Системы для анализа физиологической активности хемосенсорных клеток, разработка и применение в физиологическом эксперименте тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат физико-математических наук Хохлов, Александр Анатольевич

• Хохлов, Александр Анатольевич
• кандидат физико-математических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Хохлов, Александр Анатольевич

I. Введение

II. Обзор литературы

11.1. Строение основной обонятельной системы

11.2. Трансдукция обонятельного сигнала обонятельными рецептирующими нейронами

11.3. Трансдукция обонятельного сигнала другими обонятельными нейронами

11.4. Электрическая активность других клеток обонятельного эпителия

11.5. Принципы распознавания и кодирования запахов

11.6. Электрическая активность обонятельных эпителиев

III. Материалы и методы

111.1. Животные

111.2. Регистрация ответов обонятельного эпителия

III.4. Флуоресцентная микроскопия и микрофотометрия

IV. Результаты и обсуждение

IV. 1. Олфактометр 21 IV.2. Регистрация электроолфактограмм 25 IV.3. Моделирование электроолфактограмм. Исходные положения модели.

IV.4. Анализ экспериментальных данных.

IV.5. Микрофлуориметрия клетки

IV.6. Шумовые характеристики.

IV.7. Исследование одиночных клеток.

IV. 8. Обсуждение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Системы для анализа физиологической активности хемосенсорных клеток, разработка и применение в физиологическом эксперименте»

