Совершенствование этиологической диагностики обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат медицинских наук Саматова, Елена Валерьевна

• Саматова, Елена Валерьевна
• кандидат медицинских наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Саматова, Елена Валерьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ХРОНИЧЕСКИХ ИНФЕКЦИОННО-ВОСПАЛИТЕЛБНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЕГКИХ У ДЕТЕЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Эпидемиологическая характеристика хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей

1.2 Этиология и антибиотикорезистентность ведущих бактериальных патогенов, вызывающих обострение хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей

1.3 Микроскопическое исследование мокроты у детей

1.4 Особенности культивирования бактериальных пневмотропов

1.5 Состояние некоторых показателей гуморального иммунитета у здоровых и больных хроническими инфекционно-воспалительными заболеваниями легких детей

1.6 Клиническое значение короткоцепочечных жирных кислот

при бронхолегочной патологии

1.7 Применение полимеразной цепной реакции в диагностике обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний

легких

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Контингент обследованных детей и объем проводимых исследований

2.2 Микроскопический метод

2.3 Культуральный метод

2.4 Методы определения чувствительности к антимикробным препаратам

2.5 Типирование штаммов Streptococcus pneumoniae

методом мультиплексной полимеразной цепной реакции

2.6 Метод непрямой иммунофлюоресценции

2.7 Метод газожидкостной хроматографии

2.8 Серологический метод исследования

2.9 Выявление дезоксирибонуклеиновой кислоты Haemophilus influenzae и Streptococcus pneumoniae методом полимеразной цепной реакции в клиническом материале

2.10 Статистические методы обработки результатов исследования

ГЛАВА 3. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СПОСОБОВ ВЫЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПНЕВМОТРОПОВ ИЗ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ПРИ ОБОСТРЕНИИ ХРОНИЧЕСКИХ ИНФЕКЦИОННО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЕГКИХ У ДЕТЕЙ

3.1 Микроскопическая оценка годности мокроты у детей для культурального исследования

3.2 Создание питательной среды для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала (кровяно-сывороточный агар)

3.3 Разработка способа выявления ß-лактамазопродуцирующих оксидазопозитивных грамотрицательных диплококков, подозрительных

на принадлежность к Moraxella catarrhalis

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ РОЛИ АЭРОБНЫХ, ФАКУЛЬТАТИВНО-АНАЭРОБНЫХ И АНАЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ХРОНИЧЕСКИХ ИНФЕКЦИОННО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЕГКИХ У ДЕТЕЙ

4.1 Частота выявления микроорганизмов культуральным методом

4.2 Частота обнаружения IgM и IgG к вирусам и труднокультивируемым бактериям методом непрямой

иммунофлюоресценции

4.3 Частота выявления дезоксирибонуклеиновой кислоты Haemophilus influenzae и Streptococcus pneumoniae в клиническом материале методом

полимеразной цепной реакции

4.4 Уровень IgG к Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus

4.5 Биологические особенности основных бактериальных патогенов

4.5.1 Биовары Haemophilus influenzae

4.5.2 Серотипы Streptococcus pneumoniae

4.6 Чувствительность к антимикробным препаратам

4.6.1 Haemophilus influenzae

4.6.2 Streptococcus pneumoniae

4.6.3 Moraxella catarrhalis

4.6.4 Доминирующие бактериальные ассоциации

ГЛАВА 5. ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ДЛЯ УСКОРЕННОГО ВЫЯВЛЕНИЯ МАРКЕРОВ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ ПРИ

ОБОСТРЕНИИ ХРОНИЧЕСКИХ ИНФЕКЦИОННО-

ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЕГКИХ У ДЕТЕЙ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Совершенствование этиологической диагностики обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень её разработанности

Проблема хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких (ХИВЗЛ) у детей была и остается одной из наиболее актуальных и сложных вопросов в педиатрии и клинической медицине в целом [8, 79, 131]. Статистические и эпидемиологические данные подтверждают рост распространенности ХИВЗЛ у взрослого и детского населения [2, 14, 64, 79, 81, 138, 139, 141]. Особенности течения хронических заболеваний легких, их клинико-функциональная эволюция на различных возрастных этапах (ребенок-подросток-взрослые) являются предметом интереса и педиатров, и терапевтов, так как под наблюдение педиатров переходят подростки в возрасте до 18 лет [14, 46].

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в диагностике и лечении обострений ХИВЗЛ у детей, многие вопросы, затрагивающие эту патологию, требуют обсуждения. В частности, в настоящее время не совсем ясна причина, связанная с инфицированием респираторного тракта тем или иным видом микроорганизмов при обострении ХИВЗЛ у детей. Можно отметить ряд факторов, влияющих на микробный пейзаж бронхиального дерева: вид и распространенность морфологических изменений структур бронхов и легких; особенности среды, в которой находится ребенок; воздействие антибактериальных средств; особенности внутрибольничных штаммов бактерий стационаров, в которые госпитализируется ребенок [5]. Не меньшее значение в последующем инфицировании больного определенным видом микроорганизма имеет типоспецифический иммунитет, влияющий на серотиповую и биотиповую принадлежность возбудителя [20, 60, 101]. Мукоцилиарный аппарат слизистой дыхательных путей несет главную ответственность за стерильность нижних дыхательных путей. Его повреждения

при вирусных инфекциях или других вредных воздействиях, приводят к колонизации нижних дыхательных путей микроорганизмами, заселяющими носоглотку (например, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae). Бактерии интенсивно размножаются там и становятся причиной развития бронхита, пневмонии или обострения ХИВЗЛ.

Существующая нормативная база по лабораторной диагностике хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких рассчитана преимущественно на взрослых пациентов [9, 17, 22, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 80].

В руководствах как отечественных, так и зарубежных существуют значительные разночтения в соотношении и составе клеточных элементов, количестве просматриваемых полей зрения и других приемов микроскопического исследования мокроты у взрослых с инфекционной бронхолегочной патологией. А микробиологическое исследование мокроты в педиатрии вообще не имеет широкого применения из-за трудностей в сборе материала и отсутствии однозначных критериев микроскопической оценки качества мокроты для культурального исследования [9, 22, 29, 32, 47].

Для бактериологического анализа отделяемого дыхательных путей наиболее часто используют 5% кровяной агар, среду для посева и выделения Streptococcus pneumoniae по прописи JI.K. Катосовой, агар с сердечной вытяжкой, которые имеют либо низкие ростовые свойства для «прихотливых» микроорганизмов, в частности для пневмококка, или высокую себестоимость из-за применения дефицитных компонентов в приготовлении, которые недоступны для большинства практических лабораторий [15, 47, 62].

Исследования последних лет свидетельствуют, что неспорообразующие анаэробы и их ассоциации с аэробами играют важную роль в развитии как острой, так и обострения хронической инфекции при легочной патологии. Но из-за трудностей, связанных с выделением анаэробных бактерий и необходимым для этого временем, диагноз анаэробных инфекций нередко основывается только на предположении [10, 16, 19, 42, 77].

Кроме того, инфекции дыхательных путей являются самой частой причиной назначения антибиотиков. По данным фармацевтической промышленности, на их лечение приходится приблизительно 2/3 всех выписываемых антибактериальных препаратов, что является основной причиной злопоутребления антибиотиками и способствует развитию резистентности микроорганизмов. На сегодняшний день наблюдается рост частоты выделения возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей с множественной устойчивостью к антибиотикам [18, 21, 64, 70, 87, 89, 94, 100, 111].

Поэтому для своевременной и качественной диагностики обострений ХИВЗЛ у детей требуется изучение этиологической роли разных микроорганизмов, в том числе их биотипов и серотипов, их антибиотикочувствительности и оценка диагностических возможностей, как культурального исследования клинически значимого материала, так и других лабораторных методов. Кроме того, выявление возбудителей необходимо как для назначения рациональной этиотропной антибактериальной терапии, так и прогнозируемой эмпирической, а также для применения различных методов профилактики обострений ХИВЗЛ у детей.

Цель исследования

Усовершенствовать методы и критерии оценки результатов этиологической диагностики обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей.

Задачи исследования

1. Оценить диагностическую ценность для культурального исследования у детей образцов мокроты, обнаруживающих при микроскопии менее 25 полиморфноядерных лейкоцитов и более 10 десквамированного плоскоклеточного эпителия.

2. Разработать доступную питательную среду для выделения, культивирования бактерий и ускоренный способ обнаружения ß-лактамазопродуцирующих штаммов Moraxella catarrhalis из клинического материала.

3. Определить критерии оценки результатов выявления маркеров бактериальной инфекции методом газожидкостной хроматографии при обострении хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей.

4. Установить частоту встречаемости серотипов Streptococcus pneumoniae, выделенных при обострении хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей в Екатеринбурге и Свердловской области.

5. Оценить возможность использования и диагностическую значимость различных методов определения этиологии обострения хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей.

Методология и методы исследования

С 2009 по 2011 гг. был обследован 241 ребенок в возрасте от года до 17 лет, проживающий в Екатеринбурге и городах Свердловской области, с обострением разных нозологических форм ХИВЗЛ: бронхоэктатической болезни (п = 133) и хронического бронхита (п = 108). Дети проходили лечение в торакальном отделении ГБУЗ СО «Областная детская клиническая больница № 1» г. Екатеринбурга. Среди пациентов было 132 (54,8%) мальчика и 109 (45,2%) девочек (соотношение 1,2:1). В динамике обследовано 95 детей.

В контрольную группу были включены дети без инфекционной бронхолегочной патологии (воронкообразная деформация грудной клетки, инородное тело дыхательных путей, атрезия пищевода, рубцовый стеноз пищевода, стеноз трахеи, у которых в общем анализе крови признаков воспаления нет) (п = 45).

Для решения поставленных цели и задач исследования использовались следующие методы: микроскопический, культуральный, молекулярно-генетический, непрямой иммунофлюоресценции, газожидкостной хроматографии, серологический (иммуноферментный анализ).

Исследование одобрено локальным комитетом по этическим вопросам при ГБУЗ СО «Областная детская клиническая больница № 1» протокол № 24 от 30.10.2012 года.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора

Достоверность результатов работы, обоснованность выводов и рекомендаций базируется на достаточном числе наблюдений и использовании современных методов статистической обработки материалов исследования, при консультативном участии специалистов в области математического анализа, с использованием программ: Statistica ® (Data analysis software system, StatSoft) версия 6.0, Microsoft Excel.

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на III международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения - 2009. К 160-летию академика И.П. Павлова» (Санкт-Петербург, декабрь 2009); конференции с международным участием «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, февраль 2010); ХП-ом международном конгрессе по антимикробной терапии Межрегиональной ассоциации по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии (Москва, май 2010); VII международной научно-практической конференции «Актуальные научные достижения 2011» (Чехия, июнь-июль 2011); Российской научно-практической конференции «Национальные дни лабораторной медицины России-2011» (Москва, октябрь 2011); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы эпидемиологии на современном этапе» (Москва, октябрь 2011); XIII-ом международном медицинском форуме «Стандарты и порядки медицинской

помощи, как основа повышения эффективности здравоохранения» -межрегиональной междисциплинарной научно-практической конференции «Современные стандарты и технологии диагностики, лечения и профилактики инфекционных болезней» (Нижний Новгород, апрель 2012); заседании общества эпидемиологов, микробиологов, паразитологов Свердловской области (Екатеринбург, февраль 2013).

