Роль глюкантрансферазы Bgl2p в формировании молекулярной структуры клеточной стенки дрожжей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Лауринавичюте, Даниэла Кестуче

• Лауринавичюте, Даниэла Кестуче
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лауринавичюте, Даниэла Кестуче

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: «Клеточная стенка дрожжей: биосинтез основных компонентов и сборка»

1. Введение

2. Основные этапы биосинтеза глюкана

2.1. Биосинтез Р1,6-глюканов

2.2. Регуляция синтеза Р1,3-глюкана

2.3. Локализация синтеза Р1,3 -глюкана

2.4. Модификации р1,3-глюкана

3. Основные этапы биосинтеза хитина 17 3.1 Биосинтез хитина на протяжении клеточного цикла 17 3.2. Ферменты, участвующие в биосинтезе хитина в дрожжах

4. Белки клеточной стенки дрожжей

4.1. Модификации белков клеточной стенки дрожжей

4.1.1. О-гликозилирование

4.1.2. И-гликозилирование

4.1.3. Присоединение гликозилфосфатидилинозитола

4.2. Разнообразие белков клеточной стенки дрожжей 26 4.2.1. БОБ-экстрагируемые белки

4.2.2 Белки, экстрагируемые глюканазами

4.2.3 Белки, экстрагируемые щелочью 29 4.3 Регуляция биосинтеза белков клеточной стенки дрожжей

4.4. Транспорт маннопротеинов к клеточной стенке дрожжей

4.5. Локализация белков в клеточной стенке дрожжей 33 5 Связь макромолекул в составе клеточной стенки дрожжей

5.1 Ковалентные связи между компонентами в составе клеточной стенки дрожжей

5.2 Ферменты, вовлеченные в формирование ковалентных связей между компонентами в составе КС дрожжей

5.3 Роль белков в формировании и поддержании молекулярной организации клеточной стенки дрожжей

6 Биогенез клеточной стенки во время специфических программ развития

6.1 Спаривание

6.2 Псевдогифальный рост

6.3 Спорулядия 46 7. Биогенез клеточной стенки в стрессовых условиях

7.1. Реакция клетки на стресс

7.2 Детекция стресса и передача сигналов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Используемые в работе реактивы

2. Используемые в работе штаммы микроорганизмов и условия их выращивания

3. Состав сред, используемых для культивирования микроорганизмов

3.1. Среды для выращивания Е. coli

3.2. Среды, используемые для выращивания дрожжей

4. Выделение ДНК

4.1. Выделение плазмидной ДНК

4.2. Выделение дрожжевой ДНК

5. Выделение дрожжевой РНК

6. Электрофоретические методы

6.1. Электрофорез в агарозном геле

6.2. Электрофорез в денатурирующих условиях

7. Трансформация клеток микроорганизмов

7.1. Получение компетентных клеток и трансформация Е. coli

7.2. Трансформация дрожжей

8. Получение штамма дрожжей S. cerevisiae с нарушенными генами

BGL2 и CHS

9. ПЦР-амплификация

10. Экстракция ДНК из агарозного геля после электрофоретического разделения

11. Определение нуклеотидной последовательности фрагмента гена BGL

12. Гибридизация по Саузерну

13. Нозерн-блот гибридизация

14. Выделение клеточных стенок дрожжей

15. Депротеинизация КС дрожжей с помощью трипсина и проназы, а также NaOH

16. Экстракция белков из КС дрожжей

17. Выделение и анализ белков среды роста дрожжей

17.1. Выделение белков из среды роста дрожжей

17.2. Анализ устойчивости белков среды роста к действию трипсина

18. Получение внутриклеточного содержимого клеток дрожжей

19. Получение антител к белку с молекулярной массой 33 кДа

20. Вестерн-блот анализ

21. Определение количества компонентов в изолированных КС дрожжей

21.1. Определение количества белков в изолированных КС дрожжей

21.2. Определение количественного содержания полисахаридов КС

21.3. Определение количественного содержания аминосахаров

22. Определение чувствительности клеток дрожжей к различным агентам

22.1. Определение чувствительности клеток к Calcofluor white и Congo red

22.2. Определение чувствительности клеток дрожжей к Никомицину Z

23. Электронная микроскопия клеток и КС дрожжей

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Определение нуклеотидной последовательности гена, кодирующего белок с молекулярной массой 33 кДа КС дрожжей C.utilis, выявление степени гомологии этого белка белку Bgl2p дрожжей S. cerevisiae

2. Сравнительный анализ устойчивости белка Bgl2p в составе КС S.cerevisiae к действию трипсина и проназы

3. Изучение роли белка Bgl2p в формировании структуры КС дрожжей

3.1 Получение штамма дрожжей S.cerevisiae, лишенного гена BGL

3.2 Изучение роста штамма с нарушенным геном BGL2 (bgl2), а также определение чувствительности к CFW, Congo red и Никкомицину Z

3.3 Сравнительный анализ количества хитина и других компонентов КС дрожжей bgl

3.4 Анализ встраивания хитина в КС дрожжей штамма bgl

3.5 Выявление роли хитинсинтазы 3 (СЬвЗр) в биосинтезе "дополнительного" хитина в штамме Ъ%

4. Изучение встраивания белка

§12р в КС дрожжей Ъ.сегеутие

4.1 Изучение роли ОР1-заякоренных белков во встраивании белка Е^12р в КС дрожжей Б. cerevisiae

4.2 Анализ роли белков в защите Е^12р в КС дрожжей 5. сеге\Ыае к действию трипсина

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль глюкантрансферазы Bgl2p в формировании молекулярной структуры клеточной стенки дрожжей»

Клеточная стенка дрожжей представляет собой полифункциональную, физиологически активную органеллу, которая принимает участие в осуществлении всего комплекса взаимоотношений между микроорганизмом и окружающей средой. Клеточная стенка (КС) участвует в обмене веществ между клеткой и внешней средой. Она выполняет функцию прочного наружного скелета, определяя форму клетки и защищая ее от внешних воздействий, в то же время на молекулярном уровне КС очень динамична, она увеличивается в размерах за счет встраивания новосинтезированных компонентов в процессе роста клетки. Изменения морфологии клетки при флоккуляции, спаривании, псевдогифальном росте также сопровождаются реконструкцией КС. Более того, структура КС может модифицироваться в зависимости от условий роста клеток. Все перестройки КС происходят за пределами цитоплазматической мембраны, и в этих процессах особо важную роль приобретают ферменты, принимающие участие в окончательном формировании молекулярного ансамбля КС. Все это делает клеточную стенку дрожжей весьма интересным объектом для изучения.

