Процессы сворачивания-разворачивания и стабильность белков, имеющих структуру типа бета-бочонка тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Степаненко, Олеся Викторовна

• Степаненко, Олеся Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Степаненко, Олеся Викторовна

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность исследования.

Цели и задачи исследования.

Основные положения, выносимые на защиту.

Научная новизна исследований.

Теоретическое и практическое значение работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структура и фолдинг белков: современные представления.

1.2. Флуоресцентные белки.

1.2.1. Спектральные свойства флуоресцентных белков.

1.2.1.1. Флуоресцентные белки из класса Anthozoa.

1.2.1.2. Флуоресцентные белки из других классов организмов.

1.2.1.3. Aequorea GFP и его улучшенные варианты.

1.2.1.4. Фото активируемые флуоресцентные белки.

1.2.2. Структурные свойства флуоресцентных белков.

1.2.2.1. Пространственная структура, топология и олигомеризация.

1.2.2.2. Механизмы образования хромофора.

1.2.2.3. Микроокружение хромофора.

1.2.3. Конформационная стабильность флуоресцентных белков.

1.3. одорант-связывающие белки.

1.3.1. Лиганды OBPs.

1.3.2. Трехмерная структура OBPs.

1.3.3. Комплексы OBPs с молекулами одорантов.

1.3.4. Предположительная роль OBPs.

1.3.5. Конформационная стабильность рОВР.

ГЛАВА 2: МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Анализ пространственной структуры белка.

2.2.2. Флуоресцентные измерения.

2.2.3. Регистрация и анализ кривых затухания флуоресценции.

2.2.4. Измерение спектров кругового дихроизма.

2.2.5. Измерение равновесных кривых денатурации.

2.2.6. Измерение кинетических кривых денатурации белков.

2.1.7. Тушение флуоресценции акриламидом.

2.2.8. Анализ экспериментальных данных о процессе сворачивания-разворачивания белков с использованием параметрического представления двух независимых экстенсивных характеристик системы.

2.2.9. Расчет кинетических параметров.

2.2.10. Расчет термодинамических параметров.

ГЛАВА 3: РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Особенности процессов денатурации EGFP и его мутантных форм с заменами в положении 96.

3.1.1. Экспрессия EGFP и его мутантных форм в бактериальных клетках.

3.1.2. Кинетика созревания хромофора EGFP и его мутантных форм.

3.1.3. Влияние точечных аминокислотных замен в положении 96 на структуру EGFP.

3.1.4. Особенности денатурации EGFP под действием GdnHCl. Влияние замен в положении 96 на стабильность EGFP.

3.2. роль четвертичной структуры в стабилизации флуоресцентных белков

3.2.1. Спектральные свойства мономерных и олигомерных FPs.

3.2.2. Вторичная и третичная структура флуоресцентных белков.

3.2.3. Спектры флуоресценции и доступность хромофора молекулам растворителя.

3.2.4. Особенности триптофановой флуоресценции.

3.2.5. Кинетика денатурации под действием гуанидингидрохлорида.

3.2.6. Квазистационарные зависимости.

3.3. Разворачивание-сворачивание ОВР под действием GdnHCl и нагревания.

3.3.1. Локальные предденагурационные изменения структуры ОВР под действием небольших концентраций GdnHCl.

3.3.2. Устойчивость структуры ОВР к денатурирующему действию GdnHCl.

3.3.3. Тепловая денатурация ОВР.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Процессы сворачивания-разворачивания и стабильность белков, имеющих структуру типа бета-бочонка»

Актуальность исследования

Вопрос о том как белки сворачиваются в уникальное нативное состояние является одним из основных фундаментальных вопросов молекулярной биологии. Выяснение причин нарушений фолдинга белков представляет существенное практическое значение для медицины и биотехнологии. Специфическая ассоциация макромолекул белка, связанная с нарушением их фолдинга и приводящая к образованию амилоидных фибрилл, часто сопровождает так называемые конформационные болезни, такие как болезни Паркинсона и Альцгеймера, злокачественная миелома, катаракта и др., а возникновение неправильно свернутых ассоциатов рекомбинантных белков и их накопление в телах включения является главной проблемой при получении нативных рекомбинантных белков. Большинство исследований фолдинга белков выполнено на небольших глобулярных а-спиральных белках. Процессы сворачивания белков, имеющих выраженную (3-складчатую структуру, в частности, структуру типа Р-бочонка, изучались значительно меньше.

В настоящей работе объектами исследования стали представители двух классов белков, имеющих структуру типа Р-бочонка: одорант-связывающий белок (ОВР) из обонятельного эпителия свиньи и флуоресцентные белки (FPs). Флуоресцентные белки представляют собой обширный класс белков, характерной особенностью которых является наличие уникального хромофора, поглощающего и, в большинстве случаев, способного флуоресцировать в видимой области спектра. Одорант-связывающие белки представляют собой группу растворимых белков, секретируемых в обонятельном эпителии позвоночных и способных обратимо связывать молекулы одорантов с константой диссоциации микромолярного порядка. Несмотря на то, что FPs и ОВР принадлежат к одному архитектурному типу, структура Р-бочонка этих белков имеет существенные различия. В случае FPs Р-бочонок образован одиннадцатью антипараллельными Р-тяжами и в центре бочонка проходит а-спираль, содержащая хромофор, в то время как р-бочонок ОВР полый и образован девятью аитипараллельными Р-тяжами. Флуоресцентные белки интересны в связи с их широким использованием в клеточной биологии в качестве биологических маркеров, которые позволяют изучать динамику генной экспрессии, локализацию и транспорт белков в живых клетках и тканях. Одорант-связывающие белки представляют исключительный интерес в связи с исследованием механизмов распознавания запахов и в связи с возможностью их использования для создания биосенсоров, чувствительных к различным, в том числе, опасным (яды, взрывчатые вещества и т.п.) соединениям.