Личное участие автора в получении научных результатов, изложенных в диссертации, выразилось в проведении научно-информационного поиска, анализа и обобщении данных специальной литературы, в предложении основной идеи и цели исследования, в разработке необходимых методологических подходов, в проведении 95% всех лабораторных исследований и сборе всего необходимого фактического материала. В едином целом автор представил современные методы диагностики (газожидкостную хроматографию, метод непрямой иммунофлюоресценции, полимеразную цепную реакцию, иммуноферментный анализ) и культуральное исследование, участвовал в разработке питательной среды для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала (кровяно-сывороточный агар) и способа выявления ß-лактамазопродуцирующих оксидазопозитивных грамотрицательных диплококков, подозрительных на принадлежность к Moraxella catarrhalis. Автор сформулировал положения, выносимые на защиту, выводы и подготовил диссертационную работу.

Положения, выносимые на защиту

1. Определяющей характеристикой микроскопической оценки годности мокроты у детей для культурального исследования является наличие в мазке 1 и более полиморфноядерных лейкоцитов при отсутствии десквамированного плоскоклеточного эпителия, 10 и более полиморфноядерных лейкоцитов при 1 -9 клеток десквамированного плоского эпителия, более 25 полиморфноядерных лейкоцитов при 10-24 клеток десквамированного плоского эпителия, в других случаях образцы не должны подлежать бактериологическому анализу.

2. При комплексном подходе к обследованию детей установлено, что помимо основных пневмотропных микроорганизмов, неспорообразующие анаэробы вызывают обострение хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких в 31% случаев.

3. Доказана диагностическая ценность метода газожидкостной хроматографии для выявления маркеров анаэробной инфекции в бронхоальвеолярном лаваже, мокроте, плевральном выпоте при обострении хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей.

Научная новизна

Разработан и внедрен «Способ выявления ß-лактамазопродуцирующих оксидазопозитивных грамотрицательных диплококков, подозрительных на принадлежность к Moraxella catarrhalis» и получено положительное решение от 3 сентября 2012 г. о выдаче патента на изобретение по заявке от 15 июля 2011 г., №2011129509/10.

Разработана и внедрена «Питательная среда для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала (кровяно-сывороточный агар)» и получено положительное решение от 27 июля 2012 г. о выдаче патента на изобретение по заявке от 08 июля 2011 г., № 2011128466/10.

Установлена частота встречаемости серотипов S. pneumoniae, выделенных при обострении хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей в Екатеринбурге и Свердловской области.

Определены критерии оценки результатов выявления маркеров бактериальной инфекции методом газожидкостной хроматографии при обострении хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей.

По результатам комплексного подхода к обследованию детей установлена частота обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких, вызванных неспорообразующими анаэробами: в монокультуре - 17,8%

{Bacteroides spp/, Fusobacterium nucleatum; Peptostreptococcus spp.) и в ассоциации с основными пневмотропными микроорганизмами - 13,2% (Bacteroides spp. + Streptococcus pneumoniae; Propionibacterium spp. + Pseudomonas aeruginosa + Escherichia coli; Peptostreptococcus spp. + Bacteroides ureolyticus + Staphylococcus aureus; Eubacterium spp. + Respiratory Syncytial Virus).

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные данные могут быть использованы в работе практических лабораторий, а также при обучении в медицинском ВУЗе, включающем обучение ординаторов, курсантов факультетов повышения квалификации врачей и последипломной переподготовки специалистов.

Разработан алгоритм действий при микроскопической оценке качества мокроты у детей для культурального исследования.

Разработанные питательная среда для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала (кровяно-сывороточный агар) и способ выявления ß-лактамазопродуцирующих оксидазопозитивных грамотрицательных диплококков, подозрительных на принадлежность к М. catarrhalis позволяют достоверно улучшить этиологическую диагностику обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей, вызванных S. pneumoniae и ß-лактамазопродуцирующими штаммами М. catarrhalis.

Определена область применения метода газожидкостной хроматографии в диагностике обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей.

Установлена частота встречаемости у детей с обострением хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких различных серотипов S. pneumoniae, входящих в состав конъюгированных пневмококковых вакцин.

Предложен комплексный подход к обследованию детей с помощью газожидкостной хроматографии, метода непрямой иммунофлюоресценции,

полимеразной цепной реакции, иммуноферментного анализа и культурального исследования для увеличения результативности этиологической диагностики обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких.

Внедрение результатов исследования в практику

Разработаны и используются в учебном процессе кафедры клинической лабораторной диагностики и бактериологии факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки ГБОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия» Минздрава России учебно-методические пособия: 1) «Микробиологическое исследование мокроты у детей»; 2) «Лабораторные методы обнаружения, идентификации и определения резистентности к антибиотикам Moraxella catarrhalis».

Разработаны и внедрены в работу лаборатории клинической микробиологии ГБУЗ СО «Областная детская клиническая больница № 1» (г. Екатеринбург): 1) алгоритм действий при микроскопической оценке качества мокроты у детей для культурального исследования; 2) способ выявления ß-лактамазопродуцирующих оксидазопозитивных

грамотрицательных диплококков, подозрительных на принадлежность к Moraxella catarrhalis; 3) критерии оценки результатов выявления маркеров бактериальной инфекции методом газожидкостной хроматографии при обострении хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей; 4) питательная среда для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала (кровяно-сывороточный агар). Питательная среда для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала (кровяно-сывороточный агар) также внедрена в работу микробиологической лаборатории МБУ «Детская городская клиническая больница №11» (г. Екатеринбург).

Публикации

Автор имеет 48 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликованы 23 научные работы общим объёмом 151 печатная страница, в том числе 6 статей в научных журналах, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов для опубликования основных научных результатов диссертаций, а также 1 работа в зарубежном научном издании.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 131 странице машинописного текста, иллюстрированы 23 таблицами и 20 рисунками, состоят из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 153 источника, из них 84 - отечественных и 69 -зарубежных.

ГЛАВА 1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ХРОНИЧЕСКИХ ИНФЕКЦИОННО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЕГКИХ У ДЕТЕЙ

(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Эпидемиологическая характеристика хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей

По данным Минздравсоцразвнтия Российской Федерации 2009 года, болезни органов дыхания неизменно стоят на первом месте в структуре общей заболеваемости детей и подростков. Доля болезней органов дыхания в структуре общей заболеваемости занимает у детей - половину, а у подростков -одну треть. Болезни органов дыхания у детей в возрасте 0-17 лет занимают III место в структуре причин смерти после внешних причин и пороков развития. По данным статистики, в РФ от болезней органов дыхания ежегодно умирает около 1000 детей. В структуре причин инвалидности в России среди детей до 15 лет болезни органов дыхания занимают 5-е место. При этом в последнее время отмечается неуклонный рост рецидивирующих и хронических форм болезней органов дыхания у детей (ежегодно 5-7%). За последние 20 лет распространенность этих заболеваний выросла с 5-6 до 35% [14, 64, 138, 139, 141].

Согласно классификации основных клинических форм бронхолегочных заболеваний у детей, к ХИВЗЛ относят облитерирующий бронхиолит (143), хронический бронхит (141), бронхоэктатическую болезнь (147) [26, 36, 65]. Первые труды, посвященные хроническим заболеваниям органов дыхания, появились в начале XIX века, а термин «хронические» впервые введен в практику клинической диагностики лишь в 1929 году [31]. Заболеваемость бронхитами, по данным ряда авторов, колеблется от 15%» до 50%. Этот процент существенно повышается (до 50-90%) у детей, часто болеющих острыми

респираторными заболеваниями, особенно в экологически неблагоприятных регионах [6, 12, 128]. Распространенность рецидивирующих бронхитов у детей составляет 2,5 на 1000 детей в возрасте 1-15 лет. Рецидивирующим бронхитом болеют 2,3% детей в возрасте до 3 лет, 7,1% дошкольного и 2,6% школьного возраста [5, 30]. По данным Министерства здравоохранения РФ, в России в 2001 г. было зарегистрировано 55643 детей (до 14 лет) и 31196 подростков (1517 лет), больных хроническим бронхитом, и 20729 детей и 5629 подростков с бронхоэктатической болезнью. Однако сведения о ее распространенности среди населения не могут считаться достаточно точными, поскольку наиболее достоверный признак болезни — локально расширенные бронхи — диагностируется лишь при использовании специальных методов исследования [6, 28, 112, 113].

Ряд исследователей отмечают, что ХИВЗЛ чаще болеют мальчики, чем девочки. Основную роль в развитии ХИВЗЛ играют острые респираторные заболевания и острые пневмонии, перенесенные в первые годы жизни ребенка [12, 25, 128]. Наблюдающиеся при острых респираторно-вирусных инфекциях резкое снижение иммунологической реактивности и функционально-морфологические изменения органов дыхательной системы способствуют обсеменению бронхиального дерева патогенными и условно-патогенными микроорганизмами и развитию бактериального инфекционного процесса. К другим факторам, способствующим формированию ХИВЗЛ относят неблагоприятное воздействие пренатального и постнатального фона (токсикоз во время беременности, асфиксия в родах, смешанное и искусственное вскармливание, конституциональные особенности и др.), пороки развития бронхов и легких, патологию периода новорожденности, аспирацию в бронхи инородного тела, патологию ЛОР-органов, компрессию бронхов среднего калибра гиперплазированными лимфоидными образованиями, иммунодефицитные состояния, «фоновые» состояния (экссудативно-катаральный диатез, гипотрофия и т.д.), неудовлетворительные жилищно-бытовые условия детей, курение родителей [28, 31, 96, 99, 108, 126].

Обращает на себя внимание тот факт, что в последние десятилетия наблюдается неуклонный рост распространенности ХИВЗЛ среди детского населения, который вероятно обусловлен недостаточно адекватным назначением антимикробных препаратов.

1.2 Этиология и антибиотикорезистентность ведущих бактериальных патогенов, вызывающих обострение хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей

До 40-50-х годов XX века ведущим этиологическим фактором обострений ХИВЗЛ считался пневмококк. В 60-е годы появляются исследования, в которых ведущую роль в возникновении и поддержании воспалительного процесса в бронхах отводят микрофлоре, в норме, обитающей в верхних дыхательных путях, особенно стафилококкам.

В 80-90-е годы на основании клинико-микробиологических и клинико-иммунологических данных, а также экспериментальных исследований наряду с пневмококком была показана этиологическая роль Н. influenzae в развитии обострений ХИВЗЛ [24].

На данный момент считается, что воспалительный процесс при обострениях ХИВЗЛ у детей реализуется и поддерживается бактериальной флорой, среди которой, в первую очередь, этиологическую роль играют следующие микроорганизмы: Н. influenzae и S. pneumoniae, а также недооцененный ранее - М. catarrhalis [21, 67, 70, 94, 111, 120, 128, 130]. Обращает на себя внимание тот факт, что у 54,6% всех больных с инфекцией, вызванной М. catarrhalis, диагностируется хроническая обструктивная болезнь легких [30, 72, 79, 97, 106, 123, 129, 133]. До сих пор существуют определенные трудности в выявлении М. catarrhalis по причине того, что: 1) безпигментные «сапрофитные» нейссерии, в норме обитающие в носоглотке, нередко контаминирующие мокроту, имеют сходную морфологию с М. catarrhalis -растут в виде беспигментных круглых непрозрачных полусферических беловато-серых колоний диаметром до 2-3 мм; гемолиз не образуют, при

бактериоскопии культур обнаруживаются грамотрицательные парные кокки, оксидазо- и каталазоположительные (раньше относились к одному семейству Neisseriaceae [29]); 2) при культуральном исследовании носоглотки или мокроты М. catarrhalis может быть не идентифицирована из-за подавления роста другими преобладающими микроорганизмами: Neisseria spp., Streptococcus viridans, Corynebacterium spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., в норме находящимися в носоглотке или контаминирующих мокроту. В 90-е годы М. catarrhalis обычно был высокочувствителен к пенициллину, но в настоящее время 95-100% клинических изолятов М. catarrhalis продуцируют ß-лактамазу [29, 34, 41, 88, 90, 125, 133].