Обоняние - способность определять запах веществ, рассеянных в воздухе.Обонятельная система позвоночных и млекопитающих состоит из двух связанных подсистем - основной и дополнительной, расположенных в носовой раковине. Традиционно считалось, что.у позвоночных главный обонятельный эпителий (МОЕ) специализируется на восприятии обычных запахов, а вомероназальный орган (VNO) ответственен за распознавание относительно узкого класса пахучих веществ (феромонов), детерминирующих социальное и половое поведение животных. Однако исследования, проведенные в последние годы, свидетельствуют о том, что VNO свойственна более широкая химическая чувствительность, в то время как восприятие животными ряда феромонов происходит при участии МОЕ. Процесс восприятия простых пахучих стимулов, не участвующих в химических коммуникациях животных, основательно изучен и прослежен от связывания молекул запаха с рецептирующей поверхностью обонятельных нейронов МОЕ до возбуждения нейронных сетей' обонятельной луковицы. В частности, установлено, что запахи распознаются \ специализированными рецепторами, относящимися к суперсемейству гептаспиральных рецепторов, сопряженных с сигнальными каскадами с помощью G-белков. Связывание молекулы запаха с рецептором приводит к активации аденилатциклазы, быстрому повышению уровня циклического аденозинмонофосфата (сАМР) в обонятельной цилии, активации сАМР -зависимых катионных каналов и генерации рецепторного потенциала. Вопросы о том, какие клетки МОЕ и при участии каких рецепторных и сигнальных механизмов детектируют феромоны, остаются открытыми.Методами иммуногистохимии недавно показано, что: 1) в МОЕ функционирует субпопуляция клеток, которые экспрессируют не гептаспиральные рецепторы запахов, а рецептор-гуанилатциклазу; 2) определенная популяция клеток МОЕ экспрессирует G-белок гастдуцин и ионный канал TRPM5 - ключевые элементы каскада вкусовой трансдукции.Вполне вероятно, что клетки данных подтипов являются феромончувствительными, хотя прямых доказательств этого не существует. В силу сказанного, одним из направлений исследований нашей лаборатории, является попытка выяснить физиологическую роль этих субпопуляций клеток МОЕ, скорее всего выполняющих хемосенсорную функцию. В частности, предполагается установить природу химических стимулов, на которые способны отвечать эти неканонические хемосенсорные клетки, и исследовать сигнальные процессы, запускаемые в этих клетках химическими стимулами.Существует несколько специфических проблем, препятствующих эффективному анализу популяции неканонических хемосенсорных клеток МОЕ. Во-первых, данная субпопуляция слишком мала (1% числа нейронов), что значительно затрудняет их идентификацию среди клеток диссоциированного обонятельного эпителия и делает проблематичным эффективное использование таких методов клеточной физиологии как patch clamp и Са2+ imaging.Морфологические критерии для решения задачи идентификации одиночных клеток МОЕ практически неприменимы. В частности, в процессе выделения большинство обонятельных нейронов теряют обонятельные цилии, наличие которых является характерным морфологическим признаком этих клеток. Кроме того, обонятельные нейроны постоянно обмениваются, развиваясь из базальных клеток. Незрелые нейроны приобретают цилии только когда их рецептирующая апикальная мембрана достигает поверхности эпителия. Задача идентификации неканонических хемосенсорных клеток могла бы быть решена с помощью трансгенных животных, у которых различные хемосенсорные клетки МОЕ экспрессируют различные флуоресцентные маркерные белки. Еще одной проблемой является то, что химические вещества, специфически стимулирующие неканонические хемосенсорные клетки, в целом, не идентифицированы. Учитывая все эти обстоятельства, а также то, что в нашей лаборатории предполагалось использование трансгенных и нокаутных животных, в качестве основной цели данной работы было сформулировано создание новой методической и приборной базы для анализа физиологической активности неканонических хемосенсорных клеток, функционирующих в обонятельном эпителии. Решались следующие задачи: 1. Разработать мультиволновой осветитель на сверхярких излучающих полупроводниковых диодах для идентификации и исследования одиночных хемосенсорных клеток методом флуоресцентной микроскопии.2. Разработать двухканальный олфактометр для поддержания и регистрации электрической активности изолированного обонятельного эпителия и стимуляции его газовыми пахучими стимулами заданной концентрации.3. Исследовать роль субпопуляции гастдуцин-положительных рассеянных хемосенсорных клеток в генерации ответов на 2-гептанон - синтетический феромон мышей.4. Для интерпретации полученных данных разработать математическую модель суммарного электрического ответа обонятельного эпителия, генерируемого при участии нескольких популяций хемосенсорных клеток.В результате выполненной работы: 1. Был разработан и построен двухканальный олфактометр, который позволяет поддерживать и регистрировать электрическую активность изолированного обонятельного эпителия до 5 часов и стимулировать его пахучими стимулами в виде калиброванной смеси воздуха и насыщенных паров пахучих веществ. Идея создания данного прибора возникла при анализе современных тенденций в электрофизиологии. Дело в том, что классическая микроэлектродная техника, а затем и метод patch clamp, революционизировавший клеточные исследования и позволивший решить многие задачи от регистрации активности одиночных ионных каналов до анализа экспрессии генов в одиночных клетках, вытеснили на какое-то время некогда традиционные электрофизиологические методы исследования. В частности, исследователи практически отказались от измерения трансэпителиальных токов и потенциалов, которые, естественно, уступают по своей информативности современным методам клеточной биологии. Тем не менее, в последние годы возродился интерес к относительно простым электрофизиологическим методикам, таким как экстраклеточное отведение или методика Усинга для измерения электрической активности эпителиев (Ussing andZerahn, 1951), которые позволяют осуществлять экспресс-анализ функционального состояния биологических объектов с разными уровнями организации. Связано это с рядом обстоятельств, из которых в контексте данной работы следует отметить следующее. Современные методы молекулярной биологии и генной инженерии позволяют манипулировать рецепторными, канальными и сигнальными белками, либо подавляя экспрессию данного белка (knock-out, sRNA interference), либо усиливая его экспрессию, либо вводя точечные мутации. Простые электрофизиологические методы часто дают возможность выявить функциональные последствия подобных манипуляций. В качестве примера отметим, что мыши с нокаутированным геном аденилилциклазы типа 3, которая в норме специфически экспрессируется в обонятельных нейронах, становились полными аносмиками по отношению к простым запахам, что успешно выявлялось по олфактограмме (Wong et al., 2000)., 2. Была проведена разработка мультиволнового осветителя на сверхярких излучающих диодах для исследования одиночных хемосенсорных клеток методами флуоресцентной микроскопии, в том числе, с использованием флуоресцентных зондов. Основанием для постановки такой задачи явилось следующее. Если исключить дорогостоящую конфокальную микроскопию, традиционным для флуоресцентных приложений является использование осветителей на основе ксеноновых ламп - достаточно нестабильный источник света - в сочетании с оптическими фильтрами или монохроматорами. В первом случае имеется плохо перестраиваемая система с ограниченным набором длин волн (две, как правило). Во втором, платой за широкий спектральный диапазон является потеря светосилы и/или чувствительности. Например, в светосильных монохроматорах на дифракционных решетках, которые обеспечивают возбуждение на произвольных длинах волн, фоновая засветка составляет порядка 0.05-0.08% от интенсивности возбуждающего света в силу неидеальности решеток и наличия спектров выше первого порядка (Lakowicz, 1999). Наличие достаточно интенсивного «паразитного» света является одним из основных факторов, ограничивающих чувствительность регистрации и недостаточное соотношение сигнал/шум. Между тем, нами планировались: идентификация клеток с помощью флуоресцентных маркерных белков, исследование одиночных клеток с помощью флуоресцентных зондов и использование нескольких красителей одновременно. Для этого были необходимы мультиволновое монохроматичное возбуждение и идеальное спектральное разделение возбуждения и эмиссии.Достоинством излучающих диодов является то, что они работают в узком спектральном диапазоне относительно длины волны максимального излучения (^ тах^ Ю нм), уже выпускаются диоды с А™ах в широком спектральном диапазоне (320-1500 нм), диоды эффективно управляются электронным образом* и практически безинерционны в масштабах кинетики подавляющего большинства изучаемых внутриклеточных процессов. Немаловажным обстоятельством является низкая стоимость излучающих диодов и практически неограниченное время эксплуатации. Для сравнения, время непрерывного излучения ксеноновых ламп обычно составляет 400-800 часов. Опыт работы с монохроматором фирмы PTI (Photon Technology International, США) и проделанные расчеты давали основание1 думать, что разработка и создание управляемого осветителя на сверхярких излучающих диодах позволит нам существенно улучшить чувствительность фотометрического метода и исследовать одиночные клетки с большей эффективностью.Разработанные и построенные приборы были апробированы с использованием биологических объектов, и, тем самым, была продемонстрирована их эффективность. В частности, было показано, что по сравнению с фирменным сканирующим монохроматором использование осветителя на излучающих диодах позволяет увеличить чувствительность фотометрического метода и существенно улучшить соотношение сигнал/шум на фоне уменьшения скорости выгорания флуоресцентных зондов. Последнее весьма важно при исследовании одиночных клеток. Использование олфактометра, генерирующего воспроизводимые пахучие стимулы, позволило провести сравнительный количественный анализ чувствительности к запахам мышей дикого типа и мышей с нокаутированным геном гастдуцина. Данное исследование показало, что электроолфактограмма (EOG) является достаточно информативным параметром, по которому можно судить об относительном вкладе различных клеточных субпопуляций в электрический ответ МОЕ на запах данного типа. Последнее в сочетании с ингибиторным анализом, в принципе, позволяет идентифицировать пахучие вещества, специфически стимулирующие исследуемую субпопуляцию клеток. б

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Хохлов, Александр Анатольевич

1. Разработан и создан мультиволновой управляемый осветитель на основе сверхярких светоизлучающих диодов. Осветитель обеспечивает возбуждение практически всех флуоресцентных зондов для клеточных исследований и флуоресцентных GFP-подобных белков, лучшую чувствительность и соотношение сигнал/шум по сравнению с промышленным осветителем на, монохроматоре.Разработанный осветитель успешно апробирован при исследовании одиночных клеток, в том числе, способности вкусовых клеток секретировать АТР.

