Сигнальные белки хемосенсорных клеток млекопитающих тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, доктор биологических наук Быстрова, Марина Федоровна

• Быстрова, Марина Федоровна
• доктор биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации доктор биологических наук Быстрова, Марина Федоровна

Введение.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Вкусовая система.

1.1.1 Структурная и клеточная организация периферического вкусового органа.

1.1.2 Межклеточные коммуникации во вкусовой почке.

1.1.3 Пуринергическая сигнальная система.

1.1.4 Рецептор экстраклеточного кальция.

1.1.5 Ионные каналы.

1.2. Хемосенсорные клетки главного обонятельного эпителия.

1.3. Редокс-сигнализация.

1.3.1.Тиоловые группы белков являются сенсорами Н202 в клетке.

1.3.2. Н2О2 модулирует активность тирозиновых протеинкиназ и фосфатаз.

1.3.3. Перекись водорода как вторичный посредник.

1.3.4. Н2О2 и принцип специфичности в сигнальной трансдукции.

1.3.5. Пероксиредоксины в редокс-регуляции внутриклеточной сигнализации.

1.4. Стохастический характер экспрессии генов.

Глава И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1П.1. Исследование сигнальных белков вкусовых клеток на уровне ткани.

III. 1.1. Пуринергическая сигнальная система.

III. 1.2. Фосфолипазы вкусовых клеток.

III. 1.3. Анализ экспрессии во вкусовой ткани генов, кодирующих ai-субъединицу Са" -каналов L-типа.

III. 1.4. Исследование АТФ-проницаемые ионных каналов.

III. 1.5. Идентификация во вкусовой ткани гептаспиральных рецепторов аминокислот.

111.2. Исследование локализации обонятельного маркерного белка в тканях с эктопической экспрессией генов обонятельных рецепторов.

111.3. Исследование белок-белковых взаимодействий.

111.3.1. Исследование белок-белковых взаимодействий в обонятельном эпителии крысы с помощью биохимических методов

111.3.2. Поиск белковых партнеров пероксиредоксина 6 с помощью скрининга двухгибридной клонотеки Hybrid Hunter.

IH.3.3. Анализ обнаруженных белок-белковых взаимодействий.

111.4. Исследование одиночных хемосенсорных клеток.

III.4.1. Анализ экспрессии генов в одиночных вкусовых клетках.

III.4.1.1. Применение стратегии линейной амплификации РНК для анализа' экспрессии генов в одиночных вкусовых клетках типа II.

III.4.1.2 Применение стратегии экспоненциальной амплификации кДНК для анализа экспрессии генов в одиночных вкусовых клетках трех типов.

111.4.2. Анализ экспрессии генов в одиночных обонятельных нейронах.

III.4.2.1. Оптимизация метода амплификации РНК для анализа на уровне одиночных клеток экспрессии генов, имеющих процессированные псевдогены-ортологи.

111.4.3. Анализ обнаруженной клеточной гетерогенности.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сигнальные белки хемосенсорных клеток млекопитающих»

Вкус и обоняние наряду со зрением, осязанием и слухом составляют пять основных чувств, которые обеспечивают позвоночным жизненно важную информацию об окружающем мире. Базовой функцией вкусовой системы является оценка качества пищи и ее съедобности. В отличие от человека, для которого основной информационный канал обеспечивается зрением, у животных от беспозвоночных до млекопитающих преимущественно обоняние детерминирует пищевые, защитные и репродуктивные поведенческие реакции.