Поэтому необходимы специализированные методы, позволяющие выделить, из мокроты или другого клинического материала дыхательных путей, ß-лактамазопродуцирующие штаммы М. catarrhalis.

В последние десятилетия в этиологической структуре обострений ХИВЗЛ отмечено увеличение удельного веса заболеваний, вызванных грамотрицательными неферментирующими бактериями и энтеробактериями [23, 71, 109, 117, 124]. У пациентов с хроническими бронхолегочными заболеваниями обнаружена связь в ассоциативном взаимодействии микробной флоры между бактериальными и вирусными, бактериальными и грибковыми патогенами [12, 25, 27, 128, 151, 152]. Микроорганизмы-ассоцианты взаимно влияют на основные биологические свойства друг друга. Например, стафилококки активируют факторы патогенности дрожжеподобных грибов и этим повышают их устойчивость к антимикотическим препаратам. Грибы рода Candida усиливают размножение Pseudomonas aeruginosa [3, 27, 40, 113, 132].

Одной из важных проблем на сегодняшний день является увеличение доли возбудителей обострений ХИВЗЛ с множественной устойчивостью к антибиотикам.

В настоящий момент, по отношению к ß-лактамным антибиотикам, описано ряд фенотипов Н. influenzae, связанных с продукцией ß-лактамаз и мутациями по пенициллинсвязывающим белкам: ß-лактамазонегативные

ампициллиночувствительные штаммы; ß-лактамазопродуцирующие

ампициллинорезистентные, ß-лактамазонегативные ампициллинорезистентные; ß-лактамазонегативные умеренно-резистентные к ампициллину и ß-лактамазопродуцирующие и резистентные к амоксициллин/клавулановой кислоте. ß-лактамазонегативные ампициллинорезистентные штаммы Н. influenzae являются также резистентными к ингибиторозащищенным пенициллинам и таким цефалоспоринам, как цефаклор, цефуроксим, цефиксим, цефтибутен [1, 55].

Проанализировав работы, посвященные антибиотикорезистентности основных пневмотропов, можно сделать заключение, что чувствительность одних и тех же микроорганизмов к антибактериальным препаратам зависит от места и времени выделения микроба. В 1990 году при исследовании 431 штаммов S. pneumoniae, 1272 Н. influenzae и 305 штаммов М. catarrhalis выделенных из мокроты пациентов, проживающих в Великобритании, выявлено снижение чувствительности к ампициллину и амоксициллину/клавуланату у 3% S. pneumoniae, при этом 8,1% были резистентны к тетрациклину и 6,5% - к эритромицину. Резистентность к ампициллину обусловленная продукцией ß-лактамаз обнаружена у 9,4% штаммов Н. influenzae-, 5,2% штаммов были устойчивы к ампициллину и амоксициллину/клавуланату, но были ß-лактамазотрицательные. 4,5% штаммов Н. influenzae были устойчивы к тетрациклину, и большинство (86,6%) имели минимальную подавляющую концентрацию > 1 мг/л для эритромицина [93, 140].

По данным I. Morrissey et al. [134] с 1999 по 2007 гг. в Великобритании увеличилась доля резистентных к ß-лактамам штаммов S. pneumoniae до 8% (1000 штаммов), 11% были резистентны к эритромицину и 7% - к тетрациклину. Из 1894 штаммов Н. influenzae 15% продуцировали ß-лактамазы, среди 845 штаммов М. catarrhalis 92% культур продуцировали ß-лактамазы.

По последним данным, во всем мире жертвами инфекций вызванных S. pneumoniae со сниженной чувствительностью к пенициллину составляет в среднем 18,2%. Количество штаммов Н. influenzae продуцирующих ß-

лактамазы примерно от 4% в России до 26% в США и до 31% во Франции. Распространенность ß-лактамазонегативных ампициллинорезистентных штаммов Н. influenzae составляет около 1% по всему миру, за исключением Японии, где частота намного выше [4, 89, 100, 115, 116, 134, 140, 143, 149]. Анализ показывает, что основными причинами инфицирования резистентными возбудителями являются молодой возраст, пребывание ребенка в детском саду и применение противомикробных препаратов [14, 30].

Данные многоцентрового микробиологического исследования антимикробной резистентности у клинических штаммов пневмококков, гемофил, стрептококков группы А и моракселл в России (ПеГАС: I - 1999-2003 гг.; II - 2004-2005 гг.; III - 2006-2009 гг.) показывают региональные различия. Уровень устойчивости пневмококков к пенициллину в нашей стране остается постоянным и не превышает 10%, при этом в большинстве случаев выявляются умеренно-резистентные штаммы.

Все пенициллинорезистентные изоляты S. pneumoniae сохраняют чувствительность к амоксициллину и амоксициллину/клавуланату, резистентность к цефтриаксону составляет 2,8%. Устойчивость S. pneumoniae к макролидам также не превышает 10%, но в динамике наблюдается незначительное увеличение доли нечувствительных (резистентных и умеренно-резистентных) к макролидам штаммов пневмококков, а также рост их устойчивости к клиндамицину. Высоко активными в отношении S. pneumoniae остаются «респираторные» фторхинолоны (левофлоксацин, моксифлоксацин, гемифлоксацин), ванкомицин, эртапенем.

Несмотря на существенное сокращение использования тетрациклина и триметоприма/сулаьфаметоксазола при респираторных инфекциях в амбулаторной практике сохраняется высокий уровень устойчивости пневмококков к данным препаратам. Уровень устойчивости к аминопенициллинам среди клинических штаммов Н. influenzae в РФ в 20032005 гг. составлял 5,4%. В то же время не обнаружены штаммы, устойчивые к амоксициллину/клавуланату, цефалоспоринам III поколения (цефтриаксон),

карбапенемам, фторхинолонам. Резистентность к тетрациклину составила 5%. Наиболее высокий уровень устойчивости Н. influenzae отмечался к триметоприму/сульфаметоксазолу (29,8% нечувствительных штаммов) [4, 13, 18, 70, 74].

Учитывая региональные различия в уровне чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам, необходимо знать локальные данные по распространенности и устойчивости к антибиотикам основных возбудителей обострений ХИВЗЛ (Н. influenzae, S. pneumoniae, М. catarrhalis). Это позволит предупредить необоснованное применение антимикробных препаратов и связанного с этим риск развития и распространения антибиотикорезистентности.

1.3 Микроскопическое исследование мокроты у детей

Культуральное исследование мокроты начинают с микроскопической оценки годности собранного образца. В педиатрии бактериологический анализ мокроты не имеет широкого применения, так как кашлевой рефлекс формируется не сразу, поэтому возникает ряд технических трудностей при сборе проб у детей до 7-10 лет и, следовательно, повышается вероятность контаминации мокроты микрофлорой зева.

Мокрота - выделяемый при отхаркивании патологически измененный трахеобронхиальный секрет, к которому в носовой части глотки и полости рта обычно примешиваются секрет её слизистой оболочки и придаточных околоносовых пазух, слюна, включающие во многих случаях микроорганизмы, которые обычно связывают с легочными инфекциями. Количество таких бактерий высоко при дисбиозе верхних дыхательных путей - качественном, когда изменяется видовой состав, и/или количественном - изменение концентрации присутствующих микроорганизмов у ослабленного и/или иммунокомпроментированного пациента.

Разграничение нормального и патологического трахеобронхиального секрета представляет собой большие трудности в связи с разнообразием

методов его получения и большой вариабельностью параметров физико-химических свойств трахеобронхиального секрета в норме. Некоторых ошибок можно избежать, если строго соблюдать правила сбора мокроты и перед посевом на питательные среды производить ее макро- и микроскопическую оценку.

Но в руководствах как отечественных, так и зарубежных существуют значительные разночтения в соотношении и составе клеточных элементов, количестве просматриваемых полей зрения и других приемов микроскопического исследования мокроты.

Типичным признаком мокроты при цитологическом исследовании нативного и окрашенного препарата является наличие альвеолярных макрофагов [43]. Альвеолярные макрофаги в препаратах, окрашенных по Романовскому-Гимзе, характеризуются полиморфизмом величины и формы клеток и ядер, их количеством, что зависит от вязкости слизи, в которой они находятся. Однако, по мнению ряда авторов, наличие альвеолярных макрофагов в мокроте для бактериологического исследования, в которой более 25 ПЯЛ и менее 10 клеток ДПКЭ, при 100-кратном увеличении микроскопа, не значительно увеличивает диагностическую ценность этих образцов [135]. Поэтому мокрота, не содержащая альвеолярных макрофагов, но в которой более 25 ПЯЛ и менее 10 клеток ДПКЭ может быть использована для культурального исследования.

При оценке пригодности мокроты для микробиологического (культурального) анализа определяют два принципиально важных показателя -ПЯЛ и ДПКЭ, но их количественная характеристика варьирует у разных авторов [9, 11, 13, 15, 22, 29, 32, 34, 47, 82, 122, 125, 127, 135, 138].

Мазок мокроты, окрашенный по Граму, необходимо начинать исследовать при малом увеличении (объектив х10) микроскопа, определяя количество ПЯЛ (число которых пропорционально количеству гноя в мокроте) и ДПКЭ (они попадают в мокроту из полости рта, носоглотки). Затем производят микроскопию под иммерсией (объектив х90 или хЮО) для изучения

морфологии микроорганизмов (разрешающая способность светового микроскопа 104 колонеобразующих единиц на миллилитр (КОЕ/мл)). Для острой инфекции характерно наличие в мокроте 1-2 видов бактерий, расположенных вблизи гранулоцитов. Микроорганизмы-контаминанты мокроты, попавшие в неё из ротовой полости, напротив, чаще расположены вблизи эпителиальных клеток [37, 47].

Согласно приказу № 535 от 22 апреля 1985 г. «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях ЛПУ» [47] следует обращать внимание на наличие гранулоцитов, как признака воспалительного процесса в нижних отделах дыхательного тракта, а при их отсутствии и большом количестве эпителиальных клеток - рассматривать данный образец как неправильно забранный (с примесью слюны), что требует его повторного взятия.

Руководства по клинической микробиологии [11, 29, 37, 92] рекомендуют применение одной из специально разработанных количественных шкал оценки. Использование каждой из них предполагает микроскопию окрашенного по Граму мазка из гнойной части мокроты под малым увеличением (объектив х10). При использовании шкалы Barlett просматривают 20-30 полей зрения, давая каждому оценку путем суммирования баллов, в зависимости от количества нейтрофилов, эпителиальных клеток, слизи. Затем рассчитывают средний балл: складывают все начисленные баллы и делят сумму на количество просмотренных полей. Если полученный результат равен нулю или менее, вероятность воспаления мала, или мокрота, по всей видимости, контаминирована в ротовой полости. Такие образцы не подлежат бактериологическому исследованию, и взятие мокроты должно быть повторено.

По данным Murray Washington, принадлежность образца мокроты к определенной группе устанавливается по количеству в поле зрения лейкоцитов и эпителиальных клеток при микроскопии с объективом х10. При этом бактериологическому исследованию подлежат только образцы, принадлежащие

к четвертой группе (10-25 эпителиальных клеток, 25 лейкоцитов) и пятой группе (менее 10 эпителиальных клеток, 25 лейкоцитов) [11, 29].

