (CueR и HmrR), кадмию (CadR), ртути (MerR), супероксидрадикалу (SoxR) и другим соединениям (TipA, BmrR, NmlR) (Brown et al., 2003, Hobman, 2007, Permina et al., 2006).

Белки семейства MerR находятся в клетках в димерной форме и содержат три различных домена, при этом N-концевой взаимодействует с ДНК, а С-концевой воспринимает регуляторный сигнал (Рисунок 4) (Brown et al., 2003). N-и С-концевые домены связаны длинной спиралью, которая формирует антипараллельную биспиральную структуру, необходимую для димеризации (Рисунок 4) (Changela et al., 2003; Newberry, Brennan, 2004). Все представители этого семейства имеют гомологичные N-концевые ДНК-связывающие домены длиной около 70 аминокислот, представленные двумя а-спиралями, соединенных поворотом - НТН (helix-turn-helix) мотивом, ß-структурой и а-спиралями 3, 4 (Heldwein, Brennan, 2001, Newberry, Brennan, 2004, Changela et al., 2003). C-концевые участки, ответственные за взаимодействие с эффекторными молекулами, демонстрируют низкую степень гомологии и консервативны только среди белков ортологов (Brown et al., 2003; Newberry, Brennan, 2004, MarchlerBauer et al., 2005).

A

ДНК-связывающий двойная

домен спираль домен сигнальной трансдукции

BmrR -—M-IZZl-KXXXXXXXXXX]

ДНК-связывающий двойная спираль и домен домен сигнальной

трансдукции

Б

»........к.........м.........т .... . . ... т.........и.........я

MTTEDHSYKOKKVI Sl Gl VSELTGLSVRQI RYYEERKLI Y Р QR S S R GT R К YSF A DV Е R L М

■»МШДЦ ЛААЛЛААЛЛ ЛААААААА

а спираль - поворот - а спираль ß структура а спираль 3

.........п.........И.........«.........и* .........Ш

DI ANKRE DGVQTAEI L К DMR К К Е QMLK N DP QV R К К Ml Е GQL N А Н F R Y К N R

ЛЛАЛЛАЛ ШШШ ШШШШШАШ

а спираль 4 а спираль 5

Рисунок 4 - Доменная структура белков семейства MerR на примере BmrR и ТпгА (А) (Heldwein, Brennan, 2001, Wray, Fisher, 2007). Предположительная вторичная структура белка TnrA B.subtilis полученная на основе кристаллических структур других белков семейства MerR с использованием сервера Phyre (Б) (Kelley, Sternberg, 2009)

Среди всех представителей белков семейства MerR самым небольшим является фактор ТпгА размером 12 кДа, который состоит из 110 аминокислотных остатков и содержит только два функциональных домена (Рисунок 4) (Wray, Fisher, 2007). Несмотря на высокую гомологию ДНК-связывающего N-концевого домена, С-концевой домен белка ТпгА значительно короче, чем у белков семейства MerR (Рисунок 4) (Wray, Fisher, 2007).

Активность белков семейства MerR контролируется главным образом эффекторными молекулами: ионами металлов или органическими веществами (Brown et al., 2003). Фактор ТпгА является уникальным представителем этого семейства, поскольку в подавлении его ДНК-связывающей способности участвует ингибированная форма фермента GS, а в активном состоянии ТпгА находится в комплексе с белком GlnK (Wray et al., 2001, Brown et al., 2003, Heinrich et al.,

2006). За взаимодействие с GS ответственен С-концевой домен ТпгА, в котором идентифицированы аминокислоты, необходимые для этого взаимодействия (М96, L97, Q100, L101, А103, Fl05) (Wray, Fisher, 2007). Сайт-специфичный мутагенез этих аминокислот приводит к конститутивной экспрессии ТпгА-регулируемых генов в клетках бацилл, независимо от источника азота в среде (Wray, Fisher,

2007). Обнаружено, что делеция С-концевого фрагмента на 7 и 20 аминокислот также приводит к конститутивному синтезу генов регуляции азотного

метаболизма, а удаление 34 аминокислотных остатков приводит к возникновению

_ *

фенотипов бацилл мутантных по ТпгА (Рисунок 5) (Shin et al., 2000).

tnrA (110 а.о.) і ' і і

і і

AtnrA7 (103 а.о.) • конститутивная экспрессия ТпгА-регулируемых генов

I

AtnrA20 (90 а.о.)

AtnrA34 (76 а.О.) • фенотип клеток AtnrA

Рисунок 5 - Мутагенез и функциональная роль С-концевого домена фактора транскрипции ТпгА (Shin et al., 2000)

Также корейские ученые показали, что мутанты с делениями С-конца белка ТпгА способны к споруляции в присутствии глюкозы (Shin et al., 2000). Авторы предположили, что это может быть следствием неконтролируемой экспрессии TnrA-зависимых генов или подавлением образования фосфорилированной формы белка SpoOA - основного регулятора, запускающего процесс спорообразования (Shin et al., 2000).

