Роль стволовых и прогениторных клеток в патогенезе и регенерации при фиброзе и эмфиземе лёгких (экспериментальное исследование) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, доктор наук Крупин Вячеслав Андреевич

• Крупин Вячеслав Андреевич
• доктор наук
• 2022

Оглавление диссертации доктор наук Крупин Вячеслав Андреевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Идиопатический легочной фиброз

1.1.1 Эпидемиология и этиология

1.1.2 Патогенез

1.1.3 Лечение

1.1.3.1 Медикаментозное лечение

1.1.3.2 Хирургические методы

1.1.3.3 Клеточная терапия

1.2 Хроническая обструктивная болезнь лёгких

1.2.1 Эпидемиология и этиология

1.2.2 Патогенез

1.2.3 Лечение

1.2.3.1 Нефармакологические методы

1.2.3.2 Фармакологические методы

1.2.3.3 Хирургические методы

1.2.3.4 Клеточная терапия

1.3 Стволовые клетки в регенерации лёгких

1.3.1 Общие сведения о стволовых клетках

1.3.2 Стволовые клетки костного мозга

1.3.3 Рекрутирование стволовых клеток

1.3.4 Стволовые клетки при хронической обструктивной болезни лёгких

1.3.5 Стволовые клетки при идиопатическом легочном фиброзе

1.4 Notch 1 сигнальный путь

1.4.1 Общее представление

1.4.2 Легочная патология

1.5 Серотонин и его роль в воспалении и фиброзе

1.5.1 Общее представление о серотонине

1.5.2 Воспаление лёгких

1.5.3 Фиброз лёгких

1.6 Кетансерин

1.7 Дофамин и его роль в регуляции сосудистого гомеостаза

1.8 Спиперон

1.9 Заключение

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материал исследования

2.2 Реагенты

2.3 Экспериментальные модели фиброза и эмфиземы лёгких

2.4 Введение и дозы спиперона и кетансерина при исследовании in vivo

2.5 Дозы спиперона и дофамина, ФНО-а и ИЛ-ip при исследовании in vitro

2.6 Дизайн исследования

2.7 Методы исследования

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ НАБЛЮДЕНИЙ

3.1 Реакция стволовых и прогениторных клеток при фиброзе и эмфиземе лёгких

3.1.1 Фиброз лёгких, вызванный блеомицином

3.1.1.1 Характеристика модели

3.1.1.2 Содержание стволовых и прогениторных клеток в крови, лёгких и костном мозге

3.1.1.3 Активность стволовых и прогениторных клеток in vitro

3.1.2 Эмфизема лёгких, вызванная эластазой

3.1.2.1 Характеристика модели

3.1.2.2 Содержание стволовых и прогениторных клеток в крови и лёгких

3.1.3 Эмфизема лёгких, индуцированная ЛПС и экстрактом табачного дыма

3.1.3.1 Характеристика модели

3.1.3.2 Содержание стволовых и прогениторных клеток в крови, лёгких и костном мозге

3.1.4 Эмфизема лёгких, вызванная эластазой и D-галактозамин гидрохлоридом

3.1.4.1 Характеристика модели

3.1.4.2 Содержание стволовых и прогениторных клеток в крови, лёгких и костном мозге

3.2 Реакция Notch1+стволовых и прогениторных клеток при фиброзе и эмфиземе лёгких

3.2.1 Фиброз лёгких, вызванный блеомицином

3.2.2 Эмфизема лёгких, вызванная эластазой

3.2.3 Эмфизема лёгких, вызванная ЛПС и экстрактом табачного дыма

3.2.4 Эмфизема лёгких, вызванная эластазой и D-галактозамин гидрохлоридом

3.3 Влияние фармакологической блокады С2-серотониновых рецепторов на лёгкие в условиях введения повреждающих факторов

3.3.1 Фиброз лёгких, вызванный блеомицином

3.3.2 Эмфизема лёгких, вызванная эластазой

3.3.3 Эмфизема лёгких, вызванная ЛПС и экстрактом табачного дыма

3.3.4 Эмфизема лёгких, вызванная эластазой и Э-галактозамин

гидрохлоридом

3.4 Влияние фармакологической блокады В2-дофаминовых рецепторов на лёгкие в условиях введения повреждающих факторов

3.4.1 Фиброз лёгких, вызванный блеомицином

3.4.2 Эмфизема лёгких, вызванная эластазой

3.4.3 Эмфизема лёгких, вызванная ЛПС и экстрактом табачного дыма

3.4.4 Эмфизема лёгких, вызванная эластазой и Э-галактозамин гидрохлоридом

3.5 Влияние фармакологической блокады С2-серотониновых рецепторов

на стволовые и прогениторные клетки при патологии лёгких

3.5.1 Фиброз лёгких, вызванный блеомицином

3.5.1.1 Предшественники мезенхимальных клеток

3.5.1.2 Эпителиальные прогениторные клетки

3.5.1.3 Эндотелиальные прогениторные клетки

3.5.1.4 Ко1:сЫ+ стволовые и прогениторные клетки

3.5.2 Эмфизема лёгких, вызванная эластазой

3.5.2.1 Предшественники мезенхимальных клеток

3.5.2.2 Эпителиальные прогениторные клетки

3.5.2.3 Эндотелиальные прогениторные клетки

3.5.2.4 Ко1:сЫ+ стволовые и прогениторные клетки

3.5.3 Эмфизема лёгких, вызванная ЛПС и экстрактом табачного дыма

3.5.3.1 Предшественники мезенхимальных клеток

3.5.3.2 Эпителиальные прогениторные клетки

3.5.3.3 Эндотелиальные прогениторные клетки

3.5.3.4 Ко1:сЫ+ стволовые и прогениторные клетки

3.5.4 Эмфизема лёгких, вызванная эластазой и Э-галактозамин гидрохлоридом

3.5.4.1 Предшественники мезенхимальных клеток

3.5.4.2 Эпителиальные прогениторные клетки

3.5.4.3 Эндотелиальные прогениторные клетки

3.5.4.4 Ко1:сЫ+ стволовые и прогениторные клетки

3.6 Влияние фармакологической блокады Э2-дофаминовых рецепторов на

стволовые и прогениторные клетки при патологии лёгких

3.6.1 Фиброз лёгких, вызванный блеомицином

3.6.1.1 Предшественники мезенхимальных клеток

3.6.1.2 Эпителиальные прогениторные клетки

3.6.1.3 Эндотелиальные прогениторные клетки

3.6.1.4 Notch1+ стволовые и прогениторные клетки

3.6.2 Эмфизема лёгких, вызванная эластазой

3.6.2.1 Предшественники мезенхимальных клеток

3.6.2.2 Эпителиальные прогениторные клетки

3.6.2.3 Эндотелиальные прогениторные клетки

3.6.2.4 Notch1+ стволовые и прогениторные клетки

3.6.3 Эмфизема лёгких, вызванная ЛПС и экстрактом табачного дыма

3.6.3.1 Предшественники мезенхимальных клеток

3.6.3.2 Эпителиальные прогениторные клетки

3.6.3.3 Эндотелиальные прогениторные клетки

3.6.3.4 Notch1+ стволовые и прогениторные клетки

3.6.4 Эмфизема лёгких, вызванная эластазой и D-галактозамин гидрохлоридом

3.6.4.1 Предшественники мезенхимальных клеток

3.6.4.2 Эпителиальные прогениторные клетки

3.6.4.3 Эндотелиальные прогениторные клетки

3.6.4.4 Notch 1 + стволовые и прогениторные клетки

ГЛАВА 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль стволовых и прогениторных клеток в патогенезе и регенерации при фиброзе и эмфиземе лёгких (экспериментальное исследование)»

Актуальность проблемы

В последнее время огромное внимание уделяется заболеваниям лёгких, приводящим к инвалидизации населения. К таковым можно отнести идиопатический легочной фиброз (ИЛФ) и хроническую обструктивную болезнь лёгких (ХОБЛ). Идиопатический легочной фиброз является хроническим прогрессирующим заболеванием неизвестной этиологии. Прогноз ИЛФ в большинстве случаев неблагоприятный, состояние пациентов ухудшается быстрыми темпами. С момента постановки диагноза продолжительность жизни составляет от 2 до 4 лет [Raghu G. et al., 2018; Richeldi L. et al., 2020]. ХОБЛ характеризуется персистирующим ограничением воздушного потока, развитием обструктивного бронхита и эмфиземы лёгких [Ovali C., §ahin A., 2018]. В 2015 году ХОБЛ затронула примерно 299 миллионов человек, что на 174 миллиона человек или 44% больше в сравнении с 1990 годом, а смертность от ХОБЛ составила более 3 миллионов человек во всем мире, что на 12% больше по сравнению с 1990 T.[Ruvuna L., Sood A., 2021]. В настоящее время ХОБЛ занимает 4 место в мире в структуре смертности населения. Предполагается, что к 2030 году ХОБЛ переместится на третье место [De Cunto G. et al., 2020].

Этиологические факторы ИЛФ и ХОБЛ во многом сходные: это генетические предрасположенности, курение, побочное действие лекарственных препаратов, воздействие на лёгкие пыли, которая в большом количестве образуется в воздухе при нынешних темпах урбанизации населения [Roche N. et al., 2016]. Существующий в практике набор лекарственных средств не приносит ожидаемого положительного результата - полного выздоровления или длительной ремиссии. При длительном применении эти препараты вызывают различные побочные эффекты, а хирургические методы лечения приводят к снижению качества жизни пациентов, к значительным ограничениям физической нагрузки и неустойчивости к инфекционным заболеваниям [Calverley P.M. et al., 2007].

В последнее время огромное внимание уделяется терапии стволовыми клетками (СК) [Ahmadian-Moghadam H., Sadat-Shirazi M.-S., Zarrindast M.-R., 2020; Biressi S., Filareto A., Rando T.A., 2020; Gauthier-Fisher A., Kauffman A., Librach C.L., 2020; Götherström C., Walther-Jallow L., 2020; Pixley J.S., 2020; Rehakova D., Souralova T., Koutna I., 2020; Vasanthan J.,Gurusamy N., Rajasingh S. et al. 2020; Yamanaka S., 2020; Watanabe Y., Tsuchiya A. , Terai S., 2021; Zeng X., Geng W., Jia J. et al., 2021]. Трансплантация гемопоэтических СК (ГСК) используется в настоящее время для лечения Т-клеточного лейкоза у взрослых, множественной мие-ломы, лимфомы и др. Клеточная терапия ГСК предлагается для лечения заболеваний лёгких. Донорскими мезенхимальными СК (МСК) лечат гастроинтерстици-альные и нейродегенеративные заболевания, инсульты и инфаркты, лейкозы, лимфомы, костные (хрящевые) заболевания, диабет, противодействуют реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) [Trounson A. et al., 2011]. Клеточная терапия МСК рассматривается как новый перспективный подход лечения хронических заболеваний лёгких, в том числе ИЛФ и ХОБЛ [Shigemura N. et al., 2006; Si-niscalco D. et al., 2008; Moodley Y. et al., 2009; Shukla M.N. et al., 2009; Huh J.W. et al., 2011; Guan X.J. et al., 2012; Gu W. et al., 2015].

Несмотря на тот огромный путь, который проделала клеточная терапия, до настоящего времени не совсем понятно, с какими из СК связаны её лечебные эффекты. Отдельно взятые клоны СК, составляющие одну популяцию, отличаются друг от друга по фенотипу, экспрессии генов, пролиферативной активности и способности к дифференцировке [Muraglia A. et al., 2000; Tremain N. et al., 2001]. Кроме лечебных эффектов клеточная терапия СК повышает риск развития аллергических реакций, бактериальных, вирусных и грибковых инфекционных заболеваний [Benjamin D.K. et al., 2002; Engelhard D. et al., 2002]. В клинической практике для клеточной терапии применяются прекультивированные мононуклеары. Эти манипуляции приводят к изменению фенотипа и функций стволовых клеток [Ban-fi A. et al., 2000; Banfi A. et al., 2002], в том числе, к приобретению неопластических свойств [Lalu M.M. et al., 2012]. После проведения клеточной терапии выделенные из костного мозга пациентов МСК доноров демонстрируют черты частич-

ного или полного химеризма [Lee S.T. et al., 2002; Le Blanc K. et al., 2007]. Имеются данные об иммуномодулирующих свойствах МСК: в зависимости от ситуации одна популяция может демонстрировать провоспалительную и противовоспалительную активности [Tse W.T. et al., 2003]. Общеизвестно, что время жизни СК донора в организме пациента ограничен часами. Как известно, процессы регенерации требуют значительного времени. В этой связи, трудно ожидать от клеточной терапии существенного ускорения регенерации повреждённых и утраченных клеток. В этой связи, иммуномодулирующие и другие кратковременные эффекты клеточной терапии можно объяснить исключительно паракринной активностью клеток [Kang S.K. et al., 2012].

Альтернативой клеточной терапии может оказаться фармакологическая регуляция костномозговых и регионарных СК, как потенциально более безопасный подход лечения с целевой направленностью на регенерацию клеток и тканей. Между тем, на сегодняшний день роль СК различных органов и тканей в патогенезе заболеваний, в том числе хронических заболеваний лёгких, и процессах регенерации остается мало изученной. Это серьезно затрудняет разработку тактики медикаментозного лечения ИЛФ и ХОБЛ с использованием СК. Не решён вопрос с подходами фармакологической регуляции СК. Известна регуляция СК хемоки-нами и ростовыми факторами, которая продемонстрирована in vitro. Однако при трансляции результатов in vivo ожидаемых положительных эффектов в большинстве своем не наблюдается.

В легочной ткани существуют островки нейроэндокринных клеток, секрети-рующие биогенные амины и пептиды. В норме и при патологии эти биологически активные молекулы оказывают регуляторное влияние на эпителиоциты [Lau-weryns J.M., Van Lommel A., 1997; Reynolds S.D. et al., 2000]. Легочная ткань также богата дофаминовыми рецепторами [Amenta F. et al., 2002]. Так, рецепторы к дофамину обнаружены в легочной артерии кролика [Kobayashi Y. et al., 1994], человека [Ricci A. et al., 2006], на альвеоцитах II типа [Helms M.N. et al., 2006], на мезенхимальных и эндотелиальных прогениторных клетках [Chakroborty D. et al., 2008; Shome S. et al., 2012; Mirones I. et al., 2014]. Общеизвестно, что развитие эм-

физемы лёгких сопровождается разрывом межальвеолярных перегородок, разрушением альвеолярных ацинусов, в области эмфизематозно расширенных участков количество сосудов микроциркуляторного русла значительно уменьшается, что закономерно приводит к нарушению кровоснабжения альвеол [Liebow A.A., 1959; Washko G.R., 2012]. Ряд авторов объясняют угнетение ангиогенеза в лёгких «дофаминовой» концепцией [Vohra P.K. et al., 2012; Hoeppner L. et al., 2015]. Предполагается, что дофаминовые рецепторы, расположенные на мембране эндотелиаль-ных клеток и связанные с рецепторами к VEGF (англ. Vascular endothelial growth factor, фактор роста эндотелия сосудов), при активации дофамином нарушают ответ клеток эндотелия на стимуляцию VEGF.

Фиброзные заболевания лёгких имеют в своей основе серотониновую составляющую. Продукция серотонина тромбоцитами и тучными клетками может локально сужать просвет легочной артерии после травмы [MacLean M.R., Dempsie Y., 2010]. Вместе с тромбоцитами и тучными клетками серотонин секретируют и нейроэндокринные клетки лёгких [Johnson D.E., Georgieff M.K., 1989]. Серотонин вызывает бронхоспазм и стимулирует гиперплазию в клетках гладких мышц и миофибробластах. Данный эффект серотонина вызывает склеротическое ремоде-лирование в легочных сосудах и дыхательных путях. У пациентов с ИЛФ также наблюдается повышенная экспрессия 5-HT2A рецепторов на фибробластах и 5-HT2B рецепторов на эпителиальных клетках в лёгких. В исследованиях, проведенных in vitro, серотонин оказывал митогенное и профибротическое воздействие на некоторые клоны мезенхимальных клеток. В частности, в культуре легочных артерий крыс при гипоксии серотонин увеличивал пролиферацию фибробластов и миофибробластов [Lee S.L. et al., 1994; Welsh D.J. et al., 2004]. Исходя из этого, нами выдвинуто предположение о существовании дофаминовых и серотониновых механизмов регуляции регенерации легочной ткани с участием стволовых и про-гениторных клеток. Использование антагонистов серотониновых и дофаминовых рецепторов может оказаться перспективным подходом лечения ХОБЛ и ИЛФ.

Принимая во внимание вышеизложенное, несомненный интерес представляет изучение механизмов регуляции стволовых и прогениторных клеток различных

классов при фиброзе и эмфиземе лёгких, а также поиск новых подходов их фармакологической регуляции для коррекции нарушений и ускорения регенерации утраченных и повреждённых клеток лёгких.

Степень разработанности проблемы

По данным Всемирной организации здравоохранения лекарственная терапия ИЛФ ограничена, неэффективна и направлена в основном на лечение осложнений. Новые препараты для лечения ИЛФ (пирфенидон и нинтеданиб) не проявили ожидаемой высокой противофибротической активности и способны замедлить, но не остановить прогрессирование заболевания [Sgalla G. et al., 2020]. При длительном применении этих препаратов у пациентов с ИЛФ наблюдаются побочные эффекты [Kishaba Т., 2019; Gulati S, Luckhardt T.R., 2020; Richeldi L. et al. 2020]. Отсутствие эффективного и недорогого фармакологического лечения характерно и для ХОБЛ. Основными рекомендациями для таких пациентов остаются отказ от курения и прием лекарственных средств, которые лишь облегчают течение болезни, но их применение не восстанавливает повреждения и функцию лёгких.

Разработанные в эксперименте (прежде всего в условиях in vitro) другие подходы для лечения ИЛФ и ХОБЛ интересны и объяснимы для применения с патогенетической точки зрения: использование иммунорегуляторных цитокинов [Horowitz J.C., Thannickal V.J., 2006; Hisatomi K. et al., 2012], клеточная терапия МСК [Glassberg M.K. et al., 2017]. Однако в условиях целостного организма и в клинической практике результат их применения не оправдывает ожиданий [Averyanov A. et al., 2020]. Проведение такого тяжелого для больного лечебного мероприятия, как трансплантация лёгких сдерживается прежде всего отсутствием необходимого донорского материала [Togel F., Westenfelder C., 2011].

Таким образом, поиск новых эффективных, нетоксичных и малозатратных подходов лечения ИЛФ и ХОБЛ жизненно необходим. Прогресс в лечении этих хронических заболеваний лёгких нам видится в фармакологической регуляции стволовых и прогениторных клеток.