Основными полисахаридными компонентами КС дрожжей являются полимеры глюкозы - (31,3- и (31,6-глюкан - их количество составляет до 60% массы КС, примерно 2% приходится на хитин. Около 40% массы КС составляют маннопротеины, при этом лишь для единичных белков, входящих в эту группу соединений, выявлена роль в функционировании клеточных стенок дрожжей и определена локализация в данной органелле. По способу закрепления белки КС дрожжей делятся на нековалентно связанные (SEP) с глюкановым каркасом КС дрожжей и ковалентно связанные (CWP). SEP белки могут быть экстрагированы из КС дрожжей в буфере, содержащем SDS, ЭДТА и тиоловые реагенты при нагревании. К CWP белкам КС относятся щелоче-экстрагируемые (PIR белки), характеризующиеся наличием внутренних повторов и глюканазо-экстрагируемые белки (GPI-белки), содержащие на С-конце полипептиднсй цепи сигнал для присоединения гликозилфосфоинозитольного (GPI) «якоря» (Mrsa et al1997).

Ранее в нашей лаборатории был разработан подход к изучению структуры КС дрожжей с использованием протеиназ с различной субстратной специфичностью (Калебина и др., 1994). Было установлено, что протеолиз КС дрожжей Candida utilis с использованием трипсина практически полностью удаляет белки, связанные нековалентно, оставляя единственный белок с молекулярной массой 33 кДа. Изменение времени инкубации КС с трипсином, а также увеличение концентрации фермента не приводило к гидролизу этого белка и удалению его из состава КС. Этот белок, помимо своей повышенной устойчивости к действию трипсина, был интересен также тем, что присутствовал в КС дрожжей С.utilis на всех стадиях роста культуры и его количество составляло до 20% общего количества SDS-экстрагируемых белков КС дрожжей (Чжан С., 1994).

Сравнительный анализ выявил сходство N-концевой последовательности белка с молекулярной массой 33 кДа КС дрожжей C.utilis и последовательности глюкантрансферазы Bgl2p КС дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Калебина и др., 1994); было сделано предположение о гомологии этих белков. Необходимо отметить, что к моменту начала данной работы о белках КС дрожжей, их встраивании, а также роли в формировании этой органеллы было известно крайне мало. Существовали лишь отрывочные данные, позволяющие предполагать, что белки могут играть структурную роль, а также, возможно, принимать участие в формировании молекулярного ансамбля КС дрожжей. В связи со сказанным, представлялось актуальным исследовать столь уникальный белок, его встраивание в КС дрожжей, а также роль в формировании молекулярной структуры этой органеллы.

В связи со сказанным, целью настоящей работы являлось сравнительное исследование свойств белка с молекулярной массой 33 кДа из КС дрожжей C.utilis и глюкантрансферазы Bgl2p из КС дрожжей S.cerevisiae, и выяснение роли Bgl2p в формировании клеточных стенок дрожжей S.cerevisiae. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

• Определение нуклеотидной последовательности гена, кодирующего белок с молекулярной массой 33 кДа КС дрожжей C.utilis, выявление степени гомологии этого белка белку Bgl2p дрожжей S.cerevisiae.

• Изучение роли белка Bgl2p в формировании молекулярной структуры клеточной стенки дрожжей S. cerevisiae, в частности, изучение участия Bgl2p во встраивании полисахарид-белковых комплексов в клеточную стенку дрожжей.

• Изучение встраивания 1^12р в КС дрожжей в первую очередь изучение возможной роли ОР1-белков в этом процессе.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. КЛЕТОЧНАЯ СТЕНКА ДРОЖЖЕЙ: БИОСИНТЕЗ ОСНОВНЫХ КОМПОНЕНТОВ И СБОРКА.

1 .ВВЕДЕНИЕ

Клетки дрожжей целиком покрыты клеточной стенкой (КС), жесткой, но динамичной жизненно необходимой структурой. От цитоплазматической мембраны клеточная стенка отделена периплазматическим пространством. Основными компонентами КС дрожжей являются полимеры глюкозы - ß-глюканы (до 60% веса КС), до 2% приходится на хитин и около 40% - на маннопротеины.

Глюкан является важным структурным компонентом клеточной стенки, ответственным за поддержание ее прочности. В КС дрожжей присутствует два вида глюкана - ßl,3- и р1,6-глюкан (Manners et al, 1974; Duffus et al., 1982). Глюкан локализован как в латеральной клеточной стенке, так и в зоне почкования.

Хитин - минорный, но чрезвычайно важный компонент клеточной стенки дрожжей - представляет собой полимер с ß 1,4-связанными остатками N-ацетилглюкозамина. Примерно 90% этого соединения находится в области образования и отделения дочерних клеток - почек (Cabib et al., 1983). В этой зоне хитин участвует в построении первичной перегородки - септы между материнской и дочерней клетками и образует жесткое кольцо, защищающее канал между ними. В латеральной клеточной стенке локализовано примерно 10% хитина, который в основном связан ковалентно с глюканами, этот комплекс и формирует «каркас» клеточной стенки в целом (Fleet & Manners, 1976).

