Создание конструкции иммунолипосомы и изучение иммунополипосомальной формы противоопухолевого препарата доксорубицин тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат биологических наук Толчева, Елена Викторовна

• Толчева, Елена Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Толчева, Елена Викторовна

Введение.

Часть I. Обзор литературы.

Глава 1. Липосомы: строение, свойства и области их применения.

Глава 2. Липосомы как средство доставки биологически активных молекул к клеткам-мишеням.

Глава 3. Лиганды для направленного транспорта липосом.

Глава 4. Модификация поверхности липосом.

Часть II. Собственные исследования.

Глава 1. Материалы и методы исследования.

Глава 2. Получение лиганд-полиэтиленгликоль-липидного коньюгата.

Глава 3. Получение 1С080-иммунолипосом, нагруженных доксорубицином.

Глава 4. Проверка специфической активности 1С080-иммунолипосом, нагруженных доксорубицином, в системе in vitro.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Создание конструкции иммунолипосомы и изучение иммунополипосомальной формы противоопухолевого препарата доксорубицин»

Актуальность проблемы

Известно, что лекарственные препараты, применяемые в традиционных формах, лишь ограниченно и медленно проникают в клетки через барьер биологических мембран, а после попадания в организм нередко разрушаются за счет действия различных защитных систем, что уменьшает желаемый терапевтический эффект. Эти проблемы в ряде случаев затрудняют применение или же делают невозможным медицинское применение многих весьма эффективных препаратов.

Основной задачей экспериментальной и клинической химиотерапии является доставка лекарственного препарата как можно ближе к опухолевой клетке. Оптимальным вариантом является доставка лекарства внутрь клетки опухоли. Еще в конце XIX века немецкий бактериолог Пауль Эрлих предложил термин "волшебная пуля", подразумевающий химиопрепарат, который находит в организме и избирательно убивает клетки-мишени без повреждения окружающих здоровых тканей. С тех пор селективный транспорт химиотерапевтических препаратов к опухоли in situ остается предметом многочисленных исследований. Одним из способов достижения этой цели является разработка липосомальной лекарственной формы противоопухолевых препаратов.

Использование липосом для транспорта и целенаправленной доставки противоопухолевых препаратов - цитостатиков является одним из перспективных направлений в медицине. Применение цитостатиков для лечения онкологических больных часто сопровождается токсическими осложнениями, обусловленными поражением быстро обновляющихся, с высоким темпом пролиферации клеток кроветворных и иммунокомпетентпых органов (в первую очередь костного мозга, эпителия желудочно-кишечного тракта, сердечной мышцы, почек и др.). Кроме того, малое непосредственное влияние на опухолевый рост также ограничивает использование цитостатиков в свободном виде. Данные, накопленные 3 специалистами за последние годы подтверждают способность липосом транспортировать лекарственное средство, снижать его токсическое действие, увеличивать терапевтический эффект [5;7].

Для обеспечения направленного транспорта липосом к клеткам-мишеням было предложено модифицировать поверхность липосом различными лигандами, способными специфически связываться с антигенами или рецепторами на поверхности клетки. Выбор лиганда зависит от антигена/рецептора, экспрессированного на поверхности клетки, куда необходимо доставить липосомы. В качестве векторных молекул могут выступать, например, моноклональные антитела (МКА) или их фрагменты (Fab'-фрагменты МКА), пептиды, факторы роста, углеводы, гликопротеины, лиганды к специфическим рецепторам на поверхности клеток-мишеней и др. Липосомы, к поверхности которых присоединены МКА или Fab'-фрагменты МКА, назвали иммунолипосомами [19].

На протяжении последних 20 лет не ослабевал интерес ученых к липосомальным системам доставки лекарственных препаратов, что позволило добиться значительных успехов в этой области науки. На сегодняшний день известен целый ряд «адресных» липосомальных систем доставки, способных специфически связываться с антигеном/рецептором на поверхности клетки-мишени. Так, например, были получены иммунолипосомы, избирательно действующие, на клетки головного мозга [60], легкого [67], молочной железы [63], ВИЧ-инфицированные клетки [54;83;84], клетки иммунной системы [46], а также на другие клетки-мишени. Однако, ни один лекарственный препарат на основе иммунолипосом или других «адресных» липосом не разрешен еще для клинических испытаний.

Разработка нового поколения лекарственных препаратов на основе иммунолипосом является стратегически важным, поскольку это позволит решить многие задачи, связанные с направленной доставкой лекарственных веществ. Хотя иммунолипосомы - это сложная биохимическая система, создание и разработка которой требует участия специалистов из многих областей науки, есть надежда, что иммунолипосомы займут достойное место среди лекарственных препаратов.

Цель исследования

Целью исследования являлось создание конструкции иммунолипосомы и изучение иммунолипосомальной формы противоопухолевого препарата доксорубицин.

Задачи исследования

1. Разработать методику получения активированного ПЭГ-липидного коньюгата.

2. Подобрать условия присоединения лигандов (циклический RGD-содержащий пептид, моноклональное антитело IC080) к активированному ПЭГ-липидному коньюгату.

3. Получить 1С080-иммунолипосомы и проверить их специфическую активность в системе in vitro.

4. Получить иммунолипосомальную форму доксорубицина, а также проверить иммунологическую специфичность и цитотоксическую активность полученной иммунолипосомальной формы доксорубицина в системе in vitro.

Научная новизна исследования

Разработана методика получения активированного полиэтиленгликольлипидного коньюгата. Подобраны условия присоединения лигандов (циклический RGD-содержащий пептид, моноклональное антитело IC080) к активированному ПЭГ-липидному коньюгату. Отработана методика получения 1С080-иммунолипосом и проверена их специфическая активность в системе in vitro. Отработана методика получения иммунолипосомальной формы доксорубицина. Проведено тестирование иммунологической специфичности и цитотоксической активности полученной иммунолипосомальной формы доксорубицина в системе in vitro.

Практическая значимость исследования

Разработанная технология получения «адресных» липосом на основе пнитрофенилкарбонил-ПЭГ-липидного коньюгата является универсальной для любых лигандов, содержащих аминогруппу. Получение «адресных» липосом путем встраивания лиганд-ПЭГ-липидного коньюгата в липосомальный бислой дает возможность встраивать множество различных лиганд-ПЭГ-липидных коньюгатов в предварительно приготовленные липосомы, содержащие различные лекарственные препараты. Этот метод не требует разработки отдельной технологии производства направленных липосом для каждого из множества лигандов в сочетании с лекарственным препаратом.

Часть I. Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Онкология», Толчева, Елена Викторовна

Выводы

1. Разработан простой метод получения полиэтиленгликоль-липидного коньюгата твердофазным методом на основе орнитина в качестве гидрофильной группировки.

2. Подобраны условия присоединения моноклональных антител IC080 к активированному ПЭГ-липидному коньюгату в водном буферном растворе: молярное соотношение pNP-PEG-Lipid/IC080 40:1; концентрация pNP-PEG-Lipid 2.24 мг/мл; концентрация IC080 2.0 мг/мл; рН среды 8.8; температура реакции 4°С.

3. Показана возможность присоединения нерастворимых в водной среде лигандов на примере циклического RGD-содержащего пептида. Подобранные условия проведения реакции в органическом растворителе: молярное соотношение pNP-PEG-Lipid/cRGDfK 1:1.5; концентрация pNP-PEG-Lipid 6.4 мг/мл; концентрация cRGDfK 4.5 мг/мл; рН среды 9.0; температура реакции 20°С; применимы не только к пептидам, но и к лигандам другой природы, нерастворимым в водной среде.