2. Разработан и построен олфактометр для.длительного поддержания электрической активности обонятельного эпителия и регистрации его ответов на запахи.Олфактометр включает двухканальный генератор газообразных пахучих стимулов, который обеспечивает воспроизводимость концентрационных и кинетических параметров стимулов с точностью ±5% и ±12 %, соответственно. С помощью разработанного олфактометра изучены электрические ответы обонятельного эпителия мыши на ряд синтетических пахучих веществ и синтетический феромон мышей 2-гептанон.3. На примере 2-гептанона с использованием ингибиторного анализа установлено, что распознавание социально-значимых запахов происходит при участии как минимум двух различных популяций хемосенсорных клеток - обонятельных нейронов с аденилатциклазным каскадом и клеток, использующих фосфолипазный каскад трансдукции. Создана математическая модель, адекватно описывающая ответы на запахи и позволяющая оценить вклад отдельных клеточных субпопуляций в генерацию суммарного ответа эпителия.4. Показано, что нокаут гена G-белка гастдуцина. модифицирует ответы на 2-

гептанон обонятельного эпителия мышей: Подобные изменения ответов наблюдаются при ингибировании фосфолипазы С в клетках эпителия мышей дикого типа. Это-свидетельствует о.том; что гастдуцин-положительные клетки, в которых функционирует фосфолипазный сигнальный каскад, могут специализироваться в распознавании этого и, возможно, других феромонов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Хохлов, Александр Анатольевич, 2008 год

1. Бронштейн А.А. Обонятельные рецепторы позвоночных. // Л., «Наука»,.1977. 160.

2. Винников ЯЛ., Титова Л.К. Морфология органа обоняния. // М., «ГИ мед.Лит», 1957. 296.

3. Вулис Л.А., Кашкаров В.П. Теория струй вязкой жидкости. // М., «Наука», 1965. 331.

4. Гулаков И.Р., Холондырев СВ. Метод счета фотонов в оптико-физических измерениях. //Минск, «Университетское». 1989. 256.

5. Гутман A.M. Биофизика внеклеточных токов мозга. // М., «Наука», 1980.1841-,

6. Дулевич В.Е.,. Коростелёв А.А., Мельник Ю.А. и др. Теоретические основы радиолокации. // М., «Сов.радио». 1964. 731.

7. Жадин М.Н. Биофизические механизмы формирования электро-энцефалограммы. // М., «Наука», 1984. 196,

8. Зайдель А.Н. Ошибки измерений физических величин. // -Пб. «Лань», 2005. 112. Р. Идельчик И.Е. Справочник по гидравлическим сопротивлениям. // М. «Машиностроение», 1975. 574.

9. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. // М., «Мир», 1979. 280. И. Лойцянский Л.Г. Механика жидкости и газа. // М., «Наука», 1970. 905.

10. Минор А.С., Персод К.Ч. Оптическая регистрация как метод исследования ответов на пахучие вещества в обонятельной луковице. // Сенсорные системы. 2001. 15(3), 179-194.

11. Мирошников • М.М. Теоретические основы оптико-электронных приборов. // Л., «Машиностроение». 1988. 696.

12. Плонси Р., Барр Р. Биоэлектричество. Количественный подход. // М., «Мир», 1992. 366.

13. Романов Р.А., Хохлов А.А., Быстрова М.Ф., Рогачевская О.А., Яценко Ю.Е., Колесников С. Мониторинг выброса АТФ из одиночных клеток методом биосенсора. // Биологические мембраны. 2007. 24,333-339.

14. Сунцов Н.Н. Методы аналогий в аэрогидродинамике. // М., «Физматгиз», 1959. 319.

15. Тихонов В.И. Статистическая радиотехника. // М., «Сов.радио». 1966. 678.

16. Хохлов А.А., Колесников С. Установка для регистрации электроретинограммы. // Приборы и техника эксперимента. 2000. 2, 159-160.

17. Хохлов АА, Колесников СС. Установка для стимуляции и измерения электрической активности обонятельного эпителия. // Приборы и техника эксперимента. 2002. 6,113-117.

18. Хохлов А.А., Романов Р.А., Зубов Б.В., Пашинин А.Д., Колесников С. Осветитель на излучающих диодах для микрофотометрических исследований клеток. // Приборы и техника эксперимента. 2007. 3, 128-131.

19. Altenhofen W, Ludwig J, Eismann E, Kraus W, Bonigk W, Kaupp UB. 1991. Control of ligand specificity in cyclic nucleotide-gated channels from rod photoreceptors and olfactory epithelium. // Proc Nat. Acad Sci USA. 88-21, 9868-9872.

20. Bakalyar HA, Reed RR. Identification of a specialized adenylyl cyclase that may mediate odorant detection. // Science. 1990.250,1403-1406.

21. Balasubramanian S, Lynch JW, Barry PH. Calcium-dependent modulation of the agonist affinity of the mammalian olfactory cyclic nucleotide-gated channel by calmodulin and a novel endogenous factor. // J Membr Biol. 1996.152,13-23.

22. Baylor DA, Hodgkin AL, Lamb TD. The electrical response of turtle cones to flashes and steps of light. // J. Physiol. 1974. 242, 685-727.

23. Baryshnikov SG, Rogachevskaja OA, and Kolesnikov SS. // J. Neurophysiol. 2003. 90, 3283-3294.

24. Belluscio L, Gold GH, Nemes A, Axel R. Mice deficient in G0if are anosmic. // Neuron. 1998.20,69-81.

25. Lancet D, Ben-Arie N, Cohen S, Gat U, Gross-Isseroff R. Olfactory receptors: transduction, diversity, human psychophysics and genome analysis. // Ciba Found. Symp. 1993.179,131-141.

26. Bernhardt SJ, Nairn M, Zehavi U, Lindemann B. Changes in TP3 and cytosolic Ca2 + in response to sugars and non-sugar sweeteners in transduction of sweet taste in the rat. // J Physiol. 1996. 490, 25-36.

27. Berridge M J. Inositol trisphosphate and calcium signaling. // Nature. 1993. 361(6410), 315-325.

28. Berridge MJ, Lipp P, and Bootman MD. The versatility and universality of calcium signaling. // Nature Rev Mol Cell Biol. 2000.1,11-21.

29. Blanchard DC. A simple method for the production of homogeneous water drops down to one micron radius. // Coll Sci. 1954. 9, 321-328.