Маннопротеины формируют поверхностный слой КС, который, по-видимому, участвует в защите клетки от агрессивного действия ферментов извне (Pastor et al., 1984; Valentín et al., 1984). Некоторые белки КС распределены по всей толще этой огранеллы, и могут играть важную роль в функционировании клеточной стенки.

Приведенные выше сведения о составе КС дрожжей известны достаточно давно. В последнее время наметился существенный прогресс в развитии представлений о строении и функциях клеточной стенки дрожжей. Показано, что она представляет собой динамичную, полифункциональную и физиологически активную органеллу, которая принимает участие в осуществлении всего комплекса взаимоотношений между микроорганизмом и окружающей средой (Вагабов, 1988). Клеточная стенка выполняет функцию наружного скелета, определяя форму клетки. В КС располагаются рецепторы, и она играет важную роль в иммунологических реакциях и, кроме того, участвует в обмене веществ между клеткой и внешней средой. На молекулярном уровне КС очень динамична, она увеличивается в размерах за счет встраивания новосинтезированных компонентов в процессе роста клетки. Изменения морфологии клетки при флоккуляции, спаривании, псевдогифальном росте также сопровождаются реконструкцией КС. Более того, структура КС может модифицироваться в зависимости от условий роста клеток (Кар1еуп е( а!., 2001).

Считается, что КС дрожжей имеет слоистую структуру, в которой [31,3-глюкан и хитин ответственны за прочность этой органеллы и формируют внутренний, менее электронноплотный слой, наблюдаемый при электронной микроскопии. Наружный, более электронноплотный слой, сфомирован маннопротеинами. В настоящее время для различных видов дрожжей опубликовано несколько вариантов схемы строения КС (8с11геис1ег, 1994; СЪаШп е( а1, 1998; Глрке & Оуа11е, 1998; Бт^ ег а!., 1999). Несмотря на некоторые отличия, в целом схемы не противоречат, а дополняют друг друга, позволяя более полно представить как общий план строения клеточной стенки, так и детали взаимодействия отдельных участников ансамбля. Наиболее изучена молекулярная организация КС дрожжей 51. сегеушае, ее структура представлена на рис. 1.

Необходимо отметить, что основной прорыв в изучении КС дрожжей произошел в последние годы благодаря открытию белков, ковалентно связанных с глюкановым каркасом КС. Исследователи стали отводить значительную роль белкам в формировании и функционировании КС. Также постоянно дополняются представления о структуре самой КС. Происходит активное накопление экспериментальных фактов, однако большая часть вопросов, касающихся структуры, функций, а также локализации белков клеточной стенки дрожжей и сейчас далека от полной ясности.

N-связанная цепь маннопротеина

О-связанная цепь маннопротеина белки периплазматического цитоплазматическая мембрана

Р1,6-глюкан

Р1,3-глюкан маннопротеины пространства хитин

Рисунок 1. Схема строения клеточной стенки дрожжей S.cerevisiae (Schekman & Novick, 1982; Schreuder, 1994).

В данном обзоре литературы сделана попытка обобщения накопленных за последнее время данных о формировании КС дрожжей и роли белков в этом процессе.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Лауринавичюте, Даниэла Кестуче

выводы

1. Показано, что глюкантрансфераза Bgl2p может быть вовлечена во встраивание в клеточные стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae сложных молекулярных комплексов, в состав которых входят белки (возможно, GPI-заякоренные) и хитин, синтезируемый хитинсинтазой 3.

2. Обнаружено увеличение количества хитина в клеточных стенках дрожжей Saccharomyces cerevisiae с нарушенным геном BGL2\ в совокупности с данными литературы это указывает на участие хитина в компенсации нарушений, возникающих в клеточной стенке при отсутствии глюкантрансферазы Bgl2p.

3. Изучено встраивание белка Bgl2p в клеточную стенку дрожжей Saccharomyces cerevisiae штамма ssu21, с нарушенным биосинтезом гликозилфосфоинозитольного "якоря" GPI-белков. Показано, что правильное формирование GPI-белков необходимо для встраивания глюкантрансферазы Bgl2p в клеточную стенку дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Продемонстрировано, что встроенный в клеточную стенку дрожжей Bgl2p в значительной степени защищен от гидролиза трипсином другими, возможно, белковыми компонентами клеточной стенки.

4. В клеточных стенках дрожжей Candida utilis охарактеризован белок с молекулярной массой 33 кДа. Определена нуклеотидная последовательность фрагмента гена, кодирующего белок с молекулярной массой 33 кДа (Bgl2pc). Продемонстрирована гомология белка Bgl2pc глюкантрансферазе Bgl2p КС дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Лауринавичюте, Даниэла Кестуче, 2002 год

1. Алексеева О.В. Изучение структурной роли белков клеточной стенки дрожжей // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 1999 Москва, МГУ.

2. Вагабов В.М. Биосинтез углеводных компонентов клеточной стенки дрожжей // 1988. Пущино ОНТИ НЦБИ АН СССР. 198 С.

3. Калебина Т.С., Нурминская М.В., Чжан С., Чертов О.Ю., Руденская Г.Н., Степанов В.М., Кулаев И.С. Протеиназы с различной субстратной специфичностью в структурных изучениях клеточной стенки дрожжей // Биоорг. Химия. 1994, т.20, 627-634.

4. Калебина Т.С., Кулаев И.С. Роль белков в формировании молекулярной структуры клеточной стенки дрожжей // Успехи биол. Химии. 2001, т.41, 105-130.

5. Чжан С. Роль белков в молекулярной организации клеточной стенки дрожжей Candida utilis. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук // 1994. Москва, МГУ.

6. Andrews P.D., Stark M.J.R. Dynamic, Rholp-dependent localization of Pkclp to sites of polarized growth // J. Cell Sci. 2000, vol. 113, 2685-2693.

7. Ballou C.E. Some aspects of the structure, immunochemistry, and genetic control of yeast mannans // Adv.Enzymol. 1974, vol.40, 233-270.

