Фолдинг лиганд-связывающих белков периплазмы бактерий. Роль лигандов в стабилизации их структуры тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Степаненко, Ольга Викторовна

• Степаненко, Ольга Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Степаненко, Ольга Викторовна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность исследования.

Цель и задачи исследования.

Основные положения, выносимые на защиту.

Научная новизна исследований.

Теоретическое и практическое значение работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Современные представления о фолдинге белков.

1.1.1. Сворачивание белков в клетке.

1.1.2. Модель энергетической воронки. Роль внутри- и межмолекулярных взаимодействий в фолдинге и нарушении фолдинга белков.

1.2. Периплазматические лиганд-связывающие белки.

1.2.1. И-галактоза/О-глюкоза-связывающий белок из Escherichia coli.

1.2.1.1. Структура GGBP и его комплекса с О-глюкозойЛЗ-галактозой.

1.2.1.2. Спектральные свойства GGBP и GGBP/Glc.

1.2.1.3. Тепловая денатурация GGBP. Роль лигандов — D-глюкозы и иона кальция — в стабилизации структуры белка.

1.2.2. Глутамин связывающий белок из Escherichia coli.

1.2.2.1. Структура GlnBP в свободном состоянии и в комплексе с Gin.

1.2.2.2. Спектральные свойства GlnBP и GlnBP/Gln.

1.2.2.3. Изучение структуры и стабильности GlnBP и комплекса GlnBP/Gln при тепловой денатурации.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Анализ свойств микроокружения и особенностей локализации триптофановых и тирозиновых остатков.

2.2.2. Фпуорещентные измерения.

2.2.3. Регистрация и анализ кривых затухания флуоресценции.

2.2.4. Круговой дихроизм.

2.2.5. Измерение равновесных кривых денатурации.

2.2.6. Измерение кинетических кривых разворачивания-сворачивания белков.

2.2.7. Анализ экспериментальных данных о процессе сворачивания-разворачивания белков с использованием параметрического представления двух независимых экстенсивных характеристик системы.

2.2.8. Расчет констант скоростей процессов сворачивания-разворачивания.

2.2.9. Расчет термодинамических параметров.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Процессы сворачивания-разворачивания GGBP и его комплекса GGBP/Glc.

3.1.1. Анализ микроокружения триптофановых и тирозиновых остатков GGBP в отсутствие и в присутствии лиганда.

3.1.2. Триптофановая флуоресценция GGBP и его комплекса с D-глюкозой в нашивном и полностью развернутом состоянии.

3.1.3. Разворачивание GGBP и GGBP/Glc под действием GdnHCl.

3.1.4. Ренатурация GGBP.

3.1.5. Тепловая денатурация GGBP и GGBP/Glc.

3.1.6. Отщепление иона кальция.

3.2. Процессы сворачивания-разворачивания GlnBP и его комплекса GlnBP/Gln.

3.2.1. Триптофановая флуоресценция GlnBP и его комплекса с Gin в нашивном и полностью развернутом состояниях.

3.2.2. Характеристика микроокружения триптофановых остатков GlnBP.

3.2.3. Флуоресцентные свойства и характеристика микроокружения триптофановых остатков комплекса GlnBP/Gln.

3.2.4. Тирозиновая флуоресценция GlnBP.

3.2.5. Зависимость триптофановой флуоресценции GlnBP от длины волны возбуждения. 3.2.5. Разворачивание GlnBP и GlnBP/Gln под действием GdnHCl. Равновесные зависимости.

3.2.6. Кинетика разворачивания GlnBP под действием GdnHCl.

3.2.7. Параметрическое представление процессов разворачивания GlnBP.

3.2.8. Ренатурация GlnBP.

3.2.9. Тепловая денатурация GlnBP и комплекса GlnBP/Gln. Стабилизация структуры GlnBP при взаимодействии с лигандом.