30. Boekhoff I, Kroner C, Breer H. Calcium controls second messenger signalling in olfactory cilia. // Cell Signal. 1996. 8,167-171.

31. Borisy FF, Ronnett GV, Cunningham AM, Juilfs D, Beavo J, Snyder SH. Calcium/Calmodulin-activated phosphodiesterase expressed in olfactory receptor neurons //J.Neurosci. 1992. 12, 915-923.

32. Borisy FF, Hwang PM, Ronnett GV, Snyder SH. High affinity cyclic AMP phosphodiesterase and adenosine localized in sensory organs. // Brain Res. 1993. 610, 199-207.

33. Borisy FF, Ronnett GV, Cunningham AM, Juilfs D, Beavo J, Snyder SH. Calcium/calmodulin activated phosphodiesterase selectively expressed in olfactory receptor neurons. // J. Neurosci. 1991. 12, 915-23.

34. Breer H, Boekhoff I. Odorants of the same odor class activate different second messenger pathways. // Chem Senses. 1991. 16, 19-29.

35. Bruch RC. Signal transducing GTP-binding proteins in olfaction. // Comp.BiocheaPhysiol. 1990. 95A, 27-29.

36. Brunet LJ, Gold GH, Ngai J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. // Neuron. 1996.17, 681-693.

37. Buck L, Axel R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognishion. // Cell. 1991. 65, 175-187.

38. Buck LB. Information coding in the vertebrate olfactory system. // Annu Rev Neurosci. 1996. 19, 517-544.

39. Buiakova 01, Scott JW, Farbman A, Kream R, Grillo M, Franzen L, Richman M, Davis

40. M, Abbondanzo S, Stewart CL, Margolis FL. Olfactory marker protein (OMP) gene deletion causes altered physiological activity of olfactory sensory neurons. // PNAS. 1996. 93, 9858-9863.

41. Calof AL, Chikaraishi DM. Analysis of nuerogenesis in a mammalian neuroepithelium: proliferation and differentiation of an olfactory neuron precursor in vitro. // Neuron. 1989. 3,115-127.

42. Chaput MA, Chalansonnet M. Recording the slow potentials evoked by odors in the olfactory mucosa of awake animals. // J Neurosci Methods. 1997. 75,193-198.

43. Chaput MA. EOG responses in anesthetized freely breathing rats. // Chem Senses. 2000. 25,695-701.

44. Chaudhari N, Landin AM, and Roper SD. A novel metabotropic glutamate receptor is a taste receptor for monosodium L-glutamate. // Nat.Neurosci. 2000. 3, 113-119.

45. Chen S, Lane AP, Bock R, Leinders-Zufall T, Zufall F. Bloking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by "ГРЗ-odors". // J Neurophysiol. 2000. 84, 55-580.

46. Chen T.-Y., Yau K.-W. Direct modulation by Ca2 + calmodulin of cyclic nucleotide- activated channel of rat olfactory receptor neurons //Nature. 1994. 368, 545-548.

47. Chess A., Simon I., Cedar H., and Axel R. Allelic inactivation regulates olfactory receptor gene expression. // Cell. 1994. 78, 823-834.

48. Cheesman GH, Kirkby HM. An air dilution olfactometer suitable for group threshold. // Quart J Elcp Psychop. 1959. 11, 115-123.

49. Clapp TR, Stone LM, Margolskee RF, bCinnamon SC. Immunocytochemical evidence for co-expression of Type Ш receptor with signaling components of bitter taste transduction. //Neuroscience. 2001. 6, 2-10.

50. Cometo-Muniz JE, Cain WS, Abraham MH. Quantification of chemical vapors in chemosensory research. //Chem Senses. 2003. 28, 467-477.

51. Cowan CM, Roskams AJ. Apoptosis in the mature and developing olfactory neuroepithelium. // Microsc Res Tech. 2002. 58, 204-215.

52. Daval G, Leveteau J, MacLeod P. Electro-olfactogramme local et discrimination olfactive chez la Grenouille. J Physiol (Paris). // 1970. 62,477-488.

53. Daval G, Leveteau J, MacLeod P. Analyse topographique de I'electro-olfactogramme chez la grenouille J Physiol (Paris). // 1980. 76, 559-567.

54. Day JA. Small droplets from rapturing air bubble films. // Rech Atmos. 1963.Г, 191-197.

55. Defer N, Best-Belpomme M, Hanoune J. Tissue specificity and physiological relevance of various isoforms of adenylyl cyclase. // Am J Physiol Renal Physiol. 2000. 279, 400-416.

56. Dravnieks A. Instrumental aspects of "olfactory research. // In: Methods in Olfactory Research (Moulton DG, Turk A, Jonllnston JW Jr., eds). // NY., Acad Press., 1975. 437.

57. Duchamp-Viret P, Chaput MA, Duchamp A. Odor response properties of rat olfactory receptor neurons. // Science. 1999. 284,2171-2174.

58. Dulac C, Torello AT. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. //Nat Rev Neurosci. 2003. 4, 551-562.

59. Eggermont J. Calcium-activated Chloride Channels. (Un)known, (Un)loved? // Proc Am Thorac Soc. 2003. 1, 22-27.

60. Eldering HG. The theory of optimum spectral filtering. // Infr.Phys. 1964. 4, 231-237.

61. Elsaesser R, Montani G, Tirindelli R, Paysan J. Phosphatidyl-inositide signalling proteins in a novel class of sensory cells in the mammalian olfactory. // Eur J NeuroSci. 2005. 21, 2692-2700.

62. Ezeh PI, Scott JW, Davis LM. Regional distribution of rat electroolfactogram. // J Neurophysiol. 1995.73,2207-2220.

63. Finger T, Bottger B, Hansen A, Anderson KT, Alimohammadi H, Silver WL. Solitary chemoreceptor cells in the nasal cavity serve as sentinels of respiration. // PNAS. 2003. 100, 8981-8986.