8. Ballou C.E. Isolation, characterization, and properties of Saccharomyces cerevisiae mnn mutants with nonconditional protein glycosylation defects // Meth. Enzymol. 1990, vol.185,440-470.

9. Bickle M., Delley P.A., Schmidt A., Hall M.N. Cell wall integrity modulates RHOl activity via the exchange factor ROM2 II EMBO J. 1998, vol.17, 22352245.

10. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucleic Acids Res. 1979, vol.7, 1513-1515.

11. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976, vol.72, 248-254.

12. Boone C., Sommer S.S., Hensel A., Bussey H. Yeast KRE genes provide evidence for a pathway of cell wall |3-glucan assembly I I J. Cell. Biol. 1990, vol. 110, 1833-1843.

13. Brown J.L., Kossaczka Z., Jiang B., Bussey H. A mutational analysis of killer toxin resistance in Saccharomyces cerevisiae identifies new genes involved in cell wall (l,6)-beta-glucan synthesis//Genetics. 1993, vol. 133, 837-847.

14. Brown J.L., Bussey H. The yeast KRE9 gene encodes O-glycoprotein involved in cell surface |3-glucan assembly // Mol. Cell. Biol. 1993, vol. 13, 63466356.

15. Cabib E., Bowers B., Roberts R.L. Vectorial synthesis of a polysaccharide by isolated plasma membranes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983, vol. 80, 33183321.

16. Cabib E., Sburlati A., Bowers B., Silverman S.J. Chitin synthase 1, an auxiliary enzyme for chitin synthesis in Saccharomyces cerevisiae // J. Cell. Biol. 1989, vol.108, 1665-1672.

17. Cabib E., Silverman S.J., Shaw J.A. Chitinase and chitin synthase 1: counterbalancing activities in cell separation of Saccharomyces cerevisiae II J. Gen. Microbiol. 1992, vol.138, 97-102.

18. Cabib E., Drgonova J., Drgon T. Role of small G proteins in yeast cell polarization and wall biosynthesis // Annu. Rev. Biochem. 1998, vol.67, 307-333.

19. Cabib E., Roh D.H., Schmidt M., Crotti L.B., Varma A. The yeast cell wall and septum as paradigms of cell growth and morphogenesis // J. Biol. Chem. 2001, vol.276, 19679-19682.

20. Cappellaro C., Mrsa V., Tanner W. New potential cell wall glucanases of Saccharomyces cerevisiae II J. Bacterid. 1998, vol. 180, 5030-5037.

21. Caro L.H.P., Smits G.J., Van Egmond P., Chapman J.W., Klis F.M. Transcription of multiple cell wall protein-encoding genes in Saccharomyces cerevisiae is differently regulated during the cell cycle // FEMS Microbiol. Lett. 1998, vol.161, 345-349.

22. Chaffin W.J., Stocco D. Cell wall proteins of Candida albicans II Can.J.Microbiol. 1983, vol. 29, 1438-1444.

23. Chaffin W.J., Lopez-Ribot J.L., Casanova M., Gozalbo D., Martinez J.P. Cell wall and secreted proteins of Candida albicans: identification, function and expresion // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998, vol.62,130-180.

24. Choi W.J., Santos B., Duran A., Cabib E. Are yeast chitin synthases regulated at the transcriptional or the posttranscriptional level? // Mol. Cell Biol. 1994, vol.14, 7685-7694.

25. Christodoulidou A., Briza P., Ellinger A, Bouriotis V. Yeast ascospore wall assembly requires two chitin deacetylas isosymes // FEBS Lett. 1999, vol. 460, 275-279.

26. Chu S., DeRisi J., Eisen M., Mulholland J., Botstein D., Brown P.O., Herskowitz I. The transcriptional program of sporulation in budding yeast // Science. 1998, vol.282, 699-705.

27. Chuang J.S., Schekman R.W. Differential traffiking and timed localization of two chitin synthase proteins, Chs2p and Chs3p // J. Cell Biol. 1996, vol.135, 597610.

28. Conzelmann A., Riezman H., Desponds C., Bron C. A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid // EMBO J. 1988, vol.7, 22332240.

29. Conzelmann A., Puoti R.L., Lester L., Desponds C. Two different types of lipid moieties are present in glycerol phosphatidylinositol-anchored membrane proteins of Saccharomyces cerevisiae II EMBO J. 1992, vol.11, 457-466.

30. Delley P.A., Hall M.N. Cell wall stress depolarizes cell growth via hyperactivation of RHOl II J. Cell. Biol. 1999, vol.147,163-174.

31. De Marini D.J., Adams A.E., Fares H., De Virgilio C., Valle G., Chuang J.S., Pringle J.R. A septin-based hierarchy of proteins required for localized deposition of chitin in the Saccharomyces cerevisiae II J. Cell. Biol. 1997, vol. 139, 75-93.

32. De Nobel J.G., Lipke P.N. Is there a role for GPI-s in the yeast cell wall assembly? // Trends Cell. Biol. 1994, vol.4,41-45.

33. Dijkgraaf G.J., Brown J.L., Bussey H. The KNH1 gene of Saccharomyces cerevisiae is a functional homolog of KRE9II Yeast. 1996, vol.15, 683-692.

34. Dohrmann P.R., Butler G., Tamai K., Dorland S., Greene J.R., Thiele D.J., Stillman D.J. Parallel pathways of gene regulation: homolous regulators SWI5 and ACE2 differentially control transcription of HO and chitinase // Genes Dev. 1992, vol.6, 93-99.

35. Drgonova J., Drgon T., Roh D.H., Cabib E. The GTP-binding protein Rholp is required for cell cycle progression and polarization of the yeast cell // J. Cell. Biol. 1999, vol.146,373-387.

