Сравнительное иммуногистохимическое исследование клеточных реакций в нестабильных и в стабильных атеросклеротических поражениях у человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Снегова Влада Андреевна

• Снегова Влада Андреевна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Снегова Влада Андреевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Морфологическая характеристика различных типов атеросклеротических поражений

2.2. Состояние эластико-коллагенового каркаса при формировании атеросклеротических поражений

2.3. Лимфоциты и их субпопуляции при формировании атеросклеротического поражения

2.4. Макрофаги и их роль в дестабилизации атеросклеротической бляшки

2.5. Регионарные лимфатические узлы при формировании нестабильных атеросклеротических поражений

2.6. Роль цитокинов в атерогенезе

2.6.1. Роль медиаторов активации эндотелия и

адгезивных молекул в атерогенезе

2.6.2. Интерлейкин-17

2.6.3. Интерлейкин-18

2.6.4. Интерферон-гамма

2.6.5. Фактор некроза опухоли

2.6.6. Интерлейкин-4

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Характеристика исследованного материала

3.2. Подготовка материала для гистологического

исследования

3.3. Обзорные гистологические окраски

3.4. Иммуногистохимическое исследование

3.5. Фотосъемка объектов

3.6. Морфометрический и статистический анализ

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Морфологические особенности и классификация нестабильных атеросклеротических поражений

4.2. Состояние эластико-коллагенового каркаса в

в нестабильных и стабильных атеросклеротических поражениях

4.3. Роль хемоадгезивного фактора 1Ь-8 в формировании нестабильной атеросклеротической бляшки

4.4. Мононуклеарно-клеточная инфильтрация стенок

артерий

4.5. Иммуногистохимический и морфометрический анализ популяций лимфоцитов и макрофагов

в сосудистой стенке человека

4.6. Иммуноморфологическое исследование парааортальных лимфатических узлов

4.7. Морфометрическое исследование ТИ-1 и ТИ-2-клеток

в сосудистой стенке при атерогенезе

4.8. Влияние про- и антивоспалительных цитокинов на формирование атеросклеротических поражений

4.8.1. Интерлейкин-17 (1Ь-17)

4.8.2. Интерлейкин-18 (1Ь-18)

4.8.3. Интеферон-гамма (ШБ-у)

4.8.4. Фактор некроза опухоли (Т№-а)

4.8.5. Интерлейкин-4 (1Ь-4)

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

7. ВЫВОДЫ

8. СПИСОК ОБОЗНАЧЕНИИ

9. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сравнительное иммуногистохимическое исследование клеточных реакций в нестабильных и в стабильных атеросклеротических поражениях у человека»

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. В настоящее время сердечнососудистые заболевания остаются главной причиной смертности и инвалидности во всех развитых странах мира. Наиболее распространенными формами сердечно -сосудистых заболеваний являются ишемическая болезнь сердца и болезнь сосудов головного мозга, в развитии которых атеросклероз играет основополагающую роль (по данным ВОЗ) (Dahlof, 2010; Константинов, 2012; Pagidipati, Gaziano, 2013; Фатхуллина и соавт., 2016; Гордиенко, Сердюков, 2020). Несмотря на значительный прогресс в исследовании атеросклероза и многочисленные гипотезы, объясняющие его возникновение и течение, ряд ключевых моментов пато- и морфогенеза заболевания остаются дискуссионными и недостаточно изученными (Нагорнев, 2006).

В 90-х годах прошлого века было сформулировано понятие острого коронарного синдрома (ОКС). Возникновение самого термина - острый коронарный синдром связано с появлением новых данных о механизмах развития различных форм ИБС. Известно, что ишемическая болезнь (коронарная) болезнь сердца клинически может проявляться в виде стабильной стенокардии, нестабильной стенокардии, инфаркта миокарда, сердечной недостаточности и внезапной смерти (Севергина, 2005; Пигаревский, 2018). В настоящее время нестабильную стенокардию, инфаркт миокарда и внезапную сердечную смерть принято относить к ОКС (Севергина, 2005; Кактурский, 2007). Важно, что 70-80% ОКС составляет нестабильная стенокардия. В основе развития ОКС и других форм ИБС лежат два основополагающих процесса - атеросклероз и последующий тромбоз коронарных артерий (Пигаревский и соавт., 2013; Cimmino et al., 2017).

Известно также, что морфологической основой ОКС являются нестабильные, легкоранимые атеросклеротические бляшки артерий, склонные к изъязвлению, разрыву и последующему тромбозу. Само понятие «уязвимая», ранимая бляшка (vulnerable plaque) было введено американским кардиологом Дж. Мюллером в 1994 году. Этот тип бляшки характеризовался, как склонный к разрыву из-за

тонкой фиброзной покрышки и крупного липидного ядра. По мнению автора именно такие бляшки лежат в основе сердечного приступа (Пигаревский и соавт., 2013).

Единый патогенез всех форм заболеваний ОКС возможно связан с единым морфологическим субстратом — нестабильной атеросклеротической бляшкой. Однако, механизмы развития нестабильных атеросклеротических бляшек, причины их разрыва, а также участие клеточных иммуновоспалительных реакций в этом процессе остаются пока недостаточно изученными (Пигаревский и соавт., 2013; Abdolmaleki et а1., 2019). Большинство исследований направленных на решение данной проблемы представлены ангиоскопическими, ангиографическими и внутрисосудистыми ультразвуковыми исследованиями.

Актуальность данной работы связана с тем, что основной упор, как отечественных, так и зарубежных авторов делается не на клеточные, а на молекулярные факторы, способствующие надрыву/разрыву уже сформировавшейся нестабильной бляшки. В настоящее время участие различных типов иммуновоспалительных клеток и их медиаторов в прогрессивном развитии атеросклеротических бляшек, а также их влияние на дестабилизацию остается пока малоизученным. В данной работе с помощью комплекса современных гистологических, иммуногистохимических и морфометрических методов проведен подробный сравнительный анализ клеточных реакций, способствующих развитию деструктивных процессов в сосудистой стенке. Таким образом, представленное исследование по изучению роли клеточных механизмов в развитии нестабильных атеросклеротических поражений у человека является оригинальным и соответствует современному уровню.

Степень разработанности темы. В 70-е годы прошлого столетия обсуждалось не менее 20 теорий и гипотез развития атеросклероза. В настоящее время общее признание получила иммуновоспалительная теория, рассматривающая данное заболевание как иммунный ответ на антигены различной природы (Нагорнев и соавт., 2005; М^бои et а!., 2005).

Результаты экспериментальных исследований, направленных на изучение патогенеза атеросклероза, позволили рассматривать поражения артерий как проявление аутоиммунного процесса. Доказано, что при атеросклерозе основную и инициирующую роль играют модифицированные ЛПНП, и в первую очередь перекисно-модифицированные ЛПНП (Климов, 1987; Нагорнев, 2006). Признаки локального воспалительного процесса при атеросклерозе выявляются на начальных стадиях развития артериальной патологии, а также в фазе дестабилизации и повреждения атеросклеротической бляшки (Iyemere et al., 2006; Hinz et al., 2007).

В настоящее время степень участия иммуновоспалительных реакций в формировании и развитии нестабильного типа атеросклеротических поражений, а также выявление их возможной роли в процессах дестабилизации атеросклеротической бляшки не ясны. Однако установлено, что Т-лимфоциты и макрофаги являются важными участниками воспалительного процесса в сосудистой стенке (Galkina et al., 2009; Фатхуллина и соавт., 2016). Ряд исследователей демонстрирует присутствие активированных лимфоцитов и синтезируемых ими антител на ранних и выраженных стадиях формирования атеросклеротических поражениях у человека (Klimov et al., 1988; Stemme et al., 1995; Нагорнев, 2006). Установлено, что Т-лимфоциты являются ключевыми иммунорегуляторными клетками при развитии атеросклероза (Hansson, Libby, 2006; Hansson et al., 2009).

Наряду с ними в настоящее время большое значение придается роли моноцитов/макрофагов при атерогенезе (Mosser et al., 2008; Shibata et al., 2009; Shimada et al., 2009; Gong et al., 2017). Инфильтрацию артерий моноцитами/макрофагами отмечали при экспериментальном моделировании атеросклероза у кроликов, свиней, крыс и обезьян (Нагорнев, 2006; Hinz et al., 2007). Выявленная адгезия моноцитов на эндотелиальной поверхности артерий, наличие их большого числа непосредственно под эндотелием, а более зрелых макрофагов в глубине интимы свидетельствует в пользу поступления этих клеток

из крови. Локальная инфильтрация моноцитов/макрофагов в формирующихся атеросклеротических поражениях, зачастую сочетается с одновременным накоплением в тех же участках Т-лимфоцитов, что может указывать на воспалительный характер процесса (Hinz et al., 2007; Kubatova et al., 2020).

