Регулон фактора транскрипции GLNR в клетках LENTILACTOBACILLUS HILGARDII и механизм регуляции его ДНК-связывающей активности тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат наук Журавлева Дарья Эдуардовна

• Журавлева Дарья Эдуардовна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Журавлева Дарья Эдуардовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Цели и задачи исследования

Научная новизна полученных результатов

Методология и методы исследования

Достоверность результатов

Теоретическая и практическая значимость работы

Основные положения, выносимые на защиту

Место выполнения работы и личный вклад автора

Связь работы с научными программами

Публикация результатов исследования

Объем и структура диссертации

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Регуляция транскрипции генов, вовлеченных в азотный метаболизм в клетках В. яиЫШя

1.1.1 MerR семейство ДНК-связывающих белков

1.1.2 Фактор транскрипции TnrA

1.1.3 Фактор транскрипции GlnR

1.1.4 Фактор транскрипции CodY

1.1.5 Фактор транскрипции GltC

1.1.6 PП-подобные белки и их роль в регуляции экспрессии генов азотного обмена

1.2 Ассимиляция азота клетками бактерий

1.2.1 Транспорт глутамина в клетку

1.2.2 Транспорт ионов аммония в клетку

1.2.3 Поглощение нитратных и нитритных форм азота

1.3 Пути биосинтеза глутаминовой кислоты

1.3.1 Глутаматдегидрогеназа

1.3.2 Глутаминсинтетаза

1.3.3 Глутаматсинтаза

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Методы работы с бактериальными клетками

2.1.1 Штаммы

2.1.2 Питательные среды и условия культивирования бактерий

2.1.3 Трансформация клеток E. coli методом теплового шока

2.2 Методы работы с рекомбинантной ДНК

2.2.1 Плазмидные векторы

2.2.2 Выделение геномной ДНК лактобацилл методом фенол-хлороформной экстракции

2.2.3 Выделение плазмидной ДНК с помощью GeneJET Plasmid Miniprep Kit

2.2.4 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2.2.5 Рестрикция ДНК

2.2.6 Дефосфорилирование ДНК

2.2.7 Лигирование ДНК

2.2.8 Метод энзиматической сборки фрагментов ДНК по Гибсону

2.2.9 Электрофорез ДНК

2.2.10 Очистка ДНК из агарозного геля

2.3 Схемы получения рекомбинантных конструкций

2.3.1 Клонирование генов glnR L. hilgardii в экспрессионный вектор pET15b

2.3.2 Клонирование генов glnR L. hilgardii в экспрессионный вектор pASK-IBA5plus

2.3.3 Клонирование генаpotNL. hilgardii в плазмиду pUT18

2.3.4 Клонирование генов glnR L. hilgardii в векторы pKT25 и pKNT25

2.4 Методы работы с белками

2.4.1 Скрининг рекомбинантных штаммов, обладающих максимальной гиперпродукцией белков

2.4.2 Гиперпродукция белков в клетках E. coli и получение клеточных экстрактов

2.4.3 Очистка белков на Ni-NTA сефарозе

2.4.4 Очистка белков на Strep-tactin сефарозе

2.4.5 Эксклюзионная хроматография

2.4.6 Диализ белков

2.4.7 Определение концентрации белка

2.4.8 Электрофорез белков в денатурирующих условиях

2.4.9 Окрашивание белковых гелей кумасси синим

2.4.10 Окрашивание белковых гелей нитратом серебра

2.4.11 Осаждение белков с помощью трихлоруксусной кислоты

2.4.12 Иммуноблоттинг (Western Blot)

2.4.13 Иммунодетекция

2.5 Методы анализа взаимодействия макромолекул

2.5.1 Анализ взаимодействия белков методом ко-элюции

2.5.3 Исследование взаимодействия белков методом плазмонного поверхностного резонанса (ППР)

2.5.4 Исследование взаимодействия белков методом микромасштабного термофореза

2.6 Аналитические методы

2.6.1 Определение активности ß-галактозидазы

2.6.2 Определение активности глутаминсинтетазы

2.6.3 Определение уровня АТФ в клетках

2.6.4 Изотермальная титрующая калориметрия

2.6.5 Определение уровня транскрипции генов

2.6.5.1 Выделение РНК из клеток бактерий с помощью набора DiaGene

2.6.5.2 Обратная транскрипция и ПЦР в режиме реального времени одношаговым методом дОТ-ПЦР SYBR Blue

2.7 Математические методы

2.7.1 Биоинформатика

2.7.2 Статистика

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Структурная характеристика фактора транскрипции GlnR

Lentilactobacillus hilgardii

3.1.1 Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательности фактора транскрипции GlnR

3.1.2 Оценка роли С-концевого домена фактора транскрипции GlnR в димеризации белка

3.2 Характеристика взаимодействия фактора транскрипции GlnR с PII-подобным белком PotN in vitro и in vivo

3.2.1 Характеристика взаимодействия GlnR-PotN in vitro методами ко-элюции и поверхностного плазмонного резонанса, и in vivo в бактериальной двугибридной системе

3.2.2 Оценка влияния нуклеотидов на взаимодействие GlnR-PotN in vitro методом микромасштабного термофореза

3.2.3 Оценка влияния нуклеотидов на взаимодействие GlnR-PotN in vitro методом эксклюзионной хроматографии

3.3 Секвенирование генома L. hilgardii, поиск генов азотного обмена и определение GlnR-регулона

3.4 Характеристика ДНК-связывающей активности фактора транскрипции GlnR

3.4.1 Характеристика взаимодействия фактора транскрипции GlnR c промоторами генов предполагаемого GlnR-регулона

3.4.2 Влияние PotN на ДНК-связываюшую активность фактора транскрипции GlnR

3.5 Оценка экспрессии оперона glnRA в условиях различной доступности азотного питания

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

Приложение

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГТ Ангидротетрациклин гидрохлорид

АДФ Аденозиндифосфат

АТФ Аденозинтрифосфат

АМФ Аденозинмонофосфат

БСА Бычий сывороточный альбумин

ГС (ГС) Глутаминсинтетаза

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

ДТТ Дитиотреитол

ИПТГ Изопропил-Р^-1 -тиогалактопиранозид

кДа Килодальтон

НАДН Никотинамидадениндинуклеотид

ПААГ (PAGE) Полиакриламидный гель

ППР Поверхностный плазмонный резонанс

ПЦР Полимеразная цепная реакция

РЕ Резонансные единицы

РНК Рибонуклеиновая кислота

Трис 2-амино-2-гидроксиметилпропан-1,3-диол

ТХУ Трихлоруксусная кислота

ФАД Флавинадениндинуклеотид

Фн Неорганический фосфор

ФМН Флавинмононуклеотид

ЭДТА Этилендиаминтетраацетат

АА Акриламид

В1Б-АА Бис-акриламид

СТАВ Бромид цетилтриметиламмония

БВ1-ГС Глутаминсинтетаза ингибированная по типу обратной связи

GDH Глутаматдегидрогеназа

GOGAT Глутаматсинтаза,

глутамин-2-оксоглутарат-аминотрансфераза

HEPES 4-(2-гидроксиэтил)-1 -пиперазинэтансульфоновая кислота

LB Питательная среда Лурия-Бертани

NADH+ Никотинамидадениндинуклеотид

NADPH+ Никотинамидадениндинуклеотидфосфат

ONPG Орто-нитрофенил-Р-галактозид

PBS Фосфатный буфер

PMSF Фенилметилсульфонил фторид

PSA Персульфат аммония

SDS Додецилсульфат натрия

TEMED Тетраметилетилендиамин

X-gal 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-Р-Д-галактопиранозид

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Регулон фактора транскрипции GLNR в клетках LENTILACTOBACILLUS HILGARDII и механизм регуляции его ДНК-связывающей активности»

Актуальность темы исследования

В ходе эволюции бактерии выработали ряд механизмов адаптации к постоянно изменяющимся условиям окружающей среды. Для поддержания гомеостаза в клетке происходит включение или выключение экспрессии генов, кодирующих структурные и транспортные белки, внутриклеточные и секретируемые ферменты, которые адаптируют микроорганизм к конкретной экологической ситуации [Herrero et al., 2019; Jiang et al., 201S].

Регуляция экспрессии генов у прокариот происходит главным образом на уровне транскрипции. В ответ на метаболические сигналы происходит изменение активности факторов транскрипции - белков, которые связываются со специфическими последовательностями ДНК на промоторах их генов-мишеней и модулируют тем самым их транскрипцию. Существует два типа транскрипционных факторов - репрессоры и активаторы. Негативная регуляция со стороны репрессоров происходит путем образования стерического препятствия, деформацией ДНК в промоторной области или антиактивации. Позитивная регуляция осуществляется за счет повышения силы связывания промотора и сигма-фактора (для активаторов I-III классов), или изменения конформации промотора, например, белками семейства MerR [Bei"voets, Chañie^ 2019; Browning, Busby, 201б; Yang et al., 2021; Brown et al., 2003].

Азот является одним из важнейших макроэлементов для построения клеток живых организмов. В качестве источников азота микроорганизмы поглощают преимущественно те вещества, которые требуют наименьших энергетических затрат для транспорта в клетку и включения в метаболизм [Batista, Dixon, 2019; Femandes et al., 2017; Sun et al., 2017]. Наиболее предпочтительными источниками азота для многих бактерий являются глутамин и ионы аммония [Herrero et al., 2019]. При низких концентрациях восстановленного азота в среде в бактериальных клетках запускается

экспрессия генов, продукты которых направлены на ассимиляцию азота из ряда других азотсодержащих соединений [Huang et al., 2020; Sun et al., 2017].

Одними из центральных регуляторов азотного обмена в бактериальной клетке являются PII-подобные белки. Это семейство сигнальных белков, контролирующих широкий спектр генов-мишеней в клетке в зависимости от углеродного, азотного и энергетического статуса клетки. Конкурентное связывание АТФ, АДФ или синергетическое связывание 2-оксоглутарата с АТФ вызывает конформационные изменения внутри тримера PII-белка, что, в свою очередь позволяет PII-белку напрямую взаимодействовать с белками-мишенями, в частности, транскрипционными факторами, регулируя их ДНК-связывающую активность и тем самым модулировать экспрессию различных групп генов [Selim et al., 2021; Forchhammer, Selim, 2020; Lapina et al., 2018].