Цели и задачи исследования

Цель работы состояла в изучении особенностей процессов сворачивания-разворачивания белков, имеющих структуру типа (3-бочонка: одорант-связывающего белка из обонятельного эпителия свиньи (ОВР) и набора флуоресцентных белков, а также их мутантных рекомбинантных форм. В задачи исследования входило:

1. Изучение процессов сворачивания—разворачивания FPs и одорант-связывающего белка под действием гуанидингидрохлорида (GdnHCl).

2. Определение устойчивости структуры ОВР к различным денатурирующим воздействиям.

3. Установление влияния аминокислотных замен в положении 96 на структуру и стабильность зеленого флуоресцентного белка (EGFP).

4. Выяснение на примере зеленых и красных флуоресцентных белков роли четвертичной структуры в стабилизации FPs.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Белки с топологией нативной структуры типа Р-бочонка более устойчивы к действию химических денатурантов и нагреванию по сравнению с глобулярными а-спиральными белками.

2. Небольшие концентрации GdnHCl вызывают предденатурационпые локальные изменения структуры белков.

3. Четвертичная структура флуоресцентных белков EGFP (зеленого мономера), zFP506 (зеленого тетрамера), raRFPl (красного мономера), dimer2 (красного димера) и DsRedl (красного тетрамера) не является единственным фактором, определяющим различия в их стабильности.

4. Аминокислотные замены в положении 96 в зеленом флуоресцентном белке влияют на возможность сворачивания, скорость сворачивания, структуру и устойчивость к денатурирующим воздействиям этого белка.

Научная новизна исследований

Установлено, что белки, имеющие топологию типа Р-бочонка, характеризуются более высокой стабильностью структуры по сравнению с глобулярными а-спиральными белками. В то же время, особенностью фолдинга FPs, по сравнению с одорант-связывающими белками, является наличие существенно более высокого энергетического барьера между нативным и денатурированным состояниями этих белков. Показано, что предденатурационные концентрации GdnHCl вызывают локальные изменения микроокружения триптофанового остатка ОВР. В случае зеленого флуоресцентного белка, при небольших концентрациях GdnHCl уменьшаются напряжения, существующие в каркасе этого белка, и в этих условиях хромофор, оставаясь недоступным тушащему действию растворителя, становится более планарным, что проявляется в возрастании интенсивности флуоресценции хромофора.

Показано, что агрегация ОВР при высоких температурах может быть вызвана разрушением старых и образованием новых неканонических межмолекулярных ионных пар или иных контактов петлевых участков молекулы белка.

Впервые показано, что помимо существенной роли Arg96 в процессах созревания хромофора, аминокислотные замены в положении 96 в зеленом флуоресцентном белке оказывают влияние на сворачивание и устойчивость к денатурирующему воздействию этого белка.

Теоретическое и практическое значение работы

Полученные результаты имеют важное теоретическое значение для понимания особенностей процессов фолдинга белков, имеющих различную нативнуто структуру. Данные об особенностях действия химического денатуранта GdnHCl на структуру белковой молекулы, предшествующих ее денатурации, должны учитываться в дальнейшем при исследовании процессов сворачивания—разворачивания белков.

Данные о стабильности и процессах сворачивания-разворачивания одорант-связывающего белка могут иметь практическое значение при использовании белков данного класса в качестве чувствительных элементов биосенсорных систем высокой социальной значимости. Данные, полученные при изучении влияния остатка в положении 96 на структуру и стабильность зеленого флуоресцентного белка и роли четвертичной структуры в стабилизации флуоресцентных белков, могут представлять интерес для создания новых флуоресцентных биомаркеров. Новая информация о флуоресцентных характеристиках триптофанового остатка Тгр16 ОВР, полученная в данной работе, может представлять интерес для выявления взаимосвязи особенностей локализации триптофановых остатков в белке с параметрами их флуоресценции.

Существенной методической разработкой является вывод поправочного коэффициента, введение которого в соотношение для определения константы равновесия, позволяет использовать для расчета данной величины такую интенсивную характеристику системы, как параметр А.

Результаты работы используются при проведении лекционно-практических занятий для студентов 4 курса кафедры биофизики СПбГПУ.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Степаненко, Олеся Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Исследованные в работе белки, одорант-связывающий белок и флуоресцентные белки, с топологией нативной структуры типа Р-бочонка характеризуются более высокой устойчивостью к действию химических денатурантов и нагреванию по сравнению с глобулярными а-спиральными белками. Высота свободноэнергетического барьера, разделяющего нативное и денатурированное состояния, для флуоресцентных белков существенно превышает эту величину для одорант-связывающего белка.