Реакции в сосудистой стенке при формировании атеросклеротических поражений представляют собой сложную систему взаимодействия клеток, продуцируемых ими цитокинов и факторов роста (Hansson et al., 1989; Карагодин и соавт., 2014; Munijal, Khandia, 2020). Показано, что цитокины продуцируются в ответ на воспалительные и другие стимулы различными клетками: Т-лимфоцитами, моноцитами, макрофагами, тромбоцитами, а также эндотелиальными клетками, ГМК и адипоцитами (Farias-Itao et al., 2019). Повышенная продукция провоспалительных цитокинов связана с прогрессированием заболевания и способствует развитию атеросклероза (Ait-Oufella et al., 2011; Фатхуллина и соавт., 2016). Установлено, что баланс между про- и противовоспалительными цитокинами является основным фактором, определяющим стабильность атеросклеротической бляшки (Фатхуллина и соавт., 2016). Однако на данный момент влияние цитокинов на дестабилизацию атеросклеротической бляшки остается пока малоизученным направлением.

Таким образом, на сегодняшний день установлено, что в патогенезе атеросклероза существенную роль играют клеточные иммуновоспалительные реакции. Тем не менее, влияние этих реакций на развитие прогрессирующих нестабильных атеросклеротических поражений практически не исследована.

Вовлеченность иммунных реакций при формировании нестабильных атеросклеротических поражений подтверждена преимущественно на экспериментальных моделях животных. Наибольшее количество информации получено при исследовании мышей с различными генетически-индуцированными дефектами. Несмотря на очевидную ценность полученных данных, эти модели лишь частично отражают многообразие процессов, имеющих место при атеросклерозе у человека (Soliman et al., 2008; Карагодин и соавт., 2014). В

настоящее время большинство работ отечественных и зарубежных авторов, посвященных роли иммуннокомпетентных клеток и их медиаторов в атерогенезе, а также их влияние на дестабилизацию атеросклеротических поражений представлены в основном молекулярными и биохимическими исследованиями. Оригинальность нашей работы заключается в комплексном сравнительном анализе иммуновоспалительных реакций, влияющих на деструктивные процессы в сосудистой стенке человека, с использованием современных иммуноморфологических и морфометрических методов исследования.

Целью работы стало изучение участия различных типов иммуновоспалительных клеток и их медиаторов в дестабилизации атеросклеротических бляшек у человека.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Верифицировать типы поражений с целью отбора нестабильных бляшек, обладающих признаками прогрессирующего роста;

2. Изучить состояние эластико-коллагенового каркаса и гладкомышечных клеток нестабильных и стабильных атеросклеротических поражений;

3. Осуществить анализ мононуклеарно-клеточной инфильтрации в разных отделах, изучаемых атеросклеротических бляшек;

4. Изучить роль хемоадгезивного фактора IL-8 в качестве одного из инициаторов формирования нестабильной атеросклеротической бляшки;

5. Изучить содержание и функциональную активность различных типов иммуновоспалительных клеток: CD3, CD4, CD8, CD68, CD 163 и их медиаторов (IL-17, IL-18, INF-y, TNF-a, IL-4) в прогрессирующих и стабильных типах атеросклеротических поражений, а также в парааортальных лимфатических узлах;

6. Изучить INF-y и IL-4 позитивные клетки, в качестве маркеров про- (Th1) и антиатерогенного (Th2) иммунного ответа в сосудистой стенке и в парааортальных лимфатических узлах.

Научная новизна.

1. В результате сравнительного иммуноморфологического и морфометрического исследования впервые выявлены клеточные и внеклеточные факторы, лежащие в основе механизмов дестабилизации атеросклеротической бляшки у человека.

2. Создана морфологическая классификация обобщенных типов состоявшихся нестабильных и стабильных атеросклеротических поражений.

3. Впервые выявлена отдельная прогрессирующая форма нестабильной атеросклеротической бляшки.

4. Установлено, что при формировании нестабильного атеросклеротического поражения в эндотелиальных и мононуклеарных клетках наблюдается выраженная экспрессия мощного хемоаттрактанта IL-8. Этот факт может говорить о генерализованном характере адгезионного процесса в сосудистой стенке, и о необходимости, проникающих в интиму сосуда макрофагов и лимфоцитов, для инициации и усиления иммуновоспалительных реакций.

5. Впервые исследованы количественное содержание и функциональная активность различных типов лимфоцитов и макрофагов: CD3, CD4, CD8, CD68, CD 163 и их медиаторов (IL-17, IL-18, INF-y, TNF-a, IL-4) в прогрессирующих типах атеросклеротических поражений. Установлено, что наблюдаемые дегенеративные процессы в нестабильной бляшке могут быть связаны с действием провоспалительных цитокинов (IFN-y, TNFa, IL-17, IL-18). Показано, что баланс между про- и анти-воспалительными клетками в очагах иммунного воспаления может оказывать важное влияние на развитие атеросклероза, его активацию и прогрессирование.

6. С целью наиболее полного раскрытия механизмов, лежащих в основе формирования прогрессирующих атеросклеротических поражений у человека, иммуновоспалительные клеточные реакции впервые изучены не только в сосудистой стенке, но и в структурных компонентах Т- и В-зон

парааортальных лимфатических узлов, контролирующих соответствующие участки сосуда.

Важно подчеркнуть, что представленная работа проведена не на экспериментальных моделях, а на человеческом секционном материале и в ней использованы современные иммуноморфологические и морфометрические методы исследования.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы направлена на решение фундаментальной задачи медицины, связанной с изучением роли иммуновоспалительных реакций в прогрессирующих атеросклеротических поражениях. Подтверждена иммуновоспалительная теория патогенеза атеросклероза. В рамках представленной работы получены данные, свидетельствующие о том, что при атеросклерозе существенное значение оказывают клеточные иммуновоспалительные реакции, которые приводят к деструктивным процессам в сосудистой стенке и образованию нестабильных атеросклеротических бляшек, склонных к изъязвлению, разрыву и последующему тромбозу. Подробный иммуноморфологический и морфометрический анализ позволил расширить существующую информацию об инициировании иммуновоспалительных реакций и функциональной активности различных типов лимфоцитов и макрофагов, а также их медиаторов в прогрессирующих атеросклеротических поражениях. Подтверждена гипотеза, согласно которой, синтезируемые этими клетками, интерлейкины обладают провоспалительным и проатерогенным эффектом, что может приводить к дестабилизации атеросклеротической бляшки.

Практическая значимость работы заключается в том, что изучение роли иммуновоспалительных реакций и раскрытие механизмов формирования прогрессирующих атеросклеротических поражений, которые являются причиной острого коронарного синдрома, нестабильной стенокардии, инфаркта миокарда и внезапной смерти, может помочь в разработке новых лекарственных препаратов, а также методов лечения и профилактики атеросклероза и его осложнений.

Результаты выполненного диссертационного исследования могут быть использованы в лекционных курсах высших учебных заведений медико-биологического профиля. Кроме этого, на основании полученных результатов в настоящее время разрабатывается диагностический тест, позволяющий выявить больных с тяжелым прогрессирующим течением ИБС, в основе которого лежит выраженная дестабилизация атеросклеротической бляшки.

Методология и методы исследования. При проведении научно-исследовательской работы в рамках представленного диссертационного исследования применялся комплексный методический подход с одновременным использованием гистологических, иммуногистохимических и морфометрических методов.

Исследование проводилось на архивном материале (сегменты аорты, коронарные, сонные артерии, артерии головного мозга и парааортальные лимфатические узлы), взятом в короткие сроки после смерти пациентов, погибших от ИБС.

На первом этапе работы с помощью традиционных гистологических методов и окраски препаратов Oil Red O осуществлялась верификация типов атеросклеротических поражений с целью отбора нестабильных, обладающих признаками прогрессирующего роста. Одновременное выявление эластических и коллагеновых волокон в сосудистой стенке осуществлялось с помощью специальной гистологической окраски по методу Вейгерта - Ван-Гизона. Степень инфильтрации сосудистой стенки мононуклеарами выявляли с помощью окрашивания срезов гематоксилином Майера с докраской водно-спиртовым раствором эозина. Для дифференциации лимфоидных клеточных форм, входящих в мононуклеарные инфильтраты, использовали метод Браше. Иммуногистохимическое исследование поражений осуществляли высокочувствительным двухступенчатым авидин-биотиновым методом с применением панели моноклональных антител, направленных против: CD3, CD4, CD8, CD68, CD163 (с целью изучения состояния иммунорегуляторного и

эффекторного звеньев иммунитета); новой линии дифференцировки Т-хелперов: Th17 клеток, а также клеток продуцирующих ключевые интерлейкины в бляшке: IL-17, IL-18, INF-y, TNF-a, IL-4.

Микрофотографии получали с использованием цифровой фотокамеры «Leica» DFC 420 (Германия) и компьютерной программы «Leica Application Suite Version 3.4.0» (Германия).

