Сравнительное изучение роли белка и полисахаридов в молекулярной организации клеточной поверхности археи Halobacterium salinarium и клеточной стенки некоторых видов дрожжей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Карпова, Елена Витальевна

• Карпова, Елена Витальевна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Карпова, Елена Витальевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Клеточная поверхность Архей. 6 1. Клеточная поверхность археи На1оЬааегшт %а1тагшт

1.1. Мембранные белки На1оЬас(егшт за1тагшт.

1.2. Гликопротеин Б-слоя клеточной поверхности На1оЬас1епит ьаИпапит

1.2.1. Аминокислотный и карбогидратный анализ.

1.2.2. Гликозилирование.

1.2.3. Липидная модификация. 19 II. Клеточная поверхность микроорганизмов, относящихся к домену Эукариоты.

1. Клеточная стенка дрожжей.

1.1. Белки.

1.1.1. Белки, нековалентно связанные с клеточной стенкой дрожжей.

1.1.2. Белки, содержащие гликозилфосфоинозитольный якорь (ОР1 - белки). 31 Ы.З.Белки, содержащие внутренние повторы в аминокислотной последовательности (РШ-белки).

1.2. Глюкан.

1.2.1. р-1,3-глюкан.

1.2.2. р1,6-глюкан.

1.3. Хитин. 41 ЗАКЛЮЧЕНИЕ. 44 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 45 1. Используемые в работе штаммы микроорганизмов.

2. Состав сред для выращивания микроорганизмов и условия культивирования.

2.1. Среда для выращивания археи На!оЬас(егшт мйтагшт

2.2. Среда для выращивания дрожжей

2.3. Условия выращивания микроорганизмов.

3. Приготовление препаратов клеточных стенок

3.1. Приготовление препаратов клеточных стенок археи НаЬЬаШпит закпапит, используя постепенное понижение концентрации солей

3.2. Приготовление препаратов клеточных стенок археи НаЬЬаШпит ьаНпапит с использованием стеклянных шариков баллотини.

3.3. Приготовление препаратов клеточных стенок дрожжей с использованием стеклянных шариков баллотини.

4. Микроскопические методы. 48 4.1. Метод фазового контраста 48 4.2 Метод флуоресцентной микроскопии.

4 3. Электронная микроскопия клеток (клеточных стенок) дрожжей.

4.4. Электронная микроскопия клетосных поверхностей Halobacterium bahnarium.

5. Фракционирование белков клеточной стенки.

5 1. Получение фракции нековалентно связанных с клеточной стенкой белков. 50 5 2 Получение фракции ковалентно связанных с клеточной стенкой белков

6. Электрофоретические методы.

6.1. Электрофорез в денатурирующих условиях.

6.1.1. Окраска белков при помощи красителя Кумасси.

6.1.2. Окраска белков при помощи нитрата серебра.

6.2. Электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану

Вестерн-блот анализ).

7. Биотинилирование белков.

8. Получение очищенного препарата клостридиопептидазы. 54 8.1. Электрофорез коллагеназы в неденатурирующих условиях. 54 8 2. Подготовка субстрата коллагена для определения коллагенолитической активности клостридиопептидазы.

8.3. Определение коллагенолитической активности клостридиопептидазы с помощью электрофореза в денатурирующих условиях 55 8 4. Определение протеолитической активности в препаратах коллагеназы по гидролизу окрашенного казеина.

9. Обработка клеточных стенок микроорганизмов протеолитическими ферментами.

9.1. Обработка клеточных стенок микроорганизмов трипсином.

9.2. Обработка клеточных стенок микроорганизмов клостридиопептидазой. 56 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. 57 1. Идентификация коллагеноподобных последовательностей в белках клеточной поверхности археи Halobacterium salinanum и клеточной стенки некоторых видов дрожжей.

1.1 Очистка коллагеназы Clostridium histolyticum с помощью электрофореза в неденатурирующих условиях.

1.1.1. Проверка коллагенолитической активности полученного препарата клостридиопептидазы.

1.1.2. Проверка присутствия в очищенном препарате клостридиопептидазы протеолитической активности.

1.1.3. Определение влияния присутствия NaCl в среде инкубации на активность коллагеназы.

1.2. Идентификация коллагеноподобных последовательностей в белках клеточной поверхности археи Halobacterium salinarium.

1.2.1. Подбор оптимальных условий для выделения клеточных поверхностей археи Halobacterium salinarium.

1.2.2. Воздействие клостридиопептидазы на клеточные поверхности Halobacterium salinarium

1.3. Идентификация коллагеноподобных последовательностей в белках клеточной стенки дрожжей.

1.3.1. Подбор оптимальных условий для выделения клеточных стенок дрожжей.

1.3.2. Воздействие клостридиопептидазы на клеточные стенки дрожжей.

1.3.3. Сравнение состава белковых фракций клеточных стенок дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Hansenulapolymorpha и Candida utilis

1.3.4. Воздействие клостридиопептидазы на фракцию PIR-белков клеточных стенок дрожжей Hansenula polymorpha и Candida utilis

1.3.5. Проверка чувствительности клеточных стенок дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha и Candida utilis к протеолитической деградации использованием фермента трипсина.

1.3.6. Изучение роли О-гликозилирования белков в поддержание структурной целостности клеточной стенки дрожжей.

2. Изучение роли полисахаридных компонентов клеточной стенки дрожжей в структурной организации этой органеллы клетки.

2.1. Сравнительный анализ уровня хитина в клеточной стенкие дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha и Candida utilis. 2.2 Изучение роли глюкантрансферазы Bgl2p в формировании молекулярной структуры клеточной стенки дрожжей Hansenula polymorpha и Saccharomyces cerevisiae.