2. Малые концентрации гуанидингидрохлорида вызывают локальные изменения структуры белков: изменение микроокружения триптофанового остатка в случае одорант-связывающего белка и уменьшение непланарпости хромофора в случае зеленого флуоресцентного белка.

3. Четвертичная структура является существенным, но не единственным фактором, определяющим различия в стабильности зеленых и красных флуоресцентных белков: возможно создание мономерных мутантных форм этих белков с высокой стабильностью.

4. Аминокислотные замены в положении 96 в зеленом флуоресцентном белке EGFP приводят к нарушению или замедлению процессов сворачивания белка и могут оказывать влияние на структуру и устойчивость этого белка к денатурирующим воздействиям.

5. Главной причиной агрегации молекул одорант-связывающего белка при высоких температурах является увеличение подвижности петлевых участков и, как следствие, образование неканонических ионных взаимодействий.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Степаненко, Олеся Викторовна, 2008 год

1. Бурштейн Э. А. 1976. Люминесценция белковых хромофоров. Сер. Биофиз, Т.7, ВИНИТИ, Москва.

2. Кузнецова И. М., Степаненко Ольга В., Туроверов К. К, Хуанг Ч, Ванг Ч.-Ч. 2005. Конформационные изменения дисульфидизомеразы С под действием гуанидингидрохлорида. Цитология 47 (11): 1007-1016.

3. Кузнецова И. М., Туроверов К. К. 1998. Что определяет характеристики собственной УФ-флуоресценции белков? Анализ свойств микроокружения и особенностей локализации их триптофановых остатков. Цитология 40 (8/9): 747762.

4. Лакович Дж. 1986. Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир. стр. 136139.

5. Поварова О. И., Кузнецова И. М, Туроверов К. К. 2005. Физико-химические свойства актина в различных структурных состояниях. Новые представления о процессах его сворачивания-разворачивания. Цитология 47: 935-977.

6. ПолингЛ., Полинг П. 1978. Химия. М.: Мир. стр. 683.

7. Степаненко Ольга. В., Кузнецова И. М., Туроверов К. К., Скогнамиглио В., Стаяно М., ДАуриа С. 2005. Структура и стабильность глутаминсвязывающего белка из Escherichia coli и его комплекса с глутамином. Цитология 47(11): 9881006.

8. Степаненко Олеся В., Верхуша В.В., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. 2007. Флуоресцентные белки: физико-химические свойства и использование в клеточной биологии. Цитология 49 (5): 395-420.

9. Степаненко Олеся В., Верхуша В. В., Шавловский М. М., Алейникова Т. Д., Уверский В. Н., Кузнецова И. М., Туроверов К. К. 2005. Роль четвертичной структуры в стабилизации флуоресцентных белков. Цитология 47(11): 10171027.

10. Туроверов К. К, Бикташев А. Г., Дорофеюк А. В., Кузнецова И. М. 1998. Комплекс аппаратных и программных средств для измерения спектральных, поляризационных и кинетических характеристик флуоресценции в растворе. Цитология 40 (8/9): 806-817.

11. Финкелъштейн А. В. 1976. Стереохимический анализ вторичной структуры полипептидной цепи при помощи пространственных моделей Курто. I. Разрешение конформации дипептидов. Мол. Биол. 10: 507-513.

12. Финкелъштейн А. В., Птицын О. Б. 2005. Физика белка. М.: КДУ. 456 с.

13. Эфтинк М. Р. 1998. Использование флуоресцентных методов для изучения разворачивания белков. Биохимия 63 (3): 327-337.

14. Akerstrom В., Flower D. Я., Salier J.-P. 2000. Lipocalins: unity in diversity. BBA 1482: 1-8.

15. Altschuler G. M., Klug D. R., Willison K. R. 2005. Unfolding energetics of G-a-actine: a discrete intermediate can be re-folded to the native state by CCT. J. Mol. Biol. 353: 385-396.

16. Ando R., Hama II., Yamamoto-Hino M., Mizuno II, Miyawaki A. 2002. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 12651-12656.

17. Ando R., Mizuno II, Miyawaki A. 2004. Regulated fast nucleocytoplasmic shutting observed by reversible protein highlighting. Science 306: 1370-1373.

18. Andrews В. Т., Schoenfish A. R., Roy M., Waldo G., Jennings P. A. 2007. The rough energy landscape of superfolder GFP is linked to the chromophore. J.Mol.Biol. 373: 476-490.

19. Anfinsen С. B. 1973. Principles that govern the folding of proteins chains. Science. 181:223-230.

20. Axelsen P. H., Prendergast F. G. 1989. Molecular dynamics of tryptophan in ribonuclease-Tl. II. Correlations with fluorescence. Biophys. J. 56: 43-66.

21. Baird G. S., Zacharias D. A., Tsien R. Y. 2000. Biochemistry, mutagenesis and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 11984-11989.

22. Baldaccini N. E., Gagliardo A., Pelosi P., Topazzini A. 1986. Occurrence of apyrazine binding protein in the nasal mucosa of some vertebrates. Сотр. Biochem. Physiol. B. 84(3): 249-253.

23. Berman H. M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T. N., Weissing H., Shindyalov I. N., Bourne P. E. 2000. The protein data bank. Nucleic Acids Research. 28 (1): 235-242.