В настоящее время остается открытым вопрос о сайте димеризации белка TnrA (Wray, Fisher, 2007, Kayumov et al., 2011). Тогда как у белков MerR димеризация происходит по С-концевой а-спирали, удаление гомологичного домена фактора ТпгА не приводит к нарушению образования димерной молекулы этого белка (Wray, Fisher, 2007, Kayumov et al., 2011). Ранние исследования показали, что удаление до 27 аминокислот с С-конца белка не нарушает димеризацию белка, хоть и приводит к удалению а-спирали, имеющей высокую гомологию с областью димеризации ряда белков семейства MerR (Changela et al., 2003, Wray, Fisher, 2007).

1.3 Регуляция генов белков азотного метаболизма с участием факторов транскрипции TnrA, GInR, CodY, GltC

В клетках бактерий активность генов контролируется ДНК-связывающими белками - факторами транскрипции, которые, взаимодействуя с промоторной областью гена, активируют или, наоборот, подавляют его транскрипцию в ответ на изменение условий окружающей среды. Регуляция экспрессии основных генов азотного обмена позволяет бактериям использовать наиболее предпочтительный источник азота, который, с одной стороны, обеспечивает оптимальный рост клеток, и, с другой стороны, требует минимальных затрат энергии для его ассимиляции. Три ключевых фактора транскрипции TnrA, GlnR, CodY осуществляют регуляцию генов, контролирующих гены азотного метаболизма у Bacillus subtilis (Wray et al., 1996, Sonenshein, 2007).

Факторы транскрипции GlnR и TnrA являются взаимными структурными гомологами, относятся к семейству регуляторных белков MerR и контролируют

экспрессию генов в ответ на доступность азота в среде (Wray et al., 1996, Fisher, 1999). Гены белков GlnR (glnR) и GS (glnA) включены в единый оперон glnRA, в то время как ген tnrA является моноцистронным (Рисунок 6) (Wray et al., 1996).

I Ц1

Q1 Щ ^ amtB glnK

I jl I !......I I t

i I

(G,nR ! TnrA AmtB GlnK

—

C+J

Л ureC

nasC V

nasB

♦

-w

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Федорова, Ксения Павловна

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что глутаминсинтетаза принимает участие в подавлении активности фактора транскрипции ТпгА в условиях как избытка, так и недостатка источника восстановленного азота. Взаимодействие с белком GlnK обеспечивает высокую активность фактора ТпгА и предотвращает связывание ТпгА с глутаминсинтетазой. Транспортер ионов аммония белок AmtB не участвует в передаче сигнала на фактор ТпгА.

2. Переход фактора ТпгА из мембраносвязанного состояния в цитоплазматическое определяется сменой аффинности к нему белка GlnK и глутаминсинтетазы, и регулирует активность фактора ТпгА в условиях недостатка и избытка источника восстановленного азота.

3. Белок GlnK не подавляет ДНК-связывающей активности фактора транскрипции ТпгА, в то время как глутаминсинтетаза снижает способность фактора ТпгА взаимодействовать с ДНК. При этом ингибированная глутаминсинтетаза снижает ДНК-связывающую активность фактора ТпгА в два раза эффективнее, чем активный фермент.

4. На основе плазмиды рЕТ15Ь созданы генетические конструкции для гиперпродукции рекомбинантных белков ТпгА с укороченным С-концевым доменом на 6, 20, 35 и 43 аминокислоты, и соответствующие белки получены в электрофоретически гомогенном состоянии.

5. Близкорасположенные, неперекрывающиеся участки С-концевого домена фактора транскрипции ТпгА отвечают за взаимодействие с белком GlnK и глутаминсинтетазой. С-концевой домен не участвует в димеризации, но контролирует ДНК-связывающую активность белка и необходим для стабилизации комплекса ТпгА-ДНК.

