Выделение и свойства альфа-фетопротеина человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Томашевский, Андрей Юрьевич

• Томашевский, Андрей Юрьевич
• кандидат биологических наук
• 0

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Томашевский, Андрей Юрьевич

Оглавление

Введение---------------------------------------------------------------------------------------5

Раздел 1. ОБЗОР Литературы-----------------------------------------------------------8

1.1. Открытие АФП и его свойства.---------------------------------------------------8-

Иммунорегуляторные свойства АФП--------------------------------------------14

1.2. Взаимодействие АФП с различными типами клеток------------------------16

1.3. Стурктура и физико-химические свойства-------------------------------------18

1.4. Схемы выделения альфа-фетопротеина-----------------------------------------23

Раздел 2. Материалы и методы.

2.1. Материалы----------------------------------------------------------------------------25

2.2. Методы исследования--------------------------------------------------------------27

2.2.1 Синтез аффиных сорбентов-------------------------------------------------------27

2.2.2 Очистка альфа-фетопротеина-----------------------------------------------------27

2.2.3 Электрофорез белков---------------------------------------------------------------27

2.2.4 Определение концентрации белков---------------------------------------------27

2.2.5 Обработка модифицированного сахарозой АФП инвертазой------------27

2.2.6 Удаление гидрофобных лигандов-----------------------------------------------27

2.2.7 Калориметрические измерения--------------------------------------------------29

2.2.8 Исследования флуоресценции---------------------------------------------------29

2.2.9 Спектры кругового дихроизма--------------------------------------------------30

3. Основные физико-химические методы---------------------------------------

3.1 Круговой дихро изм

3.2 Сканирующая калориметрия-----------------------------------------------------32

3.3 Флуоресцентная спектроскопия-------------------------------------------------34

3.4 Определение степени кооперативности переходов-------------------------38

Результаты и обсуждение

Глава 1. Схема очистки высоко гомогенного АФП--------------------------------41

Глава 2. Исследование стабильности молекулы альфа-фетопротеина по

отношению к внешним воздействиям--------------------------------------------------49

Глава 3. Сравнение физико-химических характеристик АФП, выделенного

различными способами--------------------------------------------------------------------60

Глава 4. а -фетопротеин связывает сахарозу специфически---------------------70

Глава 5. Сравнение свойств гомологичных белков

сывороточного альбумина и АФП-----------------------------------------------------80

Заключение

Выводы--------------------------------------------------------------------------92

Список литературы----------------—----------------------------------------------------95

Приложение: Обозначения и сокращения---------------------------------------111

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выделение и свойства альфа-фетопротеина человека»

Введение

Данная работа посвящена разработке метода выделения и изучению некоторых физико-химических свойств апьфа-фетопротеина человека. Исследование свойств данного белка представляет собой актуальную задачу, лежащую на стыке различных областей биологической науки, поскольку понимание механизма функционирования исследуемого белка может стать ключом к решению ряда проблем современной иммунологии, эмбриологии и онкологии. АФП -выполняет в организме ряд важных функций, основными из которых, являются транспортная и иммуннорегуляторная. АФП единственный известный на сегодняшний день специфический переносчик ненасыщенных жирных кислот, в частности арахидоновой, которая является основным соединением при синтезе простагладнинов и лейкотриенов. В норме максимальная концентрация АФП (5-7мг/мл) обнаруживается в сыворотке плода. В сыворотке взрослого организма обычная концентрация АФП менее 5 нг/мл. Однако его уровень возрастает до 1-3 мг/мл при развитии различных патологий в частности гепатом, тератокарцином.

Как видно из выше изложенного, роль АФП в организме существенна. В связи с этим данный белок интенсивно изучается с момента его обнаружения по настоящее время. Однако по ряду объективных причин (сложность очистки, выраженная микрогетерогенность) структурные, физико-химические свойства и молекулярный механизм его функционирования в организме до конце не изучены.

Целью данной работы являлось разработка высоэффективной схемы очистки АФП и изучение ряда его физико-химических

свойств. Для решения данной задачи применялся ряд современных физико-химических методов, позволяющих получать сведения о структуре белковой молекулы, таких как круговой дихроизм, флуоресцентная спектроскопия, сканирующая микрокалориметрия и другие.

В результате проведенных исследований была разработана оригинальная схема высокоэффективной очистки данного белка. Определены границы стабильности АФП по отношению к внешним воздействиям. Обнаружено не описанное ранее свойство АФП специфически связывать сахарозу. Установлено, что удаление природных лигандов приводит к необратимой потере белком уникальной третичной структуры и переходом в состояние расплавленной глобулы.

Следует отметить что, кроме возможного прикладного значения, исследование физико-химических свойств сложного по своей структуре белка а-гликоггротеина, несущего на себе разнообразные лиганды - является с нашей точки зрения, само по себе интересной задачей в области физико-химии белка и дополняет наши знания о структуре и возможных свойствах белковых молекул.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора

литературы, раздела "Материалы и методы", пяти глав в которых описаны основные результаты иследований, заключения, выводов и списка литературы. Во введении дано краткое описание задач и результатов исследования. Обзор литературы посвящен описанию и анализу литературных данных, касающихся схем выделения, физико-химических и биологических свойств, онко-эмбрионального

белка а-фетопротеина. В следующем разделе дано описание используемых методов и материалов. Главы 1-5 посвящены описанию и анализу полученнх результатов. В главе 1 рассматривается разработанная схема выделения АФП. В главе 2 описаны результаты исследований структурных свойств а-фетопротеина. В главе 3 проведен сравнительный анализ свойств АФП, выделенного различными способами. Глава 4 описывает влияние сахарозы на структурные свойства АФП. В главе 5 описано сравнение структурных свойств АФП и его гомолога сывороточного альбумина. Раздел "Заключение» содержит описание основных результатов данной работы. В конце диссертации приведены выводы, вытекающие из проделанных экспериментов.

Диссертация написана на основе материалов, опубликованных в 11 работах

Раздел I.. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Открытие АФП и его свойства.

Альфа-фетопротеин человека а-гликопротеин с молекулярной массой 67-70 kD, содержащий 4% углеводных остатков (Smith and Kelleher, 1980; Pucci et al., 1991), был впервые обнаружен в 1956 году в сыворотке эмбриона человека (Bergstrand & Czar, 1956), а позднее в сыворотке мыши и других млекопитающих (Deutcsh, 1991). После обнаружения АФП в крови больных гепатомой (Tatarinov, 1964), а затем в сыворотке больных рядом других онкологических заболеваний (Abelev et.al.,1967, Masopust et. al., 1968), интерес к данному белку резко возрос. Так как АФП характерен как для эмбрионов, так и для опухолей, он был отнесен к классу онко-эбриональных белков.

Альфа-фетопротеин синтезируется в желточном мешке, а позднее - в печени зародыша на протяжении всего периода развития эмбриона (Deutsch, 1991). Существуют данные, что возможен также локальный синтез данного белка в других тканях зародыша, в частности в головном мозге (Naval et,al., 11992) Наибольшая концентрация АФП наблюдается в сыворотке 14-16 недельного эмбриона (5-7 мг/мл), после чего происходит постепенное снижение его концентрации. В течение первых двух недель после рождения концентрация АФП резко падает, и к концу второго месяца после рождения в сыворотке обнаруживаются только следовые его количества (8-10 нг/мл) (Deutsch, 1991). Повышение концентрации данного белка в сыворотке взрослого организма (до уровня сравнимого с его концентрацией в сыворотке плода) как правило происходит при развитии ряда онкологических заболеваний (Deutsch, 1991). Причем синтез АФП происходит в глубоко

дифференцированных опухолевых клетках ( Iseki & Kondo, 1990, Deutsch, 1991).

Одной из главных функций АФП является транспортная функия, обусловленная его способностью связывать различные лиганды. Основными лигандами АФП человека являются полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) (Deutsch, 1991). Относительное количество жирных кислот несколько отличается в различных препаратах белка. Были выявлены следующие жирные кислоты: пальмитиновая ( 8-10 %), стеариновая (2-5 %), олеиновая (10-28 %), линоленовая (7-15 %), арахидоновая (12-70%) и

100

80

о.

U-<

0 60

СП

с

1 40 CÛ

20

О

cl 6:0 Cl8:1 С20:4 022:6 des

Таблица 1 .Количественное содержание лигандов (жирных кислот) в составе АФП. Белые столбика АФП быка, темные человека.С16:0 пальмитиновая, С18:1 олеиновая, С20:4 арахидоновая, С22:6 докасагексаноиковая жирные кислоты.

4,7,10,13,16,19 докасаексоеновая (16-42 %). АФП содержит от 2.39 до 3.09 моль жирных кислот на моль белка, причем доля ненасыщенных кислот порядка 86-89 % ( количество 20:4 и 20:6

кислот составляет 54-70 % от общего количества). Константа связывания АФП с ненасыщенными жирными кислотами на пять порядков выше, чем у сывороточного альбумина и имеет значение 106 - 107 М"1 [Vallette et. al., 1989 Deutsch, 1991]. Можно сделать вывод, что АФП обладает не только большим сродством к жирным кислотам, но также имеет большую специфичность к полиненасыщенным жирным кислотам. (Parmelee,1978; Parmelee et al.,1978).

Одним из главных вопросов, возникающих при исследовании связывания АФП ненасыщенных жирных кислот, является вопрос, есть ли различие в уровне связывания лигандов белком из нормальных тканей и из опухолей. В таблице 2 представлены данные сравнительного анализа содержания жирных ненасыщенных кислот в образцах АФП, выделенного из нормальных и патологических тканей. Как видно из приведенных данных, арахидоновая и докасаексоевая жирные кислоты присутствуют во всех образцах белка, выделенного из нормальных эмбриональных источников (Parmelee et al.,1978; Nagai ei al.,1982), в то время как содержание этих лигандов у белка, выделенного из гепатом, сильно варьирует вплоть до полного отсутствия (Yaclmin et al., 1980). Является ли такое явление характерным для белка из опухолей или это возможно связано с процессом выделения представляет ' собой вопрос, требующий изучения. К сожалению, отсутствуют количественные данные по содержанию лигандов у АФП, выделенного из материнского организма человека. Такого рода исследования были проведены на крысином АФП, выделенном из сыворотки беременных крыс. Из таблицы 2 видно, что уровень лигандов в этом случае низок. Возможно, это связано с потерей лигандов при