24. Bhuyan А. К. 2002. Protein stabilization by urea and guanidine hydrochloride. Biochemistry. 41 (45): 13386-13394.

25. Bianchet M. A., Bains G., Pelosi P., Pevsner J., Snyder S. H., Monaco H. L., Amzel L. M. 1996. The three-dimensional structure of bovine odorant binding protein and its mechanism of odor recognition. Nat. Struct. Biol. 3(11): 934-939.

26. Bignetti E., Cavaggioni A., Pelosi P., Persaud К. C., Sorbi R. Т., Tirindelli R. 1985. Purification and characterisation of an odorant-binding protein from cow nasal tissue. Eur. J. Biochem. 149(2): 227-231.

27. Bignetti E., Damiani G., De Negri P., Ramoni R., Avanzini F., Ferrari G., Rossi G. L. 1987. Specificity of an immunoaffinity column for odorant-binding protein from bovine nasal mucosa. Chem. Senses 12: 601-608.

28. Bokman S. H., Ward W. W. 1981. Renaturalion of Aequorea Green-Fluorescent Protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 101: 1372-1380.

29. Brejc K., Sixma Т. K., Kitts P. A., Kain S. R., Tsien R. Y., Ormo M., Remington S. J. 1996. Structural basis for dual excitation and photoisomerization of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 2306-2311.

30. Bulina M. E., Chudakov D. M, MudrikN. N., Lukyanov K. A. 2002. Interconversion of Anthozoa GFP-like fluorescent and non-fluorescent proteins by mutagenesis. BMC Biochem. 3: 1-8.

31. Burchell B. 1991. Turning on and turning off the sense of smell. Nature 350: 16-17.

32. Burova Т. V., Choiset Y., Jankowski С. K., Haertle T. 1999. Conformational stability and binding properties of porcine odorant binding protein. Biochemistry 38: 1504315051.

33. Carrell R. W., Gooptu B. 1998. Conformational changes and disease serpins, prions and Alzheimer's. Curr. Opin. Struct. Biol. 8: 799-809.

34. Cavaggioni A., Findlay J. В., Tirindelli R. 1990. Ligand binding characteristics of homologous rat and mouse urinary proteins and pyrazine-binding protein of calf. Сотр. Biochem. Physiol. B. 96: 513-520.

35. Cavaggioni A., Sorbi R. Т., Keen J. N., Pappin D. J., Findlay J. B. 1987. Homology between the pyrazine-binding protein from nasal mucosa and major urinary proteins. FEBS Lett. 212:225-228.

36. Ckalfle M., Tu Y., Euskirchen G„ Ward W. W, Prasher D. C. 1994. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263: 802-805.

37. Chen Y., Barkley M. D. 1998. Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins. Biochemistry 37: 9976-9982.

38. Chudakov D. M., Belousov V. V., Zaraisky A. G., Novoselov V. V., Staroverov D. В., Zorov D. В., Lukyanov S. A., Lukyanov K. A. 2003. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nat. Biotechnol. 21: 191-194.

39. Chudakov D. M., Verkhusha V. V., Staroverov D. В., Souslova E. A, Lukyanov S., Lukyanov K. A. 2004. Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking. Nat. Biotechnol. 22: 1435-1439.

40. Cody С. W., Prasher D. C., Westler W. M, Prendergast F. G., Ward W. W. J993. Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green-fluorescent protein. Biochemistry. 32: 1212-1218.

41. Cormack B. P., Valdivia R. H., Falkow S. 1996. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173: 33-38.

42. Cubitt А. В., Heim R., Adams S. R., Boyd A. E., Gross L. A., Tsien R. Y. 1995. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem. Sci. 20: 448-455.

43. Dal Monte M., Andreini 1., Revoltella R., Pelosi P. 1991. Purification and characterization of two odorant-binding proteins from nasal tissue of rabbit and pig. Сотр. Biochem. Physiol. B. 99(2): 445-451.

44. Dal Monte M., Centini M., Anselmi C., Pelosi P. 1993. Binding of selected odorants to bovine and porcine odorant-binding proteins. Chem. Senses 18: 713-721.

45. Dale R. E., Eisinger J. 1974. Intramolecular distances determined by energy transfer. Dependence on orientational freedom of donor and acceptor. Biopolymers 13: 15731605.

46. Danson M. J., Hough D. W 1998. Structure, function and stability of enzymes from the Archaea. Trends Microbiol. 6: 307-314.

47. Das P., Wilson C. J., Fossati G., Wittung-Stafshede P., Matthews K. S., Clementi C. 2005. Characterization of the folding landscape of monomeric lactose repressor: quantitative comparison of theory and experiment. PNAS 102(41): 14569-14574.

48. D'Auria S., Staiano M., Kuznetsova I. M, Turoverov К. K. 2005. The combined use of fluorescence spectroscopy and X-ray crystallography greatly contributes to elucidating structure and dynamics of proteins. Reviews in Fluorescence: 25-61.

49. Dear T. N., Campbell K., Rabbitts Т. H. 1991. Molecular cloning of putative odorant-binding and odorant-metabolizing proteins. Biochemistry 30: 10376-10382.