Обонятельная система животных способна детектировать тысячи запахов в широчайшем диапазоне концентраций- с чувствительностью, предполагающей, что связывание одиночных молекул пахучего вещества на поверхности обонятельных цилий вызывает физиологически, значимые ответы. Способность обонятельной системы распознавать широкое многообразие стимулов в значительной степени опосредована большим количества молекулярных рецепторов запахов. Достаточно сказать, что гены этих рецепторов составляют самое большое семейство в геномах позвоночных. С молекулярной точки зрения вкусовая система кажется намного проще. Имеется всего пять базовых модальностей вкуса - горький, сладкий, соленый, кислый и умами, и вкусовые вещества распознаются весьма небольшим количеством молекулярных рецепторов. К настоящему моменту идентифицированы около 30 относительно специализированных рецепторов горького, один универсальный рецептор сладкого и один универсальный рецептор аминокислот. Несколько ионных каналов рассматриваются как рецепторы соленых и кислых стимулов. Тем не менее, по сравнению с обонятельной системой, механизмы детекции вкусовых стимулов, а главное принципы кодирования вкусовой информации, изучены гораздо слабее. Распознавание химического стимула - молекулы запаха или вкусового вещества - сенсорными системами животных представляет собой сложнейший процесс, который начинается со связывания молекулы вещества на поверхности специализированных хемосенсорных клеток, вовлекает внутриклеточные системы усиления сигнала и кодирования-сенсорной информации в виде электрического импульса и заканчивается анализом информации в мозге. Определяющими в этой цепочке являются разнообразные рецепторные, сигнальные и канальные белки, исследованию которых посвящена данная диссертация. Попытки понять физиологию периферического вкусового анализатора показали, что клетки вкусовой почки коммуницируют между собой. Это делает актуальным вопрос, какие молекулярные механизмы лежат в основе этих коммуникаций и какие сигнальные системы вовлечены в эти процессы. В настоящее время считается установленным, что АТФ является афферентным нейротрансмиттером и ключевой сигнальной молекулой в паракринных регуляциях во вкусовой почке. Это делает актуальной задачу выяснения рецепторных механизмов детекции экстраклеточного АТФ во вкусовой почке и механизмов секреции АТФ. Помимо АТФ* идентифицирован ряд других нейротрансмиттеров, в том числе серотонин, FAMK, норадреналин, нейропептид У. Сигнальная роль этих молекул во вкусовой- почке фактически неизвестна. Однако с помощью, различных подходов было показано, что эти молекулы высвобождаются при возбуждении вкусовой почки. В частности, есть данные, что за высвобождение серотонина и норадреналина ответственны клетки типа III. Какие клетки высвобождают остальные молекулы неизвестно.

Большой вклад в понимание процесса вкусовой трансдукции внесли физиологические исследования на трансгенных и нокаутных животных, которые показали, что рецепторы семейства T1R ответственны за восприятие сладких стимулов и аминокислот, а рецепторы T2R детектируют горькие вещества. Между тем, генетический нокаут белков T1R1/T1R3, которые образуют гетеродимерный рецептор аминокислот, не приводит к полной потери чувствительности этой модальности. Тоже самое характерно для T1R2/T1R3 - сладкочувствующего рецептора. Это делает актуальным исследование альтернативных механизмов восприятия периферической вкусовой системой стимулов указанных вкусовых категорий.

В последние годы, с выявлением роли пероксида водорода как вторичного посредника, запускающего редокс-чувствительные процессы фосфорилирования-дефосфорилирования в клетке, все более актуальной становится задача изучения белков пероксиредоксинов, вовлеченных в процесс редокс-регуляции внутриклеточной сигнализации, и выявления роли этих белков в функционировании хемосенсорных клеток. Это тем более важно, поскольку популяции обонятельных нейронов и вкусовых клеток постоянно обновляются из прогениторных клеток. Процессы дифференцировки контролируются разнообразными ростовыми факторами, в развитии эффектов которых ключевую роль играет редокс-сигнализация. Ранее в обонятельном эпителии крысы был идентифицирован один белок из семейства пероксиредоксинов — Ргхб. Присутствуют ли остальные представители этого семейства в обонятельном эпителии и, в» частности, в обонятельных нейронах, не было известно. Кроме того; на уровне одиночной клетки ко-локализация или дифференцированная экспрессия представителей этого семейства никогда не исследовалась ни для каких клеточных систем.

