Особенности структуры глюкантрансферазы BGL2P и способ ее закрепления в клеточной стенке дрожжей Saccharomyces cerevisiae тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Безсонов, Евгений Евгеньевич

• Безсонов, Евгений Евгеньевич
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Безсонов, Евгений Евгеньевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: БЕЛКИ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЖЕЙ И СПОСОБЫ ИХ ЗАКРЕПЛЕНИЯ.

Введение.

1. Компоненты клеточной стенки дрожжей.

2. Способы ковалентной модификации белков клеточной стенки.

2.1. N-гликозилирование.

2.2.0-гликозилирование.

2.3. GPI-якорь.

3. Классификация и характеристика белков клеточной стенки по способу экстракции.

3.1. Ковалентно закрепленные белки: GPI и PIR.

3.1.1. GPI-белки клеточной стенки.

3.1.2. ASL-белки клеточной стенки.

3.2. SEP-белки клеточной стенки.

3.2.1. Глюкантрансфераза Bgl2p клеточной стенки дрожжей.

4. Примеры белков, ремоделирующих клеточную стенку дрожжей.

4.1. р-1,3-глюканозилтрансфераза Gaslp.

4.2. Экзо-р-1,3-глюканазы.

4.3. Эндохитиназа.

4.4. Предполагаемые глюкан/хитин кросс-связывающие ферменты.

4.5. Глюканазы Scw4p и ScwlOp.

4.6. Глюкантрансфераза Bgl2p.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Особенности структуры глюкантрансферазы BGL2P и способ ее закрепления в клеточной стенке дрожжей Saccharomyces cerevisiae»

Клеточная стенка (КС) дрожжей состоит из (31,3- и р1,6-глюканов, составляющих до 60% массы КС, 40% белков, которые являются маннопротеинами различной степени гликозилирования, и минорного, но очень важного в структурном отношении полисахарида - хитина, на долю которого приходится не более 5% массы этой органеллы. КС покрывает всю поверхность клетки дрожжей и располагается за пределами цитоплазматической мембраны. Она выполняет функцию прочного наружного скелета, определяет форму клетки и защищает ее от внешних воздействий. Вместе с тем, КС является динамичной органеллой, структура которой может быстро и кардинально перестраиваться в зависимости от стадии жизненного цикла дрожжевой клетки и претерпевать постоянные локальные изменения в процессе ее роста и растяжения. На структуру КС оказывают влияние условия окружающей среды. В указанных изменениях ключевую роль играют белки КС, принимающие участие в окончательном формировании ее молекулярного ансамбля.

Можно классифицировать белки КС дрожжей по способу их закрепления. В соответствии с этой классификацией, они подразделяются на связанные и не связанные ковалентно с полисахаридами КС. Белки первой группы (сокращенно CWP — covalently. linked cell wall proteins) могут быть экстрагированы из данной огранеллы с использованием таких гидролаз, как р-глюканазы, (например, ламинариназа) (Pastor et al., 1984; Van Der Vaart et al., 1995; Shimoi et al., 1998), а также щелочной экстракцией (Mrsa et al., 1997; Mrsa and Tanner, 1999). Белки, обладающие остатком GPI-якоря (GPI-белки), через который они ковалентно связаны с глюканом КС, входят в группу CWP-белков. Роль этих белков в функционировании КС дрожжей активно изучается. Белки второй группы могут быть экстрагированы в буфер, содержащий ДСН, восстанавливающие реагенты (ДТТ, p-меркаптоэтанол) и ЭДТА при нагревании (Chaffin and Stocco, 1983; Valentin et al., 1984). Большинство этих белков (SEP-белков — от англ. sodium dodecyl sulfate extractable protein) закреплено с помощью нековалентных взаимодействий. Следует ' отметить, что некоторые члены данной группы могут быть связаны друг с другом и/или CWP-белками посредством дисульфидных связей, образуемых между остатками цистеинов белковых молекул. В группе SEP-белков есть много ферментов, в том числе обладающих глюканазной и/или глюкантрансферазной активностью.