Цель исследования

Выявить роль стволовых и прогениторных клеток при фиброзе и эмфиземе лёгких. Дать патогенетическое обоснование использования антагонистов серото-ниновых и дофаминовых рецепторов для ускорения регенерации альвеолярного эпителия и эндотелия.

Задачи исследования

1. Изучить закономерности формирования изменений мезенхимальных, эн-дотелиальных и эпителиальных стволовых и прогениторных клеток, и их роль в фиброзе и регенерации лёгких в условиях введения блеомицина.

2. Исследовать роль мезенхимальных, эндотелиальных и эпителиальных стволовых и прогениторных клеток в воспалении, формировании эмфизематозных нарушений и регенерации лёгких при введении эластазы, ЛПС и экстракта табачного дыма, эластазы и Б-галактозамин гидрохлорида.

3. Изучить особенности реакций Ко1:сЫ+ стволовых и прогениторных клеток при моделировании фиброза и эмфиземы лёгких.

4. В условиях введения эластазы, ЛПС и экстракта табачного дыма, эластазы и Б-галактозамин гидрохлорида исследовать возможность коррекции антагонистом Б2-дофаминовых рецепторов спипероном воспаления и эмфиземы лёгких.

5. Изучить возможность коррекции спипероном воспаления и фибротических изменений в лёгких в условиях введения блеомицина.

6. Исследовать возможность коррекции антагонистом С2-серотониновых рецепторов кетансерином воспаления и фибротических изменений в лёгких, индуцированных блеомицином.

7. В условиях введения эластазы, ЛПС и экстракта табачного дыма, эластазы и Б-галактозамин гидрохлорида изучить возможность коррекции кетансерином воспаления и эмфиземы лёгких.

8. На моделях фиброза и эмфиземы лёгких оценить регенераторную активность спиперона и кетансерина, а также механизмы, лежащие в её основе.

Научная новизна работы

Впервые в сравнительном аспекте показана роль костномозговых, циркулирующих в крови и резидентных (лёгкие) мезенхимальных, эндотелиальных и эпителиальных стволовых и прогениторных клеток в развитии типовых патологических процессов и регенерации внеклеточного матрикса, альвеолярного эндотелия и эпителия при экспериментальном фиброзе и эмфиземе лёгких. Представлены данные, демонстрирующие участие Ко1:сЫ-сигнального пути, дофаминовой и се-ротониновой систем в регуляции стволовых и прогениторных клеток при экспериментальной патологии лёгких.

На моделях эмфиземы лёгких и фиброза лёгких показана неспецифическая стимуляция различных популяций мезенхимальных клеток предшественников с профибротической активностью. В развитии блеомицин-индуцированного фиброза лёгких участвуют прогениторные фибробластные клетки и МСК (СВ45-СВ31-CD34-CD73+СD90+), а также эпителиальные прогениторные клетки (СБ45-ТБК119-СВ49£+), продуцирующие ТОБ-1р. Профибротическая активность МСК (CD45-CD31-CD34-CD73+СD90+) и фибробластных прогениторных клеток ^45-CD31-CD34+СD90+) в случае введения эластазы, МСК ^45^31^34-CD73+СD90+) под влиянием эластазы и D-галактозамин гидрохлорида, миелоид-ных фиброцитов ^31-CD34+CD45+Nectin2+) при введении ЛПС и экстракта табачного дыма направлена на восстановление поврежденного коллагенового и эла-стинового каркаса лёгких.

Показано, что независимо от модели патологии лёгких гуморальные факторы воспаления (в частности ФНО-а, ИЛ-1Р) снижают активность рекрутируемых в лёгкие и резидентных стволовых клеток эндотелия и эпителия.

Продемонстрирована ведущая роль микрососудистого русла в регенерации легочной ткани при экспериментальном фиброзе и эмфиземе лёгких. Так, значительное повреждение системы эндотелия лёгких (блеомицин, эластаза) влечет за собой нарушение миграции клеток глубокого резерва регенерации из костного мозга и крови в лёгкие. В этом случае восстановление альвеолярного эпителия и эндотелия происходит за счет регионарных стволовых и прогениторных клеток.

При сохранении большей части микрососудистого русла (введение эластазы и Б-галактозамин гидрохлорида, ЛПС и экстракта табачного дыма) дополнительно к регионарным незрелым клеткам в поврежденную ткань мигрируют костномозговые и циркулирующие в крови стволовые и прогениторные клетки.

Подтверждена гипотеза о различной реакции стволовых и прогениторных клеток, экспрессирующих Ко1сЫ, на моделирование фиброза и эмфиземы лёгких. При эмфиземе лёгких увеличивается содержание Ко1:сЫ+ клеток в популяциях резидентных УЕОБ+ эндотелиальных клеток, предшественников ангиогенеза, эндо-телиальных прогениторных клеток (CD45-CD31+CD34+), мезенхимальных клеток предшественников и эпителиальных прогениторных клеток (CD45-TER119-СБ49^), при этом возрастает уровень экспрессии Ко1:сЫ на клетках. Для фиброза лёгких характерна противоположная реакция Ко1:сЫ рецепторов стволовых и прогениторных клеток.

На моделях эмфиземы лёгких антагонист Б2-дофаминовых рецепторов спи-перон оказывает противовоспалительное и противоэмфизематозное действие, стимулирует регенерацию альвеолярного эпителия и эндотелия. В основе регенераторного эффекта спиперона лежит активация резидентных эпителиальных про-гениторных клеток (CD45-TER119-CD49f+) и мигрирующих из костного мозга и крови в лёгкие эндотелиальных прогениторных клеток (СБ45-СБ31+СБ34+), УЕОБ+ эндотелиальных клеток и предшественников ангиогенеза, в том числе экспрессирующих Ко1:сЫ. При разрушении микрососудистой сети эластазой в регенерацию вовлекаются резидентные стволовые и прогениторные клетки.

Фармакологическая блокада Б2-дофаминовых рецепторов спипероном снижает индуцируемую дофамином пролиферативную активность СБ31+СБ34+СБ146+№с1ш2+ эндотелиальных прогениторных клеток в культуре СБ31+ клеток, выделенных из лёгких мышей в условиях введения ЛПС и экстракта табачного дыма.

При фиброзе лёгких фармакологическая блокада С2-серотониновых рецепторов кетансерином уменьшает секрецию медиаторов воспаления и фиброза, сни-

жает функциональную активность рекрутируемых в лёгкие костномозговых МСК (CD45-CD31-CD34-CD73+СD90+) и прогениторных фибробластных клеток, понижает концентрацию гиалуроновой кислоты в лёгких, что приводит к угнетению активности воспаления и сокращению площади соединительной ткани в лёгких, и, как следствие, к ускорению регенерации эпителия и эндотелия.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные данные вносят существенный вклад в понимание закономерностей формирования специфической для фиброза и эмфиземы лёгких программы регенерации альвеолярного эпителия и эндотелия с участием костномозговых, циркулирующих в крови и резидентных стволовых и прогениторных клеток эндотелия и эпителия. Показана важная роль различных популяций мезенхимальных клеток предшественников в фибропластическом процессе при разрушении альвеолярного эпителия блеомицином, внеклеточного матрикса эластазой, моделировании дефицита альфа1-антитрипсина D-галактозамин гидрохлоридом и в условиях хронического токсического действия экстракта табачного дыма на эпителий.

Продемонстрирована необходимость использования циркулирующих в крови стволовых и прогениторных клеток, в том числе экспрессирующих NotcЫ, а также вспомогательных клеток эндотелиогенеза (сосудистых клеток просвета зарождающегося сосуда, перицитов, гладкомышечных клеток) в качестве диагностических биомаркеров фиброза, разрушения эндотелия и эпителия в лёгких, и биомаркеров эффективности проводимого лечения (регенерация).

Результаты исследования позволили предложить новые подходы фармакологической коррекции фибропластического процесса и воспаления, ускорения регенерации альвеолярного эпителия и эндотелия при экспериментальных заболеваниях лёгких. Так, введением антагониста D2-дофаминовых рецепторов спиперона достигается усиление регенерации эндотелия лёгких в условиях эмфиземы лёгких, при этом биомишенью выступают эндотелиальные прогениторные клетки (CD45-CD31+CD34+). При блокаде С2-серотониновых рецепторов кетансерином

снижается активность пролиферации и дифференцировки профибротических МСК и фибробластных прогениторных клеток.

Высокая практическая значимость диссертационной работы подтверждается результатами интеллектуальной деятельности: патент RU № 2479312; патент RU № 2497523; патент RU № 2554843; патент RU № 2530651; патент RU № 2714679, патент RU № 2740378.

Методология и методы исследования

Настоящая диссертация является экспериментальным исследованием. В соответствии с поставленными задачами были выбраны современные высокоинформативные методы и технические решения с использованием оборудования НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ РАН.

В НИР использовали мышей линии С57BL/6 обоего пола. Различными по механизму действия повреждающими агентами (блеомицин, эластаза, экстракт табачного дыма, Б-галактозамин гидрохлорид) моделировали фиброз лёгких или эмфизему лёгких. Объектом исследования выступали костномозговые, циркулирующие в крови и резидентные (лёгкие) стволовые и прогениторные клетки, бло-катор Б2-дофаминовых рецепторов спиперон, блокатор С2-серотониновых рецепторов кетансерин.

В исследовании использовались морфологические и иммуногистохимические методики для оценки воспаления и повреждения лёгких, эмфиземы и площади соединительной ткани в легочной ткани, клеточной и тканевой регенерации. Имму-ноферментным анализом определяли уровни медиаторов воспаления и противовоспалительных цитокинов, а также молекул фибропластического процесса в биологических пробах. Метод проточной цитофлуориметрии позволил определить иммунофенотип клеток и содержание стволовых и прогениторных клеток эндотелиальной, эпителиальной и мезенхимальной природы в костном мозге, крови и лёгких, а также представительство Ко1:сЫ+ клеток в общей популяции СК.

Культуральными методами с использованием магнитной сепарации и про-

точной цитофлуориметрии из общей фракции мононуклеаров изолировали необходимые стволовые и прогениторные клетки, получали первичные культуры клеток и оценивали их функциональную активность (клональная активность, пролиферация, потенциал к самообновлению, дифференцировка).

На моделях фиброза лёгких и эмфиземы лёгких исследованы эффекты и механизмы действия (в том числе связанные со стволовыми и прогениторными клетками) кетансерина и спиперона.

Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики с использованием программы статистики SPSS 12,0. Используя выборочные коэффициенты асимметрии и эксцесса, оценивали степень приближения закона распределения исследуемого признака к нормальному (тест Шапиро-Вилка). В случаях нормального распределения для статистической обработки применяли параметрический t-критерий Стьюдента. При больших отклонениях распределений признака от нормального вида для независимых выборок использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Различие двух сравниваемых совокупностей считали статистически значимыми в том случае, если вероятность их тождества была меньше 5% (р<0,05).

Положения, выносимые на защиту:

1. При индуцированном блеомицином фиброзе лёгких мигрирующие из костного мозга в лёгкие прогениторные фибробластные клетки и резидентные МСК (CD45-CD31-CD34-CD73+CD90+) секретируют профибротические и провос-палительные медиаторы (TGF-ip, ФНО-а), формируют профибротический гиалу-роновый матрикс и дифференцируются в продуцирующие коллаген фибробласты. В основе профибротической активности резидентных эпителиальных прогени-торных клеток (CD45-TER119-CD49f+) лежит секреция ФНО-а.

2. На различных моделях эмфиземы лёгких показана неспецифическая активация МСК (CD45-CD31-CD34-CD73+CD90+), фибробластных прогениторных клеток и фиброцитов миелоидного происхождения (CD31-CD34+CD45+ Nectin2+). В зависимости от выраженности эмфиземы в восстановлении коллагенового и эла-

стинового матрикса лёгких участвуют отдельные мезенхимальные предшественники (введение ЛПС и экстракта табачного дыма) или весь резерв регенерации (введение эластазы, эластазы и Б-галактозамин гидрохлорида).

3. При фиброзе лёгких воспаление (в частности ФНО-а и ИЛ-1Р) выступает фактором, ингибирующим функциональную активность мигрирующих в лёгкие костномозговых эндотелиальных прогениторных клеток (CD45-CD31+CD34+; CD45-CD31+CD34+CD73-СD90-) и предшественников ангиогенеза, а также стволовых клеток лёгких.

4. Причиной низкой активности регенерации эндотелия в условиях введения эластазы выступает нарушение миграции костномозговых и циркулирующих в крови эндотелиальных прогениторных клеток, предшественников ангиогенеза и УЕОБ+ эндотелиальных клеток в лёгкие, обусловленное разрушением микроцир-куляторного русла. В случае сохранения целостности большей части микроцир-куляторного русла (введение эластазы и Б-галактозамин гидрохлорида, ЛПС и экстракта табачного дыма) факторы воспаления (ФНО-а, ИЛ-1Р) снижают активность рекрутируемых в лёгкие СК эндотелия, в том числе их взаимодействие с перицитами, клетками просвета зарождающего сосуда и сосудистыми гладкомы-шечными клетками.

5. При эмфиземе лёгких, индуцированной эластазой, ингибиция резидентных мультипотентных эпителиальных прогениторных клеток выступает основой нарушения регенерации альвеолярного эпителия. В условиях введения эластазы и Б-галактозамин гидрохлорида, или сочетания ЛПС и экстракта табачного дыма реализуется программа патологической регенерации эпителия: при системном дефиците альфа1 -антитрипсина в процесс вовлечены СК лёгких, эпителиальные прогениторные клетки ^45-ТЕК119-СБ49^; СБ45-ТЕК119-СБ49^СБ326+) и мультипотентные эпителиальные прогениторные клетки, при хроническом токсическом действии смол и никотина - эпителиальные прогениторные клетки (СБ326ЫСБ49^СБ45-; СБ45-ТЕК119-СБ49^СБ326+; СБ326+СБ45-СБ49^).

6. Резидентные мезенхимальные, эндотелиальные и эпителиальные Notch1+ стволовые и прогениторные клетки участвуют в развитии экспериментального

фиброза и эмфиземы лёгких. Если на моделях эмфиземы лёгких содержание Notch1+ клеток увеличивается и при этом возрастает уровень экспрессии Notch1, то при фиброзе лёгких число Notch1+ клеток в общей фракции стволовых и проге-ниторных клеток уменьшается.

7. На моделях эмфиземы лёгких продемонстрированы уменьшение площади эмфиземы, противовоспалительный и регенераторный эффекты спиперона. Ускорение регенерации альвеол антагонистом D2-дофаминовых рецепторов находится в зависимости от целостности микрососудистого русла, мобилизации и миграции эндотелиальных прогениторных клеток (CD45-CD31+CD34+), УЕОБ+ эндотели-альных клеток, предшественников ангиогенеза.

8. При введении блеомицина блокада D2-дофаминовых рецепторов препятствует развитию воспаления и фиброза, увеличивает количество эндотелиальных и эпителиальных клеток в лёгких. Регенераторный эффект спиперона обусловлен миграцией костномозговых эндотелиальных прогениторных клеток (CD45-CD31+CD34+) в лёгкие и стимуляцией резидентных эпителиальных прогениторных клеток (CD45-Ter119-CD49f+), противофибротический эффект - снижением активности мезенхимальных клеток.

9. При введении блеомицина кетансерин нарушает серотониновый механизм секреции медиаторов воспаления и фиброза, дифференцировку МСК (CD45-CD31-CD34-CD73+CD90+) и прогениторных фибробластных клеток в клетки мезенхи-мального ряда, формирование гиалуронового матрикса, что приводит к уменьшению активности воспаления и площади соединительной ткани в лёгких, ускорению регенерации альвеолярного эпителия и эндотелия.

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Крупин Вячеслав Андреевич, 2022 год

Источник

1

2

3

Эпителиальные и

эндотелиальные клетки

Продукция медиаторов воспаления, инициирующих антифибринолитический коагуляционный каскад, который приводит к активации тромбоцитов, формированию тромбов и изменению качество экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ)

[Wynn T.A., 2011]

Регенерация поврежденной ткани

[Zolak J.S., Joao A.A., 2012]

Трансдифференцировка в ходе эпители-ально-мезенхимального перехода (ЭМП) в фибробласто-подобные клетки

[Willis B.C., Du Bois R.M., Borok Z., 2006; Corvol H., Flamein F., Epaud R. et al., 2009; Felton V.M., Borok Z., Willis B.C., 2009; Tanjore H., Cheng D.S., Degryse A.L. et al., 2011; _Wynn T.A., 2011]_

Альвеолярные эпителиальные прогениторные клетки

Дифференцировка в эпителиальные клетки

[Crystal R.G., Randell S.H., Engelhardt J.F. et al., 2008; Kajstura J., Rota M., Hall S.R. et _al., 2011]_

«Ненормальные» альвеолярные эпителиальные клетки

Инициируют миграцию, пролиферацию, и дифференцировку мезенхимальных клеток в фибробласты / миофибробласты

[Selman M., Pardo A., 2006]

Дифференцировка клетки

в гладкомышечные

[Zhu P., Huang L., Ge X. et al., 2006; Arciniegas E., 2007; Bar_bera J.A., 2011]_

Бронхоальвео-лярные стволовые клетки

Дифференцировка в альвеоциты I и II типов

[Kim C.F.B., Jackson E.L., Woolfenden A.E. et al., 2005; Fujino N., Kubo H., Suzuki T. et al., 2011; Wang X.-Y., Keefe K.M., Jensen-Taubman S.M. et _al., 2012]_

Эндотелиальные прогениторные клетки

Дифференцировка в эндотелиальные клетки, восстановление сосудистой стенки

[Fadini G.P., Miorin M., Facco M. et al., 2006; Caramori G, Rigolin G.M., Mazzoni F.. et al., 2010]

1 2 3

Тромбоциты Агрегация и дегрануляция способствует расширению и повышению проницаемости кровеносных сосудов, что обеспечивает привлечение клеток воспаления к месту травмы [Wynn T.A., 2007; Wynn T.A., 2011]

Тучные клетки Химаза тучных клеток повышает агрессивность TGF-P и тем самым способствует легочному фиброзу [Tomimori Y., Muto T., Saito K. et al., 2003]

Способствуют распространению фиб-робластов в очаге травмы [Garbuzenko E., Nagler A., Pick-holtz D. et al., 2002]

Макрофаги и нейтрофилы На начальном этапе воспаления очищают рану и элиминируют чужеродные организмы, продуцируют цитокины и хе-мокины (ИЛ-1Р , ФНО-а и TGF-P) [Bringardner B.D., Baran C.P., 2008]

Макрофаги Увеличивают выработку коллагена нормальными человеческими фибробластами ССЬ18-зависимым образом in vitro [Prasse A., Pechkovsky D.V., Toews G.B. et al., 2006]

Секреция TGF-P и PDGF, усиление поли-аминного и пролинового биосинтеза, образование коллагена [Hesse M., Modolell M., La Flamme A C. et al., 2001]

Продукция фибронектина и a-SMA [Muro A.F., Moretti F.A., Moore B.B. et al., 2008]

Нейтрофилы CCR2-, CXCR3- и CXCR2-опосредованная миграция из костного мозга в лёгкие [Belperio J.A., Keane M.P., Burdick M.D. et al., 2001; 2002; 2005]

Эозинофилы ИЛ-5- и ИЛ-4-опосредованная продукция TGF-P [Elovic A.E., Ohyama H., Sauty A. et al., 1998]

Т-клетки Дифференцировка в ^2-клетки, тем самым обеспечивается секреция ИЛ-5, ИЛ-9, ИЛ-13, ИЛ-21. [Takatsu K., Nakajima H., 2008]

Т-хелперные клетки Формирование ТЬ2-цитокинового профиля, характерного для различных фиброзных состояний лёгкого (ИЛ-4, ИЛ-13, TGF-P) [Strutz F., Zeisberg M., Ren-ziehausen A. et al., 2001; Wynn T.A., 2003].