Объектом исследования данной работы были обонятельные сенсорные нейроны главного обонятельного эпителия и вкусовые клетки, входящие в состав вкусовых почек желобоватого, листовидного и грибовидного сосочков языка. Анализ физиологических процессов в периферических сенсорных органах затруднен тем, что исследователь сталкивается с гетерогенной клеточной популяцией. Во вкусовой почке идентифицировано три морфологически различных типа клеток, среди которых также имеются дифференцирующиеся, зрелые и апоптотические. Фактически, эта клеточная система еще более гетерогенна на функциональном и молекулярном уровне. Вкусовая ткань организована в виде гетерогенных включений в эпителиальную и мышечную ткани, так что выделение функциональных вкусовых клеток - весьма тонкая и трудно воспроизводимая процедура. Выделение обонятельных нейронов из ткани обонятельного эпителия, в котором также присутствуют опорные и базальные клетки, также достаточно сложная задача. Между тем многие детали вкусовой и обонятельной трансдукции требуют анализа индивидуальных хемосенсорных клеток. Работы по исследованию сигнальных белков, вовлеченных в трансдукцию вкусовых и обонятельных стимулов, ведутся, как правило, на ткани, группе клеток, клеточной культуре. Однако невозможно получить представление об индивидуальной клетке, оценивая клеточную популяцию, поскольку в результате мы получаем усредненную информацию о вероятном состоянии «среднестатистической» клетки, а поведение единичных клеток может совершенно отличаться от популяционного большинства. Поэтому актуальной является задача разработки подходов, которые позволили» бы исследовать сигнальные системы на уровне одиночных хемосенсорных клеток.

Цель работы состояла в молекулярной идентификации белков, вовлеченных в сигнальные процессы в хемосенсорных клетках.

В процессе выполнения диссертационной работы решались следующие задачи:

1. Идентифицировать на уровне транскриптов (ОТ-ПЦР) и на уровне белков (иммуногистохимия и иммуноцитохимия) некоторые рецепторные (P2Y, CASR, GPRC6A, T1R), сигнальные (гастдуцин, фосфолипазы) и канальные (TRPM5, Caví, коннексины, паннексин 1) белки, вовлеченных в сигнальные процессы во. вкусовых клетках.

2. Отработать методологические подходы для анализа одиночных хемосенсорных клеток, которые позволили бы изучить профиль транскрипции генов в функционально-идентифицированных вкусовых клетках и обонятельных нейронах. Как дополнение электрофизиологического портрета клетки необходимо было создать ее молекулярный портрет.

3. Исследовать белок-белковые взаимодействия в обонятельном эпителии крысы с использованием в качестве «наживки» белка из семейства пероксиредоксинов, вовлеченных в процессы редокс-регуляции внутриклеточной сигнализации.

4. Провести исследования по локализации обонятельного маркерного белка в тканях с эктопической экспрессией генов обонятельных рецепторов.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Быстрова, Марина Федоровна

Выводы.

1. Во вкусовой почке мыши пуринергическая сигнализация происходит при участии множественных метаботропных пуринорецепторов, включая Р2У1, Р2У2, Р2У4 и Р2У6.

2. Анализ экспрессии во вкусовой ткани генов, кодирующих а]-субъединицу СаГ -каналов Ь-типа выявил транскрипты а!С и аЮ при существенно более высоком уровне экспрессии а1С.

3. Разработана методология анализа экспрессии генов в одиночных хемосенсорных клетках, основанная на глобальной амплификации мРНК. Сформирована стратегия экспрессионного анализа генов, имеющих процессированные псевдогены или не содержащих интроны, на уровне одиночных клеток.

4. На уровне одиночных вкусовых клеток получены профили ко-экспрессии генов, кодирующих ряд рецепторных (САБЯ, ОРЯСбА, Т1Ю), сигнальных (гастдуцин, РЬС|32), канальных (ТИРМ5, РКХ)2Ь1, коннексины, паннексин 1) и маркерных белков (ШТ02, 8КАР-25). Показано, что транскрипты рецептора САБЯ локализованы в клетках типа I и III, транскрипты рецептора ОРЯСбА присутствуют исключительно в клетках типа I, а клетки типа II не содержат транскриптов этих рецепторов.

5. Получены прямые доказательства соответствия электрофизиологического и молекулярного «портретов» одиночных вкусовых клеток.

6. На уровне одиночных обонятельных нейронов выявлены многочисленные вариации в репертуаре транскриптов, кодирующих белки семейства пероксиредоксинов.