3.3. Сравнение характера процессов разворачивания-сворачивания GGBP с GlnBP.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фолдинг лиганд-связывающих белков периплазмы бактерий. Роль лигандов в стабилизации их структуры»

Процессы разворачивания-сворачиваиия белков, их устойчивость к действию химических денатураптов и нагреванию, структура и механизмы образования частично-свернутых форм белков являются в настоящее время предметом интенсивных исследований, проводимых многими научными коллективами мира. Актуальность этих исследований обусловлена как их значимостью для решения фундаментальной проблемы фолдипга белков, так и тем обстоятельством, что ассоциация макромолекул белков в денатурированных частично-свернутых состояниях представляет существенную проблему для медицины (Harper, Lansbury, 1997; Carrell, Gooptu, 1998; Fink,. 1998; Uversky et al., 1999a; Uversky et al., 1999b; Selkoe, 2003) и биотехнологии (Wetzel, 1994; Speed et al., 1996; Fink, 1998). Специфическая ассоциация, приводящая к образованию амилоидных фибрилл, сопутствует ряду тяжких заболеваний (так называемых "конформационных болезней"), таких как нейродегенеративные болезни Альцгеймера и Паркинсона, злокачественная миелома, прионные заболевания, а образование аморфных агрегатов при синтезе рекомбинантных белков, приводящее к возникновению белковых преципитатов, является наиболее существенным препятствием при получении нативных рекомбинантных белков.

К настоящему времени хорошо охарактеризованы процессы фолдинга-рефолдинга небольших мономерных белков. Фолдинг мультидоменных и олигомерных белков, а также белков, содержащих в своем составе лиганды, изучен в значительно меньшей степени. В связи с этим значительный интерес представляет исследование фолдинга белков, принадлежащих к большому классу периплазматических лиганд-связывающих белков, участвующих в процессах активного транспорта различных биологически-активных веществ (углеводов, аминокислот, анионов, ионов металлов, дипептидов и олигопептидов), процессах хемотаксиса и кооперативной чувствительности (quorum sensing) бактерий. В настоящей работе объектами исследования стали глутамин-связывающий белок и D-галактозаЛЭ-глюкоза-связывающий белок из Escherichia coli. Связывание этих белков с их лигандами (глутамином и сахарами) приводит к большим структурным изменениям третичной структуры белка, что делает возможным использование этих белков при конструировании социально значимых биосенсоров для определения содержания глутамина и Сахаров. Последнее имеет важное практическое значение для биотехнологии (определение уровня глутамина в клеточных культурах; Dattelbaum, Lakowicz, 2001) и медицинской биохимии (неинвазивное определение уровня сахара в крови диабетических больных; Staiano et al., 2004). Поскольку при использовании лиганд-связывающих белков в качестве чувствительного элемента биосенсоров важно использовать такие формы белков, которые отличаются высоким уровнем устойчивости к агрессивному действию окружающей среды, немаловажным является изучение стабильности этих белков.

Цель и задачи исследования

Цель работы состояла в изучении процессов сворачивания-разворачивания глутамин-связывающего белка и О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка. В задачи работы входило:

1. Изучение процессов денатурации глутамин-связывающего белка и D-галактоза/Б-глюкоза-связывающего белка под действием гуанидингидрохлорида (GdnHCl);

2. Определение количества промежуточных состояний, возникающих в процессе денатурации глутамин-связывающего белка и О-галактозаЛЭ-глюкоза-связывающего белка и изучение свойств этих промежуточных состояний;

3. Выяснение, является ли денатурация глутамин-связывающего белка и D-галактоза/Е)-глюкоза-связывающего белка под действием GdnHCl обратимой;

4. Исследование роли лигандов - глутамина, в случае глутамин-связывающего белка, и D-глюкозы и иона кальция, в случае О-галактозаЛЭ-глюкоза-связывающего белка - в стабилизации структуры этих белков к денатурирующему действию GdnHCl и нагревания.

Основные положения, выносимые па защиту

1. Связывание лиганда стабилизирует структуру лиганд-связывающих белков и делает процесс их разворачивания более кооперативным, однако не влияет на путь разворачивания белка и число возникающих при этом промежуточных состояний.

2. Несмотря на сходство структуры глутамин-связывающего белка и D-галакгозаЛЭ-глюкоза-связывающего белка, характер процессов разворачивания этих белков существенно различается: разворачивание О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка осуществляется по принципу "все или ничего", при разворачивании глутамин-связывающего белка образуется два промежуточных частично-свернутых состояния. Одно из этих состояний является состоянием типа расплавленной глобулы, его возникновение сопровождается ассоциацией молекул глутамин-связывающего белка.

3. Хотя связывание лиганда вызывает существенные преобразования структуры лиганд-связывающих белков, их флуоресцентные характеристики изменяются при этом незначительно.