2.3. Изучение структурной роли хитина в клеточной стенке дрожжей Saccharomyces cerevisiae

2.4. Исследование морфологии двойного мутанта дрожжей Saccharomyces cerevisiae с нарушенными генами BGL2 и CHS

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сравнительное изучение роли белка и полисахаридов в молекулярной организации клеточной поверхности археи Halobacterium salinarium и клеточной стенки некоторых видов дрожжей»

Одним и* важнейших компартментов клегки микроорганизмов является клеточная поверхность (KII), в состав которой входит клеточная стенка (КС), цитоплазматическая мембрана и, в некоторых случаях, перишшматическое пространство. КС представляет собой внешнюю часть КП Она играет роль наружного скелета клетки, выполняет защитную функцию и осуществляет комплекс взаимоотношений клетки с окружающей средой Таким образом, КС является важной и мнотфункциональной органеллой клетки, которая офажает основные особенности микроорганизма, в зависимости от условии его обитания и принадлежности к той или иной филогенетической группе Это делает КС весьма интересным объектом для изучения.

Основными структурными компонентами КС микроорганизмов являются белки различной степени гликозилировапия и полисахариды Следует отметить, однако, что компонентный состав КС микроорганизмов различной видовой и таксономической принадлежности может существенно отличаться (Kandier, Konig, 1993, Klis, 1994, Калебина, Кулаев, 2001)

Белки выполняют двоякую функцию в КС: ферментативную, участвуя во встраивании структурных компонентов в КС и функцию структурного модуля Для исследователей белки КС, также, могут являйся важным маркером для изучения процессов эволюции Последнее можно отнести, например, к белкам, относящимся к семейству коллагенов Как известно, именно колла1епы являются важными структурными белками высших эукариот животного происхождения В связи с этим интересно было бы проследить, прису1ствуют ли белки с коллагепоподобными последовательное ¡ями в белках КС микроорганизмов, находящихся на разных стадиях эволюционного развития Основанием для поиска таких белков в составе КП микроорганизмов явились работы М В Нурмипской (Нурминская и др , 1994), выполненные в нашей лаборатории Помимо этого, сравнительное исследование белкового состава КС микроорганизмов, относящихся к разным филогенешческим группам, даст возможность проследить основные этапы эволюции КС у разных микроорганизмов

Другой струк1урныи компонент КС - полисахариды служат опорным материалом жес1ких кчеточных стенок (хитин, глюкан, целлюлом), выполняют защитные функции (капсульные иолиахариды), а также служат в качестве энергешческого резерва клетки (BaiaöoB, 1988) Гидрофильные полисахариды способствуют поддержанию водного баланса клеток Особенно важную роль играют полисахариды в образовании клеточных поверхностей, характеризующихся набором различных типов молекул полисахаридов, входящих в их состав Так, например, КС грибов - оомицегов состоя!, в основном, из целлюлозы и глюкана, а пе хитина, как у большинства дру!их мицелиальных грибов

Таким образом, сравнительное изучение роли основных структурных компонентов в молекулярной организации КП микрооршнизмов из разных филогенетических групп является важной и актуальной в настоящее время задачей Особенно актуальным является изучение КП архей, сравнительно недавно охарактеризованною домена живых существ, в первую очередь, в контексте сравнения присутствующих на их поверхностях белков и полисахаридов с компонентами КС дрожжей - представителей низших эукариот

Обзор литературы.

I. Клеточная поверхнос1ь Архей.

Важным открытием в области микробиологии явилось выявление нового домена живой природы - Архей (Архебактерии) (Wose et all., 1990)

Следует отметить, что па филогенетическом древе (рис 1) домен Архей разделен на два царства Кренархеоы и Эвриархеота (рис 1) Царство Крснархеота представляв собой достаточно roMoiennoe сообщество, включающее сравнительно узкую ipynny экстремально термофильных архей. Эвриархеоты (от греческою eurys - широкий) включает все архейные типы, основными из которых являются метаногены и их фенотипически близкие формы.

В результате исследования особенностей жизнедеятельности и ор[анизации клеточных структур у представителей этого домена жизни было выяснено много интересных с эволюционной точки зрения фактов.

Самой удиви 1ельной особенностью архей является их обитание в экстремальных условиях жизни, в связи с этим некоторые гены у представителей домена Архея являются уникальными, как было показано в результате проведенных генетических и биохимических экспериментов (Graham etal, 2000) Поэтому они могут выживать в среде, которая до последнего времени считалась неприемлемой для поддержания жизни (Lubberi 1995) Следует отметить, что микроорганизмы, обитающие в таких экстремальных ареалах, как правило, лишены возможности конкурировать с другими группами микроорганизмов Поэтому архей гораздо менее нуждаются в молекулярной адаптации с помощью мутаций, чем другие микроорганизмы, например бактерии Следовательно, архей не без основания относят к «low-clock» (медленно эволюционирующим) организмам Таким образом, они могут больше походить на своих предков, чем эукариоты и бактерии (Lubben, 1995) Благодаря этому изучение структурных и биохимических особенностей клеток архей и, в частности, их КП особенно важно для прослеживания эволюционных отношений между доменами

Помимо этого археи не являются однородным сообществом организмов Некоторые типичные преде ивители живут при экстремально высоких температурах (термофилы) или при высокой концентрации солеи (галофилы), тогда как другие обладают уникальными метаболистическими путями, подобный метановым сообществам, которые требуют стро! их анаэробных условии (метаногепы) (Lubben, 1995 )

1 акое разнообразие в предпочтении к необычным условиям обитания говорит и о возможности существования различных типов КП внутри домена Археи.

IIa основании исследования полимеров КП было построено филогенетическое древо Архей (рис. 1) Как видно на этом рисунке разные археи не обладают одним и тем же компонентом в составе клеточной стенки (Kandier, Konig, 1998).