В клетках грамотрицательных бактерий, например, в клетках E. coli, PII-подобные белки-паралоги GlnK и GlnB контролируют NTR-систему регуляции азотного метаболизма путем связывания с белком NtrB [Ninfa, Jiang, 2005; Jiang et al., 2007]. Гистидин-киназа NtrB осуществляет фосфорилирование фактора транскрипции NtrC, который активирует транскрипцию генов утилизации альтернативных источников азота [Frare et al, 2020; Gosztolai et al, 2017].

В клетках грамположительных бактерий система NTR отсутствует. В этих микроорганизмах центральную роль в контроле транскрипции генов, продукты которых вовлечены в азотный метаболизм, играет фактор транскрипции GlnR. В клетках свободноживущей бактерии Bacillus subtilis контроль экспрессии генов метаболизма азота осуществляется факторами транскрипции GlnR, TnrA, CodY и GltC. Основная роль при этом принадлежит белкам-гомологам GlnR и TnrA: в условиях избытка восстановленного азота GlnR формирует комплекс глутаминсинтетаза-GlnR-ДНК и подавляет транскрипцию собственного оперона glnRA, гена tnrA, оперона утилизации мочевины (ureABC) и гена N-ацетил-глутаматсинтазы [Randazzo et al., 2017; Xu et al., 2007]. В отсутствии глутаминсинтетазы С-концевой домен GlnR

препятствует образованию димерной структуры и связыванию с ДНК [Biswas et al., 2020; Randazzo et al., 2017; Wray, Fisher, 2008]. Фактор TnrA активен в условиях недостатка азотного питания и контролирует транскрипцию более чем 20 генов и оперонов.

В геномах бактерий семейства Lactobacillaceae обнаруживаются только гены факторов транскрипции GlnR и GltC [Gong et al., 2020]. При этом GlnR-и GltC-регулоны, а также молекулярные механизмы регуляции активности этих факторов транскрипции остаются неохарактеризованными, несмотря на широкое применение этих бактерий в биотехнологических производствах.

Ранее нами было показано, что в клетках Lentilactobacillus hilgardii фактор транскрипции GlnR взаимодействует с PII-подобным белком PotN [Iskhakova et al., 2016]. Взаимодействие PII-подобных белков с факторами транскрипции до настоящего времени показано только для двух случаев. Связывание PII-подобного белка GlnK из S. mutans с белком GlnR повышает ДНК-связывающую активность последнего [Castellen et al. 2011]. В клетках B. subtilis фактор транскрипции TnrA в активном состоянии также связан с белком GlnK [Kayumov et al., 2011], однако роль этого взаимодействия в регуляции транскрипции вызывает споры [Fedorova et al., 2013; Hauf et al., 2016]. Нужно отметить, что среди примерно 400 видов бактерий семейства Lactobacillaceae, известных на сегодняшний день, только семь имеют гены PII-подобных белков в геноме [Zhuravleva et al., 2020], что может быть отражением высоких адаптационных возможностей данных видов для существования в различных экологических нишах. Связывание PotN с GlnR может влиять на ДНК-связывающую активность последнего, однако физиологическая роль и механизм регуляции взаимодействия этих белков остаются неисследованными.

Цели и задачи исследования

Целью работы явилось идентифицировать регулон фактора транскрипции GlnR в клетках Lentilactobacillus hilgardii, и установить механизм контроля ДНК-связывающей активности данного белка.

В работе решались следующие задачи:

1) Охарактеризовать in silico структуру фактора транскрипции GlnR и экспериментально определить роль C-концевого домена в регуляции ДНК-связывающей активности белка.

2) Исследовать взаимодействие фактора транскрипции GlnR c PII-подобным белком PotN in vitro и in vivo и оценить влияние АТФ и АДФ на взаимодействие этих белков.

3) Секвенировать и аннотировать геном L. hilgardii, идентифицировать гены азотного обмена и определить потенциальный GlnR-регулон.

4) Определить возможность взаимодействия GlnR с промоторами генов потенциального GlnR-регулона и оценить влияние PII-подобного белка PotN на ДНК-связывающую активность GlnR.

5) Оценить экспрессию оперона glnRA в условиях различной доступности азотного питания и определить роль фактора транскрипции GlnR в регуляции транскрипции генов азотного метаболизма.

Научная новизна полученных результатов

Впервые показано, что in vitro фактор транскрипции GlnR L. hilgardii находится в состоянии мономера; удаление 42 аминокислот с C-концевого домена приводит к димеризации белка, что свидетельствует о наличии в структуре С-конца белка аутоингибиторного мотива, препятствующего димеризации.

В работе впервые секвенирован и аннотирован геном L. hilgardii (номер доступа Генбанка CP050262.1), определены гены белков, участвующих в азотном обмене клетки, идентифицированы 13 генов, транскрипция которых потенциально подвержена регуляции со стороны GlnR (GlnR-регулон), из них

восемь генов - с известной функцией, включая собственный ген glnR, и пять генов - с неизвестной. При этом GlnR способен связывать все промоторы потенциального GlnR-регулона, но с разной эффективностью.

Впервые показано, что белок PotN снижает ДНК связывающую активность GlnR. При этом АТФ-насыщенная форма PotN (Т-форма) характеризуется повышенным сродством к GlnR (Кд=8.1±0.7 мкМ) и подавляет связывание GlnR с ДНК (Кд=1.26±0.3 мкМ). Напротив, АДФ-насыщенная форма PotN (О-форма) обладает меньшим сродством к GlnR (Кд=13±1.4 мкМ) и способствует более стабильному связыванию GlnR с ДНК (Кд=0.46±0.2 мкМ).

Таким образом, в работе впервые установлен механизм контроля ДНК-связывающей активности фактора транскрипции GlnR в клетках L. hilgardii, который заключается в ассоциации-диссоциации комплекса PotN-GlnR и переассоциации GlnR от PotN к ДНК в зависимости от энергетического статуса клетки, определяемого соотношением концентраций АТФ и АДФ.

Методология и методы исследования

Экспериментальное решение задач исследования осуществлено с применением молекулярно-генетических, биохимических, физико-химических и микробиологических методов, включая биоинформатические методы и средства обработки данных. Для экспрессии исследуемых белков в клетках кишечной палочки использовали современные приемы создания генетических конструкций и трансформации бактериальных штаммов. Для получения исследуемых белков в электрофоретически гомогенном состоянии использовали метод аффинной хроматографии. Для исследования белок-белковых взаимодействий использовали методы микромасштабного термофореза, поверхностного плазмонного резонанса, бактериальной двугибридной системы и эксклюзионной хроматографии.

Достоверность результатов

Описанные в диссертационной работе результаты являются воспроизводимыми, получены с использованием современных молекулярно-генетических, биохимических, физико-химических и микробиологических методов. Представленные в работе результаты экспериментов являются достоверными, что подтвеждается соответствующим статистическим анализом. Большая часть полученных результатов диссертации опубликованы в журналах, индексируемых WoS, Scopus и РИНЦ и доложена на всероссийских и международных научных конференциях.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные результаты вносят вклад в блок фундаментальных знаний о механизмах регуляции экспрессии генов в клетках бактерий. Регуляция активности факторов транскрипции путем прямого взаимодействия с PII-подобными белками представлены на сегодняшний день единичными работами, полученные результаты расширяют представления о способах регуляции ДНК-связывающей активности факторов транскрипции в клетках микроорганизмов. Понимание механизмов реализации генетической информации открывает возможности контроля и направленной модификации метаболизма микробной клетки, что актуально при решении задач биотехнологии, где широкое использование получили лактобациллы.

Основные положения, выносимые на защиту

1) Секвенированный геном L. hilgardii содержит 2705 кодирующих последовательностей, из них 1846 генов кодируют белки с известными или предсказанными функциями. Уникальной особенностью генома L. hilgardii является представленность многих генов в виде двух копий, что, по всей видимости, является результатом горизонтального переноса генов.

2) Идентифицированы 13 генов, промоторы которых способны in vitro связываться с фактором транскрипции GlnR, и составляющие потенциальный

GlnR-регулон. Из них восемь генов кодируют белки с известными функциями, включая собственный ген glnR, и пять генов кодируют гипотетические белки.

3) PII-подобный белок PotN из L. hilgardii связывается с С-концевым доменом GlnR, чем подавляет его ДНК-связывающую активность. При этом АТФ-насыщенная форма PotN обладает большим сродством к GlnR по сравнению с АДФ-насыщенной формой, что приводит к преимущественному связыванию GlnR с ДНК в условиях недостатка энергетического питания для клетки.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертационной работы представлены на 14 международных и российских конференциях, таких как Трансляционная медицина 2016 (Казань, 2016), Международная конференция The 41st FEBS Congress: Molecular and system biology for a better life (Кушадасы, 2016), Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2017, 2018), III Международная школа-конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2018), Международная конференция The 44th FEBS Congress: From molecules to living systems (Краков, 2019), Всероссийская школа-конференция молодых ученых «Биосистемы: организация, поведение, управление» (Нижний Новгород, 2019, 2020, 2021), XII Всероссийский конгресс молодых ученых-биологов с международным участием (Пермь, 2020), Международная научно-практическая конференция «Биотехнология: наука и практика» (Ялта, 2020), Европейский биотехнологический конгресс 2020 (Прага, 2020), Международная конференция The 2nd International Conference on Agriculture and Rural Development (ICARD) (Индонезия, 2020), Международная конференция European Society for clinical investigation (ESCI) (Индия, 2021).

Место выполнения работы и личный вклад автора

Работа выполнена на кафедре генетики и НИЛ «Молекулярная генетика микроорганизмов» Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета. Автором диссертации совместно с научным руководителем разработаны главные направления научного исследования, сформулирована цель, поставлены задачи исследовательской работы. Экспериментальные исследования были выполнены диссертантом либо лично, либо при его непосредственном участии с коллективом коллег, проведен анализ и статистическая обработка полученных данных, сформулированы выводы. Обсуждение и подготовка статей к публикации (написание и редактирование) проводилось совместно с научным руководителем и соавторами.

Планирование экспериментов по исследованию взаимодействия GlnR-PotN методами микромасштабного термофореза и поверхностного плазмонного резонанса проводились совместно с профессором Карлом Форшхаммером в Университете Тюбингена (Германия).

Секвенирование ДНК выполнялось сотрудниками

Междисциплинарного центра протеомных исследований КФУ и сотрудниками Университета Тюбингена (Германия).