Морфометрический анализ осуществляли в следующих зонах сосудистой стенки: в интиме нормальных участков артерий, в зонах интимы под липидным пятном, в фиброзной покрышке нестабильных и стабильных бляшек, в их атероматозных ядрах, а также в участках адвентиции подлежащих под соответствующими атеросклеротическими поражениями. Подсчеты производили без морфометрической сетки в десяти полях зрения при увеличении х600 под микроскопом Olympus CX41 (Япония). Статистический анализ полученных данных проводился с использованием компьютерной программы Statistica Version 10. Значимость различий между изучаемыми выборками определяли с помощью Т-критерия Стьюдента.

Положения, выносимые на защиту:

1. Классифицированы и охарактеризованы обобщенные типы нестабильных и стабильных атеросклеротических поражений сосудистой стенки. Обнаружена новая форма прогрессирующей нестабильной атеросклеротической бляшки.

2. Определены деструктивные изменения эластико-коллагенового каркаса и резкое снижение числа гладкомышечных клеток в нестабильных атеросклеротических поражениях.

3. В интиме и адвентиции нестабильных атеросклеротических поражений выявлены многочисленные мононуклеарно-клеточные инфильтраты, состоящие из малых, средних лимфоцитов и макрофагов.

4. Установлено, что при формировании нестабильного атеросклеротического поражения в эндотелиальных клетках наблюдается выраженная экспрессия

мощного хемоаттрактанта IL-8, который способствует проникновению мононуклеаров в интиму сосудистой стенки.

5. Показано, что основными клеточными популяциями, проникающими в стенку артерий, являются лимфоциты и макрофаги. Лимфоидная популяция представлена в основном Т-лимфоцитами (CDB-клетками), среди которых преобладают T-хелперы (CD4-клетки). Выявлено, что во всех видах атеросклеротических поражений количественное содержание Т-лимфоцитов преобладает над численностью макрофагов. Предполагается, что возможным источником Т-лимфоцитов в сосудистой стенке могут быть регионарные к ней парааортальные лимфатические узлы.

6. Установлено, что наблюдаемые дегенеративные изменения в нестабильных поражениях могут быть связаны с действием провоспалительных цитокинов.

7. Изучена роль проатерогенного Th1-иммунного ответа при формировании нестабильных атеросклеротических поражений. Установлено, что баланс между про- и анти-воспалительными клетками и продуцируемыми ими цитокинами в очагах иммунного воспаления оказывает важное влияние на развитие атеросклероза, его активацию и прогрессирование.

Степень достоверности и апробация результатов. Высокая степень достоверности результатов обеспечена большим объемом архивного материала. Исследовано 345 образцов ткани, полученных из различных отделов аорты, коронарных артерий, a. basilaris и парааортальных лимфатических узлов. В работе использованы современные гистологические и иммуногистохимические методы исследования, а также корректные методы морфометрического и статистического анализа данных.

Результаты диссертационной работы были представлены в качестве устных докладов на III Всероссийской молодежной конференции с международным участием «Нейробиология интегративных функций мозга», посвященной 100-летию Физиологического общества им. И. П. Павлова (Санкт-Петербург, 2017), Всероссийской научной конференции с международным участием «Актуальные

вопросы морфогенеза в норме и патологии», ФГБНУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» (Москва, 2018).

По материалам диссертации опубликовано 16 работ, из которых 16 являются статьями, опубликованными в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Личное участие автора в получении результатов. Планирование, подготовка и проведение исследования, обработка гистологического материала, изготовление гистологических срезов, проведение гистохимических окрасок препаратов и постановка иммуногистохимических реакций, получение микрофотографий, проведение морфометрической и статистической обработки полученных данных и их анализ, интерпретация результатов, их обсуждение и обобщение выполнены лично автором.

Структура и объём диссертации. Работа построена по традиционному плану и включает введение, обзор литературных данных, описание материалов и методов исследования, изложение экспериментальных результатов, их обсуждение и выводы. Работа изложена на 195 страницах, содержит 1 таблицу и 77 иллюстраций, в том числе 2 рисунка, 25 графиков и 50 микрофотографий. Библиографический указатель содержит 224 источника, в том числе 53 - на русском языке и 171 - на иностранных языках.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Морфологическая характеристика различных типов атеросклеротических поражений

Известно, что атеросклеротические поражения встречаются в артериях мышечно-эластического типа крупного и среднего калибра, причем та или иная артерия поражается не тотально, а отдельными очагами. Более того, имеются «излюбленные» места, которые в первую очередь вовлекаются в процесс, например устья межреберных артерий, выходящих из аорты. В одних случаях поражения развиваются раньше, в других - позже, но прежде всего и чаще они появляются в жизненно важных артериях, таких, как аорта, коронарные артерии сердца и артерии головного мозга (French, 1970; Климов, 1987; Pelisek et al., 2016).

Атеросклеротические изменения впервые возникают в аорте и в некоторых из ее главных ветвей. Изменения распространяются всюду по направлению от проксимальных (более близко расположенных к сердцу) отделов системы артерий к ее периферическим разветвлениям. Первые изменения в виде липидных пятен и бляшек появляются всегда в главном стволе на местах отхождения боковых ветвей. В дальнейшем обычно в главном артериальном стволе видны развитые фиброзные атеросклеротические бляшки, а в его ветвях - только липидные пятна или образующиеся из них бляшки на разных стадиях развития (Poredos et al., 2018).

Частота появления атеросклеротических изменений в отдельных областях артериальной системы не совпадает со степенью их развития в тех же областях. Например, изменения в начальной части аорты, а также в aa. carotis, pulmonalis и brachialis наблюдается очень часто, но развиваются они относительно медленно и в большинстве случаев не достигают резкой степени развития. Наоборот, в других артериях атеросклеротические изменения появляются сравнительно поздно, а если и наблюдаются в молодом возрасте, то выражены слабо, однако, начиная с определенного возраста (50-60 лет), они начинают быстро прогрессировать и в

пожилом возрасте бывают выражены очень резко, например, в брюшной части аорты. Наконец, в других артериях атеросклеротические изменения развиваются довольно равномерно и достигают особенно резкой степени в 60-70 лет (венечные артерии сердца, мозговые артерии) (Аничков, 1940).

Позднее Fox и Hugh (1966), Texon (1972, 1977) разработали гемодинамическую теорию атеросклероза на основании изучения законов динамики жидкости, математического компьютерного анализа, экспериментов на животных и изучения изменения сосудистой конфигурации. Они рассматривают изменения гемодинамики как первичный фактор в развитии атеросклероза, полагая, что только за счет этого происходит образование и прогрессирующее развитие атеросклеротических поражений в специфических зонах, характеризующихся искривлениями, сужениями, отхождением боковых ветвей. Общей картиной таких изменений является образование очаговых сегментальных зон, в которых повышается давление плазмы и усиливается присасывание липопротеидов (Анестиади, Нагорнев, 1982).

Липидные пятна появляются, прежде всего, у клапанов и мест отхождения боковых ветвей, где кроме гемодинамических завихрений тока крови имеются еще и валикообразные утолщения интимы артерий с более рыхлым строением, что создает благоприятные условия для отложения липопротеидов.

Атеросклеротические бляшки формируются на месте образования липидных пятен в той же последовательности, т. е. вначале там, где, прежде всего, наблюдалось образование липидных пятен, а именно у устий крупных ветвей дуги аорты, рубца боталова протока, на задней стенке грудного отдела в зоне межреберных артерий или между ветвями в брюшном отделе аорты. В венечных артериях сердца отмечается такая же закономерность - от проксимального отдела к дистальному. Интересно отметить, что в основной артерии мозга, образующиеся и сливающиеся между собой бляшки, иногда занимают до двух третей поверхности артерии, но резкого сужения просвета при этом не наблюдается;

наоборот, такие артерии выглядят даже несколько расширенными (Анестеади, Нагорнев, 1982).

Начальные морфологические проявления атеросклероза тесно связаны с нарушением проницаемости эндотелиального барьера. К ним относятся прежде всего разрыхление и исчезновение защитного полисахаридного слоя эндотелиального покрова артерий - гликокаликса, расширение межэндотелиальных пространств, увеличение количества кавеол и везикул в эндотелиальных клетках, указывающее на возросшую активность эндотелия. Затем, в эндотелиальных клетках отчетливо выступают эндоплазматическая сеть, пластинчатый комплекс и митохондрии. Наряду с изменениями в эндотелии отмечаются и перестройки в мезенхимной ткани интимы. Описанные изменения приводят в целом к усиленной инфильтрации интимы плазменными липопротеидами (Климов, 1987; Гордиенко, Сердюков, 2020).

В зависимости от проявлений атеросклеротические поражениия делят на три основных типа: 1. липидные пятна и полоски; 2. атеросклеротические бляшки и 3. осложненные поражения (Вихерт, 1982).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Снегова Влада Андреевна, 2022 год

норма

липидное пятно

нестаб. бляшка

стаб. бляшка

7

6

5

4

3

2

1

0

Рисунок 33. Количественное содержание плазматических клеток в норме и в различных типах атеросклеротических поражений интимы артерий.