4. Получены иммунолипосомы, содержащие на дистальных концах цепей полиэтиленгликоля, моноклональные антитела IC080, направленные против антигена CD5:

Мольное соотношение липидов PC : Choi: mPEG2ooo-DSPE 2:1:0.15 Общая концентрация липидов (моль/л) 15.31x10-6

Средний размер частиц (нм) 126 ± 12

Концентрация белка (мг/мл) 0.3

Количество молекул антител, приходящееся на одну липосому 55 ± 5 Специфическая активность полученных 1С080-иммунолипосом проверена в системе in vitro на клеточных линиях MOLT4, Jurkat, Raji и лимфоцитах периферической крови здоровых доноров.

5. Получены 1С080-иммунолипосомы, нагруженные доксорубицином (концентрация доксорубицина 1.2 мг/мл). Цитотоксическая активность полученной иммунолипосомальной формы доксорубицина проверена в системе in vitro на клеточных линиях Jurkat и Raji. Показано, что включенный в иммунолипосомы доксорубицин обладает большим цитотоксическим эффектом, чем включенный в ненаправленные липосомы доксорубицин.

Заключение.

На сегодняшний день ряд лекарственных препаратов в составе «классических» и пэгилированных липосом применяется в клинике. Первоначальный успех, достигнутый в работе с липосомальными формами различных лекарственных препаратов, послужил толчком для дальнейших научных исследований. Разработка нового поколения лекарственных препаратов на основе «адресных» липосом является стратегически важным, поскольку это позволило бы решить многие задачи, связанные с направленной доставкой биологически активных молекул. Известно, что до сих пор в клинике нет ни одного препарата на основе иммунолипосом. Это может быть связано как с трудностями промышленного получения таких препаратов, с условиями их хранения так и с множеством других причин. В связи с этим разработка простых и универсальных методов присоединения лигандов различной природы к поверхности липосом или к ПЭГ-липиду представляет практический интерес. Таким образом, развитие липидных систем доставки связано с разработкой простых методов получения лиганд-ПЭГ-липидных коньгатов и с поиском новых лигандов.

Согласно литературным данным, присоединение лиганда к поверхности липосомы осуществляется посредством одной из трех реакций, которые являются достаточно эффективными и избирательными. Это реакция между активированными карбоксильными группами и аминогруппами, в результате которой образуется амидная связь; реакция между пиридилдитиолами и тиолами, в результате чего образуются дисульфидные связи; и реакция между малеимидными производными и тиолами, в результате которой формируются тиоэфирные связи [63]. Также существуют другие подходы, например, образование карбаматной связи посредством реакции между п-нитрофенилкарбонильной группой и аминогруппой [147]. Кроме того, для присоединения лигандов к липосомальной поверхности может быть использован метод нековалентного связывания - через образование комплекса биотин - авидин/стрептавидин [127]. Методы ковалентного присоединения, не требующие предварительной модификации лиганда, являются предпочтительными, так как значительно упрощают процесс получения «адресных» липосом, делая его одностадийным. К таким методам относится присоединение лиганда, содержащего NH2-rpynny, к п-нитрофениловому эфиру ПЭГ-липидного коньюгата или к цианурхлоридной производной ПЭГ-липидного коньюгата.

Однако конечный выбор метода присоединения определяется молекулярными особенностями лиганда.

Вторым, не менее важным аспектом получения «адресных» липосом является выбор лиганда. Известно, что в качестве векторных молекул, направляющих липосомы к клеткам-мишеням, могут выступать: ♦♦♦ молекулы антител ♦♦♦ Fab'-фрагменты молекул антител ♦♦♦ пептиды ❖ углеводы ♦♦♦ гликопротеины лиганды к рецепторам на поверхности клеток-мишеней, то есть, по существу, любая молекула, способная специфически распознавать и связываться с антигеном или рецептором на поверхности клетки-мишени. Выбор лиганда определяется местом назначения лекарственного препарата или другой биологически активной молекулы, включенной в липосому и полностью зависит от цели работы.

Часть II. Собственные исследования Глава 1. Материалы и методы исследования.

1.1. Материалы.

L-a-фосфатидилхолин (PC, egg, chicken) (Avanti Polar Lipids), холестерин (Choi) (Sigma), 1,2-дистеароил-зп-глицеро-3фосфатидилэтаноламин-Л'-[метокси(полиэтиленгликоль) (MW 2000)] (mPEG2ooo-DSPE) (Avanti Polar Lipids), доксорубицин (Sigma, USA), флуорескамин (Sigma, USA), сукцинимидный эфир 5-(и-6)-карбоксифлюоресцеина (Carboxyfluorescein, succinimidyl ester) (CF) (Molecular Probes, USA), 1,2-диолеоил-5п-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин-ЛЦкарбоксифлюоресцеин) (DOPE-CF) (Avanti Polar Lipids), 1,2-диолеоил-5п-глицеро-З-фосфатидилэтаноламин-Л^п-нитрофенилкарбонил (полиэтиленгликоль (MW 3400)] (pNP-PEG3400-DOPE) (Northeastern University, Boston, MA, USA), смола Tenta Gel PAP (RAPP Polymere, Germany), diFmoc-Orn (Calbiochem-Novabiochem, Germany), стеариновая кислота (Sigma, USA), iV-гидроксибензотриазол (Calbiochem-Novabiochem, Germany), диизопропилкарбодиимид (Fluka, USA), диметилформамид (Химмед, РФ), диметилсульфоксид (Sigma, USA), п-нитрофенилхлорформиат (Fluka, USA), триэтиламин (Fluka, USA), хлороформ (Химмед, РФ), дихлорметан (Химмед, РФ), трифторуксусная кислота (Fluka, USA), триметилбромсилан (Fluka, USA), диэтиловый эфир (Химмед, РФ), хлорид натрия (Химмед, РФ), хлорид калия (Химмед, РФ), натрий фосфорнокислый дизамещенный (Химмед, РФ), калий фосфорнокислый монозамещенный (Химмед, РФ), натрия цитрат (Химмед, РФ), iV-[2-hydroxy-ethyl]piperazine-./V-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) (Sigma, USA), циклический пептид cRGDfK (лаборатория Химии пептидов, ИБХ РАН, РФ), моноклональные антитела ICO-80 (анти CD5) (НПЦ МедБиоСпектр, РФ), моноклональные антитела анти CD20 (IC0180) (НПЦ «МедБиоСпектр», РФ), клеточная линия MOLT-4 (Т-лимфобласты, острый лимфобластный лейкоз) (American Type Culture Collection, Manassas, VA), клеточная линия Jurkat (Т-лимфобласты, острый

43 лимфобластный лейкоз) (ГУ РОЩ им. Н.Н. Блохина РАМН), клеточная линия Raji (В-лимфоциты, лимфома Беркитта) (ГУ РОЩ им. Н.Н. Блохина РАМН).

1.2. Методы.

1.2.1. Получение HO-PEG-Orn-St2.

1.2.1.1. Присоединение От и St. Acid к Tenia Gel PAP смоле (RAPP Polymere).

