Собственная флуоресценция белков: Структура и динамика макромолекул тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, доктор физико-математических наук Туроверов, Константин Константинович

• Туроверов, Константин Константинович
• доктор физико-математических наук
• 1999

Оглавление диссертации доктор физико-математических наук Туроверов, Константин Константинович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. АНАЛИЗ СВОЙСТВ МИКРООКРУЖЕНИЯ И ОСОБЕННОСТЕЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ ТРИПТОФАНОВЫХ ОСТАТКОВ БЕЛКОВ С УСТАНОВЛЕННОЙ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРОЙ

- НОВЫЙ ПОДХОД В РАЗВИТИИ ТЕОРИИ СОБСТВЕННОЙ

ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ БЕЛКОВ.

1.1. Алгоритм анализа пространственной структуры белков, позволяющий выявлять факторы, существенные для понимания флуоресцентных свойств их триптофановых остатков.

1.1.1. Микроокружение триптофановых остатков.

1.1.2. Плотность упаковки атомов микроокружения триптофановых остатков.

1.1.3. Доступность индольных колец триптофановых остатков молекулам растворителя.

1.1.4. Конформация боковой цепи триптофанового остатка.

1.1.5. Безызлучательный перенос энергии возбуждения от тирозиновых остатков к триптофановым и между триптофановыми остатками.

1.1.6. Способы наглядного представления локализации триптофановых остатков в макромолекуле белка.

1.2. Факторы, определяющие квантовый выход флуоресценции отдельных триптофановых остатков.

1.2.1. Тушащие группы в составе макромолекулы белка.

1.2.2. Определение вклада в излучение отдельных триптофановых остатков.

1.2.3. Влияние атомов серы на флуоресценцию триптофановых остатков лизоцима.

1.2.4. Вклад отдельных триптофановых остатков во флуоресценцию актина.

1.2.5. Тушение флуоресценции единственного триптофанового остатка азурина медным центром.

1.3. Факторы, определяющие положение спектра отдельного триптофанового остатка.

1.3.1. Уникальные свойства микроокружения Тгр 48 азурина.

1.3.2. Образование комплексов между индольными кольцами триптофановых остатков в возбужденном состоянии и группами микроокружения.

1.3.3. Причины возникновения у ряда белков уникально коротковолновых спектров флуоресценции.

ГЛАВА 2. ДИНАМИКА СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ. ИЗУЧЕНИЕ МЕТОДОМ ВРАЩАТЕЛЬНОЙ ДЕПОЛЯРИЗАЦИИ СОБСТВЕННОЙ

ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ.

2.1. Использование собственной флуоресценции для изучения внутримолекулярной подвижности в белках методом вращательной деполяризации.

2.1.1. Вращательная деполяризация флуоресценции.

2.1.2. Определение характеристик внутримолекулярной подвижности методом вращательной деполяризации при стационарном возбуждении

2.1.3. Высокочастотная внутримолекулярная подвижность.

2.2. Характер внутримолекулярной подвижности триптофановых остатков, проявляющейся в деполяризации флуоресценции белков.

2.3. Спектрально-поляризационные характеристики флуоресценции белков и модельных соединений.

2.3.1. Проявление дуальной флуоресценции в спектрально-поляризационных характеристиках излучения.

2.3.2. Участвует ли осциллятор ]Lb в формировании спектра флуоресценции белков?

2.3.3. Причины возникновения зависимости г =/(Лрег) по спектру излучения

2.4. Внутримолекулярная подвижность триптофановых остатков в белках.

2.4.1. Предельная анизотропия флуоресценции триптофановых остатков в белках.

2.4.2. Внутримолекулярная подвижность триптофановых остатков с различной локализацией в макромолекуле белка.

2.4.3. Внутримолекулярная подвижность триптофанового остатка азурина

ГЛАВА 3. СТРУКТУРА И ДИНАМИКА БЕЛКОВ В ЧАСТИЧНО-СВЕРНУТЫХ ДЕНАТУРИРОВАННЫХ СОСТОЯНИЯХ: ИНАКТИ-ВИРОВ АННЫЙ АКТИН.

3.1. Инактивированный актин - термодинамически стабильное промежуточное состояние белка.

3.2. Вторичная структура инактивированного актина.

3.3. Диэлектрические и релаксационные свойства микроокружения трип-тофановых остатков инактивированного актина.

3.4. Локализация триптофановых остатков в инактивированном актине

3.5. Гидродинамические размеры инактивированного актина.

3.6. Внутримолекулярная подвижность триптофановых остатков нативного и инактивированного актина.

3.7. Свойства поверхности инактивированного актина.

3.8. Представляет ли инактивированный актин структуру типа расплавленной глобулы?.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Собственная флуоресценция белков: Структура и динамика макромолекул»

Флуоресцентные методы находят широчайшее применение при решении различных научных и прикладных задач в области физики, химии и биологии, экологического мониторинга и медицинской диагностики. В этом отношении не является исключением и метод собственной флуоресценции. Одним из достоинств этого метода при его использовании в биологии является принципиальная возможность получения адекватной и взаимодополняющей информации при изучении объектов различной сложности от растворов белков (Barenboim et al., 1969; Бурштейн, 1977) до клеток и отдельных клеточных структур (Черногряд-скаяидр., 1978).

Диссертационная работа в основном базируется на исследованиях, выполненных в последние 15 лет, хотя в нее вошли также некоторые результаты, полученные до этого периода. В частности, не утратили своего значения результаты приоритетных исследований по установлению природы и основных закономерностей собственной флуоресценции белков (и клеток), обобщенные в монографиях второй половины 60-х годов (Баренбойм и др., 1966; Barenboim et al., 1969), написанных с участием автора настоящей работы. С тех пор уже более 30 лет метод собственной флуоресценции, обусловленный входящими в состав белков триптофановыми и тирозиновыми остатками, используется для изучения структуры, конформационных превращений и динамики структуры белков в растворе. Становление этого метода напрямую зависело от состояния аппаратурной и методической базы и, в то же время, стимулировало ее развитие. Поскольку выпуск спектрофлуориметрической аппаратуры в Советском Союзе не был налажен, исследователи, использующие этот метод, были вынуждены разрабатывать, создавать и постоянно совершенствовать собственное спектрофлуо-риметрпческое оборудование. В результате этого под руководством и при непосредственном участии автора настоящей работы в Институте цитологии РАН были созданы и эксплуатируются спектрофлуориметрические установки для измерения спектральных, поляризационных и кинетических характеристик флуоресценции в растворе (Туроверов и др., 1998). Аппаратура для измерения различных флуоресцентных характеристик при стационарном возбуждении в настоящее время достаточно широко распространена, в то время как импульсная спектрофлуориметрическая аппаратура для измерения кривых затухания флуоресценции и временных зависимостей анизотропии флуоресценции наносе-кундного диапазона остается в России достаточно уникальной.