50. Deheyn D. D., Kubokawa K., McCarthy J. K., Murakami A., Porrachia M., Rouse G. W., Holland N. D. 2007. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. Biol. Bull. 213:95-100.

51. Dinner A. R., Sali A., Smith L. J., Dobson С. M., Karplus M. 2000. Understanding protein folding via free-energy surfaces from theory and experiment. Trends. Biochem. Sci. 25: 331-339.

52. Dobson С. M. 2003. Protein folding and misfolding. Nature 426: 884-890.

53. Dumoulin M., Dobson С. M. 2004. Probing the origins, diagnosis and treatment of amyloid diseases using antibodies. Biochimie. 86: 589-600.

54. Eckl P. M., Ortner A., Esterbauer H. 1993. Genotoxic properties of 4-hydroxyalkenals and analogous aldehydes. Mutat. Res. 290: 183-192.

55. EftinkM. R. 1994. The use of fluorescence methods to monitor unfolding transitions in proteins. Biophys. J. 66: 482-501.

56. Eisinger J., Feaer В., Lamola A. A. 1969. Intramolecular singlet excitation transfer. Applications to polypeptides. Biochemistry 8: 3908-3915.

57. Enoki S., Saeki K., Maki K., Kuwajima K. 2004. Acid denaturation and refolding of green fluorescent protein. Biochemistry. 43 (44): 14238-14248.

58. Fink A. L. 1998. Protein aggregation: folding aggregates, inclusion bodies and amyloid. Fold. Des. 3: 9-23.

59. Flower D. R. 1996. The lipocalin protein family: structure and function. Biochem. J. 318: 1-14.

60. Flower D. R. 2000. Experimentally determined lipocalin structures. Biochim. Biophys. Acta. 1482: 46-56.

61. Flower D. R., North A. C., Sansom С. E. 2000. The lipocalin protein family: structural and sequence overview. Biochim. Biophys. Acta. 1482: 9-24.

62. Forster Th. 1960. Transfer mechanisms of electronic excitation energy. Rad. Res. Suppl. 2: 326-339.

63. Fukuda H., Arai M., Kuwajima K. 2000. Folding of green fluorescent protein and the cycle3 mutant. Biochemistry 39: 12025-12032.

64. Ganni M., Garibotti M., Scaloni A., Pucci P., Pelosi P. 1997. Microheterogcneity of odorant-binding proteins in the porcupine revealed by N-terminal sequencing and mass spectrometry. Сотр. Biochem. Physiol. B. 117: 287-291.

65. Garibotti M., Navarrini A., Pisanelli A. M., Pelosi P. 1997. Three odorant-binding proteins from rabbit nasal mucosa. Chem. Senses. 22: 383-390.

66. Goers J., Permyakov S. E., Permyakov E. A., Uversky V. N., Fink A. L. 2002. Conformational prerequisites for alpha-lactalbumin fibrillation. Biochem. 41: 1254612551.

67. Golebiowski J., Antonczak S., Fiorucci S., Cabrol-Bass D. 2007. Mechanistic Events Underlying Odorant Binding Protein Chemoreception. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 67: 448^158.

68. Grinvald A., Steinberg I. Z. 1976. The fluorescence decay of tryptophan residues in native and denatured proteins. Biochim. Biophys. Acta 427: 663-678.

69. GrolliS., Merli E., Conti V., Scaltriti E., Ramoni R. 2006. Odorant binding protein has the biochemical properties of a scavenger for 4-hydroxy-2-nonenal in mammalian nasal mucosa. FEBS J. 273: 5131-5142.

70. Gurskaya N. G., Savitsky A. P., Yanushevich Y. G., Lukyanov S. A., Lukyanov K. A. 2001. Color transitions in coral's fluorescent proteins by site-directed mutagenesis. BMC Biochem. 2: 6.

71. Hajjar E., Perahia D., Debat H„ Nespoulous C., Robert С. H. 2006. Odorant Binding and Conformational Dynamicsin the Odorant-binding Protein. J. Biol. Chem. 281 (40): 29929-29937.

72. Herent M. F., Collin S., Pelosi P. 1995. Affinities of nutty and green-smelling compounds to odorant-binding proteins. Chem. Senses 20: 601-610.

73. Hubbard S. J., Campbell S. F., Thornton J. M. 1991. Molecular recognition. Conformational analysis of limited proteolytic sites and serine proteinase protein inhibitors. J. Mol. Biol. 220: 507-530.

74. Humphrey W., Dalke A., Schulten K. 1996. VMD: visual molecular dynamics. J. Molec. Graphics 14: 33-38.

75. Ikematsu M., Takaoka D., Yasuda M. 2005. Odorant binding initially occurring at the central pocket in bovine odorant-binding protein. BBRC 333: 1227-1233.

76. Jablonski A. 1957. Decay of fhotoluminescence of solutions. Acta Phys. Polon. 16: 471-479.

77. John T. R. and Radford S. E. 2005. The Yin and Yang of protein folding. FEBS J. 272: 5962-5970.

78. Johnson F. H., Shimomura O., Saiga Y., Gershman L. C., Reyholds G. Т., Waters J. R. 1962. Action of cyanide on Cypridina luciferin. J. Cell. Сотр. Physiol. 60: 85-104.