прохождении плацентарного барьера белком (Nagai et al.,1982). По всей видимости, крысиный АФП, как модель, мало пригоден для экстраполяции полученных данных на человеческий АФП, поскольку белок крыс, как показано, имеет большее сродство к эстрогенам, нежели к жирным кислотам. Нагаи и Дойч (Nagai and Deutsch, 1980) показали, что при делипидизации крысиного АФП его микрогетерогенность лишь частично изменяется и практически не восстанавливается при ределипидизации, в то время как в случае АФП человека наблюдается обратная картина (Pannelee et al.,1978). Возможно это связано с тем, что (по данным Ауссела и Массеува (Aussei and Masseyeff, 1983а)) крысиный АФП имеет один сайт связывания жирных кислот, а АФП человека три. Разброс данных по содержанию лигандов возможно связан со схемой выделения, так, по данным Калво, при выделении АФП методом иммунно-аффинной хроматографии элюция белка низким значением pH (2.8) может приводить к потере до 80% ненасыщенных жирных кислот (Calvo et al.,1985). Аффинное связывание полиненасыщенных жирных кислот было обнаружено практически у всех препаратов АФП, выделенных из различных видов животных: свиньи (Ingvarsson and Carlsson,1978; Lampreave et al.,1982), коровы (Carlsson et al.,1980), крысы, мыши и человека (Benassayag etal.,1980; Vallette et al., 1980). Таким образом, несмотря на видоспецифические различия в связывании эстрогенов и ненасыщенных жирных кислот, основной функцией АФП по мнению ряда авторов является строго специфическое связывание полиненасыщенных жирных кислот (Pannelee etal.,1978; Carlsson et

al.,1980; Hsia et al.,1980). Хотя в работе Саву (Savu et al.,1981) приводятся данные о том, что мышиный сывороточный альбумин лучше связывает арахидоновую кислоту чем фетальный АФП это

скорее исключение из правила. Ряд авторов исследовал способность АФП связывать другие лиганды помимо жирных кислот и эстрогенов. Оказалось, что еще одно соединение способно связываться с АФП с достаточно высокой аффиностью. Аналогично сывороточному альбумину, АФП, выделенный из различных источников: человека (Aoyagi et al., 1979), быка (Ruoslahti etal.,1979; Hsia et al., 1980), крысы (Versee and Barel, 1979) оказался способен связывать билирубин. Особенно эффективно билирубин связывался АФП, выделенным из сыворотки крупно-рогатого скота (Hsia et al.,1980). В случае человеческого белка билирубин выступал в качестве конкурента жирным кислотам, по всей видимости экранируя сайт связывания жирных кислот (Aussei and Masseyeff,1984b). Так же была обнаружена способность крысиного АФП, предварительно обработанного активированным углем при нейтральных значениях pH, связывать ряд лекарственных препаратов, таких как: варфарин, фенилбутазон, азапропазон, диазепам, дигитоксин и холиевая кислота (Herve et al., 1984). И, наконец, показана способность АФП связывать ионы двух валентных металлов - никеля и меди (Aoyagi et al.,1978; Lau et al.,1989).

глин-: in

Fatty Лели Contents ok Various Soi;*ck AFP Isolates and of Serum Ai.rumjns

Source Protein* Total 12 0 14:0 16:0 18:0 18:1 18:2 C20:0 C20:4 C22:6 % PUFA' Investigator

Human leial AFP

1 2.39 0.21 0.65 0 66 0.17 0.29 1.01 55 Parmelee

2 2.66 0.20 0.14 0.58 0.17 0.99 0.88 70 Hal. {1978)

3 3.09 0.33 0.11 0.51 0.16 1.20 0.49 55

4 5.58 0.27 0.08 M8 0.31 0.87 057 56

Average 2.6R 0.25 0.12 0.48 0.28 0.84 0.74 59

Human fetal Alb 0.7 0.10 0.02 0.37 0.10 0.05 0.03 12

Adult human Alb 2.44 0.83 0.83 0.48 (1.24 0.05 0 2

Human hepatoma AFP

1 2.12 0.49 0.14 0.49 0.26 0.58 0.18 35 Nagat

2 0.45 0.18 o.ot 0.09 0.06 0.08 0 18 el «1. (1982)

3 0.70 0.35 0.02 0.20 0.13 0 0 0

4 1.2« 0.58 0.18 0 30 0.20 0 0 0

Humau hepatoma AFP

1 3.3 — 0.2 2.05 0.S6 — 0.19 — 5.8 Yaclmin

2 2.3 0.14 0.29 (1.95 11.76 0.05 0.1 — 1.3 ctal. (1980)

3 8 0.38 0.67 5.90 2.76 0.29 — — 0

4 4.8 0.12 0.43 2.65 1.60 — — — 0

5 l.j 0.1 0.29 2.05 20 — 0.05 1.1

6 4.9 0.19 0.42 2,38 1.62 0.14 0.1 2.0

7 3.9 0.14 0.S3 171 1.52 0.1 0.115 — 1.3

Fetal Rat AFP (1.93 0.14 0.03 0.29 0.16 П.16 0.15 33.3 Nagai

tltil. (1982)

Pregnant rat AFP 0.58 0.16 0.07 0.28 0.05 0.02 0 3.4

Morris 7777 rat 0.86 0.22 0.09 0.43 0.08 0.04 0 4.6

hepatoma AFP

a The various human fetal AFP isolates were cadi obtni ncd from a pool of 4 to 7. 12- to 1 (•¡•week-old fetuses. AU rat AFP preparations were from pooled maceria! from 10 to 20 animals. Alb. Albumin.

* Polyunsaturated fatty acids (PUFA) arc .iin«.hi<lonit (C20:4) ;in<l clocosahrxnenoic (C22:ii).

Таблица 2. Содержание лигандов (жирных кислот) в составе АФП и сывороточного альбумина выделенных из нормальных патологических образцов.( С 16:0 пальмитиновая, С 18:1 олеиновая, С 20:4 арахидоновая, С 22:6 докосагексаноевая жирные кислоты.

1.2. Иммуннорегуляторные свойства АФП.

В настоящий момент в различных лабораториях проводятся исследования по выяснению влияния АФП на различные иммунные процессы. По всей видимости, первым исследованием в этом направлении является работа Пармели (Parmely and Hsu, 1973), в которой было показано, что сыворотка мышей больных, гепатомой Морриса, способна ингибировать стимуляцию

фитогемоагглютинином крысиных лимфоцитов в культуре. Ряд исследований был посвящен влиянию АФП, выделенного из амниотической жидкости мыши. Было отмечено ингибирование продукции различных подклассов иммуноглобулинов, в основном IgA и IgG, клетками селезенки. Причем апликация не влияла на способность В-клеток продуцировать антитела, а происходила супрессия популяций Т -супрессоров и Т-хелперов.(Мищйа et al., 1975а,b; Murgita et al.,1977). Так же была показана супрессия формирования NK-киллерных клеток низкими концентрациями АФП (Dattwyler and Tomasi,1975). Связывание АФП Т-клетками было показано при обработке мышиных спленоцитов амниотической жидкостью (Dattwyler et al., 1975). Позднее было установлено, что АФП способен супрессировать Т-лимфоцит зависимую цитотоксическую реакцию (Peek et al.,1982; Hooper et al.,1982). Так же оказалось, что АФП способен взаимодействовать с фракцией лимфотитов, ответственных за трансплатационный ответ (Dattwyer and Tomasi,1975; Dattwyer et al.,1975). Таким образом, данные, приведенные выше позволяют предположить, что АФП

является одним из основных иммунномодуляторов (in vivo), мишенью для которого является в основном популяция Т -клеток (Murgita et al.,1981; Peck et al.,1982). По аналогиии с АФП животного происхождения были проведены исследования с АФП человека, выделенным из различных источников. Так, было показано, что данный белок, выделенный из сыворотки и асцидной жидкости больных гепатомой, так же ингибировал стимуляцию лимфоцитов ФГА. Причем отмечались различия в воздействии белка из нормальной и патологической сыворотки (Yanchin,1976). В дальнейшем авторами было исследовано влияние на пролиферацию фитогемаагглютинин стимулированных лимфоцитов АФП, выделенного из пяти различных гепатом и фетального белка. Было показано, что данные белки различаются по активности на три порядка, причем уровень активности не изменялся при обработке белков нейроминедазой (Yanchin and Lester, 1976), в то время как в случае АФП мышиного происхождения, данная активность была прямо связана с наличием сиаловых кислот (Zimmerman et al.,1977). Ьторгн76С другой стороны были обнаружены различия данной активности между препаратами АФП, выделенными из фетальной печени, гепатомы и сыворотки больных (Lester et al.,1977). И тоже время ряд авторов показал, что данная супрессорная активность человеческого АФП связана с наличием (либо отсутствием) ненасыщенных жирных кислот (Deutsch et al.,1980, Deutsch, 1983). Делипидизированный АФП не обладал супрессивной активностью, в то время как белок ренасыщенный жирными кислотами, проявлял супрессорные свойства (Goeken and Thompson, 1977).

1.3 Взаимодейтвие АФП с различными типами клеток.

Альфа-фетопротеин способен in vivo взаимодействовать не только с клетками иммунной системы, а так же с различными типами клеточных популяций, в частности с клетками нервной системы, эпителиальными и мезенхимными компонентами различных тканей. Основным условием для взаимодействия явлется степень дифференцировки тканей (Uriel et al.,1984; Villacampa et al.,1984a; Mollgard and Jacobsen,1984). Однако, по понятным причинам, исследования in vivo крайне затруднены, в связи с этим основная масса работ по взаимодействию АФП с различными типами клеток проводится in vitro, на постоянных клеточных линиях как опухолевых, так и нормализованных. Показано, что АФП взаимодействует с мышиной нейробластомой (Hajeri-Germond et al.,1985), рабдомиосаркомой крысы (Uriel et al.,1987). Для последней клеточной линии показано, что АФП транспортирует в клетки арахидоновую кислоту (Uriel et al., 1983b). Человеческая и мышиная линии саркомы молочной железы так же способны взаимодействовать с данным белком (Uriel et al., 1984a,b). Различные клеточные линии лимфоидной природы также способны взаимодествовать с АФП: мышиная Т-лимфома YAG-1 (Naval et al.,1985), различные варианты человеческих В и Т лимфобластоидных клеточных линий, а так же перитонеальные лимфоидные клетки больных лейкемией ( Laborda et al.,1987). Во всех выше перечисленных случаях транспорт белка в клетки осуществляется посредством рецептор-зависимого эндоцитоза (Villacampa et al.,1984b; Naval et al.,1985; Geuskens et al.,1986). АФП

так же может выступать в роли интегрального мембранного белка, как показано для человеческих гепатомных клеточных линий KN и PLC/PRF/5,a так же для нормализованной клеточной линии печени NuE (Hosokawa et al., 1989). Возможно, что оценка взаимодействия АФП с лейкозными клетками может быть использована в диагностике, классификации опухоли, выборе способа лечения и мониторинга терапевтического эффекта. Поскольку АФП взаимодействует с различными опухолевыми клетками, возможно его использование в качестве направленного переносчика различного рода антиопухолевых препаратов, в частности препаратов антрациклинового ряда, способных образовавать комплекс с ненасыщенными жирными кислотами. Такого рода исследование было проведено на клетках рака молочной железы человека MCF-7 (Deutsch et al.,1987). Аналогичные эксперименты были проведены так же на клетках карциномы молочной железы MDA-256, Т-лимфобластоме СЕМ и Molt-4 (Deutsch, 1991) и клетках гепатокарциномы (Semenkova et al., 1996). Эти данные позволяют предположить, что АФП в коплексе с различными цитотоксическими препаратами может оказаться мощным орудием в деле борьбы с онкогенными заболевания.