Связь работы с научными программами

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ 14-0432317 мол_а (2014-2015) «Регуляция азотного метаболизма в клетках молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum» (исполнитель), РФФИ 1504-02583 А (2015-2017) «Сигнальная роль глутамина у микроорганизмов: молекулярные механизмы регуляции азотного обмена и сигналинга в клетках грамположительных бактерий» (исполнитель), гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых -докторов наук № МД-572.2020.4 (2020-2021) «Мультифункциональная роль PII-подобных регуляторных белков в клетках бактерий класса Bacilli»

(исполнитель) и Программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета.

Публикация результатов исследования

По материалам диссертации опубликовано 24 работы, в том числе 4 научные статьи в журналах, индексируемых в Web of Science, Scopus и РИНЦ. Опубликовано 3 тезиса в приложении к журналам, индексируемым в Web of Science.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, обсуждения результатов, выводов, приложений и списка цитируемой литературы. Текст изложен на 135 страницах, проиллюстрирован 47 рисунками, включает 9 таблиц, список литературы содержит 137 библиографических источников. Приложение 1 включает данные о получении генетических конструкций и очистке рекомбинантных белков.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Регуляция транскрипции генов, вовлеченных в азотный метаболизм в клетках B. subtilis

Существуют значительные различия в контроле транскрипции генов, кодирующих ферменты, участвующие в центральном метаболизме азота, среди различных бактерий. У B. subtilis экспрессия этих генов опосредована четырьмя основными транскрипционными факторами: CodY, GlnR, TnrA и GltC, а также белками GlnA, AmtB и GlnK (Рисунок 1). Из них GlnR, TnrA и GltC специфичны для метаболизма азота, тогда как CodY связан как с метаболизмом углерода, так и с метаболизмом азота [Biswas et al., 2020]. GltC специфически связан с контролем генов, кодирующих глутамин-а-кетоглутарат аминотрансферазу. Транскрипционный фактор GlnR активен во время роста в среде с избытком азота, тогда как TnrA активен во время роста в среде с недостатком азота. Изменение активности этих факторов транскрипции непосредственно зависит от глутаминсинтетазы (GS) и ингибированной формы этого фермента (FBI-ГС) [Zalieckas et al., 2006]. GlnR активируется в присутствии FBI-ГС, а TnrA ингибируется посредством физического взаимодействия с FBI-ГС [Hauf et al., 2016]. Было также показано, что TnrA связывается с PII-подобным белком-регулятором GlnK, который чувствителен к АТФ, Mg2+ и а-кетоглутарату. Оба белка тесно связаны с аммиачной пермеазой AmtB при низком уровне АТФ [Kormelink et al., 2012].

Рисунок 1 - Схема регуляции азотного обмена в клетках B. suЫШs. Сверху -регуляторные белки и регуляция в условиях недостатка азота, снизу -регуляторные белки и механизмы в условиях избытка азота

[БсИишасЬег et al., 2015]

В клетках B. suЫШs ген глутаминсинтетазы (glnA) и ген транскрипционного фактора GlnR (glnR) объединены в оперон glnRA. В клетках B. suЫШs GlnR регулирует транскрипцию собственного оперона glnRA (негативная ауторегуляция), ген ШМ фактора транскрипции ТпгА и оперон утилизации мочевины ureABC. ТпгА также контролирует экспрессию

большого количества генов, вовлеченных в азотный обмен клетки [Kormelink et al., 2012].

1.1.1 MerR семейство ДНК-связывающих белков

Семейство белков MerR представляет собой группу ДНК-связывающих белков, распространенных среди широкого диапазона бактериальных родов и имеющих общую структуру. Активность белков этого семейства контролируется эффекторными молекулами: органическими веществами и ионами металлов. Белки этого семейства проявляют активность в димерной форме; состоят из трех доменов: N-концевого, необходимого для взаимодействия с промоторами генов, С-концевого, необходимого для восприятия регуляторного сигнала путем белок-белковых взаимодействий, и двойной антипараллельной спирали, необходимой для димеризации (Рисунок 2) [Brown et al., 2003; Changela et al., 2003; Chen et al., 2010].

Рисунок 2 - Общая схема строения белков семейства MerR

[Changela et al., 2003]

У всех белков МегЯ семейства К-концевые ДНК-связывающие участки около 70 аминокислот имеют высокую степень гомологии, тогда как С-концевые участки отличаются низкой гомологией [Вго1П et al., 2003]. N концевой ДНК-связывающий домен состоит из двух а-спиралей, соединенных

19

поворотом (helix-turn-helix motif), ß-структуры и а-спиралей 3 и 4. N и C-концевые домены связаны друг с другом длинной спиралью, которая участвует в димеризации [Wray, Fisher, 2007].

Регуляция транскрипции с помощью этих белков происходит через белок-зависимое искривление цепи ДНК. Димерный MerR регулятор связывается с операторной областью промотора и привлекает g70 РНК-полимеразу, образуя тройной комплекс. В таком состоянии транскрипция слегка подавлена, так как димер регулятора MerR изменил конформацию ДНК в районе промотора так, что РНК-полимераза не может связаться с ней должным образом. При связывании специфического для каждого MerR иона металла, такой металлированный гомодимер MerR изменяет конформацию ДНК в районе промотора так, что РНК-полимераза связывается с последовательностями -35 и -10, что приводит к образованию открытого комплекса и транскрипции (Рисунок 3) [Hobman, 2007].

Рисунок 3 - Схема обобщенного механизма активации транскрипционной регуляции белками семейства MerR [Hobman, 2007]

1.1.2 Фактор транскрипции TnrA

Фактор транскрипции TnrA является уникальным представителем данного семейства, так как он не подвержен ковалентной модификации в отличие от других представителей семейства MerR, и его ДНК-связывающая активность регулируется путем взаимодействия с FBI-ГС. За взаимодействие

А

В

MerR regulator homodimer

с ГС ответственен консервативный участок из 15 аминокислот в С-концевом домене ТпгА [Беёогоуа et al., 2013; Wгay et al., 2001].

ТпгА B. suЫШs состоит из 110 аминокислот, является одним из самых небольших представителей МегЯ семейства, и содержит всего два домена (Рисунок 4). С-концевой регуляторный домен ТпгА имеет гораздо меньшую длину, чем большинство представителей семейства МегК Сравнение аминокислотных последовательностей ортологов ТпгА показывает наличие консервативной С-концевой области, состоящей из 15 аминокислот, связанной с К-концевым ДНК-связывающим доменом линкерной областью переменной длины. Эта консервативная область связывается с ГС, то есть функционирует как домен передачи сигнала ТпгА ^гау, Е1вЬег, 2007; БсИишасЬег et al., 2015]. Тогда как область внутри 75-90 аминокислотных остатков взаимодействует с 01пК [БсИишасЬег et al., 2015].

Рисунок 4 - Доменная структура белков МегЯ семейства ВшгЯ и ТпгА

^гау, Б1вЬег, 2007]

У B. suЫШs белок ТпгА является транскрипционным фактором, регулирующим экспрессию генов в зависимости от доступности источников восстановленного азота. Факторы транскрипции ТпгА и 01пЯ являются взаимными структурными гомологами и связываются с гомологичными консенсусными последовательностями ДНК (5'-ТОТКА-К7-ТКАСА-3') в промоторной области гена, но проявляют активность в разных условиях доступности источников восстановленного азота ^гау et al., 1997; Wгay et al., 2000; Wгay et al., 1996]. Фактор транскрипции ТпгА в условиях недостатка

восстановленного азота активирует транскрипцию собственного гена (tnrA), генов, участвующих в ассимиляции нитратов и нитритов (nasABCDEF), генов деградации мочевины (ureABC), генов транспорта аммония (nrgAB), гены транспорта у-аминобутирата (gabP), гены деградации аспарагина, регуляции споруляции и многих других [Wray et al., 2000; Shin et al., 2000]. Также TnrA подавляет транскрипцию с оперонов глутаминсинтетазы (glnRA) и глутаматсинтазы (gltAB) [Yoshida et al., 2003].

Избыточное количество восстановленного азота в среде обитания приводит к повышению внутриклеточной концентрации глутамина; в таких условиях активность глутаминсинтетазы ингибирована глутамином (ингибирование по типу обратной репрессии, FBI-ГС). Такая ингибированная форма ГС связывает транскрипционный фактор TnrA, снижая его ДНК-связывающую активность. При этом FBI-ГС активирует фактор транскрипции GlnR, который подавляет транскрипцию собственного оперона glnRA и гена tnrA. Когда уровень глутамина внутри клетки снижается, ГС проявляет биосинтетическую активность, прекращается ингибирование гена tnrA фактором транскрипции GlnR. Фактор транскрипции TnrA диссоциирует из комплекса с FBI-ГС и связывается с TnrA-боксом на промоторах генов-мишеней, активируя транскрипцию собственного гена и целого ряда других [Wray et al., 2001].

В условиях недостатка восстановленного азота TnrA находится в мембраносвязанном состоянии и способен формировать комплекс с белками AmtB и GlnK [Coutts et al., 2002; Heinrich et al., 2006; Kayumov et al., 2011]. При переносе клеток в среду, не содержащую источников азота, TnrA переходит в цитозольную локализацию и быстро элиминируется из клеток с помощью протеолиза. В клетках, мутантных по белкам AmtB или GlnK такой деградации TnrA не наблюдается. Протеолитическая деградация TnrA может служить механизмом поддержания оптимального количества этого фактора транскрипции в клетках [Kayumov et al., 2008].

Фактор транскрипции TnrA осуществляет позитивную регуляцию генов, продукты которых направлены на утилизацию трудноассимилируемых источников азота, а негативная регуляция, вероятнее всего, направлена на подавление углеродного катаболизма в условиях недостатка источников восстановленного азота [Yoshida et al, 2003].

Таким образом, TnrA B. subtilis активен как позитивный или негативный регулятор в условиях ограничения источников азота, что индуцирует высокую активность ГС и инактивирует GlnR.

1.1.3 Фактор транскрипции GlnR

Одним из представителей семейства факторов транскрипции MerR является белок GlnR. GlnR из клеток B. subtilis состоит из 135 аминокислот и является вторым фактором транскрипции, участвующим в регуляции метаболизма азота [Schreier, 1995]. В геноме B. subtilis ген фактора транскрипции GlnR (glnR) составляет оперон glnRA вместе с геном глутаминсинтетазы (glnA) [Wray et al., 1996; Fisher, 1999]. GlnR и TnrA являются структурными гомологами, но, в отличие от TnrA, GlnR проявляет активность в условиях избытка восстановленного азота [Wray et al., 1996; Fisher, 1999]. Факторы транскрипции GlnR и TnrA распознают гомологичные последовательности нуклеотидов: 5'-ATGTNA-N7-TNACAT-3' для GlnR и 5'-TGTNA-N7-TNACA-3' для TnrA [Дорощук c соавт., 2006].