Согласно данным американских авторов [125] исследуется много полей при малом увеличении (объектив х10) для оценки адекватности материала по количеству эпителиальных клеток и нейтрофилов, а также с иммерсией для характеристики бактерий. Первая-третья группа не подлежит культуральному исследованию, образцы должны быть повторены. Пробы мокроты, содержащие более 25 эпителиальных клеток и менее 10 нейтрофилов при стократном увеличении микроскопа и множестве микроорганизмов, должны быть расценены как содержащие нормальную флору ротовой полости и не исследоваться культурально. Образцы мокроты, содержащие более 25 нейтрофилов при отсутствии эпителиальных клеток (100 кратное увеличение) и один преобладающий микроорганизм должны быть оценены как показатель инфекционно-воспалительного процесса данной локализации. Пробы мокроты, содержащие более 25 нейтрофилов и менее 10 эпителиальных клеток (100 кратное увеличение) при отсутствии микроорганизмов исследуются на такие возбудители как Legionella spp., Mycoplasma spp. или Mycobacterium tuberculosis. Более того, образцы, содержащие более 25 нейтрофилов (100 кратное увеличение) и один преобладающий микроорганизм, но не давшие рост при посеве, могут свидетельствовать о наличии анаэробных, «прихотливых», или антибиотик-поврежденных микроорганизмах.

Ряд авторов считают, что пригодным является образец мокроты, где при микроскопическом исследовании под малым увеличением (объектив х10 и окуляр х10) в ста полях зрения обнаруживается не более 10 клеток слущенного эпителия [34].

При оценке пригодности мокроты для культурального исследования общепринятым является следующее соотношение клеточных элементов: более 25 ПЯЛ и менее 10 ДГЖЭ в поле зрения при малом увеличении микроскопа (объектив х10) [9, 13, 15, 22, 32, 82, 127].

Только посев мокроты в целях выделения представителей родов Legionella и Mycobacterium, необходимость которого диктуется конкретной клинической ситуацией, не требует предварительного цитологического исследования [9, 118].

V. Lakshmi et al. [122] рекомендуют рассчитывать коэффициент качества мокроты, Q: при использовании данной шкалы оценивают в баллах от «-3 до О» количество ДПКЭ и в баллах от «О до +3» - количество ПЯЛ, затем определяют коэффициент качества мокроты Q. Если Q равен О, -1, -2, -3, вероятность воспаления мала или мокрота, по всей видимости, контаминирована микрофлорой верхних дыхательных путей и ротоглотки. Такие образцы не подлежат бактериологическому исследованию, и взятие мокроты должно быть повторено.

Таким образом, до настоящего времени нет однозначных критериев к микроскопической оценке годности мокроты для культурального исследования, особенно у детей.

1.4 Особенности культивирования бактериальных пневмотропов

Для культивирования бактериальных пневмотров очень важен выбор питательных сред для посева патологического материала от детей с обострением ХИВЗЛ в связи с многочисленностью возбудителей и разнообразием клинического материала.

В настоящее время для посева отделяемого дыхательных путей (отделяемое слизистой зева и носа; мокрота; содержимое бронхов, полученное при бронхоскопии или при отсасывании через трахеостому; экссудаты; резецированные ткани и др.) наиболее часто используют следующие питательные среды:

- 5% кровяной агар для первичного выделения микроорганизмов и определения их гемолитических свойств, рекомендованный приказом № 535 от 22 апреля 1985 года [47]. К недостаткам этой питательной среды следует отнести: низкие ростовые свойства для «прихотливых» микроорганизмов, в

частности для S. pneumoniae, Streptococcus pyogenes и других ß-гемолитических стрептококков.

- среда для посева и выделения S. pneumoniae по прописи JI.K. Катосовой [15]. К недостаткам данной среды следует отнести использование лошадиной сыворотки, что для большинства практических лабораторий затруднительно, и значительно увеличивает себестоимость конечного продукта.

- агар с сердечной вытяжкой (с добавлением крови), который используют для выделения и культивирования большого количества разнообразных микроорганизмов. В частности, его используют при приготовлении кровяного агара с 5% дефибринированной кровью кролика, лошади или барана для определения гемолитической активности S. pneumoniae, S. pyogenes [62]. К недостаткам последних сред следует отнести их высокую себестоимость и использование дефицитных компонентов в приготовлении недоступных для большинства практических лабораторий.

Поэтому необходима высокоэффективная, качественная и в тоже время доступная практическим лабораториям питательная среда для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала, в том числе «прихотливых».

1.5 Состояние некоторых показателей гуморального иммунитета у здоровых и больных хроническими инфекционно-воспалительными заболеваниями легких детей

Ответная иммунная реакция в виде стимуляции синтеза антител к различным антигенам микроорганизма у здоровых детей происходит либо при острой инфекции, либо при назофаренгиальном носительстве соответствующего микроорганизма. Кроме того возможна продукция антител на общие эпитопы антигенов Escherichia coli К-100, S. pneumoniae типа 6, некоторых видов лактобактерий и стафилококков, перекрестно реагирующих с капсульным материалом патогенов, в частности Н. influenzae типа b [86, 98, 101, 105, 111].

У детей с ХИВЗЛ с одной стороны неспецифическая реакция гуморального иммунитета в большинстве случаев проявляется более выским уровнем антител из-за более длительной антигенной стимуляции, что также зависит от распространенности и активности воспалительного процесса в легких. С другой стороны именно среди больных с ХИВЗЛ чаще выявляются лица с недостаточностью гуморального иммунитета в виде гипоиммуноглобулинемии, чем среди детей с острыми заболеваниями легких [20, 60, 101]. В этих условиях только использование иммунологического исследования в совокупности с другими методами позволит выявить этиологический агент обострения ХИВЗЛ у детей.

Уровень антител к патогенным и условно-патогенным бактериям обусловлен эпидемиологическими особенностями распространения того или иного возбудителя и зависит от: возраста детей, территории где проводилось исследование, контингента обследуемых детей.

Основными антигенами Н. influenzae, к которым вырабатываются антитела являются капсульные полисахариды и белки внешней мембраны (пять основных белков - Р1, Р2, Р4, Р5, Р6 - составляют 80% от общего количества белков внешней мембраны капсульных и бескапсульных штаммов).

Концентрация антител против капсульного полисахарида Н. influenzae типа b в сыворотках здоровых имеет следующее распределение: уровень материнских антител в крови новорожденных постепенно снижается с 0,18 мкг/мл в возрасте 0-6 месяцев до 0,09 мкг/мл к 12 месяцам, затем до 5 лет концентрация антител остается низкой - около 0,20 мкг/мл, в дальнейшем постепенно повышается, достигая к 15 годам значений как у взрослых. Подобная закономерность изменения уровня антител в сыворотки крови характерна и для антител против белков внешней мембраны Н. influenzae [84, 85,91,99, 110, 114, 119, 144].

Минимальный защитный уровень антител против капсульного полисахарида Н. influenzae типа Ь, по данным S.A. Plotkin [136] равен 60-150 нг/мл или, согласно U.K. Griffiths et al. [103] >0,15 мг/л и становиться таковым

примерно к 5-7 годам жизни. Отсутствие или незначительный уровень защитных антител является главным фактором риска развития инвазивных заболеваний, вызываемых Н. influenzae типа Ь. Кроме того, антитела имеют и обеспечивают иммунитет к инфекции того же, но не гетерогенного серотипа.

Антигенами S. pneumoniae, к которым вырабатываются антитела, также являются капсульные полисахариды и белки внешней мембраны. Геометрические средние концентрации IgG к капсульному полисахариду S. pneumoniae у здоровых детей низкие в возрасте от 6 месяцев до 1 года (9,2 мг/л), затем постепенно увеличиваются, чтобы достичь уровня взрослого населения (59,5 мг/л) в возрасте от 8 до 11 лет [75, 95].

N. Gupta et al. и G.I. Parameswaran et al. [Ill, 129] отмечено, что уровень IgG к антигенам M. catarrhalis в сыворотке значительно больше после обострений ХИВЗЛ по сравнению с бессимптомным носительством М. catarrhalis, в то время как нарастание титра антител к Н. influenzae происходит во время обострения ХИВЗЛ, что сочетается с усилением колонизации данного микроорганизма [111, 129].

Определение антител к патогеным и условно-патогенным бактериям расширяет возможности оценки качественных и количественных показателей иммунного отклика на возбудитель при обострении ХИВЗЛ, а также их определение в совокупности с другими методами может повысить этиологическую расшифровку обострений ХИВЗЛ.

1.6 Клиническое значение короткоцепочечных жирных кислот при бронхолегочной патологии

Исследования последних лет свидетельствуют, что неспорообразующие анаэробы и их ассоциации с аэробами играют важную роль в развитии как острой, так и обострения хронической инфекции при легочной патологии. Доля бесспоровых анаэробов в подобных ассоциациях может доходить до 80-85%. Среди неспорогенных анаэробов, имеющих наибольшее клиническое значение, в первую очередь, выделяют группу грамотрицательных палочек (различные

виды родов Bacteroides и Fusobacterium), группу грамположительных кокков (.Peptococcus spp. и Peptostreptococcus spp.) и группу грамположительных палочек {Bifidobacterium spp., Eubacterium spp. и др.) [10, 16, 19, 42, 77].

Анаэробные микроорганизмы, являясь представителями нормальной микрофлоры, в то же время имеют потенциальные способности для развития инфекционного процесса практически в любом органе. Для транслокации анаэробов необходимо ряд условий: нарушение целостности эпителиальных барьеров; наличие нарушений, обуславливающих дефекты в клеточных и гуморальных иммунных механизмах специфической и неспецифической защиты; инфицирующая доза оппортунистического патогена должна превышать компенсаторные механизмы; приобретение микроорганизмами различных факторов патогенности.

Из-за трудностей, связанных с выделением анаэробных бактерий и необходимым для этого временем, диагноз анаэробных инфекций нередко должен основываться только на предположении. В диагностике анаэробной инфекции различают несколько решающих условий: 1) получение соответствующих проб непосредственно из участка поражения с максимальным предохранением от загрязнения нормальной флорой; 2) их быстрая доставка в микробиологическую лабораторию. Наилучшие результаты получают при посеве материала на питательную среду в момент взятия (90-100% высеваемости). При посеве, на среду спустя два часа после взятия материала выделяемость на 20% ниже. Высеваемость же из материала, доставленного без герметизации, составляет только 5%. Время полного бактериологического анализа 5-7 дней и более. Данные условия так же часто наблюдаются у детей с обострением ХИВЗЛ.

Однако, учитывая физиологические особенности этой обширной группы микроорганизмов и их высокие питательные потребности, культивирование анаэробов представляется сложным и недоступным для большинства бактериологических лабораторий.

Поэтому главное значение приобретают методы экспресс-диагностики анаэробной инфекции, позволяющие подтвердить диагноз в течение нескольких часов. Для изучения метаболитов микрофлоры в последние годы используются хроматографические методы: газожидкостная, ионная, высокоэффективная жидкостная хроматография, хромато-масс-спектрометрия. Ряд методов исследования обладают трудоемкой пробоподготовкой с потерей 20% общего пула короткоцепочечных жирных кислот (КЖК), неудовлетворительным разделением изомеров кислот; другие - использованием дорогостоящих приборов и длительностью исследования.

