Создание и биофармацевтическое обоснование термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.04.01, кандидат фармацевтических наук Тазина, Елизавета Владимировна

• Тазина, Елизавета Владимировна
• кандидат фармацевтических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат фармацевтических наук Тазина, Елизавета Владимировна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1.Липосом ы.

1.1.1. Строение липосом.

1.1.2. Свойства л ипосом.

1.1.3. Методы получения липосом.

1.1.4. Контроль качества липосомальных препаратов.

1.1.5. Стабильность липосом.

1.1.6. Методы загрузки лекарственных препаратов в липосомы.

1.1.7. Применение липосом в биологии и медицине.

1.2. Селективная доставка препаратов в опухоль с помощью термочувствительных липосом и локальной гипертермии.

1.2.1. Особенности микроциркуляции в опухоли.

1.2.2. Эффект повышенной проницаемости и удерживания как основа нацеливания липосом на опухоль.

1.2.3. Гипертермия как компонент комбинированного лечения.

1.2.4. Доксил и локальная гипертермия.

1.2.5. Термочувствительные липосомы в комбинации с локальной гипертермией.

1.2.6. Воздействие термочувствительных липосом с доксорубицином на опухолевые сосуды.

1.2.7. Термочувствительные липосомы с пролонгированным временем циркуляции.

1.2.8. Термочувствительные липосомы и магнитно-резонансная термометрия.

1.2.9. Термочувствительные полимеры и термолипосомы.

1.3. Антрациклиновые антибиотики.

1.3 Л. Доксорубицина гидрохлорид.

1.3.2. Липосомальные лекарственные формы доксорубицина.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Создание и биофармацевтическое обоснование термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина»

Актуальность темы

Применение большинства традиционных химиотерапевтических препаратов в онкологической практике часто ограничено из-за тяжелых токсических эффектов на здоровые ткани и , органы. Поэтому необходимо разрабатывать технологии новых наноносителей, которые можно использовать для селективной доставки лекарственных соединений в опухоль, и таким образом улучшать их терапевтический индекс [56]. Использование липосом в качестве носителей противоопухолевых веществ является одним из перспективных направлений в лечении злокачественных новообразований.

Антрациклиновый антибиотик доксорубицин обладает высокой противоопухолевой и противолейкозной активностью при низкой избирательности действия. Одной из характерных токсикологических особенностей препарата является кардиотоксичность. Поскольку проявление кардиотоксического действия зависит от дозы и резко повышается при высоких кумулятивных дозах, противоопухолевую активность доксорубицина нельзя реализовать полностью. Включение цитостатика в липосомы позволяет оптимизировать его противоопухолевый эффект [10]. В настоящее время на мировом фармацевтическом рынке присутствует несколько липосомальных форм доксорубицина: Доксил®, Келикс®, Миоцет®, Липодокс. В состав Доксила и Келикса входит полиэтиленгликоль (ПЭГ), защищающий липосомы от обнаружения и захвата фагоцитарной системой, поэтому ПЭГ-липосомы позволяют поддерживать более высокую концентрацию доксорубицина в крови в течение длительного времени [10]. Однако присутствие ПЭГ-причина возникновения некоторых новых побочных эффектов, в первую очередь, эритродизестезии ладоней и подошв (от обычного покраснения до появления язв на коже), а также гиперчувствительности, включая анафилактические реакции [49, 198, 199].

С целью увеличения избирательности противоопухолевого действия доксорубицина проводятся исследования по созданию новых наноструктурированных лекарственных форм, в частности, термочувствительных липосом, используемых в комбинации с локальной гипертермией [89, 102, 139, 146]. Термолипосомы высвобождают цитостатик в процессе нагревания опухоли до температуры 40-43 °С. При этой температуре в липосомальной мембране образуются поры, через которые инкапсулированный доксорубицин проникает в окружающее пространство. Новый препарат ThermoDox®, созданный компанией Celsion Corporation совместно с Duke University (США), в сочетании с высокочастотной аблацией проходит III фазу клинических испытаний при гепатоцеллюлярном раке, а с СВЧ-нагревом -1-Й фазы клинических испытаний при рецидивирующем раке молочной железы [276].

В РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН предложена модель термолипосомального доксорубицина [И, 12], однако ее существенным недостатком изначально являлась невысокая эффективность инкапсулирования цитостатика в везикулы, для увеличения которой потребовалась модификация технологии получения лекарственной формы [3]. Но в процессе масштабирования производства и наработок лиофилизированного препарата для углубленных биологических и химико-фармацевтических исследований загрузка доксорубицина в термолипосомы снова снизилась. Поэтому данная работа посвящена разработке оптимального состава, технологии производства и методов анализа термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина.

Цель исследования

Получение термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина для увеличения селективности доставки препарата в опухоль.

Задачи исследования:

1. Оптимизировать технологию получения термолипосомального доксорубицина с высокой степенью загрузки цитостатика в везикулы: выбрать подходящий состав термолипосомальной мембраны и соотношение препарат : суммарные липиды.

2. Разработать методику очистки термолипосомальной дисперсии от невключившегося цитостатика.

3. Подобрать криопротектор, разработать режим лиофилизации термолипосомального доксорубицина и наработать лиофилизированный препарат в количестве, достаточном для проведения химико-фармацевтических и биологических исследований.

4. Разработать методики химико-фармацевтического анализа термолипосом с доксорубицином.

5. Выбрать критерии качества готового препарата, провести его стандартизацию и изучить стабильность в процессе хранения.

6. Провести оценку биологической активности лиофилизированного термолипосомального доксорубицина в сочетании с локальной гипертермией in vitro и in vivo.

Методы исследования:

1. Технологические методы получения термолипосом, их гомогенизация, лиофилизация.

2. Физические методы анализа: спектрофотометрия, метод корреляционной спектроскопии светорассеяния (динамического лазерного светорассеяния) для анализа размера везикул.

3. Физико-химические методы анализа: хроматография (гель-фильтрация, ТСХ).

4. Химические методы анализа: перекисное окисление липидов.

5. Методы экспериментальной химиотерапии: изучение биологической активности термолипосом in vitro и in vivo. ■

Научная новизна исследования

Впервые предложен состав и разработана технология производства отечественного противоопухолевого препарата - термолипосомального доксорубицина - в виде лиофилизата для приготовления инъекционного раствора. Разработана методика очистки везикул от невключившегося доксорубицина на хроматографической колонке. Показана возможность проведения стерилизующей фильтрации термолипосомальной дисперсии доксорубицина. Изучено влияние различных криопротекторов на стабильность термолипосом с доксорубицином до и после лиофилизации, а также в процессе замораживания до температуры -18 °С. Обосновано использование в качестве криопротектора 4% раствора сахарозы. Разработан режим лиофилизации термолипосомального доксорубицина. Предложены методики химико-фармацевтического анализа термолипосом с доксорубицином: спектрофотометрическое определение содержания действующего вещества в лекарственной форме и хроматографическое определение компонентов лекарственной формы. Выбраны критерии и параметры качества лиофилизированного термолипосомального доксорубицина, разработан проект ФСП на препарат «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг». Показана стабильность лекарственной формы в процессе хранения в течение одного года при температуре —18°С. В биологических экспериментах показано, что термолипосомальный препарат в комбинации с локальной гипертермией обладает большей избирательностью действия по сравнению со свободным доксорубицином.

Практическая значимость и внедрение результатов исследования

Создана новая термочувствительная липосомальная лекарственная форма высокоактивного противоопухолевого антибиотика доксорубицина для использования в комбинации с локальной гипертермией. В экспериментальных исследованиях in vitro и in vivo выявлено преимущество новой лекарственной формы перед субстанцией доксорубицина. Разработан проект ФСП, в соответствии с которым проведена стандартизация препарата «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» и показана его стабильность при хранении в течение одного года при температуре -18 °С.

В РФ в настоящее время липосомальные лекарственные формы доксорубицина не производятся, импорт дорогостоящих зарубежных препаратов резко сужает возможность применения лекарств с направленной доставкой в отечественной клинической практике. Разработка и производство собственного высокоэффективного препарата для лечения онкологических больных позволит расширить его доступность для широкого круга отечественных пациентов, повысив тем самым качество оказываемой населению медикаментозной помощи.