Однако, в отличие от MerR белков, которые активируют транскрипцию путем искажения и перестройки ДНК-промоторов с неоптимальным расстоянием между -10 и -35 боксами, промоторы, связанные с GlnR и TnrA расположены оптимально. Эти данные предполагают, что GlnR и TnrA регулируют транскрипцию с использованием молекулярных механизмов, отличных от белков семейства MerR. C-концевой домен GlnR последовательно отличается от TnrA, содержит 15 дополнительных аминокислотных остатков и препятствует связыванию GlnR с ДНК.

Как и в случае с ТпгА, связывание с глутаминсинтетазой происходит с С-конца С-конец является аутоингибиторным, в отсутствие FBI-

ГС препятствует образованию димерной структуры (Рисунок 5). В присутствии ДНК-мишени происходит образование комплекса 01пК-ГС, что снимает аутоингибиторный эффект С-конца 01пЯ, затем комплекс 01пК-ГС связывается с ДНК с образованием комплекса ГС-01пК-ДНК ^гау, Fisher, 2008].

GlnR GlnR Unstable Stable

Monomer Dimer GlnR-DNA GlnR-DNA

Complex Complex

Рисунок 5 - Механизм димеризации и связывания ДНК фактором транскрипции 01пЯ. ДНК-связывающий К-концевой домен представлен в виде эллипса, в котором область димеризации окрашена серым, регуляторный С-концевой домен представлен в виде циллиндра

Г^гау, Fisher, 2008]

Известно, что G1nR в геноме бацилл активирует экспрессию оперона glnRA, гена ШтЛ и оперона ассимиляции мочевины игеЛБС. G1nR также регулирует синтез К-ацетилглутаматсинтазы, которая является частью пути биосинтеза аргинина и синтезирует К-ацетилглутамат из глутамата и ацетил-КоА, деятельность которой зависит от внутриклеточных концентраций глутамата и глутамина [Хи & а1., 2007]. Недавно с помощью метода иммунопреципитации на чипе (СЫР-оп-сЫр) был определен 61 участок в геноме Б. 8иЫШ8, с которыми может связываться G1nR в условиях избытка восстановленного азота; 15 из них принадлежат к ранее определенному первичному регулону ТпгА. В условиях, когда G1nR максимально активен,

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Журавлева Дарья Эдуардовна, 2021 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1) Дорощук, Н. А. Регуляция азотного метаболизма в грамположительных бактериях [Текст] / Н. А. Дорощук, М. С. Гельфанд, Д. А. Родионов // Мол. Биол. - 2006. - Т.40 (5). - С. 919-926.

2) Amon, J. A genomic view on nitrogen metabolism and nitrogen control in Mycobacteria [Text] / J. Amon, F. Titgemeyer, A. Burkovski // J Mol Microbiol Biotechnol. - 2008. - V. 17 (1). - P. 20-29.

3) Anagnostopoulos, C. Requirements for transformation in Bacillus subtilis [Text] / C. Anagnostopoulos, J. Spizizen // Journal of Bacteriology. - 1961. -V. 81. - №5. - P. 741-746.

4) Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data / S. Andrews // [Online]: http://bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc. - 2010.

5) Aziz, R. K. The RAST server: rapid annotations using subsystems technology [Text] / R. K. Aziz, D. Bartels, A. A. Best, M. DeJongh, T. Disz, R. A. Edwards, K. Formsma, S. Gerdes, E. M. Glass, M. Kubal, F. Meyer, G. J. Olsen, R. Oslon, A. L. Osterman, R. A. Overbeek, L. K. McNeil, D. Paarmann, T. Paczian, B. Parrello, G. D. Pusch, C. Reich, R. Stevens, O. Vassieva, V. Vonstein, A. Wilke, O. Zagnitko // BMC Genomics. - 2008. - V. 9 (75).

6) Batista, M. B. Manipulating nitrogen regulation in diazotrophic bacteria for agronomic benefit [Text] / M. B. Batista, R. Dixon // Biochem. Soc. Trans. -2019. - V. 47 (2). - P. 603-614.

7) Battesti, A. The bacterial two-hybrid system based on adenylate cyclase reconstitution in Escherichia coli [Text] / A. Battesti, E. Bouveret // Methods. - 2012. - V. 58 (4). - P. 325-334.

8) Belitsky, B. R. Genetic and biochemical analysis of CodY-binding sites in Bacillus subtilis [Text] / B. R. Belitsky, A. L. Sonenshein // Journal of Bacteriology. - 2008. - V. 190 (4). - P. 1224-1236.

9) Belitsky, B. R. Role of branched-chain amino acid transport in Bacillus subtilis CodY activity [Text] / B. R. Belitsky // Journal of Bacteriology. - 2015. - V. 197 (8). - P. 1330-1338.

10) Bervoets, I. Diversity, versatility, and complexity of bacterial gene regulation mechanisms: opportunities and drawbacks for applications in synthetic biology [Text] / I. Bervoets, D. Charlier // FEMS Microbiology Reviews. - 2019. - V. 43 (3). - P. 304-339.

11) Biswas, R. Role of GlnR controlling expression of nitrogen metabolism genes in Listeria monocytogenes [Text] / R. Biswas, A. L. Sonenshein, B. R. Belitsky // Journal of Bacteriology. - 2020. - V. 202 (19). - P. 209-220.

12) Blagova, E. V. Crystallization of the GTP-dependent transcriptional regulator CodY from Bacillus subtilis [Text] / E. V. Blagova, V. M. Levdikov, K.

Tachikawa, A. L. Sonenshein, A. J. Wilkinson // Acta Cryst. - 2003. - V. 59. -P. 155-157.

13) Boogerd, F.C. AmtB-mediated NH3 transport in prokaryotes must be active and as a consequence regulation of transport by GlnK is mandatory to limit futile cycling of NH4+/NH3 [Text] / F. C. Boogerd, H. M. Ma, F. J. Bruggeman, W. C. van Heeswijk, R. Garcia-Contreras, D. Molenaar //FEBS Lett. - 2011. -V. 585. - P. 23-28.

14) Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [Text] / M. Bradford // Anal Biochem. - 1976. - V. 7 (72). - P. 248-254.

15) Brantl, S. Characterisation of Bacillus subtilis transcriptional regulators involved in metabolic processes [Text] / S. Brantl, A. Licht // Current Protein and Peptide Science. - 2010. - V. 11. - P. 274-291.

16) Brandenburg, J. L. Roles of PucR, GlnR and TnrA in regulating expression of the Bacillus subtilis ure P3 promoter [Text] / J. L. Brandenburg, L. V. J. Wray, L. Beier, H. Jarmer, H. H. Saxild, S. H. Fisher // J. Bacteriol. - 2002. -V. 184 (21). - P. 6060-6064.

17) Brown, N. L. The MerR family of transcriptional regulators [Text] / N. L. Brown, J. V. Stoyanov, S. P. Kidd, J. L. Hobman // FEMS Microbiol. - 2003. - V. 27. - P. 145-163.

18) Brown, S. W. Autogenous regulation of the Bacillus subtilis glnRA operon [Text] / S. W. Brown, A. L. Sonenshein // Journal of Bacteriology. - 1996. -V. 178 (8). - P. 2450.

19) Browning, D. F. Local and global regulation of transcription initiation in bacteria [Text] / D. F. Browning, S. J. W. Busby // Nature Reviews Microbiology. - 2016. - V. 14 (10). - P. 638.

20) Camacho, C. BLAST+: architecture and applications [Text] / C. Camacho, G. Coulouris, V. Avagyan, N. Ma, J. Papadopoulos, K. Bealer, T. L. Madden // BMC Bioinformatics. - 2009. - V. 10 (421).

21) Castellen, P. The Streptococcus mutans GlnR protein exhibits an increased affinity for the glnRA operon promoter when bound to GlnK [Text] / P. Castellen, F. G. M. Rego, M. E. G. Portugal, E. M. Benelli // Brazilian Journal of Medical and Biological Research. - 2011. - V. 44 (12). - P. 1202-1208.

22) Changela, A. Molecular basis of metal-ion selectivity and zeptomolar sensitivity by Cue [Text] / A. Changela, K. Chen, Y. Xue, J. Holschen, C. E. Outten, T. V. O'Halloran, A. Mondragon // Science. - 2003. - V. 301. - P. 1383-1387.

23) Chen, P. M. Role of GlnR in acid-mediated repression of genes encoding proteins involved in glutamine and glutamate metabolism in Streptococcus mutans [Text] / Y. Y. Chen, S. L. Yu, S. Sher, C. H. Lai, J. S. Chia // Appl Environ Microbiol. - 2010. - V. 76 (8). - P. 2478-2486.

24) Conroy, M. J. The crystal structure of the Escherichia coli AmtB-GlnK complex reveals how GlnK regulates the ammonia channel [Text] / M. J. Conroy, A. Durand, D. Lupo, X. Li, P. A. Bullough, F. K. Winkler, M. Merrick // Proc Natl Acad Sci USA. - 2007. - V. 104. - P.1213-1218.

25) Cottevieille, M. The subnanometer resolution structure of the glutamate synthase 1.2-MDa hexamer by cryoelectron microscopy and its oligomerization behavior in solution: functional implications [Text] / M. Cottevieille, E, Larquet, S. Jonic, M. V. Petoukhov, G. Caprini, S. Paravisi, D. I. Svergun, M. A. Vanoni, N. Boisset // J Biol Chem. - 2008. - V. 283 (13). -P. 8237-8249.

26) Coutts, G. Membrane sequestration of the signal transduction protein GlnK by the ammonium transporter AmtB [Text] / G. Coutts, G. Thomas, D. Blakey, M. Merrick // EMBO J. - 2002. - P.21 (4). - P.536-545.

27) De Man, J. C. A medium for the cultivation of Lactobacilli [Text] / J. C. De Man, M. Rogosa, M. E. Sharpe // Journal of Applied Bacteriology. - 1960. -V. 23. - P. 130-135.

28) Detsch, C. Ammonium utilization in Bacillus subtilis: transport and regulatory functions of NrgA and NrgB [Text] / C. Detsch, J. Stulke // Microbiology. -2003. - V. 149. - P. 3289-3297.