HO-PEG-Orn-St2 синтезировали твердофазным методом в ручном варианте путём наращивания цепи с С-конца на Tenta Gel PAP смоле (RAPP Polymere), нагрузка составила 0.22 ммоль/г. Для временной защиты а- и £-ЫН2-группы аминокислоты использовали флуоренилметоксикарбонильную группу (Fmoc). Аминокислоту diFmoc-Orn и стеариновую кислоту присоединяли последовательно к полимеру через образование бензо-триазолового эфира в присутствии карбодиимида. Для активации 1 экв. аминокислоты использовали 1,2 экв. HOBt и 1 экв. DIC.

Для присоединения аминокислоты к смоле 5 экв (по отношению к количеству активных групп на смоле) Fmoc-защищённой аминокислоты растворили в 3 мл DMF и инкубировали с НОВТ в DMF в течение 15-30 мин для активации карбоксильной группы diFmoc-Orn. Смолу Tenta Gel PAP (1 г, 0.22 ммоль активных групп на смоле) инкубировали в DMF в течение 1 часа для набухания, затем инкубировали в 50% растворе пиперидина в DMF 2x30 мин. и промывали DMF 8><5 мин. Затем к смоле добавляли раствор активированной Fmoc-аминокислоты в DMF, раствор рН-зависимого индикатора бромфенолового синего в DMSO, DIC. Содержание непрореагировавших аминогрупп контролировали визуально по окрашиванию рН-зависимого индикатора бромфенолового синего (добавляли из расчета на 1000 моль NH2-rpynn - 1 моль индикатора). Конденсация проходила в течение ночи. Желтое окрашивание индикатора свидетельствовало об отсутствии свободных NH2-rpynn и о завершении реакции. Далее смолу промывали DMF 8x5 мин. и инкубировали в 50% растворе пиперидина в DMF 2x30 мин. (для снятия защитных Fmoc-групп с Огп), после чего смолу снова промывали DMF 8х5 мин.

Для последующего присоединения 10 экв стеариновой кислоты (из расчета 5 экв кислоты на каждую NH2-rpynny смолы) растворили в 4 мл DMF и инкубировали с НОВТ в DMF в течение 15-30 мин для активации карбоксильной группы. После этого к смоле добавляли раствор активированной стеариновой кислоты, раствор рН-зависимого индикатора бромфенолового синего в DMSO, DIC. Конденсацию вели при комнатной температуре в течение 5-7 часов. Далее смолу промывали DMF 8Х5 мин. и инкубировали в 50% растворе пиперидина в DMF 2><30 мин. (для полного удаления индикатора бромфенолового синего), после чего смолу снова промывали DMF 10x5 мин. и 8x5 мин. ЕЮН. Смолу высушивали под вакуумом, следы растворителя удаляли с помощью лиофильной сушки.

1.2.1.2. Отщепление HO-PEG-Orn-St2 от смолы Tenta Gel PAP.

Отщепление HO-PEG-Orn-St2 от смолы проводили TFA, содержащей 1 % TMBS, в течение 2 часов (из расчета 5 мл смеси на 1 г смолы). HO-PEG-Orn-St2 отфильтровывали от смолы, смолу промывали 5 мл TFA, содержащей 1% TMBS, и 10 мл TFA (100%) или DCM 2x3 мин, слив собирали. Растворитель частично удаляли на роторном испарителе и высаживали продукт охлаждённым диэтиловым эфиром (из расчёта 10-12-кратного избытка эфира по объёму), отфильтровывали и промывали 2 раза эфиром для удаления остатков TFA. Растворитель удаляли под вакуумом, для полного удаления диэтилового эфира использовали лиофильную сушку. Качество полученного продукта оценивали методом ТСХ в системе Х:М:У = 90:18:2 и масс-спектрометрии на установке Ultraflex MALDI TOF/TOF Bruker.

1.2.2. ПолучениеpNP-PEG-Orn-St2.

Для получения pNP-PEG3ooo-Orn-St21 экв HO-PEG-Orn-St2 растворили в безводном хлороформе (из расчета 1 мл на 75 мг), к которому добавили 4 экв п-нитрофенилхлорформиата, растворенного в безводном хлороформе (из расчета 0.4 мл на 16 мг), и 4 экв триэтиламина. Реакцию вели во льду при постоянном перемешивании. За ходом реакции следили методом ТСХ в системе Х:М:У = 90:18:2. Продукт реакции высаживали из реакционной смеси охлаждённым диэтиловым эфиром (из расчёта 10-12-кратного избытка эфира по объёму) и промывали 2 раза эфиром для удаления п-нитрофенилхлорформиата. Растворитель удаляли под вакуумом. Качество полученного продукта оценивали методом ТСХ в системе Х:М:У = 90:18:2 и масс-спектрометрии на установке Ultraflex MALDI TOF/TOF Bruker.

1.2.3. Получение cRGDfK-PEG30oo-Orn-St2.

Циклический пептид cRGDfK был получен в группе А.Ю. Сурового (лаборатория Химии пептидов, ИБХ РАН). Полученный пептид был охарактеризован методом HPLC и масс-спектрометрии на установке Ultraflex MALDI TOF/TOF Bruker.

Для получения cRGDfK-PEG3ooo-Orn-St2 1 экв pNP-PEG3ooo-Om-St2 (19.1 мг) растворили в 3 мл DMF и инкубировали с 1.2 экв НОВТ, растворенным в DMF, в течение 15 мин. Затем 1.5 экв. cRGDfK (4.5 мг) растворили в 1 мл DMF и добавили его к раствору pNP-PEG3000-Om-St2. Реакцию вели при постоянном перемешивании при комнатной температуре. Контролировали рН реакционной смеси с помощью универсальной индикаторной бумаги, рН подводили диизопропилэтиламином до значения 8-9. За ходом реакции следили методом ТСХ в системе Х:М:У = 90:18:2. Об окончании реакции судили по исчезновению пятна от pNP-PEG3ooo-Orn-St2 в реакционной смеси. По окончании реакции растворитель удаляли на роторном испарителе при 60° С. Далее реакционную массу растворяли в воде и лиофилизовали.

Полученный продукт cRGDfK-PEG3ooo-Orn-St2 выделяли из реакционной смеси двумя методами: методом гель-фильтрации на носителе Sephadex G-25 и диализом. Для выделения продукта лиофилизованную реакционную смесь растворили в 2 мл воды и разделили на две части. При хроматографическом разделении реакционной смеси (для этого к 1 мл реакционной смеси добавили 1 мл 0.2 М СН3СООН) элюцию вели 0.1 М СН3СООН со скоростью 1.3 мл/мин, объем колонки составил 171.5 мл. Собранные фракции анализировали методом ТСХ в системе Х:М:У = 90:18:2 и масс-спектрометрии. cRGDfK-PEG3ooo-Oni-St2 элюировался сразу после свободного объема колонки. Фракцию, содержащую cRGDfK-PEGjooo-Orn-St2, лиофилизовали.

При выделении продукта реакции методом диализа к 1 мл реакционной смеси добавили 1 мл буферного раствора, содержащего 10 мМ Hepes и 280 mM NaCl, рН 7.4, и поместили в диализный мешок (MWCO 12-14,000 Da). Реакционную смесь диализовали против Н20, при этом из реакционной смеси был удален непрореагировавший пептид cRGDfK и другие низкомолекулярные компоненты смеси. Чистоту выделенного cRGDfK-PEG3ooo-Orn-St2 контролировали методом ТСХ в системе Х:М:У = 90:18:2 и масс-спектрометрии. Очищенный продукт лиофилизовали.