64. Firestein S, Shepherd GM, Werblin FS. Time course of the membrane current underlying sensory transduction in salamander ofactory receptor neurones. // J Physiol. 1990. 430, 135-158.

65. Firestein S, Shepherd GM. A kinetic model of the odor response in single olfactory receptor neurons. // J Steroid Biochem Mol Biol. 1991. 39, 615-620.

66. Firestein S, Werblin F. Odor-induced membrane currents in vertebrate olfactory receptor neurons. // Science. 1989. 244, 79-82.

67. Firestein S, Zufall F, Shepherd GM. Single odor sensitive channels in olfactory receptor neurons are also gated by cyclic nucleotides. // J.Neurosci. 1991. 11", 3565-3572.

68. Firestein S., Zufall F. The cyclic nucleotide gated channel of olfactory receptor neurons // Semin. Cell Biol. 1994. 5, 39-46.

69. Flaugh PL, O'Donnell SE, Asher SA. Development of a new optical wavelength rejection filters.//Appl.Spectrosc. 1984. 386, 847-850.

70. Friedrich RW, Korsching SI. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. // Neuron. 1997. 18, 737-752.

71. Frings S, Reuter D, Kleene SJ. Neuronal Ca -activated CI channels: homing in on an elusive channel species. // Prog Neurobiol. 2000.60, 247-289.

72. Getchell TV. Analysis of intracellular recordings from salamander olfactory epithelium. / /BrainRes . 1977. 123, 275-286.

73. Getchel TV, Shepherd GM. Adaptive properties of olfactory receptors analysed with odour pulses of varying durations. // J Physiol. 1978. 282, 541-560.

74. Getchell TV. Functional properties of vertebrate olfactory receptor neurons. // Physiol Rev. 1986. 66,772-818.

75. Getchell ML, Zielinski B, DeSimone JA, Getchell TV. Histological and histochemical studies of the secretory components of the salamander olfactory mucosa: effects of isoproterenol and olfactory nerve section. // J Comp Physiol. 1987.160,155-168.

76. Gibson AD, Garbers DL. Guanylyl cyclases as a family of putative odorant receptors. // Annu Rev Neurosci. 2000. 23, 417-439.

77. Gold GH. Controversial issues in vertebrate olfactory transduction. // Ann Rev Physiol. 1999.61,857-871.

78. Halpern M. The organization and function of the vomeronasal system. // Annu Rev Neurosci. 1987.10, 325-362.

79. Hayashi S, Hazama A, Dutta AK, Sabirov RZ, Okada Y. Detecting ATP release by a biosensor method. // Sci. STKE. 2004.258,114-119.

80. Haynes L, Yau KW. Cyclic GMP-sensitive conductance in outer segment membrane of catfish cones. //Nature. 1985. 317-6032,61-64.

81. Hazama A, Hayashi S, Okada Y. Cell surface measurements of ATP release from single pancreatic beta cells using a novel biosensor technique // Pflugers Arch. 1998. 437, 31-35.

82. Herness S, Zhao F, Kaya N, Lu S, Shen T, and Sun X. Adrenergic signalling between rat taste receptor cells. // J Physiol. 2002. 543, 601-614.

83. Holcomb JD, Mumm JS, Calof AL. Apoptosis in the neuronal lineage of the mouse olfactory epithelium: regulation in vivo and in vitro. // Dev Biol. 1995. 192, 307-323.

84. Hornung ЕЕ, Mozell MM. Factors influencing the differential sorption of odorant molecules across the olfactory mucosa. // J Gen Physiol. 1977. 69, 343-361.

85. Hosoya Y, Yoshida H. t-Fber die bioelektrische Erscheinung an der Riechschleimhaut. // Jpn J Med Sci Biol III Biophys. 1937. 5, 22-23.

86. Huang Y-J, Maruyama Y, Lu K-S, Pereira E, Plonsky I, Baur J.E, Wu D, Roper SD. Mouse taste buds use serotonin as a neurotransmitter // J. Neurosci. 2005. 25, 843-847.

87. Hume RI, Role LW, Fischbach GD. Acetylcholine release from growth cones detected with patches of acetylcholine receptor-rich membranes // Nature. 1983. 305,632-634.

88. Imanaka Y, Takeuchi H. Spiking Properties of Olfactory Receptor Cells in the Slice Preparation. // Chem Senses. 2001. 26, 1023-1027.

89. Ivic L, Pyrski MM, Margolis-JW, Richards LJ, Firestein S, Margolis FL. Adenoviral vector-mediated rescue of the OMP-null phenotype in vivo. // Nat Neurosci. 2000. 3, 1113-1120.

90. Jemiolo B, Harvey S, Novotny M. Promotion of the Whitten effect in female mice by synthetic analogs of male urinary constituents. // Proc. NatlAcad. Sci. USA. 1986. 83, 4576-4579.

91. Wachowiak M, Cohen LB. Representation of Odorants by Receptor Neuron Input to the Mouse Olfactory Bulb. //Neuron. 2001. 32, 723-735.

92. Jones DT, Masters SG, Bourne HR, Reed RR. Biochemical characterization of three stimulatory GTP-binding proteins. The large and small forms of Gs and the olfactory-specific G-protein, Golf. // J.Biol.Chem. 1990. 265, 2671-2676.

93. Jones DT, Reed RR. Golf. An olfactory neuron specific-G-protein involved in odorant signal transduction. // Science. 1989. 244,790-795.

94. Juilfs DM, FuUe H-J, Zhao AZ, Housley MD, Garbers DL, Beavo JA. A subset of olfactory neurons that selectively express cGMP-stimulated phosphodiesterase (PDE2) and guanylyl cyclase-D define a unique olfactory signal. // PNAS. 1977. 94, 3388-3395.

95. Jung A, Lischka FW, Engel J, Schild D. Sodium/calcium exchenger In olfactory raceptor neurones of Xenopus laevis. //Neuroreport. 1994. 5,1741-1744.