Как видно из выше изложенного, функция АФП в организме очень многостороння и зависит от множества факторов. Все это дало основание для следующих выводов, сделанных Нунецом (Nunez, 1994):

1) АФП регулирует содержание свободной формы многочисленных лигандов ( ПНЖК, эстрогены и другие), которые, в

свою очередь учавствуют в гормональной и энзиматической деятельности организма.

2) В зависимости от своего происхождения и связанных лигандов, АФП может принимать различные конформации, что может влиять на его специфическое связывание с рецепторами и, как следствие, на его биологические функции.

3) Исходя из сказанного в пунктах (1) и (2), функционирование АФП в организме может быть взаимосвязано с функционированием других сигналов, например факторов роста. Совместная деятельность лигандов АФП и факторов роста может "направлять" клетку в сторону пролиферации и дифференцировки.

1.4 Структура и физико-химические свойства.

Нуклеотидная последовательность гена АФП была определена Моринагой (Morinaga et al., 1983).) Из выведенной на основании сиквенса ДНК белковой последовательности и аминокислотного анализа было установлено, что данный белок состоит из 590 аминокислотных остатков (Law and Dugaiczyk, 1981; Gorin et al., 1981. Gibbs et al., 1987). (Рис 1)

Double

Fig. J. The amino acid sequence of human AFP arranged as proposed for serum albumin (Brown, 1976). Amino acid residues liomolgous to mouse AFP and human albumin are indicated by blackened portions of the amino acid circle above or below, respectively. Residues 62-65 missing in mouse AFP are starred. Arrows indicate potential glycosy- | lation sites for the human (H), mouse (M), and rat (R) proteins (Morinaga el al., 1983). |

" - I

' 1

АФП принадлежит к семейству альбумино-подобных белков, в которое кроме него входят также сывороточный альбумин и витамин D-связывающий белок. Все эти белки имеют высокую степень гомологии, близкие молекуярные массы и изоэлектрические точки (Не & Carter, 1992). Гены данных белков расположены кластером на четвертой хромосоме человека (Deutsch, 1991). Для сывороточного альбумина сделан рентгеноструктурный анализ с разрешением 2.8 А (Не & Carter, 1992). Для АФП пространсвенная структура не

определена. Компьтерный анализ аминокислотных

последовательностей АФП и CA выявил, что гомология между данными белками достигает 40 процентов, а некоторые сегменты имеет гомологию до 80 процентов (Deutsch, 1991). Обычно по аналогии с CA предполагают, что АФП состоит из трех доменов. Компьютерные расчеты, проведенные для CA и АФП, по программе ALB (Finkelstein, 1983) показали, что данные белки имеют в своем составе 50 процентов и 41 процент альфа-спирали, соответственно. Как альфа-фетопротеин, так и сывороточный альбумин сильно перешиты S-S связями ( 15 в АФП и 17 в CA). Гомология между фетопротеином витамин D-связывающим белков значительно меньше и составляет 20 процентов. Так же следует отметить, что в отличие от CA, АФП является гликопротеином.

АФП обладает ярко выраженной микрогетерогенностью, как по составу своего углеводного "хвоста", так и по составу переносимых лигандов. По всей видимости, этими фактами определяется разброс в молекулярной массе белка при различных методах ее определения - от 69 до 74 кДА (молекулярная масса, расчитаная на основание сиквенса, составляет 67 кДА), а изоточка от 4.5 до 5.2.

Человеческий АФП, выделенный различными способами и из различных источников, обладает значительной

микрогетерогенностью, выявляемой либо нативным электрофорезом, либо изофокусировкой, в го время как при форезе в денатурирующих условиях присутствуют одна либо две полосы (Ruoslahti and Seppala, 1971; Younget al.,1976; Auer and Kress,1977; Baiig, 1980). По предположению ряда авторов гетерогенность белка связана с различной степенью гликозилирования (Purves et al.,1970с;

Alpert et al., 1972; Yachnin et al.,1977;Parmelee et al.,1978; Gold et al.,1978; Lester et al.,1977,1978a,b; Young and Webb,1978; Balig,1980). Так Янг и Вебб (Young and Webb, 1978) показали наличие семи изоформ белка при выделении методом хроматофокусирования из амниотической жидкости. При изофокусировке белка, выделенного из пуповинной сыворотки в значениях рН от 4.5 до 5.2, изпользуя поликлональные и моноклональные антитела было обнаружено 9 изоформ (Sittenfeld and Moreno, 1988). При выделении белка из различных гепатом авторами была обнаружена еще большая гетерогенность, нежели при выделении АФП из нормальных тканей и жидкостей (Purves et al.,1970b; Lester et al.,1977,1978a). Обработка препаратов белка, выделенного из различных источников (нормальных и опухолевых), нейроминидазой приводила к противоречивым результатам. Так, по данным Лестера (Lester et al., 1978а), такая процедура приводила к изменению гетерогенности у АФП из гепатом и переходу белка из нормальных источников в единую форму, в го же время, по данным Алперта, не все изоформы, выделенные из нормальных источников после обработки переходят в одну, а все изоформы АФП из гепатомы преходят в электрофоретически гомогенный препарат с изоточкой 5.2 (Alpert et al.,1972). Гетерогенность АФП способна изменятся не только при обработке белка нейроминидазой, но так же и при длительном хранении, как показанов в работе Хираи (Hirai et al.,1973b). Таким образом, можно предположить, что гетерогенность связано не только со степенью и качеством гликозилирования, но и с наличием или отсутствием лигандов. Действительно, рядом авторов было показано, что гетерогенность АФП зависит так же и от наличия или отсутствия жирных кислот, как лигандов. В работе Пармеле

показано, что делипидизалия АФГ1 приводит к изменению его изоточки, а процесс ренасыщения жирными кислотами приводит к переходу белка в одну изоформу (Parmelee et al.,1978). Аналогичное явление отмечено и для крысиного АФГ1, для которого гетерогенность частично исчезала при делипидизации белка (Kerckaert etal.,1975, 1979b; Nunez et al.,1976a; Bayard and Kerckaert,1977; McMahon et al.,1977; Nagai et al.,1982). Возможность связи гетерогенности АФП с первичной структурой мало вероятна, посколько в работе по построению пептидых карт АФП из нормального источника и гепатомы путем трипсинолиза денатурированного белка было показано, что картина элетрофореза продуктов гидролиза идентична для обоих белков (Ruoslahti and Seppala, 1971). Эти данные подтвердились при анализе первичной структуры кДНК, мРНК и выведенной на их основании аминокислотной последовательности АФР из карциномы (Morinaga et al.,1983) и нормальной печени (Gibbs et al.,1987), а так же сравнением N-концевого сиквенса белка из различных источников (таблица 3). Таким образом вопрос, что является основным фактором, определяющим гетерогенность АФП остается до конца не выясненным. На основании анализа первичной структуры к ДНК была предсказана вторичная структура белка (рис.1). Согласно этому рисунку АФП представляет собой трех доменный белок, аналогично сывороточному альбумину причем гомология в области отдельных доменов достигает 48%. (Morinaga et al.,1983).

1.5.Схемы выделения альфа-фетопротеина.

Основной проблемой, с которой приходится сталкиватся при выделении высоко гомогенного препарата АФП, является очистка от сывороточного альбумина. Данный белок присутствует в сыворотке в высоких концентрациях ( до 40мг/мл) и обладает рядом свойств, сходных с АФП: молекулярная масса, близкие изоточки и т.д. В настоящий момент существует несколько различных схем выделения АФП. Наиболее распостраненным является иммунно-аффинный метод выделения АФП, с использованием специфических высоко аффинных поликлональных антител (Nishi,1970; Adinofl etal.,1971; Ruoslahti and Seppala,1971; Hirai et al.,1973; Kapadia et al.,1979). Этот метод используется, в основном, при выделении из материала с высоким содержанием АФП: фетальной и пуповинной сывороток, амниотической жидкости второго триместра беремености, сыворотки или асцидной жидкости больных гепатомой или тератокарциномой. При этом антисыворотка предварительно обработывается сывороткой, полученной от взрослого организма ( для освобождения от антител к примесным белкам), после чего смешивается с исходным материалом для образования преципитата. Преципитат растворяется буфером с низким значением рН. АФП и свободные антитела разделяются при помощи гель-фильтрации. Так же используются антитела, пришитые к различным матриксам (агароза, сефадекс или сефароза). В этом случае АФП элюируют так же низким значением рН или высокими концентрациями хаотропных агентов (8М мочевиной). Менее распостраненным иммуно-аффинным методом является схема выделения с использованием моноклональных антител с низкой аффинностью (Ruoslahti, 1978) и антител к примесным белкам (Balig, 1980). Очевидно, что

использование низких значений pH и высоких концентраций хаотропных агентов для элюирования целевого продукта в случае использования положительных антител, несомненно может сказыватся на нативности белка. Так же к отрицательным чертам данной схемы является сильное взаимодействие между антителом и целевым белком (с константой связывания порядка 1С)"8), что приводит к существенной потере целевого продукта в процессе выделения. При использованиим низкоаффинных моноклональных антител и отрицательных антисывороток возникают проблемы, связанные с высокой стоимостью (моноклональные атитела) и низкой емкостью сорбентов в обоих случаях. Рядом, авторов были разработаны альтернативные схемы очистки АФП, такие как: использование иммобилизованного конканавалина А, с которым специфически способен связыватся АФП , очистка на матриксе с пришитым красителем "Cibacron F3GA" (так называемый Affi-Gel Blue (Laietal., 1978;Parmelee et al.,1978; Alpert et al.,1978; Goldetal.,1978;Bareta and Koj,1982;Huse et al.,1982)). Но при данном методе возникают аналогичные проблемы -низкая емкость и низкая степень очистки. Схема выделение АФП на аффинных колонках с пришитым к матриксу эстрадиолом (Anion et al.,1973; Uriel et al.,1975; Hassoux et al.,1977;Aussel and Masseyeff, 1984a; Terentev et al.,1988), применима в основном для выделения АФП из сыворотки грызунов и элюция проводится 50% гесаном. Применяются также такие подходы как, разделение АФП и альбумина с использованием двух-фазной системы (Birkenmeier et al.,1984). Аффинная хроматография на металл-хелатных сорбентах (Anderson et al.,1987), различные схемы выделения с использованием хроматографии высокого давления (Wong et al.,1985a,b; Wong and Hsia,1984; Wong

е1 а1.,1988). И самым основным из недостатков всех выше перечисленных схем выделения, является гетерогенность выделяемого белка.