6. Фактор транскрипции ТпгА примерно в два раза подавляет биосинтетическую активность глутаминсинтетазы в условиях in vitro и в клетках Bacillus subtilis. В отсутствие белка GlnK фактор ТпгА конститутивно связывается с глутаминсинтетазой и подавляет ее активность in vivo.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для поддержания равновесия между процессами анаболизма и катаболизма, бактерии выработали сложнейшие механизмы, контролирующие активность различных ферментов и биохимических циклов. Азот является одним из основных макроэлементов, необходимых для построения таких клеточных структур как белки, нуклеиновые кислоты, муреин и т.д. Азот в восстановленной форме в виде глутамина или аммиака является наиболее предпочтительной формой для ассимиляции бактериальными клетками. Недостаток азота в восстановленной форме приводит к повышению активности фермента GS, который осуществляет синтез глутамина из глутамата и аммония. В условиях недостатка азота подавляется синтез глутаминсинтетазы и глутаматсинтазы, но активно начинают продуцироваться ферменты утилизации сложных азотсодержащих соединений, а также белки AmtB и GlnK, которые осуществляют транспорт ионов аммония внутрь клетки (Detsch, Stulke, 2003). При этом ключевыми белками-регуляторами, контролирующими экспрессию генов белков ассимиляции альтернативных источников азота, являются фактор транскрипции ТпгА и его структурный гомолог GlnR (Wray et al., 2001, Fisher, Wray, 2008). Фактор TnrA в условиях азотного голодания активирует гены, ответственные за ассимиляцию альтернативных источников азота. Особенностью этого фактора транскрипции является то, что он не подвержен ковалентной модификации в отличие от других факторов транскрипции, а его активность может регулироваться образованием комплекса с GS, связыванием с цитоплазматической мембраной через белок GlnK или протеолизом в условиях отсутствия источника азота. Однако молекулярные механизмы трансдукции сигнала между факторами транскрипции и глутаминсинтетазой, а также ключевые эффекторные молекулы, участвующие в этом процессе, остаются мало изученными. Данная работа посвящена выяснению участия регуляторных белков азотного метаболизма AmtB, GlnK и GS в контроле активности фактора транскрипции ТпгА.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Штаммы и плазмиды. Штаммы ВлиЬйШ и Е.соїі, использованные в работе, перечислены в таблице 1. В качестве исходного штамма использовали штамм В.зиЬНШ СР250, несущий ген |3-галактозидазы под контролем ТпгА-зависимого промотора гена nrgA. Штаммы ВлиЬіїШ СР253 (AnrgB), В.зиЬШіз ОР254 {AnrgA), В.зиЬіїШ ОР251 {AglnA) дефектные по генам nrgB, nrgA, glnA соответственно, получены на основе штамма В.яиЬШз ОР250, и также несут конструкцию nrgA-lacZ (ОєібсЬ, БШІке, 2003). Использованные в работе штаммы были предоставлены профессором Йоргом Штульке, университет Геттингена, Германия.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Федорова, Ксения Павловна, 2013 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ источников

1. Дорошчук, Н. А. Регуляция азотного метаболизма в грамположительных бактериях [Текст] / Н. А. Дорошчук, М. С. Гельфанд, Д. А. Родионов // Мол. Биол. - 2006. - Т.40. - №5. - С. 919-26.

2. Каюмов, А. Р. Влияние азотной катаболитной репрессии на биосинтез сериновых протеиназ Bacillus intermedius [Текст] / А. Р. Каюмов, Т.Р. Шамсутдинов, А. Р. Сабирова, Н. П. Балабан, А. М. Марданова, С. В. Костров, О.Н. Ильинская, М. Р. Шарипова. // Микробиология. - 2009. - Т. 78. - № 6. -С. 742-748.

3. Каюмов, А. Р. Содержание и локализация регуляторных белков ТпгА и GlnK в клетках Bacillus subtilis в условиях азотного голодания [Текст] / А. Р. Каюмов, К. П. Федорова, О. Н. Ильинская, М. Р. Шарипова // Мол. Биол. -2010. - Т.44. - №4. - С. 743-745.

4. Abe, S. Regulation of Bacillus subtilis aprE expression by glnA through inhibition of scoC and (sigma) D-dependent degR expression [Text] / S. Abe, A. Yasumura, T. Tanaka // J. Bacteriol. - 2009. - V. 191. - P. 3050-3058.

5. Altshul, J. H. Comparison of dentinal crack incidence and of post removal time resulting from post removal by ultrasonic or mechanical force [Text] / J. H. Altshul, G. Marshall, L. A. Morgan, J. C. Baumgartner // J. Endod. - 1997. - V. 23. - P. 683-686.

6. Amon, J. Common patterns - unique features: nitrogen metabolism and regulation in Gram-positive bacteria [Text] / J. Amon, F. Titgemeyer, A. Burkovski // FEMS Microbiol Rev. - 2010. - V. 34. - P.588-605.

7. Anagnostopolous, C. Requirements for transformation in Bacillus subtilis [Text] / Anagnostopolous C., Spizizen // Journal of Bacteriology. - 1961. - V. 81. - P. 741746.

8. Belitsky, B. R. Genetic and biochemical analysis of CodY-binding sites in Bacillus subtilis [Text] / B. R. Belitsky, A. L. Sonenshein // J Bacteriol. - 2008. - V. 190. -P. 1224-1236.

9. Belitsky, B. R. Modulation of activity of Bacillus subtilis regulatory proteins GltC and TnrA by glutamate dehydrogenase [Text] / B. R. Belitsky, A. L. Sonenshein // J Bacteriol. - 2004. - V. 186. - P. 3399-3407.

10. Belitsky, B. R. Role of TnrA in nitrogen source-dependent repression of Bacillus subtilis glutamate synthase gene expression [Text] / B. R. Belitsky, L. V. Wray, S. H. Fisher, D. E. Bohannon, A. L. Sonenshein // J. Bact. - 2000. - V. 182. - P. 59395947.

11. Belitsky, B. R. Role of TnrA in nitrogen source-dependent repression of Bacillus subtilis glutamate synthase gene expression [Text] / B. R. Belitsky, L. V. Wray, S. H. Fisher, D. E. Bohannon, A. L. Sonenshein // J. Bact. - 2000. - V. 182. - P. 59395947.