Научная новизна исследований

Результаты исследования процессов разворачивания—сворачивания глутамин-связывающего белка и О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка, получены впервые. Впервые установлено трехстадийное, но обратимое разворачивание глутамин-связывающего белка и одностадийное, обратимое разворачивание D-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка под действием GdnHCl. Показано, что лиганд не только делает структуру белка более устойчивой по отношению к денатурирующему действию GdnHCl и нагреванию, по и делает процесс денатурации более кооперативным. Впервые охарактеризована стабильность белков путем определения величин свободных энергий Гиббса.

Впервые установлено, что, несмотря на значительные структурные преобразования, происходящие в глутамин-связывающем белке и Б-галактозаЯ)-глюкоза-связывающем белке при связывании соответствующих лигандов, характеристики их триптофановой флуоресценции при этом изменяются незначительно. Сделано заключение о том, что собственная флуоресценция D-галактозаЛЭ-глюкоза-связывающего белка вряд ли может использоваться в качестве регистрируемой характеристики при создании биосенсоров для пеинвазивного определения содержания сахара в крови больных диабетом. Тем не менее, существенные изменения пространственной структуры белков при связывании лигандов открывают возможности для использования при конструировании биосенсоров явления поверхностного плазмонного резонанса, а также эффекта переноса энергии при введении в белок флуоресцентных меток - донора и акцептора энергии возбуждения.

На примере глутамин-связывающего белка впервые показано, что вклад отдельных триптофановых остатков в суммарную флуоресценцию белка может зависеть от длины волны возбуждающего света. Предложен метод учета этого эффекта.

Теоретическое и практическое значение работы

Новые данные о процессах сворачивания-разворачивания глутамин-связывающего белка и Б-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка, а также роли лигандов в этом процессе, существенны для более глубокого понимания роли лигандов в процессах фолдинга этих белков и устойчивости их структуры к действию различных химических денатурантов и нагреванию. Эти данные существенны также для понимания процессов фолдинга сложных мультидоменных белков.

Данные о характере процессов сворачивания-разворачивания глутамин-связывающего белка и О-галактоза/Э-глюкоза-связывающего белка могут иметь важное практическое значение при их использовании в качестве чувствительных элементов биосенсорных систем на глутамин и сахара.

Существенной методической разработкой является установление того факта, что вклад отдельных триптофановых остатков в суммарную флуоресценцию белка может зависеть от длины волны возбуждающего света. Этот эффект необходимо учитывать при использовании метода собственной УФ-флуоресценции для изучения структуры и конформационных изменений белков, при оценке вклада тирозиновых остатков в суммарную флуоресценцию белка, а также при разложении спектра флуоресценции белков, содержащих несколько триптофановых остатков, на составляющие.

Результаты работы используются при проведении лекционно-практических занятий для студентов 4 курса Кафедры биофизики СПбГПУ.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Степаненко, Ольга Викторовна

выводы

1. Связывание лиганда стабилизирует структуру глутамин-связывающего белка и О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка и делает процесс их разворачивания более кооперативным, однако не влияет на путь разворачивания белка и число возникающих при этом промежуточных состояний.

2. Несмотря на сходство структуры глутамин-связывающего белка и D-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка, характер процессов разворачивания этих белков существенно различается:

• разворачивание глутамин-связывающего белка под действием гуанидингидрохлорида является трехстадийным, т.е. проходит с образованием двух промежуточных состояний Ii и 12.

• процесс разворачивания О-галактозаЛЭ-глюкоза-связывающего белка под действием гуанидингидрохлорида является одностадийным.

3. Разворачивание глутамин-связывающего белка и О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка под действием гуанидингидрохлорида является обратимым, а тепловая денатурация необратима.

4. Существенное увеличение интенсивности флуоресценции красителя 1-анилинонафталин-8-сульфоната при переходе в первое промежуточное состояние 1Ь возникающее при разворачивании глутамин-связывающего белка, связано с образованием состояния типа "расплавленной глобулы". Возникновение гидрофобных кластеров на поверхности макромолекулы глутамин-связывающего белка при переходе в это состояние сопровождается ассоциацией макромолекул.