Раздел II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2 Л.Материалы

В работе использовали следующие материалы и реактивы: акриламид, М,1Ч-бисакрилам ид, агароза, додецилсульфат натрия (ДДС-Na) фирмы "Bio-Rad", США; кумасси G-250, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), имминодиуксусная кислота, фирмы "Serva", Германия; трис, эпихлорогидрин, бычий сывороточный альбумин (5 фракция), набор белков-стандартов молекулярных весов для белкового электрофореза, "Sigma", США; сефароза 4В для синтеза аффинных сорбентов фирмы "Pharmacia", Швеция; трипсин, химотрипсин, термолизин, эластаза "Beringer Manheim", Германия; антитела против АФП, сывороточного альбумина, альфа-антитрипсина "Sigma", США. В экспериментах по разворачиванию белков использовались препараты мочевины и гуанидингидрохлорида с чистотой 99% Все остальные реактивы, использованные в работе, были отечественного производства марки х.ч. или о.с.ч. Для приготовления всех растворов и буферов использовали только деионизованную воду. Буфер PBS для выделения фетопротеина содержал 20 мМ калий (натрий) фосфата, 150 мМ хлористого натрия pH 7,5. Буфер для элюции белка с металл-хелатной колонки заряженной медью: PBS плюс 1.5М

хлористого натрия и 2.5М хлористого аммония. 5х трис-глициновый буфер для электрофореза белков по методу Лэммли (Laemmli,1970): 125 мМ трис (15 г/л), 1,8 М глицина (280 г/л), 0,5% ДДС-Na (5 г/л), рН 8,3. Буфер для рокетного иммунофореза в агарозе барбитуратный буфер рН 7.5.

Аффинные сорбенты для выделения фетопротеина.

Голубая сефараза 4В, металл-хелатириемая сефароза 4В, были синтезированы автором. Обратно-фазовая колонка С-3 производства "Beckman" США.

2.2. Методы исследования. 2.2.1. Синтез аффинных сорбентов.

Голубая сефароза была получена путем пришивки к матрице Sepharose 4В активированной эпихлорогидрином красителя Cibacron Blue F3GA по методу (Porath et al.,1975). Металл-хелатную Sepharose 4В, получали путем пришивки к эпоксиактивированной эпихлорогидрином сефарозе имминодиуксусной кислоты по Порату (Porath et al, 1978)с модификациями.

2.2.2. Очистка альфа-фетопротеина.

Пуповинную сыворотку центрифугировали на центрифуге JA21 (ротор JA-14) в течении 30 минут при 12000 об/мин. Супернатант фильтровали, используя мембранный фильтр с размером пор 0.45 микрон и наносили на колонку с голубой сефарозой, предварительно уравновешенную буфером PBS. Фракции, содержащие целевой продукт, который не связывался с сорбентом собирали и наносили на металл-хелатную сефарозу, заряженную иономи никеля. Альфа-фетопротеин, как и в случае с голубой сефарозой находился в проскоке. Затем фракции содержащие белок концентрировали на системе для концентрирования Minitan "Millipore"CIIlA и пропускали через металл-хелатную колонку, заряженную ионами меди. Целевой продукт элюировали линейным градиентом модифицированного буфера mPBS (20мМ фосфата 1.5М хлористого натрия) - mPBS, содержащим 5М хлористого аммония. Фракции, содержащие фетопротеин, высаливали сульфатом аммония (440г/л), растворяли в минимальном обьеме PBS, содержащем 1мМ триэтиламина и 0.1% трифторуксусной кислоты (ТФА) и наносили на обратно-фазную колонку С-3, предварительно уравновешенную буфером следующего состава 0.1% 1мМ триэтиламина, 0.1% ТФА. Элюцию проводили линейным градиентом данного буфера -ацетонитрил (0-100%). Фракции, содержащие целевой продукт

(время удерживания на колонке 52-60 минут) собирали, концетрировали на погружном фильтре СХ-30 "Millipore" США, и преводили в PBS буфер на колонке для обезсаливания PD-10, содержащей Сефадекс G-25 "Pharmacia" Швеция. В дальнейшем выделенный белок тестировали на чистоту от примесей рокетным иммуноэлектрофорезом, нативным и SDS- электрофорезом, иммуноферментным анализом и обратно-фазной хроматографией.

2.2.3. Электрофорез белков.

Элетрофорез проводили в градиентном 10%-20% полиакриламидном геле по методу Лэммли (Laemmli,1970).

2.2.4. Определение концентрации белков.

Концетрацию белка определяли по методу Седмарка (Sedmark and Grossberg,1977) (в качестве калибровочного белка использовали сыворточный альбумин), либо спектрофотометрически с помощью высокочувствительного спектрофотометра Hitachi24. Для рассчета концентрации АФП использовался коэфициент экстинциии 8280=0.365 о. е./(см мг/мл), а для С A s280 =0.533.

2.2.5.0бработка модифицированного сахарозой АФП инвертазой.

Обработка инвертазой проводилась 50 удельными единицами фермента в 50 тМ натрий-ацетатном буфере, содержащем 150 тМ №С1 рН 6.5 при 37 С в течении одного часа. Концентрация АФП составляла 5 мг/мл.

2.2.6. Удаление гидрофобных лигандов.

К раствору белка (0.15 М №С5, 20 мМ Ыа-Р, рН 6.5) добавляли активированный уголь (весовое соотношение уголь : белок составляло 5:1) или гексан (объемное соотношенгие 1:1) и инкубировали в течении 12 часов. При обработке гидроксиламином, белки инкубировали в течении двух часов в 1М гидроксиламине, рН 7.4 на ледянной бане. Затем центрифугировали, отделяли водную фракцию, фильтровали и пропускали через гель-фильтрационную колонку РБ-Ю, уравновешенную РВ8-буфером. Профиль газовой хромотографии а-фетопротеина, полученного путем такой обработки содержал только пик, соответствующий белку. С помощью газовой хромотографии было показано, что выделенный препарат а-фетопротеина содержит по крайней мере один мажорный природный лиганд этого белка - арахидоновую кислоту. .

Концентрация денатурантов тестировалась рефрактометрически, по коэффициенту преломления на длине волны 589 нм.

2.2.7. Калориметрические измерения Калориметрические исследования осуществлялись на прецизионном сканирующем микрокалориметре DASM-5 (НПО "Биоприбор", Пущино, Россия) с объемом ячейки 1 мл. Сканирование производилось со скоростью 1 °К/мин при избыточном давлении 3.6 атмосферы. Парциальную теплоемкость белка определяли стандартным способом [Privalov & Potekhin, 1986]. Концентрация белка варьировала от 0.7 до 2.0 мг/мл. Точность измерения температуры составляет ±0.3°С.

2.2.8. Исследования флуоресценции

Спектры флуоресценции получали на спектрофлуориметре SPF-1000cs (Aminco, США). Использовались растворы с концентрацией белка 0.01 мг/мл. Для возбуждения триптофановой флуоресценции была выбрана длина волны 286 нм, для возбуждения флуоресценции гидрофобного зонда АНС - 360 нм. Гидрофобный зонд АНС - 8-анилино-1-нафталин-сульфонат - (чистота 95%, "Sigma", США) добавлялся в раствор белка в соотношении 10:1.

2.2.9. Спектры кругового дихроизма

Спектры кругового дихроизма получали на спектрполяриметре ^эко-бОО (Япония). Концентрация белка составляла 0.8 мг/мл.

Ниже приведено подробное описание этих методов.

3. Основные физико-химические методы.

3.1 .Круговой дихроизм.

Метод кругового дихроизма (КД) основан на взаимодействии света с оптически активными средами. Оптической активностью называют способность среды поворачивать плоскость поляризации проходящего через нее света. Оптическая активность может быть обусловлена, например, асимметрией молекул и присуща, в той или иной степени, практически всем молекулам, синтезируемым живыми организмами. В методе КД используется тот факт, что оптически активная среда по разному поглощает право- и лево-поляризованный свет, и эта разница зависит от длины волны света. Плоско поляризованный свет, пройдя через оптически активную среду, превращается в эллиптически поляризованный свет. Арктангенс отношения малой и большой оси эллипса обычно рассматривают как один из параметров активности среды. Этот параметр называют эллиптичностью (0) [Кантор и Шиммел]. Именно этот параметр, приведенный к концентрации белка в растворе, используют как

характеристику содержания упорядоченной структуры в белке. В белках существует два типа оптически активных хромофоров -ароматические боковые группы аминокислотных остатков и пептидные связи. Как следствие, при исследовании белковых молекул методом КД обычно рассматривают две области длин волн. Спектры КД в ближней ультрафиолетовой (УФ) области, или ароматической области, (250 - 350 нм) отражают симметричность окружения ароматических боковых групп и характеризуют третичную структуру белковых молекул. Спектры КД в дальней УФ-области, или пептидной области, (180 - 250 нм) отражают симметричность окружения пептидиых связей и, следовательно, указывают на содержание вторичной структуры в белках. Однако существует вероятность того, что при некоторых условиях ароматические боковые группы могут оказывать заметное влияние на спектры КД в дальней УФ-области, что, конечно, затрудняет интерпретацию экспериментальных данных. Для того, чтобы избежать неоднозначности результатов, был разработан метод, позволяющий определять вклад ароматических аминокслотных остатков в спектры КД белков в дальней УФ-области [Болотина и Лагаускас, 1985]. Сейчас метод КД широко используется и является

одним из основных методов по определению изменений в структуре белковых молекул.

3.2. Сканирующая микрокалориметрия.

Метод сканирующей микрокалориметрии основан на явлении избыточного поглощения тепла при разрушении уникальной третичной структуры белковой молекулы в процессе нагревания раствора белка. Это уникальный метод для прямого определения термодинамических характеристик денатурационных переходов в белках, таких как удельная парциальная теплоемкость белка (при любой температуре, доступной в калориметре); скачок теплоемкости, связанный с денатурацией белка; температура денатурации; теплота денатурационного процесса и температурная зависимость энтальпии денатурации. Калориметрическая энтальпия процесса (ЛНкал) рассчитывается как площадь под кривой зависимости молярной удельной теплоемкости от температуры. Кроме того, если предположить, что процесс денатурации происходит по принципу "все или ничего", можно рассчитать эффективную энтальпию (или энтальпию Вант Гофа) - ДНэфф [см. Рпуа1оу,1974; Рпуа1оу, 1979]. В том случае, когда рассматриваемый процесс действительно описывается моделью двух состояний (т.е. является внутримолекулярным аналогом фазового перехода первого

рода), калориметрическая энтальпия и энтальпия Вант Гоффа совпадают. Таким образом, соотношение ДНкал /ДНэфф является тестом на то, проходит ли процесс денатурации белка по принципу "все или ничего". Для большого количества небольших глобулярных белков показано, что это действительно так [Рпуа1оу, 1979]. Белковые молекулы с молекулярным весом более 30 кДа состоят, как правило, из нескольких квази-независимых структурных доменов, которые плавятся неодновременно. Поэтому процесс разрушения третичной структуры таких белковых молекул не может описываться моделью двух состояний, что и было показано для большого количества белков, в частности, для сывороточного альбумина. Процесс плавления сывороточного альбумина будет более подробно рассмотрен в разделе "Результаты и Обсуждение", где будет проводиться сравнение свойств сывороточного альбумина и а-фетопротеина.