12. Bender, R.A. Biochemical parameters of glutamine synthetase from Klebsiella aerogenes [Text] / R. A. Bender, K. A. Janssen, A. D. Resnick, M. Blumenberg, F. Foor, B. Magasanik// J Bacteriol. - 1977. - V. 129.-P. 1001-1009.

13. Bennett, B. D. Absolute metabolite concentrations and implied enzyme active site occupancy in Escherichia coli [Text] / B. D. Bennett, E. H. Kimball, M. Gao, R. Osterhout, S. J. Van Dien, J. D. Rabinowitz // Nat Chem Biol. - 2009. - V. 5. - P. 593-599.

14. Bonifacino, J. S. Immunoprecipitation [Text] / J. S. Bonifacino, E. C. Dell Angelica, T. A. Springer // Current Protocols in Molecular Biology. - 2001. -10.16.1-10.16.29.

15. Boogerd, F.C. AmtB-mediated NH3 transport in prokaryotes must be active and as a consequence regulation of transport by GlnK is mandatory to limit futile cycling of NH47NH3 [Text] / F. C. Boogerd, H. M. Ma, F. J. Bruggeman, W. C. van Heeswijk, R. Garcia-Contreras, D. Molenaar // FEBS Lett. - 2011. - V. 585. - P. 23-28.

16. Brandenburg, J. L. Roles of PucR, GlnR, and TnrA in regulating expression of the Bacillus subtilis ure P3 promoter [Text] / J. L. Brandenburg, L. V. Wray, L. Beier, H. Jarmer, H. H. Saxild, S. H. Fisher // J. Bacteriol. - 2002. -V. 184. - P. 60606064.

17. Brown, N. L. The MerR family of transcriptional regulators [Text] / N. L. Brown, J. V. Stoyanov, S. P. Kidd, J. L. Hobman // FEMS Microbiol. - 2003. - V. 27. - P. 145-163.

18. Brown, S. W. Autogenous regulation of the Bacillus subtilis glnRA operon [Text] / S. W. Brown, A. L. Sonenshein // J Bacteriol. - 1996. - V. 178. - P. 2450-2454.

19. Changela, A. Molecular basis of metal-ion selectivity and zeptomolar sensitivity by Cue [Text] / A. Changela, K. Chen, Y. Xue, J. Holschen, C. E. Outten, T. V. O'Halloran, A. Mondragon // Science. - 2003. - V. 301. - P. 1383-1387.

20. Conroy, M. J. The crystal structure of the Escherichia coli AmtB-GlnK complex reveals how GlnK regulates the ammonia channel [Text] / M. J. Conroy, A. Durand, D. Lupo, X. Li, P. A. Bullough, F. K. Winkler, M. Merrick // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.-2007.-V. 104. - P.1213-1218.

21. Dauner, M. Bacillus subtilis metabolism and energetics in carbon-limited and excess-carbon chemostat culture [Text] / M. Dauner, T. Storni, U. Sauer // J Bacteriol.-2001.-V. 183.-P. 7308-7317.

22. Deshpande, K. L. Glutamate synthase from Bacillus subtilis: in vitro reconstitution of an active amidotransferase [Text] / K. L. Deshpande, J. F. Kane // Biochem Biophys Res Commun. - 1980.-V. 93.-P. 308-314.

23. Detsch, C. Ammonium utilization in Bacillus subtilis: transport and regulatory functions of NrgA and NrgB [Text] / C. Detsch, J. Stulke // Microbiology. - 2003. -V. 149.-P. 3289-3297.

24. Deuel, T. F. Regulation of glutamine synthetase from Bacillus subtilis by divalent cations, feedback inhibitors, and L-glutamine [Text] / T. F. Deuel, S. Prusiner // J. Biol. Chem. - 1974. - V. 249. - P. 257-264.

25. Deuel, T. F. Some kinetic properties of Bacillus subtilis glutamine synthetase [Text] / T. F. Deuel, E. R. Stadtman // J Biol Chem. - 1970. - V. 245. - P. 5206-5213.

26. Durand, A. In vitro analysis of the Escherichia coli AmtB-GlnK complex reveals a stoichiometric interaction and sensitivity to ATP and 2-oxoglutarate [Text] / A. Durand, M. Merrick // J Biol Chem. - 2006. - V. 281. - P. 29558-29567.

27. Eisenberg, D. Structure-function relationships of glutamine synthetases [Text] / D. Eisenberg, H. S. Gill, G. M. U. Pfluegel, S. H. Rotstein // Biochim. Biophys. Acta. -2000.-V.1477.-P. 122-145.

28. Fabret, C. Two-component signal transduction in Bacillus subtilis: how one organism sees its world [Text] / C. Fabret, V. A. Feher, J. A. Hoch // J Bacteriol. -1999.-V. 181. - P.1975-1983.