29) Deuel, T. F. Regulation of glutamine synthetase from Bacillus subtilis by divalent cations, feedback inhibitors, and L-glutamine [Text] / T. F. Deuel, S. Prusiner // Journal of Biological Chemistry. - 1974. - V. 1. - P. 257-264.

30) Deuel, T. F. Some kinetic properties of Bacillus subtilis glutamine synthetase [Text] / T. F. Deuel, E. R. Stadtman // J Biol Chem. - 1970. - V. 245. - P. 52065213.

31) Dormeyer, M. Variants of the Bacillus subtilis LysR-type regulator GltC with altered activator and repressor function [Text] / M. Dormeyer, S. Lentes, B. Richts, R. Heermann, T. Ischebeck, F. M. Commichau // Frontiers in Microbiology. - 2019. - V. 10. - P. 1-16.

32) Eisenberg, D. Structure-function relationships of glutamine synthetases [Text] / D., Eisenberg, H. S. Gill, G. M. Pfluegl, S. H. Rotstein // Biochim Biophys Acta. - 2000. -P. 122-145.

33) Fedorova, K. Transcription factor TnrA inhibits the biosynthetic activity of glutamine synthetase in Bacillus subtilis [Text] / K. Fedorova, A. Kayumov, K. Woyda, O. Ilinskaja, K. Forchhammer // FEBSLetters. - 2013. - P. 1293-1298.

34) Fernandes, G. C. Glutamine synthetase stabilizes the binding of GlnR to nitrogen fixation gene operators [Text] / G. C. Fernandes, K. Hauf, F. H. Sant'Anna, K. Forchhammer, L. M. P. Passaglia // FEBS J. - 2017. - V. 284 (6). - P. 903-918.

35) Fisher, S. H. Bacillus subtilis glutamine synthetase regulates its own synthesis by acting as a chaperone to stabilize GlnR-DNA complexes [Text] / S. H.

Fisher, L. V. Wray // Proc Natl Acad Sci USA. - 2008. - V. 105. - P. 10141019.

36) Fisher, S. H. Feedback-resistant mutations in Bacillus subtilis glutamine synthetase are clustered in the active site [Text] / S. H. Fisher, L. V. Wray // J Bacteriol. - 2006. - V. 188. - P. 5966-5974.

37) Fisher, S. H. Nitrogen source utilization and its regulation in Bacillus subtilis and its closest relatives: from genes to cells [Text] / S. H. Fisher, M. Debarbouille // American Society for Microbiology. - 2002. - P. 181-191.

38) Fisher, S. H. Novel trans-acting Bacillus subtilis glnA mutations that derepress glnRA expression [Text] / S. H. Fisher, L. V. Wray // J Bacteriol. - 2009. - V. 191. - P. 2485-2492.

39) Fisher, S. H. Regulation of nitrogen metabolism in Bacillus subtilis: vive la difference! [Text] / S. H. Fisher // Mol Microbiol. - 1999. - V. 32. - P. 223232.

40) Fisher, S. H. Role of CodY in regulation of the Bacillus subtilis hut operon [Text] / S. H. Fisher, K. Rohrer, A. E. Ferson // J Bacteriol. - 1996. - V. 178.

- P. 3779-3784.

41) Forchhammer, K. Glutamine signalling in bacteria [Text] / K. Forchhammer // Frontiers in Bioscience. - 2007. - V. 12. - P. 358-370.

42) Forchhammer, K. P (II) signal transducers: novel functional and structural insights [Text] / K. Forchhammer // Trends Microbiol. - 2008. - V. 16. - P. 6572.

43) Forchhammer, K. Carbon/nitrogen homeostasis control in cyanobacteria [Text] / K. Forchhammer, K. A. Selim // FEMS Microbiology Review. - 2020.

- v. 44 (1). - P. 33-53.

44) Frare, R. Elimination of GlnKAmtB affects serine biosynthesis and improves growth and stress tolerance of Escherichia coli under nutrient-rich conditions [Text] / R. Frare, M. Stritzler, C. Pascuan, K. Liebrenz, L. Galindo-Sotomonte, G. Soto, P. I. Nikel, N. Ayub // FEMS Microbiology Letters. - 2020. - V. 367 (23). - P. fnaa197.

45) Fulyani, F. Structural and functional diversity of substrate-binding domains in ABC importers [Text] / F. Fulyani // Groningen: University of Groningen. -2015. - P. 1-25.

46) Gardan, R. Role of the transcriptional activator RocR in the arginine-degradation pathway of Bacillus subtilis [Text] / R. Gardan, G. Rapoport, M. Débarbouillé // Mol Microbiol. - 1997. - V. 24 (4). - P. 825-837.

47) Gibson, D. G. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases [Text] / D. G. Gibson, L. Young, R-Y. Chuang, J. C. Venter, C. A. Hutchison III, H. O. Smith // Nature Methods. - 2009. - V. 6 (5). - P. 343-345.

48) Godsey, M. H. Crystal structure of MtaN, a global multidrug transporter gene activator [Text] / M. H. Godsey, N. N. Baranova, A. A. Neyfakh, R. G. Brennan // Journal of Biological Chemistry. - 2001. - V. 276 (50). - P. 47178-47184.

49) Gong, L. GlnR negatively regulates glutamate-dependent acid resistance in Lactobacillus brevis [Text] / L. Gong, C. Ren, Y. Xu // Applied and environmental microbiology. - 2020. - V. 86 (7). - P. e02615-19.

50) Gosztolai, A. GlnK facilitates the dynamic regulation of bacterial nitrogen assimilation [Text] / A. Gosztolai, J. Schumacher, V. Behrends, J. G. Bundy, F. Heydenreich, M. H. Bennett, M. Buck, M. Barahona // Biophysical Journal.

- 2017. - V. 112 (10). - P. 2219-2230.

51) Gunka, K. Control of glutamate homeostasis in Bacillus subtilis: a complex interplay between ammonium assimilation, glutamate biosynthesis and degradation [Text] / K. Gunka, F. M. Commichau // Mol Microbiol. - 2012. -V. 85. - P. 213-224.

52) Gunka, K. Functional dissection of a trigger enzyme: mutations of the Bacillus subtilis glutamate dehydrogenase RocG that affect differentially its catalytic activity and regulatory properties [Text] / K. Gunka, J. A. Newman, F. M. Commichau, C. Herzberg, C. Rodrigues, L. Hewitt, R. J. Lewis, J. Stülke // J Mol Biol. - 2010. - V. 400 (4). - P. 815-827.

53) Hauf, K. The molecular basis of TnrA control by glutamine synthetase in Bacillus subtilis [Text] / K. Hauf, A. Kayumov, F. Gloge, K. Forchhammer // J Biol Chem. - 2016. - V. 291 (7). - P. 3483-3495.

54) Heinrich, A. Interaction of the membrane-bound GlnK-AmtB complex with the master regulator of nitrogen metabolism TnrA in Bacillus subtilis [Text] / A. Heinrich, K. Woyda, K. Brauburger, G. Meiss, C. Detsch, J. Stülke, K. J. Forchhammer // Biol Chem. - 2006. - V. 281. - P. 34909-34917.

55) Heldwein, E. E. Z. Crystal structure of the transcription activator BmrR bound to DNA and a drug [Text] / E. E. Z. Heldwein, R. G. Brennan // Nature. - 2001.

- V. 409 (6818). - P. 378-382.

56) Herrero, A. Nitrogen assimilation in bacteria [Text] / A. Herrero, E. Flores, J. Imperial // Ref. Modul. Life Sci. - 2019.

57) Hobman, J. L. MerR family transcription activators: similar designs, different specificities [Text] / J. L. Hobman // Mol Microbiol. - 2007. - V. 63 (5). - P. 1275-1278.

58) Hosie, A. H. Bacterial ABC transporters of amino acids [Text] / A. H. Hosie, P. S. Poole // Res Microbiol. - 2001. - V. 152. - P. 259-70.

59) Hu, P. Sensing of nitrogen limitation by Bacillus subtilis: comparison to enteric bacteria [Text] / P. Hu, T. Leighton, G. Ishkanova, S. Kustu // J Bacteriol. -1999. - V. 181. - P. 5042-5050.

60) Huang, X. Nitrate assimilation, dissimilatory nitrate reduction to ammonium, and denitrification coexist in Pseudomonas putida Y-9 under aerobic conditions [Text] / X. Huang, C. G. Weisener, J. Ni, B. He, D. Xie, Z. Li // Bioresource Technology. - 2020. - V. 312. - P. 123597.

61) Huergo, L. F. PII signal transduction proteins: nitrogen regulation and beyond [Text] / L. F. Huergo, G. Chandra, M. Merrick // FEMSMicrobiology reviews.

- 2013. - V. 37 (2). - P. 251-283.

62) Iskhakova, Z. The preliminary characterization of P-II like protein GlnK from Lactobacillus brevis [Text] / Z. Iskhakova, D. Zhuravleva, A. Laykov, K. Forchhammer, A. Kayumov // FEBS Journal. - 2016. - V. 283 (1). - P. 228.

63) Javelle, A. Complex formation between AmtB and GlnK: an ancestral role in prokaryotic nitrogen control [Text] / A. Javelle, M. Merrick // Biochem Soc Trans. - 2005. - V. 33. - P. 170-172.

64) Jiang, P. Escherichia coli PII signal transduction protein controlling nitrogen assimilation acts as a sensor of adenylate energy charge in vitro [Text] / P. Jiang, A. J. Ninfa // Biochemistry. - 2007. - V. 46. - P. 12979-12996.

65) Jiang, Y.-L. Coordinating carbon and nitrogen metabolic signaling through the cyanobacterial global repressor NdhR [Text] / Y.-L. Jiang, X.-P. Wang, H. Sun, S.-J. Han, W.-F. Li, N. Cui, G.-M. Lin, J.-Y. Zhang, W. Cheng, D.-D. Cao, Z.Y. Zhang, C.-C. Zhang, Y. Chen, C.-Z. Zhou // PNAS. - 2018. - V. 115 (2). -P. 403-408.

66) Joseph, P. A region of Bacillus subtilis CodY protein required for interaction with DNA [Text] / P. Joseph, M. Ratnayake-Lecamwasam, A. L. Sonenshein // Journal of Bacteriology. - 2005. - V. 187 (12). - P. 4127-4139.

67) Karimova, G. A bacterial two-hybrid system based on a reconstituted signal transduction pathway [Text] / G. Karimova, J. Pidoux, A. Ullmann, D. Ladant // PNAS. - 1998. - V. 95 (10). - P. 5752-5756.