Качество полученного продукта оценивали методом ТСХ в системе Х:М:У = 90:18:2 и масс-спектрометрии на установке Ultraflex MALDI TOF/TOF Bruker. Полученный cRGDfK-PEG3ooo-Orn-St2 был охарактеризован с помощью аминокислотного анализа.

1.2.4. Гель-проникающая высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

Гель-проникающая ВЭЖХ проводилась на колонке Shodex PROTEIN KW-804 (8.0mm*300mm) (Shodex, Япония) с использованием системы для ВЭЖХ (Hitachi, Япония). Условия проведения анализов: буферный раствор А - 100 мМ ЫаНгРОд буферный раствор, содержащий 150 мМ Na2S04, рН 7.0; буферный раствор Б - деионизованная Н20. Колонку промывали буферным раствором Б, уравновешивали буферным растворм А. Элюцию проводили буферным растворм А. Скорость элюции 1.0 мл/мин. Детекцию осуществляли при длине волны 220 нм.

1.2.5. Подбор условий присоединения антител к активированному ПЭГ-липидному коньюгату (pNP-PEG-Lipid).

Для подбора оптимальных условий реакции присоединения моноклональных антител использовали коньюгат pNP-PEG3400-DOPE, полученный и охарактеризованный в лаборатории профессора Торчилина В.П. (Северо-Восточный университет, Бостон, штат Массачусетс, США).

1.2.5.1. Влияние температуры.

Моноклональные антитела IC080, растворенные в 0.1 М NaHCCb буферном растворе, рН 8.3 (концентрация IC080 составила 1.0 мг/мл), добавляли к PNP-PEG3400-DOPE, растворенному в 5 мМ Na-цитратном буферном растворе, содержащем 150 мМ NaCl, рН 5.0 (концентрация pNP-PEG3400-DOPE составила 0.56 мг/мл). Мольное соотношение белок/pNP-PEG3400-DOPE 1:20. Реакционную смесь инкубировали при рН 8.2 в течение 24 часов при 4°С и при 20°С при постоянном перемешивании. Образование продукта контролировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

1.2.5.2. Влияние молярного соотношения белок/рИР-РЕОзмгВОРЕ. Моноклональные антитела IC080, растворенные в 0.1 М NaHC03 буферном растворе, рН 8.3 (концентрация IC080 составила 1.0 мг/мл), добавляли к pNP-PEG34oo-DOPE, растворенному в 5 мМ Ыа-цитратном буферном растворе, содержащем 150 мМ NaCl, рН 5.0 (концентрация pNP-PEG3400-DOPE составила 1.12 мг/мл). Мольное соотношение белок/pNP-PEG3400-DOPE составило 1:20 и 1:40. Реакционную смесь инкубировали при рН 8.2 в течение 24 часов при 4°С при постоянном перемешивании. Образование продукта контролировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

1.2.5.3. Влияние рН реакционной среды.

Моноклональные антитела IC080, растворенные в 0.1 М NaHC03 буферном растворе, рН 9.0 (концентрация IC080 составила 1.0 мг/мл), добавляли к PNP-PEG3400-DOPE, растворенному в 5 мМ Na-цитратном буферном растворе, содержащем 150 мМ NaCl, рН 5.0 (концентрация pNP-PEG3400-DOPE составила 1.12 мг/мл). Мольное соотношение белок/pNP-PEG3400-DOPE 1:40. Реакционную смесь инкубировали при рН 8.2 и 8.8 в течение 24 часов при 4°С при постоянном перемешивании. Образование продукта контролировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

1.2.5.4. Влияние концентрации антител иpNP-PEG^oo-DOPE.

Моноклональные антитела IC080, растворенные в 0.1 М ЫаНСОз буферном растворе, рН 9.0 (концентрация IC080 составила 1.0 мг/мл и 2.0 мг/мл), добавляли к PNP-PEG3400-DOPE, растворенному в 5 мМ Na-цитратном буферном растворе, содержащем 150 мМ NaCl, рН 5.0 (концентрация PNP-PEG3400-DOPE составила 1.12 мг/мл и 2.24 мг/мл соответственно). Мольное соотношение белок/р№>-РЕОз4оо-ООРЕ 1:40. Реакционную смесь инкубировали при рН 8.8 в течение 24 часов при 4°С при постоянном перемешивании. Образование продукта контролировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

1.2.6. Получение IC08()-PEG3m-D0PE.

Антитела IC080 (меченные CF или немеченые), растворенные в 0.1 М NaHC03 буферном растворе, рН 9.0 (концентрация IC080 2 мг/мл), добавляли к pNP-PEG3ooo-Orn-St2, растворенному в 5 мМ Na-цитратном буферном растворе, содержащем 150 мМ NaCl, рН 5.0. Мольное соотношение белок/р№-РЕОз4оо-ООРЕ составило 1:40. Реакционную смесь инкубировали при рН 8.8 в течение 24 часов при 4°С при постоянном перемешивании. Образование продукта контролировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

I.2.7. Приготовление липосом.

Липосомы были приготовлены из следующих липидов: PC, Choi, mPEG2ooo-DSPE (мольное соотношение липидов составило 2:1:0.15 соответственно). Для этого в круглодонной колбе готовили смесь из растворенных в хлороформе липидов согласно протоколу (Табл. 3, 4), растворитель удаляли на роторном испарителе. Полученную липидную пленку суспендировали в буферном растворе, содержащем 5 мМ HEPES, 140 мМ NaCl, рН 7.4. и озвучивали в течение 20 минут при слабом нагревании, затем пропускали последовательно через поликарбонатные мембраны с диаметром пор 200 и 100 нм (Nuclepore) посредством мини-экструдера (Avanti Polar Lipids) [22]. Размер полученных липосомальных частиц определяли методом динамического светорассеяния с помощью анализатора размера частиц (Coulter N4+ MD Submicron Particle Size Analyzer, Beckman Coulter, Канада). Общая концентрация липидов составляла приблизительно

II.4 мг/мл, размер полученных частиц был 119±10 нм.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Толчева, Елена Викторовна, 2007 год

1. Барсуков Л.И. Липосомы // Соросовский образовательный журнал- 1998.-№ 10.-С. 2-8.

2. Барышников А.Ю., Тоневицкий А.Г. Моноклональные антитела в лаборатории и клинике / М.: ВНТИЦ, 1997. 212 С.

3. Березов Т.Т., Яглова Н.В., Чехонин В.П. и др. Липосомальные формы антрациклиновых антибиотиков // Биомедицинская химия 2004. - Т. 50,№5.-С. 411.

4. Брагина Н.А., Миронов А.Ф. Мембранология / М.: ИПЦ МИТХТ, 2002.-98 С.

5. Дудниченко А.С., Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Липосомальные лекарственные препараты в эксперименте и в клинике / Харьков: «РА-Каравелла» 2001. - 143 С.

6. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Динамическая структура липидного бислоя / М.: Наука, 1981. 296 С.

7. Каплун А.П., Ле Банг Шон, Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ // Вопросы медицинской химии 1999. - Т. 45, No 1. - С. 3-16.

8. Кортава М.А., Рябова А.В., Игнатьева Е.В. и др. Изучение эффективности включения Фотосенса в пространственно стабилизированные липосомы // Российский Биотерапевтический Журнал 2005. - Т. 4, № 4. - С. 96-101.