7. Предложено объяснение обнаруженной клеточной гетерогенности в контексте концепции стохастической экспрессии генов.

8. Специфический маркер зрелых обонятельных нейронов, обонятельный маркерный белок, обнаружен в клетках вкусовых почек желобоватого сосочка языка.

9. Выявлены новые потенциальные партнеры по взаимодействию с пероксиредоксином 6; все они оказались редокс-чувствительными белками.

Заключение.

Цикл работ, представленных в диссертации, посвящен исследованию белков, вовлеченных в сигнальные процессы во вкусовых клетках и обонятельных нейронах. Особое внимание мы уделили тиол-зависимым пероксидазам, пероксиредоксинам, участвующим в редокс-регуляции внутриклеточной сигнализации. Для обонятельных нейронов этот вид сигнализации имеет особое значение, поскольку постоянное обновление этих клеток из прогениторных клеток происходит под влиянием многочисленных факторов роста, в трансдукции сигналов которых перекиси водорода отводится роль вторичного посредника. Пероксиредоксины выполняют две функции - пероксидазную и сигнальную, реализация которых в клетке может происходить за счет белок-белковых взаимодействий. Мы выявили новые потенциальные партнеры по взаимодействию с пероксиредоксином 6 в обонятельном эпителии крысы. Интересно, что все они оказались редокс-чувствительными белками. Мы предложили механизм, посредством которого белок-белковые взаимодействия могут затрагивать функциональную активность пероксиредоксина 6 in vivo.

Сигнальные белки в данной работе изучались на уровне ткани, группы клеток, одинаковых по своим электрофизиологическим характеристикам, и, наконец, нам удалось добиться разрешения на уровне одиночной клетки. В ходе работы была разработана методология анализа экспрессии генов в одиночных хемосенсорных клетках, основанная на глобальной амплификации мРНК. Сравнительный анализ методов экспоненциальной и линейной амплификации применительно к исследованию одиночных хемосенсорных клеток показал, что экспоненциальная амплификация имеет преимущества в чувствительности и методологической простоте.

Целесообразность проведения исследований по экспрессионному анализу, прежде всего, диктовалась результатами электрофизиологического анализа одиночных клеток. В результате мы дополнили электрофизиологический «портрет» хемосенсорной клетки ее «молекулярным» портретом. Анализ экспрессии генов в одиночных клетках позволяет получить их «молекулярный портрет», и мы представили убедительные доказательства, что на уровне популяции эти портреты чрезвычайно отличаются.

Проведение исследований одновременно на группе клеток и на одиночных клетках позволили сделать вывод о том, что результаты анализа одиночных клеток нуждаются в особой интерпретации. Например, согласно центральной догме молекулярной биологии направление передачи информации ген — мРНК - белок диктует, что если в образце есть белок, то должна быть и кодирующая его мРНК. Это условие непременно выполняется на уровне клеточной популяции, ткани или группы клеток. Однако является ли оно безусловным применительно к измерениям, сделанным на уровне одиночных клеток? Дискретный характер передачи информации в системе экспрессии генов, отличающейся би-стабильностыо, а также продолжительность жизни белков, намного превышающая время жизни мРНК, определяют такие моменты в клеточном цикле, когда при наличии в клетке белка кодирующая его мРНК может отсутствовать. При попытке объяснить обнаруженные клеточные вариации в паттернах экспрессии мы обратились к концепции стохастической экспрессии генов. Базируясь на этой концепции, мы выдвинули предположение, что индивидуальная клетка имеет вероятностный фенотип в том смысле, что в различные моменты времени она содержит различные комбинации транскриптов, ко-экспрессия которых детектируется в контрольных экспериментах на уровне популяции или группы клеток. Хотя в работе исследовались исключительно вкусовые клетки и обонятельные нейроны, ее результаты позволили увидеть проявление феномена общебиологического характера, а именно клеточную гетерогенность. Гетерогенность является фундаментальным свойством биологических систем. Но какие основания есть для этого утверждения применительно к клеткам, тем более у исследователей, работающих с клеточной популяцией, культурой, тканью? Усредненные измерения, сделанные на группе клеток, могут отражать признаки большинства клеток этой группы, но при этом терять признаки, свойственные единичным клеткам, которые как раз могут иметь особое функциональное значение. Кроме того, при усредненных измерениях неизбежно теряется информация, которая может быть зашифрована в клеточной гетерогенности. Результаты диссертации ставят новую интересную задачу ее интерпретации.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Быстрова, Марина Федоровна, 2011 год

1. Авдонин П.В. (2005) Структура и сигнальные свойства сопряженных с G-белками рецепторных комплексов. //Биологические мембраны.