36. Duffus J.H., Levi C., Manners D.J. Yeast cell-wall glucans // Adv. Microbial. Physiol. 1982, vol.23,151-181.

37. Erdman S., Lin L., Makzynski M., Snyder M. Pheromone-regulated genes required for yeast mating differentiation // J. Cell Biol. 1998, vol. 140,461-483.and identification of a putative upstream regulator // EMBO J. 1997, vol.16, 49244937.

38. Gustin M.C., Albertyn J., Alexander M., Davenport K. MAP kinase pathways in the yeast Saccharomyces cerevisiae II Microboil. Mol. Biol. Rev. 1998, vol. 62, 1264-1300.

39. Harsay E., Bretscher A. Parallel secretory pathways to the cell surface in yeast //J. Cell Biol. 1995,vol.131,297-310.

40. Hartland R.P., Emerson G.W., Sullivan P.A. A secreted P-glucan-branching enzyme from Candida albicans II Proc. R. Soc. London Ser. B Biol. Sci. 1991, vol.246, 155-160.

41. Henrissat B., Callebaut I., Fabrega S., Lehn P., Mornon J.P., Davies G. Conserved catalytic machinery and production of a common fold for several families of glycosyl hydrolases // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995, vol.92, 70907094.

42. Henrissat B., Bairoch A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases // Biochem J. 1996, vol.315, 695-696.

43. Herscovics A., Orlean P. Glycoprotein biosynthesis in yeast // FASEB J. 1993, vol.7, 540-550.

44. Hien N.H., Fleet G.H. Separation and characterization of six (l-3)-p-glucanases from Saccharomyces cerevisiae II J. Bacteriol. 1983, vol.156, 12041213.

45. Igual J.C., Johnson A.L., Johnston L.H. Coordinated regulation of gene expression by the cell cycle transcription factor Swi4 and the protein kinase C MAP kinase pathway for yeast cell integrity // EMBO J. 1996, vol.15, 5001-5013.

46. Inoue S.B., Takewaki N., Takasuka T., Mio T., Adachi M., Fujii Y., Miyamoto C., Arisawa M., Furuichi Y., Watanabe T. Characterization and gene

47. Ermacova S.A., Mansurova S.E., Lobakova E.S., Selyach I.O., Kalebina T.S., Kulaev I.S. Accumulation of pyrophosphate and other energy rich phosphorus compound under various condition of yeast growth // Arch. Microbiol. 1981, vol.128, 394-397.

48. Epp J.A., Chant J. An IQGAP-related protein controls actin-ring formation and cytokinesis in yeast // Curr. Biol. 1997, vol.7, 921-929.

49. Fleet G.H., Manners D.J. Isolation and composition of an alkali-soluble glucan from the cell walls of Saccharomyces cerevisiae II J. Gen. Microbiol. 1976, vol.94, 180-192.

50. Garcia-Rodrigues L.J., Trilla J.A., Castro C., Valdivieso M.H., Duran A., Roncero C. Characterization of the chitin biosynthesis process as a compensatory F mechanism in the fksl mutant of Saccharomyces cerevisiae II FEBS Lett. 2000, vol. 478, 84-88.

51. Gaynor E.C., Mondesert G., GriMMe S.J., Reed S.I., Orlean P., Emr S.D. MCD4 encodes a conserved endoplasmic reticulum membrane protein essential for glycosylphosphatidylinositol anchor synthesis in yeast // Mol. Biol. Cell 1999, vol.10, 627-648.

52. Gentzsch M., Immervoll T., Tanner W. Protein O-glycosylation in Saccharomyces cerevisiae: the protein O-mannosyltransferases Pmtlp and Pmt2p function as heterodimer//FEBS Lett. 1995, vol.377, 128-130.

53. Gentzsch M., Tanner W. The PMT gene family: protein glycosilation in Saccharomyces cerevisiae in vital // EMBO J. 1996, vol. 15, SI52-5159.

54. Gentzsch M., Tanner W. Protein O-glycosylation in yeast: protein-specific mannosyltransferases // Glycobiology. 1997, vol.7, 481-486.

55. Gietz, R.D, Schiestl, R.H., Willems, A.R., Woods, R.A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure // Yeast. 1995, vol.11,355-360.

56. Goldman R.C., Sullivan P.A., Zakula D., Capoblanco J.O. Kinetics of P-1,3 glucan interaction at the donor and acceptor sites of the fungal glucosyltransferase encoded by the BGL2 gene // 1995. Eur. J. Biochem., vol. 227, 372-378.

57. Inoue S.B., Qadota H., Arisawa M., Watanabe T., Ohya Y. Prenylation of Rholp is required for activation of yeast 1,3-P-glucan synthase // J. Biol. Chem. 1999, vol. 274,38119-38124.

58. Jacoby J.J., Nilius S.M., Heinisch J.J. A screen for upstream components of the yeast protein kinase C signal transduction pathway identifies the product of the SLG1 gene I I Mol. Gen. Genet. 1998, vol.258, 148-155.

59. Jung U.S., Levin D.E. Genome-wide analysis of gene expression regulated by the yeast cell wall integrity signalling pathway // Mol. Microbiol. 1999, vol.34, 1049-1057.

60. Kapteyn J.C., Van Den Ende H., Klis F.M. The contribution of cell wall proteins to the organization of the yeast cell wall // Biophys. Biochem. Acta 1999a, vol.1426, 373-383.

61. Kapteyn J.C., Hoyer L.L., Hecht J.E., Muller W.H., Andel A., Verkleij A.J., Makarow M., Van Den Ende H., Klis F.M. The cell wall architecture of Candida albicans wild-type cells and cell wall-defective mutants // Mol. Microbiol. 2000, vol.35, 601-611.

62. Kapteyn J.C., ter Riet B., Vink E., Blad S., De Nobel H., Van Den Ende H., Klis F.M. Low external pH induces HOG 1-dependent changes in the organization of the Saccharomyces cerevisiae cell wall // Mol. Microbiol. 2001, vol.39, 469479.