Информативность метода собственной флуоресценции при изучении структуры и динамики белков в значительной мере определяется тем, насколько хорошо установлена связь между регистрируемыми экспериментально характеристиками флуоресценции и особенностями локализации триптофановых остатков в структуре белка. Сложившиеся на этот счет представления были получены в период становления метода из экспериментов с модельными соединениями и из сопоставления флуоресцентных свойств разных белков и одного и того же белка в различных структурных состояниях. В настоящей работе предложен и реализован новый подход для развития теории собственной флуоресценции, состоящий в анализе свойств микроокружения и особенностей локализации триптофановых остатков белков с установленной пространственной структурой. Этот подход целесообразно использовать также при анализе результатов флуоресцентных исследований конкретных белков. Действительно, большинство белков содержит более одного триптофанового остатка и поэтому регистрируемые экспериментально флуоресцентные характеристики имеют усредненный характер. Ценность экспериментальных данных значительно возрастает, если вклад отдельных триптофановых остатков может быть установлен. Для этой цели существует много подходов: избирательное тушение (Eftink and Ghiron, 1981; Eftink, 1991; Burstein, 1996), избирательная модификация (Formoso and Forster, 1975; Imoto et al., 1971), избирательное возбуждение (Rao et al., 1981; Kuramitsu et al., 1978), разделение суммарного спектра на составляющие в предположении конечного числа дискретных форм триптофановых остатков (Burstein et al., 1973; Аборнев и др., 1992; Решетняк и Бурштейн, 1997), определение время-ассоциированных спектров (Knutson et al., 1982; Philips et al., 1989; Beechem et al., 1991). Однако, успешное определение вклада отдельных триптофановых остатков в суммарную флуоресценцию, особенно при большом числе триптофановых остатков, является скорее исключением, чем правилом. На практике каждый из названных подходов имеет существенные ограничения и не дает достоверных однозначных результатов. Так избирательность избирательной модификации и избирательного тушения обычно не велика. При использовании химической модификации нельзя исключить возможность изменения структуры белка. Избирательное возбуждение возможно только в особых случаях (например, в случае лизоцима оно возможно ввиду существования у одного из триптофановых остатков аномальной, минорной полосы на длинноволновом краю спектра поглощения). Развиваемое в работах Э.А.Бурштейна предположение о существовании конечного числа дискретных форм триптофановых остатков (Burstein et al., 1973; Аборнев и др., 1992; Решетняк и Бурштейн, 1997), на наш взгляд, еще требует дополнительных теоретических обоснований, которые можно попытаться получить из анализа свойств микроокружения большого числа триптофановых остатков. Трудно ожидать высокой эффективности метода, основанного на регистрации время-ассоциированных спектров уже потому, что существующие методы не позволяют определять более трех (по мнению некоторых авторов - четырех) временных составляющих кривой затухание флуоресценции. В то же время именно такое число временных составляющих имеют кривые затухания флуоресценции белков с одним единственным триптофановым остатком (Vincent et al., 1988; Gentin et al., 1990).

Наиболее прямой метод определения вклада отдельных триптофановых остатков в излучение состоит в измерении флуоресцентных характеристик белков, мутантных по триптофановым остаткам (см., например, Martensson et al., 1995; Gopalan et al., 1997). Однако, этот подход весьма дорогостоящий и, кроме того, известно, что даже одна аминокислотная замена может привести к нарушению правильного сворачивания белка.

В то же время, сложившееся к настоящему времени представления о связи флуоресцентных характеристик триптофановых остатков со свойствами их микроокружения позволяют предсказывать флуоресцентные характеристики триптофановых остатков на основании анализа трехмерной структуры белка. Основные принципы такого подхода были развиты в ходе анализа единственного триптофанового остатка азурина (Туроверов и др., 1984), а позднее использованы при интерпретации флуоресцентных характеристик трипсина, трипсиногена, РНКазы С2, актина, лизоцима и некоторых других белков (Кузнецова и Туроверов, 1998).

В тех случаях, когда вклад отдельных триптофановых остатков удается оценить экспериментально, остается вопрос, почему каждый данный триптофа-новый остаток имеет те, а не иные флуоресцентные характеристики. Ответить на этот вопрос можно, анализируя свойства микроокружения и особенности локализации триптофановых остатков исследуемых белков. Использование такого подхода для большого числа триптофановых остатков большого числа белков позволяет проверять и уточнять существующие представления о связи регистрируемых экспериментально флуоресцентных характеристик со свойствами микроокружения триптофановых остатков и составляет новый подход в развитии теории флуоресценции белков. Изучение флуоресцентных свойств белков, мутантных по триптофановым остаткам, существенно расширяет экспериментальную базу для проведения такого анализа.

Актуальным, интенсивно развиваемым направлением исследований в области физико-химии белков в течение последних двух десятилетий является изучение их динамической структуры. Повышенный интерес к изучению динамики (внутримолекулярной подвижности) белков обусловлен тем, что ей отводится существенная функциональная роль, которая, по современным представлениям, состоит в том, что вследствие броуновского движения часть макромолекул белка принимает конформацию, при которой выполнение биологической функции (акта ферментативного катализа, белок-белкового взаимодействия и т.д.) становится стерически и энергетически более выгодным. Метод собственной флуоресценции обеспечивает ряд существенно разных подходов к изучению внутримолекулярной подвижности белков. Так, использование метода тушения флуоресценции внешними тушителями позволяет судить о диффузии молекул тушителя внутри макромолекулы белка, т.е. дает некоторую усредненную оценку возникновения и миграции "полостей" в макромолекуле белка.