Формирование провоспалительного профиля цитокинов, характерного для пациентов с ИЛФ (ИЛ-1a, ИЛ-ip, ФНО-a, TGF-P, PDGF) [Agostini C., Gurrieri C., 2006]

Фиброциты CXCL12-, CCL12- и CCR2- опосредованная миграция из костного мозга в лёгкие [Phillips R.J., Burdick M.D., Hong K. et al., 2004; Moore B.B., Kolodsick J.E., Thannickal V.J. et al., 2005; Moore B.B., Murray L., Das A. et al. 2006]

1 2 3

Фиброциты Обнаруживаются в непосредственной близости от очагов в областях с текущими признаками воспаления [Andersson-Sjoland A., De Alba C.G., Nihlberg K. et al., 2008]

Участвуют в фиброзе [Phillips R.J., Burdick M.D., Hong K. et al., 2004]

Источники фибробласто-подобных клеток [Abe R., Donnelly S.C., Peng T. et al., 2001; Hashimoto N., Jin H., Liu T. et al., 2004]

Фибробласты Трансформация в миофибробласты, экс-прессирующие a-SMA [Andersson-Sjoland A., Nihlberg K., Eriksson L. et al., 2011]

ИЛ-13- и TGF-P-опосредованный синтез коллагена [Wenzel S.E., Trudeau J.B., Barnes S. et al., 2002; Malavia N.K., Mih J.D., Raub C.B. et al., 2008]

Фибробласты Создание профибротического ЭЦМ [Andersson-Sjoland A., De Alba C.G., Nihlberg K. et al., 2008]

Продукция фибронектина и a-SMA [Muro A.F., Moretti F.A., Moore B.B. et al., 2008]

TGF-P-опосредованная миграция вдоль границы внеклеточного матрикса и ремо-дуляция повреждения [Garcia-Alvarez J., Ramirez R., Checa M. et al. 2006; Gill S.E. Parks W.C., 2008]

Апоптотическая гибель после ремодуля-ции альвеолярного эпителия [Fattman C.L., 2008]

Прогениторные фибробластные клетки Дифференцировка в фибробласты [Wilson M.S., Wynn T.A., 2009]

Миофибробласты Синтезируют компоненты ЭЦМ, способствуют ремоделированию раневой поверхности [Zolak J.S., Joao A.A., 2012]

Сокращают площадь поражения, меняют баланс MMPs / TIMPs (tissue inhibitors of metalloproteinases) и коллаген / коллаге-назы [Garcia-Alvarez J., Ramirez R., Checa M. et al. 2006; Gill S.E. Parks W.C., 2008]

Удаляются из раны после ремодуляции альвеолярного эпителия [Fattman C.L., 2008]

Мезенхимальные клетки-предшественники Выход из костного мозга в циркуляцию, миграция по сосудистому руслу в поврежденные участки лёгких, где дифференцируются до фибробластов и миофиб-робластов [Gomperts B.N., Strieter R.M., 2007; Strieter R.M., Gomperts B.N., Keane M.P., 2007]

Мезенхимальные стволовые клетки Предполагают трансдифференцировку в альвеоциты, дают начало структурным дыхательным единицам, включающим бронхиолы, альвеолы и легочные сосуды [Baksh D., Song L., Tuan R.S., 2004; Tzouvelekis A., Antoniadis A., Bouros D. 2011; Huleihel L., Levine M., Rojas M., 2013]

1 2 3

Мезенхимальные стволовые клетки Иммуносупрессивная активность, секреция фактора стромальных клеток-1, мо-ноцитарного хемотаксического протеина-3, сосудистого эндотелиального фактора роста (УЕОБ) [Kotton D.N., Fine A. 2008; Garcia-Gomez I., Elvira G., Zapata A G. et al., 2010; Gimble J.M., Guilak F., Bunnell B.A., 2010]

Дифференцировка в клетки стромальных линий (адипоциты, остеобласты, хондро-циты, фибробласты) [Summer R., Fitzsimmons K., Dwyer D. et al., 2007; Martin J., Helm K., Ruegg P. et al., 2008; Skurikhin E.G., Khmelevskaya E.S., Pershina O.V. et al. 2013]

В период начальной фазы миграции лейкоцитов активированные нейтрофи-лы и макрофаги очищают рану, элиминируют чужеродные антигены, а также синтезируют различные цитокины и хемокины (ИЛ-lß, ИЛ-13, ФНО-а и TGF-ß), которые усиливают воспалительный ответ и вызывают пролиферацию резидентных фибробластов [Bringardner B.D., Baran C.P., 2008]. Считается, что привлечение циркулирующих в крови фиброцитов и костномозговых прогениторных фиб-робластных клеток происходит во время третьего этапа фиброгенеза [Wilson M.S., Wynn T.A., 2009]. Фибробласты дифференцируются в миофибробласты [Andersson-Sjöland A. et al., 2011]. Еще одним источником миофибробластов являются эпителиальные клетки, которые могут увеличивать данную популяцию посредством эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) [Wynn T.A., 2011]. Считается, что и при патологическом фиброзе и при нормальном заживлении раны смена эпителиоцитами эпителиального фенотипа на мезенхимальный - это необходимый процесс.

Поле своей активации фибробласты трансформируются в a-SMA-экспрессирующие миофибробласты, которые производят компоненты ЭЦМ. В фазу разрешения миофибробласты способствуют сокращению раневой поверхности (ремоделирование). На заключительном этапе эпителиальные и эндотелиаль-ные клетки мигрируют в активные области, где начинают активно делиться и восстанавливать поврежденные участки [Zolak J.S., Joao A.A., 2012]. Если любой из этих этапов в процессе восстановления ткани нарушается или остаются стимулы,

повреждающие лёгкие, то развивается фиброз (постоянный фиброзный «шрам») [Wynn T.A., 2011]. Вероятность необратимости фиброгенеза также сохраняется и при обширной раневой поверхности.

Цитокины. Воспалительная реакция в легочной ткани занимает важное место в прогрессировании ИЛФ. Как правило, на начальном этапе именно воспаление инициирует развитие разных форм ИЛФ [Crystal R.G. et al., 2008]. В легочной ткани у большинства пациентов отмечается скопление макрофагов, эозинофилов, нейтрофилов, лимфоцитов и плазматических клеток, а также наличие лимфоид-ных фолликулов с терминальными центрами [Crystal R.G., 1974]. Первоначальные термины «диффузный фиброзирующий альвеолит» и «криптогенный фиброзиру-ющий альвеолит» использовались как раз для отражения воспалительного компонента легочного фиброза [Bois R.M., Wells A.U., 2001]. В некоторых видах фиброза лёгких воспалительная реакция отмечается на протяжении всего заболевания. Однако довольно часто встречаются формы ИЛФ с отсутствием воспаления [Thannickal V.J. et al., 2004]. Данный факт можно объяснить временным фактором. В большинстве случаев заболевание диагностируется на этапе, когда болезнь уже перешагнула фазу воспаления и неумолимо движется к своему разрешению. С этим связано обнаружение только следов воспаления. Именно поэтому стандартная противовоспалительная терапия (в составе глюкокортикостероидов и цито-статиков) малоэффективна у больных с фиброзом лёгких [Demedts M. et al., 2005]. В условиях эксперимента есть возможность отследить у животных всю вышеописанную последовательность событий, от этапа травмы альвеолярного эпителия до момента ремоделирования легочной ткани либо до остановки дыхания.

В патогенезе ИЛФ важное место занимают цитокины. В легочной ткани синтезировать цитокины способны эпителиальные и мезенхимальные клетки, тромбоциты, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, Т- и В-лимфоциты. В таблице 3 представлены цитокины, принимающие участие в развитии фиброза лёгких.

Таблица 3 - Цитокины, участвующие в регуляции легочного фиброза

Факторы роста Эффекты

1 2

Трансформирующий фактор роста в (TGF-P) TGF-ß является «ключевым» цитокином фибротического процесса, способствует активации, пролиферации и дифференцировки эпителиальных клеток и миофибробластов [Border W.A., Noble N.A., 1994]. Основной профиб-ротический фактор роста. В условиях in vitro стимулирует синтез ЭЦM фибробластами и инициирует дифференцировку миофибробластов. Индуцирует апоптоз в эпителиальных клетках и способствует ЭMП. При моделировании фиброза у животных TGF-ß усиливает свою активность, избыточная его экспрессия вызывает тяжелый фиброз. [Willis B.C. et al.,2005; Gharaee-Kermani M. et al., 2009; Biernacka A. et al., 2011].

Тромбоцитар-ный фактор роста (PDGF) В условиях in vitro PDGF стимулирует пролиферацию фибробластов. В условиях пневмофиброза ингибирование PDGF уменьшает активность фиб-рогенеза у животных. Фактор усиливает свою активность у больных с ИЛФ, однако ингибирование PDGF не улучшает выживаемость у пациентов [Abdollahi A. et al., 2005; Trojanowska M., 200S].

Фактор роста соединительной ткани (CTGF) CTGF in vitro усиливает пролиферацию фибробластов и способствует ЭMП. Увеличивает свою активность в блеомициновой модели, избыточная секреция in vivo вызывает тяжелый фиброз. Функционирует в сочетании с TGF-ß [Atamas S.P., 2002; Ihn H., 2002].

Инсулинопо-добный фактор роста (IGF) IGF in vitro усиливает выработку фибробластами молекул ЭЦM. Aot™-ность фактора в условиях блеомицинового пневмофиброза возрастает, но избыточная секреция in vivo не вызывает фиброз. IGF усиливает пролиферацию эпителиальных клеток [Hsu E., Feghali-Bostwick C.A., 200S].

Интерлейкины Эффекты

Интерлейкин-4 (ИЛ-4) Интерлейкин-13 (ИЛ-13) Продуцируются Th-2 клетками, в условиях in vitro вызывают активацию макрофагов, стимулируют пролиферацию фибробластов и производство ЭЦM. Усиливают свою активность при поражении лёгких блеомицином, избыточная экспрессия in vivo вызывает фиброз [Jakubzick C. et al., 2004; Joshi B.H. et al., 200б].

Интерлейкин-17 (ИЛ-17) Провоспалительный цитокин, на модели блеомицинового фиброза усиливает свою активность. В условиях in vivo стимулирует фиброз, который уменьшается при блокировании TGF-ß. ИЛ-17 усиливает свою активность у пациентов с ИЛФ [Wilson M.S. et al., 2010].

Интерлейкин-1 в (ИЛ-1в) Фактор некроза опухоли-a (ФНО-a) Провоспалительные цитокины, которые in vitro стимулируют пролиферацию фибробластов, но снижают синтез коллагена. В условиях блеомицино-вого пневмофиброза усиливают свою активность, их избыточная продукция вызывает воспаление и фиброз. Ингибирование ФНО-а у пациентов с ИЛФ не влияло на фиброгенез [Ortiz L.A. et al., 199S; Hoshino T. et al., 2009].

Интерлейкин-10 (ИЛ-10) Противовоспалительный цитокин, в условиях in vitro подавляет выработку фибробластами молекул ЭЦM. Повышение уровня ИЛ-10 уменьшает блео-мицин-индуцированный фиброз [Sun L. et al., 2011].

1 2

Хемокины Эффекты

CCL3 (MIP-1a) Провоспалительный хемокин, привлекает в лёгкие фиброциты, возможно, костномозгового происхождения [Ishida Y. et al., 2007].

CCL2 (MCP-1) Провоспалительный хемокин, в условиях in vitro увеличивает синтез фиб-робластами компонентов ЭЦМ. На модели блеомицинового фиброза концентрация CCL2 повышается, его блокирование или нокаут обеспечивает защиту от поражения лёгких блеомицином. Предполагается, что CCL2 привлекает в легочную ткань фиброциты костномозгового происхождения [Liu X. et al., 2007].

CCL18 Провоспалительный хемокин, in vitro стимулирует производство фибробла-стами молекул ЭЦМ. В условиях in vivo повышенная экспрессия CCL 18 индуцирует фиброз, однако, сверхэкспрессия в сочетании с блеомицином уменьшает фиброз. Концентрация в сыворотке CCL18 обратно коррелирует с клиническими параметрами фиброгенеза у пациентов с ИЛФ [Pochetuhen K. et al., 2007].

CXCL12 CXCL12 является главным хемокином, который при блеомициновом пнев-мофиброзе отвечает за привлечение фиброцитов в легочную ткань. У больных ИЛФ уровень CXCL12 увеличивается в сыворотке и БАЛ, и обратно коррелирует с параметрами фиброгенеза [Phillips R.J. et al., 2004].

Эффекты

Интерферон-у (y-IFN) Провоспалительный цитокин Th-1-клеток, в условиях in vitro y-IFN подавляет пролиферацию фибробластов и синтез ЭЦМ, усиливает апоптоз фиб-робластов. В условиях in vivo при блеомициновом повреждении лёгких уменьшает фиброз, но введение IFN-y больным ИЛФ не улучшает их выживаемость [King T.E. et al., 2009].

Онкостатин М (Oncostatin M) В условиях in vitro стимулирует пролиферацию фибробластов и производство молекул ЭЦМ, ингибирует апоптоз. Сверхэкспрессия и введение in vivo вызывает воспаление и фиброз [Scaffidi A.K. et al., 2002; Mozaffarian A. et al., 2008].

При организации воспалительного каскада первым этапом являются рецеп-торные взаимодействия. Такие экзогенные раздражители, как патоген-связанные молекулярные паттерны (Pathogen-associated molecular pattern (PAMPs)), которые распознаются Toll-подобными и NOD-подобными рецепторами, и определяют в дальнейшем клеточный ответ [Janeway C.A.Jr., Medzhitov R., 2002]. Эндогенные сигналы также могут формировать воспалительный ответ [Matzinger P., 2002].

В зависимости от доминирующего цитокинового профиля иммунный ответ Т-хелперных клеток разделяют на несколько типов. Первый тип представляют TM-клетки, которые синтезируют ФНО-a, IFN-y, IgG2, имеет провоспалительный характер, второй тип - ^2-клетки, синтезирующие ИЛ-5, ИЛ-4, ИЛ-13, Ig E и

третий тип - ТЫ7-клетки, в последнее время их связывают с провоспалительным состоянием. Например, хроническое воспаление при бронхиальной астме обычно сопровождается повышением профиля цитокинов иммунного ответа 2-го типа (ИЛ-3, ИЛ-5, ИЛ-4, ИЛ-9, ИЛ-13) [Holgate S.T., 2008], в то время как при ИЛФ регистрируется другой провоспалительный профиль цитокинов (ФНО-а, TGF-ß, PDGF, ИЛ-1а, ИЛ-lß) [Agostini C., Gurrieri C., 2006]. При фиброзных заболеваниях лёгких особое внимание обращают на себя цитокины 2-го типа иммунного ответа: TGF-ß, ИЛ-4 и ИЛ-13. Каждый из этих цитокинов демонстрирует значительную профибротическую активность [Strutz F. et al., 2001; Wynn T.A., 2003]. Так, TGF-ß, ИЛ-4 и ИЛ-13 при повреждении привлекают в лёгкие макрофаги, фиб-робласты и миофибробласты, а также стимулируют пролиферацию фибробластов [Wynn T.A., 2004].

У пациентов с ИЛФ, радиационным пневмонитом и криптогенным фибрози-рующим альвеолитом в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) повышается уровень ИЛ-4 [Jakubzick C., Kunkel S.L., 2004]. Рецепторы к ИЛ-4 экспрессируются фиб-робластами лёгких, а ИЛ-4-сигналинг стимулирует отложение коллагена и увеличивает количество белков внеклеточного матрикса. По некоторым данным ИЛ-4 в индуцировании синтеза коллагена фибробластами превосходит TGF-ß1 [Sempow-ski G.D. et al., 1994]. Также известна способность ИЛ-4 активировать макрофаги по так называемому «альтернативному пути активации макрофагов» (alternative activation of macrophages - AA-Mac) [Martinez-Pomares L. et al., 2003]. Об участии макрофагов в патогенезе легочного фиброза известно давно, однако точные механизмы действия и функции AA-Mac в условиях фиброза лёгких выяснены совсем недавно. При AA-Mac наблюдается секреция макрофагами TGF-ß и PDGF, а также усиление полиаминного и пролинового биосинтеза, образование коллагена [Hesse M. et al., 2001]. Prasse A. и соавт. в своих экспериментах удалось выделить и в дальнейшем культивировать макрофаги после альтернативной активации из БАЛ пациентов с ИЛФ. Супернатант этих макрофагов в условиях in vitro значительно увеличивал ССЬ18-зависимым образом синтез коллагена нормальными человеческими фибробластами [Prasse A. et al., 2006].

Самой главной функцией ИЛ-4 является стимуляция дифференцировки Т-клеток в сторону ТМ-клетки с последующей продукцией цитокинов 2-го типа: ИЛ-5, ИЛ-13, ИЛ-9, ИЛ-21. В свою очередь, ИЛ-5 стимулирует созревание эози-нофилов и их миграцию в очаг воспаления [Takatsu K., Nakajima H., 2008]. ИЛ-5 совместно с ИЛ-4 также способствует выработке эозинофилами TGF-ß [Elovic A.E. et al., 1998]. Кроме этого, ИЛ-5 может усиливать секрецию ИЛ-13, а также провоцировать ИЛ-13-зависимый фиброз [Reiman R.M. et al., 2006].

Под действием ИЛ-9 избирательно активируются и привлекаются в лёгкие тучные клетки. Химаза тучных клеток повышает агрессивность TGF-ß и тем самым способствует легочному фиброзу [Tomimori Y. et al., 2003]. Тучные клетки способствуют распространению фибробластов в очаге поражения, синтезу коллагена и матриксных металлопротеиназ [Garbuzenko E. et al., 2002]. По мнению Ma-suda T. и соавт., тучные клетки после стимуляции аллергеном могут быть вовлечены в субэпителиальный фиброз [Masuda T. et al., 2003].