Следует также отметить, что все уравнения термодинамики применимы только для обратимых процессов. Поэтому применение их для изучения процессов, происходящих в белках, стало возможно только после того как Анфинсен [АлГтБеп е! а1., 1961] показал возможность ренатурации белковых молекул. Процесс денатурации а-фетопротеина, как будет показано дальше, в наших условиях

имеет необратимый характер. Формально расчет энтальпии Вант Гоффа для необратимых процессов не имеет смысла, однако в тех случаях, когда кривая повторного плавления белковой молекулы не имеет каких-либо выраженных несоответствий, вызванных, например, аггрегацией белковых молекул, такие расчеты все же проводят. Это было сделано и в нашей работе. Хочется отметить, что правомерность вывода, сделанного нами на основании расчета энтальпии Вант Гоффа, была косвенно подтверждена другими методами.

3.3. Флуоресцентная спектроскопия.

Метод флуоресцентной спектроскопии основан на способности ряда молекул излучать свет при облучении их светом определенной длины волны. При этом свет, излучаемый молекулой (флуоресценция), имеет длину волны большую, чем у падающего на молекулу света. В таком большом полимере, как молекула белка, может существовать целый ряд хромофоров, способных излучать флуоресцентный свет. Хромофор может находиться в возбужденном состоянии 10"9-10~8 секунд. За это время в молекуле могут произойти различные изменения - протонирование, депротонирование, локальные конформационные изменения, релаксация окружающих

молекул растворителя и т.д. Все эти изменения могут влиять как на квантовый выход, так и на длину волны флуоресценции. Таким образом, флуоресцентная спектроскопия является

высокочувствительным методом, позволяющим получать данные об окружении хромофоров в молекулах.

В белках существует три типа собственных флуоресцирующих хромофоров - это ароматические аминокислотные остатки триптофан, тирозин и фенилаланин, каждый из которых имеет собственные длины волн поглощения и испускания. На практике имеет смысл говорить не о длинах волн, а о спектрах флуоресценции (спектр испускания флуоресценции и спектр возбуждения флуоресценции), то есть о зависимости интенсивности флуоресценции от длины волны. В белковых молекулах, содержащих триптофан, обычно наблюдают за триптофановой флуоресценцией, имеющей наибольший квантовый выход. Флуоресценция тирозина в свободном состоянии может иметь квантовый выход, сравнимый с флуоресценцией триптофана, однако в белках флуоресценция тирозина обычно сильно тушится из-за его ионизации или расположенных рядом аминогруппы или карбоксильной группы.

Спектр флуоресценции свободного триптофана имеет максимум излучения в воде при 352 нм. Триптофан, полностью или частично экранированный от растворителя в молекуле белка, имеет так называемый "синий сдвиг" спектра флуоресценции. Максимум интенсивности флуоресценции в нативном глобулярном белке может приходиться на 325-350 нм, что отражает воздействие окружения на триптофановый остаток. В данной работе мы использовали именно это свойство триптофановой флуоресценции. При разворачивании белковой молекулы увеличивается доступность триптофанового остатка для растворителя. Это приводит к характерному "красному сдвигу" триптофановой флуоресценции, который позволяет следить за процессом разворачивания.

Помимо собственных хромофоров в белке молено следить также за флуоресценцией внесенных хромофоров. Внесенные хромофоры могут быть пришиты к молекуле белка ковалентно (метки) или удерживаться какими-либо другими силами (зонды). В нашей работе мы использовали гидрофобный флуоресцирующий зонд АНС. АНС - 8-анилино-1-нафталин-сульфанат - молекула с молекулярным весом около 300 Да, имеющая высокое сродство к гидрофобным поверхностям. Квантовый выход флуоресценции этого зонда в воде очень низкий, однако он резко возрастает при

уменьшении полярности окружающей среды (с 0.04 до 0.98). При этом наблюдается сдвиг спектра флуоресценции в коротковолновую область [81гуег, 1965].

Большинство гидрофобных боковых групп в нативном белке экранированы от окружающей среды. Исключение составляют функциональные гидрофобные кластеры на поверхности белковых молекул. Вследствие этого гидрофобный зонд АНС практически не взаимодействует с большинством нативных белков. Однако при переходе белка в состояние расплавленной глобулы доступность гидрофобных кластеров растворителю, а следовательно и АНС, сильно увеличивается. Как следствие, сродство АНС к белку в состоянии расплавленной глобулы заметно выше по сравнению с нативным белком, а интенсивность флуоресценции АНС заметно больше, когда в растворе находится белок в состоянии расплавленной глобулы. Было также показано, что АНС слабо связывается с клубкообразными полипептидными цепями [81гуег,1965; БениБОйюу е! а1.,1991]. Все вышеописанные свойства гидрофобного зонда АНС говорят о том, что его можно использовать как тест на расплавленную глобулу в белках.

При исследований структурных изменений, происходящих в белке, методом флуоресцентной спектроскопии удобно представлять

полученные данные в виде денатурационной кривой. Денатурационная кривая в общем случае - это кривая зависимости какого-либо параметра, характеризующего структуру белковой молекулы от параметра, характеризующего внешнее воздействие на молекулу. В предлагаемой работе денатурационные кривые, представляющие собой зависимость изменения положения максимума флуоресценции (определяемого по отношению интенсивности флуоресценции на фиксированных длинах волн справа и слева от пика) от внешнего воздействия, представлены в нормированном виде. То есть, кривая представляет собой зависимость доли развернутого состояния от параметра внешнего воздействия. Доля развернутого состояния (ГР) определялась из соотношения: Гр = (Ун - У)/(УН -Ур),

где У - значение исследуемого параметра, а У„ - значение этого параметра для нативного состояния. Ур - значение этого параметра для развернутого состояния

3.4 .Определение степени кооперативности переходов.

Косвенным доказательством того, что переход между двумя состояниями является фазовым переходом первого рода, является форма и крутизна перехода. В идеальном случае фазовый переход

первого рода в термодинамической системе происходит при одном определенном значении параметра внешнего воздействия. В таком случае кривая фазового процесса (в нашем случае кривая денатурации) выглядела бы как крутая ступенька. Однако в микроскопических системах, таких как молекула белка, реально такой переход никогда не наблюдается. Конформационный переход происходит в некотором интервале изменений параметра внешнего воздействия (в нашем случае это будет концентрация денатурирующего агента), и говорят о точке полуперехода -концентрации денатурирующего агента, при которой половина молекул белка денатурирована. Параметр, определяющий кооперативность такого прехода в белковых молекулах, был предложен в работе Птицына и Уверского [Ptitsyn & Uversky, 1994] и основан на работах Хилла по термодинамике малых систем [Hill, 1968]. В качестве такого параметра избран параметр Дуэфф, который представляет собой число молекул денатуранта, которое должно присоединиться к молекуле белка, чтобы она перешла из начального состояния в конечное (расчет.проводится для точки полуперехода). Определение параметра Av31^ описано в работе [Ptitsyn & Uversky, 1994]. В этой же работе было показано, что для однодоменных белков (молекулярный вес до 30 кДа) параметр кооперативности

прямо пропорционален молекулярному весу белка. Однако параметр кооперативности для белков одного молекулярного веса будет зависеть также от того, какой именно переход рассматривается: в белковой молекуле возможны три конформационных перехода, проходящие по принципу "все или ничего", а именно: переход из нативного состояния в развернутое (Н i—> Р), из нативного состояния в расплавленную глобулу (Н ь-> РГ) и из расплавленной глобулы в развернутое состояние (РГ ь-> Р). В зависимости от типа перехода предложены три уравнения, связывающие величину Дуэфф с молекулярным весом белка:

Нн*Р: Дуэфф = 0.63 М+1.59 Н ь> РГ: Дуэфф = 0.35 М + 0.19 РГ ь» Р: Дуэфф = 0.36 М + 1.05, где М - молекулярный вес молекулы белка. Сравнивая параметр кооперативности конкретного наблюдаемого в эксперименте структурного перехода в белке с данными уравнениями можно предположить, какой тип перехода фиксируется в данном эксперименте.

"""«ВЛЙО'ГЙК,

Раздел III. Результаты и обсуждение Глава 1. Схема очистки высоко гомогенного АФП.

Несмотря на то, что на данный момент описаны различные схемы выделения АФП, нами была предпринята попытка разработать свою схему выделения данного белка. Дело в том, что все известные схемы имеют ряд недостатков, в частности при использовании иммуноаффинных сорбентов (как позитивных так и негативных) возникает ряд проблем, в первую очередь связанных с малой емкостью данных сорбентов, и низким выходом целевого продукта при использовании антител с низкой аффиностью, в то время как использование антител с высокой аффиностью вынуждает использовать в качестве элюанта хаотропные агенты (мочевина, гуанидин гидрохлорид ) высокой концентрации (до 8М), что существенно сказывается на нативности белка. При использованиии традиционных методов очистки ионно-(обменная хроматография, гельфильтрация, гидрофобная хроматография ) возникают проблемы, связанные с многократной заменой буфферных растворов, что приводит к значительному разбавления продукта. К тому же выход целевого продукта небольшой. Использование аффинной хроматографии на СопА Сефарозе применимо только для выделения АФП из сыворотки на строго определенных стадиях развития плода.

В связи с выше изложенным, предлагаемая нами схема очистки имеет ряд преимуществ, а именно: на первых двух стадиях (хроматография на голубой сефарозе, и маталл-хелатной колонке заряженной никелем) целевой продукт сходит с колонок

в свободном объеме, в то время как большинство примесных белков оказываются прочно связанными. На этих стадиях колоночной хроматографии удается избавится приблизительно от 60-65% примесных белков ( в частности, что особенно важно от 30-40-% сывороточного альбумина) (рис.2,3).

После пропускания через металл-хелатный сорбент, заряженный медью происходит очистка АФП до 80% и его концентрирование (Рис.4). На последней стадии (обращенно-фазовая хроматография) происходит очистка целевого продукта до гомогенного состояния (чистота>98%) (рис.5). На рисунке 6 представлены результаты хроматографического анализа на обращенно-фазовой колонке очищенного препарата АФП, комерческого препарата СА и смеси АФП/СА. Как можно видеть из рисунка, нам удалось полность разделить СА и АФП. Следует отметить, что несмотря на довольно жесткие условия на последней стадии (низкое значение рН и присутствие органического растворителя), выделенный белок был нативен т.е. имел стабильную третичную структуры и содержал в своем составе лиганды (ПНЖЛ.). Наличие лигандов, в частности арахидоновой кислоты проверяли методом газовой хроматографии по Пармели (Рагте1ее а1.Д 978), анализ любезно проведен А.В. Ариповским (ВНИИ ПМ). В таблице 4 приведены суммарные данные по степени очистки и выходу целевого продукта по стадийно в процессе выделения АФП.