5. Несмотря на значительные структурные преобразования, происходящие в глутамин-связывающем белке и О-галактоза/О-глюкоза-связывающем белке при связывании соответствующих лигандов, характеристики их триптофановой флуоресценции при этом изменяются незначительно.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Степаненко, Ольга Викторовна, 2008 год

1. Бурштейн Э. А. (1976). Люминесценция белковых хромофоров. Сер. Биофиз, Т.7, ВИНИТИ, Москва.

2. Бычкова В. А. и Птицын О.Б. (1995). Функциональное состояние денатурированных белков: принципы моделирования и первые результаты. Цитология. 37: 1238 — 1250.

3. Гильманшии Р.И., Долгих Д.А., Птицын О.Б., Финкелынтейн А.В. и Шахнович Е.И. (1982). Белковые глобулы без уникальной пространственной структуры: экспериментальные данные для а-лактальбуминов и общая модель. Биофизика. 27: 1005 1015.

4. Грузина В.Д. (2003). Коммуникативные сигналы бактерий. Антибиотики и химиотерапия. 48(10): 32-39.

5. Гусев Н.Б. (2004). Нейродегенеративные болезни и проблема правильного сворачивания белка. СОЖ. 8(2): 15-23.

6. Капланас Р.И., Буколова Т.Г., Бурштейн Э.А. (1975). Флуоресценция Р-лактоглобулина в различных физико-химических условиях. Мол. Биол. 9: 795 -804.

7. Кузнецова И.М., Форже В., Туроверов К.К. (2005). Структурная динамика, стабильность и фолдинг белков. Цитология. 47(11): 943 952.

8. Кузнецова И.М., Степаненко Ольга В., Туроверов К.К., Хуанг Ч., Ванг Ч.-Ч. (2005) Конформационные изменения дисульфидизомеразы С под действием гуанидингидрохлорида. Цитология. 47 (11): 1007 1016.

9. Кузнецова И.М., Туроверов К.К. (1983). Поляризация собственной флуоресценции белков. III. Внутримолекулярная подвижность триптофановых остатков. Мол. биол. 17 (4): 741 754.

10. Кузнецова И.М., Туроверов К.К. (1998). Что определяет характеристики собственной УФ-флуоресценции белков? Анализ свойств микроокружения иособенностей локализации их триптофановых остатков. Цитология. 40 (8/9): 747 762.

11. Лакович Дж. (1986). Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир. стр. 136 139.

12. Поварова О.И., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. (2005). Физико-химические свойства актина в различных структурных состояниях. Новые представления о процессах его сворачивания — разворачивания. Цитология. 47: 935 — 977.

13. Полинг Л., Полинг П. (1978). Химия. М.: Мир. стр. 683.

14. Птицын О.Б. (1973). Стадийный механизм организации белковых молекул. Докл. Акад. Наук СССР. 210: 1213 1215.

15. Степаненко Ольга В., Кузнецова И.М., Туроверов К.К., Скогиамиглио В., Стаяно М., Д'Ауриа С. (2005). Структура и стабильность глутаминсвязывающего белка из Escherichia coli и его комплекса с глутамином. Цитология. 47(11): 988 1006.

16. Степаненко Ольга В., Кузнецова И.М., Туроверов К.К., Скогнамиглио В., Стаяно М., Д'Ауриа С. (2007). Влияние лиганда на стабильность и процессы фолдинга двухдоменных лигапд-связывающих белков. Вестник молодых ученых. Выпуск IV. М.: СП "Мысль". 42-52.

17. Туроверов К.К., Бикташев А.Г., Дорофеюк А.В., Кузнецова И.М. (1998). Комплекс аппаратных и программных средств для измерения спектральных, поляризационных и кинетических характеристик флуоресценции в растворе. Цитология. 40 (8/9): 806-817.

18. Туроверов К.К., Кузнецова И.М. (1998). Собственная УФ-флуоресценция белков как инструмент для изучения их динамики. Цитология. 40 (8/9): 735 -746.

19. Финкельштейн, А.В. (1976). Стереохимический анализ вторичной структуры полипептидной цепи при помощи пространственных моделей Курто. I. Разрешение конформации дипептидов. Мол. Биология. 10 (3): 507 513.

20. Финкельштейн А.В., Птицын О.Б. (2005). Физика белка. М.: КДУ. 456 с.

21. Эфтинк М.Р. (1998). Использование флуоресцентных методов для изучения разворачивания белков. Биохимия. 63 (3): 327 337.