При многих фиброзных состояниях ИЛ-13 является одним из ключевых фиб-рогенных цитокинов [Wynn T.A., 2003; Munitz A., Brandt E.B., 2008]. Он может функционировать независимо от TGF-ß [Kaviratne M. et al., 2004]. ИЛ-21 способен усиливать Th2-легочной ответ и ИЛ-13-связанный фиброз посредством стимуляции экспрессии рецепторов к ИЛ-13 и ИЛ-4. Под влиянием ИЛ-13 происходит дифференцировка фибробластов в a-SMA-экспрессирующие миофибробласты и PDGF-продуцирующие клетки [Ingram J.L., Rice., 2004]. Интересно, что ИЛ-13-контролуемая дифференцировка фибробластов в миофибробласты устойчива к стероидному ингибированию, данный факт объясняет, почему стероиды в лечении фиброза не эффективны.

У пациентов с ИЛФ и бронхиальной астмой легочные фибробласты демонстрируют значительную гиперреактивность к ИЛ-13, TGF-ß и CCL-2 [Kraft M. et al., 2001; Murray L.A. et al., 2008]. ИЛ-13 через различные субъединицы своего рецептора может стимулировать активатор плазминогена и ММР 9, что в дальнейшем приводит к высвобождению активного TGF-ß и развитию легочного фиброза [Lee C.G. et al., 2001]. В условиях in vitro фибробласты человека при совместном

культивировании с эпителиальными клетками, предварительно обработанными ИЛ-13, вырабатывали значительно больше TGF-ß, растворимого и фибриллярного коллагена по сравнению культурами на необработанном эпителии [Malavia N.K. et al., 2008]. Эти эксперименты указывают на то, что ИЛ-13 может прямо или косвенно способствовать синтезу коллагена фибробластами. Wenzel S.E. с коллегами подтвердили необходимость совместного действия TGF-ß и ИЛ-13 для стимуляции синтеза коллагена фибробластами [Wenzel S.E. et al, 2002].

Одним из наиболее изученных профиброзных цитокинов является TGF-ß [Grotendorst G.R. et al.,1989; Letterio J.J., Roberts A.B., 1998]. Ростовой фактор стимулирует пролиферацию фибробластов и синтез ими белков внеклеточного матрикса [Strutz F. et al., 2001], а также опосредованно через провоспалительный хемокин MCP-1 (CCL2) привлекает в очаг воспаления клетки воспаления [Szardening-Kirchner C. et al., 2008]. Также имеются сведения о подавлении цито-кином Т-клеточного иммунного ответа [Letterio J.J., Roberts A.B., 1998; Biernacka A. et al., 2011]. Такие разные эффекты TGF-ß можно объяснить различными источниками и клеточными мишенями [Coker R.K. et al., 1997]. У мышей с легочным фиброзом отмечается избыточная экспрессия TGF-ß. В отличие от ИЛ-13, повышенная экспрессия TGF-ß напрямую не привлекает клетки воспаления и не усиливает секрецию слизи в лёгких [Kaviratne M. et al. 2004]. Возможно при отсутствии значительной воспалительной реакции TGF-ß может непосредственно вызывать фиброз. При этом подавление активности TGF-ß в результате нарушения SMAD-передачи сигналов (small mother against decapentaplegic) [Flanders K.C., 2004] значительно уменьшает развитие глазного [Stramer B.M. et al., 2005], кожного [Lakos G. et al., 2004], почечного [Inazaki K. et al., 2004] и легочного [Bonni-aud P. et al., 2004] фиброгенеза.

Хемокины являются большим семейством хемоаттрактантов, которые участвуют в развитии фиброза лёгкого. Хемокины способны привлекать в очаг поврежденной ткани лёгких лейкоциты, предшественники фибробластов и многие другие эффекторные клетки [Strieter R.M. et al., 2007]. На основании этого можно предположить, что соединения семейства хемоаттрактантов возможно использо-

вать в качестве потенциальных средств для лечения пневмофиброза. Концентрация CCL18 в сыворотке крови пациентов с ИЛФ уменьшается одновременно с ухудшением легочной функции [Prasse A. et al., 2006]. На основании этого наблюдения, по мнению Prasse A. и соавт., CCL18 можно использовать в качестве сывороточного биомаркера прогрессии легочного фиброза [Prasse A. et al., 2009]. Блокирование или генетическое удаление CCL6, CCL2 или CCR1 обеспечивает значительное снижение активности блеомицин-индуцированного фиброза лёгких [Tokuda A. et al., 2000; Moore B.B. et al., 2001]. Важную роль в FITC- и блеоми-цин-индуцированном легочном фиброзе играют такие хемокины, как CCL12, CXCL12 и CCR2. Их профибротическое действие связывают с рекрутированием из костного мозга в лёгкие фиброцитов, которые секретируют коллаген [Phillips R.J. et al., 2004; Moore B.B. et al., 2005; 2006]. При синдроме облитерирующего бронхиолита хемокины CCR2, CXCR2 и CXCR3 участвуют в ремоделировании сосудов, привлекают в лёгкие нейтрофилы и фагоциты [Belperio J.A. et al., 2001; 2002; 2005]. Однако не все хемоаттрактанты оказывают профибротическое действие. Так, CXCR3, CXCL10 и CXCL11 обладают антифибротическим действием: уменьшают миграцию фибробластов и ангиогенез в лёгких, стимулируют секрецию IFN-y [Jiang D. et al., 2004; 2010].

Фибробласты и миофибробласты. При создании профибротического ЭЦМ в лёгких ведущая роль принадлежит фибробластам и миофибробластам. Однако, происхождение фибробластов и миофибробластов в лёгких при фиброзе до конца не ясно. В классическом понимании травма альвеолярного эпителия вызывает активацию резидентных фибробластов с последующей пролиферацией и синтезом компонентов ЭЦМ [Andersson-Sjoland A. et al., 2008]. Ряд исследователей считают, что в поврежденной ткани лёгких под влиянием TGF-ß запускается трансформация эпителиальных клеток в клетки мезенхимального фенотипа (фибробласты, миофибробласты), пул которых значительно увеличивается. Третья гипотеза предполагает участие в пневмофиброзе циркулирующих фиброцитов, источником которых являются мезенхимальные клетки-предшественники костного мозга. Последние выходят из костного мозга в кровь, мигрируют по сосудистому руслу в

поврежденные участки лёгких и там уже дифференцируются в фибробласты и миофибробласты [Gomperts B.N., Strieter R.M., 2007; Strieter R.M. et al., 2007]. Подтверждением гипотезы служат данные Phillips R.J. с соавт., которые зарегистрировали циркулирующий в крови пул CD45--клеток, положительных по коллагену I и CXCR4. Данные клетки назвали «фиброцитами», они направлялись в лёгкие в ответ на травму и приводили к фиброзу [Phillips R.J. et al., 2004]. Механизм рекрутирования фиброцитов из костного мозга в лёгкие предположительно связан с CXCR4, и его лигандом SDF-1/CXCL12, экспрессия которого усиливается в условиях гипоксии [Ceradini D.J. et al.,2004; Phillips R.J. et al., 2005]. Как известно, костный мозг хуже снабжается кислородом по сравнению с окружающими его сосудами и экспрессирует SDF-1 / CXCL12. Повреждение легочной ткани способствуют повышению уровня SDF-1 / CXCL12 в плазме крови и БАЛ [Andersson-Sjoland A. et al., 2008]. Это приводит к рекрутированию фиброцитов по хемотак-сическому градиенту SDF-1 / CXCL12 из костного мозга к поврежденным легким [Christopher M.J. et al., 2009]. Кроме этого, фиброциты продуцируют MMPs, что, по всей видимости, облегчает их трансэндотелиальную и тканевую миграцию [Garcia-de-Alba C. et al., 2010].

Прогрессирующее накопление в ткани лёгких фибробласт-миофибробластных очагов - это отрицательный прогностический фактор: чем больше очагов фиброза, тем хуже прогноз [King T.E. et al., 2001]. При ИЛФ количество фибробластов и миофибробластов, достигнув достаточной массы, в последующем изменяется достаточно редко [Selman M. et al., 2000]. Клинические наблюдения Andersson-Sjoland A. показали, что у пациентов с ИЛФ фиброциты в легочной ткани располагаются не внутри очагов, а в непосредственной близости, в областях с текущими признаками воспаления [Andersson-Sjoland A. et al., 2008]. Впоследствии такие прилегающие области через некоторое время становятся фибробластическими очагами. В данных очагах организуется собственная среда с определенным набором цитокинов, ростовых факторов и тканевых ингибиторов металлопротеиназ (TIMP). Так, альвеолярные макрофаги и фибробласты, полученные от больных с ИЛФ, продуцируют гораздо больше a-SMA и фибронектина,

чем контрольные фибробласты. В исследуемых очагах фибробласты и миофиб-робласты более устойчивы к апоптозу, а молекулы ЭЦM продолжают производиться в избытке [Muro A.F. et al., 2008].

В фазу разрешения (ремодуляция ткани) происходит клеточная реорганизация, сокращение и закрытие раны и последующая реэпителизация. В основу внеклеточного матрикса фиброзированных лёгких входят коллаген, a-SMA и фибро-нектин миофибробластов и фибробластов - [Kadler K.E. et al., 2008]. Кроме этого ЭЦM включает в себя эластин, гликопротеины (такие как PDGF), протеогликаны и гликозаминогликаны (гиалуроновая кислота). Считается, что фибробласты после активации TGF-ß мигрируют вдоль границы внеклеточного матрикса и ремо-дулируют повреждение. Прикрепленные к внеклеточному матриксу на специализированных сайтах («fiibronexus») миофибробласты уменьшают размер поражения. При этом меняется баланс MMPs / TIMPs и коллаген / коллагеназы [Garcia-Alvarez J. et al., 2006; Gill S.E., Parks W.C., 2008]. В фазу разрешения происходит переход от синтеза коллагена к сокращению его продукции. Восстановление альвеолярного эпителия сопровождается апоптозом фибробластов. Вместе с этим из поврежденных участков удаляются клетки воспаления и наиболее интенсивно aSMA синтезирующие миофибробласты [Fattman C.L., 2008].

1.1.3 Лечение 1.1.3.1 Mедикаментозное лечение

В клинической практике различают хирургическое, немедикаментозное и медикаментозное лечение ИЛФ (Таблица 4).

Немедикаментозное лечение Медикаментозное лечение Хирургическое лечение

Программы реабилитации (физические тренировки психосоциальная поддержка, образование) Монотерапия глюкокортикостероидами и антифиброзными лекарственными средствами. Трансплантация лёгких. 5-летняя выживаемость больных после трансплантации по поводу ИЛФ составляет около 50-60%.

Вакцинация от гриппа и пневмококка Комбинированная терапия (в том числе комбинация глюкокортикосте-роидов с азатиоприном или комбинация глю-кокортикостероидов с циклофосфамидом).

Длительная кислородоте-рапия

1. Противовоспалительные средства. В противовоспалительной терапии часто используют глюкокортикостероиды (ГКС) (преднизолон, преднизол), а также их комбинацию с цитостатиками (циклофосфамид, азатиоприн, талидомид, колхицин). При этом монотерапия ГКС эффективна лишь на 20-25% [Meitzer E.B., Noble P.W., 2008]. Циклофосфамид - это цитостатический алкилирующий агент, его иммуносупрессивное действие связано с сокращением числа лейкоцитов и лимфоцитов. Азатиоприн относится к пуриновым цитостатикам, основным механизмом действия азатиоприла является блокада синтеза ДНК в лейкоцитах. Колхицин сокращает синтез макрофагами фибронектина, PDGF и инсулиноподобного фактора роста [Окороков А.Н., 2003; Khalil N., O'Connor R., 2004]. Талидомид используется для лечения миелодисплатического синдрома. Его механизм действия до сих пор неясен, однако наблюдаемое в эксперименте сокращение фиброза сопровождается уменьшением экспрессии ИЛ-6 и VEGF [Gomer R.H., Lupher M.L., 2010; Datta A. et ai., 2011].

Применение цитостатиков ограничивает высокая вероятность развития таких побочных эффектов как желудочно-кишечные нарушения, почечная дисфункция, панцитопения, гонадо- и тератотоксичность [Munson J.C.et al., 2010].

2. Антифиброзные средства. При терапии ИЛФ могут применяться и антифиброзные препараты (пирфенидон, тетратиомолебдат, D-пеницилламин). D-пеницилламин является одним из самых первых антифиброзных препаратов, которые начали применять для лечения фиброза лёгких. Он подавляет медьсодержащую аминоксидазу, что приводит к уменьшению содержания меди в крови

и лёгких и, как следствие, к ингибированию выработки коллагена [Horowitz J.C., Thannickal V.J., 2006]. Подобным эффектом обладает тетратиомолебдат, дополнительно ингибирующий экспрессию TGF-P и ФНО-а и обладающий ангиостатиче-ским эффектом [Datta A., Scotton C.J., Chambers R.C., 2011].

Пирфенидон - производное пиридина (5-метил-1-фенил-2(1Н)-пуридон), снижает пролиферацию фибробластов, дифференцировку и синтез экстрацеллю-лярного матрикса (ЭЦМ), ингибирует транскрипцию TGF-P и ФНО-а [Macias-Barragan J. et al., 2010; Gan Y. et al., 2011; Hisatomi K. et al., 2012]. Пирфенидон нейтрализует свободные радикалы и таким образом уменьшает оксидативный стресс. Пирфенидон оказывает влияние и на белок теплового шока 47, вовлеченный в синтез проколлагена [Chen L. et al., 2009]. В настоящее время проводятся клинические испытания пирфенидона [Azuma A. et al., 2011; Taniguchi H. et al., 2011; Jiang C. et al., 2012]. Пирфенидон был одобрен для терапии ИЛФ в Японии (2010 г.), Китае (2011 г) и в некоторых странах Европейского союза (2011 г.). FDA отказало в применении пирфенидона на территории США по причине незаконченности клинических исследований и большой частоте развития побочных эффектов (фоточувствительность, зуд, сыпь, печеночные дисфункции, желудочно-кишечные расстройства, усталость, сухость кожи, потеря веса, головокружение).

3. Антиоксидантные средства. Еще одним подходом в лечении ИЛФ является применение антиоксидантных препаратов, так как в процессе развития пневмо-фиброза отмечается нарушение баланса в системе оксиданты / антиоксиданты [Horowitz J.C., Thannickal V.J., 2006; Day B.J., 2008]. Так N-ацетилцистеин приводит к увеличению антиоксиданта глутатиона, который снижает уровень свободных форм кислорода и, таким образом препятствует фиброгенезу. Препарат также ингибирует пролиферацию фибробластов [Phan S.H., 1995; Meltzer E.B., Noble P.W., 2008; Behr J. et al., 2009].

4. Цитокиновые препараты. В терапии ИЛФ также возможно применение ци-токиновых препаратов. Например, интерферон у (y-IFN) снижает пролиферацию фиброцитов, их хемотаксис и продукцию коллагена [Khalil N., O'Connor R., 2004; Kim J.H. et al., 2005], подавляет активацию воспалительных клеток [Phan S.H.,

1995], способствует экспрессии ангиостатических хемокинов ELR-CXC (ИЛ-10/CXCL-10), тем самым блокируя сигналы ангиогенного профиля ELR+CXC. Кроме этого, y-IFN регулирует эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП), контролируя экспрессию рецептора фактора роста гепатоцитов на альвеоцитах II типа, что облегчает их дифференцировку в эпителиоциты [Horowitz J.C., Than-nickal V.J., 2006].

Применение других цитокиновых молекул в научных исследованиях также показало хороший эффект на моделях пневмофиброза. Так ИЛ-7 подавляет передачу сигналов фибробластами [Huang M. et al., 2002], а ИЛ-10 снижает выработку в лёгком TGF-p [Millar A.B., 2006; Nakagome K. et al., 2006].

5. Гормональные средства. На мышиных моделях пневмофиброза было показано, что экстракт Sophora flavescencensait. [Chen X. et al., 2008] и аналог мелано-цитостимулирующего гормона [Xu P.B. et al., 2011] противостоят развитию фиброза за счет уменьшения выработки в лёгких профиброзных и провоспалительных цитокинов (ФНО-а, TGF-P, ИЛ-6, MIP-2), усиления метаболизма компонентов ЭЦМ, а также благодаря подавлению пролиферации фибробластов и синтеза коллагена. Похожие эффекты отмечаются у соматостатина и его аналог остреотида, механизм действия которых до конца не ясен [Gomer R.H., Lupher M.L., 2010; Dat-ta A. et al., 2011].

6. Антибиотики. Интересные данные были получены у мышей с пневмофиб-розом при лечении антибиотиками. Так доксициклин и эритромицин уменьшают количество нейтрофилов в бронхоальвеолярном лаваже и снижают токсическое повреждение лёгких, особенно в том случае, когда назначению блеомицина предшествует введение антибиотиков [Li Y.J. et al., 1998; Fujita M. et al., 2006; Moon A. et al., 2012]. Эритромицин и цефотаксим довольно неоднозначно влияли на оксидативную активность альвеолярных макрофагов у крыс. На фоне активно протекающего фиброгенеза в лёгких они дополнительно вызывали повреждение сосудов [Новикова Л.Н. и др., 2008].

7. Ростовые факторы и их ингибиторы. Интересные результаты были получены при использовании ростовых факторов. Применение фактора роста гепатоци-

тов стимулировало образование эпителиальных клеток из мезенхимальных (ЭМП), уменьшало концентрацию профибротического TGF-ß, повышало апоптоз миофибробластов через рецептор c-Met [Khalil N., O'ConnorR., 2004; Shukla M.N. et al., 2009].

Фактор роста кератоцитов оказывает мощное влияние на процессы пролиферации, миграции и дифференцировки эпителиоцитов [Pottier N. et al., 2009; Koval M., 2010]. Фактор роста фибробластов 10 усиливает пролиферацию дистальных альвеолярных клеток-предшественников и значительно снижает депонирование коллагена [Gupte V.V. et al., 2009]. Фактор роста соединительной ткани (CTGF) вырабатывается фибробластами в ответ на стимуляцию TGF-ß. Его блокирование при помощи моноклональных антител (FG-3019) препятствует депонированию коллагена в лёгких [Gomer R.H., Lupher M.L., 2010; Datta A. et al., 2011]. Фактор некроза опухоли (ФНО-а) способствует накоплению фибробластов в лёгких и усилению депонирования в ЭЦМ. В эксперименте продемонстрировано, что антагонист ФНО-а, Etanercept (растворимый TNF-R-Fc), известный как Enbrel, значительно снижает активность фиброгенеза [Ryu J.H., DanielsC.E., 2010].