68) Kayumov, A. Inactivation of the general transcription factor TnrA in Bacillus subtilis by proteolysis [Text] / A. Kayumov, A. Heinrich, M. Sharipova, O. Iljinskaya, K. Forchhammer // Microbiology-Sgm. - 2008. - V. 154. - P. 23482355.

69) Kayumov, A. Interaction of the general transcription factor TnrA with the PII-like protein GlnK and glutamine synthetase in Bacillus subtilis [Text] / A. Kayumov, A. Heinrich, K. Fedorova, O. Ilinskaya, K. Forchhammer // FEBS J.

- 2011. - V. 278. - P. 1179-1189.

70) Kelley, L. A. The Phyre2 web portal for protein modelling, prediction and analysis [Text] / L. A. Kelley, S. Mezulis, C. M. Yates, M. N. Wass, M. J. E. Sternberg // Nat Protoc. - 2015. - V. 10 (6). - P. 845-858.

71) Khademi, S. The Amt/MEP/Rh family: structure of AmtB and the mechanism of ammonia gas conduction [Text] / S. Khademi, R. M. Stroud // Physiology (Bethesda). - 2006. - V. 21. - P. 419-429.

72) Kloosterman, T. G. Regulation of glutamine and glutamate metabolism by GlnR and GlnA in Streptococcus pneumoniae [Text] / W. T. Hendriksen, J. J. Bijlsma, H. J. Bootsma, S. A. van Hijum, J. Kok, P. W. Hermans, O. P. Kuipers // J Biol Chem. - 2006. - V. 281. - P. 25097-25109.

73) Kormelink, T. G. Comparative genome analysis of central nitrogen metabolism and its control by GlnR in the class Bacilli [Text] / T. G. Kormelink, E. Coenders, Y. Hagemeijer, L. Overmars, R. J. Siezen, W. M. de Vos, C. Francke // BMC Genomics. - 2012. - V. 13. - P. 191.

74) Krysenko, S. Gamma-Glutamylpolyamine synthetase GlnA3 is involved in the first step of polyamine degradation pathway in Streptomyces coelicolor M145 [Text] / S. Krysenko, N. Okoniewski, A. Kulik, A. Matthews, J. Grimpo, W. Wohlleben, A. Bera // Front. Microbiol. - 2017. - V. 8. - P. 726.

75) Krysenko, S. Poly- and monoamine metabolism in Streptomyces coelicolor: the new role of glutamine-synthetase-like enzymes in the survival under environmental stress [Text] / S. Krysenko, A. Matthews, T. Busche, A. Bera, W. Wohlleben // Microb Physiol. - 2021. - P. 1-15.

76) Lapina, T. The PII signaling protein from red algae represents an evolutionary link between cyanobacterial and chloroplastida PII proteins [Text] / T. Lapina, K. A. Selim, K. Forchhammer, E. Ermilova // Scientific Reports. - 2018. - V. 8. - P. 1-14.

77) Laemmli, U. K. Denaturing (SDS) discontinuous gel electrophoresis [Text] / U. K. Laemmli // Nature. - 1970. - V. 277. - P. 680-685.

78) Lee, H. S. BSP-SLIM: a blind low-resolution ligand-protein docking approach using predicted protein structures [Text] / H. S. Lee, Y. Zhang // Proteins. -2012. - V. 80 (1). - P. 93-110.

79) Leigh, J. A. Nitrogen regulation in bacteria and archaea [Text] / J. A. Leigh, J. A. Dodsworth // Annu Rev Microbiol. - 2007. - V. 61. - P. 349-377.

80) Liaw, S.-H. Interactions of nucleotides with fully unadenylylated glutamine synthetase from Salmonella typhimurium [Text] / S.-H. Liaw, G. Jun, D. Eisenberg // Biochemistry. - 1994. - V. 33. - P. 11184-11188.

81) Lightfoot, D. A. Expression of the Escherichia coli glutamate dehydrogenase gene in the cyanobacterium Synechococcus PCC6301 causes ammonium tolerance [Text] / D. A. Lightfoot, A. J. Baron, J. C. Wootton // Plant Mol Biol. - 1988. - V. 11 (3). - P. 335-344.

82) Maddocks, S. E. Structure and function of the LysR-type transcriptional regulator (LTTR) family proteins [Text] / S. E. Maddocks, P. C. F. Oyston // Microbiology. - 2008. - V. 154. - P. 3609-3623.

83) Maiti, R. SuperPose: a simple server for sophisticated structural superposition [Text] / R. Maiti, G. H. Van Domselaar, H. Zhang, D. S. Wishart // Nucleic Acids Res. - 2004. - V. 32. - P. W590-W594.

84) McGuffin, L. J. The PSIPRED protein structure prediction server [Text] / L. J. McGuffin, K. Bryson, D. T. Jones // Bioinformatics. - 2000. - V. 16 (4). - P. 404-405.

85) Merrick, M. J. Nitrogen control in bacteria [Text] / M. J. Merrick, R. A. Edwards // Microbiological reviews. - 1995. - V. 59 (4). - P. 604-622.

86) Miller, J. H. Galactosidase assay. In J. H. Miller (ed.), Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory [Text] / J. H. Miller // Cold Spring Harbor. - 1972. - P. 352-355.

87) Moreno-Vivian, C. Biology of the nitrogen cycle, Chapter 17 - Nitrate assimilation in bacteria (eds. H. Bothe, S.J. Ferguson, W.E. Newton) [Text] / C. Moreno-Vivian, E. Flores // Elsevier. - 2007. - P. 263-282.

88) Murray, D. S. Structures of the Bacillus subtilis glutamine syntetase dodecamer reveal large intersubunit catalytic conformational changes linked to a unique feedback inhibition mechanism [Text] / D. S. Murray, N. Chinnam, N. K. Tonthat, T. Whitfill, L. V. Wray, S. H. Fisher, M. A. Schumacher // The journal of biological chemistry. - 2013. - V. 288. - P. 35801-35811.

89) Nakano, M. M. Nitrogen and oxygen regulation of Bacillus subtilis nasDEF encoding NADH-dependent nitrite reductase by TnrA and ResDE [Text] / M. M. Nakano, T. Hoffmann, Y. Zhu, D. Jahn // JBacteriol. - 1998. - V. 180 (20). - P. 5344-5350.

90) Ninfa, A. J. PII signal transduction proteins: sensors of a-ketoglutarate that regulate nitrogen metabolism [Text] / A. J. Ninfa, P. Jiang // Current opinion in microbiology. - 2005. - V. 8 (2). - P. 168-173.

91) Ogawa, K-i. The nasB operon and nasA gene are required for nitrate/nitrite assimilation in Bacillus subtilis [Text] / K-i. Ogawa, E. Akagawa, K. Yamane, Z-W. Sun, M. LaCelle, P. Zuber, M. M. Nakano // Journal of bacteriology. -1995. - P. 1409-1413.

92) Oliveira, T. Crystal structure of a chimaeric bacterial glutamate dehydrogenase [Text] / T. Oliveira, M. A. Sharkey, P. C. Engel, A. R. Khan // Acta Cryst. -2016. - V. 72. - P. 462-466.

93) Ozhegov G. D. Whole genome sequence data of Lactobacillus fermentum HFD1, the producer of antibacterial peptides [Text] / G. D. Ozhegov, A. S. Pavlova, D. E. Zhuravleva, N. E. Gogoleva, E. I. Shagimardanova, M. I. Markelova, D. R. Yarullina, A. R. Kayumov // Data in brief. - 2020. - V. 32. -P. 106105. (0.437 п.л., авт. 0.07 п.л.)

94) Paz-Yepes, J. The amt gene cluster of the heterocyst-forming cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120 [Text] / J. Paz-Yepes, V. Merino-Puerto, A. Herrero, E. Flores // J Bacteriol. - 2008. - V. 190 (19). - P. 6534-6539.

95) Picossi, S. Molecular mechanism of the regulation of Bacillus subtilis gltAB expression by GltC [Text] / S. Picossi, B. R. Belitsky, A. L. Sonenshein // J Mol Biol. - 2007. - V. 365 (5). - P. 1298-1313.

96) Radchenko, M. V. Control of AmtB-GlnK complex formation by intracellular levels of ATP, ADP, and 2-oxoglutarate [Text] / M. V. Radchenko, J. Thornton, M. Merrick // J Biol Chem. - 2010. - V. 285. - P. 31037-45.

97) Randazzo P. Revisiting the in vivo GlnR-binding sites at the genome scale in Bacillus subtilis [Text] / P. Randazzo, A. Aucouturier, O. Delumeau, S. Auger // BMC Res Notes. - 2017. - V. 10 (1). - P. 422.

98) Rehm, N. Engineering of nitrogen metabolism and its regulation in Corynebacterium glutamicum: influence on amino acid pools and production [Text] / N. Rehm, A. Burkovski // Appl Microbiol Biotechnol. - 2010. - V. 89.

- P. 239-248.

99) Reitzer, L. Nitrogen assimilation and global regulation in Escherichia coli [Text] / L. Reitzer // Annu Rev Microbiol. - 2003. - V. 51. - P. 155-176.

100) Robinson, J. T. Integrative genomic viewer [Text] / J. T. Robinson, H. Thorvaldsdottir, W. Winckler, M. Guttman, E. S. Lander, G. Getz, J. P. Mesirov // Nat Biotechnol. - 2011. - V. 29 (1). - P. 24-26.

101) Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual [Text] / J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis // Cold Spring Harbor Laboratory Press. -1989.

102) Santero, E. Glutamate dehydrogenases: enzymology, physiological role and biotechnological relevance [Text] / E. Santero, A. B. Hervas, I. Canosa, F. Govantes // Chapter 12 / In Tech. - 2012. - P. 289-318.

103) Satomura, T. Enhancement of glutamine utilization in Bacillus subtilis through the GlnK-GlnL two-component regulatory system [Text] / T. Satomura, D. Shimura, K. Asai, Y. Sadaie, K. Hirooka, Y. Fujita // J Bacteriol.

- 2005. - V. 187. - P. 4813-4821.

104) Schreier, H. J. Bacillus subtilis glnR mutants defective in regulation [Text] / H. J. Schreier, C. A. Rostkowski // Gene. - 1995. - V. 161. - P. 51-56.

105) Schumacher M. A. Structures of regulatory machinery reveal novel molecular mechanisms controlling B. subtilis nitrogen homeostasis [Text] / M. A. Schumacher, N. B. Chinnam, B. Cuthbert, N. K. Tonthat, T. Whitfill // Genes and Development. - 2015. - V. 29. - P. 451-464.