2. Авдонин ПВ, Ткачук ВА. Рецепторы и внутриклеточный кальций. М., Наука. 1994.288.

3. Рогачевская О.А., Романов Р.А., Яценко Ю.Е., Колесников С.С. (2010) Межклеточные коммуникации во вкусовой почке мыши. Ацетилхолин как возможный посредник. //Биологические мембраны,27, №1, 114-120.

4. Романов Р.А., Хохлов А.А., Быстрова М.Ф. Яценко Ю.Е., Рогачевская О.А., Колесников С.С.(2007) Мониторинг выброса АТР из одиночных клеток. Метод биосенсора.// Биологические мембраны 24, 316-321.

5. Торчинский Ю.М. Сульфгидрильные и дисульфидные группы белков.// Наука, М., 1971,229с.

6. Abaffy Т, Trubey KR, Chaudhari N. (2003) Adenylyl cyclase expression and modulation of cAMP in rat taste cells. // Am J Physiol Cell Physiol. 284(6), C1420-8.

7. Ache B.W. (2010) Odorant-Specific Modes of Signaling in Mammalian Olfaction //Chem. Senses 35: 533-539.

8. Adler E, Hoon MA, Mueller KL, Chandrashekar J, Ryba NJP, and Zuker CS. // Cell. 2000.10,693-702.

9. Airey JA, Grinsell MM, Jones LR, Sutko JL, and Witcher D.(1993) Three ryanodine receptor isoforms exist in avian striated muscles. // Biochemistry. 32, 5739-5745.

10. Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson JD Molecular biology of the cell. 3rd Edition, Edited by Robertson M, New York, Garland Publishing, Inc., 1994

11. Arkin A, Ross J, McAdams HH (1998) Stochastic kinetic analysis of developmental pathway bifurcation in phage lambda-infected Escherichia coli cells. //Genetics 149, 1633-1648.

12. Arya R, Mallik M, Lakhotia SC. Heat shock genes-integrating cell survival and death. J Biosci. 2007. 32, 595-610

13. Axel, R. (1995) The molecular logic of smell. //Scientific America 273, 154-159.

14. Bae Y.S., Kang S.W., Seo M.S., Baines I.C., Tekle E., Chock P.B., Rhee S.G. Epidermal growth factor (EGF)-induced generation of hydrogen peroxide. (1997) Role in EGF receptor-mediated tyrosine phosphorylation // J. Biol. Chem. 272. 217-221.

15. Bar I, Guns PJ, Metallo J, Cammarata D, Wilkin F, Boeynams JM, Bult H, Robaye B.(2008) Knockout mice reveal a role for P2Y6 receptor in macrophages, endothelial, cells, and vascular smooth muscle cells.// Mol Pharmacol. 74(3), 777-84.

16. Barford D. (2004) The role of cysteine residues as redox-sensitive regulatory, switches.// Curr Opin Struct Biol. 14, 679-686. /

17. Bartel D.L., Sullivan S.L., Lavoie E.G., Sevigny J., Finger Т.Е. (2006) Nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-2 is the ecto-ATPase of type I cells in taste buds.// J Comp Neurol, 497, 1-12.

18. Barford D (2004) The role of cysteine residues as redox-sensitive regulatory switches.// Curr Opin Struct Biol 14: 679-686.

19. Baryshnikov SG, Rogachevskaja OA, Kolesnikov SS. Calcium signaling mediated by P2Y receptors in mouse taste cells. // J Neurophysiol. 2003. 90, 3283-3294.