Таблица 4.

Препарат Объем Содержание, мг/мл Степень чистоты, %

Суммарного белка АФП

Пуповинная 4,8 л 50,0 0,05 0,10

сыворотка

Проскок 1 6,0 л 12,5 0,04 0,32

1роскок 2 7,2 л 8,0 0,032 0,40

Элюат с 150 мл 3,0 1,45 48,3

Си2+

Элюат с С-3 60 мл 3,57 3,5 >98,0

0,8 0,7

| 0,6

0 со

™ 0,5

го

X ф

1 0,4 ф

ё 0,3

о

с

0,2 0,1 0,0

0

10 20 30 40 50 Номера фракций

60

Рисунок 2. Профиль элюции АФП с колонки Голубой Сефарозы (24x32 см). Элюцию проводили РВ8-буфером рН 7.2. Обьем одной фракции составлял 30 мл. Цифрой 1 и стрелками отмечены границы фракций, содержащих целевой продукт. Вертикальной стрелкой и цифрой 2 отмечен момент добавления 1М хлорида натрия, для элюции баластных белков и регенерации колонки.

0,20

* 0,15

0 00 см

05 X

ф

1 0,10

ш 3"

о с;

о

0,05

0,00

0 10 20 30 40 50 60 70

Номера фракций

Рисунок 3. Профиль элюции ос-фетопротеина с металл-хелатной колонки, заряженной никелем (14x16см). Промывку проводили РВБ-буфером рН 7.2. Обьем каждой фракции составлял 200мл. Цифрой 1 и стрелками указаны границы фракций содержащих АФП. Вертикальной стрелкой указан момент начала элюции ЮОмМ ЭДТА. Для элюции баластных белков.

0,5

0,4

о

сЗ 0,3

& 0,2

0,1

0,0

0

20 40 60 80 Номера фракций

100

2,0

1,5

- 1,0

0,5

0,0

120

Рисунок 4. Профиль элюции с металл-хелатной колонки, заряженной медью (6x40 см). Элюцию проводили линейным градиентом хлористого аммония ( 0-2.5 М) на РВС-буфере со скоростью протока 2,5 мл/мин. Обьем каждой фракции составлял 5 мл. АФП присутсвовал в 30 фракциях с 70 по 100.

Время удерживания на колонке (мин.)

Рисунок 5. Хроматограмма очистки АФП на обращенно-фазовой колонке С-3. Элюцию белков проводили линейным градиентом ацетонитрила (0-55%) в воде содержащей 1мМ триэтиламина и 0.1% трифторуксусной кислоты, рН 2.0. Цифрой 1 обозначен пик С А, цифрой 2 пик АФП.

Рисунок 6. Проверка чистоты выделенного препарата АФП хроматографией на обращенно-фазовой колонке. 1-препарат АФП. 2. Комерческий препарат СА. 3. Смесь АФП/ СА в отношении 1:2.

Естественно, чтобы быть полностью уверенным в адекватности препарата белка при выделении по разработанной схемы было проведено сравнение физико-химических характеристик "нашего" белка и белков, выделенных наиболее распространенными способами: иммунно-аффинной хроматографией и гидрофобной хроматографией. Препараты белков любезно предоставлены

Г.И.Абелевым Институт карциногенеза РАМН и Ф.В. Бровко ФиБХ РАН соответственно. Результаты этих эспериментов представлены далее (см.Главу 3.).

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Томашевский, Андрей Юрьевич

ВЫВОДЫ

1. Разработана крупномасштабная схема высокоэффективной очистки а-фетопротеина человека из пуповинной сыворотки. По сравнению с традиционными подходами, данная схема позволяет на порядок повысить выход целевого продукта и дает моноизоформный препарат АФП.

2. Установлено, что молекула АФП сохраняет жесткую третичную структуру в широком диапазоне экспериментальных условий: по температуре - от 0 до 70°С (при нейтральных значениях рН); по изменению рН среды - от рН 4.0 до 10.4; по концентрации мочевины - до 7 М; по концентрации гуанидин-гидрохлорида - до 2.5 М. Показано также, что как денатурация, так и разворачивание данного белка являются необратимыми процессами.

3. Проведено сравнительное исследование структурных свойств АФП, выделенного различными методами из разных источников. Показано, что препарат, полученный по разработанной в диссертационной работе схеме выделения, по своим структурным свойствам практически полностью идентичен белкам, выделенным по традиционным схемам.

4. Проведено сравнительное исследование структурных свойств и конформационной стабильности гомологичных белков АФП и СА. Показано, что данные белки существенно отличаются друг от друга по физико-химическим свойствам. Установлено,- что в отличие от АФП, процесс разворачивания СА мочевиной и его тепловая денатурация являются полностью обратимыми. Выдвинуто предположение, что такое отличие может определяться разным характером взаимодействия данных белков с природными лигандами. 5. Показано, что АФП способен специфически связывать сахарозу. При этом белковая молекула претерпевает существенные структурные изменения и превращается из однодоменного образования в двухдоменное.

Приношу свою глубокую благодарность моему научному руководителю и соавтору Владимиру Николаевичу Уверскому, без энергии и настойчивости которого данная работа не смогла бы состояться.

Моим коллегам и соавторам Наташе Нарижневой, Татьяне Мельник, Марине Киркидазе, Татьяне Ивановой за соместные усилия по проведения данной работы.

Александру Ариповскому за проведения анализа лигандов.

Гари Израевичу Абелеву за предоставление препарата АФП и обсуждение полученных результатов.

Всем сотрудникам отдела молекулярной биологии за ИБФМ РАН я моральную поддержку.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Приведенные выше данные можно суммировать следующим образом. Молекула а-фетопротеина, содержащая природные лиганды, обладает уникальной третичной структурой. При нейтральных значениях рН раствора она достаточно устойчива по отношению к воздействию сильных денатурантов - как показывают данные триптофановой флуоресценции, вплоть до 7 М мочевины и 2 М ОиНС1 ее структура не претерпевает никаких заметных изменений. Однако, важно отметить тот факт, что индуцированное сильными денатурантами разворачивание белка является необратимым процессом и при переходе в нативные условия полная ренатурация развернутой молекулы а-фетопротеина не происходит. При нагревании до 70 С наблюдается кооперативное разрушение уникальной третичной структуры молекулы а-фетопротеина, что отражается в избыточном поглощении тепла при этой температуре, фиксируемом методом микрокалориметрии. Процесс теплового разрушения жесткой третичной структуры а-фетопротеина также носит необратимый характер. Вторичная структура этого белка при нагревании также частично разрушается, однако полностью восстанавливается при охлаждении. Повышение рН раствора приводит ¡с некоторой дестабилизации молекулы а-фетопротеина, что отражается в понижении ее устойчивости по отношению к сильным денатурантам. Однако никаких кардинальных изменений структуры белка при этом, по-видимому, не происходит. Напротив, понижение рН раствора приводит к денатурации молекулы ос-фетопротеина. При рН раствора 3.1 молекула этого белка находится в состоянии расплавленной глобулы. (Отсутствие у молекулы ос-фетопротеина уникальной третичной структуры в этих условиях было показано при помощи метода микрокалориметрии, нативоподобное содержание вторичной структуры - при помощи метода КД в пептидной области. Компактность этого денатурированного состояния демонстрируется данными вискозиметрии и триптофановой флуоресценции. Кроме того, при рН 3.1 молекула а-фетопротеина обладает заметно большим сродством к гидрофобному зонду АНС по сравнению с нативной молекулой.) а-фетопротеин человека обладает высоким сродством к сахарозе). Связывание с сахарозой приводит к заметным изменениям структурных характеристик молекулы а-фетопротеина. Действительно, если как тепловая денатурация, так и разворачивание мочевиной свежевыделенного белка происходят в одну стадию, то для белка, подвергшегося предварительно лиофильному высушиванию из 0.2% сахарозы, эти процессы носят двухстадийный характер. Обработка такого препарата а-фетопротеина инвертазой - ферментом, расщепляющим сахарозу на моносахариды, приводит к существенному изменению, но не восстановлению структурных характеристик белка. Воздействие сахарозы на молекулу а-фетопротеина не удаляется в течении 8-дневного диализа против буфера без сахарозы.

Поведение а-фетопротеина в ответ на его разворачивание мочевиной и нагревание отличается от поведения его гомолога - сывороточного альбумина.

Денатурация а-фетопротеина, как уже было сказано выше, - в наших условиях in vitro носит необратимый характер, в то время как для сывороточного альбумина этот процесс полностью обратим. Можно предположить, что необратимость денатурации а-фетопротеина связана с необратимостью выхода из него лигандов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Томашевский, Андрей Юрьевич, 0 год

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. "Белки и Пептиды" под редакцией Иванова В.Т. и Липкина В.М. (Москва, "Наука", 1995).

2. Болотина, И.А. и Лугаускас, В.Ю. Определение Вторичной Структуры Белков из Спектров Кругового Дихроизма. IV. Учет Вклада Ароматических Аминокислотных Остатаков в Спектры Кругового Дихроизма Белков в Пептидной Области. Молекулярная Биология (1985) 19, вып.5, 1409-1421.

3. Бычкова, В.Е. и Птицын, О.Б. Состояние Расплавленной Глобулы Белковых Молекул Становится Скорее Правилом, Чем Исключением. Биофизика (1993) 38 N1, 58-65.

4. Волькенштейн, М.В. "Биофизика" (Москва, "Наука", 1988).

5. Дюйсекина, А.Е., Бычкова, В.В., Фантуцци, А., Росси, Дж.-Л., Птицын, О.Б. Освобождение гидрофобного лиганда из ретинол-связывающего белка в условиях, моделирующих поле мембраны. Молекулярная Биология (1997)

6. Кантор, Ч. и Шиммел, П. "Биофизическая Химия" т.2. (Москва, "Мир", 1984).

7. Ландау, Л.Д., Лифшиц, Е.М. "Теоретическая физика. Электродинамика постоянных сред",т.8, (Наука, Москва, 1982), с.60.

8. Овчинников, Ю.А. "Биоорганическая Химия" (Москва, "Просвещение", 1987).

9. Пермяков, Е.А., Калиниченко, Л.П., Морозова, Л.А., Ярмоленко, В.В. и Бурштейн, ЭА. Исследование связывания ионов Mg а-лактоалъбумином мепюдол / флуоресцентной спектроскопии. Биофизика (1982) 27 N4, 578-582.

Ю.Птицын, О.Б. Стадийный Механизм Сворачивния белковых Молекул ДАН СССР (1973) 210 N5, 1213-1215.