63. Ketela T., Green R., Bussey H. Saccharomyces cerevisiae Mid2p is a potential cell wall stress sensor and upstream activator of the PKC1-MPK1 cell integrity pathway // J. Bacteriol. 1999, vol.181, 3330-3340

64. King L., Butler G. Ace2p, a regulator of CTS1 (chitinase) expression, affects pseudohyphal production in Saccharomyces cerevisiae II Curr. Genet. 1998, vol.34, 183-191.

65. Klebl, F., Tanner W. Molecular cloninig of a cell wall exo-beta-l,3-glucanase from Saccharomyces cerevisiae II J. Bacteriol. 1989, vol. 171, 6259-6264.

66. Kollar R., Petrakova E., Ashwell G., Robbins P.W., Cabib E. Architecture of the yeast cell wall. The linkage between chitin and P(l-3)-glucan // J. Biol. Chem. 1995, vol.270, 1170-1178.

67. Kopecka M., Phaff H.J., Fleet G.H. Demonstration of a fibrillar component in the cell wall in the yeast Saccharomyces cerevisiae and its chemical nature // J. Cell. Biol. 1974, vol. 62,66-76.

68. Kovacech B., Nasmyth K., Schuster T. EGT2 gene transcription is indused predominantly by Swi5 in early G1 //Mol. Cell. Biol. 1996, vol.16, 3264-3274.

69. Kuranda M.J., Robbins P.W. Chitinase is reqired for cell separation during growth of Saccharomyces cerevisiae II J. Biol. Chem. 1991, vol.266, 1975819767.

70. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature 1970, vol.227, 680-685.

71. Lew D.J., Reed S.I. Morphogenesis in the teast cell cycle: regulation by Cdc28 and cyclins//J.Cell.Biol. 1993, vol. 120, 1305-1320.

72. Lipke P., Ovalle R. Cell wall architecture in yeast: new structure and new challenges //J. Bacteriol. 1998, vol.180, 3735-3740.

73. Liu H., Brester A. Characterization of TPM1 disrupted yeast cells indicates an involvement of tropomyosin in directed vesicular transport // J. Cell. Biol. 1992, vol. 118, 285-299.

74. Lo H.J., Kohler J.R., DiDomenico B., Loebenberg D., Cacciapouti A., Fink G.R. Nonfllamentous C.albicans mutants are avirulent // Cell. 1997, vol. 90, 939949.

75. Lo W.S., Dranginis A.M. The cell surface flocculin Flo 11 is reqired for pseudohyphae formation and invasion by Saccharomyces cerevisiae // Mol. Biol. Cell. 1998, vol.9, 161-171.

76. Longtine M.S., Fares H., Pringle J.R. Role of the yeast Gin4p protein kinase in septin assembly and the relationship between septin assembly and septin function // J. Cell. Biol. 1998, vol. 143, 719-736.

77. Lupashin V.V., Kononova S.V., Ratner E.N., Tsiomenko A.B., Kulaev I.S. Identification of a novel secreted glycoprotein of the yeast Saccharomyces cerevisiae stimulated by heat shock // Yeast. 1992, vol.8, 157-169.

78. Mandel M., Higa A. Calcium dependent bacteriophage DNA infection // J. Mol. Biol. 1970, vol.53, 154-159.

79. Manners D. J., Masson A. J., Patterson J. C. The heterogeneity of glucan preparation from the walls of various yeasts // J. Gen. Microbiol. 1974, vol. 80, 411-417.

80. Mazur P., Morin N., Baginsky W., el-Sherbeini M., Clemas J.A., Nielsen J.B., Foor F. Differential expression and function of two homologous subunits of yeast 1,3-p-D-glucan synthase // Mol. Cell. Biol. 1995., vol. 15, 5671-5681.

81. McConville M.J., Ferguson M.A.J. The structure, biosynthesis and function of glycosylated phosphatidylinositols in the parasitic protozoa and higher eucaryotes // Biochem. J. 1993, vol.294, 305-324.

82. Meaden P., Hill K., Wagner J., Slipetz D., Sommer S.S., Bussey H. The yeast KRE5 encodes a probable endoplasmic reticulum protein required for (1-6)- 0-D-glucan synthesis and normal cell growth // Mol. Cell. Biol. 1990., vol.10, 30133019.

83. Montijn R.C., Vink E., Muller W.H., Verkleij A.J., Va Den Ende H., Henrissat B., Klis F.M. Localization of synthesis of pi,6-glucan in Saccharomyces cerevisiae // J. Bacteriol. 1999, vol.181, 7414-7420.

84. Mrsa V., Klebl F., Tanner W. Purification and characterization of the Saccharomyces cerevisiae BGL2 gene product, a cell wall endo-beta-1,3-glucanase // J. Bacteriol. 1993, vol.175,2102-2106.

85. Mrsa V., Seidl T., Gentzsch M., Tanner W. Specific labelling of cell wall proteins by biotynlation. Identification of four covalently linked O-mannosylated proteins of Saccharomyces cerevisiae II Yeast. 1997, vol.13, 1145-1154.

86. Mrsa V., Tanner W. Role of NaOH-extractable cell wall proteins Ccw5p, Ccw6p, Ccw7p and Ccw8p (members of the Pir protein family) in stability of the Saccharomyces cerevisiae cell wall // Yeast. 1999, vol.15, 813-820.

87. Mrsa V., Kokanj D., Ecker M., Tanner W. Localization of the PIR protein family in the S. cerevisiae cell wall II Abstracts of "XX- international symposium on yeasts" 2000, 171-172.

88. Mrsa V., Kokanj D., Ecker M., Tanner W. Localization of NaOH-extractable proteins (PIR protein family) in the Saccharomyces cerevisiae cell wall // Abstracts of conference "Molecular Mechanisms of fungal cell wall biogenesis" 2001, 24.