Положение спектра триптофановой флуоресценции определяется не только диэлектрическими, но и релаксационными свойствами микроокружения триптофановых остатков. Информация о подвижности самих индольных колец триптофановых остатков может быть получена путем регистрации и анализа временных зависимостей анизотропии флуоресценции (Wahl, 1975 а) или с помощью метода, основанного на регистрации вязкостных зависимостей анизотропии флуоресценции при стационарном возбуждении (Weber, 1952; Ануфриева, 1972, 1976; Anufrieva and Gotlib, 1981). Сложная осцилляторная природа ин-дольного хромофора, необходимость учета вклада в деполяризацию вращательного движения макромолекул белка как целого, а также других деполяризующих факторов, потребовало уделить особое внимание разработке метода изучения внутримолекулярной подвижности, основанного на регистрации анизотропии триптофановой флуоресценции. Рассмотрение в этой связи вопроса о возможном участии осциллятора }Lb в излучении (возможность дуальной флуоресценции) представляет также существенное значение для развития теории собственной флуоресценции белков.

Актуальным является не только изучение динамики белков в нативном состоянии, но также и в денатурированных частично-свернутых состояниях белка. В течение длительного времени господствовало убеждение, что при денатурации глобулярные белки переходят в полностью развернутое (клубкообразное состояние), в котором они не могут выполнять какой-либо функциональной роли. Поэтому основное внимание исследователей уделялось изучению структуры нативных белков. В начале 80-х годов было, однако, установлено, что переход из нативного состояния в полностью развернутое осуществляется не по принципу "все или ничего", а сопровождается образованием термодинамически стабильных промежуточных состояний (Dolgikh et al., 1981; Гильманшин и др., 1982). Было также показано, что ренатурация глобулярных белков из полностью развернутого состояния происходит через стадию накопления кинетического интермедиата (Kuwajima, 1989; Ptitsyn, 1995).

Оказалось, что свойства кинетических интермедиатов, возникающих при ренатурации белков и свойства термодинамически стабильных состояний белковых молекул, промежуточных между нативным и полностью неупорядоченными состояниями, возникающих при денатурации белков, близки или даже совпадают. Было обнаружено, что в промежуточном состоянии макромолекула белка сохраняет компактность и выраженную вторичную структуру, присущую нативному состоянию, однако, отличается, от нативной молекулы отсутствием жесткой упаковки боковых цепей. О.Б.Птицыным была выдвинута идея (Dolgikh et al., 1981), что это состояние белка, названное им по совокупности перечисленных выше признаков состоянием расплавленной глобулы (Ohgushi and Wada, 1983), может играть универсальную роль в процессе самоорганизации белковой молекулы.

Идея О.Б.Птицына о существовании универсального термодинамически стабильного интермедиата на пути сворачивания белка типа расплавленной глобулы оказалась исключительно плодотворной, определив на длительное время направление научных исследований многих ведущих лабораторий мира. Интерес исследователей к изучению белков в состоянии расплавленной глобулы еще более возрос в связи с тем, что появились данные о том, что это состояние, возможно, является одной из основных форм существования макромолекул белков в клетке и обеспечивает ряд существенных внутриклеточных процессов, таких как узнавание белков шаперонами, проникновение белков через мембраны, освобождение белками лигандов и т.д. (см., например, Bychkova and Ptitsyn, 1993; Бычкова и Птицын, 1995). Интересно отметить, что на функциональное значение частично денатурированных белков, возникающих как при их повреждении, так и в процессе нормальной жизнедеятельности клеток, еще в 30-е годы указывали Д.Н.Насонов и В.Я.Александров (см., например, Бычкова и Птицын, 1995).

К настоящему времени в результате многочисленных исследований выяснилось, однако, что свойства белков в частично-свернутых денатурированных состояниях не во всем отвечают тем представлениям, которые заложены в классическом понятии расплавленной глобулы. В частности было показано, что наряду с состоянием типа расплавленной глобулы возможны и другие денатурированные, частично-свернутые состояния белка, например, состояние - предшественник расплавленной глобулы (Uversky, 1993; Uversky and Ptytsin, 1996; Уверский, 1998), высоко структурированная расплавленная глобула (Dobson, 1994). Во многих случаях оказалось, что переход в промежуточное состояние сопровождается агрегацией или специфической ассоциацией (Fink, 1995 а, 1995 Ь; Уверский и Финк, 1998 а, 1998 Ь) макромолекул белка. Было также показано, что в денатурированных частично-свернутых состояниях подвижность боковых цепей аминокислот может значительно отличаться от их подвижности в состоянии статистического клубка (Kuznetzova et al., 1988; Родионова и др., 1989;

Тигоуегоу а1., 1999). Таким образом, возникла необходимость изучения структуры и динамики денатурированных частично-свернутых состояний белков. В настоящей работе эти вопросы были детально проанализированы на примере инактивированного актина.

Цель работы состояла в разработке теории собственной флуоресценции белков и использовании метода, основанного на явлении собственной флуоресценции, для изучения структуры и динамики белков в нативном и денатурированных частично-свернутых состояниях. Круг задач, которые решались в работе, состоял в: 1) разработке и создании аппаратуры для регистрации всех основных характеристик флуоресценции (спектральных, поляризационных и кинетических); 2) разработке новых методических подходов, позволяющих в наиболее полной мере использовать потенциал метода собственной флуоресценции для изучения структуры и динамики белков; 3) разработке фундаментального вопроса теории собственной флуоресценции белков о зависимости регистрируемых экспериментально характеристик флуоресценции от свойств микроокружения и особенностей локализации триптофановых остатков в макромолекуле; 4) решении вопроса о возможности дуальной (с 1Ьа и !ЬЬ уровней) флуоресценции триптофановых остатков в белках; 5) изучении структуры, конформационных превращений и равновесной динамики белков и, в частности, изучении, на примере инактивированного актина, структуры и динамики белков в денатурированных частично-свернутых состояниях, которым по современным представлениям отводится существенная роль не только в процессе самоорганизации белковой молекулы при биосинтезе, но и в процессах функционирования белков в живой клетке.