Основным методом быстрого обнаружения и идентификации микроорганизмов в настоящее время является газожидкостная хроматография (ГЖХ). Диагностика инфекции, дисбиозов и воспалительных процессов возможна по специфическим микробным химическим веществам (маркерам). Химические маркеры содержатся в клетках микроорганизмов или продуцируются ими в процессе жизнедеятельности. Идея диагностики по химическим маркерам заключается в том, что они отличаются по химическому строению от вещества клеток человека. В данном случае, речь идет о разнообразных жирных кислотах, в том числе КЖК, которых у человека немногим более 20 видов, а у микробов - более 200 [10, 22, 72]. Среди КЖК (фракции С2-С6) выделяют: уксусную (С2), пропионовую (Сз), масляную (СД изомасляную (1С4), масляную (С4), изовалериановую (1С5), валериановую (С5), изокапроновую (1С6) и капроновую (Сб) кислоты [5, 22, 73].

ГЖХ позволяет использовать для анализа любой клинический материал -экссудаты, кровь, мочу, плевральную, перитонеальную, спинномозговую жидкости и т.д. [10, 16, 19, 42, 77].

Важность газожидкостной хроматографии для научных исследований в области микробиологии и медицины в настоящее время общеизвестна. Но работы, касающиеся легочной патологии, встречаются в ограниченном количестве и имеют отношение в основном к хроническим обструктивным

болезням взрослых [19] или пневмонии у детей, находящихся на искусственной вентиляции легких [16].

1.7 Применение полимеразной цепной реакции в диагностике обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких

В повседневной практике для экспресс-диагностики инфекционных болезней все шире применяют молекулярно-генетические методы, основанные на выявлении фрагментов генома микроорганизмов. Наибольшее распространение получили методы амплификации нуклеиновых кислот, в число которых входит и ПЦР [29, 37].

ПЦР можно использовать для выявления микроорганизмов непосредственно в клиническом материале. Предлагаемые на настоящий момент коммерческие наборы реагентов (тест-систем) для выявления методом ПЦР фрагментов генома S. pneumoniae {Streptococcus spp.), Н. influenzae в клиническом материале при бронхолегочной патологии, предназначены для диагностики пневмоний, либо ларингита, тонзиллита [29, 37]. В отечественной литературе публикаций об эффективности использования молекулярно-генетического метода для обнаружения пневмококка или гемофильной палочки при обострениях хронических неспецифических бронхолегочных патологий у детей практически нет [63].

ПЦР можно использовать также для типирования штаммов S. pneumoniae выделенных при обострении ХИВЗЛ у детей. Серологическая характеристика S. pneumoniae достаточно хорошо изучена, всего выделяют 46 серогрупп и 91 серотип пневмококка исходя из антигенных свойств полисахаридной капсулы. Около 20 серотипов S. pneumoniae связаны с более чем 80% инвазивных пневмококковых заболеваний [33, 44, 54, 68, 83].

Согласно отечественным и зарубежным научным публикациям серотиповой спектр пневмококка имеет отличия в зависимости от возраста

ребенка, временного фактора и географического региона, когда проводили исследование [24, 35, 66, 68, 69, 83, 145, 146, 147, 150].

Пневмококковая вакцина является частью программы плановой иммунизации детей, поддерживаемой многими странами. В настоящее время разработаны и разрешены к применению следующие пневмококковые вакцины: конъюгированные - 7- (зарегистрирована в 90 странах, включая США, страны ЕС, РФ), 10- (зарегистрирована в странах ЕС, готовиться к регистрации в РФ), 11- (используют в отдельных странах - США, Великобритания, Австрия) 13-валентные (зарегистрирована в странах ЕС, США, РФ) и полисахаридная 23-валентная (зарегистрирована в РФ) [68, 75, 104, 147, 148, 153]. Конъюгированные вакцины отличаются числом серотипов пневмококка, входящих в их состав, белками-конъюгантами и количеством полисахаридов для каждого конъюганта. В состав 7-валентной включены 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F серотипы, в 10-валентную вакцину входят дополнительно серотипы 1, 5 и 7F к существующей группе серотипов, включенных в 7-валентную конъюгированную вакцину, а в 13-валентную добавлены также 3, 6А и 19А серотипы пневмококков. Известно, что титр антител на серотипы 6А и 19А у 13-валентной вакцины был выше, чем у 7-валентной [61, 68]. Полисахаридная 23-валентная пневмококковая вакцина содержит очищенные капсульные полисахариды S. pneumoniae 23 серотипов: 1, 2, 3, 4, 5, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 19F, 19А, 20, 22F, 23F, 33F, данная вакцина обладает низкой эффективностью у детей до 2 лет, потому что Т-независимые полисахаридные антигены трудно распознаваемы незрелой иммунной системой новорожденных и детей раннего возраста. В то время как 7-валентная конъюгированная вакцина показала свою эффективность и у детей младше 2 лет [59, 68]. Современные рекомендации дополнительного использования пневмококковой вакцины относятся к детям и взрослым с обострениями ХИВЗЛ. Среди взрослых с бронхоэктатической болезнью, получавших 23-валентную пневмококковую вакцину и вакцину против гриппа, по сравнению с контрольной группой (получавшей вакцину только против гриппа) обнаружено

значительное снижение частоты инфекционных обострений бронхоэктатической болезни, а также уменьшилось количество пациентов, нуждающихся в лечении в течение 2-лет после вакцинации. В другом исследовании у детей после применения пневмококковой вакцины была обнаружена более эффективная элиминация S. pneumoniae из мокроты. В настоящее время обсуждается вопрос об использовании 23-валентной пневмококковой вакцины в качестве рядового назначения при лечении. Для уточнения частоты введения пневмококковой вакцины и ее влияния на параметры функции внешнего дыхания проводятся дополнительные исследования [137].

Типирование пневмококков необходимо для изучения этиологии обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких. Кроме того, зная результаты серотипирования S. pneumoniae на конкретных территориях можно проводить целенаправленную иммунизацию детей пневмококковыми вакцинами, которые являются частью программы плановой иммунизации многих странах.

В последние десятилетия наблюдается неуклонный рост распространенности ХИВЗЛ среди детского населения, который вероятно обусловлен недостаточно адекватным лечением острых респираторных заболеваний и острых пневмоний, перенесенных в первые годы жизни ребенка. Для своевременной и качественной диагностики обострений ХИВЗЛ у детей требуется изучение этиологической роли разных микроорганизмов, в том числе их биотипов и серотипов, в возникновении обострения воспалительного процесса, антибиотикочувствительности данных патогенов и диагностических возможностей, как культурального исследования клинически значимого материала, так и других лабораторных методов.

Выявление возбудителей необходимо как для назначения рациональной этиотропной антибактериальной терапии, так и прогнозируемой эмпирической, а также для применения различных методов профилактики обострений ХИВЗЛ у детей.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Саматова, Елена Валерьевна

ВЫВОДЫ

1. Доказана диагностическая ценность проведения культурального исследования у детей образцов мокроты, содержащих: 1 и более полиморфноядерных лейкоцитов при отсутствии десквамированного плоскоклеточного эпителия, 10 и более полиморфноядерных лейкоцитов при 19 клеток десквамированного плоского эпителия, более 25 полиморфноядерных лейкоцитов при 10-24 клеток десквамированного плоского эпителия, в других случаях образцы не должны подлежать бактериологическому анализу.

2. Разработанный состав питательной среды для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала (кровяно-сывороточный агар) и способ выявления ß-лактамазопродуцирующих оксидазопозитивных грамотрицательных диплококков, подозрительных на принадлежность к Moraxella catarrhalis позволяют повысить выделение из клинического материала Streptococcus pneumoniae на 52,7% и ß-лактамазопродуцирующих штаммов Moraxella catarrhalis на 66,7%.

3. Определены критерии оценки результатов выявления маркеров бактериальной инфекции в зависимости от качественного и количественного состава короткоцепочечных жирных кислот в различных клинических материалах при обострении хронических инфекционно-воспалительных заболеваниях легких у детей.

4. При обострении хронических инфекционно-воспалительных заболеваниях легких у детей доминируют серотипы Streptococcus pneumoniae 6А, 6В; 23F; 19F и неделимая совокупность - 8, 9V, 9А, 11F, IIA, IIB, 11С, 11D, 12F, 15А, 33F, которые в сумме составляют 73,1%» от всех выявленных серотипов.

5. Установлено, что использование только культурального метода для определения этиологии обострения хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей в 48,9% случаев неинформативно, в то время как метод газожидкостной хроматографии в 84,5% эпизодов позволил определить маркеры бактериального возбудителя. Но лишь комплексный подход к обследованию детей позволяет в 88,6% случаев установить причины обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИ

1. Проводить комплексное обследование детей с обострением ХИВЗЛ, включающее параллельное назначение следующих исследований: культуральное исследование клинического материала из нижних дыхательных путей; выявление маркеров анаэробной инфекции методом газожидкостной хроматографии в БАЛ, мокроте, плевральном выпоте; определение методом непрямой иммунофлюоресценции IgG, IgM в сыворотке крови к возбудителям атипичных пневмоний; выявление методом ПЦР в клиническом материале из нижних дыхательных путей ДНК Н. influenzae и S. pneumoniae-, определение уровня IgG иммуноферментным анализом в парных сыворотках крови к Н. influenzae типа b и S. pneumoniae.

2. При культуральном исследовании внедрить предлагаемый алгоритм действий при микроскопической оценке качества мокроты у детей: осуществлять посев образцов, содержащих 1 и более полиморфноядерных лейкоцитов при отсутствии десквамированного плоскоклеточного эпителия, 10 и более полиморфноядерных лейкоцитов при 1-9 клеток десквамированного плоского эпителия, более 25 полиморфноядерных лейкоцитов при 10-24 клеток десквамированного плоского эпителия, в других случаях образцы не должны подлежать бактериологическому анализу.

3. Для посева клинического материала из нижних дыхательных путей и выявления S. pneumoniae, ß-лактамазопродуцирующих штаммов М. catarrhalis использовать кровяно-сывороточный агар, следующего состава: на 100 мл основы приготовленной из сухого питательного агара для культивирования микроорганизмов (ГМФ - агар) при 45 °С добавляют эритроцитарную массу из донорской крови человека - 3 мл, сыворотку крупного рогатого скота - 5 мл, дрожжевой экстракт - 3 мл и способ обнаружения ß-лактамазопродуцирующих штаммов М. catarrhalis основанным на применении диска с пенициллином 10

ЕД., вокруг которого подавляется рост большинства микроорганизмов, являющихся представителями нормальной микрофлоры верхних дыхательных путей.

4. Внедрить в работу практических лабораторий газожидкостную хроматографию для выявления маркеров бактериальной инфекции в БАЛ, мокроте, плевральном выпоте при обострении ХИВЗЛ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Саматова, Елена Валерьевна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Авдеев, С.Н. Инфекционное обострение ХОБЛ: алгоритм лечения / С.Н. Авдеев // Фарматека. - 2012. - № 11. - С. 48-53.

2. Авдеев, С.Н. Фенотипы хронической обструктивной болезни легких: особенности терапии / С.Н. Авдеев // Consilium Medicum. - 2010. - № 1. - С. 23-29.

3. Аллергические заболевания легких у детей, ассоциированные с грибковой сенсибилизацией / Т.А. Миненкова, Ю.Л. Мизерницкий, Е.А. Ружицкая // Пульмонология детского возраста: проблемы и решения. - Москва, 2009.-Вып. 9.-С. 152-156.

4. Анализ антибактериальной терапии госпитализированных пациентов с внебольничной пневмонией в различных регионах РФ: уроки многоцентрового фармакоэпидемиологического исследования / С.А. Рачина, Р.С. Козлов, Е.П. Шаль [и др.] // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2009. - Т. 11, № 1. - С. 66-78.

5. Антипкин, Ю.Г. Рецидивирующий бронхит у детей: дискуссионные вопросы / Ю.Г. Антипкин, В.Ф. Лапшин, Т.Р. Уманец // медицинская газета «Здоровье Украины». - 2008. - № 18/1. - С. 19-21.