106) Seemann, T. Prokka: rapid prokaryotic genome annotation [Text] / T. Seemann // Bioinformatics. - 2014. - V. 30 (14). - P. 2068-2069.

107) Selim, K. A. Functional and structural characterization of PII-like protein CutA does not support involvement in heavy metal tolerance and hints at a small-molecule corrying/signaling role [Text] / K. A. Selim, L. Tremino, C. MarcoMarin, V. Alva, J. Espinosa, A. Contreras, M. D. Hartmann, K. Forchhammer, V. Rubio // The FEBS Journal. - 2021. - V. 288 (4). - P. 1142-1162.

108) Sen, T. Z. GOR V server for protein secondary structure prediction [Text] / T. Z. Sen, R. L. Jernigan, J. Garnier, A. Kloczkowski // Bioinformatics. - 2005. -V. 21 (11). - P. 2787-2788.

109) Sharkey, M. A. Modular coenzyme specificity: a domain-swopped chimera of glutamate dehydrogenase [Text] / M. A. Sharkey, P. C. Engel // Proteins. -2009. - V.77. - P. 268-278.

110) Sharkey, M. A. Structure of NADP+-dependent glutamate dehydrogenase from Escherichia coli: reflections on the basis of coenzyme specificity in the family

of glutamate dehydrogenases [Text] / M. A. Sharkey, T. F. Oliveira, P. C. Engel, A. R. Khan // Febs J. - 2013. - V. 280 (18). - P. 4681-4692.

111) Shin, B. S. Analysis of tnrA alleles which result in a glucose-resistant sporulation phenotype in Bacillus subtilis [Text] / B. S. Shin, S. K. Choi, I. Smith, S. H. Park // J Bacteriol. - 2000. - V. 182. - P. 5009-5012.

112) Shivers, R. P. Activation of the Bacillus subtilis global regulator CodY by direct interaction with branched-chain amino acids [Text] / R. P. Shivers, A. L. Sonenshein // Mol Microbiol. - 2004. - V. 53 (2). - P. 599-611.

113) Sonenshein, A. L. Control of key metabolic intersections in Bacillus subtilis [Text] / A. L. Sonenshein // Nature Reviews Microbiology. - 2007. - V. 5. - P. 917-927.

114) Sun, Y. Nitrogen assimilation in denitrifier Bacillus azotoformans LMG 9581T [Text] / Y. Sun, P. De Vos, A. Willems // Antonie van Leeuwenhoek. - 2017. -V. 110. - P. 1613-1626.

115) Suzuki, A. Glutamate synthase: structural, mechanistic and regulatory properties, and role in the amino acid metabolism [Text] / A. Suzuki, D. B. Knaff // Photosynth Res. - 2005. - V. 83 (2). - P. 191-217.

116) Tiffert, Y. The Streptomyces coelicolor GlnR regulon identification of new GlnR targets and evidence for a central role of GlnR in nitrogen metabolism in Actinomycetes [Text] / Y. Tiffert, P. Supra, R. Wurm. W. Wohlleben, R. Wagner, J. Reuther // Mol Microbiol. - 2008. - V. 64 (7). - P. 861-880.

117) Tremblay, P-L. Of blood, brains and bacteria, the Amt/Rh transporter family: emerging role of Amt as a unique microbial sensor [Text] / Tremblay P-L., Hallenbeck P. C. // Mol Microbiol. - 2009. - V. 71 (1). - P. 12-22.

118) Van den Heuvel, R. H. H. Glutamate synthase: a fascinating pathway from L-glutamine to L-glutamate [Text] / R. H. H. Van den Heuvel, B. Curti, M. A. Vanoni, A. Mattevi // Cell Mol Life Sci. - 2004. - V. 61. - P. 669-681.

119) Van Dommelen, A. (Methyl)ammonium transport in the nitrogen-fixing bacterium Azospirillum brasilense [Text] / A. Van Dommelen, V. Keijers, J. Vanderleyden, M. de Zamaroczy // J Bacteriol. - 1998. - V. 180 (10). - P. 2652-2659.

120) Van Heeswijk, W. C. Nitrogen assimilation in Escherichia coli: putting molecular data into a systems perspective [Text] / W. C. van Heeswijk, H. V. Westerhoff, F. C. Boogerd // Microbiol Mol Biol Rev. - 2013. - V. 77 (4). - P. 628-695.

121) Vanoni, M. A. Structure-function studies of glutamate synthases: a class of self-regulated iron-sulfur flavoenzymes essential for nitrogen assimilation [Text] / M. A. Vanoni, B. Curti // IUBMB Life. - 2008. - V. 60(5). - P.287-300.

122) Wick, R. R. Unicycler: resolving bacterial genome assemblies from short and long sequencing reads [Text] / R. R. Wick, L. M. Judd, C. L. Gorrie, K. E. Holt // PLoS Comput Biol. - 2017. - V. 13 (6). - P. e1005595.

123) Wray, L. V. Bacillus subtilis GlnR contains an autoinhibitory C-terminal domain required for the interaction with glutamine synthetase [Text] / L. V. Wray, S. H. Fisher // Molecular Microbiology. - 2008. - V. 68 (2). - P. 277285.

124) Wray, L. V. Bacillus subtilis glutamine synthetase controls gene expression through a protein-protein interaction with transcription factor TnrA [Text] / L. V. Wray, J. M. Zalieckas, S. H. Fisher // Cell. - 2001. - V. 107. - P. 427-435.

125) Wray, L. V. Expression of the Bacillus subtilis ureABC operon is controlled by multiple regulatory factors including CodY, GlnR, TnrA, and Spo0H [Text] / L. V. Wray, A. E. Person, S. H. Fisher // Journal of Bacteriology. - 1997. -V. 179. - P. 5494-5501.

126) Wray L. V. Functional analysis of the carboxy-terminal region of Bacillus subtilis TnrA, a MerR family protein [Text] / L. V. Wray, S. H. Fisher // J Bacteriol. - 2007. - V. 189 (1). - P. 20-27.

127) Wray, L.V. Functional roles of the conserved Glu304 loop of Bacillus subtilis glutamine synthetase [Text] / L.V. Wray, S. H. Fisher // J Bacteriol. - 2010. -V.192. - P.5018-5045.

128) Wray, L. V. Purification and in vitro activities of the Bacillus subtilis TnrA transcription factor [Text] / L. V. Wray, J. M. Zalieckas, S. H. Fisher // Journal of Molecular Biology. - 2000. - V. 300. - P. 29-40.

129) Wray, L. V. TnrA, a transcription factor required for global nitrogen regulation in Bacillus subtilis [Text] / L. V. Wray, A. E. Ferson, K. Rohrer, S. H. Fisher // Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. - 1996. - V. 93. -P. 8841-8845.

130) Wu, T. D. Discovering empirically conserved amino acid substitution groups in databases of protein families [Text] / T. D. Wu, D. L. Brutlag // ISMB. -1996. - P. 230-240.

131) Xu, Y. Surprising arginine biosynthesis: a reappraisal of the enzymology and evolution of the pathway in microorganisms [Text] / Y. Xu, B. Labedan, N. Glansdorff // Microbiol Mol Biol Rev. - 2007. - V.71 (1). - P. 36-47.

132) Yakunin, A. F. AmtB is necessary for NH4+-induced nitrogenase switch-off and ADP-ribosylation in Rhodobacter capsulatus [Text] // J Bacteriol. - 2002.

- V. 184 (15). - P. 4081-4088.

133) Yang, Y. Structural visualization of transcription activated by a multidrug-sensing MerR family regulator [Text] / Y. Yang, C. Liu, W. Zhou, W. Shi, M. Chen, B. Zhang, D. G. Schatz, Y. Hu, B. Liu // Nature communications. - 2021.

- V. 12 (1). - P. 1-14.

134) Yoshida, K. Identification of additional TnrA-regulated genes of Bacillus subtilis associated with a TnrA box [Text] / K. Yoshida, H. Yamaguchi, M. Kinehara, Y. H. Ohki, Y. Nakaura, Y. Fujita // Mol. Microbiol. - 2003. - V. 49. - P. 157-165.

135) Zalieckas, J. M. Cross-regulation of the Bacillus subtilis glnRA and tnrA genes provides evidence for DNA binding site discrimination by GlnR and TnrA

[Text] / J. M. Zalieckas, L. V. Wray, S. H. Fisher // J Bacteriol. - 2006. - V. 188. - P.2578-2585.

136) Zhuravleva D. Analysis of glutamine synthetase activity from Lactobacillus hilgardii LMG 7934 [Text] / D. Zhuravleva, L. Yadykova, Z. Iskhakova, A. Kayumov // IOP Conference Series: Earth and Environmental Science, IOP Publishing. - 2021. - V. 715. №. 1. - P. 012069.

137) Zhuravleva D. E. Complete genome sequence of Lactobacillus hilgardii LMG 7934, carrying the gene encoding for the novel PII-Like protein PotN [Text] / D. E. Zhuravleva, Z. I. Iskhakova, G. D. Ozhegov, N. E. Gogoleva, D. R. Khusnutdinova, E. I. Shagimardanova, K. Forchhammer, A. R. Kayumov // Current Microbiology. - 2020. - V. 77. №11. - P. 3538-3545.

Приложение 1

1 Получение плазмид

1.1 Получение плазмид для гиперпродукции рекомбинантных белков GlnR-his6, GlnR15-his6, GlnR42-his6, GlnR-ST, GlnR15-ST, GlnR42-ST

С геномной ДНК L. hilgardii синтезировали фрагменты ДНК, содержащие полноразмерный и укороченные гены glnR, используя праймеры GlnR pET for / GlnR wt pET rev, GlnR pET for / GlnR15 pET rev, GlnR pET for / GlnR42 pET rev, GlnR pASK5 Eco for / GlnR wt pASK Bam rev, GlnR pASK5 Eco for / GlnR15 pASK Bam rev, GlnR pASK5 Eco for / GlnR42 pASK Bam rev (Таблица 2). Полученные фрагменты, содержащий гены glnR выделяли из геля после электрофореза (Рисунок 1).