Полимеры клеточной стенки и клеточной поверхности

Л I! С II Л Г Л lulococtui" ILlIrrfuclcr 1Ш

КЛгоооюсси*4 МгIhano . LaUcriun Arelix

КСЛКТЛ * мезофилы умеренные термофилы

4hanopUmjsO "Vtharxuplrlllie^ Hettunoi»rctiu*

Euryarchaeota ltemoplas«^ l клгипосмт1^ t I jannaschii 7 i<incus „ 3 Ihcrwlllholro 4 vannicf!I

Hu rmoirxrus

H II л | jrr js

ПАИШЛ. псевдомуреин ф сульфатированный гетерополисахарид щ метанохондроитин глюкозаминогликан

О гликопротеин S-слоя Q протеин S-слоя д протеин оболочки гликокаликс гипертермофильиая линия

Рис I. Распространение клеточно-стеночных и клеточно-поверхностных полимеров среди архей (Kandier, Konig, 1993)

Это факт говорит о том, что общий предок в домене Археи не обладал специфическим клеточно-поверхносгным полимером Таким образом, в огличие от ситуации, обнаруженной в бактериальном домене, где, по крайней мере, муреин является наиболее широко распространенным и характерным полимером для КП бактериальных клеток, компоненты КП Археи эволюционировали независимо у различных систематических групп Подобная ситуация обнаружена в домене Эукариот (Kandier, Konig, 1998)

1ем не менее, в систематике архей присутствует кршерии, применяемый среди представителей домена Бактерии - реакция клеток на окрашивание по методу Грама По этому критерию археи делят на грамположительные и грамотрицательные

При отсутствии муреина в КП архей, ригидная КП в грамиоложительных археях сформирована полимерами отличной химической природы (псевдомуреном, метанохондраитином или i етерополисахаридом) (Kandier, Konig, 1998).

Для грамотрицательных архей, к которым относится преобладающее количество видов, не существует типичного профиля КП Общим в строении их КП является присутствие одинарного поверхностного слоя, который содержит протеиновую или i ликопротеиновую субъединицу и может выполнять функции, аналогичные экзополисахаридному гликокаликсу (гликопротеиновому комплексу, включенному в наружную поверхность цитоплазматическои мембраны в животных клетках) (Kandier, Konig, 1998)

На основании вышесказанного можно заключить, что КГ1 различных представителей домена археи обладают уникальными структурными и биохимическими особенностями, которые имеют отличительные черты и некоторое подобие как внутри домена Археи, так и на междоменном уровне

Следовательно, дальнейшее, более подробное описание особенностей КП Архей целесообразно проводить на примере одного, наиболее характерного и хорошо изученного к настоящему времени представителя лого уникального домена жизни. Таковой является облигатно-галофильная архея Halobaclerium salinarium, принадлежащая царству Эвриархеоты .

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Карпова, Елена Витальевна

выводы.

1. Воздействие высокоспецифичного в отношении фибриллярного белка коллагена фермента клостридиопептидазы Clostridium histolyticum на клеточные поверхности микроорганизмов, в частности, археи Halobactermm salinarium и дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha и Candida utilis является простым и эффективным методом для выявления присутствия коллагеноподобных последовательностей в белках этой клеточной органеллы.

2. С помощью клостридиопептидазы Clostridium histolyticum в белках клеточной поверхности облигатно-галофильной археи Halobactermm salinarium обнаружены коллагеноподобные последовательности. Этот факт является важным как для характеристики самих белков, так и с эволюционной точки зрения.

3. С использованием высокоспецифичного теста - бактериальной клостридиопептидазы было продемонстрировано, что в клеточных стенках дрожжей с низким содержанием хитина, а именно Hansenula polymorpha и Candida utilis присутствуют белки с коллагеноподобными последовательностями, которые не были обнаружены в белках клеточной стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae с относительно высоким содержанием хитина.

4. Нарушения структуры клеточной стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, вызванные делецией глюкантрансферазы Bgl2p, компенсируются хитином, в то время, как «хитиновая» компенсация при подобных нарушениях в клеточной стенки дрожжей Hansenula polymorpha отсутствует.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В результате проведенных в рамках этой работы исследований было выявлено, что прокариотический микроорганизм - облигатно-галофильная архея Н ясАтапит имеет некоторые общие черты строения клеточной поверхности с низшими эукариотами. Несмотря на простоту строения КС этого микроорганизма, в ее состав входят элементы таких структурных компонентов, как коллаген и хитин, характерных для высших эукариот. Эти данные еще раз подтверждают современные представления о том, что именно археи (по крайней мере, некоторые из них) являются предками эукариотических клеток (ОзЫша,1994).

В отличие от археи Н заИпапит, дрожжи имеют более сложноорганизованную КС, в состав которой входят как белковые (гликопротеиновые), так и полисахаридные компоненты. Соотношение этих компонентов КС у разных видов дрожжей различно.

Таким образом, по-видимому, у древних архей и у низших эукариот важную роль в молекулярной организации КС, несмотря на малое количество, играют белки с коллагеноподобными последовательностями и хитин соответственно. Причем у дрожжей с низким содержанием хитина коллагеноподобные последовательности также выявлены и играют важную структурную роль. До сих пор эти соединения считали важными компонентами клеток, в основном, высших эукариот животного происхождения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Карпова, Елена Витальевна, 2007 год

1. Вагабов В М (1988) Биосинтез у1леводных компоненюв клеточной стенки дрожжей // Пущино ОНТИ НЦБИ АН СССР

2. Калебина 1С, Кулаев И С (2001) Роль белков в формировании молекулярной структуры клеточной стенки дрожжей II Успехи биол Химии 141 С 105-130

3. Калебина ТС., Нурминская MB, Чжан С, Чертов ОЮ, Руденская ГН, Степанов ВМ, Кулаев И С (1994) Про1еиназы с различной субстрашой специфичностью в струк1урных изучениях клеточной стенки дрожжей С utihs II Биоорг Химия Т 20, с 627-634

4. Лауринавичюте Д К, Бовин НВ, Насонов В В, Моренков ОС, Калебина I С, Кулаев И С (2000) Влияние нарушения гена BGL2 на структурные изменения в клеточной стенке дрожжей Saccharomyces cerevisiae //Докл Акад Наук Т372, № 3, с. 407-409