Глюкантрансферазы - группа ферментов, участвующих в создании и перестройках глюканового каркаса КС. Следует отметить, что данная группа исследована недостаточно. Один из таких белков - глюкантрансфераза Bgl2p - мажорный SEP-белок, обнаруживающийся в большом количестве на всех стадиях роста культуры (45000 молекул на клетку в логарифмической фазе роста - Ghaemmaghami et al., 2003). Bgl2p это небольшой (31.5-34 кДа в зависимости от вида дрожжей), консервативный белок, присутствие которого в КС показано для многих видов дрожжей. Молекула Bgl2p имеет один N-связанный олигоманнозид небольшого размера (приблизительно 2.5 кДа), который, как было опубликовано ранее, присоединен к аспарагину-284 (Mrsa et al.} 1993).

По результатам анализа первичной структуры Bgl2p может быть отнесен к семейству 17 гликозид гидролаз (ЕС 3.2.1.58). Было показано in vitro, что при низких концентрациях глюкозных олигосахаридов у Bgl2p может наблюдаться эндоглюканазная активность, а при более высоких преобладает глюкозилтрансферазная активность (Goldman et al., 1995). Делеция гена BGL2 не приводит к возникновению выраженного фенотипа при стандартных лабораторных условиях выращивания, за исключением небольшого увеличения содержания в КС хитина и щелочерастворимого ((31,3-связанного) глюкана-структурных компонентов КС (Mrsa et al., 1993; Laurinavichyute et al., 2000; Sestak et al., 2004).

Bgl2p характеризуется несколькими необычными свойствами, выделяющими его из общей массы белков КС. В нашей лаборатории было показано, что Bgl2p в составе КС устойчив, по сравнению с другими SEP-белками, к гидролизу трипсином, хотя и содержит, 19 остатков Lys и Arg в своей молекуле, и протеиназой К (в белке 134 сайта для гидролиза этой протеиназой). Bgl2p характеризуется необычайно прочным закреплением в КС, например, он не может быть экстрагирован из изолированной КС с помощью 1% ДСН при 37°С в отличие от большинства SEP-белков КС. Bgl2p, как уже было сказано, не содержит GPI-якоря. Однако, в штамме дрожжей S. cerevisiae, характеризующемся нарушенным формированием GPI-якорей, он не закрепляется в КС, а секретируется в среду культивирования (Kalebina et al., 2002). Кроме того, известно, что Bgl2p разных видов дрожжей демонстрирует выраженную тенденцию к формированию агрегатов при очистке (Klebl and Tanner, 1989; Hartland et al., 1991; Elorza et al., 1988). Ранее в нашей лаборатории была показана способность Bgl2p, выделенного из КС при нагревании, А формировать фибриллярные структуры (Плотникова, 2006).

Jeng и соавторы обнаружили, что у Candida albicans Bgl2p выполняет роль адгезина (Jeng et al., 2005). Авторы предположили, что ключевую роль в данном процессе играют лектин-подобные свойства этого фермента. Bgl2p является термостабильным белком — исследователи выделяли его при температуре 70°С и более, после чего он был способен проявлять ферментативную активность (Klebl and Tanner, 1989; Mrsa et al., 1993). Bgl2p проявляет высокую аффинность к (51,3-глюкану и, что достаточно удивительно, к хитину (Klebl and Tanner, 1989; Mrsa et al., 1993).

Несмотря на более чем 20-летнюю историю изучения, структура молекулы Bgl2p практически не охарактеризована. Отсутствуют сведения относительно причин, обуславливающих способность данного белка столь прочно закрепляться в КС.

Целью настоящей работы являлось исследовать физико-химические свойства, особенности структуры глюкантрансферазы Bgl2p и способ ее закрепления в клеточной стенке дрожжей S. cerevisiae. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

• Установить, присутствует ли в клеточной стенке дрожжей S. cerevisiae дикого типа пул молекул Bgl2p, закрепленных при помощи дисульфидных связей.

• Сравнить первичную структуру, ковалентные модификации, а также способность формировать олигомеры и фибриллы Bgl2p, выделенного из клеточных стенок штамма дрожжей S. cerevisiae дикого типа и секретируемого в культуральную жидкость штамма с нарушенным формированием GPI-якорей.

• Исследовать способность глюкантрансферазы Bgl2p, выделенной из клеточной стенки дрожжей S. cerevisiae дикого типа, образовывать фибриллы и изучить конформационные изменения ее молекулы в зависимости от температуры.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: БЕЛКИ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЖЕЙ И СПОСОБЫ ИХ ЗАКРЕПЛЕНИЯ.

Введение.