79. Kabsch W., Sander C. 1983. Dictionary of protein secondary structure: Pattern recognition of hydrogen bonded and geometrical features. Biopolymers 22: 25772637.

80. Kumar S., Nussinov R. 1999. Salt bridge stability in monomeric proteins. J. Mol. Biol. 293:1241-1255.

81. Kuznetsova I. M., Stepanenko Olga V., Turoverov К. K., Zhu L.,. Zhou J.-M., Fink A. L., Uversky V. N. 2002b. Unravelling multistate unfolding of rabbit muscle creatine kinase. Biochem. Biophys. Acta. 1596: 138-155.

82. Kuznetsova I. M., Turoverov К. K., Uversky V. N. 2004. Use of the phase diagram method to analyze the protein unfolding-refolding reactions: fishing out the "invisible" intermediates. J. Proteome Res. 3: 485^194.

83. Labas Y A., Gurskaya N. G., Yanushevich Y. G., Fradkov A. F., Lukyanov K. A., Lukyanov S. A., Matz M. V. 2002. Diversity and evolution of the green fluorescent protein family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 4256-4261.

84. Levinthal C. 1968. Are there pathways for protein folding? J. Chim. Phys. 65: 44-45.

85. Lindahl E., Hess В., van der Spoel D. 2001. GROMACS 3.0: a package for molecular simulation and trajectory analysis. J. Mol. Model. 7: 306-317.

86. Loebel D., Marchese S., Krieger J., Pelosi P., Breer H. 1998. Subtypes of odorant-binding proteins: heterologous expression and assessment of ligand binding. Eur. J. Biochem. 254:318-324.

87. Lobel D., Jacob M., Volkner M., Breer H. 2002. Odorants of Different Chemical Classes Interact with Distinct Odorant Binding Protein Subtypes. Chem. Senses 27: 39-44.

88. Maddalo S.L., Zimmer M. 2006. The role of the protein matrix in green fluorescent protein fluorescence. Photochem. Photobiol. 82: 367-372.

89. Magert H. J., Hadrys Т., Cieslak A., Groger A., Feller S., Forssmann W. G. 1995. cDNA sequence and expression pattern of the putative pheromone carrier aphrodisin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 2091-2095.

90. Marchese S., Pes D., Scaloni A., Carbone V., Pelosi P. 1998. Lipocalins of boar salivary glands binding odours and pheromones. Eur. J. Biochem. 252: 563-568.

91. Marquardt D. W. 1963. An algorithm for least-squares estimation of nonlinear parameters. J. Soc. Indust. Apl. Math. 11: 431-441.

92. Marinari U. M, Ferro M., Sciaba L., Finollo R., Bassi A. M., Brambilla G. 1984. DNA-damaging activity of biotic and xenobiotic aldehydes in Chinese hamster ovary cells. Cell Biochem. Funct. 2: 243-248.

93. Merritt E. A., Bacon D. J. 1977. Raster3D: Photorealistic molecular graphics: Methods Enzymol. 277: 505-524.

94. Mishin A. S., Subach F. V., Yampolsky I. V., King W., Lukyanov K. A., Verkhush V.V. 2008. The First Mutant of the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein That Forms a Red Chromophore. Biochemistry. Published online 27.03.2008.

95. Mizuno H., Sawano A., Eli P., Hama H., Miyawaki A. 2001. Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy transfer. Biochemistry. 40: 2502-2510.

96. Nolting B. 1999. Protein Folding Kinetics. In Biophysical Methods, pill, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg.

97. Ormo M., Cubitt А. В., Kallio K., Gross L. A., Tsien R. Y, Remington S. J. 1996. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Science. 273: 1392-1395.

98. Pace C. N. 1986. Determination and analysis of urea and guanidine hydrochloride denaturation curves. Methods Enzymol. 131: 266-280.

99. Pan C. P., Barkley M. D. 2004. Conformational effects on tryptophan fluorescence in cyclic hexapeptides. Biophys. J. 86: 3828-3835.

100. Pan C. P., Callis P. R., Barkley M. D. 2006. Dependence of tryptophan emission wavelength on conformation in cyclic hexapeptides. J. Phys. Chem. B. 110: 70097016.

101. Pande V. S., Grosberg A. Yu., Tanaka Т., Rokhsar D. S. 1998. Pathways for protein folding: is a new view needed? Curr.Opin.Struct.Biol. 8: 68 79.

102. Paolini S., Tanfani F., Fini C., Bertoli E., Pelosi P. 1999. Porcine odorant-binding protein: structural stability and ligand affinities measured by Fourier-transform infrared spectroscopy and fluorescence spectroscopy. BBA 1431: 179-188.

103. Parisi M., Mazzini A., Sorbi R. Т., Ramoni R., Grolli S., Favilla R. 2003. Unfolding and refolding of porcine odorant binding protein in guanidinium hydrochloride: equilibrium studies at neutral pH. Biochim. Biophys. Acta. 1652: 115-125.

104. Patterson G. H., Lippincott-Schwartz J. 2002. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 13: 1873-1877.

105. Pelosi P., Baldaccini N. E., Pisanelli A. M. 1982. Identification of a specific olfactory receptor for 2-isobutyl-3-methoxypyrazine. Biochem. J. 201(1): 245-248.

