Роль маннозилтрансферазы Рmt1p в формировании молекулярного ансамбля клеточной стенки дрожжей Hansenula polymorpha тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Соколов, Святослав Сергеевич

• Соколов, Святослав Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Соколов, Святослав Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: «Молекулярная композиция клеточной стенки дрожжей.

Роль гликозилирования маннопротеинов в её формировании.»

1. Состав клеточной стенки дрожжей

2. Модификации белков клеточной стенки дрожжей

2.1. N-гликозилирование

2.2. О-гликозилирование

2.3. Гликозил-фосфоинозитольный «якорь»

3. Систематика белков по способу закрепления в клеточной стенке 17 3.1 Нековалентно связанные белки 1В

3.2. Белки экстрагируемые ламинариназой

3.3. Белки экстрагируемые щёлочью

4. Строение клеточной стенки дрожжей

4.1. Локализация белков в клеточной стенке дрожжей

4.2. Химические связи между различными компонентами молекулярного ансамбля клеточной стенки.

4.3 Ферменты, вовлеченные в формирование ковалентных связей между компонентами в составе КС дрожжей

5. Биосинтез О-связанных гликозидов и маннозилтрансферазы, вовлечённые в данный процесс

5.1. Обнаружение О-маннозилтрансфераз

5.2. Трансмембранная топология Pmtlp

5.3. Формирование комплекса между маннозилтрансферазами Pmt-семейства

5.4. Фенотипические проявления нарушений РМТ генов

5.5. Специфичность Pmt белков к различным белковым субстратам

5.6. Роль О-маннозилирования

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

I. Используемые в работе реактивы 43 2 Штаммы и микроорганизмы

3. Состав сред и условия для выращивания микроорганизмов

4. Выделение КС

5. Обработка клеток и клеточных стенок гидролазами

6. Определение чувствительности клеток к Калькофлюору и Конго красному

7. Определение содержания нейтральных Сахаров

8. Определение содержания аминосахаров

9. Определение белков в изолированных КС дрожжей 48 10 Определение сухого веса клеточных стенок

II. Биотинилирование клеток

12. Выделение белков из КС дрожжей

13. Выделение белков из среды роста дрожжей

14. Электрофоретические методы

15. Вестерн-блот анализ

16. Трансформация клеток Е. coli

17. Трансформация дрожжевых клеток

18. Выделение плазмидной ДНК из Е. coli

19. Выделение суммарной ДНК дрожжей

20. Гибридизация по Саузерну

21. Секвенирование фрагмента гена РМС

22. Экстракция ДНК из агарозного геля после электрофоретического разделения

23.Измерение хитиназной активности.

24. Выделение хитиназы из среды роста дрожжей

25. Окраска белков при помощи нитрата серебра

26. Микроскопические методы

27. Компьютерный анализ белковых последовательностей

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Сравнение клеточных стенок дрожжей Hansenula polymorpha и Saccharomyces cerevisiae

1.1 Сравнительный анализ вклада белков и полисахаридов в поддержание целостности клеточной стенки дрожжей Candida utilis, Hansenula polymorpha и Saccharomyces cerevisiae

1.2 Сравнение химического состава клеточных стенок дрожжей Hansenula polymorpha и Saccharomyces cerevisiae

1.3 Сравнение чувствительности дрожжей Hansenula polymorpha и Saccharomyces cerevisiae к присутствию в среде культивирования ингибиторов роста клеточной стенки - Калькофлюора и Конго красного

1.4 Фракционирование и сравнение набора белков клеточных стенок дрожжей Hansenula polymorpha и Saccharomyces cerevisiae

2. Физиологические последствия нарушения гена PMTI Hansenula polymorpha!

2.1 Доказательство того, что изучаемый ген Hansenula polymorpha является функциональным гомологом PMTI Saccharomyces cerevisiae

2.2 Получение штамма Hansenula polymorpha с делецией гена РМТ

2.3 Анализ гена, нарушение которого приводит к фенотипическим проявлениям сходным с проявлениями нарушения гена PMTI Hansenula polymorpha

2.4 Изменения в уровне О-гликозилирования у штамма Hansenula polymorpha с нарушенным геном РМТ1 на примере хитиназы

2.5 Фенотипические проявления, возникающие у дрожжей

Hansenula polymorpha при нарушении гена РМТ1.