В отличие от лимфоидных клеток, содержание макрофагов в интиме нестабильной атеросклеротической бляшки, существенно не отличается от их численности в нормальных участках артерий. Однако выявлено заметное возрастание числа макрофагов в нестабильных поражениях в 2,5 раза (р<0,05) по сравнению со стабильными атеросклеротическими бляшками (Рисунок 34).

Рисунок 34. Количественное содержание макрофагов в норме и в различных типах атеросклеротических поражений интимы артерий.

Различия по содержанию лимфоцитов в адвентиции не так ярко выражено, как в интиме. Но, тем не менее, имеется тенденция к увеличению их числа в подлежащих участках адвентиции под нестабильными атеросклеротическими поражениями. Так, количество малых и средних и лимфоцитов в зоне под нестабильной бляшкой в 1,6 раза превысило их содержание в таких же участках, как в норме, так и зонах под стабильным атеросклеротическим поражением (Рисунок 35).

Адвентиция. Малые и средние лимфоциты

т о а й

ч и

Я

О

я

о

о т н о

сг я

ч о

и

60

50

40

30

20

10

-г

1—

1-

норма липидное пятно нестаб.бляшка стаб.бляшка

0

Рисунок 35. Количественное содержание малых и средних лимфоцитов в адвентиции в норме и в различных типах атеросклеротических поражений.

Интересно, что численность лимфобластов в адвентиции нормальных

участков сосудистой стенки заметно увеличена. Например, наблюдается

возрастание числа этих клеток в норме в 2,9 раза (р<0,05) по сравнению с начальной стадией поражения, в 1,3 раза по сравнению с участками адвентиции под нестабильной бляшкой и в 2,4 раза по сравнению с участками под стабильным атеросклеротическим поражением. Одновременно отмечается тенденция к увеличению числа лимфобластов в подлежащих участках адвентиции под нестабильными атеросклеротическими поражениями. Так, количество этих клеток в зоне адвентиции под нестабильной бляшкой в 2,2 раза выше по сравнению с начальной стадией поражения и в 1,8 раза по сравнению с участками адвентиции под стабильной бляшкой (Рисунок 36).

Адвентиция. Лимфобласты.

5 4 3 2

-1-

липидное пятно

нестаб. бляшка

стаб. бляшка

6

1

о

норма

Рисунок 36. Количественное содержание лимфобластов в адвентиции в норме и в различных типах атеросклеротических поражений.

Численность плазматических клеток в участках адвентиции под нестабильной бляшкой не имеет существенных различий по сравнению с нормой и со стабильной бляшкой. Однако их количество заметно возрастает в участке адвентиции под нестабильным поражением в 2,7 раза (р<0,05) по сравнению с участками, находящимися под липидным пятном (Рисунок 37).

Адвентиция. Плазматические клетки.

и

& 4

н о

1) Л

эт

X «

н 8

-Г

норма липидное пятно нестаб.бляшка стаб.бляшка

5

3

2

0

Рисунок 37. Количественное содержание плазматических клеток в адвентиции в норме и в различных типах атеросклеротических поражений.

В отличие от лимфоидной клеточной популяции, в адвентиции всех типов изученных атеросклеротических поражений выявлено существенное снижение количества макрофагов (от 1,7 до 3,3 раза), по сравнению с нормальными участками сосудистой стенки (Рисунок 38).

Рисунок 38. Количественное содержание макрофагов в адвентиции в норме и в различных типах атеросклеротических поражений.

При морфометрическом анализе атероматозного ядра нестабильных и стабильных атеросклеротических поражений заметного увеличения числа клеток лифоидной популяции и макрофагов выявлено не было.

Таким образом, при морфометрическом анализе по дифференциации клеточных форм, выявлено, что основную долю клеток, составляющих

мононуклеарные инфильтраты, как в интиме, так и в адвентиции артерий в норме и во всех типах атеросклеротических поражений, составляют малые и средние лимфоциты. Было показано, что в нестабильных атеросклеротических поражениях лимфоидная клеточная популяция преобладает над макрофагами. В результате исследования было установлено, что при формировании нестабильной атеросклеротической бляшки основную роль играют малые и средние лимфоциты, а также лимфобласты. Что возможно связано с развитием в сосудистой стенке клеточного иммунного ответа по Т-типу. Признаков развития В-иммунного ответа, напротив, не наблюдается. Содержание плазматических клеток, как в норме, так и на всех стадиях формирования атеросклеротических поражений незначительно и неподвержено изменениям. Численность макрофагов во всех атеросклеротических поражениях значительно снижена, что может говорить об их частичной трансформации в пенистые клетки в процессе развития атеросклероза. Установлен интересный факт увеличения численности лимфобластов в адвентиции нормальных участков сосудистой стенки. Однако этот вопрос еще недостаточно изучен и требует дальнейшего всестороннего исследования.

4.5. Иммуногистохимический и морфометрический анализ популяций лимфоцитов и макрофагов в сосудистой стенке человека

Как было отмечено ранее, в составе мононуклеарно-клеточных инфильтратов нестабильных атеросклеротических поражений преобладают различной степени зрелости лимфоидные клетки и макрофаги.

Проведенный иммуногистохимический анализ показал, что лимфоидные клетки представлены в основном Т-лимфоцитами (СОЭ-клетками), в то время как В-лимфоциты либо единичны, либо отсутствуют совсем. При этом СЭЭ-клетки выявляются как в поверхностных, так и в более глубоких отделах покрышки нестабильной атеросклеротической бляшки (Рисунок 39 а, б).

Рисунок 39. Т-лимфоциты (CD3) (стрелки) в поверхностных (а) и более глубоких (б) отделах покрышки нестабильной атеросклеротической бляшки. Иммунопероксидазный метод. Увеличение а, б - х 600.

Особенно яркие картины наблюдаются в поврежденных участках интимы a. basilaris, где обнаруживаются многочисленные Т-клетки (Рисунок 40).

Рисунок 40. Многочисленные Т-лимфоциты (CD3) в поверхностных (указано стрелками) отделах поврежденной интимы нестабильной атеросклеротической бляшки в a. basilaris. Иммунопероксидазный метод. Увеличение х 700.

В самом атероматозном ядре нестабильной атеросклеротической бляшки Т-лимфоциты не выявляются (Рисунок 41).

Рисунок 41. Отсутствие Т-лимфоцитов (CD3) в атероматозном ядре нестабильной атеросклеротической бляшки. Иммунопероксидазный метод. Увеличение х 450.

В стабильных атеросклеротических поражениях Т-лимфоциты обнаруживаются

либо в незначительном количестве, либо отсутствуют совсем (Рисунок 42).

Рисунок 42. Полное отсутствие CD3 клеток в покрышке стабильной атеросклеротической бляшки. Иммунопероксидазный метод. Увеличение х 200.

Морфометрическое исследование сосудистой стенки показало, что по мере формирования атеросклеротических поражений количество Т-лимфоцитов заметно увеличивается как в интиме, так и в адвентиции артерий. Так, в интиме на начальной стадии поражения число Т-лимфоцитов возрастает в 1,8 раза, а в нестабильной бляшке их численность увеличивается в 3,7 раза (p<0,05) по сравнению с нормой. Кроме этого, в интиме нестабильного поражения содержание Т-лимфоцитов оказалось в 3,1 раза (p<0,05) выше по сравнению со стабильной бляшкой и в 2 раза (p<0,05) по сравнению с липидным пятном (Рисунок 43).

Т-лимфоциты в интиме

я

Я «

о я

Р Я

о

и

я

я

ч

з

80 70 60 50 40 30 20

10

норма

липидное пятно нестабильная бляшка стабильная бляшка

0

Рисунок 43. Количественное содержание Т-лимфоцитов в интиме артерий.

В отличие от нестабильного поражения, заметного увеличения численности Т-лимфоцитов в стабильной атеросклеротической бляшке по сравнению с нормой не наблюдалось (Рисунок 43).

Аналогичная закономерность в отношении содержания Т-лимфоцитов была выявлена в участках адвентиции, располагающихся под атеросклеротическими поражениями. Так, в участках адвентиции под нестабильным атеросклеротическим поражением численность Т-лимфоцитов возрастала в 4,5 раза (р<0,05) по сравнению с нормой и в 2,3 раза по сравнению со стабильной бляшкой и липидным пятном (Рисунок 44).

Т-лимфоциты в адвентиции

35 30 25 20 15 10 5 0

Г1-! г-н

Г*~1

липидное пятно

нестабильная бляшка стабильная бляшка

Рисунок 44. Количественное содержание Т-лимфоцитов в адвентиции артерий.

Общая популяция Т-лимфоцитов представлена двумя основными иммунорегуляторными субпопуляциями: CD4 (хелперными) и CD8 (супрессорными/цитотоксическими) клетками. При иммуногистохимическом анализе изучаемых поражений удалось установить, что хелперные CD4-лимфоциты в повышенном количестве обнаруживаются в поверхностных отделах поврежденной интимы нестабильной бляшки (Рисунок 45а), а также в районе деструкции и отслоения ее покрышки (Рисунок 45б). В стабильных атеросклеротических поражениях они обнаружены не были (Рисунок 45в).