29. Ferson, A. E. Expression of the Bacillus subtilis gabP gene is regulated independently in response to nitrogen and amino acid availability [Text] / A. E. Ferson, L. V. Wray, S. H. Fisher//Mol Microbiol. - 1996. -V. 22. - P. 693-701

30. Fisher, S. H. Bacillus subtilis glutamine synthetase regulates its own synthesis by acting as a chaperone to stabilize GlnR-DNA complexes [Text] / S. H. Fisher, L. V. Jr. Wray // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2008. - V. 105. - P. 1014-1019.

31. Fisher, S. H. Feedback-resistant mutations in Bacillus subtilis glutamine synthetase are clustered in the active site [Text] / S. H. Fisher, L. V. Wray // J. Bacteriol. -2006.-V. 188.-P. 5966-5974.

32. Fisher, S. H. Mutations in Bacillus subtilis glutamine synthetase that block its interaction with transcription factor TnrA [Text] / S. H. Fisher, J. L. Brandenburg, L. V. Wray // Mol. Microbiol. - 2002. - V. 45. - P. 627-635.

33. Fisher, S. H. Novel trans-acting Bacillus subtilis glnA mutations that derepress glnRA expression [Text] / S. H. Fisher, L. V. Wray // J Bacteriol. -2009. - V. 191. -P. 2485-2492.

34. Fisher, S. H. Regulation of nitrogen metabolism in Bacillus subtilis: vive la difference! [Text] / S.H. Fisher // Mol. Microbiol. - 1999. - V. 32. - P. 223-232.

35. Forchhammer, K. P (II) signal transducers: novel functional and structural insights [Text] / K. Forchhammer // Trends Microbiol. - 2008. - V. 16. - P. 65-72.

36. Fujita, M. Evidence that entry into sporulation in Bacillus subtilis is governed by a gradual increase in the level and activity of the master regulator SpoOA [Text] / M. Fujita, R. Losick // Genes Dev. - 2005. - V. 19. - P. 2236-2244.

37. Fujita, M. Rapid isolation of RNA polymerase from sporulating cells of Bacillus subtilis [Text] / M. Fujita, Y. Sadaie // Gene. - 1998. - V. 221. - P. 185-190.

38. Gawronski, J. D. Microtiter assay for glutamine synthetase biosynthetic activity using inorganic phosphate detection [Text] / J. D. Gawronski, D. R. Benson // Anal. Biochem. - 2004. - V. 327. - P. 114-118.

39. Gill, H.S. The crystal structure of phosphinothricin in the active site of glutamine synthetase illuminates the mechanism of enzymatic inhibition [Text] / H. S. Gill, D. Eisenberg // Biochemistry. - 2001. - V. 40. - P. 1903-1912.

40. Guédon, E. Overall control of nitrogen metabolism in Lactococcus lactis by CodY, and possible models for CodY regulation in Firmicutes [Text] / E. Guédon, B. Sperandio, N. Pons, S. D. Ehrlich, P. Renault // Microbiology. - 2005. - V. 151. -P. 3895-3909.

41. Gunka, K. Control of glutamate homeostasis in Bacillus subtilis: a complex interplay between ammonium assimilation, glutamate biosynthesis and degradation [Text] / K. Gunka, F. M. Commichau // Mol Microbiol. - 2012. - V. 85. - P. 213224.

42. Gunka, K. Functional dissection of a trigger enzyme: mutations of the Bacillus subtilis glutamate dehydrogenase RocG that affect differentially its catalytic activity and regulatory properties [Text] / K. Gunka, J. A. Newman, F.M. Commichau, C. Herzberg, C. Rodrigues, L. Hewitt // J Mol Biol. - 2010. - V. 400. - P. 815-827.

43. Hart, S. C. Nitrogen mineralization, immobilization and nitrification [Text] / S. C. Hart, J. M. Stark, E. A. Davidson, M. K. Firestone // Methods of Soil Analysis. -1994.-P. 985-1018.

44. Heinrich, A. Interaction of the membrane-bound GlnK-AmtB complex with the master regulator of nitrogen metabolism TnrA in Bacillus subtilis [Text] / A. Heinrich, K. Woyda, K. Brauburger, G. Meiss, C. Detsch, J. Stülke, K. J. Forchhammer // Biol. Chem. - 2006. - V. 281. - P. 34909-34917.

45. Heldwein, E. E. Z. Crystal structure of the transcription activator BmrR bound to DNA and a drug [Text] / E. E. Z. Heldwein, R. G. Brennan // Nature. - 2001. - V. 409. - P. 378-382.

46. Hobman, J. L. MerR family transcription activators: similar designs, different specificities [Text] / J. L. Hobman // Mol. Microbiol. - 2007. - V. 63. - P. 12751278.

47. Javelle, A. Ammonium sensing in Escherichia coli. Role of the ammonium transporter AmtB and AmtB-GlnK complex formation [Text] / A. Javelle, E. Severi, J. Thornton, M. Merrick // J. Biol. Chem. - 2004. - V. 279. - P. 8530-8539.