Диссертация состоит из Введения, трех Глав, Приложения, раздела Основные результаты и выводы и Списка цитируемой литературы.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Туроверов, Константин Константинович

ВЫВОДЫ

1. С целью наиболее полной реализации возможностей использования спектрально-поляризационных характеристик собственной флуоресценции белков для изучения структуры, конформационных превращений и динамических свойств макромолекул, проведено сопоставление флуоресцентных характеристик, свойств микроокружения и особенностей локализации триптофановых остатков белков с установленной пространственной структурой. Использование такого подхода позволило установить ряд новых закономерностей, определяющих флуоресцентные свойства белков. В частности показано, что 1) тушащее действие отдельных атомов или групп, входящих в состав боковых цепей аминокислот, таких как атомы серы цистеиновых и метиониновых остатков, карбоксильных групп глутаминовой и аспарагиновой аминокислот, имидазольных колец гистидина и т.д., определяется не только их удаленностью от индольного кольца триптофанового остатка, но, также, в значительной мере, локализацией этих групп относительно индольного кольца; 2) уникально коротковолновое положение спектра флуоресценции имеют триптофа-новые остатки, в непосредственной близости которых локализованы кластеры колец ароматических аминокислот и пролина.

2. На основании измерения и анализа спектрально-поляризационных характеристик флуоресценции белков и модельных соединений установлено, что нет оснований предполагать участие осциллятора !ЬЬ в излучении, в том числе и для белков с коротковолновым положением спектра флуоресценции. Показано, что в коротковолновой части спектра флуоресценции существенным фактором, влияющим на величину анизотропии флуоресценции и ее зависимость от длины волны возбуждающего света является вклад в излучение тирозино-вых остатков белка.

3. Установлен ряд новых закономерностей, касающихся динамических свойств макромолекул белков в растворе. Показано, что для большинства исследованных в работе белков триптофановые остатки участвуют в высокочастотной подвижности (1 /го > 1 /го), а некоторые из них, кроме того - в медленной подвижности, приводящей к изменению ориентации осцилляторов излучения за время жизни возбужденного состояния триптофановых остатков. Из сопоставления величин Иг о и параметра Л = 1з2о/1зб5> характеризующего положение спектра флуоресценции, сделано заключение о том, что значительную амплитуду высокочастотной подвижности имеют не только триптофановые остатки, расположенные на поверхности макромолекулы, но и триптофановые остатки, расположенные во внутренних гидрофобных областях макромолекулы.

4. На примере актина показана высокая чувствительность спектрально-поляризационных характеристик собственной флуоресценции белков к кон-формационным изменениям структуры их макромолекул. Показано, что инактивированный актин - промежуточная форма между нативным и полностью развернутым состоянием белка - представляет термодинамически стабильный монодисперсный ассоциат, состоящий из 10 - 15 мономерных единиц, свойства которого не зависят от способа его получения (нагревание, умеренные концентрации Ос1тС1 или мочевины, удаление Са, ренатурация из

183 полностью развернутого состояния). Показано, что инактивированный актин имеет уникальную структурную организацию: на поверхности ассоциата расположены обширные гидрофобные кластеры, в то время как полярные области расположены во внутренних, недоступных для растворителя областях ассоциата. Показано, что амплитуда высокочастотной подвижности трипто-фановых остатков в инактивированном актине меньше, чем в в- или Б-актине. Кроме того, в инактивированном актине время вращательной релаксации "медленной" подвижности триптофановых остатков много больше, чем в нативном в-актине.

БЛАГОДАРНОСТИ

В заключении мне приятно выразить искреннюю признательность моим коллегам по работе и в первую очередь И.М.Кузнецовой, много лет являющейся неизменным участником всех проводимых мною исследований и соавтором всех работ, опубликованных за последние годы; А.Г.Бикташеву и В.Н.Уверскому (сотруднику Института биологического приборостроения РАН, ныне работающему в Калифорнийском университете, Санта-Круз, США), интенсивная научная работа с которыми осуществляется в настоящее время; С.Ю.Хайтлиной, совместно с которой выполнен цикл работ по изучению актина в различных структурных состояниях; моим бывшим сотрудникам А.С.Дорофеюку, В.Н.Умецкой, Е.В.Гусеву; сотрудникам ряда других институтов: А.М.Сурину (бывшему сотруднику Института биоорганической химии РАН), К.М.Полякову, Б.В.Строкопытову и В.Н.Зайцеву (Института кристаллографии РАН), М.М.Шавловскому (Институт экспериментальной медицины РАМН), Е.С.Воропаю и Ф.А.Ермалицкому (Институт прикладных физических проблем, Минск); Ю.М.Розанову, В.И.Воробьеву и Г.П.Пинаеву, с которыми в разное время в той или иной мере пересеклись наши научные пути, и которые оказали существенную поддержку в выполнении этой работы.

Я благодарен Б.Н.Кудрявцеву - заведующему лаборатории за творческую атмосферу, способствовавшую работе.

Я хочу поблагодарить директора Института, академика Н.Н.Никольского за доброе отношение и ту доброжелательную обстановку в Дирекции и Институте, которая только и позволила сочетать научную работу с административными обязанностями.

И, наконец, я глубоко признателен моей жене, Туроверовой Лидии Викторовне, за постоянную поддержку, заботу и внимание.

Список литературы диссертационного исследования доктор физико-математических наук Туроверов, Константин Константинович, 1999 год

1. Агекян, Т. В., С. И. Безбородова, И. М. Кузнецова, К. М. Поляков, и К. К.

2. Туроверов. 1988. Спектрально-поляризационные характеристики рибонуклеазы С2. Аномальная флуоресценция остатков тирозина. Мол. биол. 22:612-623.

3. Александров, В. 1975. Клетки, макромолекулы и температура. Наука, Л.

4. Ануфриева, Е.В., Ю.Я. Готлиб, М. Г. Краковяк и С.С. Скороходов. 1972.

5. Исследование внутримолекулярной подвижности макромолекул в растворе методом поляризованной люминесценции. Высокомол. coed. 14А: 1430-1450.