22. Akiyama S., Takahashi S., Ishimori К. and Morishima I. (2000). Stepwise formation of a-helices during cytochrome с folding. Nat. Struct. Biol. 7: 514 — 520.

23. Altschuler G.M., Klug D.R., Willison K.R. (2005). Unfolding energetics of G-a-actine: a discrete intermediate can be re-folded to the native state by CCT. J.Mol.Biol. 353(2): 385-396.

24. Ames G. F.-L. and Lecar H. (1992). ATP-dependent bacterial transporters and cystic fibrosis: analogy between channels and transporters. FASEB J. 6: 2660-2666.

25. Anfinsen C.B. (1973). Principles that govern the folding of proteins chains. Science. 181:223 -230.

26. Anraku Y. (1968). Transport of sugars and amino acids in bacteria. I. Purification and specificity of the galactose and leucine-binding proteins. JBC 243 (11): 3116 -3122.

27. Arai M., Inobe Т., Maki K., Ikura Т., Kihara H., Amemiya Y., and Kuwajima K. (2003). Denaturation and reassembly of chaperonin GroEL studied by solution X-ray scattering, Protein Sci. 12: 672 680.

28. Bader M.V. and Bardwell J.C.A. (2002). Catalysis of disulfide bond formation and isomerization in Escherichia coli. Adv. Protein. Chem. 59: 283 301.

29. Baldwin R.L. and Rose G.D. (1999a). Is protein folding hierarchic? I. Local structure and peptide folding. Trends Biochem. Sci. 24(1): 26-33.

30. Baldwin R.L. and Rose G.D. (1999b). Is protein folding hierarchic? II. Folding intermediates and transition states. Trends Biochem. Sci. 24(2): 77-83.

31. Beel B.D. and Hazelbauer G.L. (2001). Signaling substitutions in the periplasmic domain of chemoreceptor Trg induce or reduce helical sliding in the transmembrane domain. Molecular Microbiology. 40(4): 824 834.

32. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissing H., Shindyalov I.N., Bourne P.E. (2000). The protein data bank. Nucleic Acids Research. 28 (1): 235-242.

33. Bilsel O., Matthews C.R. (2000). Barriers in protein folding reactions. Adv. Protein Chem. 53: 153 -207.

34. Bjorkman A.J. and Mowbray S.L. (1998). Multiple open forms of ribose-binding protein trace the path of its conformational change. JMB. 279(3): 651 64.

35. Borrok M.J., Kiessling L.L. and Forest K.T. (2007). Conformational changes of d-glucose/D-galactose binding protein illuminated by apo and ultrahigh resolution ligand-bound structures. Prot.Sci. 16(6): 1032- 1041.

36. Bushmarina N. A., Kuznetsova I. M., Biktashev A. G., Turoverov К. K., Uversky V. N. (2001). Partially folded conformations in the folding pathway of bovine carbonic anhydrase II: a fluorescence spectroscopic analysis. Chem.Bio.Chem. 2: 813 — 821.

37. Bychkova V.E. and Ptitsyn O.B. (1993). The molten globule in vitro and in vivo. Chemtracts Biochemistry and Molecular Biology. 4: 133 — 163.

38. Careaga C.L., Sutherland J., Sabeti J. and Falke J. (1995). Large amplitude twisting motions of an interdomain hinge: a disulfide trapping study of the galactose-glucose binding protein. Biochemistry. 34: 3048 3055.

39. Carrell R.W., Gooptu B. (1998). Conformational changes and disease serpins, prions and Alzheimer's. Curr. Opin. Struct. Biol. 8: 799 - 809.

40. Carrio M., Gonzalez-Montalban N., Vera A., Villaverde A., Ventura S. (2005). Amyloid-like properties of bacterial inclusion bodies. J.Mol.Biol. 347: 1025 1037.

41. Chen Y., Barklcy M. D. (1998). Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins. Biochemistry 37: 9976-9982.

42. Chen X., Schauder S., Potter N., Van Dorsselaer A., Pelczer I., Basslcr B.L., and Hughson F.M. (2002). Structural identification of a bacterial quorum-sensing signal containing boron. Nature. 415: 545 549.

43. Chen J., Walter S., Horwich A.L. and Smith D.L. (2001). Folding of malate dehydrogenase inside the GroEL-GroES cavity. Nature Struct. Biol. 8: 721 728.47