% 4 * ■ t v у/ л Д \ , . * ■ . \ 1

' * if * 1 t

а Ц

'Ш, 'i. • vHk I. * '■ 'if ' . i

Ь. t * * ; f*. у /

\ k B": . ♦ V Л " У V' J t

б ■ i '

Рисунок 45. а - СЭ4-клетки (стрелки) в районе дегенерирующей интимы нестабильной атеросклеротической бляшки; б - СЭ4-клетки (стрелки) в районе отслоения покрышки нестабильной атеросклеротической бляшки; в - отсутствие СЭ4 лимфоцитов в фиброзной покрышке стабильной атеросклеротической бляшки. Иммунопероксидазный метод. Увеличение а, б, в - х 350.

В отличие от Т-лимфоцитов хелперов, в интиме нестабильных атеросклеротических поражений выявлялись лишь единичные СЭ8-клетки (Рисунок 46).

/

Рисунок 46. CD8 - клетка (стрелка) в поверхностном отделе поврежденной покрышки нестабильной бляшки. Иммунопероксидазный метод. Увеличение х 400.

Помимо Т-лимфоцитов, при формировании нестабильных атеросклеротических поражений важную, и иногда негативную роль, играют макрофаги. Считается, что эти клетки способствуют поверхностной эрозии бляшки с последующим ее разрывом и образованием тромба, вызывая деградацию внеклеточного матрикса с помощью сильных протеолитических ферментов.

Проведенный иммуногистохимический анализ различных типов атеросклеротических поражений в артериях человека показал, что отличительной особенностью интимы нестабильной бляшки является наличие в них большого количества макрофагов (CD68-клеток) (Рисунок 47).

Рисунок 47. Многочисленные макрофаги в субэндотелиальном слое интимы нестабильной атеросклеротической бляшки. Иммунопероксидазный метод. Увеличение х 700.

Однако в соединительнотканной фиброзной покрышке стабильного атеросклеротического поражения выявлялись либо единичные макрофаги, либо они отсутствовали совсем (Рисунок 48).

Рисунок 48. Отсутствие макрофагов в покрышке стабильной атеросклеротической бляшки. Иммунопероксидазный метод. Увеличение х 600.

При морфометрическом исследовании сосудистой стенки удалось установить заметное увеличение численности макрофагов, как в интиме, так и в адвентиции артерий. Их количество оказалось значительно выше в интиме нестабильной бляшки в 21 раз (р<0,05) по сравнению с нормой, в 1,3 раза по сравнению с липидным пятном и в 2,4 раза по сравнению со стабильным атеросклеротическим поражением. Наряду с нестабильной бляшкой, увеличение числа макрофагов было выявлено на начальной стадии поражения в 15,8 раза (р<0,05) по сравнению с нормой и в 1,8 раза по сравнению со стабильным поражением. Интересно, что в интиме стабильной атеросклеротической бляшки также наблюдалось увеличение численности макрофагов в 8,6 раза (р<0,05) по сравнению с нормой (Рисунок 49).

Макрофаги в интиме

I

норма липидное пятно нестабильная бляшка стабильная бляшка

Рисунок 49. Количественное содержание макрофагов в интиме артерий.

Параллельно с интимой, в зонах адвентиции расположенных под липидным пятном и нестабильной бляшкой выявлено увеличение количества макрофагов (от 6,8 до 5,2 раза) по сравнению с нормальными участками сосудистой стенки (Рисунок 50).

Одновременно увеличение числа макрофагов наблюдалось и в адвентиции стабильного атеросклеротического поражения в 10 раз (р<0,05) по сравнению с

й

0 ^

^ а

« я 8 £

ё = я я

1 3

5 о.

о эт

° X!

й *

40 35 30 25 20 15 10

сг я ч о И

5

0

нормой, в 1,5 раза по сравнению с липидным пятном и в 1,9 раза по сравнению с нестабильной бляшкой (Рисунок 50).

Рисунок 50. Количественное содержание макрофагов в адвентиции артерий.

Параллельный иммуногистохимический анализ сосудистой стенки позволил выявить еще одну субпопуляцию макрофагов СВ163-клетки, которые обладают атеропротективной функцией. Такие клетки были обнаружены преимущественно на ранних стадиях развития атеросклеротических бляшек, а также в стабильных поражениях (Рисунок 51).

Рисунок 51. Макрофаг CD163 (стрелка) на границе интимы и медии под стабильной атеросклеротической бляшкой. Иммунопероксидазный метод. Увеличение х 700.

Данные о количественном соотношении макрофагов/лимфоцитов в нестабильных бляшках разнятся. Одни авторы связывают степень нестабильности поражения, изъязвленность ее покрышки и последующий разрыв с выраженностью макрофагальной инфильтрации. Другие, напротив, отдают приоритет в этих процессах Т-лимфоцитам.

Проведенный нами сравнительный анализ общей численности Т-лимфоцитов и макрофагов позволил установить факт преобладания первых над вторыми во всех видах атеросклеротических поражений. Так, в нормальной интиме сосудов содержание Т-лимфоцитов было выше в 10,7 раза (р<0,05) по сравнению с макрофагами, в липидном пятне в 1,2 раза, в нестабильной бляшке в 2 раза и в стабильной в 1,5 раза (Рисунок 52).

Т-лимфоциты и макрофаги в интиме

о н к я

о

-е-

К

ч

•е

о

к

ч

3

80 70 60 50

«

| 40 &

й

30 20 10 0

■

И

"П 1н

□ лимфоциты

□ макрофаги

ноРма липидное пятно нестабильная бляшка стабильная бляшка

Рисунок 52. Количественное содержание Т-лимфоцитов и макрофагов в интиме артерий.

В еще более выраженной степени эта закономерность выявлялась в соответствующих участках адвентиции. Так, в нормальных участках сосудистой стенки численность Т-лимфоцитов преобладала над макрофагами в 11,4 раза, в липидном пятне в 3,2 раза, в нестабильной бляшке в 9,8 раза (р<0,05) и в стабильном поражении в 2,2 раза (Рисунок 53).

Лимфоциты и макрофаги в адвентиции

к я

о

•е 8 к ч

к

и &

И К

£ £

§ & с й

к

ч

3

о

35 30 25 20 15 10 5 0

а

□ лимфоциты

□ макрофаги

норма липидное пятно нестабильная бляшка стабильная бляшка

Рисунок 53. Количественное содержание Т-лимфоцитов и макрофагов в адвентиции артерий.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что основными клеточными популяциями, проникающими в стенку артерий, являются лимфоциты и макрофаги. Первые представлены в основном субпопуляцией Т-лимфоцитов, среди которых преобладают хелперные СЭ4-клетки. Известно, что эти клетки, наряду с макрофагами, обеспечивают развитие иммуновоспалительных реакций. В результате проведенного иммуноморфологического и морфометрического анализа мононуклеарных инфильтратов было обнаружено, что при формировании атеросклеротического поражения количество Т-лимфоцитов и макрофагов заметно увеличивается как в интиме, так и в адвентиции артерий. Взаимодействие Т-лимфоцитов и макрофагов при формировании атеросклеротического поражения приводит к полноценному иммунному ответу в сосудистой стенке, что может способствовать дестабилизации атеросклеротической бляшки. Согласно полученным результатам нами выявлено, что во всех видах атеросклеротических поражений количественное содержание Т-лимфоцитов преобладает над численностью макрофагов. Установление этого факта может поставить точку в многолетнем споре исследователей о численном превосходстве одной из этих двух основных

клеточных популяций при развитии воспалительного процесса в сосудистой стенке.

4.6. Иммуноморфологическое исследование парааортальных лимфатических

узлов

Как было отмечено выше, при формировании нестабильной атеросклеротической бляшки основную роль играют малые и средние лимфоциты, а также лимфобласты, что возможно связано с развитием в кровеносных сосудах клеточного иммунного ответа по Т-типу. На основании этих данных нами была выдвинута гипотеза о том, что возможным источником Т-лимфоцитов в сосудистой стенке могут быть регионарные к ней парааортальные лимфатические узлы.

Проведенное нами гистологическое исследование парааортальных лимфатических узлов, регионарных к аорте, содержащей нестабильные поражения, показало резкое увеличение численности посткапиллярных венул по сравнению с нормальным узлом (Рисунок 54).

Рисунок 54. Резкое увеличение численности посткапиллярных венул, заполненных эритроцитами в парааортальном лимфатическом узле, регионарном к аорте с нестабильными поражениями (б), по сравнению с нормальным узлом (а). Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение а, б - х 550.

Такие морфологические изменения указывают на возросшую миграционную активность и усиленную рециркуляцию лимфоидных клеток в ткань парааортального лимфатического узла.

При гистологическом анализе коры и мозгового слоя парааортального лимфатического узла, регионарного к участку аорты с нестабильными атеросклеротическими поражениями, наблюдались многочисленные лимфобласты (Рисунок 55).