9. Меерович И.Г., Оборотова Н.А. Применение липосом в фотохимиотерапии: 1. Липосомы в ФДТ // Российский Биотерапевтический Журнал 2003. - Т. 2, № 4. - С.3-8.

10. Оборотова Н.А., Виланская А.А., Прокофьева В.И. Термочувствительные липосомальные лекарственные формы в экспериментальной онкологии // Российский Биотерапевтический Журнал -2006.-Т. 5,№ 1.-С. 62-70.

11. Смирнова З.С., Кубасова И.Ю., Макарова О. А. и др. Доклиническое изучение эффективности липосомальной лекарственной формы Фотосенса для фотодинамической терапии // Российский Биотерапевтический Журнал 2003. - Т. 2., № 4. - С. 40-44.

12. Сорокоумова Г.М., Селищева А.А., Каплун А.П., Швец В.И. Фосфолипиды. Методы их выделения, обнаружения и изучения физико-химических свойств липидных дисперсий в воде // М.: ИПЦ МИТХТ, 2000. -68 С.

13. Стойлова Т.Б., Толчева Е.В., Егорова Н.С., Суровой А.Ю. // Пэгилирование пептидов и липидов // Российский симпозиум по химии и биологии пептидов. Тезисы стендовых сообщений 2003. - С. 96.

14. Суровой А.Ю., Егорова Н.С., Гребенникова Ж.О., Шамборант О.Г. Твердофазный метод синтеза катионных липидов // Биоорганическая химия 1999.-Т. 25, No 2.-С. 153.

15. Толчева Е.В., Кортава М.А., Палкина Т.Н., Егорова Н.С., Стойлова Т.Б., Суровой А.Ю., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. // Анти

16. CD5 иммунолипосомы: модификация пэгилированных липосом отечественными моноклональными антителами ICO-80 // Российский Биотерапевтический Журнал - 2005. - Т. 4, № 1. - С. 19.

17. Толчева Е.В., Оборотова Н.А. // Липосомы как транспортное средство для доставки биологически активных молекул // Российский Биотерапевтический Журнал 2006. - Т. 5, № 1. - С. 54-61.

18. Чикинева Н. А., Смирнова 3. С., Орлова О. JL, Оборотова Н. А., Барышников А. Ю. // Создание и изучение липосомальной лекарственной формы цифелина // Химико-фармацевтический журнал 2001. - Т. 4, № 8. -С. 19.

19. Экспериментальная онкология на рубеже веков. Под ред. Давыдова М.И. и Барышникова А.Ю. / М.: издательская группа РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, 2003. 552 С.

20. Яглова Н.В. Стерически стабилизированные иммунолипосомы, специфичные к клеткам глиомы С6 крыс // Материалы третьей международной конференции «Болезни цивилизации в аспекте учения В.И. Вернадского» Москва - 2005. - С. 347.

21. Abra R. М., Bankert R.B., Chen F. et al. The next generation of liposome delivery systems: recent experience with tumor-targeted, sterically-stabilized immunoliposomes and active-loading gradients // J. Liposome Res. -2002.-Vol. 12.-P. 1-3.

22. Ahmad I., Longenecker M., Samuel J. et al. Antibody-targeted delivery of doxorubicin entrapped in sterically stabilized liposomes can eradicate lung cancer in mice // Cancer Res. 1993. - Vol. 53. - P. 1484-1488.

23. Allen T.M. Long-circulating (sterically stabilized) liposomes for targeted drug delivery // Trends Pharmacol. Sci. 1994. - Vol. 15, No 7. - P. 215220.

24. Allen T.M., Brandeis E., Hansen C.B. et al. A new strategy for attachment of antibodies to sterically stabilized liposomes resulting in efficient targeting to cancer cells // Biochim. Biophys. Acta 1995. - Vol. 1237. - P. 99108.

25. Allen T.M., Moase E.H. Therapeutic opportunities for targeted liposomal drug delivery // Adv. Drug Del. Rev. 1996. - Vol. 21. - P. 117-133.

26. Allen T.M., Newman M.S. Woodle M.C. et al. Pharmacokinetics and anti-tumor activity of vincristine encapsulated in sterically stabilized liposomes // Int. J. Cancer 1995.-Vol. 62.-P. 199-204.

27. Allen T.M., Sapra F., Moase E. Use of the post-insertion method for the formation of ligand-coupled liposomes // Cell. Mol. Biol. Letters -2002. -Vol. 7.-P. 889-894.

28. Asai Т., Shimizu K., Kondo M. et al. Anti-neovascular therapy by liposomal DPP-CNDAC targeted to angiogenic vessels // FEBS Lett. 2002. -Vol. 520.- P. 167-170.

29. Audouy S.A., de Leij L.F., Hoekstra D. et al. In vivo characteristics of cationic liposomes as delivery vectors for gene therapy // Pharm. Res. 2002. -Vol. 19.-P. 1599-1605.

30. Bendas G., Krause A., Bakowsky U. et al. Targetability of novel immunoliposomes prepared by a new antibody conjugation technique // Int. J. Pharm.- 1999.-Vol. 181.-P. 79-93.

31. Bogdanov A.A., Klibanov A.L., Torchilin V.P. Protein immobilization on the surface of liposomes via carbodiimide activation in the presence of N-hydroxysulfosuccinimide // FEBS Lett. 1988. - Vol. 231, No 2. -P. 381-384.

32. Bolotin E.M., Cohen R., Bar L.K. et al. Ammonium sulfate gradients for efficient and stable remote loading of amphipathic weak bases into liposomes and ligandoliposomes // J. Liposome Res. 1994.- Vol. 4, No 1. - P. 455-479.

33. Bradbury L.B., Kansas G.S., Levy S. etal. The CD19/CD21 signal transducing complex of human В lymphocytes includes the target of antiproliferative antibody-1 and Leu-13 molecules // J. Immunol. 1992. - Vol. 149.-P. 2841-2850.

34. Brignole C. et al. Targeted delivery system for antisense oligonucleotides: a novel experimental strategy for neuroblastoma treatment // Cancer Lett. 2003. - Vol. 197. - P. 231-235.

35. Bungener L. et al. Virosome-mediated delivery of protein antigens to dendritic cells // Vaccine 2002. - Vol. 20. - P. 2287-2295.

36. Bungener L., Huckriede A., Wilschut J. Delivery of protein antigens to the immune system by fusion-active virosome: a comparison with liposomes and ISCOMs. // Biosci. Rep. 2002. - Vol. 22. - P. 323-338.

37. Bungener L., Idema J., Veer W. et al. Virosomes in vaccine development: induction of cytotoxic T-lymphocytes activity with virosome-encapsulated protein antigens // J. Liposome Res. 2002. - Vol. 12. - P. 155-163.

38. Carrion C., de Madariaga M.A., Domingo J.C. In vitro cytotoxic study of immunoliposomal doxorubicin targeted to human CD34+ leukemic cells // Life Sciences 2004. - Vol. 75. - P. 313-328.

39. Carter P. Improving the efficacy of antibody-based cancer therapies // Nat. Rev. Cancer-2001.-Vol. l.-P. 118-129.

40. Coiffier В., Lepage E., Briere J. et al. CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma // N. Eng. J. Med. 2002. - Vol. 346, No 4. - P. 235-242.

41. Corti A., Ponzoni M. Tumor vascular targeting with Tumor Necrosis Factor-a and chemotherapeutic drugs // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2004. - Vol. 1028. -P. 104-112.