11.Семисотнов, Г. В. Исследование равновесных и кинетических промежуточных состояний на пути самооргаииза1{ии глобулярных белков. Реферат диссертационной работы д. ф.-м. н., Пущино, 1994.

12.Тиктопуло, Е.И., Привалов, ПЛ., Борисенко, С.Н., Троицкий, Г.В. Микрокалориметрическое Исследование Доменной Организации Сывороточного Альбумина. Молекулярная Биология (1985) 19, 1072-1078.

13.Уверский, В.Н. Разворачивание "Расплавленной Глобулы" как фазовый переход первого рода. Диссерт. работа к. ф.-м. н.б, Пущино, 1991.

14.Уверский, В.Н. Разнообразие денатурированных форм глобулярных белков: I. Индуцированное анионами сворачивание

стафилококковой нуклеазы. Молекулярная Биология (1998), в печати.

15.Уверский, В.Н. Разнообразие денатурированных форм глобулярных белков: 11. Структурные характеристики А-форм. Молекулярная Биология (! 998), в печати.

16.Уверский, В.Н. и Птицын, О.Б. Трехстадийное Равновесное Развораччивание Небольших Глобулярных Белков Сильными Денатурантами. I .Карбон гидраза В. Молек, Биол. (1996а) 30 N5, 1124-1134.

17.Уверский, В.Н. и Птицын, О.Б. Трехстадийное Равновесное Развораччивание Небольших Глобулярных Белков Сильными Денатурантами. 2./3-Лактамаза и Общая Модель. Молек, Биол. (1996-) 30 N5, 1135-1143 .

18.Abelev, G.I. Adv. Cancer Res. (1971) 14, 295-358.

19.Abramsky, O., Brenner, Т., Mizrachi, R. & Soffer, D. J. Neuroimmunol. (1982) 2, 1-7.

20.Alexis, M.N. & Gratzen, W.B. Interection of Skeletal Myosyn Light Chains with Calcium Ions. Biochemistry (1978) 17, 2319-2325.

21.Anfinsen,C.B. Haber, E., Sela, M. & White, F.N. Kinetics of Formation of Native Ribonuclease During Oxidation of the Reduced

Polypeptide-Chain. Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1961) 47 N6, 13091314.

22.Aussel, C. & Masseuff, R. Biochera. Biophys. Res. Commun. (1984) 119,1122-1127.

23.Barber, B.H. & Carber, J.P. Can. J. Biochem. (1975) 53, 371-379.

24.Bloom Biochemistry 17 (1978) 4430-4438.

25.Braig, K., Otwinowski, Z., Hegde, R., Boisvert, D.C., Joachimiak, A., Horwich, A.L. & Sigler, P.B. The crystal structure of the bacterial chaperonin GroEL at 2.8A. Nature (1994) 371,578-586.

26.Breslow, E., Beychok, S., Hardman, K.D. &Gurd, F.R.N. Relative Conformaton of Sperm Whale Metmyoglobin and Apomyoglobin in Solution. J.B.C. (1965) 240, 304-309.

27.Brooks, C.L. Ill Characterization of "Native" Apomyoglobin by Molecular Dynamics Simulation. J.M.B. (1992) 227, 375-380.

28.Buchner, J., Renner, M., Lilie, H., Hinz, H.-J. & Jaenicke, R. Alternative Folded States of an Immunoglobulin. Biochemistry (1991) 30, 6922-6929.

29.Buck, M., Radford, S.E., Dobson, C.M. Biochemistry (1993) 32, 669678.

30.Burston, S.G., Ranson, N.A. & Clarse, A.R. The origins and consequences of asymmetry in the chaperonin reaction cycle. J. Biol. Chem.(1995) 249, 138-152.

31 .Bychkova, V.E.,Pain, R.H. & Ptitsyn, O.B. The "Molten Globule" State is involved in the Translocation of Proteins Across Membranes? FEBS Lett. (1988) 238 N2, 231-234.

32.Bychkova, V.E., Berni, R., Rossi, G-L., Kutushenko, V.P. & Ptitsyn, O.B. Retinol-Binding Protein Is in the Molten Globule State at Low pH. Biochemistry (1992) 31, 7566-7571.

33.Bychkova,V.E.&Ptitsyn, O.B. The Molten Globide in Vitro and in Vivo. Chemtracts - Biochem. and Molec. Biol. (1993) 4, 133-163.

34.Bychkova, V.E., Dujsekina, A.E., Klenin, S.I., Tiktopulo,E.I., Uversky, V.N. & Ptitsyn, O.B. Molten Globule-Like State of Cytochrome C under Conditions Simulating Those Near the Membrane Surface. Biochemistry (1996) 35 N19, 6058-6063.

35.Caldwell, J.L., Severson, C.D., Thompson, J.S. Human Alphafetoprotein: embryonic alpha-globulin with in vitra immunosupressive activity. Fed. Proc. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. (1973) 32, 979.

36.Carpenter, J.F. & Crowe, J.H. Cryobiology (1988) 25, 244-255.

37.Carpenter, J.F. & Crowe, J.H. Biochemistry (1989) 28, 3916-3922.

38.Ceve, A.& Morin, Ph. Biochemie (1979) 61, 607-613.

39.Chen, Sh., Roseman, A.M., Hunter, A.S., Wood, S.P., Burston, S.G., Raiison, N.A., Clarke, A.G. & Saibil, H.R. Location of a folding protein and shape chages in GroEL-GroES complexes imaged by cryo-electrom microscopy. Nature (1994) 371, 261-264.

40.Closset, J & Gerday, Cli. BBA (1975) 405, 228-235.

41.Cocco, M.J. & Lecomte, J.T.J. Characterization of Hydriphobic Cores in Apomyoglobin: a proton NMR spectroscopy study. Biochemistry (1990)29,11067-11072.

42.Cohen, J.S. Spectroscopic Studies on the Conformation of Cytochrome C andApocytochrome C. J. Biol. Chem. (1974) 249 N4, 1113-1118.

43.Delmas, P.D., Stenner, D.D.,Romberg, R.W., Riggs, B.L. & Mann, K.G. Immunichemical Studies of Conformational Alteration in Bone g-Car boxy glutamic Acid Containing Protein. Biochemistry 23 (1984) 4720-4725.

44.Desormeaux et al. Biochem. Biophys. Acta (1992) 1121, 137-152.

45.Deutsch, H.F. Chemistry and Biology of a-fetoprotein Advances in Cancer

46.research (1991) 56, 253-312.

47.Dobson, C.M., Curr. Opin. Struct. Biol. (1994) 4, 636-640.

48.Dolgikli, D.A., Gilmanshin, R.I., Brazhnikov, E.I., Bychkova, V.E., Semisotnov, G.V., Venyaminov, S.Yu & Ptitsyn, O.B. cc-Lactoalbumin:

Compact State with Fluctuating Tertiary Structure?. FEBS Lett. (1981) 136 N2,311-315.

49.Dolgikh, D.A., Kolomiets, A.P., Bolotina, LA., & Ptitsyn, O.B. Molten Globule State Accumulates in Carbonic Anhydrase Folding FEBS Lett. (1984) 165, 88-92.

50.Dorrington, K. Can J. of Biochem(1978) 56, 492-499.

51 .Dufonr, E., Haertle, T. Protein Engng (1990) 4, 185-190.

52.Dufour, E., Bertrand-Harb, C., ITaertle, T. Biopolymers (1993) 33, 589598.

53.Ellezer, D. &. Wright, P.E. Is Apomyoglobin a Molten Globule? Structural Characterization by NMR. J MB (1996) 263, 531-538.

54.Endo, T., Schatz, G. EMBO J. (1988) 7, 1153-1158.

55.Eisenberg, M.A., Gresalfi, T., Riccio, T., McLaughlin, S Biochemistry (1979) 18, 5213-5223.

56.Filimonov, V.V., Pfeie, W., Tsalkova, T.N.& Privalov, P.L. Termodynamic Investigation of Proteins. IV. Calcium Binding Protein Paralbumin. Biophys. Chem. (1978) 8, 117-122.

57.Fulmer, C.S., Wasserman, R.H., Huang, J.W. & Colin D.V. B.B.A. (1975)412, 256-261.

58.Furie, B & Furie, B.C. Conformation-Specific Antibodies as Probes of the g-Carboxyglutamic Acid-Rich Region of Bovine Prothrombin. J. Biol. Chem. (1979) 254, 9766-9771.

59.Georgopoulos, C.P., Hendrix, R.W., Casjens, S.R. & Kaiser, A.D. Host participation in bacieriopfage lambda head assembly. J. Mol. Biol.(1973) 76, 45-60.

60.Gilmanshin R.I. & Ptitsyn, O.B. An Early Intermediate of Refolding a-Lactoalbumin forms within 20 ms. FEBS Lett. (1987) 223 N2, 327-329.

61.Goloubinoff, P., Gatenby, A.A. & Lorimer, G.H. GroE heat-shok proteins promote assembly of foreign prokaryotic ribulose

bisphoshpate carboxylase oligomers in Escherichia coli. Nature (1989) 337, 44-47.

62.Goto, Y. & Fink, A.L. Acid-Induced Folding of heme proteins. Methods Enzymol. (1994) 232, 3-15.

63.Griko, Y.V., Privalov. P.L., Venyaminov, S.Y. & Kutyshenko, V.P. Termodynamic stydy of apomyoglobin structure. J.M.B. (1988) 202,

127-138.

64.Griko Y.V. & Privalov, P.L. Termodynamic puzzle of apomyoglobin unfolding. J.M.B. (1994) 235, 1318-1325.

65.Hamada, D., Segawa, S., Goto, Y. Nature Struct. Biol. (1995) 3, 868873.

66.Hansen, J.E. & Gafni, A. Fluorescence detection of conformational changes in GroEL induced by thermal switching and nucleotide binding. J. Biol. Chem.(1994) 269, 6286-6289.

67.Hauschka Biochemistry 21 (1982) 2538-2547.

68.He, X.M. & Carter, D.C. Atomic structure and chemistry of human serum albumin Nature (1992) 358 N6383, 209-214.

69 .Hill, T. "Thermodynamics of Small Sistems" (New York, Wiley, 1968).

70.Hughson, F.M., Wright, P.E. & Baldwin,R.L. Structural Characterization of Partly Folded Apomyoglobin intermediate. Science (1990) 249, 1544-1548.

71.1seki, Sh. & Kondo, H. Light Microscopic Localization of Hepatic Fatty Acid Binding Protein mRNA in Jejiunal Epithelia of Rats Using In Situ Hybridization, Immunohistochemical and Autoradiographic Techniques. J. Histochem. Cytochem. (1990) 38 N1, 111-115.

72.1sfell Biochemistry (1993) 32,11352-11362.

73.1wami, K., Dohi, Y., Moriyame, T. & Hamaguchi, K. J.Biochem (1987) 102,75-82.