Внедрено в учебный процесс методическое пособие «Липосомальные формы лекарственных препаратов» для системы послевузовского профессионального образования провизоров.

Положения, выносимые на защиту

1. Состав и технология производства лиофилизированного термолипосомального доксорубицина.

2. Методики химико-фармацевтического анализа термолипосомального препарата: спектрофотометрическое определение содержания доксорубицина в лекарственной форме и хроматографическое определение компонентов лекарственной формы.

3. Результаты контроля качества шести наработанных серий препарата и изучения их стабильности в процессе хранения при температуре -18 °С.

4. Результаты оценки эффективности действия термолипосомального доксорубицина в сочетании с локальной гипертермией in vitro и in vivo.

Апробация работы

Материалы проведенных исследований представлены на конференциях: VI, VII и VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (24-26 марта 2007 г., 17-19 марта 2008 г. и 21-22 апреля 2009 г., Москва); VIII конференции молодых онкологов с международным участием «Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (2627 апреля 2007 г., Киев); The 2008 Nanotechnology Conference and Trade Show, NSTI Nanotech 2008, 11th Annual Conference (June 1-5, 2008, Boston, Massachusetts, USA); The Second Saint

Petersburg International Conference on NanoBioTechnologies, NanoBio 2008 (16-18 June 2008, Saint-Petersburg, Russia); XII и XIII Российском онкологическом конгрессе (18-20 ноября 2008 г. и 17-19 ноября 2009 г., Москва); The 2008 Materials Research Society (MRS) Fall Meeting (December 1-5, 2008, Boston, Massachusetts, USA); III съезде токсикологов России (25 декабря 2008 г., Москва); Международном форуме по нанотехнологиям Rusnanotech 2008 и Rusnanotech 2009 (3-5 декабря 2008 г. и 6-8 октября 2009 г., Москва); Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» (18-19 февраля 2009 г., Москва); IV региональной конференции молодых ученых-онкологов имени академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (24 апреля 2009 г., Томск); Российской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 30-легию НИИ онкологии- СО РАМН «Современная онкология: достижения и перспективы развития» (10-11 сентября 2009 г., Томск).

Апробация диссертационной работы прошла 28 сентября 2009 г. в НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ, из них 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 5 тезисов докладов на английском языке и 20 тезисов на русском языке.

Связь темы диссертационной работы с планом научных работ учреждения

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН по теме: «Разработка и создание новых лекарственных форм для медицинской промышленности» (№ гос. регистрации 01.200.316267), а также в рамках научно-технической программы «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний» на 2007-2009 гг.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, четырех глав результатов собственных исследований, общего заключения, общих выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 244 страницах машинописного текста, содержит 92 рисунка и 54 таблицы. Библиографический список включает 318 наименований, в том числе 278 - на иностранном языке.

Заключение диссертации по теме «Технология получения лекарств», Тазина, Елизавета Владимировна

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Установлен оптимальный состав термолипосомальной мембраны -дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC): дистеароилфосфатидилхолин (DSPC): холестерин (Choi): дистеароилфосфатидилэтаноламин-ПЭГ-2000 (DSPE-PEG-2000): а-токоферола ацетат (а-ТА) = 9:1:0,2:0,02:0,2 с весовым соотношением препарат: суммарные липиды — 0,13-0,20: 1. Масштабирована технология получения водной дисперсии термолипосомального доксорубицина с размером частиц 170 ± 20 нм и эффективностью инкапсулирования препарата в свежеприготовленные везикулы - 87-94 %.

2. Разработана методика очистки термолипосомальной дисперсии от невключившегося доксорубицина на хроматографической колонке для оценки эффективности инкапсулирования цитостатика в везикулы.

3. Для стабилизации дисперсии термолипосомального доксорубицина в процессе хранения разработан режим ее лиофилизации с криопротектором - 4 % раствором сахарозы.