8. Антисеротониновые препараты. Блокада серотониновых рецепторов 5-НТ2А и 5-НТ2В тергуридом и кетансерином у мышей при блеомицин-индуцированном пневмофиброзе приводит к уменьшению продукции коллагена фибробластами [Fabre A. et al., 2008; Konigshoff M. et al., 2010]. Механизм этого эффекта до конца не изучен, однако считается, что эффект антисеротониновых препаратов может быть связан с уменьшением уровня мРНК TGF-ß, ингибитора активатора плазминогена-1 и CTGF.

9. Гипотензивные средства. Ангиотензиноген является стимулятором продукции проколлагена фибробластами лёгких и мощным индуктором апоптоза эпителиальных клеток [Marshall R.P. et al., 2004]. Такие препараты, как каптоприл (ингибитор ангиотензин-превращающего фермента) [Wang R. et al., 2000], и ло-зартан (антагонист АТ2-рецепторов) облегчают индуцированный блеомицином фиброз лёгкого. Данный эффект объясняется снижением экспрессии TGF-ß и со-

кращением апоптоза эпителиоцитов [Molina-molina M. et al., 2006; Nelson C.A. et al., 2011].

Эндотелин-1 является мощным эндогенным вазоконстриктором, который вовлечен в патогенез легочной артериальной гипертензии при ИЛФ [De Andrade J.A., Thannickal V.J., 2009]. Эндотелин-1 усиливает синтез коллагена, пролиферацию и дифференцировку фибробластов, а также является митогеном для сосудистых гладкомышечных и эндотелиальных клеток [Datta A. et al., 2011]. По экспериментальным данным антагонисты эндотелина-1 (босентан, амбрисентан, маци-центан) ингибируют активацию фибробластов и уменьшают отложение коллаге-новых волокон в лёгких [Gomer R.H., Lupher M.L., 2010; Ryu J.H., Daniels C.E., 2010].

10. Ингибиторы 5-липоксигеназы. Лейкотриены (ЛТ В4/ЛТ C4) и проста-гландин E2 также принимают участие в патогенезе ИЛФ. Лейкотриены оказывают профиброзные эффекты, в то время как циклооксигеназа-2-зависимый проста-гландин E2 обладает антифиброзным действием [Ogushi F. et al., 1999; Horowitz J.C., Thannickal V.J., 2006]. Простагландин E2 подавляет миграцию, пролиферацию и дифференцировку фибробластов в миофибробласты, а также продукцию коллагена [Bozyk P.D., Moore В.В., 2011; Li Y.J. et al., 2011]. Кроме этого, простагландин E2 играет главную роль в так называемом «парадоксе апоптоза» при ИЛФ: чрезмерный апоптоз эпителиоцитов и иммортализация фибробластов [Maher T.M. et al., 2010; Datta A. et al., 2011]. Применяемый в настоящее время для лечения астмы, ингибитор 5-липоксигеназы зулеутон подавляет воспалительную реакцию и отложение коллагена в лёгких [Ali E.N., Mansour S.Z., 2011].

11. Ингибиторы тирозиновых протеинкиназ. Трансмембранные белки, участвующие в передаче сигналов, в частности, от CTGF, VEGF, PDGF и TGF-ß являются тирозиновыми протеинкиназами. Ингибиторы протеинкиназ гефитиниб и иматиниб, применяемые для лечения хронического миелолейкоза, тормозили фосфорилирование тирозина c-Abl, ингибировали выработку PDGF и снижали экспрессию на стволовой клетке рецепторов c-kit [Daniels C.E., Wilkes M.C., Edens M. et al., 2004; De Andrade J.A., Thannickal V.J., 2009; Namba T., Tanaka K.-I.,

Hoshino T. et al., 2011]. Однако клинические исследования этого препарата потерпели неудачу [Ryu J.H., Daniels C.E., 2010].

Существующее медикаментозное лечение может только снизить скорость прогрессирования фиброза и облегчить симптомы заболевания.

1.1.3.2 Хирургические методы

На более поздних стадиях ИЛФ при отсутствии положительного эффекта от проводимого лечения рекомендуют трансплантацию лёгких. Однако данный подход также имеет ограничения и побочные эффекты. Во-первых, ишемия и гипоксия клеток легочной ткани, возникающие в процессе трансплантации, приводят к продукции большого количества высокоактивных веществ (HIF-1, ICAM-1, VEGF). Последние привлекают клетки воспаления и во время реперфузии пересаженных лёгких вызывают отек альвеолярной ткани и в последующем ее деструкцию [Taghavi S. et al., 2002; Dhillon G.S. et al., 2010; Paulus P. et al., 2012]. Во-вторых, легочная артериальная гипертензия, которая постепенно развивается у больных ИЛФ, после операции повышает в капиллярах пересаженного лёгкого кровеносное давление, что приводит к притоку клеток крови, отеку легочного ин-терстиция и быстрой несостоятельности трансплантата [Shorr A.F. et al., 2007; Farkas L. et al., 2009; Fang A. et al., 2011]. В-третьих, до сих пор ведутся споры между сторонниками одно- и двусторонней трансплантации лёгких. Односторонняя трансплантация привлекательна для пациентов меньшими послеоперационными осложнениями, более коротким ишемическим периодом и социальной выгодой для двух реципиентов от одного донора. После проведения двусторонней трансплантации отмечается более полное восстановление дыхательной функции, меньшее несоответствие вентиляции и перфузии долей лёгких и более низкий риск повторного развития ИЛФ [Force S.D. et al., 2011; Puri V. et al., 2011; Sims M.W. et al., 2011]. Однако у обеих операций имеются недостатки: при односторонней трансплантации продолжительность жизни больных меньше, однако при

двусторонней трансплантации в течение первого года жизни отмечается более низкая выживаемость.

Применение данных методов лечения ИЛФ сопровождаются многими побочными эффектами, связанными с типичной реакцией «трансплантат против хозяина» и пожизненным приемом иммуносупрессоров [Окороков А.Н., 2003; Horowitz J.C., Thannickal V.J., 2006; Meltzer E.B., Noble P.W., 2008].

1.1.3.3 Клеточная терапия

В клинической практике пристальное внимание уделяется клеточной терапии с использованием стволовых клеток. СК обладают высоким потенциалом к обновлению, а также способны дифференцироваться в клетки практически всех линий. В настоящее время СК принято делить на эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) и взрослые стволовые клетки (или СК постнатального развития). По сложившимся представлениям СК участвуют в регенерации тканей при заболеваниях нервной системы, поджелудочной железы, печени, миодистрофиях, послеоперационных осложнениях, инфаркте, инсульте, аутоиммунных и других заболеваниях [Pittenger M.F., 2005; Greco S.J. et al., 2008; Li Y.J. et al., 2008; Pittenger M.F. et al., 2008; Feldman B.J., 2009; Kosztowski T. et al., 2009; Laurila J. et al., 2009; Shi X.-L. et al., 2010; Lo-di D. et al., 2011].

1. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК). При заболеваниях лёгких после внутривенного или интратрахеального введения ЭСК мигрируют в легочную ткань и продуцируют противовоспалительные цитокины, что приводит к активации эндогенных СК [Warburton D. et al., 2008; Weiss D.J. et al., 2008]. На блеоми-цин-индуцированной модели фиброза у мышей человеческие ЭСК после введения дифференцировались в альвеоциты I, II типов и клетки Clara, также при этом наблюдалась экспрессия белков сурфактанта [Weiss D.J. et al., 2011; Banerjee E.R. et al., 2012]. Однако сдерживает применение ЭСК в клеточной терапии высокая

вероятность развития злокачественных новообразований [Lodi D. et al., 2011; Trounson A. et al., 2011].

2. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК). Мезенхимальные стволовые клетки постнатального развития были выделены из разных тканей человека и животных. МСК человека (чМСК) являются негематопоэтическими, мультипотент-ными стволовыми клетками, которые могут дифференцироваться в клетки мезо-дермальной линии (остеоциты, адипоциты, хондроциты), а также в клетки энто-дермальной (гепатоциты) и эктодермальной (нейроциты) линий [Ullah I. et al., 2015]. МСК характеризуются экспрессией CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 и отсутствие поверхностных маркеров CD14, CD34, CD45 и HLA-DR. У человека МСК были обнаружены в костном мозге, жировой ткани, эндометрии, пуповине, амниотической жидкости, мягкой ткани зубов. В экспериментах in vitro у чМСК был выявлен большой потенциал к самоподдержанию без значительных изменений их свойств. МСК человека обладают иммуномодулирующими свойствами, способны секретировать цитокины и рецепторы к воспалительным молекулам, что позволяет клеткам регулировать тканевое микроокружение. Мультилинейный потенциал, иммуномодуляция и секреция противовоспалительных молекул позволяют использовать МСК в клеточной заместительной терапии для лечения хронических заболеваний. Многие доклинические и клинические исследования проводились с использованием МСК в лечении хронических сердечно-сосудистых, аутоиммунных, нейродегенеративных и других заболеваний [Leibacher J., Hen-schler R., 2016; Spees J.L. et al., 2016; Sugino N. et al., 2017].

В пользу необходимости применения МСК в терапии ИЛФ выступают следующие результаты. Так, у мышей, получавших блеомицин, после внутривенного введения МСК уменьшается воспаление и содержание коллагена в лёгких, при этом отмечается снижение экспрессии y-IFN, TGF-P, MIP-2 [Moodley Y. et al., 2009]. Эффекты МСК связывают с целым спектром продуцируемых биологически активных веществ: ИЛ-6, 7, 8, 11, 12, 14, 15, М-КСФ, ГМ-КСФ, фактором роста стволовой клетки, SDF-1, CXCR-4 [Rojas M. et al., 2005; Кругляков П.В. и др., 2006]. МСК может продуцировать антагонист рецептора ИЛ 1 (ИЛ-1РА), пред-

ставляющий собой белок, который принадлежит к семейству ИЛ-1 и кодируется геном «IL1RN» на 2-й хромосоме. Связываясь с ИЛ-1РА, он препятствует активации внутриклеточного сигнального каскада провоспалительного ИЛ-1. С другой стороны, отмечается ингибиция пролиферации ИЛ-1-зависимой линии Т-лимфоцитов и продукции ФНО-а и CCL-2 макрофагами [Ortiz L.A. et al., 2007; Saito S. et al., 2011].

За счет активации матриксных металлопротеиназ 2 и 9, подавления функции их ингибиторов, донорские МСК способны снижать активность воспалительной реакции, секреции TGF-ß и депонирования коллагена [Chistiakov D.A., 2010]. В исследованиях A. Cargnoni и соавт. было показано, что кондиционная среда от МСК обладает антифибротической активностью [Cargnoni A. et al., 2012].

В настоящее время имеется информация о вполне успешных результатах клинических испытаний пациентов с умеренным ИЛФ при лечении МСК из жировой ткани. Через 1 год после однократной инъекции 86% клеток от общей популяции МСК показали хорошую функциональную активность в ткани лёгких, при этом серьезные побочные эффекты отсутствовали [Tzouvelekis A. et al., 2013]. В исследовании D.C. Chambers и коллег показано, что по истечении 6 месяцев МСК плаценты человека после трансплантации демонстрировали высокую выживаемость и улучшали качество жизни пациентов с тяжелым ИЛФ, побочные эффекты не обнаруживались [Chambers D.C. et al., 2014]. И в результатах недавнего клинического исследования M.K. Glassberg и соавторы сообщают о прекращении прогрессии ИЛФ после введения аллогенных костномозговых МСК [Glassberg M.K. et al., 2017]. У пациентов с хронической обструктивной болезнью лёгких (ХОБЛ) в 2013 году проводилось подобное клиническое исследования [Weiss D.J. et al., 2013]. Группа из 30 больных ХОБЛ получали 4 ежемесячные инъекции МСК. В течение последующих двух лет у данных пациентов побочных эффектов не было выявлено, однако и значительных терапевтических эффектов не зарегистрировано [Weiss D.J. et al., 2013].

Ежегодно регистрируется большое количество клинических испытаний терапии на основе аллогенных СК. Так, согласно Clinical Trials на 2017 г. заявлено

6648 клинических испытаний терапии различных заболеваний на основе аллоген-ных МСК. При этом число распространенных заболеваний лёгких, для которых рекомендована аллогенная трансплантация МСК, возросло до 21 [Ullah I. et al., 2015]. При многих заявленных терапевтических эффектах и активном продвижении клеточной терапии с использованием чМСК для лечения пациентов обращает на себя внимание то обстоятельство, что из 6648 клинических испытаний 1196 находятся на уровне 3 и 4 фазы испытаний, а с результатами исследования 4 фазы испытаний - 33 исследования.

Перед применением чМСК в больших клинических масштабах необходимо разрешить ряд вопросов. В первую очередь это вопрос безопасности. При ксено-генной и аллогенной трансплантации МСК неизбежно возникновение реакции «трансплантат против хозяина» [Majumdar M.K. et al., 2003; Barry F.P. et al., 2005; Otto W.R., Wright N.A., 2011]. Также довольно серьезным вопросом является долгосрочное культивирование МСК, которое может привести к трансформации клеток, что значительно повышает вероятность развития злокачественных опухолей [Togel F., Westenfelder C., 2011].

В 2017 году была опубликована статистика отдаленных осложнений клеточной терапии [Inamoto Y., Lee S.J., 2017]. Уже сейчас можно говорить о развитии после аллогенной трансплантации солидного рака, болезней печени, почек, сердечно-сосудистых, эндокринных и инфекционных заболеваний, дисфункций гонад и бесплодия, а также таких легочных осложнений как облитерирующий брон-холит и легочная гипертензия.

Также поднимается вопрос о контроле качества чМСК, получаемых для трансплантации. Так, перед использованием чМСК необходимо проведение in vivo исследований на жизнеспособность клеток, анализов на эндотоксины и онко-генные тесты. Важно решить задачу по созданию протокола для определения оптимального количества и конкретного времени введения чМСК пациенту в зависимости от тяжести заболевания [Inamoto Y., Lee S.J., 2017].

3. Гемопоэтические стволовые клетки. Существуют положительные результаты использования гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в качестве транс-

плантационного материала. Так, в исследованиях Krause D.S. и соавт. зарегистрирована способность ГСК дифференцироваться в альвеоциты I типа [Krause D.S. et al., 2001]. Таким образом, ГСК могут проявлять «пластичность» и дифференцироваться в негемопоэтические клеточные линии [Grove J.E. et al., 2004]. На модели блеомицинового фиброза лёгких отмечается регенерация легочной ткани после внутривенного введения ГСК [Hashimoto N. et al., 2004; Kotton D.N. et al., 2004; Kotton D.N. et al., 2005]. Однако при отсутствии повреждения лёгких, введение костномозговых ГСК не приводит к их заселению в легочной ткани [Herzog E.L. et al., 2006]. Не исключено, что существует зависимость процессов мобилизации и миграции ГСК от инициирующих хоминг медиаторов воспаления и других факторов, высвобождающихся после травмы альвеолярной ткани. По результатам Aguilar S. и соавт. отмечается уменьшение экспрессии ФНО-а, CCL-2, CCL-9 и усиление митогенной активности альвеоцитов после трансплантации ГСК в лёгких мышей, получавших блеомицин [Aguilar S. et al., 2009].

4. Тканеспецифичные прогениторные клетки. Считается, что роль тканеспе-цифичных прогениторных клеток (ТПК) могут выполнять кубоидальные клетки II типа, которые способны делиться и восполнять количество альвеоцитов I типа [Mason R.J., Williams M.C., 1977; Brody J.S, Williams M.C., 1992]. Применение блеомицина приводит к развитию фибротического процесса с одновременным сокращением пула ТПК лёгких. В этих условиях трансплантация экзогенных ТПК снижает отложение коллагена в поврежденных блеомицином лёгких, уменьшает в бронхоальвеолярной жидкости содержание лимфоцитов и гранулоцитов и инги-бирует пролиферацию Т-лимфоцитов [Jun D. et al., 2011]. У мышей, получавших блеомицин, после инъекции ТПК человека отмечается формирование бронхиол, альвеол и легочных сосудов [Kajstura J. et al., 2011; Konigshoff M. et al., 2011]. В исследованиях Uzunhan Y. и соавторов использование альвеоцитов II типа, полученных из лёгких здоровых доноров, препятствовало фиброгенезу [Uzunhan Y. et al., 2011]. В других исследованиях, сообщается о том, что человеческие эмбриональные клетки были дифференцированы в альвеоциты II типа in vitro, а затем уже были пересажены в блеомициновые лёгкие животных, тем самым достигался

положительный эффект [Zhou Q.L. et al., 2014]. Между тем, довольно сложно выделять фракцию ТПК из легочной ткани. В этой связи Tanaka K. и соавт. предлагают применять смешанную популяцию эпителиальных клеток лёгких, что приводит к улучшению клеточного микроокружения в поврежденной ткани [Tanaka K. et al., 2014].

Появились данные, подтверждающие участие клеток Клара в восстановлении легочного эпителия [Borthwick D.W. et al., 2001]. Не исключено, что пул ТПК лёгких может восполняться за счет стволовых клеток костного мозга [Banerjee E.R., Henderson W.R., 2012; Ricciardi M. et al., 2012]. Однако механизмы обеспечения этого процесса до конца не изучены.

1.2 Хроническая обструктивная болезнь лёгких 1.2.1 Эпидемиология и этиология

Хроническая обструктивная болезнь лёгких (ХОБЛ) - заболевание, которое характеризуется персистирующим ограничением воздушного потока, которое прогрессирует и является следствием хронического воспалительного ответа дыхательных путей и легочной ткани в ответ на воздействие ингалируемых повреждающих частиц или газов [Global initiative for chronic Obstructive Lung Disease, 2014]. У больных ХОБЛ чаще всего отмечаются оба состояния и в ряде случаев достаточно сложно клинически разграничить их на ранних стадиях заболевания [Чучалин А.Г. и др., 2014].

Согласно данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) ХОБЛ занимает 3-е место в рейтинге причин смерти от всех заболеваний. Исследование летальных случаев в промежутке между 1990 и 2010 годами показало, что смертность от ХОБЛ составляет 2,9 миллиона человек в год [Lozano R. et al., 2012; Roche N. et al., 2016]. В 2012 году от ХОБЛ погибло более 3 миллионов человек, что составляет 6% от общего числа смертей во всем мире [Lozano R. et al., 2012]. Эпидемиологические исследования, проведенные в 12 регионах Российской Фе-

дерации в 2014 году, показали среднюю распространенность ХОБЛ в 15,3 % [Chuchalin A.G. et al., 2014], в то время как более поздние исследования показали распространенность ХОБЛ в России от 6,8% до 21% в зависимости от региона [Andreeva E. et al., 2016]. По прогнозам ВОЗ заболеваемость ХОБЛ и дальше будет увеличиваться из-за постоянного воздействия факторов риска ХОБЛ и старения населения [Global initiative for chronic Obstructive Lung Disease, 2014].