3. Влияние делеции гена РМТ1 на структуру клеточной стенки дрожжей Hansenula polymorpha

3.1 Сравнение чувствительности клеточных стенок pmtl дизруптанта и исходного штамма Hansenula polymorpha к действию гидролитически* ферментов

3.2 Сравнение химического состава клеточных стенок дрожжей

Hansenula polymorpha дикого типа и pmtl дизруптанта

3.3 Сравнение состава белковых фракций клеточных стенок дрожжей Натепи1а ро1утогрка дикого типа и ртИ дизруптанта

3.4 Электронная микроскопия дрожжей Натепи1аро1утогрка с нарушенным геном РМТ1 и дикого типа

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль маннозилтрансферазы Рmt1p в формировании молекулярного ансамбля клеточной стенки дрожжей Hansenula polymorpha»

Клеточная стенка (КС) дрожжей представляет собой полифункциональную, физиологически активную органеллу. Она составляет наружный скелет клетки и участвует в осуществлении всего комплекса взаимоотношений между микроорганизмом и окружающей средой. Это делает КС весьма интересным объектом для изучения.

В последнее время количество данных о белках КС дрожжей стремительно растёт. Стало очевидно, что белки играют одну из ключевых ролей в устройстве и функционировании данной органеллы. Показано, что они выполняют в КС как ферментативную, так и структурную роль. Интенсивно изучаются механизмы закрепления белков в КС дрожжей, исследуется роль отдельных белков КС.

Большинство белков, входящих в состав КС дрожжей высоко О-гликозилированы (Kapteyn J.C. et al, 1999). Белки с данным типом маннозилирования можно обнаружить в составе всех трёх известных в настоящее время групп маннопротеинов КС дрожжей, а именно, носящих условные названия, SEP, GPI и PIR - белков. Присоединение О-связанных маннозных цепей необходимо для жизнеспособности организма, мутации приводящие к полной потере О-гликозилирования детальны, но роль О-связанных гликозидов до сих пор остаётся не выясненной. Результаты, которыми располагают исследователи в данной области, получены в основном при изучении дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Gentzsch М., 1996, Mrsa V., 1997). Маннозилтрансфераза Pmtlp считается одним из ключевых ферментом в процессе О-гликозилирования белков, поскольку катализирует реакцию переноса первой маннозы на сериновые и треониновые аминокислотные остатки белков.

Несмотря на то, что структура фермента из S. cerevisiae достаточно хорошо изучена, отсутствуют чёткие представления о его роли в процессе формирования КС.

Очевидно, что изучение роли в формировании молекулярного ансамбля КС дрожжей, такого фермента, как маннозилтрансфераза РМТ1, неизбежно опосредовано исследованием роли белков, в маннозилировании которых принимает участие этот фермент. Данные, полученные в нашей лаборатории ранее при исследовании устойчивости КС дрожжей к воздействию литических ферментов (Калебина, 1984), свидетельствовали о том, что в сравнительном отношении структурная роль белков в КС сегеуг'^гае меньше, чем у дрожжей относящихся к некоторым другим систематическим группам. В то же время у £ се ге VIя гае наблюдается множественность генов РМТ семейства, белок РтПр один из представителей консервативного Рт1 семейства, состоящего из 6 белков у X сегеу'шае (Оеп^БсИ М., 1996). Вклад отдельных маннозилтрансфераз, кодируемых данными генами, в маннозилирование белков формирующих ансамбль КС до конца не выяснен.

Из сказанного следует, что в рамках изучения роли О-маннозилирования белков КС дрожжей, выявление и изучение дрожжей с более отчётливо выраженной ролью белков и ферментов, осуществляющих их маннозилирование, в частности маннозилтрансферазы РМТ1 является актуальной задачей. По нашим предварительным данным, такими дрожжами могли являться метилотрофные дрожжи Натепи1а ро1утогрНа. Дополнительным преимуществом служат достигнутые в последнее время успехи в изучении генетики данных дрожжей, поскольку позволяют проводить с ним широкий спектр генноинженерных манипуляций.

В связи со сказанным, целью настоящей работы явился сравнительный анализ структурной роли белков и полисахаридов КС Натепи1а ро1утогрка и БассИаготусез сегеУ1$1ае, с последующим выявлением роли маннозилтрансферазы РгтШр в формировании молекулярного ансамбля КС дрожжей Натепи1а ро1утогрка. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

• Сравнительный анализ состава и структуры КС Натепи1а ро1утогрка и Засскаготусеъ сегеугягае.

• Получение делеционной мутации РМТ1 гена, кодирующего маннозилтрансферазу РтИр в дрожжах Натепи1а ро1утогрЬа.

• Биохимический и электронно-микроскопический анализ последствий данной делеции, в частности изменений химического состава и морфологии КС, а так же выявление маннопротеинов в О-гликозилировании которых Рт1:1р принимает участие.

Обзор литературы