89. Muniz M., MorsoMMe P., Riezman H. Protein sorting upon exit from the endoplasmic reticulum // Cell. 2001, vol.104, 313-320.

90. Nakajima T., Ballou C.E. Structure of the linkage region between the polysaccharide and protein parts of Saccharomyces cerevisiae mannan // J. Biol. Chem. 1974, vol.249, 7685-7694.

91. Novick P., Schekman R. Export of major cell surface proteins is blocked in yeast secretory mutants // J. Cell Biol. 1983, vol.96, 541-547.

92. Novick P., Botstein D. Phenotypic analysis of temperature-sensitive yeast actin mutants // Cell. 1985, vol. 40, 405-416.

93. Novick P., Ferro S., Schekman R. Order of events in the yeast secretory pathway // Cell. 1981, vol.42,461-469.

94. Ono T., Suzuki T., Anaraku Y., Iida H. The MID2 gene encodes a putative integral membrane protein with a Ca -binding domain and shows mating pheromone-stimulated expression in Saccharomyces cerevisiae II Gene. 1994, vol.151, 203-208.

95. Orlean P. Two chitin synthases in Saccharomyces cerevisiae II J. Biol. Chem. 1987, vol.262, 5732-5740.

96. Orlean P. Biogenesis of yeast wall and surface components // 1997. In: The molecular biology of the yeast Saccharomyces, vol.3, 229-362. Edited by J.R.

97. Pringle, J.R. Broach, E.W.Jones. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory.

98. Packeiser A.N., Urakov V.N., Polyakova Y.A., Shimanova N.I., Shcherbukhin V.D., Ter-Avanesyan M.D. A novel vacuolar protein encoded by SSU21/MCD4 is involved in cell wall integrity in yeast // Yeast 1999, vol.15, 1485-1501.

99. Pastor F.I.J., Valentin E., Herrero E., Sentandreu R. Structure of Saccharomyces cerevisiae cell wall. Mannoproteins released by zymolyase and their contribution to wall architecture // Biochim. Biophys. Acta. 1984, vol.802, 292-300.

100. Philip B., Levin D.E. Wscl and Mid2 are cell surface sensors for cell wall integrity signaling that act through Rom2, a guanine nucleotide exchange factor for Rhol // Mol. Cell. Biol. 2001, vol.21, 271-280.

101. Popolo L., Gilardelli D., Bonfante P., Vai M. Increase in chitin as an essential response to defects in assembly of cell wall polymers in the ggplA mutant of Saccharomyces cerevisiae II J. Bacteriol. 1997, vol.179, 463-469.

102. Popolo L.,Vai M. The Gasi glycoprotein, a putative wall polymer cross-linker // Biophys. Biochem. Acta. 1999, vol.1426, 385-400.

103. Rajavel M., Philip B., Buehrer B.M., Errede B., Levin D.E. Mid2p is a putative sensor for cell integrity signalling in Saccharomyces cerevisiae // Mol. Cell. Biol. 1999, vol.19, 3969-3976.

104. Ram A.F.J., Walters A., Ten Hoopen R., Klis F.M. A new approach for isolating cell wall mutants in Saccharomyces cerevisiae y screening for hypersensitivity to calcofluor white // Yeast. 1994, vol.10,1019-1030.

105. Ram A.F.J., Van Den Ende H., Klis F.M. Green fluorescent protein-cell wall fudion proteins are covalently incorporated into the cell wall of Saccharomyces cerevisiae IIFEMS Microbiol. Lett. 1998a, vol. 162, 249-255.

106. Reynolds E.S. The use of lead citrate of high pH as an electronopaque stain inelectron microscopy // J.Cell. Biol. 1963, vol.17,208-212.

107. Rodriguez-Pena J.M., Cid V.J., Arroyo J., Nombela C. A novel family of cell wall-related proteins regulated differently during the yeast life cycle // Mol. Cell. Biol. 2000, vol. 20, 3245-3255.

108. Roemer T., Bussey H. Yeast 0-glucan synthesis: KRE6 encodes a predicted type II membrane protein required for glucan synthesis in vivo and for glucan synthase activity in vitro // Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 1991, vol.88, 1129511299.

109. Roemer T., Delaney S., Bussey H. SKNJ and KRE6 define a pair of functional homologs encoding putative membrane proteins involved in beta-glucan synthesis // Mol. Cell. Biol. 1993, vol. 13, 4039-4048.

110. Roncero C., Duran A. Effect of calcofluor white and congo red on fungal cell wall morphogenesis: in vivo activation of chitin polymerization // J. Bacteriol. 1985, vol.163,1180-1185.

111. Sarthy A.V., McGonigal T., Coen M., Frost D.J., Meulbroek J.A., Goldman R.C. Phenotype in Candida albicans of a disruption of the BGL2 gene encoding a 1,3-beta-glucosyltransferase // Microbiology 1997, vol.143, 367-376.

112. San Segundo P., Correa J., Vasquez de Aldana C.R., del Rey F. SSG1, a gene encoding a sporulation-speciflc 1,3-(3-glucanase in Saccharomyces cerevisiae II J. Bacteriol. 1993, vol.175, 3823-3837.

113. Santos B., Snyder M. Targeting of chitin synthase 3 to polarized growth sites in yeast requires Chs5p and Myo2p // J. Cell Biol. 1997, vol. 136, 95-110.

114. Santos B., Duran A., Valdivieso M.H. CHS5, a gene involved in chitin synthesis and mating in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Cell. Biol. 1997, vol. 17, 2485-2496.

115. Schekman R., Orci L. Coat proteins and vesicle budding // Science. 1996, vol.271,1526-1533.

116. Schreuder M.P. Targeting of proteins to the cell wall of yeast and possible applications // PhD thesis 1994 (Leiden University, Leuden, the Netherlands).