Распространенность ХОБЛ в странах мира разнится. Так, в Чили число больных ХОБЛ очень высоко и превышает 20% от всего населения, в Мексике, напротив, количество больных не превышает 6% [Российское респираторное общество, 2014]. Причинами такой вариабельности могут служить различия в образе жизни людей и интенсивность контакта с разнообразными повреждающими лёгкие агентами.

Отмечена зависимость заболевания от пола и возраста. Так, по данным глобального исследования BOLD, распространенность ХОБЛ II стадии и выше среди лиц старше 40 лет составила 10,1 ± 4,8%, при этом данный параметр у мужчин составил 11,8 ± 7,9%, у женщин - 8,5 ± 5,8%. Основной причиной смерти пациентов ХОБЛ является прогрессирование основного заболевания: около 50-80% больных умирают от респираторных причин, от 8,5 до 27% больных - от опухолей лёгких, остальные - от других респираторных заболеваний [Российское респираторное общество, 2016].

Причинами развития ХОБЛ могут выступать как эндогенные факторы, так и воздействие окружающей среды. Ниже приведен перечень наиболее вероятных причин развития ХОБЛ - это курение, инфекции лёгких, генетическая предрасположенность, профессиональные вредности, бронхиальная астма и бронхиальная гиперреактивность.

Курение. Курение считается одним из ключевых факторов развития ХОБЛ. В индустриальных странах курение вносит вклад в смертность около 60% женщин и 80% мужчин, в развивающихся странах эти цифры немного меньше: у 45% мужчин и у 20% женщин [Eisner M.D. et al., 2010; Lamprecht B. et al, 2011]. Действие табачного дыма на лёгкие курильщиков активизирует множество процессов. К

примеру, происходит выброс протеолитических ферментов, мобилизуются нейтрофилы и макрофаги, развивается оксидативный стресс и ингибируется а1-антитрипсин в легочной ткани, нарушается баланс между протеиназами и ингибиторами протеиназ, что приводит к разрушению межклеточного матрикса и развитию эмфиземы [MacNee W., 2006]. Кроме табачного дыма в лёгкие поступает огромное количество других вредных веществ. У постоянных курильщиков развивается хронический бронхит и гиперсекреция слизи, что приводит к обструкции бронхиальных путей [Guerra S. et al. 2009; Allinson J.P. et al., 2016]. По сравнению с мужчинами, женщины более восприимчивы к табачному дыму. При эквивалентном потреблении сигарет осложнения у женщин более серьезные, чем мужчины [Silverman E.K. et al., 2000; Lopez Varela M.V. et al., 2010]. Это клиническое наблюдение позднее было подтверждено на животных моделях эмфиземы лёгких, индуцированной табачным дымом [Tam A. et al., 2016]. Считается доказанным, что пассивное курение выступает фактором риска развития ХОБЛ [Yin P. et al., 2007]. Активное и пассивное курение женщин во время беременности негативно сказывается на развитии лёгких плода [Tager I.B. et al., 1995].

Инфекции лёгких. Затяжные инфекционные заболевания лёгких могут самостоятельно приводить к развитию ХОБЛ [De Marco R. et al., 2011]. Опубликованы данные о том, что ВИЧ-инфицированные пациенты склонны к инфекциям верхних дыхательных путей, которые характеризуются хроническим течением [Drummond M.B., Kirk G.D., 2014]. Туберкулез также идентифицирован как самостоятельный фактор риска развития ХОБЛ [Byrne A.L. et al., 2015].

Генетическая предрасположенность. Наиболее изученным генетическим фактором развития ХОБЛ является тяжелый наследственный дефицит альфа1 -антитрипсина [Stoller J.K., Aboussouan L.S., 2005]. Альфа1-антитрипсин (ААТ) относится к семейству сериновых протеаз. Главной функцией ААТ является инактивация протеаз, в том числе, секретируемых лейкоцитами во время воспалительных реакций [Carrell R.W. et al., 1996]. Эластаза является довольно агрессивным ферментом для легочной ткани. В норме эластаза - это элемент неспецифической защиты организма, она депонируется в азурофильных гранулах нейтрофи-

лов. При нормальном содержании ААТ длительность действия эластазы на легочную ткань не превышает 20 миллисекунд. Однако при дефиците ААТ влияние эластазы может превышать даже 80 миллисекунд, что неизбежно приводит к деструкции эластических волокон лёгких. В результате эластичные волокна замещаются соединительной тканью, лёгкие теряют свою эластичность, развивается обструкция и формируются эмфизематозные расширения [Knight K.R. et al., 1997; Campbell E.J. et al., 1999; Silverman E.K., Mosley J.D., 2002]. Существуют и другие генетические мутации, предрасполагающие к развитию ХОБЛ: дефекты трансмембранного регулятора муковисцидоза, витамин D-связанного протеина, а2-микроглобулина, цитохрома Р 450 А1, антигенов группы крови, локуса человеческого лейкоцитарного антигена, иммуноглобулиновая недостаточность.

Профессиональные вредности. В процессе работ в производственных зданиях резко увеличивается загрязнение воздуха газами, биологической или минеральной пылью, что значительно повышает риск развития ХОБЛ [Mehta A.J. et al., 2012].

Бронхиальная астма и бронхиальная гиперреактивность. Бронхиальная астма вносит большой вклад в развитие ХОБЛ. Исследование, проведенное в США, показало увеличение в 12 раз риска развития ХОБЛ у пациентов с астмой, чем у пациентов без астмы [Silva G.E. et al., 2004].

В других исследованиях обнаружено нарушение функции лёгких у детей, болеющих бронхиальной астмой [McGeachie M.J. et al., 2016]. Это указывает на необходимость более внимательно отнестись к этому фактору риска в свете контроля ХОБЛ у детей. В отсутствие диагноза «бронхиальная астма», гиперреактивность бронхиальных путей может быть самостоятельным фактором развития ХОБЛ и снижения качества жизни у пациентов [Hospers J.J. et al., 2000].

1.2.2 Патогенез

Долгое время ХОБЛ считалась заболеванием, исключительно связанным с курением. Подробное изучение причин развития ХОБЛ выявило дополнительные

факторы риска, такие как профессиональные вредности и инфекционные заболевания [De Marco R. et al., 2011; Mehta A.J. et al., 2012]. Между тем, при всем разнообразии этих причин было отмечено, что основные пути развития ХОБЛ схожи и главная роль в этом принадлежит хроническому воспалению, а именно клеткам воспаления.

Нейтрофилы. Нейтрофилы постоянно присутствуют в лёгких. Сразу же после повреждения легочной ткани имеет место поступательное увеличение этих клеток в дыхательных путях и появление их в альвеолярной ткани. Многие исследователи регистрировали увеличение нейтрофилов в мокроте пациентов с ХОБЛ наряду с повышением уровня ИЛ-6 [Hunninghake G.W., Crystal R.G., 1983]. В бронхоаль-веолярном лаваже также обнаружены нейтрофилы [Hunninghake G.W. et al., 1979; Martin T.R. et al., 1985]. Долгое время клетки остаются на месте повреждения в достаточно большом количестве [Lams B.E. et al., 1998; Dhami R. et al., 2000]. Количество нейтрофилов в подслизистой основе бронхов хорошо коррелирует с интенсивностью курения сигарет и повреждением лёгких [Lams B.E. et al., 1998].

Нейтрофилы являются главными деструкторами эластического матрикса альвеол при ХОБЛ. Высвобождаемые нейтрофилами ферменты и катионные пептиды способны расщеплять коллаген на фрагменты, последние активируют клетки воспаления и запускают процесс хронического воспаления [Overbeek S.A. et al., 2013]. Такие медиаторы, как ИЛ-8, CXCL-2 и ЛТ B4, концентрация которых повышается в силу повреждения эпителия и эндотелия, дополнительно привлекают нейтрофилы в очаг воспаления [Kobayashi S.D. et al., 2005; Kobayashi S.D., DeLeo F.R., 2009].

Макрофаги. Макрофаги играют ведущую роль в развитии ХОБЛ. Клетки локализуются в эмфизематозно-расширенных участках лёгких, обнаруживаются в повышенных количествах в дыхательных путях, паренхиме, бронхоальвеолярном лаваже и мокроте больных [Shapiro S.D., 1999]. Содержание макрофагов в дыхательных путях соответствуют степени тяжести ХОБЛ [Di Stefano A. et al., 1998]. Макрофаги считаются основными продуцентами матричных металлопротеиназ ММР2, ММР9, ММР12 в легочной ткани [Punturieri A. et al., 2000; Russell R.E.K.

et al., 2002], способствуют распространению воспаления, высвобождая ряд хемо-аттрактантов: фактор некроза опухоли а, ИЛ-8, CXC-хемокины, MCP-1, ЛТ B4 и многие другие [Barnes P.J. et al., 2003].

Т-лимфоциты. Purwar R. и соавт. продемонстрировали наличие обильных резидентных Т-клеток в лёгких человека (более 10 миллиардов) [Purwar R. et al., 2011]. В лёгких обнаружили Т-клетки памяти, Т-регуляторные и Т-хелперные клетки (CD4), которые, в свою очередь, разделены на Th1 и Th2 цитокиновые типы.

Роль Т-клеток в ХОБЛ известна не полностью. Как описано Cosio M.G. и соавт., у курильщиков с ХОБЛ увеличивается количество всех Т-клеточных фенотипов [Cosio M.G. et al., 2002]. В легочной паренхиме у курильщиков одновременно с эмфиземой обнаруживается увеличение Т-клеток, экспрессирующих CD3 и CD8 [Majo J. et al., 2001]. Экспрессирующие CD8 Т-клетки представляют собой подгруппу цитотоксических клеток, убивающих инфицированные или поврежденные клетки, в то время как T-хелперные (CD4) клетки (Th1 клетки) после активации высвобождают цитокины и регулируют активность других воспалительных клеток. При эмфиземе количество CD8+ Т-клеток коррелирует с тяжестью разрушения тканей, и их накопление продолжается даже после прекращения курения [Wang J. et al., 2013]. Важность Т-клеток в развитии эмфиземы была доказана на лабораторных животных. Так, Т-клетки от мышей, подвергшихся воздействию сигаретного дыма, после введения здоровым мышам вызывали деструкцию лёгких. Для этого требовалась совокупность CD8+ и CD4+ Т-клеток [Eppert B.L. et al., 2013].

Цитокины T-хелперных клеток (гамма-интерферон) участвуют в поддержании аутоиммунной реакции. Некоторые авторы относят эмфизему лёгких к заболеванию TM-типа [Shirai T. et al., 2010]. Таким образом, в развитии ХОБЛ возможен аутоиммунный механизм.

Нарушение баланса протеаз-антипротеаз. В здоровом лёгком протеолитиче-ские ферменты уравновешиваются антипротеазами. В 1964 г. эмфизема лёгких была впервые описана как заболевание, связанное с дефицитом антипротеаз [Lau-

rell C.B., Eriksson S., 1964]. Как сообщалось ранее, сигаретный дым и профессиональные вредности привлекают в травмированные лёгкие нейтрофилы и макрофаги, которые производят и секретируют большое количество протеаз. По такому механизму смещается баланс протеаз/антипротеаз в сторону протеолиза и создается протеолитическая среда, состоящая в основном из эластазы и металлопроте-иназы ММР12 [Churg A. et al., 2003; Molet S. et al., 2005], катепсинов L и S [Reilly J.J.J. et al., 1991; Shi G.P. et al., 1992], коллагеназ, ММР2 и ММР9 [Atkinson J.J. et al., 2011]. В лёгких пациентов с эмфиземой значительно снижается содержание эластина [Cosio M.G. et al., 2002]. В плазме крови и моче у пациентов с ХОБЛ уровень продуктов распада эластина более высок, чем у здоровых добровольцев [Harel S. et al., 1980; Schriver E.E. et al., 1992]. Таким образом, продукты распада эластина могут служить биомаркером повреждения лёгких.

В ответ на формирование протеолитической среды система антипротеиназ производит тканевые ингибиторы металлопротеиназ (TIMP) и альфа-1-антитрипсин, являющийся ингибитором лейкоцитарной протеазы [Abboud R.T., Vimalanathan S., 2008]. Однако при длительном воздействии повреждающих факторов имеет место разрушение клеток, продуцирующих альфа-1-антитрипсин. В таких условиях эффективность системы антипротеаз значительно снижается, ХОБЛ прогрессирует.

Образующиеся в результате протеолитической деградации фрагменты внеклеточного матрикса могут действовать как хемокины и локально усиливать воспалительную реакцию в легочной ткани [Hunninghake G.W. et al., 1981; Hautamaki R.D. et al., 1997]. Например, они активируют сигнальный путь рецептора эпи-дермального фактора роста (EGFR) и усиливают выработку ИЛ-8 путем активации NF-kappaB в фибробластах лёгких [Azghani A.O. et al., 2014].

Генетическая предрасположенность. Генетическая детерминанта нарушения баланса протеиназ-антипротеиназ подкреплена данными геномных исследований. Изучение ассоциаций между геномными вариантами и фенотипическими признаками ХОБЛ (англ. genome-wide association studies, GWAS) выявило следующие локусы, имеющие общегеномное значение для развития ХОБЛ: FAM13A на 4q22,

у восходящего энхансера HHIP на 4q31, IREB2 и никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (CHRNA3 и CHRNA5) 15q25, локус 19q13 с генами RAB4B, EGLN2 и CYP2A6, RIN3 14q32, MMP 12 11q22 и TGFB2 1q41 [Hobbs B.D., Hersh C.P., 2014; Castaldi P.J. et al., 2015].Также генетические полиморфизмы MMP12 могут быть вовлечены в развитие ХОБЛ [Yu X.L. et al., 2014]. Мета-анализ выявил связь шести локусов в гене дезинтегрина и MMP33 (ADAM33) с риском развития ХОБЛ [Zhou D.C. et al., 2015]. Генетический анализ в одном из популяционных исследований показал, что ИЛ-1Р и полиморфизмы IL1RN (VNTR) связаны с риском ХОБЛ у жителей Восточной Азии [Xie Z. et al., 2014], IREB2 (rs13180) связан с ХОБЛ в популяции жителей Китая [Guo Y. et al., 2012], генотип ТТ гена MDR-1 значительно чаще встречается у пациентов с ХОБЛ из эгейской части Турции [Toru U. et al., 2014].

Ezzie M.E. и соавторы провели скрининг образцов лёгких у курильщиков с ХОБЛ и без для профилей микроРНК [Ezzie M.E. et al., 2012]. Они обнаружили 70 микроРНК, экспрессированных при ХОБЛ, и предложили несколько членов семейства miR15/107, которые заслуживают дальнейшего изучения в регуляции передачи сигналов TGF-P при ХОБЛ. Метилирование ДНК также является важным регулятором транскрипции генов, который сильно изменяется под воздействием факторов окружающей среды. В крупномасштабном геноспецифическом исследовании меток метилирования ДНК, которые ассоциируются с ХОБЛ, Qiu W. и соавторы идентифицировали уже известные гены (например, SERPINA1) и выявили новых кандидатов в биомаркеры-гены (такие как FUT7) [Qiu W. et al., 2012].

1.2.3 Лечение

В настоящее время Российским респираторным обществом разработан комплекс рекомендаций по лечению ХОБЛ, который включает нефармакологические и фармакологические методы, хирургическое лечение и клеточную терапию. В целом, при лечении ХОБЛ придерживаются 4 основных целей [Российское респираторное общество, 2016]:

• Устранение симптомов болезни и повышение качества жизни пациента;

• Профилактика возможных обострений;

• Замедление прогресса болезни;

• Уменьшение летальности.

1.2.3.1 Нефармакологические методы

1. Прекращение курения. Отказ от курения является одним из самых эффективных методов борьбы с ХОБЛ. Простой разговор с пациентом о вреде курения, психоэмоциональная поддержка родственников помогают отказаться от курения 20-30% пациентов [Pelkonen M. et al., 2001; Chandler M.A., Rennard S.I., 2010]. Дополнительно к этому можно добавить никотинозаместительную терапию, что приводит к прекращению курения через 1 год уже у 35% пациентов [Anthonisen N.R. et al., 1994].

2. Вакцинация. У пациентов с ХОБЛ весьма тяжело протекают воспалительные заболевания лёгких. Вакцинация против гриппа и пневмококковой инфекции значительно снижает вероятность обострения ХОБЛ, а также заболеваемость и число случаев госпитализации [Poole P.J. et al., 2006; Walters J.A. et al., 2010].

3. Длительная кислородотерапия. Хроническая дыхательная недостаточность является одним из наиболее тяжелых осложнений ХОБЛ, которое развивается на поздних этапах заболевания. Гипоксемия не только сокращает продолжительность жизни больных, но и обладает целым рядом нежелательных последствий: полицитемия, аритмия, легочная гипертензия [Cranston J.M. et al., 2005]. Введение кислорода под давлением способно устранить осложнения гипоксемии и снизить летальность больных ХОБЛ [Albert R.K. et al., 2016].

1.2.3.2 Фармакологические методы

1. Бронходилататоры: р?-агонисты. Назначение бронходилататоров приводит к снижению тонуса гладкой мускулатуры бронхов, улучшению спирометрических показателей лёгких и уменьшению гипервентиляции лёгких в покое и при физи-

ческой нагрузке [Thomas M. et al., 2013]. ß2-aroH^Tbi различаются по времени действия: короткого действия (сальбутамол, фенотерол), эффект от которых составляет 3-6 часов, и длительного действия (вилантерол, сальметерол, формоте-рол), эффект от применения сохраняется на 12-24 часа [Sestini P. et al., 2002; Cope S. et al., 2013]. Сальметерол и формотерол существенно снижают гиперинфляцию лёгких, что уменьшает обструкцию дыхательных путей и в целом улучшают качество жизни больных ХОБЛ. Кроме длительной бронходилатации, данные препараты имеют дополнительные эффекты: в нейтрофильных лейкоцитах накапливается цАМФ, что приводит к активации апоптоза [Johnson M., Rennard S., 2001].

ß2-агонисты довольно хорошо переносятся пациентами. Однако при их назначении существует вероятность активации ß-адренорецепторов сердца, что, в свою очередь, может провоцировать ишемию, аритмию, сердечную недостаточность, а также повышать риск внезапной смерти [Decramer M.L. et al., 2013; Kew K.M. et al., 2013]. Применение ß2-агонистов ограничено у больных сахарным диабетом вследствие развития кетоацидоза, поскольку стимуляция ß-адренорецепторов в печени вызывает расщепление гликогена и повышение уровня глюкозы в крови [Philipson L.H., 2002]. Еще одним из наиболее характерных побочных эффектов является дозозависимый тремор, возникающий в следствие прямой стимуляции ß-рецепторов скелетных мышц [Cazzola M., Matera M.G., 2012.].

