Изучение структурной роли белков клеточной стенки дрожжей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Алексеева, Ольга Вячеславовна

• Алексеева, Ольга Вячеславовна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Алексеева, Ольга Вячеславовна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Морфологическое строение клеточной стенки дрожжей.

2.1.1 Маннопротеиновый слой клеточной стенки дрожжей.

2.1.2 Глкжановый слой клеточной стенки дрожжей.

2.1.3 Локализация хитина в клеточной стенке дрожжей.

2.1.4 Локализация липидов в клеточной стенке дрожжей.

2.1.5 Дополнительные структуры на поверхности клеточной стенки дрожжей.

2.1.6 Капсула.

2.2 Структура и функции компонентов, входящих в состав клеточной стенки дрожжей.

2.2.1 р-глкжаны.

2.2.2 Минорные компоненты клеточной стенки дрожжей.

2.2.2.1 Хитин.

2.2.2 2 Липиды.

2.2.2.3 Полифосфаты.

2.3 Особенности белков клеточной поверхности дрожжей.

2.3.1 Закрепление маннопротеинов в клеточной стенке дрожжей.

2.3.2 Гликозилирование.

2.4 Разнообразие белков клеточной поверхности дрожжей.

2.4.1 Ферменты, участвующие в формировании и поддержании надмолекулярной структуры клеточной стенки.

2.4.1.1 Ферменты, участвующие в метаболизме хитина.

2.4.1.2 Ферменты, участвующие в метаболизме глюкана.

2.4.1.3 Ферменты, участвующие в метаболизме маннопротеинов.

2.4.2 Гидролитические ферменты, действующие на экзогенные субстраты.

2.4.3 Белки-рецепторы.

2.4.3.1 Белки-рецепторы Candida albicans.

2.4.3.2 Белки-рецепторы Saccharomyces cerevisiae.

2.4.4 Белки, характерные для различных морфологических форм дрожжей.

2.4.5 Белки теплового шока.

2.4.6 Гликолитические ферменты.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 Культура дрожжей и условия ее выращивания.

3.2 Препараты ферментов.

3.3 Окрашивание клеток дрожжей примулином.

3.4 Получение клеточных Стенок дрожжей.

3.5 Экстракция белков из клеточных стенок дрожжей.

3.6 Получение пептидов.

3.7 Кислотный гидролиз белка.

3.8 Анализ аминокислотного состава белка.

3.9 Получение поликлональных антител и иммуноферментный анализ

3.10 Методы определения ферментативных активностей.

3.10.1 Общая протеолитическая активность.

3.10.2 Инвертазная активность.

3.11 Аналитические методы.

3.11.1 Определение белка.

3.12 Электрофоретические методы.

3.12.1 Электрофорез в денатурирующих условиях.

3.13 Фракционирование с помощью цетавлона.

3.14 Хроматографические методы.

3.14.1 Гель-хроматография.

3.14.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография в обращенной фазе.

3.14.3 Рехроматография пептидов.

3.15 Электронная микроскопия клеточной стенки.

3.16 Электроперенос белков.

3.17 Определение N-концевой последовательности белков.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1 Выявление белков, играющих важную структурную роль в клеточной стенке дрожжей.

4.2 Выделение белка MSP116.

4.2.1 Получение грубого препарата белка MSP116.

4.2.2 Дополнительная очистка препарата белка MSP116 с помощью цетавлона.

4.2.3 Получение чистого препарата белка MSP116.

4.2.3.1 Очистка грубого препарата белка методом колоночной хроматографии.

4.2.3.2 Очистка грубого препарата белка MSP116 методом препаративного электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях.

4.3 Идентификация и характеристика MSP116.

4.3.1 Получение пептидов из чистого препарата MSP116 и идентификация MSP 116.

4.3.2 Сравнение инвертазы Candida utilis с инвертазами других дрожжей.

4.3.2.1 Сравнение физико-химических свойств инвертаз.

4.3.2.2 Сравнение аминокислотных последовательностей инвертаз, выделенных из различных видов дрожжей.

4.3.3 Локализация инвертазы у дрожжей Candida utilis.

4.4 Структурная роль и закрепление инвертазы в клеточной стенке дрожжей Candida utilis.

4.4.1 Структурная роль инвертазы в клеточной стенке дрожжей Candida utilis.

4.4.2 Закрепление инвертазы в клеточной стенке дрожжей Candida utilis.