5. Михайлов AT, Симирский ВII (1991) Методы иммунохимическою анализа в биологии развшия //М, Наука, с 287

6. Нурминская MB, Калебина ТС, Ройтберг М.А, Кулаев И С (1994), Распространение в геномах микроорганизмов фрагментов гомологичных кДНК про al(l) кочлагена цыпченка IIМикробиология Т 63, вып 1, с. 86-89

7. Северина Л О (1995) Бактериальные S-слои // Микробио шгия Т 64, №6, с 725-733

8. Степанов В М (1996) Молекулярная биология Структура и функции белков (Под редакцией академика А С Спирина) Москва «Высшая шкоча» (1996)

9. Abeijon С , Orlean Р, Robbins Р W , Ilirschberg С В (1989) Topography of glycosylation m yeast // Proc Natl Acad Su USA Vol 86, pp 6935-6939

10. Aguilar-Uscanga B, Francois JM (2003) A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation // Lett Appl Microbiol Vol 37, pp 268-274

11. Alloush HM, Lopez-Ribot J M ,Masten В J, Chaffin WL (1997) 3-phosphoglycerate kinase a glycolytic enzyme protein present in the cell wall of Candida albicans // Microbiology Vol 143, pp 321-330

12. Andrews P D , Stark M J R ( 2000) Dynamic, Rholp-dependent localization of Pkclp to sites ofpolari/ed growth //J Cell Sci Vol 113, pp 2685-2693

13. Ash J , Domínguez M , Bergeron J J M , Thomas D Y., Bourbonnais Y (1995) The yeast proprotein convertase encoded by YAP3 is a glycophosphatidylinositol-anchored protein that locali/cd to the plasmamembrane IIJ Bwchem Vol 270 pp 20847-20854

14. Ballou С E (1990) Isolation, characterization, and properties of Saccharomyces cerevisiae mnn mutants with nonconditional protein glycosylation defects // Melh hnzymol Vol.185, pp. 440-470

15. Bahler J (2005) Cell-cycle control of gene expression in budding and fission yeast // Annu Rev Genet Vol 39, pp 69-94

16. Blaurock A F , Stoeckcnius W , Oesterhelt D , Scherphof G (1976) Structure of the cell envelope of Halobaclenum halobium //J Cell Biol Vol 71, pp 1-22

17. Bond M D, Van Wart HF (1984) Relationship between the individual collagenases of Clostridium histolytieum evidence for evolution by gene duplication J/Biochemistry V 23, no 13, pp 3092-3099

18. Bond M D , Van Wart II F (1984 a) Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolytieum // Biochemistry V 23, pp 3085-3091

19. Bond M D , Van Wart H E , Steinbrink D R (1985) Substrate Specificity of ß-Collagenase from Clostridium histolyticum II J Biol Chem V 260, no 5,pp 2771-2776

20. Brown J I , Bussey II (1993) The yeast KRL9 gene encodes O-glycoprotein involved in cell surface ß-glucan assembly II Mol Cell Biol Vol 13, pp 6346-6356

21. Bruin E C, Werten M W 1 , Laane C, de Wolf T A (2002) Endogenous prolyl 4-hydroxylation in Hansenula polymorpha and its use for the prodaction of hydroxylated recombinant gelatin //TEMS V I, pp 291-298

22. Butt T M , Hoch H C , Staples R C , Leger R J S (1989) Use of fluorochromes in the study of fungal cytology and differentiation //Exp Mycol V 13, pp 303-313

23. Cabib h , Bowers B (1971) Chitin yeast budding localization ol chitin in yeast bud scars// J Biol Chem Vol 241, no I, pp 152-159

24. Cabib E, Drgonovd J, Drgon 1 (1998) Role of small G protlins in ylast cell POIARIZA i ION AND WAIL biosynthesis//ANNU RFV BlOCIlFM VOL 67, 307-333

25. Cabib E, Duran A (2005) Synthase Ill-dependent chitin is bound to different acceptors depending on location on the cell wall of budding yeast II.J Biol Chem Vol 280, no 10, pp 9170-9179

26. Cabib E, Parkas V /1971) The control of morphogenesis, an en/ymatic mechanism for the initiation of septum formation in yeast // Proc Natl Acad Sei USA Vol 9, pp.2052-2056

27. Cabib F, Bowers B, Roberts RL (1983) Vectorial synthesis of a polysaccharide by isolated plasma membranes // Proc Natl Acad Sei USA Vol 80, pp 3318-3321

28. Cabib E, Sburlati a, Bowers B, Silverman SJ (1989) Chitin synthase 1, an auxiliary enzyme for chitin synthesis in Saccharomyces cerevisiae // J Cell Biol Vol 108, pp 16651672

29. Cabib E, Silverman SJ, Shaw JA (1992) Chitinase and chitin synthase 1-counterbalancing activities in cell separation of Saccharomyccs cerevisiae // J Gen Microbiol. Vol 138, pp 97-102

30. Cabib L , Roh D H , Schmidt M, Crotti L.B, Varma A (2001) The yeast cell wall and septum as paradigms of cell growth and morphogenesis //./ Biol Chem. Vol 276, pp 1967919682

31. Cappellaro C, Baldermann C, Rachel R, Tanner W (1994) Mating type-specific cell-cell recognition of Saccharomyces cerevisiae cell wall attachment and active sites of a- and «-agglutinin IILMBOJ Vol 13, pp 4737-4744

32. Cappellaro C, Mrsa V, Ianner W (1998) New potential cell wall glucanases of Saccharomyces cerevisiae//J Bacteriol Vol 180, pp 5030-5037

33. Caro LHP, Smits G J, Van Egmond P , Chapman J W , Klis F M (1998) Transcription of multiple cell wall protein-encoding genes in Saccharomyces cerevisiae is differently regulated during the cell c>clc IIFEMS Microbiol Lett Vol 161, no 2, pp 345-349