6. Ануфриева, Е. В., Ю.Я. Готлиб, М. Г. Краковяк, и В.Д. Паутов. 1976. Использование поляризованной люминесценции для изучениявысокочастотных крутильных колебаний в макромолекулах. Высокомол. соед. 18А:2740-2746.

7. Наука и техника. Минск. Бурштейн, Э. А. 1976. Люминесценция белковых хромофоров (модельныеисследования) Итоги науки и техники. Сер. биофиз. Вып. 6. ВИНИТИ. М. Бурштейн, Э. А. 1977. Собственная люминесценция белка (природа и применение).

8. Клочков, В. П., и Б. С. Непорент. 1962. К вопросу о поляризации флуоресценции и спектральной классификации сложных молекул. Оптика и спектроскопия. 12:233-238.

9. Конев, С. В. 1965. Электронно-возбужденные состояния биополимеров. Наука и техника, Минск.

10. Конев, С. В., В. П. Бобрович, и Е. А. Черницкий. 1965 а. Поляризационные спектры флуоресценции белков по испусканию и возможность межтриптофановой миграции энергии. Биофизика. 10:42-47.

11. Конев, С. В., В. П. Бобрович, и Е. А. Черницкий. 1965 б. О возможности и механизмах миграции энергии в белках. Докл. АН СССР. 937-939.

12. Коява, В. Т., В. И. Попечиц, и А. М. Саржевский. 1980. Межмолекурныевзаимодействия и их влияние на спектрально-поляризационные зависимости флуоресценции. Оптика и спектроскопия. 48:896-902.

13. Кришталик Л.И., и В.В.Тополев. 1983. Внутримолекулярное электрическое поле фермента. I. Первичное поле, создаваемое полепептидным остовом, функциональными группами и ионами молекул альфа-химотрипсина. Мол.биол. 17:1034-1041.

14. Кузнецова, И.М. 1981. Использование собственной УФ-флуоресценции дляизучения внутримолекулярной подвижности в белках методом вращательной деполяризации. Дисс., Л.

15. Кузнецова, И.М., И.И.Кирик и К.К.Туроверов. 1981 а. Поляризация собственной флуоресценции белков. I. Факторы, определяющие форму поляризационногоспектра. Мол.биол. 15:989-999.

16. Кузнецова, И. М., С. Хайтлина, К. К. Туроверов, и Г. П. Пинаев. 1981 б.

17. Поляризация УФ-флуоресценции актина. Биофизика. 26:762-764.

18. Кузнецова, И. М., и К. К. Туроверов. 1983. Поляризация собственнойфлуоресценции белков. III. Внутримолекулярная подвижность триптофановых остатков .Мол.биол. 17:741-754.

19. Кузнецова, И. М., и К. К. Туроверов. 1998. Что определяет характеристикисобственной УФ-флуоресценции белков? Анализ свойств микроокружения и особенностей локализации их триптофановых остатков. Цитология. 40:747762.

20. Кузнецова, И. М., С. Хайтлина, и К. К. Туроверов. 1998. Особенности структурной организации инактивированного актина промежуточной формы белка на пути сворачивания-разворачивания. Биоорганическая химия. 24:883-892.

21. Насонов, Д. Н., и В. Александров. 1940. Реакция живого вещества на внешние воздействия. АН СССР, М.-Л.

22. Пархоменко, Т. В., О. А. Клыценко, М. М. Шавловский, А. И. Полетаев, И. М. Кузнецова, и К. К. Туроверов. 1998. Спектрофлуориметрический анализ белковых фракций сыворотки крови здоровых доноров и больных с заболеваниями почек. Цитология. 40:786-792.

23. Полинг, Л., и П. Полинг. 1978. Химия. Мир, М.

24. Решетняк, Я.К., и Э.А. Бурштейн. 1997. Отнесение компонент спектрафлуоресценции белка к остаткам триптофана по свойствам их микроокруженияв трехмерной структуре. Биофизика. 42:293-300.

25. Родионова, Н. А., Г. В. Семисотнов, В. П. Кутышенко, В. Н. Уверский, И. А. Болотина, В. Е. Бычкова, и О. Б. Птицин. 1989. Стадийность равновесного разворачивания карбоангидразы В сильными денатурантами. Мол. биол. 23:683-692.

26. Саржевский, А. М., и А. Н. Севченко. 1971. Анизотропия поглощения и испускания света молекулами. БГУ, Минск.

27. Семисотнов, Г. В., К. А. Мошков, К. К. Туроверов, и М. М. Шавловский. 1976. Изучение структуры церулоплазмина человека методом ультрафиолетовой флуоресценции. Биоорганическая химия. 2:413-421.

28. Семисотнов, Г. В. 1982. Исследование внутримолекулярной подвижностиполипептидов и белков в растворе методом поляризованной люминесценции триптофановых остатков, Пущино.

29. Соколова, Р. С., и Т. Н. Крылова. 1963. Интерференционные поляризаторы для УФ области спектра. Оптика и спектроскопия 163:401-409.

30. Степанов, Б. И., А. И. Рубинов, и В. И. Томин. 1982. Исследование динамического неоднородного ориентационного уширения электронных уровней растворов красителей методами спектроскопии высокого временного разрешения. Изв. АН СССР. Сер.физ. 46:380-387.

31. Строкопытов, Б. В., И. М. Кузнецова, и К. К. Туроверов. 1985. Машинноемоделирование энергетической и стерической возможности поворотов боковых групп белка. Внутримолекулярная подвижность Тгр 48 азурина. В сб.:

32. Всесоюзный семинар "Математические и вычислительные методы в биологии". Пущино. 13-14.

33. Тенфорд Ч. 1965. Физическая химия полимеров. Изд. "Химия". М.

34. Туроверов, К. К. 1969. Аналитический метод расчета констант температурного тушения флуоресценции. Оптика и спектроскопия. 26:564-570.

35. Туроверов, К. К., и Б. В. Щелчков. 1970 а. Влияние температуры на флуоресценцию производных фенола и тирозиновых остатков белка. Биофизика. 15:800-806.