6. Артамонов, Р.Г. Бронхиты / Р.Г. Артамонов // Медицинский научный и учебно-методический журнал. - 2008. - № 42. - С. 3-24.

7. Бактериологический контроль питательных сред : метод, рекомендации в помощь бактериологам санитарно-эпидемических станций и больниц / М-во здравоохранения РСФР. - Хабаровск, 1979. - 42 с.

8. Баранов, А.А. Современные подходы в изучении заболеваемости детского населения России / А.А. Баранов, В.Ю. Альбицкий, В.И. Бондарь [и др.] // Российский педиатрический журнал. - 2008. - № 5. - С. 4-7.

9. Барлетт, Д.Д. Инфекции дыхательных путей : пер. с англ. / Д.Д. Барлетт. - М. : Бином, 2000. - 192 с.

10. Белобородова, Н.В. Гомеостаз малых молекул микробного происхождения и его роль во взаимоотношениях микроорганизмов с организмом хозяина / Н.В. Белобородова, Г.А. Осипов // Вестник РАМН. -1999.-Т. 16, №7.-С. 25-31.

11. Введение в клиническую микробиологию / А.Г. Бойцов, В.П. Иванов, О.Н. Ластовка [и др.] - Санкт-Петербург : СПбГМА им. И.И. Мечникова, 1999. - 102 с.

12. Веревщиков, В.К. Профилактика и лечение вирусных инфекций у детей с отягощенным анамнезом / В.К. Веревщиков, А.Н. Копылов, А.Ю. Павлов // Поликлиника. - 2008. - № 6. - С. 81-83.

13. Внебольничная пневмония у взрослых: практические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике : пособие для врачей / А.Г. Чучалин, А.И. Синопальников, P.C. Козлов [и др.] - Москва : Российское респираторное общество, МАКМАХ, 2010.-106 с.

14. Волков, И.К. Хроническая обструктивная болезнь легких - взгляд педиатра / И.К. Волков // Лечащий врач. - 2011. - № 8. - С. 12-15.

15. Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам Streptococcus pneumoniae / О.И. Кречикова, P.C. Козлов, О.У. Стецюк [и др.] // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2000. - Т. 2, № 1. - С. 88-89.

16. Диагностика анаэробной инфекции у детей методом хроматографии : метод, рекомендации [Электронный ресурс] / Н.В. Белобородова, В.А. Курчавов, Н.Б. Бойко [и др.]. - Режим доступа: http://www.rusmedserv.com/microbiology/mikrdiag/article_10.html.

17. Диагностика и лечение хронических бронхолегочных заболеваний у детей : метод, рекомендации № 4 / Департамент здравоохранения Правительства Москвы. - Москва, 1996. - 14 с.

18. Динамика резистентности Streptococcus pneumoniae к антибиотикам в России за период 1999-2009 гг. (Результаты многоцентрового проспективного исследования ПеГАС) / Р.С. Козлов, О.В. Сивая, О.И. Кречикова [и др.] // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2010. - Т. 12, № 4.-С. 329-341.

19. Дорофеев, А.Э. Значение короткоцепочечных жирных кислот в патогенезе ХОБЛ и возможные методы коррекции / А.Э. Дорофеев // медицинская газета «Здоровье Украины». - 2009. - № 13-14. - С. 76-77.

20. Заболевания иммунной системы. Диагностика и фармакотерапия / Н.М. Калинина, С.А. Кетлинский, С.В. Оковитый [и др.]. - Москва : Эксмо, 2008. - 496 с.

21. Зайцев, А.А. Современные режимы антибактериальной терапии инфекций нижних дыхательных путей / А.А. Зайцев, И.Ц. Кулагина, Т.В. Пучнина // Лечащий врач. - 2011. - № 9. - С. 10-15.

22. Зубков, М.Н. Практическое руководство по клинической микробиологии и антимикробной терапии для врачей стационарной помощи / М.Н. Зубков. - Москва : Издательство МГУП, 2002. - 272 с.

23. Изучение распространенности редких и труднокультивируемых возбудителей воспалительных заболеваний органов дыхания / Е.В. Сперанская,

B.Н. Мазепа, Е.И. Ефимов [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2012. - № 5. - С. 3-7.

24. Катосова, Л.К. Клинико-биологическая оценка пневмотропной флоры при острых и хронических бронхолегочных болезнях у детей : автореф. дис. ... д-ра биол. наук / Л.К. Катосова. - Москва, 1990. - 48 с.

25. Ким, С.С. Роль вирусов при внебольничных пневмониях у детей /

C.С. Ким // Вопросы диагностики в педиатрии. - 2012. - Т. 4, № 4. - С. 21-25.

26. Классификация клинических форм бронхолегочных заболеваний у детей / под ред. Н.А. Геппе, Н.Н. Розиновой, И.К. Волкова [и др.]. - Москва : Российское респираторное общество, 2009. - 18 с.

27. Климко, H.H. Микозы : руководство для врачей / H.H. Климко. - 2-е изд. - Москва : Премьер МТ, 2008. - 336 с.

28. Клииико-микробиологические особенности больных с острым деструктивным бронхитом / H.A. Савицкая, JI.B. Феклисова, Е.А. Воропаева [и др.] // сб. докладов на Всерос. конф. «Инфекционные аспекты соматической патологии у детей». - 2008. - С. 61-63.

29. Клиническая лабораторная диагностика : национальное руководство : в 2-х т. / под ред. В.В. Долгова, В.В. Меньшикова. - Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2012. - Т. II. - 808 с.

30. Ковалева, JI. Облитерирующий бронхиолит в подростковом и молодом возрасте: аспекты инфекционного воспаления / JI. Ковалева, Е. Суркова, Т. Гембицкая // Врач. - 2012. - № 1. - С. 7-10.

31. Козачок, H.H. Актуальные вопросы диагностики и лечения хронического обструктивного заболевания легких / H.H. Козачок, М.Н. Селюк // медицинская газета «Здоровье Украины». - 2008. - № 6. - С. 7-14.

32. Лазарева, A.B. Этиологическая информативность бактериоскопического исследования мокроты и трахеального аспирата у детей с хронической пневмонией / A.B. Лазарева, Л.К. Катосова, О.И. Симонова // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2009. - Т. 11, № 2, приложение 1. - С. 22.

33. Магаршак, О.О. Вакцинопрофилактика пневмокковой и гемофильной типа В инфекций в России / О.О. Магаршак // Медицинскй вестник. - 2010. - № 29 (534). - С. 3-5.

34. Мари, П.Р. Клиническая микробиология : краткое руководство : пер. с англ. / П.Р. Мари, И.Р. Шей. - Москва : Мир, 2006. - 425 с.

35. Маянский, А.Н. Патогенетическая микробиология : руководство / А.Н. Маянский. - Нижний Новгород : Изд-во НГМА, 2006. - 519 с.

36. Международная статистическая классификация болезней и проблем, связанных со здоровьем (МКБ-10) : в 2-х т. / Всемирная организация

здравоохранения. Десятый пересмотр. - ВОЗ Женева : Медицина, 1995. - Т. 1, часть 1.-С. 527-561.

37. Методики клинических лабораторных исследований : в 3-х т. / под редакцией В.В. Меньшикова. - М. : Лабора, 2009. - Т. 3. - 880 с.

38. Метод, указания по контролю работы паровых и воздушных стерилизаторов / Минздрав СССР от 28 февраля 1991 № 15/6-5. - Москва, 1991. -36 с.

39. Методы контроля бактериологических питательных сред : метод, указания 4.2.2316-08 / Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. - Москва, 2008. - 152 с.

40. Мизерницкий, Ю.Л. Дифференциальная диагностика и принципы дифференциальной терапии бронхообструктивногосиндрома при острой респираторной инфекции у детей / Ю.Л. Мизерницкий // Земский врач. - 2010. -№ 3. - С. 5-10.

41. Мизерницкий, Ю.Л. Современные подходы к антибактериальной терапии инфекций нижних дыхательных путей / Ю.Л. Мизерницкий, Е.В. Сорокина // Трудный пациент. - 2009. - Т. 7, № 12. - С. 6-10.

42. Минушкин, О.Н. Способ определения короткоцепочечных жирных кислот (фракции С2-С6 с изомерами) в различных биологических субстратах методом газожидкостной хроматографии : метод, рекомендации для врачей, руководителей органов управления здравоохранением и Л11У / О.Н. Минушкин, М.Д. Ар датская, Н.С. Иконников. - Москва, 2005. - 61 с.

43. Миронова, И.И. Общеклинические исследования: моча, кал, ликвор, мокрота / И.И. Миронова, Л.А. Романова, В.В. Долгов. - 2-е изд., исправ. и доп. - Москва-Тверь : ООО «Издательство Триада», 2009. - 302 с.

44. Миронов, O.K. Идентификация и серотипирование российских штаммов Streptococcus pneumoniae с применением методик, основанных на ПЦР / O.K. Миронов, А.Е. Платонов, P.C. Козлов // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2011. - Т. 13, № 4. - С. 304313.

45. О создании детского научно-практического пульмонологического центра Министерства здравоохранения Российской Федерации : приказ М-ва здравоохранения Рос. Федерации от 6 мая 1999 г. № 156. - Москва, 1999. - 4 с.

46. О совершенствовании медицинской помощи детям подросткового возраста : приказ М-ва здравоохранения Рос. Федерации от 05 мая 1999 г. № 154. - Москва, 1999. - 13 с.

47. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях ЛПУ : приказ № 535 от 22 апреля 1985 г. - Москва, 1985. - 126 с.

48. Об утверждении порядка оказания медицинской помощи больным с бронхо-легочными заболеваниями пульмонологического профиля : приказ М-ва здравоохранения и социального развития Рос. Федерации от 7 апреля 2010 г. № 222н. - Москва, 2010. - 30 с.

49. Об утверждении стандарта медицинской помощи больным с хронической обструктивной болезнью легких (при оказании специализированной помощи) : приказ М-ва здравоохранения и социального развития Рос. Федерации от 11 мая 2007 г. № 327. - Москва, 2007. - 18 с.

50. Об утверждении стандарта медицинской помощи больным хронической обструктивной болезнью легких : приказ М-ва здравоохранения и социального развития Рос. Федерации от 23 ноября 2004 г. № 271. - Москва, 2004.- 16 с.

51. Об установлении медико-экономических стандартов по оказанию медицинской помощи больным пневмонией, бронхиальной астмой, хронической обструктивной болезнью легких : приказ М-ва здравоохранения Свердловской области от 21 сентября 2011 г. № 952-п. - Екатеринбург, 2011. -20 с.

52. Об утверждении порядка оказания медицинской помощи населению по профилю «пульмонология» : приказ М-ва здравоохранения Рос. Федерации от 15 ноября 2012 г. № 916н. - Москва, 2012. - 23 с.

53. Об утверждении стандартов (протоколов) диагностики и лечения больных с неспецифическими заболеваниями легких : приказ М-ва здравоохранения Рос. Федерации от 9 октября 1998 г. № 300. - Москва, 1998. -20 с.

54. Определение капсульных серотипов пневмококка методом мультиплексной ПЦР / Н.А. Маянский, Н.М. Алябьева, JI.K. Катосова [и др.] // Вопросы диагностики в педиатрии. - 2010. - Т. 2, № 6. - С. 6-10.

55. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам : метод, указания 4.2.1980-04 / Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России. - Москва, 2004. - 86 с.

56. Оптимальный выбор терапии при внебольничной пневмонии у детей / А.Б. Малахов, И.А. Дронов, И.К. Волков [и др.] // Лечащий врач. - 2011. -№ 1.-С. 2-6.

57. Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды : метод, указания 2.1.4.1057-01 / М-во здравоохранения Рос. Федерации. - Москва, 2001. - 40 с.

58. Пат. 2220755 Российская Федерация «Способ разделения смеси жирных кислот фракции С2-Сб методом газожидкостной хроматографии» / Ардатская М.Д., Иконников Н.С., Минушкин О.Н. - № 2002119447 ; заявл. 23.07.02 ; опубл. 10.01.04.

59. Перспективы включения вакцинации пневмо 23 в национальный календарь прививок / М.П. Костинов, О.О. Магаршак, С.В. Сулоева [и др.] // Современная педиатрия. - 2011. - № 3 (37). - С. 25-27.

60. Петрова, Г. Местный иммунитет при хронических заболеваниях легких у детей / Г. Петрова, П. Переновская, В. Улевинов // материалы VII Рос. конгр. «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». - Москва : Оверлей, 2008.-С. 281.

61. Пневмококковые вакцины и их место в профилактике осложнений респираторных инфекций и гриппа / О.О. Магаршак, М.П. Костинов, Д.В. Пахомов [и др.] // Consilium Medicum. - 2010. - № 1. - С. 43-46.

62. Поляк, М.С. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии / М.С. Поляк, В.И. Сухаревич, М.Э. Сухаревич. - Санкт-Петербург : ЭЛБИ-СПб, 2008. - 352 с.

63. Применение молекулярно-генетического метода диагностики при бронхолегочных заболеваниях у детей / О.И. Морозова, Н.В. Морозова, О.В. Островская, В.К. Козлов // Дальневосточный медицинский журнал. - 2010. -№2.-С. 48-51.

64. Пульмонология детского возраста: проблемы и решения / под ред. Ю.Л. Мизерницкого, А.Д. Царегородцева, А.А. Корсунский. - М., 2008. - Вып. 8.-176 с.

65. Рабочая классификация основных клинических форм бронхолегочных заболеваний легких у детей / Н.А. Геппе, Н.Н. Розинова, И.К. Волков [и др.] // Трудный пациент. - 2009. - № 1-2. - С. 35-40.

66. Ряпис, Л.А. Распространенность и возможности профилактики пневмококковых инфекций в мире и России / Л.А. Ряпис, Н.И. Брико // Бюллетень «Вакцинация». - 2009. - № 2. - С. 10-14.

67. Ряпис, Л.А. Проблема пневмококковых инфекций в России / Л.А. Ряпис, Н.И. Брико // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2010. - № 1. -к.,, ч-ъ.

68. Серологическая характеристика и чувствительность к антибиотикам пневмококков, выделенных у детей в возрасте до 5 лет в отдельных регионах Российской Федерации / Р.С. Козлов, А.Н. Чагарян, Л.В. Козлова [и др.] // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2011. - Т. 13, №2.-С. 177-187.

69. Серотипы Streptococcus pneumoniae у детей, больных острой пневмонией и плевритом / Л.К. Катосова, В.К. Таточенко, А.А. Арова [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1990. - № 5. - С. 23-28.

70. Сидоренко, С.В. Перспективы антибиотикотерапии респираторных инфекций в России / С.В. Сидоренко // Consilium Medicum. - 2009. - С. 5.

71. Синопальников, А.И. Современный взгляд на фармакотерапию обострений хронической обструктивной болезни легких / А.И. Синопальников, A.A. Зайцева // Медицинские новости. - 2010. - № 10. - С. 5-7.

72. Сорокина, Е.В. Принципы терапии при хронических воспалительных заболеваниях легких у детей / Е.В. Сорокина // Земский врач. -2010.-№3.-С. 11-16.

73. Справочник ВИДАЛЬ. Лекарственные препараты в России : справочник / ЗАО «АстраФармСервис». - 16-е изд., перераб. и доп. - Москва : АстраФармСервис, 2012. - 1728 с.

74. Справочник по антимикробной терапии / под редакцией P.C. Козлова, A.B. Дехнича. - Смоленск : МАКМАХ, 2010. - Вып. 2. - 416 с.

75. Таточенко, В.К. Клинические проявления пневмококковой инфекции в разных возрастных группах / В.К. Таточенко // Бюллетень «Вакцинация». - 2009. - № 2. - С. 3-7.

76. Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории : метод, указания 4.2.2039-05 / Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России. - Москва, 2005. - 116 с.

77. Федорова, Г.А. Применение микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии в медицине / Г.А. Федорова, Л.А. Кожанова, И.Н. Азарова // Вестник восстановительной медицины. - 2008. - Т. 24, № 2. - С. 4750.

78. Характеристика скрининг-иммуноферментного теста для определения антител к условно-патогенным бактериям / Н.Е. Ястребова., Н.П. Ванеева., Н.В. Цветкова // Аллергия, астма и клиническая иммунология - 1999. -№9.-С. 148-151.

79. Хронические заболевания легких у детей / под ред. H.H. Розиновой, Ю.Л. Мизерницкого. - Москва : Практика, 2011. - 224 с.

80. Хроническая обструктивная болезнь легких : протокол ведения больных : М-во здравоохранения и соиального развития Рос. Федерации от 4 июля 2005 г. - Москва, 2005. - 21 с.

81. Чебуркин, A.A. Значение деструктивных изменений в интерстициальной ткани легких и дисбаланса в системе «протеиназы-ингибиторы протеиназ» в патогенезе затяжных и рецидивирующих бронхитов у детей раннего возраста / A.A. Чебуркин, A.B. Чебуркин // Новости медицины и фармации.-2010.-№318.-С. 5-9.

82. Шелудько, Л.П. Поликлиническая терапия. Внебольничная пневмония : учеб. пособие / Л.П. Шелудько. - Чита : ИЦ ЧГМА, 2009. - 68 с.

83. Эпидемиология и вакцинопрофилактика инфекции, вызываемой Streptococcus pneumoniae : метод, рекомендации 3.3.1.0027-11 / Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. - Москва, 2011. - 27 с.

84. Эпидемиология и вакцинопрофилактика инфекции, вызываемой Haemophilus influenzae типа b : метод, рекомендации 3.3.1.0001-10 / Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. - Москва, 2010.-41 с.

85. Antibody response to Haemophilus influenzae outer membrane protein D, P6, and OMP26 after nasopharyngeal colonization and acute otitis media in children / M.E. Pichichero, R. Kaur, G.R. Casey [et al.] // Vaccine. - 2010. - Vol. 28, №44. -P. 7184-7192.

86. Acute Lower Respiratory Tract Infections in Children / J. Taneja, A. Malik, A. Malik [et al.] // Indian pediatrics. - 2009. - Vol. 46. - P. 509-511.

87. Antimicrobial resistance in Europe - Streptococcus pneumoniae / European Center for Disease Prevention and Control // Annual Report of the European Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARS-Net). - Stockholm : ECDC, 2010.-P. 19-27.

88. Antimicrobial susceptibility of select respiratory tract pathogens in Dakar, Senegal / A.G. Ndiaye, C.S. Boye, E. Hounkponou [et al.] // J. Infect. Dev. Ctries. - 2009. - Vol. 3, № 9. - P. 660-666.

89. Antimicrobial susceptibility profiles among common respiratory tract pathogen: a GLOBAL perspective / D.F. Sahm, N.P. Brown, C. Thornsberry [et al.] // Postgrad. Med. - 2008. - Vol. 120, № 3, Suppl. 1. - P. 16-24.

90. Bell, J.M. Development of a disk diffusion method for testing Moraxella catarrhalis susceptibility using clinical and laboratory standards institute methods: a SENTRY antimicrobial surveillance program report / J.M. Bell, J.D. Tumidge, R.N. Jonse // J. Clin. Microbiol. - 2009. - Vol. 47, № 7. - P. 2187-2193.

91. Berndsen, M.R. Evolving epidemiology of invasive Haemophilus infections in the post-vaccination era: results from a long-term population-based study / M.R. Berndsen, H. Erlendsdottir, M. Gottfredsson // Clin. Microbiol. Infect. -2012. - Vol. 18, № 9. - P. 918-923.

92. Bhattacharya, A.K. Role of sputum cultures in diagnosis of respiratory tract infections / A.K. Bhattacharya // Lung India. - 2008. - Vol. 23. - P. 20-24.

93. Bro (3-lactamase and antibiotic resistances in a global cross-sectional study of Moraxella catarrhalis from children and adults / M.A. Khan, J.B. Northwood, F. Levy [et al.] // J. Antimicrob. Chemother. - 2010. - Vol. 65, № 1. - P. 91-97.

94. Burden of disease caused by Haemophilus influenzae type b in children yonger than 5 years: global estimates / J.P. Watt, L.J. Wolf'son, K.L. O'Brien [et al.] // Lancet. - 2009. - Vol. 374. - P. 903-911.

95. CDC. Invasive Pneumococcal Disease in Young Children Before Licensure of 13-Valent Pneumococcal Conjugate Vaccine United States, 2007. -MMWR. - 2010. - Vol. 59, № 9. - P. 253-257.

96. Chang, F.B. Non-cystic fibrosis bronchiectasis exacerbation / F.B. Chang, D. Bilton // Thorax. - 2008. - Vol. 63. - P. 269-276.

97. Chronic suppurative lung disease and bronchiectasis in children and adults in Australia and New Zealand / A.B. Chang, S.C. Bell, C.A. Byrnes [et al.] // Med. J. Aust. - 2010,- Vol. 193, № 6. - P. 356-365.

98. Clancy, R.L. Oral non-typable Haemophilus influenzae enhances physiological mechanism of airways protection / R.L. Clancy, M.L. Dunkley // Clin. Exp. Immunol. - 2010. - Vol. 161. - P. 127-133.

99. Clinical and Laboratory Evaluation of Periodically Monitored Turkish Children with IgG Subclass Deficiencies / N.E. Karaca, C. Karadeniz, G. Aksu [et al.] // Asian pacific J. of allergy and immun. - 2009. - Vol. 27. - P. 43-48.

100. Dalhoff, A. Global Fluoroquinolone Resistance Epidemiology and Implications for Clinical Use / A. Dalhoff // Interdisciplinary Perspectives on Infec. Dis. - 2012. - Article ID 976273. - P. 37.

101. Davis, F.A. Clinical immunology & serology: a laboratory perspective / F.A. Davis. - New York : Lippincott, 2009. - 454 p.

102. Dennehy, P.H. Community-Acquired Pneumonia In Children / P.H. Dennehy // Medicine & Health. - 2010. - Vol. 93, № 7. - P. 211-214.

103. Dose-specific efficacy of Haemophilus influenzae type b conjugate vaccines: a systematic review and meta-analysis of controlled clinical trials / U.K. Griffiths, A. Clark, B. Gessner [et al.] // Epidemiol. Infect. - 2012. - Vol. 140, № 8. -P. 1343-1355.

th

104. Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases. - 12 ed. - CDC, Public Health Foundation. - 2012. - 474 p.

105. Epidemiology of nasopharyngeal carriage of respiratory bacterial pathogens in children and adults: cross-sectional surveys in population with high rates of pneumococcal disease / G.A. Mackenzie, A.J. Leach, J.R. Carapetis [et al.] // BMC.-2010.-Vol. 10.-P. 304-314.

106. Etiology and outcome of bronchiectasis in children: a study of 41 patients / O. Bouyahia, L. Essadem , N. Matoussi [et al.] // Tunis Med. - 2008. - Vol. 86, № 5.-P. 996-999.

107. Essential procedures for clinical microbiology / editor in chief H.D. Isenberg. - Washington, D.C. : ASM PRESS, 1998. - 842 p.