2. Бронходилататоры: антихолинергические препараты. Антихолинергиче-ские препараты блокируют сокращение гладкой мускулатуры бронхов под действием ацетилхолина, тем самым улучшая легочную функцию, качество жизни и снижают риск развития обострений при ХОБЛ. По длительности эффекта различают коротко действующие (ипратропий) и длительно действующие (аклидиний, тиотропий) антихолинергические препараты [Karner C. et al., 2012; Kankaanranta H. et al., 2015]. Монотерапия антихолинергиками является достаточно эффективной в силу дополнительного ингибирующего воздействия на воспалительный процесс в дыхательных путях [Kistemaker E. M. et al., 2012]. Совместное примене-

ние антихолинергических препаратов с р2-агонистами является более эффективным [Vogelmeier C. et al., 2008].

Клетки воспаления реагируют на активацию никотиновых и мускариновых рецепторов. Так, Т-лимфоциты экспрессируют на своей поверхности Mi и М5 рецепторы [Mita Y. et al., 1996]. Воздействуя на эти рецепторы ацетилхолин приводит к высвобождению ИЛ-2 и усилению пролиферации Т-клеток [Nomura J. et al., 2003]. Избирательная активация М1 рецепторов стимулирует секрецию хемотак-сических факторов бронхиальными клетками человека и таким образом усиливает миграцию в очаг моноцитов и нейтрофилов [Koyama S., et al., 1992].

Ингаляционные антихолинергические препараты хорошо переносятся пациентами. Однако могут быть побочные эффекты, обусловленные блокадой мускариновых рецепторов: тошнота, задержка мочи, повышение внутриглазного давления [Sharafkhaneh A. et al., 2013].

3. Ингаляционные глюкокортикостероиды. Монотерапия ингаляционными глюкокортикостероидами не приносит лечебного эффекта пациентам с ХОБЛ [Yang I.A., Clarke M.S., Sim E.H.A. et al., 2012]. При назначении глюкокортикосте-роидов возможны серьезные побочные эффекты, среди которых недостаточность надпочечников, атрофия кожи, остеопороз, язвенная болезнь, гипертония, диабет, катаракта, риск различных инфекций, гиперадренокортицизм и др. [Smyllie H., Connolly C., 1968; McEvoy C. E., Niewoehner D. E., 2001].

4. Муколитические препараты. Муколитики (карбоцистеин, N-ацетилцистеин) способствуют разжижению и улучшению отхождения мокроты из бронхов, тем самым снижая риск обострения ХОБЛ, но не вызывают изменения функции лёгких [Poole P. et al., 2012].

5. Ингибиторы фосфодиэстеразы (теофиллин). О применении теофиллина в лечении хронической обструктивной болезни лёгких известно уже довольно давно. Теофиллин расслабляет гладкую мускулатуру бронхов за счет ингибирования фосфодиэстераз и увеличения концентрации цАМФ и цГМФ [Rabe K.F. et al., 1995]. В большинстве европейских стран терапия теофиллином считается неэффективной [Barnes P.J., 2005]. Однако исследования некоторых авторов, позволя-

ют рассматривать его в качестве противовоспалительного препарата [Hirano T. et al., 2006]. В большинстве рекомендаций по лечению ХОБЛ теофиллин предлагают назначать пациентам с тяжелой формой ХОБЛ в комбинации с ß2-агонистами. Это значительно улучшает клиническую картину заболевания [ZuWallack R.L. et al., 2001]. Для достижения хорошего эффекта необходимы высокие концентрации препарата в крови, что плохо переносится пациентами, поскольку имеются выраженные побочные эффекты за счет ингибирования фосфодиэстеразы: головная боль, тошнота, рвота, дискомфорт в области живота, а также могут возникнуть судороги и сердечная аритмия [Kirsten D.K. et al., 1993; Zhang Z.-Y., Kaminsky L. S., 1995]

6. Антибиотики. Макролиды, такие как эритромицин и азитромицин, снижают частоту и тяжесть обострений ХОБЛ. Однако быстрое развитие к макролидам резистентности со стороны бактерий и снижение слуха при длительных курсах существенно ограничивают их широкое применение [Donath E. et al., 2013].

1.2.3.3 Хирургические методы

1. Операция уменьшения объема лёгких (Lung volume reduction surgery, LVRS). Это хирургическая процедура, при которой часть лёгкого удаляют для уменьшения гиперинфляции и увеличения механической эффективности респираторных мышц [Martinez F.J. et al., 1997; Criner G. et al., 1998]. После этой операции улучшается скорость выдоха и уменьшается риск возможных обострений. У пациентов после LVRS отмечалось увеличение продолжительности и качества жизни. Однако LVRS приводит к более высокой смертности, чем медицинское лечение у пациентов с тяжелой эмфиземой. С другой стороны, результаты проспективного экономического анализа указывают на высокую стоимость лечения по сравнению с консервативным лечением [Fishman A. et al., 2003; Ramsey S.D. et al., 2003].

2. Буллэктомия. Это более старая хирургическая процедура для лечения бул-лезной эмфиземы: хирурги удаляют большую буллу, которая не выполняет функ-

цию газообмена в лёгких. Это способствует декомпрессии окружающей паренхимы лёгких. Операция обычно дает хороший эффект, но показана для ограниченного числа пациентов с ХОБЛ [Marchetti N., Criner G.J., 2015].

3. Трансплантация лёгких. У пациентов с очень тяжелой формой ХОБЛ трансплантация лёгких улучшает состояние здоровья и функциональную работоспособность, но, к сожалению, не увеличивает продолжительность жизни [Christie J.D. et al., 2012]. Средняя выживаемость всех пациентов с ХОБЛ с трансплантацией лёгких увеличилась до 5,5 лет: 7 лет у пациентов с двусторонней трансплантацией лёгких и 5 лет у тех больных, которые перенесли одностороннюю трансплантацию [Stavem K. et al., 2006]. Трансплантация лёгких ограничена нехваткой донорских органов, высокой стоимостью и развивающимися осложнениями (отторжение трансплантата, облитерирующий бронхиолит, оппортунистические инфекции, лимфопролиферативные заболевания) [Theodore J., Lewiston N., 1990].

1.2.3.4 Клеточная терапия

Отсутствие эффективных мер для восстановления структуры и функции лёгких при ХОБЛ является важным фактором для поиска новых подходов к лечению этого заболевания. Для регенерации утраченных клеток и замены поврежденных структур дыхательной системы предлагают клеточную терапию, основанную на инфузии аллогенных или аутологичных стволовых клеток, и терапию небольшими биологически активными молекулами (хемокины, ростовые факторы) для стимуляции эндогенных стволовых клеток [Akram K.M. et al., 2016].

Одним из направлений клеточной терапии ХОБЛ является использование ме-зенхимальных стволовых клеток. На моделях эмфиземы лёгких были протестированы МСК из различных источников, включая жировую ткань [Shigemura N. et al., 2006; Hong Y. et al., 2016; Cho R.J. et al., 2017], лёгкие [Ingenito E.P. et al., 2012; Abreu S.C. et al., 2017], пуповинную кровь [Kim Y.S. et al., 2015], амниотическую жидкость [Li Y. et al., 2014] и костный мозг[Н^ J.W. et al., 2011; Tibboel J. et al., 2014; Chen Y.B. et al., 2015; Gu W. et al., 2015]. Общая популяция МСК весьма ге-

терогенна и представляет собой совокупность различных по иммунофенотипу клеток. Набор поверхностных антигенов клеток зависит от происхождения и тканевой принадлежности. Считается, что это определяет различия в иммуногенно-сти, противовоспалительной активности и способности регенерировать ткани [Ostanin A.A. et al., 2011; Ricciardi M. et al., 2012].

Эффекты in vivo во многом связаны с фенотипом МСК. Этот вывод был получен при проведении исследования эффективности лечения лабораторных животных с индуцированной эластазой эмфиземой лёгких введением МСК из костного мозга, жировой ткани и лёгких. При клеточной терапии МСК из этих тканей оказывали во многом однотипное терапевтическое действие на сердечно-легочную функцию и лёгкие, в частности, способствовали сокращению эмфиземы, снижали инфильтрацию нейтрофилами альвеолярной ткани и способствовали синтезу эластичных волокон. Между тем, некоторые результаты достигались введением только определенных типов МСК. Так, костномозговые МСК были более эффективны в противовоспалительной терапии, и это, по-видимому, связано с индукцией поляризации макрофагов в противовоспалительный фенотип [Ragni E. et al., 2013]. МСК из костного мозга в большей степени уменьшают легочную артериальную гипертензию и апоптоз эпителиальных и эндотелиальных клеток в лёгких при моделировании эмфиземы лёгких, чем МСК из других тканей [Huh J.W. et al., 2011; Antunes M.A. et al, 2014]. При клеточной терапии скорость приживления МСК в травмированных тканях очень низкая, поэтому основным механизмом, объясняющим их эффекты, независимо от источника, является паракринное действие. Многочисленные исследования показывают, что МСК, полученные из различных источников (костный мозг, жировая ткань, лёгкие, амниотическая жидкость), действуют путем выработки воспалительных и репаративных медиаторов, при этом присутствие трансплантированных клеток на месте поражения не обязательно [Antunes M.A. et al, 2014].

В эксперименте апробированы системный (внутривенный, внутрибрюшин-ный) и локальный (внутритрахеальный, внутрибронхиальный, внутриплевраль-ный, интраназальный) способы доставки МСК к очагу травмы [Antunes M.A. et al,

2014]. При эмфиземе лёгких клеточная терапия МСК эффективна при системном и локальном способах доставки клеточного материала. Между тем, опубликованы результаты, в которых указывается на то, что эффект клеточной терапии МСК зависит от способа введения клеток. Так, внутривенная инъекция более эффективна в иммуномодуляции (индукция поляризации макрофагов, пролиферация эндоте-лиальных клеток, продуцирование фактора роста эндотелия сосудов), в то время как, внутритрахеальное введение дает более эффективную репарацию легочной ткани (снижение гиперинфляции и фиброза лёгких) на эластазных моделях ХОБЛ [Antunes M.A. et al., 2014].

ХОБЛ не следует рассматривать как исключительно легочное расстройство. У пациентов с ХОБЛ со временем развиваются сердечно-сосудистые нарушения, метаболический синдром и другие заболевания [Российское респираторное общество, 2014]. В этой связи одно из предъявляемых требований к клеточной терапии МСК - это снижение инвазивности процедур. Системный путь введения МСК наиболее часто используется в доклинических исследованиях. Однако для достижения терапевтического эффекта трансплантации необходима высокая концентрация сначала циркулирующих МСК и потом избирательно в лёгких, но не в других тканях во избежании побочных эффектов. При существующих технических подходах этого практически невозможно достичь. По этой причине местное введение МСК стало предпочтительным в лечении эмфиземы лёгких [Weiss D.J. et al., 2013].

Большинство исследований позиционирует клеточную терапию МСК как единственное лечение эмфиземы лёгких. Инъекции МСК способствуют восстановлению эмфизематозно расширенных лёгких у лабораторных животных. Клинические испытания показали безопасность клеточной терапии МСК у пациентов с ХОБЛ, при этом улучшения функции лёгких или снижения смертности не наблюдалось [Ribeiro-Paes J.T. et al., 2011; Weiss D.J. et al., 2013]. Во многом это связано с отсутствием решения ряда вопросов, что сдерживает продвижение в клинику легочных заболеваний, в том числе ХОБЛ, монотерапии МСК. Во-первых, нет однозначного понимания фенотипа и характеристики популяции

МСК для клеточной терапии; во-вторых, отсутствует стандартизированный протокол клеточной терапии, где четко были бы прописаны время, продолжительность, предварительная подготовка, дозировка и частота введения, а также путь введения МСК больным ХОБЛ; в-третьих, мало данных о побочных действиях при использовании МСК [Broekman W. et al., 2018; Sun Z. et al., 2018].

С учетом обозначенных выше проблем, многие авторы указывают на необходимость проведения сочетанной терапии стромальными клетками с классическими фармакологическим и/или нефармакологическим методами лечения [Peron J.P. et al., 2015; Hong Y. et al., 2016; Cho R.J. et al., 2017]. Не исключено, что в таком случае может быть потенцирование эффектов или появление регенераторных свойств МСК с восстановлением функции легочной ткани.

Известно, что пиоглитазон с пероксисом-пролифератором-активированным рецептором (PPAR)-y-агонистом усиливает дифференцировку адипоцитов. PPAR-Y экспрессируется МСК. Применение пиоглитазона может изменять фенотип дифференцирующихся МСК и усиливать их пролиферацию и улучшать терапевтические эффекты МСК в сердце [Shinmura D. et al., 2011]. Hong Y. и соавт. трансплантировали жировые МСК, обработанные пиоглитазоном, мышам с эмфиземой лёгких, индуцированной эластазой или сигаретным дымом [Hong Y. et al., 2016]. Предварительно обработанные пиоглитазоном МСК из жировой ткани донора были более эффективны в сокращении участков эмфиземы у реципиента по сравнению с необработанными МСК.

Оптимизация условий культивирования МСК перед клеточной терапией подвергалась активному изучению для улучшения функций этих клеток. Наиболее часто МСК культивируют в двумерном монослое с использованием культураль-ных планшетов. В двухмерных культурах активность пролиферации и дифферен-цировки МСК в клетки стромальных линий может снижаться вплоть до исчезновения. Дополнительная лекарственная нагрузка для восстановления этих свойств in vivo может негативно сказаться на больных. По этой причине активно испыты-ваются методики культивирования МСК в BD-сфероидных культурах. Считается, что формирование сфероида предотвращает апоптоз клеток и облегчает диффе-

ренцировку из-за сохранения межклеточных взаимодействий [Yamaguchi Y. et al., 2014]. Межклеточные взаимодействия важны для выживания и образования колоний. В недавних исследованиях Cho R.J. и коллег изучалось влияние клеточной терапии сфероидными МСК и диссоциированными МСК на индуцированную эла-стазой эмфизему лёгких у мышей [Cho R.J. et al., 2017]. МСК получали из жировой ткани здоровой мыши-донора. По результатам исследования сфероидные МСК представили более высокую экспрессию белка антиапоптотического медиатора Bcl-2 и более низкую экспрессию апоптотического регулятора Bax по сравнению с диссоциированными МСК. Кроме этого, сфероидные МСК демонстрировали лучшие терапевтические эффекты по сравнению с диссоциированными МСК: более выраженное сокращение эмфиземы, более высокая экспрессия FGF-2 в легочной ткани, большее снижение активности MMP2 и экспрессии гена MMP12, большее увеличение экспрессии генов тканевого ингибитора MMP1 и ингибитора лейкоцитарной протеазы [Cho R.J. et al., 2017].

Кроме МСК, стволовыми клетками лёгких человека называют базальные клетки, клетки Клара, c-kit позитивные стволовые клетки лёгких, а также альвео-циты II типа [Lama V.N. et al., 2007; Jarvinen L. et al., 2008; Rawlins E.L. et al., 2008; Heise R.L. et al., 2016]. Сообщалось, что базальные клетки и альвеоциты II типа могут повторно входить в клеточный цикл из состояния покоя, размножаться и способствовать восстановлению тканей после травм лёгких [Rawlins E.L. et al., 2008]. Активность исследования клеточной терапии с использованием всех указанных легочных стволовых клеток крайне низка. Возможно, в силу низкого выхода клеточной массы при культивировании и высокого риска приобретения клетками неопластических свойств.

Доклинические исследования показали, что введение транс-ретиноевых кислот (ATRA) может активировать стволовые клетки лёгких на модели эмфиземы лёгких, индуцированной эластазой. Это приводило к уменьшению площади эмфиземы и регенерации лёгких, выражавшееся в увеличении количества клеток в альвеолах [Ishizawa K. et al., 2004]. Эта работа показала возможность фармакологической (введение ATRA) стимуляции легочных СК для регенерации альвеол.

Интересные результаты были получены при доклиническом исследовании продуктов жизнедеятельности МСК, так называемых экстрацеллюлярных везикул (ЭВ). ЭВ синтезируются клетками и выходят в окружающую среду, способны оказывать паракринное действие на близлежащие ткани. ЭВ имеют размер от 20 до 100 нм и характеризуются их эндосомным происхождением, поскольку они образуются путем слияния мультивезикулярных эндосом с клеточной мембраной [Simpson R.J. et al., 2008; Gyorgy B. et al., 2011; Biancone L. et al., 2012]. Их выделение зависит от активации цитоскелета. ЭВ содержат большое количество эндо-сомальных маркеров, включая тетраспанины (CD63, CD81), белки теплового шока (Hsp70 и Hsp90), взаимодействующий с ALG-2 белок X (Alix), ген восприимчивости опухоли 101 (Tsg101), HLA I и II класса. Кроме этого, в ЭВ часто присутствуют аннексины и клатрин. И самое главное, что в состав ЭВ включаются белки и РНК, которые являются специфическими для источника клеток и их состояния [Thery C. et al., 2009; Zhang B. et al., 2014].

Есть мнение, что ЭВ имеют огромный потенциал для лечения различных заболеваний. Были проведены доклинические исследования терапевтического потенциала ЭВ и получен положительный эффект их применения при заболеваниях почек [He J. et al., 2012], сердца [Lai R.C. et al., 2011] и печени [Tan C.Y. et al., 2014]. Весьма интересные результаты были продемонстрированы и на легочной патологии. Например, при экспериментальной пневмонии ЭВ уменьшали количество клеток воспаления (нейтрофилы) в поврежденных альвеолах [Zhu Y.G. et al., 2014]. На модели легочной гипертензии ЭВ снижали давление в лёгких и правом желудочке, препятствовали развитию гипертрофии правого желудочка и легочной артерии у крыс [Chen J.Y. et al., 2014]. Cruz F.F. и соавт. показали, что системное введение ЭВ, полученных от МСК костного мозга, снижало гиперчувствительность дыхательных путей, воспаление лёгких и количество CD4+ T-клеток у мышей с экспериментальной бронхиальной астмой [Cruz F.F. et al., 2015]. Kim Y.S. с коллегами сообщают об эффективности лечения эмфиземы лёгких назначением ЭВ, полученных от жировых МСК [Kim Y.S. et al., 2017]. При этом авторы связывают терапевтический эффект ЭВ с FGF2-зависимым сигнальным путем.