Рисунок 55. Многочисленные лимфобласты (стрелки) в коре (а) и мозговом слое (б) парааортального лимфатического узла, регионарного к участку аорты с нестабильными атеросклеротическими бляшками. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение а, б - х 550.

Скопление этих клеток в лимфатическом узле может свидетельствовать об активной пролиферации и развитии реактивных процессов, приводящих к формированию Т-иммунного ответа. Следует предположить, что такая активация Т-зоны парааортальных лимфатических узлов может рассматриваться как иммунологическая реакция, направленная против атерогенных модифицированных ЛПНП, накапливающихся в сосудистой стенке.

Как было установлено ранее, в нестабильных атеросклеротических бляшках мононуклеарно-клеточные инфильтраты состоят преимущественно из различной степени зрелости лимфоидных клеток (малых и средних лимфоцитов) и макрофагов. В свою очередь лимфоидная клеточная популяция представлена в основном Т-лимфоцитами (СЭЭ-клетками). Аналогично сосудистой стенке, при иммуногистохимическом анализе, в паракортикальной зоне парааортального

лимфатического узла выявлялись многочисленные Т-лимфоциты (СЭ3-клетки) (Рисунок 56).

Рисунок 56. СЭ3 лимфоциты в паракортикальной зоне парааортального лимфатического узла. Иммунопероксидазный метод. Увеличение х 600.

Помимо Т-лимфоцитов, в корковом веществе парааортального лимфатического узла, регионарного к участку аорты с нестабильными атеросклеротическими поражениями, наблюдались многочисленные макрофаги (СБ68-клетки) (Рисунок 57).

Рисунок 57. Многочисленные макрофаги в корковом веществе парааортального лимфатического узла, регионарного к участку аорты с нестабильными атеросклеротическими поражениями. Иммунопероксидазный метод. Увеличение х 750.

Как было показано выше, среди Т-лимфоцитов (СЭЗ-клетки) в сосудистой стенке преобладает в основном субпопуляция Т-хелперных лимфоцитов (СЭ4-клетки). При иммуногистохимическом анализе коркового вещества парааортального лимфатического узла, регионарного к участку аорты с нестабильными атеросклеротическими бляшками, были выявлены СЭ4-лимфоциты и многочисленные БОХРЗ (СВ4+СВ25)-клетки (Рисунок 58).

Рисунок 58. СБ4 - лимфоциты (стрелки) (а) и многочисленные БОХРЗ (СБ4 + СЭ25) - клетки (стрелки) (б) в корковом веществе парааортального лимфатического узла, регионарного к участку аорты с нестабильными атеросклеротическими бляшками. Иммунопероксидазный метод. Увеличение а, б - х 600.

Таким образом, настоящее исследование подтверждает выдвинутую нами ранее гипотезу о том, что возможным источником Т-лимфоцитов в сосудистой стенке могут быть регионарные к ней парааортальные лимфатические узлы. С помощью гистологического исследования было показано резкое увеличение численности посткапиллярных венул, указывающее на возросшую миграционную активность и усиленную рециркуляцию лимфоидных клеток в ткань парааортального лимфатического узла, регионарного к участку аорты с нестабильными атеросклеротическими поражениями. Показано, что в парааортальном лимфатическом узле, регионарному к сосудистой стенке с нестабильными бляшками, увеличена численность лимфобластов, что может свидетельствовать об активной пролиферации и развитии реактивных процессов, способствующих формированию Т-иммунного ответа. С помощью иммуногистохимического анализа, установлено, что, как и в сосудистой стенке, в парааортальном лимфатическом узле популяция лимфоцитов, представлена в основном Т-лимфоцитами (СЭ3-клетками) и макрофагами (СВ68-клетками). Одновременно было показано, что в парааортальном лимфатическом узле среди Т-лимфоцитов преобладает субпопуляция Т-лимфоцитов хелперов (СЭ4-клеток), что может свидетельствовать об инициировании этими клетками аутоиммунного ответа к мЛПНП.

4.7. Морфометрическое исследование Th-1 и Th-2-клеток в сосудистой стенке

при атерогенезе

Как было показано выше, Т-лимфоциты, инфильтрирующие атеросклеротические поражения, представлены в основном CD4+ клетками. Однако, согласно самым последним данным, Т-хелперные лимфоциты не являются однородной популяцией и разделяются на две субпопуляции: Th1 и Th2 клетки. Предполагается, что они выполняют противоположные функции в стенке артерий и, прежде всего, в отношении мЛПНП. Суммируя основные свойства этих клеток, следует отметить, что Th1 Т-лимфоциты секретируют IFN-y, TNFa, IL-2 и включаются в активацию макрофагов с последующим провоспалительным эффектом. Th2 Т-лимфоциты синтезируют IL-4, IL-5, IL-10 и стимулируют продукцию В-лимфоцитами антител. Th1 и Th2 лимфоциты в сосудистой стенке -ключ к возможному в дальнейшем управлению иммунным ответом при атерогенезе.

Микроскопическое исследование препаратов показало, что изучение экспрессии в сосудистой стенке INF-у и IL-4 необходимо проводить отдельно в двух клеточных формах: в округлой формы мононуклеарных клетках и в вытянутых звездчатых клетках.

Анализ содержания в интиме аорты человека INF-у позитивных клеток показал, что уже на начальной стадии атерогенеза численность мононуклеаров с этим цитокином в цитоплазме возрастает в 7 раз (p<0,05), по сравнению с нормальными участками сосуда. Столь же высокое их содержание сохраняется и на следующей стадии атеросклероза - в липидно-фиброзных бляшках. А в выраженных фиброзных бляшках с мощной соединительнотканной покрышкой количество таких мононуклеаров снижается до нормального уровня (Таблица 1).

Таблица 1.

Содержание иммунорегуляторных лимфоцитов и макрофагов, экпрессирующих различные цитокины в интиме аорты человека.

Характер поражения интимы аорты. Среднее количество клеток в 10-ти полях зрения.

С экспрессией ЮТ-у С экспрессией 1Ь-4 СБ3- клетки СБ20- клетки СБ68- клетки

Мононук леары Звездчатые клетки Мононук леары Звездчатые клетки

Нормальный участок сосуда 2,5±1,4 5,3±2,0 10,7±3,9 10,6±3,5 26,0±1,7 1,3±0,5 23,0±5,9

Липидное пятно 18,0±6,7 43,8±6,0 7,3±2,4 36,0±8,6 22,3±4,2 0,5±0,3 62,7±19,5

Липидно- фиброзная бляшка 17,5±8,4 38,0±8,9 1,3±0,5 4,5±1,8 32,8±6,8 0,5±0,3 55,2±9,5

Фиброзная бляшка 2,0±0,5 64,0±18,0 4,0±1,2 0 24,7±10.2 3,0±1,7 33,3±5,7

Сходная закономерность отмечается и в отношении вытянутой формы с многочисленными отростками звездчатых клеток, цитоплазма которых оказывается заполнена ЮТ-у. На стадии липидного пятна и липидно-фиброзной бляшки численность таких клеток в зоне поражений увеличивается в 8 раз (р<0,05), а на стадии выраженной фиброзной бляшки - в 12 раз (р<0,05), по сравнению с нормальными участками сосуда (Таблица 1).

Важно отметить, что мононуклеарные клетки округлой формы, экспрессирующие ЮТ-у, вероятно представляют собой истинные ТЫ-лимфоциты, в то время как природа звездчатых клеток остается до конца невыясненной. Мы предполагаем, что, по крайней мере, часть из них относится к дендритным клеткам, которые могут активно вовлекаться, согласно последним данным, в иммунные механизмы развития атеросклероза.

Полученные факты свидетельствуют о том, что, начиная с ранней стадии атерогенеза в атеросклеротических поражениях накапливаются клетки, продуцирующие провоспалительные цитокины, способствующие развитию ТЫ -иммунного ответа.

При изучении распределения !Ъ-4, за одним исключением, выявлена противоположная закономерность. По мере прогрессирования заболевания численность мононуклеаров, экспрессирующих в своей цитоплазме 1Ь-4 снижается и в липидно-фиброзных и фиброзных бляшках падает более чем в 2 раза (р<0,05), по сравнению с нормальными участками сосуда (Таблица 1). По сути, такой же процесс наблюдается и в звездчатых клетках. Так, в фиброзных бляшках !Ь-4 позитивных звездчатых клеток не удалось обнаружить вообще, а в липидно-фиброзных бляшках их количество было снижено в 2 раза (р<0,05), по сравнению с нормальным уровнем. Исключение составила самая ранняя стадия атерогенеза. В липидных пятнах численность этих клеток возрастала в 3 раза (р<0,05), по сравнению с нормой (Таблица 1). Почему на ранней стадии заболевания дендритные клетки одновременно демонстрируют высокую про- и противовоспалительную активность остается пока загадкой.