4. Разработаны методики химико-фармацевтического анализа термолипосом с доксорубицином, определена их чувствительность и воспроизводимость, в том числе:

- спектрофотометрическое определение содержания действующего вещества в лекарственной форме с использованием РСО доксорубицина при длине волны 252 ± 2 нм;

- хроматографическое определение доксорубицина, липидов и сахарозы в составе лекарственной формы.'

Для качественного анализа термолипосомального препарата методом ТСХ предложены следующие системы растворителей: хлороформ - метанол -концентрированный аммиак (65:25:4) и хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота -вода (25:15:4:2) для определения липидов и доксорубицина; 1,2-дихлорэтан - безводная уксусная кислота - метанол - вода (10:5:3:2) или изопропиловый спирт - ацетон - эфир-вода (7:7:2:4) для определения сахарозы.

5. Выбраны критерии качества лиофилизированной термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина, разработан проект ФСП на препарат «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» и проведен контроль качества шести наработанных серий препарата в хранении при температуре -18 °С в течение одного года, исследования продолжаются.

6. В доклинических испытаниях показано, что «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» в комбинации с локальной гипертермией обладает большей избирательностью действия по сравнению со свободным доксорубицином.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эффективность большинства противоопухолевых препаратов ограничена их высокой общей токсичностью и метаболической неустойчивостью в организме. Использование липосом для целенаправленной доставки цитостатиков в опухоль - одно из перспективных направлений в химиотерапии злокачественных новообразований.

Целью данной работы явилось получение термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина для увеличения селективной доставки препарата в опухоль. Основные задачи работы включали: оптимизацию технологии производства лиофилизированного термолипосомального доксорубицина с высокой степенью загрузки цитостатика, стандартизацию препарата по выбранным критериям качества, изучение его биологической активности на клетках in vitro и перевиваемых солидных опухолях животных in vivo в сочетании с локальной гипертермией.

Термолипосомы получали методом обращения фаз из 1,2-дипальмитоил-5«-глицеро-3-фосфохолина (DPPC), 1,2-дистеароил-5«-глицеро-3-фосфохолина (DSPC), пегилированного 1,2-дистеароил-^п-глицеро-3-фосфоэтаноламина (DSPE-PEG-2000) и холестерина. Для предотвращения окисления липидов добавляли а-токоферола ацетат. Частицы измельчали через поликарбонатные мембраны с размером пор 200 нм с помощью мини-экструдера. Доксорубицин загружали в везикулы против градиента сульфата аммония.

В результате проведенных исследований разработана спектрофотометрическая методика количественного анализа термолипосомального доксорубицина. Разработаны методики хроматографического определения доксорубицина, липидов и сахарозы в составе лекарственной формы.

В ходе изучения перекисного окисления липидов установлено, что доксорубицин и сахароза мешают количественному анализу содержания МДА в термолипосомальной лекарственной форме по реакции с ТБК, поэтому данная методика не подходит для оценки стабильности препарата.

Показано, что оптимальным составом для получения термолипосом с доксорубицином является состав DPPC:DSPC:Chol:DSPE-PEG-2000:a-TA = 9:1:0,2:0,02:0,2. Оптимальное весовое соотношение препарат : суммарные липиды составляет 0,13:1 и 0,20:1.

Для оценки эффективности включения доксорубицина в везикулы разработана методика очистки термолипосомальной дисперсии от невключившегося препарата на хроматографической колонке С 10/20, заполненной сефадексом G-50.

Выбран криопротектор для замораживания и лиофилизации термолипосомального доксорубицина -4% раствор сахарозы. Разработан режим лиофилизации препарата.

Показано, что наиболее подходящим является постепенное замораживание дисперсии до -40.-45 °С с выдержкой при данной температуре в течение 3 ч. Выбран оптимальный режим сублимационной сушки термолипосом с доксорубицином: постепенный нагрев полок от -50.-55 °С до 0 °С со скоростью 4-5 °С/ч, затем нагрев от 0 °С до +20 °С со скоростью 5-6 °С/ч, и досушивание препарата при температуре +20 °С в течение 3 ч.