36. Туроверов, К. К., и Б. В. Щелчков. 1970 б. Исследование тепловой денатурации белков с помощью двухволнового метода регистрации изменений спектра их ультрафиолетовой флуоресценции. Биофизика. 15:965-972.

37. Туроверов, К. К. 1971. О механизме температурного тушения флуоресценции. В сб.: Рефераты научных работ Института биологии моря., Владивосток. 215-218.

38. Туроверов, К. К., С. Хайтлина, и Г. П. Пинаев. 1975. Флуоресцентные свойства и определение содержания нативного актина в его препаратах. Биохимия. 40:316322.

39. Туроверов, К. К., О. П. Резункова, И. М. Кузнецова, К.А. Мошков, О. П. Борисова, к А.С.Яковлев. 1982. Ультрафиолетовая флуоресценция церулоплазмина человека. Спектральные и поляризационные характеристики. Биоорганическая химия. 8:1165-1172.

40. Туроверов, К. К., и И. М. Кузнецова. 1983. Поляризация собственнойфлуоресценции белков. II. Использование для изучения равновесной динамики триптофановых остатков. Мол.биол. 17:468-473.

41. Дисс. на соискание уч. степени докт. физ.-мат.наук, Пущино. Уверский В.Н. и А.Л.Финк 1998а. Олигомеризация может структурироватьбелковые молекулы, находящиеся в промежуточных частично свернутых состояниях. Биохимия 63:109-116.

42. Уверский В.Н. и А.Л.Финк 19986. Структурные свойства стафилококковой нуклеазы в олигомерных А-формах. Биохимия 63:117-124.

43. Умецкая, В. Н., Е. В. Гусев, М. Розанов, и К. К. Туроверов. 1974. Очистка и флуориметрический контроль качества лабораторной воды. В сб.: Сборник научных трудов Институт цитологии АН СССР, Л. 370-372.

44. Умецкая, В.- Н., и К. К. Туроверов. 1978. Изучение возбужденного состояния индола. Спектры дихроизма активированных индолом растянутых полиэтиленовых пленок. Оптика и спектроскопия. 44:1090-1096.

45. Филенко, А. М., и В. Н. Зима. 1981. Двухволновой метод регистрации малыхспектральных сдвигов флуоресценции белков. В сб. : Молекулярная генетика и биофизика. КГУ, Киев. 126-135.

46. Финкелыптейн, А. В. 1976. Стереохимический анализ вторичной структуры полипептидной цепи при помощи пространственных моделей Курто. 1 .Разрешенные конформации дипептидов. Мол.биол. 10:507-513.

47. Химмельблау, Д. 1975. Прикладное нелинейное программирование. Мир, М.

48. Черницкий, Е. А. 1972. Люминесценция и структурная лабильность белков в растворе и клетке. Наука и техника, Минск.

49. Черногрядская, Н. А., М. Розанов, М. С. Богданова, и С. Боровиков. 1978. Ультрафиолетовая флуоресценция клетки. Наука, Л.

50. Axelsen, P. H., and C. Haydock. 1988. Molecular dynamics of tryptophan in rebonuclease

51. Barenboim, G. M., A. N. Domanskii, and К. K. Turoverov. 1969. Luminescence ofbiopolymers and cells. Plenum Press, N.-Y.-London.

52. Bernstein, F. C., T. F. Koetzle, G. J. B. Williams, J. E. F. Meyer, M. D. Brice, J. R.

53. Rodgers, O. Kennard, T. Shimanouchi, and M. Tasumi. 1977. The Protein Data Bank: a computer-based archival file for macromolecular structures. J.Mol.Biol. 112:535542.

54. Bertazzon, A., Tian, G. H., Lamblin, A., and Tsong, T. Y. 1990. Enthalpic and entropie contributions to actin stability: Calorimetry, circular dichroism and fluorescence study and effect of calcium. Biochemistry 29: 291-298.

55. Brever, J. M., R. J. Desa, and J. E. Wampler. 1977. Fluorescence emission and stopped-flow kinetic studies of the acid expantion of bivins serum albumin. Biochem.Biophys.Res. Comm. 76:572-578.

56. Brochon, J. C. 1994. Maximum entropy method of data analysis in time-resolved spectroscopy. Methods Enzymol. 240:262-311.

57. Burstein, E.A., N.S. Vedenkina, and M.N. Ivkova 1973. Fluorescence and the location of tryptophan residues in protein molecules. Photochem. Photobiol. 18:263-279.

58. Burstein, E. A., E. A. Permyakov, V. A. Yashin, S. V. Burkhanov, and A. Finazzi Agro. 1977. The fine stricture of luminescence spectra of azurin. Biochim. Biophys. Acta. 491:155-159.

59. Diamond, R., D.C. Phillips, C.C.F. Blake, and A.C.T. North. 1974. Real-spacerefinement of the structure of hen egg-white lysozyme. J. Mol. Biol. 82: 371-386. Dobson C.M. 1992. Unfolded proteins, compact states and molten globules.

60. Biomol. Struct. 24: 495-522. Formoso, C., and L. Forster. 1975. Tryptophan fluorescence lifetimes in lysozyme.

61. J.Biol.Chem. 250:3738-3745. Forster, T. 1960. Transfer mechanisms of electronic excitation energy. Rad. Res. 2:326339.

62. Gezimati, J., H. Singh, and L. K. Creamer. 1996. Heat-induced interactions and gelation of mixtures of bovine beta-lactoglobulin and serum albumin. J.Agricult. and Food Chem. 44:804-810.

63. Ghosh, I., and J. A. McCammon. 1987. Sidechain rotational isomerization in proteins. Dynamic simulation with solvent surroundings. Biophys. J. 51:637-641.

64. Gokhale, R. S., S. Agarwalla, D. V. Santi, and P. Balaram. 1996. Covalent reinforcement of a fragile region in the dimeric enzyme thymidylate synthase stabilizes the protein against chaotrope-induced unfolding. Biochemistry. 35:7150-7158.

65. Gopalan, V., R. Golbik, G. Schreiber, A. R. Fersht, and S. Altman. 1997. Fluorescence properties of a tryptophan residue in an aromatic core of the protein subunit of ribonuclease P from Escherichia coli. J.Mol.Biol. 267:765-769.