42. Crommelin D.J.A., Bos J.W., Storm G. Liposomes successful carrier systems for targeted delivery of drugs // Businessbriefing: Pharmatech - 2003. - P. 209-213.

43. Cryan S. Carrier-based strategies for targeting protein and peptide drugs to the lungs // The A APS Journal 2005. - Vol. 7, No 1. - P. 20-41.

44. Demidem A, Lam Т., Alas S., et al. Chimeric anti-CD20 (IDEC-C2B8) monoclonal antibody sensitizes а В cell lymphoma cell line to cell killing by cytotoxic drugs // Cancer Biother. Radiopharm. 1997. -Vol. 12, No 3. - P. 177-186.

45. Drummond D.C., Meyer 0., Hong K. et al. Optimizing liposomes for delivery of chemotherapeutic agents to solid tumors // Pharmacological Reviews -1999.-Vol.51, No 4.-P. 691-743.

46. Emanuel N., Kedar E., Bolotin E.M. et al. Preparation and characterization of doxorubicin-loaded sterically stabilized immunoliposomes // Pharm. Res. 1996. - Vol. 13, No 3. - P. 352-359.

47. Enoch H.G., Strittmatter P. Formation and properties of 1000-angstrom-diameter, single-bilayer phospholipids vesicles // Proc. Natl. Acad. Sci. -1979.-Vol. 76, No l.-P. 145-149

48. Gabizon A., Papahadjopoulos D. Liposome formulations with prolonged circulation time in blood and enhanced uptake by tumors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988. - Vol. 85, No 18. - P. 6949-6953.

49. Gabizon A., Shmeeda H., Horowitz A.T. et al. Tumor cell targeting of liposome-entrapped drugs with phospholipid-anchored folic acid-PEG conjugates // Advanced Drug Delivery Reviews 2004. - Vol. 56. - P. 1177- 1192.

50. Gaspar M.M., Perez-Soler R., Cruz M.E. Biological characterization of L-asparaginase liposomal formulations // Cacer Chemother. Pharmacol. 1996. -Vol. 38.-P. 373-377.

51. Ghetie M.A., Ghetie V., Vitetta E.S. Anti-CD 19 antibodies inhibit the function of the P-gp pump in multidrug-resistant В lymphoma cells // Clin. Cancer Res. 1999. - Vol. 5. - P. 3920-3927.

52. Ghetie M .A., Picker L .J., Richardson J .A. et al. Anti-CD 19 inhibits the growth of human B-cell tumor lines in vitro and of Daudi cells in SCID mice by inducing cell cycle arrest // Blood 1994. - Vol. 83. - P. 1329-1336.

53. Goncalves A., Braud A.C., Viret F. et al. Phase I study of pegylated liposomal doxorubicin (Caelyx) in combination with carboplatin in patients with advanced solid tumors // Anticancer Res. 2003. - Vol. 23, No 4. - P. 3543-3548.

54. Gore M. Spectrophotometry and Spectrofluorimetry: A Practical Approach // Oxford University Press, Incorporated (New York, NY) 2000. - P. 63.

55. Goren D., Horowitz A.T., Tzemach D. et al. Nuclear delivery of doxorubicin via folate-targeted liposomes with bypass of multidrug-resistance efflux pump // Clinical Cancer Research 2000. - Vol. 6. - P. 1949-1957.

56. Goren D., Horowitz A.T., Zalipsky S. et al. Targeting of stealth liposomes to erbB-2 (Her/2) receptor: in vitro and in vivo studies // Br. J. Cancer -1996.-Vol. 74.-P. 1749-1756.

57. Greg T. Hermanson. Bioconjugate Techniques / Academic Press. -1996-785 P.

58. Hansen C.B., Kao G.Y., Moase E.H., et al. Attachment of antibodies to sterically stabilized liposomes: evaluation, comparison and optimization of coupling procedures // Biochim. Biophys. Acta. 1995. - Vol. 1239. - P. 133-144.

59. Harrington K.J., Mohammadtaghi S., Uster P.S. et al. Effective targeting of solid tumors in patients with locally advanced cancers by radiolabeled pegylated liposomes // Clinical Cancer Research 2001. - Vol. 7. - P. 243-254.

60. Heeremans J.L., Prevost R., Bekkers M.E. et al. Thrombolytic treatment with tissue-type plasminogen activator (t-PA) containing 1 iposomes in rabbits: a comparison with free t-PA // Thromb. Haemost. 1995. - Vol. 73. - P. 488-494.

61. Hofland H.E., Masson C., Iginla S. et al. Folate-targeted gene transfer in vivo // Molecular Therapy 2002. - Vol. 5, No 6. - P. 739-744.

62. Huwyler J., Wu D., Padridge W.M. Brain drug delivery of small molecules using immunoliposomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996. - Vol. 93.-P. 14164-14169.

63. Ichikawaa K., Hikitaa Т., Maeda N. et al. Antiangiogenic photodynamic therapy (PDT) by using long-circulating liposomes modified with peptide specific to angiogenic vessels // Biochim. Biophys. Acta. 2005. - Vol. 1669.-P. 69-74.

64. Iden D.L., Allen T.M. In vitro and in vivo comparison of immunoliposomes made by conventional coupling techniques with those made by a new post-insertion approach // Biochim. Biophys. Acta. 2001. - Vol. 1513. - P. 207-216.

65. Ishida O., Maruyama K., Okinaga K. et al. Liposomes bearing polyethylene glucol-coupled transferring with intracellular targeting property to the solid tumors in vivo // Pharm. Res. 2001. - Vol. 18. - P. 1042-1048.

66. Ishida Т., Iden D.L., Allen T.M. A combinatorial approach to producing sterically stabilized (Stealth) immunoliposomal drugs // FEBS Lett. -1999.-Vol. 460.-P. 129-133.

67. Janssen A.P., Schiffelers R.M., Hagen T. et al. Peptide-targeted PEG-liposomes in anti-angiogenic therapy // Int. J. Pharm. 2003. - Vol. 254. - P. 5558.

68. Kaneda Y. Virosomes: evolution of the liposome as a targeted drug delivery system // Adv. Drug Deliv. Rev. 2000. - Vol. 43. - P. 197-205.

69. Kim A., Yun M.O., Oh Y.K. et al. Phospholipid deformable vesichles for buccal delivery of insulin // Chem. Phar. Bull. (Tokyo) 2002. - Vol. 50. - P. 749-751.

70. Kirpotin D., Park J.W., Hong, K. et al. Sterically stabilized anti-HER2 immunoliposomes: design and targeting to human breast cancer cell in vitro 11 Biochemistry 1997. - Vol. 36. - P. 66-75.

71. Kisel M.A., Kulik L.N., Tsybovsky I.S. et al. Liposomes with phosphatidylethanol as a carrier for oral delivery of insulin: studies in rat // Int. J. Pharm.-2001.-Vol. 216.-P. 105-114.

72. Klibanov A.L., Maruyama K., Torchilin V.P. et al. Amphipatic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes // FEBS Lett. 1990. - Vol. 268. - P. 235-238.

73. Kok R.J., Schraa A.J., Bos E.J. et al. Preparation and Functional Evaluation of RGD-Modified Proteins as аурз Integrin Directed Therapeutics // Bioconjug. Chem. 2002. - Vol. 13. - P. 128-135.

74. Lasic D.D., Vallner J.J., Working P.K. Sterically stabilized liposomes in cancer therapy and gene delivery // Curr. Opin. Mol. Ther. 1999. - Vol. 1. - P. 177-185.