Согласно требованиям ГФХ1 и ОСТ 91500.05.001-00 к препаратам для инъекций выбраны критерии качества лиофилизированной термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина. На основе этих критериев разработан проект ФСП на препарат «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» и проведен контроль качества шести наработанных серий препарата.

В биологических экспериментах показано, что лиофилизированный термолипосомальный доксорубицин в сочетании с локальной гипертермией обладает большей избирательностью действия по сравнению со свободным доксорубицином.

Список литературы диссертационного исследования кандидат фармацевтических наук Тазина, Елизавета Владимировна, 2010 год

1. Арзамасцев А.П., Садчикова Н.П., Харитонов Ю.Я. Валидация аналитических методов // Фармация. 2006. - № 4. - С. 8-12.

2. Барсуков Л.И. Липосомы // Соросовский образовательный журнал. 1998. — № Ю.-С. 2-9.

3. Безруков Д.А., Королева А.И., Каплун А.П. и др. Оптимизация метода получения стерически стабилизированных термочувствительных липосом с активной загрузкой доксорубицином // Российский биотерапевтический журнал. 2006. -Т. 5,№4.-С. 79-83.

4. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. В 2 ч. Ч. 2. Специальная фармацевтическая химия: Учеб. для вузов. Пятигорск: Теза, 1996. - С. 128-134, С. 165-172.

5. Биология: Энциклопедия / Под. ред. М.С. Гилярова. М.: Большая Российская энциклопедия, 2003. - С. 234.

6. Биохимия мембран: Учеб. пособие для биол. и мед. спец. вузов / Под. ред. А.А. Болдырева. Кн. 3. A.M. Белоус, Е.М. Гордиенко, Л.Ф. Розанов. Замораживание и криопротекция. М.: Высш. шк., 1987. - С. 29-61.

7. Видаль Специалист. Справочник «Онкология». 4-е изд. М.: АстраФармСервис, 2006.-С. 186-188.

8. ВФС: Липодокс (Lipodox). Утв. ФК МЗ Украины. 11 с.

9. Государственная фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа / МЗ СССР.— 11-е изд., доп. М.: Медицина, 1987. - С. 32-251.

10. Дудниченко А.С. Новые возможности в лечении рака // Провизор. 2000. - № 6. -С. 18-19.

11. Игнатьева Е.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л. и др. Оценка эффективности включения доксорубицина в термозависимую липосомальную лекарственную форму // Российский биотерапевтический журнал. 2005. - Т. 4, № 1. - С. 54.

12. Игнатьева Е.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л. и др. Химико-фармацевтическая стандартизация лиофилизированной термозависимой липосомальной лекарственной формы доксорубицина (ТЛЛФД-лио) // Российский биотерапевтический журнал. 2006. - Т. 5, № 1. - С. 14.

13. Каплун А.П., Ле Банг Шон, Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ // Вопросы медицинской химии. 1999. - Т. 45, № 1. - С. 3-12.

14. Карев И.Д., Соколова Т.В., Королева И.А., Монахов А.Г. Гипертермические методы в онкологической клинике: Учеб.-метод. пособие. Нижний Новгород: Изд-во НГМА, 1999.-30 с.

15. Кпочкова Т.И., Шпрах З.С. Организация, масштабирование и оптимизация производства лиофилизированных препаратов // Российский биотерапевтический журнал. 2006. - Т. 5, № 3. - С. 115-122.

16. Компендиум 2005 лекарственные препараты / Под ред. В.Н. Коваленко, А.П. Викторова. - К.: Морион, 2005. - 1920 с.

17. Краснопольский Ю.М., Степанов А.Е., Швец В.И. Некоторые аспекты технологии получения липосомальных форм лекарственных препаратов // Химико-фармацевтический журнал. 1999. - Т. 33, № 10. - С. 20-23.

18. Крыжановский С. А., Вититнова М.Б. Полный современный справочник лекарственных препаратов. Практическое руководство: 2-е изд., перераб. и доп. -М.: Рипол Классик, 2002. С. 815-816.

19. Лекарственные препараты зарубежных фирм в России: Справочник. М.: АстраФармСервис, 1993. - С. 280.20.