117. Sentandreu R., Northcote D.H. The structure of a glycopeptide isolated from the yeast cell wall // J. Biochem. 1968, vol.109, 419-432.

118. Sestak S., Farkas V. In situ assays of fungal enzymes in cells permeabilized by osmotic shock. Anal. Biochem. 2001, vol.292, 34-39.

119. Shaw J.A., Mol P.C., Bowers B., Silverman S.J., Valdivieso M.H., Duran A., Cabib E. The function of chitin synthases 2 and 3 in the Saccharomyces cerevisiae cell cycle // J. Cell Biol. 1991, vol.114,113-123.

120. Shepherd M.G. Cell envelope of Candida albicans II CRC Crit. Rev. Microbiol. 1987, vol.15,7-25.

121. Sherman F., Fink G.R. and Hicks J.B. Methods in Yeast Genetics // 1986, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

122. Shimoi H., Iimura Y., Obata T. Molecular cloning of CWP1: a gene encoding a Saccharomyces cerevisiae cell wall protein solubilized with Rarobacter faecitabus protease I // J. Biochem. 1995, vol. 118, 302-311.

123. Shimoi T., Kitagaki H., Ohmori H., Iimura Y., Ito K. Sedlp is a major cell wall protein of Saccharomyces cerevisiae in the stationary phase and is involved in lytic enzyme resistance // J. Bacterid. 1998, vol.180, 3381-3387.

124. Siestma J.H., Wessels J.G. Solubility of (1 leads to 3)-beta-D/(l leads to 6)-beta-D-glucan in fungal walls: importance of presumed linkage between glucan and chitin // J. Gen Microbiol. 1981, vol.125, 209-212.

125. Smits G.J., Kapteyn J.C., Van Den Ende H., Klis F.M. Cell wall dynamics in yeast // Curr. Opin. Microbiol. 1999, vol. 2, 348-352.

126. Smits G.J., Van Den Ende H., Klis F.M. Differential regulation of cell wall biogenesis during growth and development in yeast // Microbiology. 2001, vol.147, 781-794.

127. Staab J.F., Sundstorm P. Genetic organization and sequence analysis of the hypha-specific cell wall protein gene HWP1 of Candida albicans II Yeast. 1998, vol.14, 681-686.

128. Strahl-Bolsinger S., Gentzsch M., Tanner W. Protein O-mannosylation // Biochem. Biophys. Acta. 1999, vol. 1426, 297-307.

129. Surarit R., Gopal P.K., Shepherd M.G. Evidens for a glycosidic linkage between chitin and glucan in the cell wall of Candida albicans II J. Gen. Microbiol. 1988, vol.134,1723-1730.

130. Sutterlin C., Doering T.L., SchiMMoller F., Schroder S., Riezman H. Specific requirements for the ER to Golgy transport of GPI-anchored proteins in yeast // J. Cell Sci. 1997, vol.110, 2703-2714.

131. Tanner W., Lehle L. Protein glycosylation in yeast // Biochim. Biophys. Acta. 1987, vol.906, 81-99.

132. Tracey M.V. Chitin // 1956, In: Peach P. & Tracey M.V. (Ed.) Modern methods of plant analysis, vol II (p 264-274). Springer Verlag, Berlin, Germany.

133. Utsugi T., Suzuki M., Abe M., Ohya Y. New aspects of cell wall remodelling: dynamics and feedback regulation II Abstracts of conference "Molecular Mechanisms of fungal cell wall biogenesis" 2000,21.

134. Valdivieso M.H., Ferrario L., Vai M., Duran A., Popolo L. Chitin synthesis in a gasl mutant of Saccharomyces cerevisiae II J. Bacteriol. 2000, vol.182, 47524757.

135. Valentin E., Herrero E., Pastor F.I.J., Sentandreu R. Solubilisation and analysis of mannoprotein from the cell wall of Saccharomyces cerevisiae II J. Gen. Microbiol. 1984, vol.130,1419-1428.

136. Van Der Vaart J.M., Caro L.H.P., Chapman J.W., Klis F.M., Verrips C.T. Identification of three mannoproteins in the cell wall of Saccharomyces cerevisiae II J. Bacteriol. 1995, vol. 177, 3104-3110.

137. Varghese J.N., Garret T.P., Colman P.M., Chen L., Hoj P.B., Fincher G.B. Three-dimensional structures of two plant beta-glucan endohydrolases with distinct substrate specificities // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994, vol.91, 27852789.

138. Vasquez de Aldana C.R., Correa J., San Segundo P., Bueno A., Nebreda A.R., Mendez E., del Rey F. Nucleotide sequence of the exo-l,3-beta-glucanase-encoding gene, EXG1, of the yeast Saccharomyces cerevisiae II Gene. 1991, vol.97, 173-182.

139. Verna J., Lodder A., Lee K., Vagts A., Ballester R. A family of genes required for maintenance of cell wall integrity and for the stress response in Saccharomyces cerevisiae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997, vol.94, 1380413809.

140. Wagner M., Briza P., Pierce M., Winter E. Distinct steps in yeast spore morphogenesis require distinct SMK1 MAP kinase thresholds // Genetics. 1999, vol. 151,1327-1340.

141. Zhao C., Jung U.S., Garrett-Engele P., Roe T., Cyert M.S., Levin D.E. Temperature-induced expression of yeast FKS2 if under the dual control of protein kinase C and calcineurin // Mol. Cell. Biol. 1998, vol.18,1013-1022.

142. Ziman M., Chuang J.S., Schekman R.W. Chslp and Chs3p, two proteins involved in chitin synthesis, populate a compartment of the Saccharomyces cerevisiae endocytic pathway // Mol. Biol Cell. 1996, vol. 7,1909-1919.

143. Zlotnik H., Fernandez M.P., Bowers B., Cabib E. Saccharomyces cerevisiae mannoproteins from an external cell wall layer that determines wall porosity // J. Bacteriol. 1984, vol.159,1018-1026.