106. Permyakov E. A., Yarmolenko V. V., Emelyanenko V. I., Burstein E. A., Closset J., Gerday C. 1980. Fluorescence study of the calcium binding to whiting (Gadus merlangus) parvalbumin. Eur. J. Biochem. 109: 307-315.

107. Pes D., Dal Monte M., Ganni M., Pelosi P. 1992. Isolation of two odorant-binding proteins from mouse nasal tissue. Сотр. Biochem. Physiol. B. 103(4): 1011-1017.

108. Pes D., Mameli M., Andreini I., Krieger J., Weber M., Breer H., Pelosi P. 1998. Cloning and expression of odorant-binding proteins la and lb from mouse nasal tissue. Gene. 212(1): 49-55.

109. Pes D., Pelosi P. 1995. Odorant-binding proteins of the mouse. Сотр. Biochem. Physiol. В 112: 471-479.

110. Petersen J., Wilmann P. G., Beddoe Т., Oakley A. J., Devenish R. J., Prescott M., Rossjohn J. 2003. The 2.0-A crystal structure of eqFP611, a far red fluorescent protein from the sea anemone Entacmaea quadricolor. J. Biol. Chem. 278: 44626-44631.

111. Pevsner J., Нои V., Snowman A. M., Snyder S. H. 1990. Odorant-binding protein. Characterization of ligand binding. J. Biol. Chem. 265(11): 6118-6125.

112. Pevsner J., Hwang P. M„ Sklar P. В., Venable J. C., Snyder S. H. 1988. Odorant-binding protein and its mRNA are localized to lateral nasal gland implying a carrier function. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 85(7): 2383-2387.

113. Pevsner J., Snyder S. H. 1990. Odorant-binding protein: odorant transport function in the vertebrate nasal epithelium Chem. Senses 15: 217-222.

114. Pevsner J., Trifiletti R. R., Strittmatter S. M., Snyder S. H. 1985. Isolation and characterization of an olfactory receptor protein for odorant pyrazines. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 82(9): 3050-3054.

115. Plotkin S. S., Onuchic J. N. 2002. Understanding protein folding with energy landscape theory. Part I: Basic concepts. Quart. Rev. Biophys. 35: 111-167.

116. Prasher D. C., Eckenrode V K., Ward W. W., Prendergast F. G., Cormier M. J. 1992. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. Ill: 229233.

117. Prendergast F. G., Mann K. G. 1978. Chemical and physical properties of aequorin and the green fluorescent protein isolated from Aequorea forskalea. Biochemistry. 17: 3448-3453.

118. Prescott M., Ling M., Beddoe Т., Oakley A. J., Dove S, Hoegh-Guldberg O., Devenish R. J., Rossjohn J. 2003. The 2.2 A crystal structure of a pocilloporin pigment reveals a nonplanar chromophore conformation. Structure. 11: 275-284.

119. RamoniR., Vincent F., Ashcroft A. E., Accornero P., Grolli S., Valencia C., Tegoni M., Cambillau C. 2002. Control of domain swapping in bovine odorant-binding protein. Biochem. J. 365: 739-748.

120. Reid B. G., Flynn G. C. 1997. Chromophore formation in green fluorescent protein. Biochemistry. 36: 6786-6791.

121. Remington S. J., Wachter R. M., Yarbrough D. K., Branchaud В., Anderson D. C., Kallio K., Lukyanov K. A. 2005. zFP538, a yellow-fluorescent protein from Zoanthus, contains a novel three-ring chromophore. Biochemistry. 44: 202-212.

122. Schofield P. R. J988. Carrier-bound odorant delivery to olfactory receptors. Trends Neurosci. 11: 471-472.

123. Shaner N. C., Campbell R. E., Steinbach P. A., Giepmans В. N., Palmer A. E., Tsien R. Y. 2004. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22: 1567-1572.

124. Shaner N. C., Steinbach P. A., Tsien R. Y. 2005. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2: 905-909.

125. Shu X., Shaner N. C, Yarbrough C. A., Tsien R. Y, Remington S. J. 2006. Novel chromophores and buried charges control color in mFruits. Biochemistry 45: 96399647.

126. Singer A. G., Macrides F. 1993. Composotion of an aphrodisiac pheromone. Chem. Senses 18: 630.

127. Staiano M., D'Auria S., Varriale A., Rossi M., Marabotti A., Fini C., Stepanenko Olesya V., Kuznetsova I. M., Turoverov К. K. 2007. Stability and dynamics of the porcine odorant-binding protein. Biochemistry. 46(39): 11120-11127.

128. Steinberg I. Z. 1971. Long-range nonradiative transfer of electronic excitation energy in proteins and polypeptides. Ann. Rev. Biochem. 40: 83-114.

129. Stepanenko Olesya V., Verkhusha V. V., Shavlovsky M:M., Kuznetsova I. M., Uversky V. N., Turoverov К. K. 2008b. Understanding the role of Arg96 in structure and stability of green fluorescent protein. Proteins. Published online 09.05.2008.

130. Szabo A. G., Faerman C. 1992. Dilemma of correlating fluorescence quantum yields and intensity decay times in single-tryptophan mutant proteins. Proc. SPIE 1640: 7080.