75. Leamon C.P., Cooper S.R., Hardee G.E. Folate-liposome-mediated antisense oligodeoxynucleotide targeting to cancer cells: evaluation in vitro and in vivo // Bioconjugate Chem. 2003. - Vol. 14. - P. 738-747.

76. Lee R.J., Low P.S. Delivery of liposomes into cultured KB cells via folate receptor-mediated endocytosis // J. Biol. Chem. 1 994. - Vol. 2 69. - P. 3198-3204.

77. Lestini B.J., Sagnella S.M., Xu Z. et al. Surface modification of liposomes for selective cell targeting in cardiovascular drug delivery // J. Control. Release 2002. - Vol. 78. - P. 235-247.

78. Li Т., Hamdi J., Hawthorne F.M. Unilamellar liposomes with enhanced boron content // Bioconjugate Chem. 2006. - Vol. 17. - P. 15-20.

79. Liu F., Huang L. Development of non-viral vectors for systemic gene delivery // J. Control. Release 2002. - Vol. 78. - P. 259-266.

80. Lopes de Menezes D.E., Pilarski L.M., Allen T.M. In vitro and in vivo targeting of immunoliposomal doxorubicin to human B-cell lymphoma // Cancer Res. 1998. - Vol. 58. - P. 3320-3330.

81. Lopes de Menezes D.E., Pilarski L.M., Belch A.R. et al. Selective targeting of immunoliposomal doxorubicin against human multiple myeloma in vitro and ex vivo // Biochim Biophys Acta. 2000. - Vol. 1466. - P. 205-220.

82. Lu Y., Low P.S. Folate-mediated delivery of macromolecular anticancer therapeutic agents // Advanced Drug Delivery Reviews 2002. - Vol. 54.-P. 675-693.

83. Lukyanov A.N., Elbayoumi T.A., Chakilam A.R. et al. Tumor-targeted liposomes: doxorubicin-loaded long-circulating liposomes modified with anti-cancer antibody // J. Control. Release 2004. - Vol. 100. - P. 135-144.

84. Lyass O., Hubert A., Gabizon A.A. Phase I study of Doxil-Cisplatin combination chemotherapy in patients with advanced malignancies // Clinical Cancer Research 2001. - Vol. 7. - P. 3040-3046.

85. Lyass O., Uziely В., Ben-Yosef R. et al. Correlation of toxicity with pharmacokinetics of pegylated liposomal doxorubicin (Doxil) in metastatic breast carcinoma // Cancer (Phila.) 2000. - Vol. 89. - P. 1037-1047.

86. Maeda H. The enhanced permeability and retention (EPR) effect in tumor vasculature: the key role of tumor-selective macromolecular drug targeting // Adv Enzyme Regul. 2001. - Vol. 41. - P. 189-207.

87. Maeda H., Sawa Т., Konno T. Mechanism of tumor-targeted delivery of macromolecular drugs, including the EPR effect in solid tumor and clinical overview of the prototype polymeric drug SMANCS // J. Control Rel. 2001. -Vol. 74.-P. 47-61.

88. Mamot C., Drummond D.C., Greiser U. et al. Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)-targeted immunoliposomes mediate specific and efficientdrug delivery to EGFR- and EGFRvIII-overexpressing tumor cells // Cancer Res. -2003.-Vol. 63.-P. 3154-3161.

89. Maruyama K., Takizawa Т., Yuda T. et al. Targetability of novel immunoliposomes modified with amphipathic poly(ethylene glycol)s conjugated at their distal terminals to monoclonal antibodies // Biochim. Biophys. Acta 1995. -Vol. 1234.-P. 74-80.

90. Mastrobattista E., Crommelin D., Wilschut J. et al. Targeted liposomes for delivery of protein-based drugs into the cytoplasm of tumor cells // J. Liposome Res. 2002. - Vol. 12. - P. 57-65.

91. Matsuura M., Yamazaki Y., Sugiyama M. et al. Polycation liposome-mediated gene transfer in vivo // Biochim. Biophys. Acta. 2003. - Vol. 1612. -P. 136-143.

92. Mayer L.D., Cullis P.R., Bally M.B. The use of transmembrane pH gradient-driven drug encapsulation in the pharmacodynamic evaluation of liposomal doxorubicin // J. Liposome Res. 1994. - Vol. 4, No 1. - P. 529-553.

93. Medina O.P., Zhu Y., Kairemo K. Targeted liposomal drug delivery in cancer // Curr. Pharm. Design 2004. - Vol. 10. - P. 2981-2989.

94. Mercadal M., Carrion С., Domingo J.C. et al. Preparation of immunoliposomes directed against CD34 antigen as target//Biochim. Biophys. Acta- 1998.-Vol. 1371.-P. 17-23.

95. Merrifield R.B. Solid-phase peptide synthesis. An improved synthesis of bradykinin // Biochemistry- 1964. Vol. 3. - P. 1385-1390.

96. Moreira J.N., Ishida Т., Gaspar R. et al. Use of the post-insertion technique to insert peptide ligands into pre-formed stealth liposomes with retention of binding activity and cytotoxicity // Pharm. Res. 2002. - Vol. 19. - P. 265-269.

97. Moser C., Metcalfe I.C., Viret J.F. Virosomal adjuvanted antigen delivery systems // Expert. Rev. Vaccines 2003. - Vol. 2. - P. 189-196.

98. Noble C.O., Kirpotin D.B., Hayes M.E. et al. Development of ligand-targeted liposomes for cancer therapy // Expert Opin. Ther. Targets 2004. - Vol. 8.-P. 335-353.

99. O'Shaughnessy J.A. Pegylated liposomal doxorubicin in the treatment of breast cancer // Clin. Breast Cancer 2003. - Vol. 4. - P. 318-328. 2.

100. Pan X.Q., Wang H., Lee R.J. Boron delivery to a murine lung carcinoma using folate receptor-targeted liposomes // Anticancer Res. 2002. -Vol. 22-P. 1629-1633.

101. Papahadjopoulos D., Gabizon A. Liposomes designed to avoid the reticuloendothelial system // Prog. Clin. Biol. Res. 1990. - Vol. 343. - P. 85-93.

102. Park J.W., Hong К., Kirpotin D.B. et al. Anti-HER2 immunoliposomes: enhancedefficacy attributabletо targeted delivery//Clinical Cancer Research 2002. - Vol. 8. - P. 1172-1181.

103. Park J.W., Hong K., Kirpotin D.B. et al. Anti-HER2 immunoliposomes for targeted therapy of human tumors // Cancer Lett. 1997. -Vol. 118.-P. 153-160.

104. Park J.W., Kirpotin D.B., Hong K. et al. Tumor targeting using anti-her2 immunoliposomes // J. Controlled Release 2001. - Vol. 74. - P. 95-113.

105. Pegram M.D., Konecny G.E., O'Callaghan C. et al. Rational combinations of trastuzumab with chemotherapeutic drugs used in the treatment of breast cancer // J. Natl. Cancer. Inst. 2004. - Vol. 96, No 10. - P. 739-749.

106. Pietras R.J., Fendly B.M., Chazin Y.R. et al. Antibody to HER-2/neu receptor blocks DNA repair after cisplatin in human breast and ovarian cancer cells // Oncogene 1994. - Vol. 9. - P. 1829-1838.