34. Caro I H P , Tettelin H , Vossen J H , Ram A 1 J , Van Den Ende H , Klis F M In silieio identification of glycosyl-phosphatidylinositol-anchored plasma-membrane and cell wall proteins of Saccharomyces cerevisiae II Yeast Vol 13 pp 1477-1489

35. Casanova M , Chaffin W L (1991) Phosphate-containing proteins and glycoproteins of the cell wall of Candida albicans II Infect Immun Vol 59, no3,pp 808-813

36. Chaffin W J , Lopez-Ribot J L , Casanova M , Go/albo D , Martinez J P. (1998) Cell wall and secreted proteins of Candida albicans, identification, function and expresion // Microbiol Mol Rial Rev Vol 62, 130-180

37. Charalambous BV, Keen JN, McPherson MJ (1988) Collagen-like sequences homotrimcrs of a bacterial hydrolase // EMBO J Vol 7, no. 9, pp 2903-2909.

38. Cho K Y, Doy C II, Mercer L II (1967) Ultrastructure of the Obligate Halophihc Bacterium Halobactet mm halobium IIJ Bacterial Vol 94, no 1, pp 196-201

39. Choi W J , Santos B , Duran A , Cabib E (1994) Are yeast chitin synthases regulated at the transcriptional or the posttranscnptional level //Mol Cell Biol Vol 14, pp 7685-7694

40. Cid V J , Duran A , del Rey T , Snyder M P , Nombela C., Sanchez M (1995) Molecular basis of cell integrity and morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae II Microbiol Rev Vol 59, pp 45-386

41. Con/elmann A, Riezman H, Desponds C, Bron C (1988) A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an mositol-contaimng phospholipid // EMBO J Vol 7, pp 2233-2240

42. Conzelmann A, Puoti R L, Lester L, Desponds C (1992) Two different types of lipid moieties are present in glycerol phosphatidylinositol-anchored membrane proteins of Saccharomyces cerevisiae // EMBO J Vol 11, pp 457-466

43. Cui X , Shin H , Song C , Laosinchai W , Amano Y , Brown J R M. (2001) A putative plant homolog of the yeast beta-l,3-glucan syntase subunit FKS1 from cotton (Gossypium hirsutum I ) fibers //Planta Vol 213, pp 223-230

44. De Groot, P W , De Boer, A D , Cunningham, J, Dekker, H L , De Jong, I , Hellingwerf, K J (2004) Proteomic analysis of Candida albicans cell walls reveals covalently bound carbohydrateactive enzymes and adhesins // Lukaryot Cell Vol 3, pp 955-965

45. De Groot PWJ, Hellingwerf KJ, Klis TM (2003) Genomewide identification of fungal GPI proteins II Yeast Vol 20, pp. 781-796

46. DeGrootPWJ , Ram A F , Klis F M (2005) Features and functions of covalently linked proteins in fungal cell walls //Fungal Genetics and Biology V 42, pp 657-675

47. Delley P A , Hall M N (1982) Cell wall stress depolarizes cell growth via hyperactivation of RHOI//J Cell Biol Vol 147, pp 163-174

48. Duffus JII, I evi C, Manners DJ (1982) Yeast cell-wall giucans II Adv Microb Physiol Vol 23,pp 151-81

49. Ecker M, Deut/mann R, Lehle L, Mrsa V, Tanner W ( 2006) PIR-proteins of Saccharomyces cerevisiae are attached to beta -1,3-glucan by a new protein-earbohydrate linkage IIJBwlChem V 281, no 17, pp 11523-11529

50. Frnst J F , Prill S K -II (2001) O-glycosylation II Medical Microbiology Vol 39 67-74

51. Garcia-Rodriguez L J, Trilla J A , Castro C , Valdivieso M H , Duran A , Roncero C (2000) Characterization of the chitin biosynthesis proccss as a compensatory mechanism in the fksl mutant of Saccharomyces ccrcvisiae // FEBSI etts, V 478, pp 84-88

52. Gaynor h C , Mondesert G , GriMMe S J, Reed S I, Orlean P , Emr S D (1999) MCD4 encodes a conserved endoplasmic reticulum membrane protein essential for glycosylphosphatidyhnositol anchor synthesis in yeast // Mol Biol Cell .Vol.10, pp 627648

53. G ebb ink M. r B G, Claessen D, Barend B , Dijkhuizen L, Wosten Han A ( 2005 ) Amyloids-a functional coat for microorganisms II Microbiology V 3, no 4, pp 333-341

54. Gentzsch M, Tanner W (1996) The PMT gene family protein glycosylation in Saccharomyces cerevisiae is vital // FMBOJ Vol. 15, pp 5752-5759.

55. Gentzsch M, Tanner W (1997) Protein O-glycosylation in yeast protein-specific mannosyltransferases // Glycobwlogy Vol 7, pp 481-486

56. Graham DF, Overbeek R, Olsen GJ, Woese CR (2000) An archaeal genomic signature // Proc Natl AcadSu U S A V 97, no 7, pp 3304-8

57. Helenius A, Aebi M (2001) Intracellular Runction of/V-hnked glycans //Science Vol 291, pp 2364-2369

58. Herscovics A , Orlean P (1993) Glycoprotein biosynthesis in yeast // FASEB J Vol 7, pp 540-550

59. Hounsell h T , Davies M J, Renouf D V (1996) O-linked protein glycosylation structure and function II Glycoconj J Vol 13 19-26

60. Hoyer L I , Scherer S , Shatzman A R , Livi G P (1995) Candida albicans AI SI domains related to a Saccharomyces cerevisiae sexual agglutinin separated by a repeating motif // Mol Microbiol Vol 15, pp 39-54

61. Hu Y, Webb F , Singh J, Morgan B A , Gainor J A , Gordon I D , Siahaan T J (2002) Rapid determination of Substrate Specificity of Clostridium histolyticum ß-Collagenase Using an Immobilized Peptide Library II J Biol Chem V 277, no 10, pp 8366-8371