108. Forey, B.A. Systematic review with meta-analysis of the epidemiological evidence relating smoking to COPD, chronic bronchitis and emphysema / B.A. Forey, A.J. Thornton, P.N. Lee // BMC Pulm. Med. - 2011. - Vol. 11. - P. 36.

109. Fuschillo, S. Mucosal inflammation in idiopathic bronchiectasis: cellular and molecular mechanisms / S. Fuschillo, A. De Felice, G. Balzano // Eur. Respir. J. -2008. - Vol. 31, № 2. - P. 396-406.

110. Gkentzi, D. The burden of nonecapsulated Haemophilus influenzae and potential for prevention / D. Gkentzi, M.P. Slack, S.N. Ladhani // Curr. Opin. Infect. Dis. - 2012. - Vol. 25, № 3. - P. 262-272.

111. Gupta, N. Moraxella catarrhalis as a respiratory pathogen / N. Gupta, S. Arora, S. Kundra // Pathology and Microbiol. - 2011. - Vol. 54, № 4. - P. 769-771.

112. Habesoglu, M.A. Clinical, radiological, and functional evaluation of 304 patients with bronchiectasis / M.A. Habesoglu, A.O. Ugurlu, F.O. Eyuboglu // Ann. Thorac. Med. - 2011. - Vol. 6, № 3. - P. 131-136.

113. Hacken, N.H. Bronchiectasis / N.H. Hacken // BMJ. - 2010. - Vol. 3. -P. 341.

114. Haemophilus influenzae type-b and non-b-type invasive diseases in urban children (<5years) of Bangladesh: implications for therapy and vaccination / M. Rahman, S. Hossain, A.H. Baqui [et al.] /'/' J. Infect. - 2008. - Vol. 56, № 3. - P. 191-196.

115. Increase of ß-Lactam-Resistent Invasive Haemophilus influenzae in Sweden, 1997 to 2010 / F. Resman, M. Ristovski, A. Forsgren [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. - 2012. - Vol. 56, № 8. - P. 4408-4415.

116. Jenkins, S.G. Trends in antibacterial resistance among Streptococcus pneumoniae isolated in the USA: update from PROTECT US Years 1-4 / S.G. Jenkins, S.D. Brown, D.J. Farrell // Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. - 2008. - Vol. 7. - P. 1-11.

117. Jivcu, C. Acute Bacterial Exacerbation of Chronic Bronchitis / C. Jivcu, M. Mathew, M. Gotfried // US Respiratory Dis. - 2008. - Vol. 4, № 2. - P. 79-82.

118. Judging respiratory specimen acceptability for AFB microscopy: visual vs. microscopic screening / M.S. Khan, O. Dar, S. Tahseen [et al.] // Tropical medicine & International health. - 2009. - Vol. 14, № 5. - P. 571-575.

119. Kenneth, T. Haemophilus influenzae (Hib) meningitis [Electronic recurs] : lectures in Microbiology / T. Kenneth, University of Wisconsin-Madison. Department of Bacteriology, 2009. - Available at: http://textbookofbacteriology.net/themicrobialworld/haemophilus.html.

120. King, P. Haemophilus influenzae and the lung {Haemophilus and the lung) / P. King // Clinical and Translational Med. - 2012. - Vol. 1. - P. 2-10.

121. Lacross, N.C. Population structure in nontypeable Haemophilus influenzae / N.C. Lacross, C.F. Marrs, J.R Gilsdorf // Infect. Genet. Evol. - 2012. -Vol. 14.-P. 125-136.

122. Lakshmi, V. Direct microscopy - the fundamental diagnostic tool / V. Lakshmi, P.U. Bala, K. Anuradha // The clinical proceedings of Nizams institute of medical sciences. - 2008. - Vol. 19, № 1. - P. 3-8.

123. Lung microbiology and exacerbations in COPD / V. Beasley, P.V. Joshi, A. Singanayagam [et al.] // International J. of COPD. - 2012. - Vol. 7. - P. 555-569.

124. Machlintyre, N. Acute exacerbations and respiratory failure in chronic obstructive pulmonary disease / N. Machlintyre, Y.C. Huang // Proc. Am. Thorac. Soc. - 2008. - Vol. 5, № 4. - P. 530-535.

125. Manual of Clinical Microbiology: vol. 1 and 2 / editor in chief J. Versalovic. - 10th ed. - Washington, D.C. : ASM PRESS, 2011. - 2552 p.

126. Martynova, A.V. Emergence of Haemophilus influenzae strains in the nasopharynx of children with tuberculosis / A.V. Martynova, L.A. Balabanova, A. Pruschinskyi // Pulm. Med. - 2011. - Article ID 420284. - P. 3.

127. Microbiological study of patients hospitalized for acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease (AE-COPD) and the usefulness of analytical and clinical parameters in its identification (VIRAE study) / R. Boixeda, N. Rabella, G. Sauca [et al.] // Int. J. Chron. Obstruct. Pulmon. Dis. J. Bacteriol. - 2012. - Vol. 7. -P. 327-335.

128. Mitchell, I. Treatment of RSV bronchiolitis: drugs, antibiotics / I. Mitchell // Pediatr. Respir. Rev. - 2009. - Vol. 10, Suppl 1. - P. 14-15.

129. Moraxella catarrhalis acquisition, airway inflammation and protease-antiprotease balance in chronic obstructive pulmonary disease / G.I. Parameswaran, C.T. Wrona, T.F. Murphy [et al.] // BMC Infect. Dis. - 2009. - Vol. 9. - P. 178.

130. Moraxella catarrhalis M35 is a general porin that is important for growth under nutrient-limiting conditions and in the nasopharynges of mice / D.M. Easton, E. Maier, R. Benz [et al.] // J. Bacteriol. - 2008. - Vol. 190, № 24. - P. 79948002.

131. Morgenthau A. S. Spectrum of fibrosing diffuse parenchymal lung disease / A.S. Morgenthau, M.L. Padilla // Mt. Sinai J. Med. - 2009. - Vol. 76, № 1. -P. 2-23.

132. Murphy T. F. Microbial interaction in the respiratory tract / T.F. Murphy, L.O. Bakaletz, P.R. Smeesters // Pediatr. J. Infect. Dis. - 2009. - Vol. 28, Suppl. 10.-P. 121-126.

133. Murphy, T.F. Moraxella catarrhalis, a Human Respiratory Tract Pathogen / T.F. Murphy, G. Parameswaran // Clin. Infect. Dis. - 2009. - Vol. 49, № l.-P. 124-131.

134. Non-susceptibility trends among Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis from community-acquired respiratory tract infections in the UK and Ireland, 1999-2007 / I. Morrissey, K. Mäher, L. Williams [et al.] // J. Antimicrob. Chemother. - 2008. - Vol. 62, № 2. - P. 97-103.

135. Optimal Sampling Sites and Methods for Detection of Pathogens Possibly Causing Community-Acquired Lower Respiratory Tract Infections / K. Loens, L.V. Neirstraeten, S. Malhotra-Kumar [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2009. -Vol. 47, № l.-P. 21-31.

136. Plotkin, S.A. Correlates of Protection Induced by Vaccination / S.A. Plotkin // Clin. Vaccine Immunol. - 2010. - Vol. 17, № 7. - P. 1055-1065.

137. Pneumococcal vaccines for children and adults with bronchiectasis / C.C. Chang, R.J. Singleton, P.S. Morris [et al.] // Cochrane Database Syst. Rev. -2009.-Vol. 15, № 2. - CD006316.

138. Quon, B.S. Contemporary management of acute exacerbations of COPD: a systematic review and metaanalysis / B.S. Quon, W.Q. Gan, D.D. Sin // Chest. -2008. - Vol. 133, № 3. - P. 756-766.

139. Torpy, J.M. Chronic Diseases of Children / J.M. Torpy, A. Campbell, R.M. Glass // JAMA. - 2010. - Vol. 303, № 7. - P. 682.

140. Trends in antibiotic susceptibility patterns of Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae isolates: four years follow up / A. Liki, P. Saqiroqlu, N. Elgormuns [et al.] // Microbiol. Bui. - 2010. - Vol. 44, № 2. - P. 169-175.

141. Trends in COPD (Chronic Bronchitis and Emphysema): Morbidity and Mortality / American Lung Association Epidemiology and Statistics Unit. - 2011. -28 p.

142. Tristram, S. Antimicrobial resistance in Haemophilus influenzae / S. Tristram , M.R. Jacobs, P.C. Appelbaum // Clin. Microbiol. Rev. - 2008. - Vol. 20, №2.-P. 368-389.

143. Resistance study of community respiratory pathogens isolated in China from 2005 to 2007 / H.L. Sun, Q.W. Yang, Y.C. Xu [et al.] // Zhonghua Yi Xue Za Zhi. - 2009. - Vol. 89, № 42. - P. 2983-2987.

144. Safety and reactogenicity of the 10-valent pneumococcal non-typeable Haemophilus influenzae protein D conjugate vaccine (PHiD-CV) when coadministered with routine childhood vaccines / B. Chevallier, T. Vesikari, J. Brzostek [et al.] // Pediatr. Infect. Dis. J. - 2009. - Vol. 4. - P. 109-118.

145. Serotype distribution of invasive pneumococcal disease isolates among children <5 years of age [Electronic recurs] / Active Bacterial Core surveillance areas, 2008. - Available at: http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/pcr.htm.

146. Serotype-speciflc IPD in children < 5 years during 2005-2009 [Electronic recurs] / Active Bacterial Core surveillance data, 2009. - Available at: http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/pcr.htm.

147. Serotyping Streptococcus pneumoniae by Multiplex PCR / D.A. Brito, M. Ramirez, H. de Lencastre // J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol. 41, № 6. - P. 23782384.

148. Shibl, A. Epidemiology of invasive pneumococcal disease in the Arabian Peninsula and Egypt / A. Shibl, Z. Memish, S. Pelton // Int. J. Antimicrob. Agents. -2009.-Vol. 33, № 5.-p. 410.

149. Short-course antibiotic treatment in acute exacerbations of chronic bronchitis and COPD: a meta-analysis of double-blind studies / R.E. Moussaoui, B.M. Roede, P. Speelman [et al.] // Thorax. - 2008. - Vol. 63. - P. 415-422.

150. Streptococcus pneumoniae serotype 3 among Costa Rican Children with Otitis Media: clinical, epidemiological characteristics and antimicrobial resistance patterns / A. Abdelnour, C. Soley, S. Guevara [et al.] // BMC Pediatr. - 2009. - Vol. 9.-P. 52.

151. The impact of viruses in lower respiratory tract infections of the adult. Part II: acute bronchitis, acute exacerbated COPD, pneumonia, and influenza / S.R. Ott, G. Rohde, P.M. Lepper [et al.] // Pneumologie. - 2010. - Vol. 64, № 1. - P. 1827.

152. Tregoning, J.S. Respiratory viral infections in infants: causes, clinical symptoms, virology, and immunology / J.S. Tregoning, J. Schwarze // Clin. Microbiol. Rev. - 2010. - Vol. 23, № 1. - P. 74-98.

153. Zangeneh, T.T. Impact of conjugate pneumococcal vaccines on the changing epidemiology of pneumococcal infections / T.T. Zangeneh, G. Baracco, J.A. Al-Tawfiq // Expert. Rev. Vaccines. - 2011. - Vol. 10, № 3. - P. 345-353.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы выражаем благодарность врачам-бактериологам и клиницистам за помощь в сборе образцов и проведении исследования: ГБУЗ СО «ОДКБ № 1», Екатеринбург - Кукушкиной М.П., Блиновой С.М., Устюговой С. С., Бегляниной O.A.