96. Kauer JS, White J. Imaging and coding in the olfactory system. // An Rev Neuro Sci. 2001.24,963-979.

97. Kaupp U.B. Family of cyclic nucleotide gated ion channels // Curr. Opin. Neurobiol. 1995. 5, 434-442.

98. Kaur R, Zhu XO, Moorhouse AJ, Barry PH. IP3-Gated Channels and their Occurrence Relative to CNG Channels in the Soma and Dendritic Knob of Rat Olfactory Receptor Neurons. // JMembrBiol . 2001.181,91-105.

99. Kawai K, Sugimoto K, Nakashima K, Miura H, and Ninomiya Y. Leptin as a modulator of sweet taste sensitivities in mice. // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. 97, 11044-11049.

100. Kent PF, Mozell MM, Murphy SJ, Hornung DE. The interaction of imposed and inherent olfactory mucosal' activity patterns and their composite representation in a mammalian species using voltage-sensitive dyes. // J Neurosci. 1996. 16,345-353.

101. Kent PF, Mozell MM. The recording of odorant-induced mucosal activity patterns with a voltage-sensitive dye. // J Neurophysiol. 1992. 68, 1804-1819.

102. Khayari A, Math F, Trotier D. Odorand-evoked potassium changes in the frog olfactory \ epithelium. // Brain Res. 1991. 539,1-5.

103. Kimbell JS, Godo MN, Gross EA, Joyner DR, Richardson RB, Morgan KT. Computer simulation of inspiratory airflow in all regions of the F344 rat nasal passages. // Toxicol Applied Pharmacol. 1997. 145, 388-398.

104. Kleene SJ. Origin of the chloride current in olfactory transduction // Neuron. 1993. 11, 123-132.

105. Kleene SJ. High-gain, low-noise amplification in olfactory transduction. // Biophys J. 1997.73,1110-1117.

106. Kolesnikov SS, Zhainazarov AB, Kosolapov AV. Cyclic nucleotide-activated channels in the frog olfactory receptor plasma membrane. // FEBS Lett. 1990. 266, 96-98.

107. Kramer RH, Siegelbaum SA. Intracellular Ca2+ regulates the sensitivity of cyclic nucleoti de-gated channels in olfactory receptor neurons. //Neuron. 1992. 9, 897-906.

108. Krautwurst D, Yau K-W, Reed RR. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. // Cell. 1998. 95, 917-926.

109. Kurakhashi T, Yau KW. Co-existence of cationic and chloride components in odorant- induced currant of vertebrate olfactory receptor cells. // Nature. 1993. 363, 71-74.

110. Kurakhashi T, Menini A. Mechanism of odorant adaptation in the olfactory receptor cell. //Nature. 1997. 385, 725-729.

111. Leinders-Zufall T, Ma M, Zufall F. Impaired odor adaptation in olfactory receptor neurons after inhibition of Ca /Calmodulin kinase II. // J Neurosci. 1999. 19,1-8.

112. Leinders-Zufall T, Rand MN, Shepherd GM, Greer CA, Zufall F. Calcium entry through cyclic nucleotide-gated channels in individual cilia of olfactory receptor cells: spatiotemporal dynamics. // J Neurosci. 1997.17,4136-4148.

113. Levy NS, Bakalyar HA, Reed RR. Signal transduction in olfactory neurons // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 39, 633-637.

114. Lide DR (ed). Handbook of Chemistry and Physics. // NY. «CRC-press», 1971. 761.

115. Lin W, Arellano J, Slotnick B, Restrepo D. Odors detected by mice deficient in cyclic nucleotide-gated channel subunit A2 stimulate the main olfactory system. // J Neurosci. 2004. 24, 3703-3710.

116. Lin W, Margolskee R, Donnert G, Hell SW, Restrepo D. Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals. // PNAS. 2007. 104, 2471-2476.

117. Lischka FW, Zviman MM, Teeter JH, Restrepo D. Characterization of Inositol-1,4,5- Trisphosphate-Gated Channels in the Plasma Membrane of Rat Olfactory Neurons. // Biophys J. 1999. 76,1410-1422.

118. Liu D, Liman ER. Intracellular Ca2+ and the phospholipids PIP2 regulate the taste transduction ion channel TRPM5. // Proc Natl Acad Sci USA. 2003.100,15160-15165.

119. Lowe G, Gold GH. The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells. // J Physiol. 1991. 442, 147-168.

120. Lucas Ph, Ukhanov K, Vrese Leinders-Zufall T, Zufall F. A Diacylglycerol-Gated Cation Channel in Vomeronasal Neuron Dendrites Is Impaired in TRPC2 Mutant Mice: Mechanism of Pheromone Transduction. //Neuron. 2003. 40, 551-561.

121. Mackay-Sim A, Kesteven S. Topographic patterns of responsiveness to odorants in the rat olfactory epithelium. // J Neurophysiol. 1994. 71, 150-160.

122. Mackay-Sim A, Shaman P, Moulton DG. Topographic coding of odorant quality: patterns of epithelial responsivity in the salamander. // J Neurophysiol. 1982. 48, 584-596.

123. Mackay-Sim A, Shaman P. Topographic coding of odorant quality is maintained at different concentration in the salamander olfactory epithelium. // Brain Res. 1984. 297, 207-216.

124. Marchand J.E., Yang X., Kauer J.S. Zonal expression patterns of olfactory receptors in salamander epithelium using gene specific probes. // Chem Senses. 2001. 26,1044.

125. Morimoto T, Popov S, Buckley KM, Poo MM. Calcium-dependent transmitter secretion from fibroblasts: modulation by synaptotagmin I. //Neuron. 1995. V. 15. P. 689-696.

126. Masukawa LM, Kauer JS, Shepherd GM. Intracellular recordings from two cell'types in an in vitro preparation of the salamander olfactory epithelium. // Neurosci Lett. 1983. 35, 59-64.

127. Mombaerts P. Mollecular biology of odorant receptors in vertebrates. // An Rev Neuro Sci. 1999. 22,487-509.

128. Mombaerts P, Wang F, Dulac C, Chao SK, Nemes A, Mendelsohn M, Edmondson J, Axel R. Visualizing an olfactory sensory map. // Cell. 1996. 87, 675-686.