В целом, полученные результаты показывают, что в атеросклеротических поражениях, начиная с самых ранних стадий, превалируют ТЫ лимфоциты и звездчатые клетки, экспрессирующие мощный провоспалительный цитокин -ЮТ-у. Этот цитокин (вместе с !Ь-2 и Т№а) может вызывать активацию макрофагов и других клеток сосудистой стенки и запускать в ней воспалительный процесс. Численность популяции ^2 клеток на всех стадиях атерогенеза, кроме самой ранней, напротив, оказывается сниженной, а продукция противовоспалительного цитокина - 1Ь-4 подавленной.

Морфометрическое исследование макрофагов показало, что в липидных пятнах их количество возрастает в 2,7 раза (р<0,05), а в липидно-фиброзных бляшках - в 2,4 раза (р<0,05), по сравнению с нормальными участками сосуда. И лишь на стадии выраженных фиброзных бляшек численность макрофагов падает

и приближается к норме (Таблица 1). Не приходится сомневаться, что увеличение числа макрофагов в начальных стадиях атерогенеза происходит как за счет их миграции из тока крови, так и за счет их пролиферации in situ. Большая часть этих макрофагов в дальнейшем трансформируется в пенистые клетки, которые и составят основу бляшки. А меньшая их часть, несущая MHC белки класса I (так же, как и звездчатые клетки) будет участвовать в презентации антигенов мЛПНП, что приведет к активации CD4+ клеток, являющихся промоторами Th1 и Th2 иммунного ответа.

Таким образом, удалось установить, что в атеросклеротических поражениях, начиная с самых ранних стадий, накапливаются Th1 лимфоциты и звездчатые клетки, экспрессирующие INF-у и развивается проатерогенный Th1-иммунный ответ, при одновременном падении численности Th2 клеток, синтезирующих противовоспалительный IL-4. По мере прогрессирования атеросклероза, особенно в начальных стадиях, в интиме аорты резко увеличивается содержание макрофагов, большая часть из которых превращается в пенистые клетки, а меньшая, также, как и дендритные клетки, участвует в презентации антигенов. Обнаруженные изменения, по всей видимости, являются ответом на откладывающиеся в сосудистой стенке человека различные модификации липопротеинов низкой плотности. Таким образом, баланс между про- и анти-воспалительными клетками в очагах иммунного воспаления оказывает важное влияние на развитие атеросклероза, его активацию и прогрессирование.

4.8. Влияние про- и антивоспалительных цитокинов на формирование

атеросклеротических поражений 4.8.1 Интерлейкин - 17 (1Ь-17)

Продуцирующие 1Ь-17 Т-хелперы (ТЫ7) - недавно открытая популяция лимфоцитов, играющая ключевую роль в развитии аутоиммунных заболеваний. Однако роль ТЫ7 клеток и 1Ь-17 в атерогенезе однозначно не определена.

Нами впервые был осуществлен иммуногистохимический и морфометрический анализ эндотелиальных и мононуклеарных клеток, экспрессирующих 1Ь-17, в интиме и адвентиции артерий на разных стадиях формирования нестабильных атеросклеротических поражений.

Иммуногистохимический анализ сосудистой стенки показал, что основным местом локализации мононуклеаров, экспрессирующих 1Ь-17, являются места максимальной деструкции интимы нестабильной атеросклеротической бляшки, часто в районе разрыва ее покрышки (Рисунок 59).

Рисунок 59. Мононуклеары, экспрессирующие ГЬ-17 (стрелки) в районе разрыва покрышки нестабильной атеросклеротической бляшки. Иммунопероксидазный метод. Увеличение х 450.

В стабильных поражениях выявлялись либо единичные мононуклеары с 1Ь-17 в цитоплазме, либо они отсутствовали совсем (Рисунок 60).

Рисунок 60. В покрышке стабильной атеросклеротической бляшки мононуклеары, экспрессирующие 1Ь-17 отсутствуют. Иммунопероксидазный метод. Увеличение х 450.

При морфометрическом анализе артерий человека максимальное число эндотелиальных клеток, экспрессирующих 1Ь-17, было выявлено на начальной стадии поражения. Так, их количество в липидном пятне выше в 1,8 раза по сравнению с нормой, в 1,5 раза по сравнению со стабильной бляшкой. Число эндотелиальных клеток, экспрессирующих 1Ь-17, также возрастает в нестабильной атеросклеротической бляшке - в 1,7 раза по сравнению с нормой и в 1,3 раза по сравнению со стабильным поражением. Тенденция к увеличению количества эндотелиальных клеток с 1Ь-17 в цитоплазме наблюдалась и в стабильной бляшке в 1,2 раза по сравнению с нормой.

Одновременно с эндотелиальными клетками, выявлено существенное увеличение числа мононуклеарных клеток, экспрессирующих 1Ь-17, в интиме нестабильной атеросклеротической бляшки в 2,6 раза (р<0,05) по сравнению с нормальными участками сосудистой стенки. Параллельно их количество возрастает в липидном пятне (в 2,6 раза) и в стабильной бляшке (в 1,3 раза) по сравнению с нормой. Однако в интиме стабильного атеросклеротического

поражения наблюдалось снижение количества мононуклеров с 1Ь-17 в 1,9 раза по сравнению с липидным пятном и нестабильной бляшкой. Численность мононуклеарных клеток, экспрессирующих 1Ь-17, как на начальной стадии поражения, так и в нестабильных участках интимы не различаются между собой (Рисунок 61).

Экспрессия ГЬ-17 в интиме

и

«

к &

к

ч

60 50 40 30 20 10 0

К

□ мононуклеары

□ эндотелиальные клетки

норма липидное пятно нестаб.бл. стаб.бл.

Рисунок 61. Количественное содержание эндотелиальных и мононуклеарных клеток, экспрессирующих 1Ь-17, в норме и в различных типах атеросклеротических поражений интимы артерий.

В адвентиции из клеточных элементов преобладают фибробласты, адипоциты, лимфоциты различной степени зрелости, а также макрофаги. Этот слой играет роль в восстановлении сосудистой стенки, взаимодействуя с интимой, медией и периваскулярным пространством.

Проведенный нами морфометрический анализ участков адвентиции, расположенных под атеросклеротическими поражениями, показал не столь выраженную картину присутствия мононуклеаров, экспрессирующих 1Ь-17, по сравнению с интимой. Но, тем не менее, имеется тенденция к снижению численности клеток с 1Ь-17 (от 1,4 до 1,9 раза) во всех видах атеросклеротических поражений по сравнению с нормальными участками адвентиции (Рисунок 62).

Экспрессия ГЬ-17 в адвентиции

К я

§ £

* 'т ср ^

° и

° о

и н

о и

я 5

и и

у

сУ Й

к к

° о

® с о

70 60 50 40 30 20 10 0

-Г

-1-

ыы

норма липидное пятно нестаб.бляшка стаб.бляшка

Рисунок 62. Количественное содержание мононуклеарных клеток, экспрессирующих 1Ь-17, в норме и в различных типах атеросклеротических поражений в адвентиции артерий.

Таким образом, при иммуногистохимическом и морфометрическом исследовании было показано, что эндотелиальные клетки интимы способны секретировать 1Ь-17 во всех типах атеросклеротических поражений. Одновременно было выявлено увеличение числа мононуклеарных клеток, экспрессирующих 1Ь-17, в интиме артерий. Показано, что максимальное число клеток, экспрессирующих 1Ь-17, обнаруживалось в интиме нестабильного атеросклеротического поражения, особенно часто в районе разрыва ее покрышки. Что может свидетельствовать о провоспалительном действии 1Ь-17 и его существенном влиянии на формирование нестабильных атеросклеротических поражений.

4.8.2 Интерлейкин -18 (IL-18)

Наблюдаемые дегенеративные процессы в нестабильных атеросклеротических бляшках могут быть связаны с опосредованным действием IL-18 за счет индукции синтеза INF-y в Т-лимфоцитах и макрофагах. Известно, что INF-y обладает способностью ингибировать синтез коллагена и эластина в гладкомышечных клетках сосудистой стенки и тем самым препятствовать формированию прочной фиброзной покрышки бляшки. Его роль в дестабилизации атеросклеротических поражений оставалась до сих пор неизвестной.

Нами впервые был осуществлен иммуногистохимический и морфометрический анализ эндотелиальных, мононуклеарных и гладкомышечных клеток, экспрессирующих IL-18, в интиме и адвентиции артерий на разных стадиях формирования атеросклеротического поражения.

При иммуногистохимическом анализе сосудистой стенки человека удалось установить локализацию IL-18 в клеточных и тканевых элементах как в нестабильных, так и в стабильных атеросклеротических бляшках. В нормальных участках интимы сосудистой стенки этот цитокин выявлялся либо в незначительном количестве, либо отсутствовал совсем (Рисунок 63).

Рисунок 63. Отсутствие 1Ь-18 в клетках и во внеклеточных структурах интимы нормального участка аорты человека. Иммунопероксидазный метод. Увеличение х 450.

Как внутриклеточная (эндотелиальные клетки, макрофаги/моноциты), так и диффузная внеклеточная локализация ТЬ-18 обнаруживалась преимущественно в

нестабильных поражениях (Рисунок 64).