Вегетативные клеточные стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae имеют слоистую ультраструктуру, наблюдаемую при электронной микроскопии (Osumi et al., 1998), с внутренним слоем глюкана и хитина и наружным слоем маннопротеинов. Заслуживает внимания тот факт, что при электронной микроскопии клетки патогенных дрожжей Candida albicans демонстрируют фибриллярные структуры на своей поверхности (Hazen et al., 1992, Nather and Munro, 2008). Электронная микрофотография клеточных стенок дрожжей S. cerevisiae, а также электронная микрофотография клеточных стенок дрожжей С. albicans, на которой видны фибриллярные структуры, представлены на рис. 1.

Рисунок 1. А - Электронная микроскопия клеточной стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae (XI00000). МПС-маннопротеиновый слой; ГС-глюкановый слой; ЦПМ— цитоплазматическая мембрана; Б - Электронная микрофотография клеток дрожжей Candida albicans, демонстрирующая, что наружный слой клеточной поверхности, обогащенный маннопротеинами, имеет фибриллярную морфологию (отмечено стрелкой). Взято из Nather and Munro, 2008.

Данный обзор литературы будет посвящен в основном компонентам клеточной стенки дрожжей S. cerevisiae — наиболее изученного на данный момент эукариотического микроорганизма, с привлечением при необходимости данных, полученных для патогенного микроорганизма С. albicans (клеточная поверхность данного вида дрожжей также интенсивно исследуется), а также других дрожжевых микроорганизмов.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Безсонов, Евгений Евгеньевич

V. ВЫВОДЫ.

1. Сравнение Bgl2p, который накапливается в культуральной жидкости штамма Saccharomyces cerevisiae с нарушенным формированием GPI-якорей, и Bgl2p, закрепленного в клеточной стенке штамма с их нормальным формированием, не выявило различий в первичной структуре и ковалентных модификациях исследуемых белков.

2. Bgl2p накапливается в культуральной жидкости штамма Saccharomyces cerevisiae с нарушенным формированием GPI-якорей в мономерной форме, либо в форме ди-или тримеров, неустойчивых в денатурирующих условиях. При концентрировании частично очищенного препарата Bgl2p из культуральной жидкости этого штамма данный белок с высокой эффективностью образует устойчивые к денатурирующим условиям олигомеры, а также способен формировать фибриллярные структуры.

3. В экстракте из клеточных стенок дрожжей Saccharomyces cerevisiae дикого типа Bgl2p при низких концентрациях существует в виде олигомеров низкого порядка со средним размером 20 нм, при высоких концентрациях — в виде полимеров со средним размером 950 нм.

4. При повышении температуры происходит постепенная обратимая деполимеризация фибрилл, образованных Bgl2p из клеточной стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, сопровождающаяся уменьшением степени экспонированности остатков/остатка триптофана. При этом в диапазоне температур 55-65°С наблюдается отчетливо выраженный структурный переход. Предполагается, что деполимеризация может приводить к освобождению Bgl2p из клеточной стенки при температуре 55°С и выше.

5. Дисульфидные связи не играют существенной роли в закреплении Bgl2p в клеточной стенке дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

6. Полученные данные, а также сведения из литературы, позволили выдвинуть гипотезу, согласно которой закрепление Bgl2p в клеточной стенке дрожжей Saccharomyces cerevisiae связано с образованием этим белком фибриллярных структур при повышении его концентрации, чему способствуют GPI-белки клеточной стенки.

7. Заключение.

Совокупность полученных результатов подтверждает гипотезу, согласно которой закрепление Bgl2p в КС дрожжей S. cerevisiae связано с образованием данным белком фибриллярных структур при повышении его концентрации в КС, в результате чего он уже не может свободно выходить из КС. При этом структурный компонент КС — GPI-белки — могут способствовать повышению концентрации Bgl2p, задерживая его прохождение через эту органеллу. Согласно выдвинутому предположению, структура глюкантрансферазы Bgl2p не является термостабильной и в процессе экстракции из состава КС при нагревании Bgl2p изменяет свою конформацию. При нагревании КС до 55°С и выше структурный элемент в молекуле Bgl2p, ответственный за образование фибриллярных структур, претерпевает обратимые конформационные изменения, при которых фибриллярные структуры деградир\ ют и белок выходит из КС в раствор.

99