4.5 Структурная роль белка MSP33 в клеточной стенке дрожжей.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение структурной роли белков клеточной стенки дрожжей»

Клеточная стенка дрожжей представляет собой полифункциональную, физиологически активную органеллу. Она составляет наружный скелет клетки, активно участвует в процессе транспорта различных соединений из внешней среды в цитоплазму и обратно, играет большую роль в иммунологических реакциях клетки, в осуществлении контроля метаболических процессов клетки факторами внешней среды. В условиях голодания клеточная стенка может служить источником запасных питательных веществ. Она несет нагрузку по осуществлению всего комплекса взаимоотношений между микроорганизмом и окружающей его средой. Это делает клеточную стенку весьма интересным объектом для исследователей.

Сведения, которыми располагают исследователи в области изучения клеточной стенки дрожжей весьма не полны и зачастую противоречивы. Так, в настоящий момент известно, что основными структурными компонентами этой органеллы являются полисахариды (глюкан, маннан, хитин) и белки (в основном маннопротеины). Однако, до настоящего времени отсутствует модель структуры клеточной стенки дрожжей, соответствующая разнообразию ее функций.

Одним из наименее изученных на данный момент компонентов клеточной стенки являются белки.

В настоящее время в составе клеточной стенки дрожжей насчитывают более 30 белков различной степени гликозилирования. Показано, что белки клеточной стенки несут на себе множество функций: участвуют в формировании и динамических изменениях надмолекулярной структуры клеточной стенки, обеспечивают питание клетки, играют большую роль во взаимодействии клеток с внешней средой (белки - рецепторы и белки теплового шока). Следует отметить, что роль белков, входящих в состав клеточной стенки изучена далеко не полностью. Однако, основываясь на уже известных фактах можно предположить, что белки играют важную роль в структуре, функционировании и динамических изменениях клеточной стенки дрожжей. Возможно, что более подробное изучение уже известных и открытие новых белков клеточной стенки позволит подойти к решению вопроса о молекулярной организации клеточных стенок.

Т.о. сказанное выше свидетельствует о том, что изучение белков клеточной стенки дрожжей, а также разработка методов исследования этих ее компонентов являются важными и актуальными задачами.

Известно, что использование гидролаз с различной субстратной специфичностью является удачным методическим подходом при изучении компонентов (таких, как глюкан, хитин, маннан), входящих в состав сложноорганизованной и многокомпонентной структуры клеточной стенки дрожжей (Pastor et al., 1984; Valentin et al., 1984).

В лаборатории Кулаева И. С. было показано, что весьма перспективным представляется использование протеолитических ферментов в качестве инструментов для исследования локализации и роли белков клеточной стенки дрожжей (Калебина и др., 1994; Kalebina et al., 1988).

Совершенно очевидно, что без детального анализа роли белков в формировании и поддержании целостности единого молекулярного ансамбля клеточной стенки дрожжей невозможно понять, как устроена и как функционирует эта органелла. Данный вопрос весьма далек от окончательного ответа.

В этой связи целью данной работы явилось изучение структурной роли белков клеточной стенки дрожжей Candida utilis и Saccharomyces cerevisiae, частичная характеристика белков, предположительно скрепляющих молекулы полисахаридов в клеточной стенке, и получение ответа на вопрос играют ли белки определяющую роль в скреплении молекул полисахаридов данной органеллы или же они закреплены на полисахаридном каркасе и структурной роли не играют.

В работе были поставлены следующиеэкспериментальные задачи:

1. Проверка гипотезы о том, что белки клеточной стенки дрожжей играют структурную роль в данной органелле. В частности проверка данной гипотезы для ранее обнаруженных белков клеточной стенки с молекулярными массами 33 и 116 кДа и названных соответственно MSP 33 и MSP116.

2, Обзор литературы

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Алексеева, Ольга Вячеславовна, 1999 год

1. Бирюзова В.И. Ультраструктурная организация дрожжевой клетки// М., Изд-во Наука, 1993.- 224с.

2. Вагабов В.М. Биосинтез углеводных компонентов клеточной стенки дрожжей// Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1988.- 198с

3. Блинов Н.П., Витовская Т.А., Калошин В.Г., Колотинская Т.М. Структурные полисахариды некоторых видов Rhodotorula и Criptococcus// Биохимия, т. 39, №4, 1974, с.787-792

4. Калебина Т.С. Выделение и характеристика сериновой протеиназы Bacillus brevis, лизирующей клетки дрожжей Candida utilis// Канд. дисс., Москва, 1984, 174с.

5. Калебина Т.С., Тимохина Н.М., Тырсин Ю.А., Кулаев И.С. Литическое действие сериновой протеиназы из Bacillus brevis. Зависимость от стадии роста и фазы почкования дрожжей// Докл. Акад. Наук, т. 2 80, №6,1985, с. 1469-1472

6. Кулаев И. С. Биохимия высокомолекулярных полифосфатов// М.: МГУ, 1975.-247с.

7. Михайлов А. Т., Симирский В.Н. Методы иммунохимического анализа в биологии развития// М., Наука, 1991, 287 с.

8. Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов// М., Изд-во Наука, 1983.-248с

9. Шкляр Б.Х. Ферментативный лизис дрожжей// Мн., Наука и техника, 1977, 192с

10. Штрейблова Е. Архитектоника клеточных стенок дрожжей// Изв. АН СССР сер. биол., №3, 1977, с. 410421

11. Чжан С. Роль белков в молекулярной организации клеточной стенки дрожжей Candida utilis// Автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. биол. наук, М., 1994, 24с.

12. Юркевич В.В. Выделение инвертазы дрожжевыми клетками// Докл. АНСССР, т.94, №2, с.329-332.

13. Alaei, S. , С. Larcher, С. Ebenbichler, W. М. Prodinger, J. Janatova, and M. P. Dierich. Isolation and biochemical characterization of the iC3b receptor of Candida albicans.//Infect. Immun., v. 61, 1993, p.1395-1399

14. Alloush, H. M., J. L. Lopez-Ribot, and W. L. Chaffin. Dynamic expression of cell wall proteins of Candida albicans revealed by probes from cDNA clones.// J. Med. Vet. Mycol., v. 34, 1996, p.91-97

15. Alloush, H. M., J. L. Lopez-Ribot, B. J. Masten, and W. L. Chaffin. 3-Phosphoglycerale kinase: a glycolytic enzyme present in the cell wall of Candida albicans. //Microbiology, v. 143, 1997, p. 321-330

16. Anderson J., Michalik R., Soil D.R. Ultrastructura and antigenicity of the unique cell wall pimple of the Candida opaque phenotype// J. of Bacteriology, v. 172, №1, 1990, p.224-235

17. Antley, P. P, and К. C. Hazen. Role of yeast cell growth temperature on Candida albicans virulence in mice. //Infect. Immun., v. 56, 1988, p.2884-2890

18. Ballou C.E. Isolation, characterization and properties of Saccharomyces cerevisiae mnn mutants with non-conditional protein glycosylation defects// Meth. Enzymol., v.185, 1990, p. 440-470

19. Banno, Y., T. Yamada, and Y. Nozawa. Secreted phospholipases of the dimorphic fungus Candida albicans: separation of three enzymes and some biological properties.// Sabouraudia, v. p.47-54

20. Barret-Bee, K., Y. Hayes, R. G. Wilson, Riley. A comparison of phospholipase cellular adherence and pathogenicity of yeasts// Gen. Microbiol., v. 131, 1985, p.1217-1221

21. Bendel, C. M., J. St. Sauver, S. Carlson, and M. K. Hostetter. Epithelial adhesion in yeast species: correlation with surface expression of the integrin analog.// J. Infect. Dis., v. 171, 1995, p.1660-1663

22. Bertram, G., R. K. Swoboda, G. W. Gooday, N. A. R. Gow, and A. J. P. Brown. Structure and regulation of the Candida albicans ADH1 gene encoding an immunogenic alcohol dehydrogenase.// Yeast, v. 12, 1996, p. 115-127

23. Bony M., Thines-Sempoux D., Barre P., Blondin B. Localization and cell surface anchoring of the Saccharomyces cerevisiae flocculation protein Flolp// J. Bacterid., v. 179, 1997, p.4929-4936

24. Bouali, A., R. Robert, G. Tronchin. and J.-M. Senet. IWCi Binding of human fibrinogen in Candida albicans in vitro: a preliminary study.// J. Med.Vet. Mycol., v. 24, 1986, p.345-348.

25. Bouali, A., R. Robert, G. Tronchin, and J. M. Senet. Characterization of binding of human fibrinogen to the surface of germ-tubes and mycelium of Candida albicans.// J. Gen. Microbiol., v. 133, 1987, p.545-551.

26. Bouchara, J. P., G. Tronchin, V. Annaix, R. Robert, and J. M. Senet. Laminin receptors on Candida33.

27. Burford-Mason, A. P., R. C. Matthews, and J. R. B. Williams. Transient abrogation of immunosuppression in a patient with chronic mucocutaneous candidiasis following vaccination with Candida albicans.// . Infect., v. 14, 1987, p.147-157

28. Calderone R.A. and Braun P.C. Adherence and receptor relationship of Candida albicans// Microbiol. Rev., v.55, 1991, p.1-20

29. Cameron, B. J., and L. J. Douglas. Blood group glycolipids as epithelial cell receptors for Candida albicans.// Infect. Immun., v. 64, 1996, p.891-896

30. Cannon R.D., Niimi K., Jenkinson H.F. and Shepherd M.G. Molecular cloning and expression of the Candida albicans p-N-glucoseaminidase (HEX1) gene// J. Bacterid., v.176, 1994, p.2640-264737,38