62. Immervoll 1 , Gentzsch M , fanner W (1995) PMT3 and PMT4, two new members of the protein-O-mannosyltranslerase gene family of Saccharomyces cerevisiae II Yeast Vol 11, pp 1345-1351

63. Jigann Y, Odani T (1999) Mannosylphosphate transfer to yeast mannan // Biochim Bwphys Acta V 1426, pp 335-345

64. Jung C-M, O Matsushita, S Katayama, J Minami, J Sakurai, A. Okabe (1999) Identification of Metal Ligands in the Clostridium histolyticum Colli Collagenase // J Bacteriol V 181, no 9, pp 2816-2822

65. Kalebina T S , Sokolov S S , Arbatskii N P , Agafonov M O ,Plotmkova T A , Sobolev D F ,Gellissen G,Kulaev IS (2003) Is the chitin repair mechanism universae in yeast// Antone Van Leeuw. V 84(3), pp 179-184

66. Kandier O, Konig H (1993) Cell envelope of Arhaea: structure and chemistry // 7he Biochemist}y of Arhaea (Archabacteria) Vol 8, pp 223-259

67. Kandier O , Konig II (1998) Cell wall polymers in Archaea (Archebacteria; //CMLS Cell and Molecular Life Sciences Vol 54, pp 305-308

68. Kapteyn J C , Hoyer I L , Ilecht J E , Mullcr W H , Andel A , Vcrkleij A J , Makarow M , Van Den Ende II, Klis T.M (2000) The cell wall architecture of Candida albicans wildtype cells and cell wall-defective mutants // Mol Microbiol Vol 35, pp 601-611

69. Kapteyn J C , Van Den bnde H , Klis F M (1999a) The contribution of cell wall proteins to the organization of the yeast cell wall // Biophys Biothem Ada Vol 1426, pp 373-383

70. Karlstrom A, Jacobsson K, Guss B (2006) SclC is a member of a novel family of collagenlike proteins in Streptococcus equi subspecies equi that are recognised by antibodies against SclC // Vet Microbiol V 114, pp 72-81

71. Kaur R, Domergue R, /upancic ML, Cormack BP (2005) A yeast by any other name Candida glabrata and its interaction with the host // Curr Opin Microbiol Vol 8, pp 378384

72. Kessel M , Wildhaber I, Cohen S , Baumcister W (1988) 1 hree-dimcnsional structure of the regular glycoprotein layer of Halobacierium volcanu from the Dead Sea LMBO J , v 7, 1549-1554

73. Kitagaki II, Shimoi H, Itoh K /1997) Identification and analysis of a static culture-specific cell wall protein, Tirlp/Srplp in Saccharomyces cerevisiae II Eur J Biochem Vol 249, pp 343-349

74. Klein C, Garcia-Rizo C, Bisle B, Sheffer B , Zischka II, Pfeiffer F Siedlcr T, Oesterhelt D (2005) The membrane proteome of Halobacierium salinarium 11 I'roteomics V 5, pp 180-197

75. Klis T M (1994) Review cell wall assembly in yeast // Yeasl Vol 10, no 7, pp 851-869

76. Klis FM, Mol P, Helhngwerf K, Brul S (2002) Dynamics of cell wall structure in Saccharomyces cerevisiae //PFMS Vol 738, pp 1-18

77. Klis FM, Caro LI I, Vossen JH (1997) Identification and characterization of a major building block in the cell wall of Saccharomyces cerevisiae II Bwchem Sot Trans Vol 25, pp 856-860

78. Klis 1 M, Boorsma A, De Groot PW (2006) Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae // Yeast V 23, no 3,pp 185-202

79. Kloda A, Martinac B (2002) Common evolutionary origins of mechanosensitive ion channels in Archaea, Bacteria and cell-walled Eucarya // Archaea V 1, pp 35-44

80. Kobayashi T, Nishizaki R, Ikezawa H (1997) I he presence of GPl-linked protcin(s) in an archaeobacterium, Sulfolobus acidocaldanus, closcly related to eukaryotes // Biochim Bwphys Ada V 1334, no l,pp 1-4.

81. KonigH (1988) Archaeobactenal cell envelopes CAN IIJ Microbiol V 34, pp 395-406

82. Kono 1 (1968) Purification and partial characterization of collagenolytic en/ymes from Clostridium histolyticum // Biochemistr V 7, no 3, pp 1106-1114

83. Kopecka M (1986) Assembly of microfibrills in vivo and in vitro fron (l-3)-|3-D-glucan from yeast cell walls //Arch Microbiol Vol 143, pp 387-395

84. Kopecka M , Phaff H J, Tleet G II (1974) Demonstration of a fibrillar component in the cell wall in the yeast Saccharomyces cerevisiae and its chemical nature // J Cell Biol V 62, pp 66-76

85. Kornacker MG, Pugsley AP (1990) Molecular characterization of pulA and its product, pullulanase, a secreted enzyme of Klebsiella pneumoniae IJNF5023 // Mol Microbiol V 4, no 1, pp 73-85

86. Koval S T (1988) Paracrystalline protein surface arrays on bacteria II Can J Microbiol V 34, pp 407-414

87. I aemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 II Nature Vol 227, pp 680-685.

88. I ehle I , Bause L (1984) Enzymatic N-glycosylation and ()-glycosylation of synthetic peptide acceptors by dohchol-linked sugar derivatives in yeast II Biochim Biophys Acta Vol 799, pp 246-251

89. Lipke P, Ovalle R (1998) Cell wall architecture in yeast new structure and new challenges IIJ Dacleriol Vol 180, pp 3735-3740

90. Lubbcn M (1995) Cytochromes of archaeal electron transfer chains (Review) //Biochim et Biophys Ada Vol 1229, pp 1-22

91. Lussier M, Gentzsch M, Sdicu A-M , Bussey H, Tanner W (1995) Protein O-glycosylation in yeast The PM12 gene specifies a second protein O-mannosyltransferase that functions in addition to the PM11-encoded activity IIJ Biol Chem Vol 270, pp 2770 -2775

92. Manners D J , Masson A J, Patterson J C (1974) The heterogeneity of glucan preparation from the walls of various yeasts IIJ Gen Microbiol Vol 80, pp 411-417

93. Manners D J , Masson A J , Patterson J C (1973) I he structure of a beta-(l lead to 3)-D-glucan from yeast cell wall // Biochem J Vol 135, pp 19-30.