20. Becskei A., Kaufmann B.B., van Oudenaarden A. (2005) Contributions of low molecule number and chromosomal positioning to stochastic gene expression.// Nat. Genet. 37, 937-944.

21. Belyavsky, A, Vinogradova, Т., and Rajewsky. R. (1989) PCR based cDNA library construction: General cDNA libraries at the level of a few cells.// Nucleic Acids Res. 17, 2919-2933.

22. Bengtsson M, Stahlberg A, Rorsman P, Kubista M. (2005) Gene expression profiling in single cells from the pancreatic islets of Langerhans reveals lognormal distribution of mRNA levels// Genome Res. 15, 1388-1392.

23. Benzer S (1953) Induced synthesis of enzymes in bacteria analyzed at the cellular level. // Biochim Biophys Acta. 11, 383-395.

24. Berridge MJ, Lipp P, and Bootman MD. (2000) The versatility and universality of calcium signaling. //Nature Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21.

25. Berridge MJ. (1995) Capacititive calcium entry. // Biochemical J. 312, 1-11.

26. Biel M, Zong X, Ludwig A, Sautter A, Hofmann F.(1999) Structure and function of cyclic-nucleotide-gated channels. // Rev PhysiolBiochem Pharmacol. 135, 151-171.

27. Blake WJ, Kaern M, Cantor CR, Collins JJ. (2003) Noise in eukaryotic gene expression.//Nature, 422, 633-637.

28. Blake WJ, Balazsi G, Kohanski MA, Isaacs FJ, Murphy KF, Kuang Y, Cantor CR, Walt DR, Collins J.J. (2006) Phenotypic consequences of promoter-mediated transcriptional noise.//Mol Cell 24, 853-865.

29. Blaustein MP, Lederer WJ. (1999) Sodium/calcium exchange: its physiological implications. Physiol Rev. 79(3), 763-854.

30. Bo X, Alavi A, Xiang Z, Oglesby I, Ford A, Burnstock G (1999) Localization of ATP-gated P2X2 and P2X3 receptor immunoreactive nerves in rat taste buds. //NeuroReport. 10,1107-1111.

31. Bodin P, Burnstock G.(2001) Purinergic signalling: ATP release. // Neurochem Res. 26(8-9), 959-69.

32. Boison D, Chen J-F, Fredholm BB (2010) Adenosine signaling and function in glial cells //Cell Death and Differentiation 17, 1071-1082.

33. Brady, G., Barbara, M., and Iscove, N. N. (1990) Representative in vitro cDNA amplification from individual hemopoietic cells and colonies.// Methods in Molecular and Cellular Biology, 2,11-25.

34. Breer H., J. Fleischer, J. Strotmann (2006) The sense of smell: multiple olfactory subsystems. //Cell. Mol. Life Sci. 63, 1465-1475.

35. Breslin PAS., Spector AC (2008) Mammalian taste perception// Curr. Biol. 18, R148-R155.

36. Brown EM, MacLeod RJ (2001). Extracellular calcium sensing and extracellular calcium signaling. //Physiol Rev 81, 239-297.

37. Bruzzone, R., Barbe,M.T., Jakob, N.J. and Monyer,H. (2005) Pharmacological properties of homomeric and heteromeric pannexin hemichannels expressed in Xenopus oocytes. J Neurochem. 92, 1033-43

38. Buck, L., Axel, R. (1991) A novel encode odorant receptors: A recognition. //Cell 65, 175-187.

39. Buckingham SD, Jones AK, Brown LA, Sattelle DB. (2009) Nicotinic acetylcholine receptor signalling: roles in Alzheimer's disease and amyloid neuroprotection. //Pharmacol. Rev. 61, 39-61.

40. BunnettNW (2006) Protease-activated receptors: how proteases signal to cells to cause inflammation and pain. //Seminars in thrombosis and hemostasis 32, 39-48.

41. Burnstock G (2001) Purine-mediated signalling in pain and visceral perception. //Trends Pharm.Sci. 22: 182-188.

42. Burnstock G, Knight GE (2004) Cellular Distribution and Functions of P2 Receptor Subtypes in Different Systems. //Int. Rev. Cytol. 240, 31-304.44.