66. Grinvald, A., and I. Steinberg. 1974. On the analysis of fluorescence decay kinetics by the method of least-squares. Anal. Biochem. 59:583-598.

67. Grinvald, A., J. Schlessinger, I. Pecht, and I. Z. Steinberg. 1975. Homogeneity and variability in the structure of azurin molecules studied by fluorescence decay and circular polarization. Biochemistry. 14:1921 -1929.

68. Gurd, F. R. N., and T. M. Rjthgeb. 1979. Motions in proteins. Adv.Protein Chem. 33:73156.

69. Kuwajima, K. 1996. The molten globule state of alpha-lactalbumin (Review). FASEB Journal. 10:102-109.

70. Kuznetsova, I. M., S. Y. Khaitlina, S. N. Konditerov, A. M. Surin, and K. K. Turoverov. 1988. Changes of structure and intramolecular mobility in the course of actin denaturation. Biophys.Chem. 32:73-78.

71. Kuznetsova, I., O. Antropova, K. Turoverov, and S. Khaitlina. 1996. Conformational changes in subdomain I of actin induced by proteolytic cleavage within the DNase I-binding loop: energy transfer from tryptophan to AEDANS. FEBSLett. 383:105-108.

72. Kuznetsova I.M., K.K.Turoverov and V.N.Uversky. 1999a. Inactivated actin, andaggregate comprised of partially-folded monomers, has a overall native-like packing density. Protein and Peptide Letters. 6:173-178.

73. Kuznetsova I.M., T. A. Yakusheva, and K.K.Turoverov. 1999b. Contribution of separate tryptophan residues to intrinsic fluorescence of actin. Analysis of 3D structure. FEBSLetters. 452:205-210.

74. MacKerell, A. D. J., L. Nilsson, R. Rigler, and W. Saenger. 1988. Molecular dynamics simulations of ribonuclease T1: analysis of the effect of solvent on the structure , fluctuations and active site of free enzyme. Biochemistry. 27:4547-4556.

75. Mallinson, R., R. Carter, and C. A. Ghiron. 1981. Acrylamide quenching studies with azurin B. Biochim. Biophys.Acta. 671:117-122.

76. Marquardt, D. W. 1963. An algorithm for least-squares estimation of nonlinear parameters. J.Soc.Indust.Apl.Math. 11:431 -441.

77. Martiland M., and A. Kedrin. 1978. Comparative sensibility of Si-»So and S2—>S0 indole electronic transition to environment perturbations. The positions of the 0-0 bands in polar media. J.Chem.Phys. 28:473-485.

78. Matveyev, V.V., A.M. Usmanova, A.V. Morozova, J.H. Collins, and S.Yu. Khaitlina. 1996. Purification and characterization of the proteinase ECP 32 from Escherichia coli A2 strain. Biochim. Biophys. Acta. 1296:55-62.

79. Merritt, E.A., and M.E.B. Murphy. 1994. Raster 3D version 2.0 a program for photorealistic molecular graphics. Acta Cryst. D50: 869-873.

80. Munro, I., I. Pecht, and L. Stryer. 1979. Subnanosecond motions of tryptophan residues in proteins. Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 76:56-60.

81. Nagy, B., and Jencks W. P. 1962. Optical rotatory dispersion of G-actin. Biochemistry 1: 987-996.

82. Nagy, B., and Strzelecka-Golaszewska, H. 1972. Optical rotatory dispersion and circular dichroic spectra of G-actin. Arch. Biochem. Biophys. 150: 428-435.

83. Nezlin, R. S., Y. A. Zagyansky, and L. A. Tumerman. 1970. Strong evidence for the freedom of rotation of immunoglobin G subunits. J.Mol.Biol. 50:569-572.

84. O'Connor, D. V., W. R. Ware, and J. C. Andre. 1979. Deconvolution of fluorescnce decay curves. A critical comparison of techniques. J.Phys.Chem. 83:1333-1343.

85. Ohgushi, M., and A. Wada. 1983. 'Molten-globule state': a compact form of globular proteins with mobile side-chains. FEBS Lett. 164:21-24.

86. Permyakov, E. A., V. V. Yarmolenko, V. I. Emelyanenko, E. A. Burstein, J. Closset, and C. Gerday. 1980. Fluorescence studies of the calcium binding to whiting (Gadus merlangus) parvalbumin. Eur.J.Biochem. 109:307-315.

87. Petrich, J. W., J. W. Longworth, and G. R. Fleming. 1987. Internal motion and elecron transfer in proteins: a picosecond fluorescence study of three homologous azurins. Biochemistry. 26:2711-2722.

88. Philips, A.V., M.S. Coleman, K. Maskos, and M.D. Barkley. 1989. Time-resolved fluorescence spectroscopy of human adenosine deaminasse: effects of enzyme inhibitors on protein conformation. Biochemistry. 28: 2040-2050.

89. Ptitsyn, O. B. 1995. Molten globule and protein folding. Adv.Protein.Chem. 47:83-229.

90. Rao, M.V.R., M. Atreyl, and M.R. Rajeswari. 1981. Fluorescence spectra of lysozyme excited at 305 nm in presence of urea. Int. J. Peptide Protein Res. 17: 205-210.

91. Sayle, R.A., and E.J. Milner-White. 1995. RASMOL: biomolecular graphics for all. Trends Biochem. Sci. 20:374.

92. Shinitzky, M., and R. Goldman. 1967. Fluorometric detection of histidine-tryptophan complexes in peptides and proteins. Eur.J.Biochem. 3:139-144.

93. Shopova, M., and N. Genov. 1983. Protonated form of histidine 238 quenches thefluorescence of tryptophan 241 in subtilisin Novo. Int. J.Peptide Protein. 21:475-478.

94. Small E.V. and I. Isenberg 1977. Hydrodynamic properties of a rigid molecule: rotational and linear diffusion and fluorescence anisotropy. Biopolymers. 16:1907-1928.

95. Song, P.-S., and W. E. Kurtin. 1969. A spectroscopic study of the polarised luminescence of indoles. JAmer. Chem.Sci. 91:4892-4906.