48. Javelle, A. Complex formation between AmtB and GlnK: an ancestral role in prokaryotic nitrogen control [Text] / A. Javelle, M. Merrick // Biochem Soc Trans. - 2005. - V. 33. - P.170-172.

49. Kayumov, A. Inactivation of the general transcription factor TnrA in Bacillus subtilis by proteolisis [Text] / A. Kayumov, A. Heinrich, M. Sharipova, O. Iljinskaya, K. Forchhammer // Microbiology. - 2008. - V. 154. - P. 2348-2355.

50. Kayumov, A. Interaction of the general transcription factor TnrA with the PII-like protein GlnK and glutamine synthetase in Bacillus subtilis [Text] / A. Kayumov, A. Heinrich, K. Fedorova, O. Ilinskaya, K. Forchhammer // FEBS J. - 2011. - V. 278. - P.1779-1789.

51. Kelley, L. A. Protein structure prediction on the Web: a case study using the Phyre server [Text] / L. A. Kelley, M. J. Sternberg // Nat Protoc. - 2009. - V. 4. - P. 363371.

52. Khademi, S. The Amt/MEP/Rh family: structure of AmtB and the mechanism of ammonia gas conduction [Text] / S. Khademi, R. M. Stroud // Physiology (Bethesda). - 2006. -V. 21. - P. 419-429.

53. Kleiner, D. Bacterial ammonium transport [Text] /D. Kleiner // FEMS Microbiol. -1985.-V. 32.-P. 87-100.

54. Kloosterman, T. G. Regulation of glutamine and glutamate metabolism by GlnR and GlnA in Streptococcus pneumoniae [Text] / T. G. Kloosterman, W. T. Hendriksen, J. J Bijlsma, H. J. Bootsma, SAFT van Hijum, J. Kok, P. W. M. Hermans, O. P. Kuipers // J Biol Chem. - 2006. - V. 281. - P. 25097-25109.

55. Kornberg, A. Enzymatic phosphorylation of adenosine and 2, 6-diaminopurine riboside [Text] / A. Kornberg, W.E. Jr. Pricer // J Biol Chem. - 1951. - V. 193. - P. 481-495.

56. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 [Text] / U. K. Laemmli // Nature. - 1970. - V. 227. - P. 680685.

57. Liaw, S.-H. Interactions of nucleotides with fully unadenylylated glutamine synthetase from Salmonella typhimurium [Text] / S.-H. Liaw, G. Jun, D. Eisenberg //Biochemistry. - 1994.-V. 33.-P. 11184-11188.

58. Losick, R. Genetics of endospore formation in Bacillus subtilis [Text] / R. Losick, P. Youngman, P. J. Piggot // Annu Rev Genet. - 1986. - V. 20. - P. 625-669.

59. Luque-Almagro, V. M. Bacterial nitrate assimilation: gene distribution and regulation [Text] / V. M. Luque-Almagro, A. J. Gates, C. Moreno-Viviän, S. J. Ferguson, D. J. Richardson, M. D. Roldän // Biochemical Society Transactions. -2011.-V. 39. - P. 1838-1843.

60. Marchler-Bauer, A. CDD: a conserved domain database for protein classification [Text] / A. Marchler-Bauer, J. B. Anderson, P. F. Cherukuri, C. De Weese-Scott, L. Y. Geer, M. Gwadz, S. He, D. I. Hurwitz, J. D. Jackson, Z. Ke, C. J. Lanczycki, C. A. Liebert, C. Liu, F. Lu, G. H. Marchler, M. Mullokandov, B. A. Shoemaker, V. Simonyan, J. S. Song, P. A. Thiessen, R. A. Yamashita, J. J. Yin, D. Zhang, S. H. Bryant // Nucleic Acids Res. - 2005. - V. 33. - D. 192-196.

61. Merrick, M. J. Nitrogen control in bacteria [Text] / M. J. Merrick, R. A. Edwards // Microbiol. Rev. - 1995. - V. 59. - P. 604-622.

62. Miethke, M. Iron starvation triggers the stringent response and induces amino acid biosynthesis for bacillibactin production in Bacillus subtilis [Text] / M. Miethke, H. Westers, E.-J., Blom, O. P., Kuipers, M. A. Marahiel // J Bacteriol. - 2006. -V. 188. -P. 8655-8657.

63. Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics [Text] / J. H. Miller // N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. - 1972. - P. 352-355.

64. Nakano, M. M. Anaerobic growth of a "strict aerobe" {Bacillus subtilis) [Text] / M. M. Nakano, P. Zuber// Annu Rev Microbiol. - 1998. - V. 52. -P. 165-190.

65. Nakano, M. M. Characterization of anaerobic fermentative growth of Bacillus subtilis: identification of fermentation end products and genes required for growth [Text] / M. M. Nakano, Y. P. Dailly, P. Zuber, D. P. Clark // J. Bacteriol. - 1997. -V. 179.-P. 6749-6755.