94. Matsushita O , Jung C -M , Minami J , Katayama S , Nishi N , Okabe A (1998) A study of the collagen-binding domain of a 116-kDa Clostridium histolyticum collagenase IIJ Biol Chem V 273, pp 3643-3648

95. Matsushita O , Jung C -M, Katayama S , Minanu J , Iakahashi Y , Okabe A (1999) Gene Duplication and Multiplicity of Collagenases in Clostridium histolyticum // J Bacteriol V 181, no 3, pp 923-933

96. Matsushita O , Koide T, Kobayashi R, Nagata K , Okabe A Substrate (2001) Recognition by the Collagen-binding Domain of Clostridium histolyticum Class I Collagenase IIJ Biol Chem V 27, pp 8761-8770

97. H6MescherM F, Strominger JI (1976 A) Structural (shape-maintaining) role of the cell surface glycoprotein of Halobacterium salinarium //Proc Natl AcadSci USA V 73, no 8, pp 2687-2691

98. Mescher M F , Strominger J L , Watson S.W (1974) Protein and carbohydrate composition of the cell envelope of Halobacterium salinarium II J Bacteriology V 120, no 2, pp 945954

99. Molano J , Bowers B , Cabib L (1980) Distribution of chitin in the yeast cell wall A structural and biochemical study //J Cell Dial Vol 85, pp 199-212

100. Montijn R C , Vink F , Muller W II, Verkleij A J , Va Den Lnde H , Henrissat B , Klis F M. (1999) Localization of synthesis of |}l,6-glucan in Saccharomyces cerevisiae IIJ Bacteriol V 181, pp 7414-7420

101. Mookhtiar K A , Van Wart H L (1992) Clostridium histolyticum collagenases a new look at some old en/ymes // /Matrix Suppl V 1, pp 116-26

102. Mouassite M , Camougrand N , Schwob E , Demaison G , Laclau M , Guenn M (2000) I he 'SUN' family yeast SUN4/SCW3 is involved in cell septation // Yeast Vol 16, pp 905919

103. Mrsa V , Seidl T, Gent/sch M , Tanner W (1997) Specific labelling of cell wall proteins by biotynilation Identification of four covalently linked O-mannosylated proteins of Saccharomyces cerevisiae II Yeast Vol 13, pp 1145-1154

104. Mrsa V , Tanner W (1999) Role of NaOH-extractable cell wall proteins Ccw5p, Ccw6p, Ccw7p and Ccw8p (members of the Pir protein family) in stability of the Saccharomyces cerevisiae cell wall II Yeast Vol 15, pp 13-820

105. Nakayama K , Teng Y , Tamaka A , Jigann Y (1998) 1 he involvement of mnn4 and mnn6 mutations in mannosyl phosphorylation of O-linked oligosaccharide in yeast Saccharomyces setevisiae. II Biochim Biophys Acta Vol 1425 255-262

106. Nurminskaya M V , Kalebina T S , Nurminsky D I, Kulaev I S (1993) Analysis of Candida utilis genomic DNA, homologous to cDNA of chicken Al(l) collagen gene// Arch Microbiol Vol 160, pp 329-331

107. Olden K , Bernard B A , Humphries M J , Yeo T-K , White S I , Bauer H C (1985) Function of glycoprotein glycan III IBS V 10, pp 78-82

108. Osumi M (1998) The ultrastructure of yeast cell wall structure and formation // Micron Vol 29, pp 207-233

109. Pakkanen 0, Ilamalainen F-R, Kivinkko K I, Myllyharju J (2003) Assembly of stable human type I and III collagen molecules from hydroxylated recombinant chains in the yeast Pichia pas torn IIJ Biol Chem ,V 278, no 34, pp 32478-32483

110. Paul G , Lottspeich F, Wieland F (1986) Asparaginyl-N-acetylgalactosamine // J Biol Chemistry V 261, no 3,pp 1020-1024

111. Paul G, Wieland F (1987) Sequence of the Halobacterial glycosaminoglycan II J of Biological Chemistry V 262, no 20, pp 9587-9593

112. Pohlschroder M, Pnnz W, Hartmann H ,Beckwith J (1997) Protein translocation in the three domains of life variation on a theme //Cell V91,pp 563-566

113. Pohonlle A, Schweighofer K, Wilson M A. (2005) lhe origin and early evolution of membrane channels //Astrobiology V 5, no 1, pp 1-17

114. Popolo L and Vai M (1999) The Gasl glycoprotein, a putative wall polymer cross-linker // Biophys Biochem Acta Vol 1426, pp 385-400

115. Reynolds F S (1963) The use of lead citrate of high pH as an electronopaque stain inelectron microscopy//J Cell Biol V 17, pp 208-212.