74.Kamatari, Y.O., Konno, T., Kataoka M., Akasaka, K. J. Mol. Biol. (1996)259,512-523.

75.Klee Biochemistry (1977) 16, 1017-1024.

76.Kuo, I.C.Y. & Coffee, C.L. 3. Biol. Chem. (1976) 251, 6315-6319.

77.Kuwajima, K, Nitta, K., Yoneyama, M. & Sugai, S. Three-state denaturation of a-Lactaalbumin by Huanidine Hydrochloride. J. Mol. Biol. (1976) 106 N2,359-373.

78.Kuwajima, K., Harushima Y., Sugai Sh. Influence of Ca2+ Binding on the Stability of Bovine a-Lactalbumin Studied by Circular Dichroism and Nuclear Magnetic Resonance Spectra. Int. J. Peptide Protein Res. (1986)27,18-27.

79.Kuwajima, K., Yamaya, H., Miva, S., Sugai Sh. & Nagamura, T. Rapid Formation of Secondary Structure Framework in Protein Folding studed by Stopped -Flow Circular Dichroism. FEBS Lett. (1987) 221 N1,115-118.

80.LaLonde, M.J., Levenson, M.A., Roe, J.J. & Bernlohr D.A. Adipocyte Lipid-Binding Protein Complexed with Arachidonic Acid J. Biol. Chem. ( 1994) 269 N 41, 25339-25347.

81.Levinthal, C. Are the Pathway for Protein Folding? J. Chem. Phys. (1968)65,44-45.

82.Liu Biochemistry 32 (1993) 11390-11396.

83.Liu, Y.P. & ReungW.K. J. Biol.Chem. (1976) 251, 4193-4198.

84.Martin J., Horwich A.L. & Hard F.U. Prevention of protein denaturation under heat stress by the chaperonin Hsp60. Science (1992)258,995-998.

85.Morinaga, T., Sakai,M., Wegmann, T.G. & Tamaoki,T. Primary structure of Human a-fetoprotein and mRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80,4604-4608.

86.Murgita, R.A. & Tomasi, JT.T.B. Suppressionof imune responce by a-fetoprotein. II. The effect of mouse a-fetoproteinon mixed lymphocyte reactivity and mitogen-indused. lymphocyte transformation. J. Exp. Med. (1975) 141 N2, 440-452.

87.Murray, A.S. & Kay, C.M. Biochem (1972) 11, 2622-2627.

88.Naval, J., Calvo, M., Laborda, J. Dubouch, P. Frain, M., Sala-Trepat, J.M. & Uriel, J. Expression of mllNAs for a-Fetoprotein (AFP) and Albumin and Incorporation of AFP and Docosahexaenoic Acid in Boboon Fetuses. J. Biochem. (1992) 111, 649-654.

89.Nelsesyuen JBC 18 (1976) 5648-5656.

90.Nishii, I., Kataoka, M., Tokunaga, F. & Goto, Y. Cold Denaturation of the Molten Globule State of Apomyoglobin and a profile for protein folding. Biochemistry (1994) 33, 4903-4909.

91.Nunez, E.A. Biological Role of Alpha-fetoprotein in Endocrinological Field: Data and Hypotheses. Tumor Biology (1994) 15 N2, 63-72.

92.0stvald, T.V. & MacLennon, D.H. JBC (1974) 249, 5867-5871.

93.Parmelee, D.C., Evenson, M.A. &Deutsch, H.F. The Presence of Fatty Acids in Human a-fetoprotein. J. Biol. Chem. (1978) 253, 2114-2119.

94.Perrier Biochemistry 33 (1994) 9960-9967.

95.Perutz, M.F. Nature (1970) 228, 726.

96.Poulos, T.L., Finzel, B.C. & Howard, A.J. Crystal Structure of Substrate-Free Pseudomonas Putida Cytochrome P-540. Biochemistry (1986)25,5314-5322.

97.Prats, M., Teissie, J., Tocanne, J.-F. Nature (1986) 322, 756-758.

98 Privalov, P.L. FEBS Lett (1974) 40S, S140-S150

99.Privalov, P.L. Stability of Proteins. Small Globular Proteins. Adv.Protein Chem. (1979) 33, 167-241.

100.Ptitsyn,O.B. Molten Globule and Protein Folding. Advances in Protein Chemistry (1995) 47, 83-229.

101.Ptitsyn, O.B. & Uversky, V.N. The Molten Globule is a Third Thermodynamical Stale of Protein Molecules. FEBS Lett. (1994) 341, 15-18.

102.Ptitsyn, O.B., Bychkova, V.E. & Uversky, V.N. Kinetic and Equilibrium Folding Intermediates. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 348 (1995), 35-41.

103.Ptitsyn, O.B., Bychkova, V.E., Dujsekina, A.E. Rossi G.-L., Fantuzzi, A., Uversky, V.N., Tiktopulo, E.I. & Klenin, S.I. Modeling of the Molten Globule State of Proteins near Membranes. Protein Engineering (1997) 10, suppl, 32. (Miamy Nature Biotechnology Winter Symposium, Feb. 1-5, 1997.)

104.Purves, L.R., Bersohn, I., Geddes, E.W., Cancer (1978) 25, 12611270.

105.Ruoslahti, E. & Seppada, M. Adv. Cancer Res. (1979) 29, 275-346.

106.Segawa T. & Sugai S. J Biochem. 93 (1983) 1321-1328. Interaction

of Divalent Metal Ions with Bovine, Human and Goat a-lactalbumins.

107.Semenkova, L.N., Dudich, E.I., Dudich, I.V., Shingarova, L.N. & Korobko, V.G. Alpha-Fetoprotein as a TNF Resistance Factor for the Human Hepatocarcinoma Cell Line HepG2. Tumor Biol. (1996) 398 10-21.

108.Schmidt, M., Rutkat,K., Rachel, R., Pfeifer, G„ Jaenicke, R., Vitanen, P., Lorimer, G. & Buchner J. Symmetric complex of GroE chaperonins as part of the functional cycle. Science (1994) 265, 656659.

109.Shikama, K. & Yamasaki, I. Nature (1961) 190, 83-84.

llO.Shiraki, K., Nishikawa K„ Goto, Y. J. Mol. Biol. (1995) 245, 180194.

lll.Soloff, M.S., Swartz, S.K., Pearlmutter, F. &Kithier, K. Biochim. Biophys. Acta (1976) 427, 644-651.

112.Sternberg, N. Properties of a mutant of Escherichia coli defective in bacteriopfage lambda head formation (groE). J. Mol. Biol. (1973) 76, 25-44.

113.Stryer. L. The Interaction of Naphthalene Dye with Apomyoglobin and Apohemoglobyn. A Fluorescen t Probe of Non-Polar Binding Sites. J. Mol. Biol. (1965) 13, 482-495.

114.Surin A.K, Kashparov, I.A., Kihara, PI., Kotova, N.V., Marchenkov, V.D., Marchenkova, S.Yu., Melnik, B.S.,

Timchenko, A.A. & Semisotnov. G.V. "Nucleotide action on the stability and conformation of chaperonin GroEIJES" / 2nd Workshop "Principles of Protein Architecture" Waseda University International Convention Center 1-6-1 Nisbiwaseda, Shinjuku-ku, Tokyo Desember 12-13, 1995.

115.Tanford

116.Tatarinov, Y.S. Vopr. Med. Khim.(1964) 10, 90-91.

117.Timasheff, S.N. "Biophysics of Water" (Eds. F.Frank & S.Mathias, N. Y.: Wiley, 1982) 70-72.

118.Timchenko, A.A.,Kihara, H., Kotova, N.V., Kutyshenko, V.P., Melnik, B.S. Surin, A.K. & Semisotnov, G.V. "Conformation and

stability of the co-chaperonin GroES" / 2nd Workshop "Principles of Protein Architecture" Waseda University Intemati-onal Convention Center 1-6-1 Nishiwaseda, Shinjuku-ku, Tokyo Desember 12-13, 1995

119.Tirado-Rives, J. & Jorgensen, W.L. Molecular Dynamics Simulations of Unfolding of Apomyoglobin in Water. Biochemistry (1993) 32, 41754184.

120.Torres, J.M., Auel, A. & Uriel, J. Alpha-Fetoprotein - Mediated Uptake of Fatty Acids by Human T Lymphocytes. J Cell. Physiol. (1992) 150 456-462.

121.Tsakova, T.V. & Privalov, P.L. BBA (1980) 624, 196-204.

122.Uriel, J., Laborda, J. Naval, J. & Geuskens, M. AFP Receptors in Malignany Cells. An overview in "Biological Activities of Alpha-Fetoprotein" (Mizejewski, G.I. & Jacobson, H.I. eds., CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, 1989) v.2, 103-117.

123.Uversky, V.N. Use of East Protein Size-Exclusion Liquid Chromatography To Study the Unfolding of Proteins Wich Denaturate through the Molten Globule. Biochemistry (1993) 32, 13288-13298.

124.Uversky, V.N. & Ptutsyn, O.B 'PartlyFolded" State, a New Equilibrium State of Protein Molecules: Four-State Guanidinium Chloride - Induced Unfolding of ß-Lactamase at Low Temperature. Biochemistry (1994) 33 N10, 2782-2791.

125.Uversky, V.N. & Ptutsyn, O.B. All-or-Non Solvent-Indused Transition Between Native, Molten Globule and Unfolded States in Globular Proteins. Folding & Design (1996s) I, 117-122.

126.Uversky, V.N. & Ptutsyn, O.B. Futher Evidence on the Equilibrium "Pre-molten Globule Stale": Four-Stale Guanidinium Chloride -Induced Unfolding of Carbonic Anhydrase B at Low Temperature J. Mol. Biol. (1996-) 255, 215-228.

127.Vallette, G., Vranckx, R., Martin, M.-E., Benassayag, C. & Nunez,

E.A. Conformational Changes in Rodent and Human a-fetoprotein: influence of fatty acids. Biochim. Biophys. Acta (1989) 997, 302-312.

128.Van Ceunebroeck, J-C., Hanssens, I., Joniau, M. & Van Cauwelaert,

F. JBC (1985) 20, 10944-10947.

129.Van Dael, P. Haezebrouck, L. Morozova, C. Arico-muendel & C.M. Dobson. Partially Folded States of Equine Lysozyme. Structural Characterization ans Significance for Protein Folding. Biochemistry

(1993)32, 11886-11894.

Приложение: обозначения и сокращения.

АНС - 8-анилино-1-нафталин-сульфонат

КД - круговой дихроизм

УФ - ультрофиолетовая часть спектра

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

АФП - альфа-фетопротеин

СА - сывороточный альбумин

Иа-Р - натрий-фосфатный буфер

ОиНС1 - гуанидин гидрохлорид

[©] - эллиптичность

^ - доля денатурированного состояния

Гр - доля развернутого состояния