131. Tcatchoff L., Nespoulous C., Pernollet J. C., Briand L. 2006. A single lysyl residue defines the binding specificity of a human odorant-binding protein for aldehydez. FEBS Lett. 580:2102-2108.

132. Tegoni M., Ramoni R., Bignetti E., Spinelli S., Cambillau C. 1996. Domain swapping creates a third putative combining site in bovine odorant binding protein dimer. Nat. Struct. Biol. 3(10): 863-867.

133. Tsien R. Y. 1998. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67: 509-544.

134. Tsutsui H., Karasawa S., Shimizu H., Nukina N., Miyawaki A. 2005. Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter. EMBO Rep. 6: 233-238.

135. Turoverov К. K, Kuznetsova I. M., Zaitzev V. N. 1985. The environment of the tryptophan residue in Pseudomonas aeruginosa azurin and its fluorecsence properties. Biophys. Chem. 23: 79-89.

136. Turoverov К. K, Kuznetsova I. M. 2003. Intrinsic fluorescence of actin. J. Fluorescence 13: 41-57.

137. Utsumi M., Ohno K., Kawasaki Y, Tamura M., Kubo Т., Tohyama M. 1999. Expression of major urinary protein genes in the nasal glands associated with general olfaction. J. Neurobiol. 39: 227-236.

138. Verkhusha V. V., Chudakov D. M., Gurskaya N. G., Lukyanov S. A., Lukyanov K. A. 2004. Common pathway for the red ehromophore formation in fluorescent proteins and chromoproteins. Chcm. Biol. 11: 845-854.

139. Verkhusha V. V, Kuznetsova I. M., Stepanenko Olesya. V., Zaraisky A. G., Shavlovsky M. M., Turoverov К. К, Uversky V. N. 2003. High Stability of Discosoma DsRed as Compared to Aequorea EGFP. Biochemistry 42: 7879-7884.

140. Verkhusha V. V, Otsuna H., Awasaki Т., Oda H., Tsukita S., Ito K. 2001. An enhanced mutant of red fluorescent protein DsRed for double labeling and developmental timer of neural fiber bundle formation. J. Biol. Chem. 276: 29621-29624.

141. Verkhusha V V, Sorkin A. 2005. Conversion of the monomeric red fluorescent protein into a photoactivatable probe. Chem. Biol. 12: 279-285.

142. Vieille C., Zeikus G. J. 2001. Plyperthermophilic enzymes: sources, uses, and molecular mechanisms for thermostability. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65: 1-43.

143. Vincent F., Ramoni R., Spinelli S., Grolli S., Tegoni M., Cambillau C. 2004. Crystal structures of bovine odorant-binding protein in complex with odorant molecules. Eur. J. Biochem. 271(19): 3832-3842.

144. Vincent F., Spinelli S., Ramoni R., Grolli S., Pelosi P., Cambillau C., Tegoni M. 2000. Complexes of porcine odorant binding protein with odorant molecules belonging to different chemical classes. J. Mol. Biol. 300(1): 127-139.

145. VisserN. V, HinkM. A., Borst J. W„ van der Krogt G. N., Visser A. J. 2002. Circular dichroism spectroscopy of fluorescent proteins. FEBS Lett. 521: 31-35.

146. Vivian J. Т., Callis P. R. 2001. Mechanisms of tryptophan fluorescence shifts in proteins. Biophys. J. 80: 2093-2109.

147. Ward W. W., Bokman S. H. 1982. Reversible denaturation of Aequorea Green-fluorescent protein: physical separation and characterization of the renatured protein. Biochemistry. 21: 4535-4540.

148. Ward W. W., Cormier M. J. 1979. An energy transfer protein in coelenterate bioluminescence. Characterization of the Renilla green-fluorescent protein. J. Biol. Chem. 254: 781-788.

149. Ward W. W, Prentice H. J., Roth A. F„ Cody C. W., Reeves S. C. 1982. Spectral Perturbations of the Aequorea Green-Fluorcscent Protein. Photochemistry and Photobiology 35: 803-808.

150. Weber W., Helms V., McCammon J. A., LanghoffP. W. 1999. Shedding light on the dark and weakly fluorescent states of green fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 6177-6182.

151. Wiedenmann J., Ivanchenko S., OswaldF., Schmitt F., Rocker C., SalihA., Spindler K. D., Nienhaus G. U. 2004. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101: 15905-15910.

152. Wood Т. I., Barondeau D. P., Hitomi C., Kassmann C. J., Tainer J. A., Getzoff E. D. 2005. Defining the role of arginine 96 in green fluorescent protein fluorophore biosynthesis. Biochemistry 44: 16211-16220.

153. Yarbrough D., Wachter R. M., Kallio K., Matz M. V., Remington S. J. 2001. Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-A resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 462-467.

154. Zimmer M. 2002. Green fluorescent protein (GFP): applications, structure, and related photophysical behavior. Chem. Rev. 102: 759-781.

155. Zuker M., Szabo A. G., Bramall L., Krajcarski D. Т., Selinger B. 1985. The delta function convolution method (DFCM) for fluorescence decay experiments. Rev. Sci. Instrum. 56: 14-22.136^

156. Хочу также выразить благодарность моей семье за постоянную поддержку, заботу и терпение.