66. Nakano, M. M. Nitrogen and oxygen regulation of Bacillus subtilis nasDEF encoding NADH-dependent nitrite reductase by TnrA and ResDE [Text] / M. M. Nakano, T. Hoffmann, Y. Zhu, D. Jahn // J. Bacteriol. - 1998. - V. 180. - P. 53445350.

67. Nakano, M. M. Two-component regulatory proteins ResD-ResE are required for transcriptional activation of fnr upon oxygen limitation in Bacillus subtilis [Text] / M. M. Nakano, P. Zuber, P. Glaser, A. Danchin, F. M. Hulett // J. Bacteriol. - 1996. -V. 178.-P. 3796-3802.

68. Newberry, K. J. The structural mechanism for transcription activation by MerR family member multidrug transporter activation, N terminus [Text] / K. J. Newberry, R. G. Brennan // J. Biol. Chem. - 2004. - V. 297. - P. 20356-20362.

69. Ninfa, A. J. PII signal transduction proteins: sensors of alpha-ketoglutarate that regulate nitrogen metabolism [Text] / A. J. Ninfa, P. Jiang // Curr Opin Microbiol. -2005.-V. 8. - P.168-173.

70. Nygaard, P. Bacillus subtilis guanine deaminase is encoded by thzyknA gene and is induced during growth with purines as the nitrogen source [Text] / P. Nygaard, S. M. Bested, K. Andersen, H. H. Saxild // Microbiology. - 2000. - V. 146. - P. 30613069.

71.0gawa, K. The nasB operon and nasA gene are required for nitrate/nitrite assimilation in Bacillus subtilis [Text] / K. Ogawa, E. Akagawa, K. Yamane, Z. W. Sun, M. LaCelle, P. Zuber, M. M. Nakano // J Bacteriol. - 1995. - V. 177. - P. 1409-1413.

72. Pan, F. L. Glutamine synthetase and glutamate synthase activities during growth and sporulation in Bacillus subtilis [Text] / F.L. Pan, J.G. Coote // J Gen Microbiol. - 1979.-V. 112.-P. 373-377.

73. Permina, E. A. Comparative genomics of regulation of heavy metal resistance in eubacteria [Text] / E. A. Permina, A. E. Kazakov, O. V. Kalinina, M. S. Gelfand // BMC Microbiol. - 2006. - V. 6. - P. 49.

74. Radchenko, M. V. Control of AmtB-GlnK complex formation by intracellular levels of ATP, ADP, and 2-oxoglutarate [Text] / M. V. Radchenko, J. Thornton, M. Merrick // J Biol Chem. - 2010. - V. 285. - P. 31037-45.

75. Rehm, N. Engineering of nitrogen metabolism and its regulation in Corynebacterium glutamicum: influence on amino acid pools and production [Text] / N. Rehm, A. Burkovski // Appl Microbiol Biotechnol. - 2010. - V. 89. - P. 239248.

76. Reitzer, L.J. Nitrogen assimilation and global regulation in Escherichia coli [Text] / L. J. Reitzer // Annu Rev Microbiol. - 2003. - V. 57. - P. 155-176.

77. Richardson, D. J. Functional, biochemical and genetic diversity of prokaryotic nitrate reductases [Text] / D. J. Richardson, B. C. Berks, D. A. Russell, S. Spiro, C. J. Taylor // Cell Mol Life Sci. - 2001. -V. 58. - P. 165-178.

78. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual [Text] / J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis // Cold Spring Harbor Laboratory Press. - 1989.

79. Schirawski, J. Anaerobic respiration of Bacillus macerans with fumarate, TMAO, nitrate and nitrite and regulation of the pathways by oxygen and nitrate [Text] / J. Schirawski, G. Unden // Arch. Microbiol. - 1995. -V.163. - P. 148-154.

80. Shin, B. S. Analysis of tnrA alleles which result in a glucose-resistant sporulation phenotype in Bacillus subtilis [Text] / B. S. Shin, S. K. Choi, I. Smith, S. H. Park // J. Bacteriol. - 2000. - V. 182. - P. 5009-5012.

81. Shivers, R. P. Bacillus subtilis ilvB operon: an intersection of global regulons [Text] / R. P. Shivers, A. L. Sonenshein // Mol Microbiol. - 2005. - V. 56. -P.1549-1559.

82. Sonenshein, A. L. Control of key metabolic intersection in Bacillus subtilis [Text] / A. L. Sonenshein // Nat Rev Microbiol. - 2007. - V. 12. - P. 917-927.

83. Sonenshein, A. L. Control of sporulation initiation in Bacillus subtilis [Text] / A. L. Sonenshein // Curr Opin Microbiol. - 2000. - V. 3. - P. 561-566.

84. Stothard, P. The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences [Text] / P. Stothard // Biotechniques. -2000. V. 6.-P. 1102-1104.

85. Strauch, M. A. Sequence of the Bacillus subtilis glutamine synthetase gene region [Text] / M. A. Strauch, A. I. Aronson, S. W. Brown, H. J. Schreier, A. L. Sonenshein // Gene. - 1988. - V. 71. - P. 257-265.