Рисунок 64. Экспрессия !Ь-18 различными клетками в интиме нестабильной атеросклеротической бляшки

а - выраженная экспрессия 1Ь-18 в отслаивающемся эндотелии; б -многочисленные макрофаги с выраженной экспрессией 1Ь-18 в цитоплазме (стрелки) в поверхностном участке покрышки нестабильной бляшки; в -диффузное распределение 1Ь-18 в поверхностных отделах покрышки нестабильной атеросклеротической бляшки. Иммунопероксидазный метод. Увеличение а - х 600; б, в - х 500.

Также выраженная экспрессия этого интерлейкина наблюдалась в цитоплазме эндотелиальных клеток и макрофагов, располагающихся непосредственно в зонах деструкции, эрозии и разрывов фиброзной покрышки нестабильной бляшки. В отличие от нестабильных поражений, в мононуклеарных клетках, располагающихся в различных зонах стабильных атеросклеротических бляшек, 1Ь-18 либо отсутствовал, либо выявлялся в незначительных количествах (Рисунок 65).

Рисунок 65. Отсутствие IL-18 в покрышке стабильной атеросклеротической бляшки. Иммунопероксидазный метод. Увеличение х 450.

Последующее морфометрическое исследование артерий человека на разных стадиях формирования атеросклеротической бляшки, показало увеличение численности эндотелиальных клеток, экспрессирующих IL-18, в интиме нестабильного поражения в 2,1 раза по сравнению с нормой. Параллельно с нестабильной бляшкой, их количество возрастает и в стабильном поражении в 1,7 раза по сравнению с нормальными участками интимы. Однако на начальной стадии поражения наблюдается тенденция к снижению числа эндотелиальных клеток, экспрессирующих IL-18: в 2,2 раза по сравнению с нестабильной бляшкой и в 1,8 раза по сравнению со стабильным поражением (Рисунок 66).

Экспрессия ^-18 в эндотелиальных клетках интимы.

И 2

и а

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

а

норма

липидное пятно нестабильная бляшка стабильная бляшка

Рисунок 66. Количественное содержание эндотелиальных клеток, экспрессирующих 1Ь-18, в норме и в различных типах атеросклеротических поражений интимы артерий.

Одновременно с эндотелиальными клетками экспрессия 1Ь-18 выявлялась в мононуклеарных клетках. Выраженное увеличение числа мононуклеаров с 1Ь-18 в цитоплазме наблюдалось: в нестабильном атеросклеротическом поражении в 3,2 раза (р <0,05), на начальной стадии формирования бляшки в 2,3 раза и в стабильной бляшке в 2 раза по сравнению с нормой (Рисунок 67).

Экспрессия ГЬ-18 в мононуклеарных клетках в интиме.

70

з Й 1) 1)

&

ч

60

50

40

30

20

10

1

-Г

-1-

Г+П

норма

липидное пятно нестабильная бляшка стабильная бляшка

0

Рисунок 67. Количественное содержание мононуклеарных клеток, экспрессирующих 1Ь-18, в норме и в различных типах атеросклеротических поражений интимы артерий.

Интересно, что максимальная численность гладкомышечных клеток, экспрессирующих 1Ь-18, наблюдалась в нормальных участках интимы артерий, она была увеличена: в 2,6 раза по сравнению с липидным пятном, в 1,9 раза по сравнению с нестабильной бляшкой и в 2,3 раза по сравнению со стабильными поражениями (Рисунок 68).

Рисунок 68. Количественное содержание гладкомышечных клеток, экспрессирующих 1Ь-18, в норме и в различных типах атеросклеротических поражений интимы артерий.

Параллельный морфометрический анализ участков адвентиции расположенных под атеросклеротическими поражениями, показал не столь выраженную картину присутствия мононуклеаров, экспрессирующих 1Ь-18, по сравнению с интимой. Но, тем не менее, имеется тенденция к увеличению их числа в участках адвентиции, подлежащих под нестабильным атеросклеротическим поражением (в 1,3 раза) и под стабильной бляшкой (в 1,2 раза) по сравнению с нормой (Рисунок 69).

Экспрессия ГЬ-18 в мононуклеарных клетках в адвентиции.

к

ч о

и

45 40 35 30 25 20 15 10

норма

липидное пятно нестабильная бляшка стабильная бляшка

5

0

Рисунок 69. Количественное содержание мононуклеарных клеток, экспрессирующих 1Ь-18, в норме и в различных типах атеросклеротических поражений в адвентиции артерий.

Следует отметить, что численность гладкомышечных клеток с 1Ь-18 в наибольшей степени возрастает в участках адвентиции, расположенных под начальными атеросклеротическими поражениями. В участках адвентиции под стабильной атеросклеротической бляшкой, напротив, наблюдалось снижение количества гладкомышечных клеток с 1Ь-18 в 1,8 раза по сравнению с нестабильной бляшкой и в 1,6 раза по сравнению с нормой (Рисунок 70).

Экспрессия ГЬ-18 в ГМК в адвентиции

в 40

о

03 >я 35

н о £ 30

и (1) И И Й 25

к 03 э 20

Ир Ш

ч. о к 15

О) О) р

к к X! 10

го р Й

8 И 5

с? 0

норма

липидное пятно нестабильная бляшка стабильная бляшка

Рисунок 70. Количественное содержание гладкомышечных клеток, экспрессирующих 1Ь-18, в норме и в различных типах атеросклеротических поражений в адвентиции артерий.

Таким образом, в результате проведенного иммуногистохимического анализа удалось установить локализацию 1Ь-18 в клеточных и тканевых элементах, как в нестабильных, так и в стабильных атеросклеротических бляшках. При помощи сравнительного морфометрического исследования выявлено выраженное преобладание эндотелиальных и мононуклеарных клеток, экспрессирующих 1Ь-18, в интиме нестабильного атеросклеротического поражения. Установлен факт максимальной численности гладкомышечных клеток в нормальных участках интимы сосудистой стенки. А также показано увеличение числа мононуклеарных и гладкомышечных клеток, экспрессирующих 1Ь-18, в зонах адвентиции под атеросклеротическими поражениями. Следовательно, эти результаты впервые достоверно позволили установить, что наблюдаемые дегенеративные процессы в нестабильных атеросклеротических бляшках могут быть связаны с опосредованным действием 1Ь-18 за счет индукции или синтеза ЮТ-у в Т-лимфоцитах и макрофагах.

4.8.3. Интерферон-гамма (ЮТ-у)

ЮТ-у обладает способностью ингибировать синтез коллагена и эластина в гладкомышечных клетках сосудистой стенки и тем самым препятствовать формированию прочной фиброзной покрышки бляшки, что в итоге может приводить к дестабилизации атеросклеротического поражения.

Проведенный нами иммуногистохимический анализ сосудистой стенки показал, что ЮТ-у отсутствует в клеточных и внеклеточных структурах нормальных участков артерий (Рисунок 71).

Рисунок 71. В нормальном участке интимы a. basilaris отсутствует экспрессия ЮТ-у. Иммунопероксидазный метод. Увеличение х 600.

На начальной стадии развития атеросклеротического поражения в районе эндотелия сосуда наблюдаются мононуклеарные клетки, активно экспрессирующие INF-у (Рисунок 72а), что, может быть связано с их адгезией и дальнейшим проникновением в интиму. По мере формирования нестабильной атеросклеротической бляшки такие мононуклеары выявляются в зоне её покрышки (Рисунок 72б). Важно отметить, что многочисленные клетки, инфильтрирующие сосудистую стенку и синтезирующие INF-у, постоянно обнаруживаются в участках деструкции и разрыва фиброзной покрышки нестабильной бляшки (Рисунок 72в).

" _ - J . ¡MS , ' Л-

rS'

»

/

\

/

с

б

а

в

Рисунок 72. Экспрессия ЮТ-у в интиме липидного пятна и в нестабильной атеросклеротической бляшке.

а - на поверхности липидного пятна наблюдаются мононуклеарные клетки активно экспрессирующие ЮТ-у (стрелки); б - многочисленные мононуклеарные клетки, экспрессирующие ЮТ-у (стрелки), в зоне поврежденного участка фиброзной покрышки нестабильной атеросклеротической бляшки; в - в районе разрыва фиброзной покрышки нестабильной атеросклеротической бляшки видны мононуклеарные клетки (стрелки), экспрессирующие ЮТ-у. Иммунопероксидазный метод. Увеличение а, б, в - х 550.

В отличие от нестабильных атеросклеротических поражений, в фиброзной покрышке стабильной атеросклеротической бляшки наблюдается полное отсутствие вне- и внутриклеточной экспрессии ЮТ-у (Рисунок 73).

Рисунок 73. Полное отсутствие вне- и внутриклеточной экспрессии ЮТ-у в фиброзной покрышке стабильной атеросклеротической бляшки. Иммунопероксидазный метод. Увеличение х 400.

Таким образом, в результате проведенного иммуногистохимического анализа, нами выявлено присутствие INF-у в нестабильных атеросклеротических