116. Rocmer T, Bussey H (1991) Yeast p-glucan synthesis KRF6 encodes a predicted type II membrane protein required for glucan synthesis in vivo and for glucan synthase activity in vitro // Proc Natl Acad Sci USA Vol 88, 11295-11299

117. Sara M , Sleytr U B (2000) S-layer proteins IIJ Bacteriol V 182, no 4, pp 859-868

118. Schaffer C, Messner P (2001) Glycobiology of surface layer proteins Biochimic, v 83, №7,pp 591-599

119. Schaffer C , Messner P (2004) Surface-layer glycoproteins an example for the diversity of bacterial glycosilation with promising impacts on nanobiotechnology (Review) // Glycobiology V 14, no 8, pp 31R-42R

120. Schreiner R, Schabel L, Wieland F (1994) Novel N-glycosylation in eukanotes laminin contains the lineage unit P-glucosylasparagine IIJ of Cell Biology VI24, no 6, pp 10711081

121. San Segundo P, Correa J, de Aldana CR, del Rey F (1993) SSG1, a gene encoding a sporulation-specific 1,3-beta-glucanase in Saccharomyces cerevisiae //J Bacteriol Vol 175, no 12, pp 3823-37

122. Severina L 0 , Pimcnov N V , Plakunov V K (1991) Glucose transport into the extremely halophilic archaebactena II Arch Microbioligy V 115, pp 131-136

123. Schreuder MP (1994) In largeting of proteins to the ccll wall oi yeast and possible applications 109

124. Sentandreu R, Northcote DH (1968) Ihe structure of a glycopeptide isolated from the yeast cell wall//./ Biochem Vol 109,419-432

125. Sharon N (1984) Glycoproteins II TIBS V 9, pp 198-202

126. Shaw J A, Mol PC, Bowers B, Silverman SJ, Valdivieso MH, Duran A, Cabib E (1991) The function oi chitin synthases 2 and 3 in the Saccharomyces cercvisiae cell cycle // J Cell Biol Vol 114, pp 113-123

127. Shimoi H, Kitagaki II, Ohmori H, Iimura Y, Ito K Sedlp is a major cell wall protein of Saccharomyces cerevisiae in the stationary phase and is involved in lytic enzyme resistance J Bacteriol (1998) Vol 180, pp. 3381-3387

128. Sleytr U B , Messner P (1983) Crystalline surfacc layers on bacteria II Ann Rev Microbiol V 37, pp 311-339

129. Sleytr U B , Messner P (1988) Crystalline surface layers in procanotes (Mimreview) // J of Bacteriology V 170, no 6, pp 2891-2897

130. Sleytr U B , Sara M (1986) Ultrafiltratijn membranes with uniform pores from crystalline bacterial cell envelope layers (Mimreview) // Applied Microbiology and Biotechnology V 25, pp 83-90

131. Stoeckcnius W , Rowcn R (1967) A morphological study of Halobacterium halobium and its lysis in media oi low salt concrntration IIJ Cell Biol Vol 34, pp 365-393

132. Stokke B I , Elgsaetr A, Hara C, Kitamura S, Takeo K (1993) Physicochemical properties of 1-6 branched 1-3 P-D-glucans // Biopolymers Vol 33 561-573

133. Strahl-Bolsinger S , Gentzsch M , Tanner W. (1999) Protein O-mannosylation // Biochem Biophys Acta Vol 1426,297-307

134. Tanner W, Lehle 1 (1987) Protein glycosylation in yeast // Biochim Biophys Acta Vol 906 81-99

135. Teparic R , Stuparevic I, Mrsa V (2004) Increased mortality of Saccharomyces cerevisiae cell wall protein mutants //Microbiology Vol 150, pp 3145-3150

136. Timpel C , Strahl-Bolsinger S , Ziegelbauer K, Frnst J F. (1998) Multiple function of Pmtlp-mediated protein O-mannosylation in the iungal pathogen Candida albicans IIJ Biol Chem Vol 273, pp 20837-20846

137. Valdivieso Mil, Ferrario L , Vai M , Duran A , Popolo L. (2000) Chitin synthesis in dgasl mutant of Saccharomyces cerevisiae IIJ Bacteriol, V. 182(17), pp 4752-4757

138. Valentin L , Herrero F , Pastor F 1J, Sentandreu R (1984) Solubilisation and analysis of mannoprotein from the cell wall of Saccharomyces cerevisiae IIJ Gen Microbiol Vol 130, pp 1419-1428

139. Verstrepen KJ, Jansen A, I ewitter F, Fink GR (2005) Intragenic tandem repeats generate functional variability II Nat Genet V 37, pp 986-990

140. West C M (1986) Current ideas on the significance of protein glycosilation // Mol Cell Biochem V 72, pp 3-20

141. Wieland T (1988) Structure and biosynthesis of prokaryotic glycoproteins // Bwchimie V 70, no 11, pp 1493-504

142. Wieland F, Heitzer R, Schaefer W (1983) Asparaginylgllucose. novel type of carbogidrate linkage // Proc Natl Acad USA V 80,pp. 5470-5474

143. Wolters G H , Vos-Scheperkeuter G H , Lin II C , van Schilfgaarde R (1995) Different roles of class 1 and class II Clostridium histolyticum collagenase in rat pancreatic islet isolation // Diabetes V 44, no 2, pp 227-233

144. Wose C R , Kandier ü , Wheelis M (1990) Towards a natural system of organisms proposal for the domains Archaea, Bacteria and bucarya // Proc Natl Acad Sei USA V 87,pp 4576-4579

145. Wösten HAB (2001) Hydrophobins1 Multipurpose Proteins // Annu Rev Microbiol Vol 55, pp 625^16

146. Zubatov A S , Rainina B J , Buchwalov J B , I usifov V M (1979) A cytochemical study of the localisation of acid phosphatase in Saccharomyces cerevisiae at different growth phases //1hstochem J V. 11, no 2, pp 299-3101. Благодарности.

147. В первую очередь мне хотелось бы поблагодарить моих научных руководителей -Игоря Степановича Кулаева и Татьяну Сергеевну Калебину за руководство данной работой, а также советы и помощь в ее написании.

148. Также я хочу поблагодарить Нину Александровну Шанину за консультации при проведении экспериментов с использованием электрофоретических методов

149. Я очень признательна Даниеле Лауринавичюте, Ольге Алексеевой, Святославу Соколову, являющихся сотрудниками нашей лаборатории во время выполнения данной работы, за помощь в экспериментальной работе и поддержку

150. Благодарю также всех сотрудников и преподавателей кафедр молекулярной биологии и микробиологии, которые содействовали мне в выполнение диссертационной работы.