129. Morimoto T, Popov S, Buckley KM, Poo MM. Calcium-dependent transmitter secretion from fibroblasts: modulation by synaptotagmin I // Neuron. 1995. 15, 689-696.-

130. Moulton DG, Beidler LM. Structure and function in the peripheral olfactory system. // Physiol Rev. 1967.47,1-52.

131. Mozell MM. Olfactory mucosal and neural responses in the frog. // Am J Physiol. 1962. 203, 353-358.

132. Mozell MM. Evidence for sorption as a mechanism of the olfactory analysis of odors. // Nature. 1964. 203,1181-1182.

133. Mozell MM. Evidence of a chromatographic model of olfaction. // J Gen Physiol. 1970. 56,46-63.

134. Mustaparta H. Spatial distribution of receptor-responses to stimulation with different odours. //Acta Physiol Scand. 1971. 82,154-166.

135. Nakamura Г., Gold G.H. A cyclic nucleotide-gated conductance in olfactory receptor cilia//Nature. 1987. 325, 442-444.

136. Ngai J, Dowling MM, Buck L, Axel R, Chess A. The family of genes encoding odorant receptors in the channel catfish. // Cell. 1993. 72, 657-666.

137. Noe J, Tareikis, E, Boekhoff I, Breer H. Sodium/calcium exchenger in rat olfactory neurons. // Neurochem Int. 1997. 30, 523-531.

138. Ogura T. Acetylcholine increases intracellular Ca in taste cells via activation of muscarinic receptors. // J Neurophysiol. 2002. 87, 2643-2649.

139. Okano M, Takagi SF. Secretion and electrogenesis of the supporting cell in the olfactory epithelium. // J Physiol. 1974. 242, 353-370.

140. Ottoson D. Analysis of the electrical activity of the olfactory epithelium. // Acta Physiologica Scandinavica. 1956. 35 (122), 1-83.

141. Ottoson, D. The electro-olfactogram: A review of studies on the receptor potential of the olfactory organ. // In: Handbook of sensory physiology V.4. (Beidler LM, ed). Berlin, Springer-Verlag, 1971. 95-131.

142. Parmentier M, Libert F, Schurmans S, Schiffmann S, Lefort A, Eggerickx D, Ledent C, Mollereau C, Gerard C, Perret J. Expression of members- of the putative olfactory in mammalian cells. //Nature. 1992. 355, 453-455.

143. Paysan J, Breer H. Molecular physiology of odor detection: current views. // Eur J Physiol. 2001. 411, 579-586.

144. Pifferi S. Pascarella G, Boccaccio A, Mazzatenta A, Gustincich S, Menini A, Zucchelli S. Bestrophin-2 is a candidate calcium-activated chloride channel involved in olfactory transduction. //PNAS. 2007.103,12929-12933.

145. Potter H, Chorover SL. Response plasticity in hamster olfactory bulb: peripheral and central processes.//Brain-Res. 1976.116,417-429.

146. Prawitt D, Monteilh-Zoller MK, Brixel L, Spangenberg C, Zabel B, Fleig A, Penner R. TRPM5 is a transient Ca2+-activated cation channel responding to rapid changes in Ca2+.i.//PNAS.2003. 100, 15166-15171.

147. Reisert J, Bauer PJ,' Yau K-W, Frings S. The Ca-activated CI channel and its control in rat olfactory receptor neurons. // J Gen Physiol. 2003. 122, 349-364.

148. Reisert J, Matthews HR. Na+-dapandant Ca + extrusion governs response.recovery in frog olfactory, racaptor calls. // J Gen Physiol. 1998. 112, 529-535.

149. Reisert J, Yaul K-W, Margolis FL. Olfactory marker protein modulates the cAMP kinetics of the odour-induced response in cilia of mouse olfactory receptor neurons. // J Physiol. 2007. 585, 731-740.

150. Ressler KJ, Sullivan SL, Buck LB. A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactory epithelium. // Cell. 1993. 73, 597-609.

151. Ressler KJ, Sullivan SL, Buck LB. Information coding in the olfactory system: Evidence for a stereotyped and highly organized epitope map in the olfactory bulb. // Cell. 1994. 79, 1245-1255.

152. Restrepo D., Miyamoto Т., Bryant B.P., Teeter J.H. Odor stimuli trigger influx of calcium into olfactory neurons of the channel catfish // Science. 1990. 249,1166-1168.

153. Restrepo D., Okada Y., Teeter J.H. Odorant-regulated* Ca2 + gradietns in rat olfactory neurons // J. Gen. Physiol. 1993. 102, 907-924.

154. Romanov RA, Rogachevskaja OA, Bystrova MF, Jiang P, Margolskee RF, Kolesnikov SS. Afferent neurotransmission mediated by hemichannels in mammalian taste cells // EMBO J. 2007. 26, 657-667.

155. Ronnett GV, Parfitt DJ, Hester LD, Snyder SH. Odorant-sensitive adenilate cyclase: rapid, potent activation and desensitization in primary olfactory neuronal cultures. // PNAS. 1991. 88, 2366-2369.

156. Sbarbati F Osculati A. The taste cell-related diffuse chemosensory system. // Progress in Neurobiology. 2005/ 75, 295-307.

157. Sbarbati A, Merigo F, Benati< D, Tizzano M, Bernard! P, Crescimanno C, Osculati F. Identification and characterization of a specific sensory epithelium in the rat larynx. // J Comp Neurol. 2004. 475,188-201.

158. Scalia F, Winans SS. The differential projections of the olfactory bulb and the accessory olfactory bulb in mammals. // J Comp Neurol. 1975. 161, 31-55.

159. Scherberger RF, Happ GP, Miller FA, Fasset DW. A dynamic apparatus for preparing air-vapor mixtures of known concentrations. // Ind Hyg J. 1958. 19,494-498.

160. Schild D, Restrepo D. Transduction Mechanisms in Vertebrate Olfactory Receptor Cells. // Physiol.Rev. 1998. 78,429-466.