107. Sapra P., Allen T.M. Internalizing antibodies are necessary for improved therapeutic efficacy of antibody-targeted liposomal drugs // Cancer Res. 2002. - Vol. 62. - P. 7190-7194.

108. Sapra P., Allen T.M. Ligand-targeted liposomal anticancer drugs // Progress in Lipid Research 2003. - Vol. 42. - P. 439-462.

109. Sarkar D.P., Ramani K., Tyagi S.K. Targeted gene delivery by virosomes//Methods Mol. Biol.-2002.-Vol. 199.-P. 163-173.

110. Sawant R.M., Hurley J.P., Salmaso S., Kale A., Tolcheva E, Levchenko T.S., Torchilin V.P. // «Smart» Drug Delivery Systems: Double-Targeted pH Responsive Pharmaceutical Nanocarriers // Bioconjug. Chem. 2006. -Vol. 17.-P. 943-949.

111. Schiffelers R.M., Koning G.A., Hagen T. et al. Anti-tumor efficacy of tumor vasculature-targeted liposomal doxorubicin // J. Control. Release 2003. -Vol. 91.-P. 115-122.

112. Schiffelers R.M., Molema G., Hagen T. Ligand-targeted liposomes directed against pathological vasculature // J. Liposome Res. 2002. - Vol. 12. -P. 129-135.

113. Schnyder A., Krahenbuhl S., Drewe J. et al. Targeting of daunomycin using biotinylated immunoliposomes: pharmacokinetics, tissue distribution and in vitro pharmacological effects // J. Drug Target. 2005. - Vol. 13, No 5. - P. 325335.

114. Schnyder A., Krahenbuhl S., Torok M. et al. Targeting of skeletal muscle in vitro using bitinylated immunoliposomes // Biocem. J. 2004. - Vol. 377.-P. 61-67.

115. Schnyder A., Krahenbuhl S., Torok M. et al. Targeting of skeletal muscle in vitro using biotinylated immunoliposomes // Biochem J. 2004. - Vol. 377.-P. 61-67.

116. Schraa A.J., Kok R.J., Botter S.M. et al. RGD-modified anti-CD3 antibodies redirect cytolytic capacity of cytotoxic T lymphocytes toward avp3-expressing endothelial cells // Int. J. Cancer 2004. - Vol. 112. - P. 279-285.

117. Schraa A.J., Kok R.J., Moorlag H.E. et al. Targeting of RGD-modified proteins to tumor vasculature: a pharmacokinetic and cellular distribution study // Int. J. Cancer 2002. - Vol. 102. - P. 469-475.

118. Schwonzen M., Kurbacher C.M., Mallmannn P. Liposomal doxorubicin and weekly paclitaxel in the treatment of metastatic breast cancer // Anticancer Drugs 2000. - Vol. 11. - P. 681 -685.

119. Shahinian S., Silvius J.R. A novel strategy affords high-yield coupling of antibody Fab' fragments to liposomes // Biochim. Biophys. Acta 1995. - Vol. 1239.-P. 157-167.

120. Singh M. Transferrin As A targeting ligand for liposomes and anticancer drugs // Curr. Pharm. Design 1999. - Vol. 5. - P. 443-451.

121. Sioud M., Sorensen D.R. Cationic liposome-mediated delivery of siRNAs in adult mice // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. - Vol. 312. -P. 1220-1225.

122. Skubitz K.M. Phase II trial of pegylated-liposomal doxorubicin (Doxil) in sarcoma // Cancer Invest. 2003. - Vol. 21, No 2. - P. 167-76.

123. Slamon D.J., Leyland-Jones В., Shak S. et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2 // N. Engl. J. Med. 2001. - Vol. 344, No 11. - P. 783-792.

124. Storm G., Crommelin D.J.A. Liposomes: quo vadis? // Pharmaceutical Science & Technology Today 1998. - Vol. 1. - P. 19-31.

125. Storm G., Nassander U.K., Vingerhoeds M.H. et al. Antibody-targeted liposomes to deliver doxorubicin to ovarian cancer cells // J. Liposome Res. -1994. -Vol.4, No l.-P. 641-666.

126. Surovoy A., Flechler I., Jung G. Gene Therapy of Cancer. New York: Plenum- 1998.-P. 000-000.

127. Suzuki S., Watanabe S., Uno S. et al. Endosytosis does not necessarily augment the cytotoxicity of adriamycin encapsulated in immunoliposomes // Biochim. Biophys. Acta 1994. - Vol. 1224. - P. 445-453.

128. Takeuchi H., Kojima H., Yamamoto H. et al. Evaluation of circulation profiles of liposomes coated with hydrophilic polymers having different molecular weights in rats // J. Control. Release 2001. - Vol. 75. - P. 83-91.

129. Templeton N.S. Cationic liposome-mediated gene delivery in vivo // Biosci. Rep. 2002. - Vol. 22. - P. 283-295.

130. Torchilin V.P. Liposomes as delivery agents for medical imaging // Mol. Med. Today 1996. - Vol. 2. - P. 242-249.

131. Torchilin V.P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers // Nat. Rev. Drug. Discov. 2005. - Vol. 4. - P. 145-160.

132. Torchilin V.P., Klibanov A.L., Huang L. et al. Targeted accumulation of polyethylene glucol-coated immunoliposomes in infracted rabbit myocardium // FASEB J. 1992. - Vol. 6. - P. 2716-2719.

133. Torchilin V.P., Levchenko T.S., Whiteman K.R. et al. Amphiphilic poly-N-vinylpyrrolidones; synthesis, properties and liposome surface modification // Biomaterials 2001. - Vol. 22. - P. 3035-3044.

134. Waelti E., Wegmann N., Schwaninger R. et al. Targeting HER-2/neu with antirat neu virosomes for cancer therapy // Cancer Res. 2002. - Vol. 62. - P. 437-444.

135. Waterhouse J.E., Harbottle R.P., Keller M. et al. Synthesis and application of integrin targeting lipopeptides in targeted gene delivery // ChemBioChem 2005. - Vol. 6. - P. 1212 - 1223.

136. Whiteman K.R., Subr V., Ulbrich K. et al. Poly(HPMA)-coated liposomes demonstrate prolonged circulation in mice // J. Liposome Res. 2001.-Vol. 11.-P. 153-164.

137. Wollina U., Dummer R., Brockmeyer N.H. et al. Multicenter study of pegylated liposomal doxorubicin in patients with cutaneous T-cell lymphoma // Cancer 2003. - Vol. 98, No 5. - P. 993-1001.

138. Xu L., Tang W., Huang C. et al. Systemic p53 gene therapy of cancer with immunolipoplexes targeted by anti-transferrin receptor scFv // Molecular Medicine 2001. - Vol. 7, No 10. - P. 723-734.

139. Yuan F., Leunig M., Huang S.K. et al. Microvascular permeability and interstitial penetration of sterically stabilized (stealth) liposomes in a human tumor xenograft // Cancer Res. 1994. - Vol. 54, No 13. - P. 3352-3356.

140. Zalipsky S. Synthesis of an end-group functionalized polyethylene glycol-lipid conjugate for preparation of polymer-grafted liposomes // Bioconjug. Chem. 1993. - Vol. 4. - P. 296-299.

141. Zanten J., Doornbos-van der Meer В., Audouy S. et al. A nonviral carrier for targeted gene delivery to tumor cells // Cancer Gene Therapy 2004. -Vol. 11.-P. 156-164.