86. Thompson, J. D. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice [Text] / J. D. Thompson, D. G. Higgins, T. J. Gibson. // Nucleic Acids Res. - 1994. - V. 22. -P.4673-4680.

87. Tremblay, P. Of blood, brains and bacteria, the Amt/Rh transporter family: emerging role of Amt as a unique microbial sensor [Text] / P. Tremblay, P. Hallenbeck // Mol. Microbiol. - 2009. - V. 71. - P. 12-22.

88. Verbaendert, I. Denitrification in Gram-positive bacteria: an underexplored trait [Text] / I. Verbaendert, P. De Vos, N. Boon, K. Heylen // Biochem Soc Trans. -2011.-V. 39.-P. 254-258.

89. Wacker, I. The regulatory link between carbon and nitrogen metabolism in Bacillus subtilis: regulation of the gltAB operon by the catabolite control protein CcpA [Text] / I. Wacker, H. Ludwig, I. Reif, H.-M. Blencke, C. Detsch, J. Stülke // Microbiology. - 2003. - V. 149. - P. 3001-3009.

90. Wacker, I. The regulatory link between carbon and nitrogen metabolism in Bacillus subtilis: regulation of the gltAB operon by the catabolite control protein CcpA [Text] / I. Wacker, H. Ludwig, I. Reif, H.-M. Blencke, C. Detsch, J. Stülke // Microbiology. - 2003. - V. 149. - P. 3001-3009.

91. Wray, L. V. A feedback-resistant mutant of Bacillus subtilis glutamine synthetase with pleiotropic defects in nitrogen-regulated gene expression [Text] / L. V. Wray, S. H. Fisher // J. Biol. Chem. - 2005. - V. 280. - P. 33298-33304.

92. Wray, L. V. Bacillus subtilis GlnR contains an autoinhibitory C-terminal domain required for the interaction with glutamine synthetase [Text] / L. V. Wray, S. H. Fisher // Mol. Microbiol. - 2008. - V. 68. - P. 277-285.

93. Wray, L. V. Bacillus subtilis glutamine synthetase controls gene expression through a protein-protein interaction with transcription factor TnrA [Text] / L. V. Wray, J. M. Zalieckas, S. H. Fisher // Cell. - 2001. - V. 107. - P. 427-435.

94. Wray, L. V. Catabolite repression of the Bacillus subtilis hut operon requires a cis-acting site located downstream of the transcription initiation site [Text] / L. V. Wray, F. K. Pettengill, S. H. Fisher // J. Bacteriol. - 1994. - V. 176. - P. 18941902.

95. Wray, L. V. Expression of the Bacillus subtilis ureABC operon is controlled by multiple regulatory factors including CodY, GlnR, TnrA, and SpoOH [Text] / L.V. Wray, A. E. Ferson, S. H. Fisher // J. Bacteriol. - 1997. - V. 179. - P. 5494-5501.

96. Wray, L. V. TnrA, a transcription factor required for global nitrogen regulation in Bacillus subtilis [Text] / L.V. Wray, A. E. Ferson, K. Rohrer, S. H. Fisher // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1996. - V. 93. - P. 8841-8845.

97. Wray, L.V. Functional analysis of the carboxy-terminal region of Bacillus subtilis TnrA, a MerR family protein [Text] / L.V. Wray, S. H. Fisher // J. Bacteriol. - 2007. -V. 189. - P.20-27

98. Wray, L.V. Functional roles of the conserved Glu304 loop of Bacillus subtilis glutamine synthetase [Text] / L.V. Wray, S. H. Fisher // J Bacteriol. - 2010. - V. 192.-P. 5018-5045.

99. Wray, L.V. Purification and in vitro activities of the Bacillus subtilis TnrA transcription factor [Text] / L. V. Wray, J. M. Zalieckas, S. H. Fisher // J. Mol. Biol. -2000.-V. 300.-P. 29-40.

100. Yamashita, M. M. Refined atomic model of glutamine synthetase at 3.5 A resolution [Text] / M. M. Yamashita, R. J. Almassy, C. A. Janson, D. Cascio, D. Eisenberg // J Biol Chem. - 1989. - V. 264. - P. 17681-17690.

101. Yasumura, A. Involvement of nitrogen regulation in Bacillus subtilis degU expression [Text] / A. Yasumura, S. Abe, T. Tanaka // J Bacteriol. - 2008. - V. 190. - P.5162-5171.

102. Yoshida, K. Identification of additional TnrA-regulated genes of Bacillus subtilis associated with a TnrA box [Text] / K. Yoshida, H. Yamaguchi, M. Kinehara, Y. H. Ohki, Y. Nakaura, Y. Fujita // Mol. Microbiol. - 2003. - V. 49. - P. 157-165.

103. Zalieckas, J. M. Cross-regulation of the Bacillus subtilis glnRA and tnrA genes provides evidence for DNA binding site discrimination by GlnR and TnrA [Text] / J. M. Zalieckas, L. V. Jr. Wray, S. H. Fisher // J Bacteriol. - 2006. - V. 188. -P.2578-2585.