161. Schwartz EA. Depolarization without calcium can release gamma-aminobutyric acid from a retinal neuron // Science. 1987. 238, 350-355.

162. Scott JW, Brierley T. A functional map in rat olfactory epithelium. // Chem Senses. 1999. 24, 679-690.

163. Scott JW, Davis LM, Shannon D, Kaplan C. Relation of chemical structure to spatial distribution of sensory responses in rat olfactory epithelium. // J Neurophysiol. 1996. 75, 2036-2049.

164. Scott JW, Scott-Johnson PE. The electrolfactogram: A review of its history and uses. // Microsc Res Tech. 2002. 58,152-160.

165. Scott JW, Shannon DE, Charpentier J, Davis LM, Kaplan С Spatially organized response zones in rat olfactory epithelium. // J Neurophysiol. 1997. 77, 1950-1962.

166. Scott-Johnson PE, Blakley D, Scott JW. Effects of air flow on rat electroolfactogram. // Chem Senses. 2000. 25, 761-768.

167. Sipior J, Carter GM, Lakowicz JR, Rao G. Blue light-emithing diode demonstrated as an ultraiolet excitation source for nanosecund phase-modulation fluorescence lifetime measurements. // Rev.Sci.Instrum. 1997. 68, 2666-2670.

168. Sklar, P.D., Anholt, R.H. & Snyder, S.H. The odorant-sensitive adenylate cyclase of olfactory receptor cells: different stimulation by distinct classes of odorants. // J.Biol.Chem. 1986. 261,15538-15543.

169. Spehr M, Spehr J, Ukhanov K, Kelliher KR, Leinders-Zufall T, and Zufall F. Parallel processing of social signals by the mammalian main and accessory olfactory systems. // Cell Mol Life Sci. 2002. 63,1476-1484.

170. Stewart WB, Kauer JS, Shepherd GM. Functional organization of rat olfactory bulb analyzed by the 2-deoxyglucose method. // J. Сотр. Neurol. 1979.185,715-734.

171. Tachibana M, Okada T. Release of endogenous excitatory amino acids from ON-type bipolar cells isolated from the goldfish retina. // J. Neurosci. 1991. 11, 2199-2208.

172. Thommesen G, Doving KB. Spatial distribution of the EOG in the rat; a variation with odour quality. // Acta Physiol Scand. 1977. 99, 270-280.

173. Trinh K, Storm DR. Vomeronasal organ detects odorants in absense of signaling through main olfactory system. //Nat Neurosci. 2003. 6, 519-525.

174. Trotier D, MacLeod P. Intracellular recordings from salamander olfactory receptor cell. // Brain Res. 1986. 374, 205-211.

175. Trotier D. Electrophysiological properties of frog olfactory supporting cells. // Chem Senses. 1998. 23, 363-369.

176. Tucker D, Shibuya T. A physiologic and pharmacologic study of olfactory receptors. // Cold Spr Harb Symp Quant Biol. 1965. 30,206-215.

177. Ussing HH, Zerahn K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. // Acta Physiol Scand. 1951. 23,110-127.

178. Van As W, Kauer JS, Menco BPM, Koster EP. Quantitative aspects of the electro- olfactogram in the tiger salamander. // Chem Senses. 1985. 10,1-21.

179. Vassar R, Ngai J, Axel R. Spatial segregation of odorant receptor expression- in- the mammalian olfactory epithelium. // Cell. 1993. 74, 309-318.

180. Vogalis F, Hegg CC, Lucero MT. Ionic conductances in sustentacular cells of the mouse olfactory epithelium. // J Physiol. 2005. 562(3), 785 - 799.

181. Wayman GA, Impey S, Storm DR. Ca2+ inhibition of type Ш adenylyl cyclase in vivo. // J. Biol. Chem. 1995. 270 , 21480-86.

182. Wei J, Wayman GA, Storm DR. Phosphorylation and inhibition f type Ш adenylyl cyclase b calmodulin-dependent protein kinase П in vivo. // J Biol Chem. 1996. 271, 24231-24235.

183. Wong ST, Trinh K, Hacker B, Chan GCK, Lowe G, Gaggar A, Xia Z, Gold GH, Storm DR. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in trans-genic mice. Neuron. 2000. 27, 487-497.

184. Yan C, Zhao AZ, Bentley JK, Lougheny K, Ferguson K, Beavo JA. Molecular cloning and characterisation of a calmodulin-dependent phosphodiesterase enriched in olfactory sensory neurons. //PNAS. 1995. 92, 9677-9681.

185. Young SH, Poo M. Spontaneous release of transmitter from growth cones of embryonic neurones //Nature. 1983. 305, 634-637.

186. Youngentob SL , Margolis FL. OMP gene deletion causes an elevation in behavioral threshold sensitivity. //Neuroreport. 1999. 10,15-19.

187. Youngentob SL, Kent PF, Sheehe PR, Schwob JE, Tzoumaka E. 1995. Mucosal inherent activity patterns in the rat, Evidence from voltage-sensitive dyes. // J Neurophysiol. 73, 387-398.

188. Youngentob SL, Kent PF. Enhancement of odorant-induced mucosal activity patterns in rats trained on an odorant identification task. // Brain Res. 1995. 670, 82-88.

189. Youngentob SL, Margolis FL, Youngentob LM. OMP gene deletion results in an alteration in odorant quality perception. //Behav Neurosci. 2001. 115, 626-631.

190. ZagottaWN, Sigelbaum SA. Structure and function of cyclic nucleotide-gated channels. // Annu.Rev.Neurosci. 1996. 19, 235-263.

191. Zhang Y, Hoon MA, Chandrashekar J, Mueller KL, Cook B, Wu D, Zuker CS, Ryba NJP. Coding of sweet, bitter, and umami tastes, Different receptor cells sharing similar signaling pathways. // Cell. 2003. 112, 293-301.

192. Zufall F, Leinders-Zufall T. Identification of a long-lasting form of odor adaptation that depends on the carbon monoxide/cGMP second-messenger system. // J Neurosci. 1997. 17, 2703-2712.