M 1 2 3 4 5 6

Рисунок 1 - ПЦР-продукты амплификации с праймеров: 1- GlnR pET for /

GlnR wt pET rev, 2 - GlnR pET for / GlnR15 pET rev, 3 - GlnR pET for / GlnR42 pET rev, 4 - GlnR pASK5 Eco for / GlnR wt pASK Bam rev, 5 - GlnR pASK5 Eco for / GlnR15 pASK Bam rev, 6 - GlnR pASK5 Eco for / GlnR42 pASK Bam rev в 1% агарозном геле, М - ДНК маркер молекулярного веса

Для получения конструкций pET15b-GlnR, pET15b-GlnR15, pET 15b-GlnR42, pASK-IBA5plus-GlnR, pASK-IBA5plus-GlnR15, pASK-IBA5plus-GlnR42 использовали плазмиды pET15b и pASK-IBA5plus соответственно. Вектор pET15b рестрицировали по сайту BamHI и дефосфорилировали. Рестрицированную плазмиду pET15b очищали из геля после электрофореза (Рисунок 2). Вектор pASK-IBA5plus рестрицировали по сайтам EcoRI и

BamHI, рестрицированную плазмиду выделяли из геля после электрофореза (Рисунок 2).

М 1 2 3 4

Ш—

'S* ' < V Is

Рисунок 2 - Рестрицированные плазмиды pET15b и pASK-IBA5plus. М -ДНК маркер молекулярного веса, 1 - плазмида pET15b, 2 - рестрицированная плазмида pET15b, 3 - плазмида pASK-IBA5plus, 4 - рестрицированная

плазмида pASK-IBA5plus

Выделенные фрагменты, содержащие гены glnR, лигировали в рестрицированные векторы pET15b и pASK-IBA5plus с получением конструкций pET15b-GlnR, pET15b-GlnR15, pET15b-GlnR42, pASK-IBA5plus-GlnR, pASK-IBA5plus-GlnR15, pASK-IBA5plus-GlnR42. Лигазными смесями трансформировали штамм E. coli XLI-Blue, рекомбинантные клетки высевали на LA с ампициллином.

После трансформации, наряду с клонами, несущими плазмиду со вставкой гена, могли образоваться клоны, несущие исходный вектор. Это связано с тем, что при лигировании вектор мог замкнуться по липким концам сам на себя. Для того, чтобы определить произошла ли вставка в векторе, проводили ПЦР-анализ используя праймеры T7 prom / T7 term для pET15b и pASK IBA5p for / pASK IBA5p rev для pASK-IBA5plus. Негативным контролем служили исходные плазмиды (Рисунок 3, 4).

МК- 12 34 56 78 9 10

М К- 11 12 13 14 15

Рисунок 3 - ПЦР-скрининг на наличие вставок генов glnR в вектор pET15b. ПЦР-продукты амплификации с праймеров T7 prom / T7 term в 1% агарозном геле. ПЦР-продукты с клонов, трансформированных: 1-5 - pET15b-GlnR, 610 - pET15b-GlnR15, 11-15 - pET15b-GlnR42. К- - с исходной плазмиды pET15b, М - ДНК маркер молекулярного веса

Рисунок 4 - ПЦР-скрининг на наличие вставок генов glnR в вектор pASK-IBA5plus. ПЦР-продукты амплификации с праймеров pASK IBA5p for / pASK IBA5p rev в 1% агарозном геле. ПЦР-продукты с клонов, трансформированных: 1-5 - pASK-IBA5plus-GlnR, 6-10 - pASK-IBA5plus-GlnR15, 11-15 - pASK-IBA5plus-GlnR42. К- - с исходной плазмиды pASK-IBA5plus, М - ДНК маркер молекулярного веса

Из 30 проанализированных клонов все 30 несли плазмиды, имеющие вставку-фрагмент, по молекулярной массе соответствующую генам glnR. Для

получения гиперпродуцентов белков GlnR, выделяли плазмиды и трансформировали ими лабораторный штамм E. coli BL21.

1.2 Получение плазмид для использования в бактериальной двугибридной системе

Для использования в бактериальной двугибридной системе подготавливали конструкции как описано в Материалах и методах. После трансформации производили отбор клонов, содержащих гены-вставки (Рисунок 5, 6).

МК- 1 23 4 567 89 10 11

М К- 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

¡¡Ji 'WS 1 III 1 Ii ' ¡ill

«а "iPfi |l

Рисунок 5 - ПЦР-скрининг на наличие вставок генов glnR в вектор pKT25. ПЦР-продукты амплификации с праймеров pKT25 for / pKT25 rev в 1% агарозном геле. ПЦР-продукты с клонов, трансформированных: 1-11 -pKT25-GlnR, 12-22 - pKT25-GlnR15, 23-33 - pKT25-GlnR42. К- - с исходной плазмиды pKT25, М - ДНК маркер молекулярного веса

Рисунок 6 - ПЦР-скрининг на наличие вставок генов glnR в вектор pKNT25. ПЦР-продукты амплификации с праймеров pKNT25 for / pKNT25 rev в 1% агарозном геле. ПЦР-продукты с клонов, трансформированных: 1-11 -pKNT25-GlnR, 12-22 - pKNT25-GlnR15, 23-33 - pKNT25-GlnR42. К- - с исходной плазмиды pKNT25, М - ДНК маркер молекулярного веса

Затем плазмиды, содержащие гены-вставки glnR использовали в экспериментах бактериальной двугибридной системы.

2 Очистка рекомбинантных белков GlnR полной длины и с делециями С-концевого домена, а также белка PotN

2.1 Отбор клонов-гиперпродуцентов белков GlnR-his6, GlnR15-his6, GlnR42-his6, GlnR-ST, GlnR15-ST, GlnR42-ST

Плазмидами pET15b-GlnR, pET15b-GlnR15, pET15b-GlnR42, pASK-IBA5plus-GlnR, pASK-IBA5plus-GlnR15, pASK-IBA5plus-GlnR42, несущими полноразмерный и укороченные гены glnR, а также ген potN, трансформировали штамм E. coli BL21. Ночной культурой рекомбинантных штаммов E. coli, а также исходного штамма E. coli BL21 засевали 2 мл среды LB и выращивали 2-3 часа до достижения ОП600=0.8. Для снятия репрессии и

индукции гиперпродукции белков вносили IPTG до конечной концентрации 1 мМ. Через 4 часа культивирования с интенсивным перемешиванием при 25-30 °С клетки собирали центрифугированием и ресуспендировали в 1 мл физиологического раствора. 25 мкл суспензии смешивали с 25 мкл однократного SDS-содержащего буфера для внесения и инкубировали при 95 °С в течение 10 мин. Пробы анализировали с помощью ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях (Рисунок 7, 8).

М ОпР-Ыве 01ПР15-1"П56 01ПР42-1"П5

Рисунок 7 - Скрининг рекомбинантных штаммов для гиперпродукции рекомбинантных белков 01пЯ полноразмерного и с делециями С-концевого

домена

М аг^-БТ ЗИРМб-БТ 01пР42-8Т

Рисунок 8 - Скрининг рекомбинантных штаммов для гиперпродукции рекомбинантных белков 01пЯ полноразмерного и с делециями С-концевого

домена 141

2.2 Очистка рекомбинантных белков GlnR-his6, GlnR15-his6, GlnR42-his6 Для препаративной очистки белков в 500 мл среды LB с соответствующим антибиотиком засевали 25 мл ночной культуры рекомбинантного штамма E. coli и инкубировали с качанием при 37 °С до ОП6оо=0.8. Далее к культуре добавляли IPTG до конечной концентрации 1 мМ либо AHT до конечной концентрации 0.2 мкг/мл, и культивировали 4 ч с качанием при 30 °С. Клетки из культуральной жидкости собирали путем центрифугирования и готовили клеточные экстракты как описано в Материалах и методах, а затем использовали для аффинной хроматографии.

Хроматографию белков, содержащих гис-tag проводили на Ni-NTA сефарозе на колонках объемом 1-5 мл. Колонку уравновешивали путем промывания пятью объемами буфера HisW. Затем наносили подготовленный клеточный экстракт со скоростью 0.5 мл/мин. Колонку промывали буфером HisW до снижения оптической плотности элюата до значения 0.01 при длине волны Х=280. Элюцию проводили буфером при скорости 0.5 мл/мин. Элюат собирали фракциями по 1 мл и анализировали с помощью ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях (Рисунок 9).

М 1 2 3

i

Рисунок 9 - Очищенные рекомбинантные белки GlnR: М - маркер белкового веса, 1 - GlnR-his6, 2 - GlnR15-his6, 3 - GlnR42-his6

Белки были очищены в среднем в 10 раз до электрофоретической гомогенности (Таблица 1).

Таблица 1 - Очистка белков GlnR-his6, GlnR15-his6, GlnR42-his6 при помощи хроматографии на Ni-NTA сефарозе

Белок Концентрация Общее количество Общее Степень

белка (мг/мл) экстракта/элюата количество очистки

(мл) белка (мг) белка

I* II* I II I II I II

GlnR-His6 6 4 9 2 60 10 1 6

GlnR15-His6 6 5 5 1.5 53 6 1 6

GlnR42-His6 6 4 5 1 32 6 1 6

*I - Клеточный экстракт *II - Элюция

2.3 Очистка рекомбинантных белков GlnR-ST, GlnR15-ST, GlnR42-ST и PotN-ST

Для получения штаммов-продуцентов белков GlnR-ST, GlnR15-ST, GlnR42-ST и PotN-ST штамм E. coli BL21 был трансформирован плазмидами: pASK-IBA5plus-GlnR, pASK-IBA5plus-GlnR15, pASK-IBA5plus-GlnR42 и pASK-IBA3plus-PotN, обеспечивающими гиперпродукцию рекомбинантных белков. Рекомбинантные белки были очищены до электрофоретической гомогенности с помощью аффинной хроматографии на стреп-тактин сефарозе (Рисунок 10, Таблица 2).

М 1 2 3 4

Рисунок 10 - Очищенные рекомбинантные белки GlnR: М - маркер белкового веса, 1 - PotN-ST, 2 - GlnR-ST, 3 - GlnR15-ST, 4 - GlnR42-ST

Таблица 2 - Очистка белков PotN-ST, GlnR-ST, GlnR15-ST, GlnR42-ST при

помощи хроматографии на стреп-тактин сефарозе

Белок Концентрация Общее количество Общее Степень

белка (мг/мл) экстракта/элюата количество очистки

(мл) белка (мг) белка

I* II* I II I II I II

PotN-ST 8 4 11 3 88 12 1 7

GlnR-ST 7 4 10 2.5 70 10 1 7

GlnR15-ST 8 5 12 2 96 10 1 10

GlnR42-ST 7 5 6 1.5 63 9 1 7

*! - Клеточный экстракт

*П - Элюция