96. Steinberg, I. 1971. Long-range nonradiative transfer of electronic excitation energy in proteins and polypeptides. Ann.Rev.Biochem. 40:83-114.

97. Steiner, R.F., and E.P. Kirby, 1969. The interaction of the ground and excited states of indole derivatives with electron scavengers. J.Phys. Chem. 73: 4130-4135.

98. Strickland E.H., J. Horwitz, and C. Billups. 1970. Near-ultraviolet absorption bands of tryptophan. Studies using indole and 3-methylindole as models. Biochemistry. 9:1914-1921.

99. Strickland E.H., and C. Billups. 1973. Oscillator strengthes of the .La and 'Lb absorption bands of tryptophan and several other indoles. Biopolymers. 12:1989-1995.

100. Strzelecka-Golaszewska, H., Venyaminov, S. Yu., Zmorzynski, S., and Mossakowska, M. 1985. Effect of various amino acid replacements on the conformational stability of G-actin. Eur. J. Biochem. 147: 331-342.

101. Szabo, A. G., and D. M. Rayner. 1980. Fluorescence of tryptophan conformers in aqueous solution. J.Am.Chem.Soc. 102:554-563.

102. Szabo, A. G., T. M. Stepanik, D. M. Wayner, and N. M. Young. 1983. Conformational heterogeneity of the copper binding site in azurin. Biophys. J. 41:233-244.

103. Szabo, A. G., and C. Faerman. 1992. Dilemma of correlating fluorescence quantum yields and intensity decay times in single tryptophan mutant proteins. Time-res. Laser Spectrosc. Biochem. 1640:1 -11.

104. Tanaka, F., and N. Mataga. 1979. Theory of time-dependent photo-selection in interacting fixed systems. Photochem. Photobiol. 29:1091-1097.

105. Tani, F., M. Murata, T. Higasa, M. Goto, N. Kitabatake, and E. Doi. 1995. Molten globule state of protein molecules in heat-induced transparent food gels. J.Agricult. FoodChem. 43:2325-2331.

106. Teale, F. W. J., and R. Badley. 1970. Depolarization of the intrinsic and extrinsic fluorescence of pepsinogen and pepsin. Biochem. J. 116:341-349.

107. Teichberg, V. I., and N. N. Sharon. 1970. A spectrofluorometric study of tryptophan 108 in hen egg-white lysozyme. FEBS Letters. 7:171-174.

108. Teichberg, V. I., and M. Shinitzky. 1973. Fluorescence polarization studies of lysozymeand lysozyme-saccharide complexes. J.Mol.Biol. 74:519-531.

109. Turoverov, K. K., S. Y. Khaitlina, and G. P. Pinaev. 1976. Ultra-violet fluorescence of actin. Determination of native actin content in actin preparations. FEBS Letters. 62:46.

110. Turoverov, K. K., I. M. Kuznetsova, and V. N. Zaitsev. 1985. The environment of the tryptophan residue in Pseudomonas aeruginosa azurin and its fluorecsence properties. Biophys.Chem. 23:79-89.

111. Turoverov, K. K., and I. M. Kuznetsova. 1986 a. What causes the variation of polarization degree across the emission spectrum of proteins? Biophys.Chem. 24:327-335.

112. Turoverov, K. K., and I. M. Kuznetsova. 1986 b. What causes the depolarization oftrypsin and trypsinogen fluorescence. Intramolecular mobility or non-radiative energy transfer? Biophys. Chem. 25:315-323.

113. Turoverov, K. K., and I. M. Kuznetsova. 1989. What can give a special analysis of X-ray data for the development of proteins intrinsic fluorescence method ? Studia Biophys. 133:227-234.

114. Turoverov K.K., I.M.Kuznetsova, S.Yu.Khaitlina, and V.N.Uversky. 1999a. Unusual combination of the distorted structure and frosen mobility in inactivated actin molecule. Protein and Peptide Letters. 6:73-78.

115. Turoverov, K. K., A.G.Bictashev, S.Yu.Khaitlina, and I. M.Kuznetsova. 1999b. The structure and dynamics of partially folded actin. Biochemistry 38: 6261-6269.

116. Uversky, V. N. 1993. Use of fast-protein size-exclusion chromatography to study the unfolding of proteins which denature through the molten globule. Biochemistry 32: 13288-13298.

117. Uversky, V. N. and O.B.Ptitsyn. 1996. Further evidence on the equibrium "pre-molten globule state": four-state GdmCl-induced unfolding opf carbonic anhydrase B at low temperature. J.Mol.Biol. 255:215-228.

118. Uversky, V. N., N. V. Narizhneva, T. V. Ivanova, M. D. Kirkitadze, and A. Y.

119. Tomashevski. 1997. Ligand-free form of human alpha-fetoprotein: evidence for the molten globule state. FEBS Lett. 410:280-284.

120. Valeur B., and G. Weber. 1977. Resolution of the fluorescence excitation spectrum of indole into the lLa and 'Lb excitation bands. Photochem.Photobiol. 25:441-444.

121. Vincent, M., J.-C. Brochon, F. Merola, W. Jordi and J. Gallay. 1988. Nanoseconddynamics of horse heart apocytochrome C in aqueous solution as studied by time-resolved fluorescence of the single tryptophan residue (Tr-59). Biochemistry. 27: 8752-8761.

122. Wahl, P. 1975 a. Decay of fluorescence anisotropy. In Concepts of biochemical fluorescence. Plenum, New York. 1-14.

123. Wahl, P. 1975 b. Nanosecond pulsefluorimetry. In New technique in biophys and cell biol. P. K. a. S. B, editor. 233-284.

124. Weber, G. 1952. Polarization of the fluorescence of macromolecules. Biochem.J. 51:145155.

125. Williams, R. J. P. 1979. The conformational properties of proteins in solution.

126. Zimmerman, H., and N. Z. Joop. 1961. Polarization der electronenbanden von aromaten.

127. Metteilung: chinolin, isochinolin, indol. Z. Electochemic. 65:61-65. Zuker, M., A. G. Szabo, L. Bramall, and D. T. Krajcarski. 1985. The delta function convolution method (DFCM) for fluorescence decay experiments. Rev.Sci.Instr. 56:14-22.