1.3 Стволовые клетки в регенерации лёгких

1.3.1 Общие сведения о стволовых клетках

В настоящее время стволовые клетки (СК) разделяют на две большие популяции - эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) и стволовые клетки постнаталь-ного развития или взрослого организма (ВСК). ВСК обнаружены практически во всех органах взрослого организма, включая лёгкие [Kajstura J. et al., 2011]. По сравнению с другими клеточными популяциями организма в постнатальный период ВСК - наименьшая клеточная фракция. По локализации выделяют костномозговые, регионарные и циркулирующие в крови стволовые клетки. Внутри тканей ВСК локализуются в специализированных нишах. Стволовые клетки митоти-чески активны, но уступают по этому показателю ЭСК [Thomson J.A. et al., 1998; Jiang Y. et al., 2002]. Взрослые стволовые клетки - весьма гетерогенная фракция. В ее состав входят не только мультипотентные стволовые клетки, но и бипотентные и унипотентные клетки-предшественники. Считается, что мультипотентные ВСК, теряя способность к самообновлению, дифференцируются в унипотентные клетки-предшественники, которые, в свою очередь, дают начало специализированным клеткам того или иного типа ткани [Chao M.P. et al., 2008]. Таким образом, ВСК участвуют в репаративной регенерации в течение жизненного цикла.

Между тем, существует точка зрения о нецелесообразности вовлечения клеток с огромным пролиферативным и дифференцировочным потенциалом в процессы репаративной регенерации. Для этого достаточно митотически активных зрелых клеток и унипотентных клеток-предшественников. Наиболее целесообразно задействовать глубокий резерв тканевой регенерации при массированных повреждениях тканей при травмах и хронических заболеваниях печени, лёгких, сердечно-сосудистой, нервной и других систем. Как правило, патологическая регенерация в корне отлична от репаративной регенерации с точки зрения нарушения течения известных типовых патологических процессов (воспаление и фиброз, и многих других). При патологической регенерации важна слаженная «оркестров-

ка» близлежащих и пространственно удаленных от очага травмы сигнальных каскадов (цитокинов различных семейств, хемокинов, ингибирующих и ростовых факторов), клеток микроокружения и ниш, симпатической нервной системы по координации ВСК [Hong K.U. et al., 2001; Giangreco A. et al., 2002; Theise N.D., 2003; Bjerknes M., Cheng H., 2005; Blanpain C., Fuchs E., 2006; Дыгай А.М., Ску-рихин Е.Г., 2011; Rennert R.C. et al., 2012]. При этом значительной важностью наделяется отрицательная регуляция всех этих процессов. Только при положительном взаимодействии всех этих механизмов реализуется достаточная для восстановления клеток и тканей мобилизация, миграция, рекрутирование, пролиферация и дифференцировка стволовых клеток больного [Rennert R.C. et al., 2012].

1.3.2 Стволовые клетки костного мозга

Гемопоэтические стволовые клетки. Несмотря на огромное представительство в мировой специализированной литературе данных о стволовых клетках костного мозга, мы посчитали необходимым представить краткую характеристику популяций тех клеток, которые, по мнению многих исследователей, участвуют в патогенезе и клеточной регенерации. Костный мозг выступает в качестве резервуара для гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), эндотелиальных прогенитор-ных клеток (ЭПК), мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и малых эмбрионально-подобных клеток (МЭПК). В ответ на высокие концентрации хемокинов или повреждение тканей происходит мобилизация стволовых клеток из костного мозга в циркулирующую кровь [Tepper O.M. et al., 2005; Kucia M.J. et al., 2008; Hamou C. et al., 2009] с последующей миграцией по кровотоку к участку повреждения в мышцах, сердце, почках, коже, костях, печени, мозге [Tepper O.M. et al., 2005; Hamada H. et al., 2006; Schenk S. et al., 2007; Qian H. et al., 2008; Hamou C. et al., 2009; Xynos A. et al., 2010; Deng J. et al., 2011; Park D. et al., 2012; Zhao W. et al., 2012]. Многие авторы полагают участие СК в восстановлении структуры и функций тканей за счет паракринных эффектов [Tepper O.M. et al., 2005; Hamou C.

et al., 2009; Chen Y. et al., 2010; Si Y., Tsou C.L. et al., 2010]. Механизм дифферен-цировки СК в клетки поврежденных органов является основным.

Гемопоэтическая стволовая клетка костного мозга отвечает за пополнение клеточных компонентов крови: лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов. Содержание ГСК составляет около 0,01-0,15% от всех клеток костного мозга [Challen G.A. et al., 2009; Hamou C. et al., 2009]. Используемая для идентификации комбинация поверхностных антигенов состоит из клон-специфического маркера (Lin), CD45, c-kit и/или Sca-1 у мышей и CD34, CD133 у человека [Ratajczak M.Z. et al., 2008; Xynos A. et al., 2010]. ГСК с маркером CD34 играют важную роль в развитии миело- и эритропоэза во время эмбрионального и постнатального развития [Cheng J. et al. 1996]. Кроме упомянутого выше антигенного профиля для изоляции и идентификации ГСК мышей и человека используют комбинацию рецепторов клеточной поверхности семейства SLAM (signaling lymphocyte activation molecule): CD48, CD150 и CD244 [Kiel M.J. et al., 2005; Larochelle A. et al., 2011].

Такое понятие как «ниша» позволило во многом объяснить жизнедеятельность ГСК в норме и при патологии [Schofield R., 1978; Spradling A. et al., 2001; Watt F.M., Hogan B.L.M., 2000]. «Ниша» обеспечивает самовоспроизведение и дифференцировку ГСК и их дочерних клеток-предшественников [Lin H., 2002; Calvi L.M. et al., 2003; Zhang J. еt al, 2003; Moore K.A., Lemischka I.R., 2006; Chan C.K. et al., 2008; Kiel M.J., Morrison S.J., 2008; Wagner W. et al., 2008; Xie Y. еt al., 2009]. Среди факторов, способствующих этому процессу следует выделить наличие молекул внеклеточного матрикса и соседние клетки, продуцирующие факторы роста.

По современным представлениям ГСК локализуются вблизи эндоста, гетерогенного слоя клеток, выстилающего костномозговую полость. Это «эндостальная ниша». Эндостальная выстилка образована остеобластами, остеогенными клетками-предшественниками (часто обозначаемыми как «клетки костной выстилки» -bone-lining cells) и остеокластами, при этом остеобласты рассматриваются как главный клеточный компонент эндоста, отвечающий за регуляцию ГСК [Calvi L.M. et al., 2003; Wu J.Y. et al., 2009]. Клетки экспрессируют Ang-1, удерживаю-

щий ГСК в нише, Bmi-1, отвечающий за пролиферацию, Jagged-1, способствующий самоподдержанию ГСК [Suda T. et al., 1983; Ohishi K. et al., 2003; Pazianos G. et al., 2003; Taichman R.S., 2005]. Паратиреоидный гормон (ПТГ) активирует остеобласты и стимулирует их деление. С другой стороны, ПТГ стимулирует экспрессию Jagged-1 на поверхности остеобластов и через взаимодействие Jagged-1 с Notch1-сигнальным путем регулирует ГСК [Weber J.M. et al., 2006]. Расположение ГСК по отношению к эндосту зависит от их функционального состояния и активности клеток микроокружения [Wilson A., Trumpp A., 200б; Lo Celso C. et al., 2009]. Так, длительно репопулирующие и непролиферирующие ГСК располагаются ближе к остеобластам и эндосту нежели более зрелые мультипотентные или коммитированные клетки-предшественники [Lo Celso C. et al., 2009].

Устойчивые ассоциации CD 150+ ГСК с эндотелиальными клетками сосудов в костном мозге представляют как «сосудистую нишу» для ГСК [Kiel M.J. et al., 2005]. Через эндотелиальные клетки циркулирующие гормоны, цитокины и факторы роста опосредованно влияют на ГСК. Рекруктирование ГСК в «сосудистую нишу» происходит под действием фактора роста фибробластов 4 (ФРФ-4), стро-мального клеточного фактора-1 (SDF-1) и в условиях повышения концентрации O2. Хоминг мобилизованной в кровоток костномозговой ГСК в «сосудистую нишу» осуществляется при низком уровне SDF-1 [Tong Y., Linheng L., 2006]. При повышении уровня SDF-1 наблюдается «возвращение» ГСК в костный мозг.

Поскольку компоненты эндостальной и сосудистой «ниши» находятся в тесной функциональной и структурной взаимосвязи, более правильно говорить об «эндостально-сосудистой нише» для ГСК [Kiel M.J., Morrison S.J., 2008; Lo Celso C. et al., 2009; Xie Y. et al., 2009].

На сегодняшний момент вклад костномозговых ГСК в ремодуляцию и регенерацию тканей остается неопределенным. Известны отдельные сообщения о мобилизации ГСК из костного мозга в кровоток у пациентов при инфаркте миокарда [Massa M. еt al., 2005], инсульте [Paczkowska E. еt al., 2009], поражении печени [Gehling U.M. et al., 2010] и ожогах кожи [Drukala J. еt al., 2012]. Озвучена гипотеза о том, что ГСК может дифференцироваться в клетки пораженной ткани и, тем

самым, восстанавливать ее структуру и функцию [Orlic D. et al., 2001; Lin F. et al., 2003]. Однако доказательства пластичности ГСК in vivo не представлены. Между тем, нельзя исключить из обсуждения пластичности ГСК того, что системные и местные инъекции ГСК при соответствующем цитокиновом сопровождении улучшают состояние травмированной ткани [Balsam L.B. et al., 2004; Si Y. et al., 2010].

Эндотелиальные прогениторные клетки. Эндотелиальные прогениторные клетки участвуют в васкулогенезе постнатального периода онтогенеза. Известны гемопоэтические и негемопоэтические ЭПК. Для каждой из субпопуляций ЭПК характерен специфический поверхностный профиль антигенов и функции [Asahara T. et al., 2011].

ЭПК гемопоэтического происхождения - эта васкулогенная субпопуляция клеток. Есть мнение, что эти клетки происходят из костномозговых ГСК [Asahara T. et al., 2011] и представляют собой альтернативу резидентным предшественникам эндотелиальных клеток [Yoon C.H. et al., 2005; Shepherd R.M. et al., 2006]. У человека ЭПК гемопоэтического происхождения экспрессируют маркер CD34, у мыши - c-kit/Sca-1. Кроме этого, описана ко-экспрессия маркеров эндотелиальной клетки (CD31, vWF, VEGFR2), пан-гемопоэтического маркера (CD45) и моноци-тарных маркеров (CD14 и CD163) [Yoon C.H. et al., 2005; Timmermans F. еt al., 2007; Yoder M.C. et al., 2007; Timmermans F. et al., 2009]. Клетки секретируют VEGF, ИЛ-8, хемокин CXCL8 и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), ремодулируют и регенерируют сосуды, в основном, через пара-кринные механизмы [Yoon C.H. et al., 2005; Yoder M.C. et al., 2007]. С другой стороны, ЭПК гемопоэтического происхождения способны включаться в эндотелий сосудов [Bailey A.S. et al., 2006; Asahara T. et al., 2011].

ЭПК негемопоэтического происхождения негативны по маркеру CD45 и маркерам моноцитов, но при этом экспрессируют антигены зрелых эндотелиаль-ных клеток [Yoon C.H. et al., 2005; Yoder M.C. et al., 2007; Timmermans F. et al., 2009]. Предположительно, клетки происходят из кровеносных сосудов или неге-мопоэтических клеток костного мозга [Asahara T. et al., 2011]. Для них характерна

низкая секреторная активность. Полагают, что ЭПК негемопоэтического происхождения мигрируют к очагу повреждения, дифференцируются в эндотелиальные клетки и таким образом участвуют в формировании сосудов [Yoder M.C. et al., 2007].

При многих заболеваниях ЭПК важны в регенерации тканей. Так, в ответ на ишемическое повреждение происходит мобилизация костномозговых ЭПК [Massa M. еt al., 2005; Sandri M. et al., 2011]. Мобилизованные ЭПК участвуют в неовас-куляризации, дифференцируясь в эндотелиальные клетки и секретируя VEGF, SDF-1, IGF-1 [Tepper O.M. et al., 2005; Urbich C. et al., 2005]. Надо отметить, что секретируемые ЭПК цитокины дополнительно содействуют миграции зрелых эн-дотелиальных клеток и резидентных клеток-предшественников в область формирования сосуда. При дефиците и дисфункции ЭПК наблюдается плохое заживление ран и утяжеление течения сахарного диабета [Fadini G.P. et al., 2005; Sorrenti-no S.A. et al., 2007]. Опыты с трансплантацией показывают, что аллогенные костномозговые ЭПК препятствуют расширению травмы и улучшают функциональные показатели животных в условиях инсульта [Fan Y. et al., 2010] и инфаркта миокарда [Schuh A. еt al., 2008], повреждения печени и лёгких [Lam C.F. et al., 2011; Nakamura T. et al., 2011].

Мезенхимальные стволовые клетки. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) костного мозга - это клетки негемопоэтического происхождения. МСК выделены не только из костного мозга [Pittenger M.F. et al., 1999], но и из жировой ткани [Zuk P.A. et al., 2001], крови [Chong P.P. et al., 2012], лёгких, мозга [Da Silva Meirelles L. et al., 2006], семенников [Дыгай А.М. и др., 2019] и скелетных мышц [Dodson M.V. et al., 2010]. В естественных условиях МСК находятся в периваску-лярной нише [Da Silva Meirelles L. et al., 2006; Feng J. et al., 2010].

На костномозговых МСК человека определяются антигены CD105, CD73 и CD90, при этом отсутствуют клон-специфические маркеры lineage-specific и CD34 [Dominici M. et al., 2006]. МСК костного мозга мышей экспрессируют Sca-1 и/или PDGFRa, при этом поверхностные маркеры гемопоэтических клеток не определяются [Hamou C. et al., 2009; Morikawa S. et al., 2009]. По функциональным ха-

рактеристикам МСК костного мозга мышей во многом сопоставимы с человеческими: клеткам присущи самообновление, адгезия к пластику, мультипотентность (дифференцировка в пробирке в остеобласты, адипоциты и хондробласты) [Pittenger M.F. et al., 1999; Horwitz E.M. et al., 2005]. Дополнительно МСК мышей способны дифференцироваться in vitro в миоциты, кератиноциты и нейроноподобные клетки [Sasaki M. еt al., 2008; Bae K.S. et al., 2011].

В других исследованиях МСК костного мозга определяются по экспрессии на своей поверхности CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, они негативны по CD31, CD34, CD45, HLA-DR [Nejad-Moghaddam A. et al., 2015]. Эти клетки мультипо-тентны и способны к самоподдержанию [Foronjy R.F., Majka S.M., 2012; Kruk D.M. et al., 2018].

По разным источникам МСК костного мозга составляет 0,001% - 0,08% от общего количества миелокариоцитов [Pittenger M.F. et al., 1999; Hamou C. et al., 2009]. При экспериментальной травме МСК мобилизуются в кровь [Hamou C. et al., 2009; Chen Y. et al., 2010] и мигрируют в поврежденный участок ткани [Hamou C. et al., 2009; Chen Y. et al., 2010], где за счет паракринного механизма (секреция HGF, EGF, VEGF и sFRP-4) способствуют регенерации клеток [Nguyen B.K. et al., 2010; Katsha A.M. et al., 2011]. Не исключается участие МСК в регуляции внеклеточного матрикса [Xu X. et al., 2005; Nguyen B.K. et al., 2010], иммунном ответе (ИЛ-1 антагонизм, секреция ИЛ-10) [Ortiz L.A. et al., 2007; Dayan V. et al., 2011], пролиферации и дифференцировке регионарных клеток-предшественников [Hat-zistergos K.E. et al., 2010]. МСК костного мозга вовлекаются в восстановление целостности сосудов и неоваскуляризацию при ишемии кожи у мышей [Kasper G. et al., 2007; Hamou C. et al., 2009]. В условиях экспериментальной травмы МСК костного мозга способны дифференцироваться в кардиомиоциты [Li Z. et al., 2009], мезангиальные клетки почек [Wong C.Y. et al., 2008], остеобласты [Park D. et al., 2012], клетки скелетных мышц [De La Garza-Rodea A.S. et al., 2011] и нейроноподобные клетки [Deng J. et al., 2011]. Однако эти события крайне редки, и, вероятно, менее важны в регенерации сосудов, чем вышеупомянутые механизмы действия.

Озвученные свойства костномозговых МСК делают их особенно привлекательными для клеточной терапии. Аутологичные МСК костного мозга, во-первых, поддерживают у реципиента образование новых сосудов, повышают эффективность окислительного фосфорилирования в митохондриях кардиомиоцитов и улучшают общую сердечную функцию в условиях моделирования ишемии миокарда [Li Z. et al., 2009; Hughey C.C. et al., 2012]. Во-вторых, при экспериментальной травме ускоряют регенерацию мозга [Borlongan C.V. et al., 2011], печени [Zhao W. et al., 2012], почек [Qian H. et al., 2008] и лёгких [Pati S. et al., 2011], участвуют в формировании иммунной толерантности [Ge W. et al., 2010; Jui H.Y. et al., 2012].

Малые эмбрионально-подобные клетки. Из всех стволовых клеток костного мозга малые эмбрионально-подобные клетки (МЭПК) наиболее примитивная [Kucia M. et al., 2006; Zuba-Surma E.K. et al., 2008; Sovalat H. et al., 2011] и малочисленная популяция: у мышей составляет 0,006% от всех клеток костного мозга [Zuba-Surma E.K. et al., 2008]. МЭПК отличают малые размеры, большое ядро и сдвиг ядерно-плазматического отношения в сторону ядра, высокая теломеразная активность и плюрипотентность: способность дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков [Kucia M. et al., 2006]. Все эти свойства характерны и для эмбриональных стволовых клеток. МЭПК негативны по lineage- и CD45. У мышей наблюдается экспрессия CXCR4 и Sca-1, у человека - CD133 и CD34 [Zu-ba-Surma E.K. et al., 2008; Sovalat H. et al., 2011]. Кроме этого, на клеточной поверхности МЭПК выявляются антигены плюрипотентности (Oct-4, SSEA-1) [Kucia M. et al., 2006] и антиген эпибласта/зародышевой линии стволовых клеток [Shin D.M. et al., 2010].

На ранней стадии гаструляции МЭПК, возможно, принимают участие в формировании тканей и органов, репопулируют ткани и являются предтечей ткане-специфичных СК постнатального развития [Ratajczak M.Z. et al., 2008]. Обладая плюрипотентностью на уровне ЭСК и регенеративным потенциалом, МЭПК костного мозга участвуют в посттравматической регенерации ткани. Этот вывод основан на клинических и экспериментальных наблюдениях. Известна мобилиза-

ция клеток в кровь у животных в условиях экспериментальной травмы и у пациентов с ишемической болезнью сердца и инсультом [Kucia M.J. et al., 2008; Paczkowska E. et al., 2009; Wojakowski W. et al., 2009]. При индуцированном инфаркте миокарда небольшая часть МЭПК подвергается дифференцировке в кар-диомиоциты [Dawn B. et al., 2008].

1.3.3 Рекрутирование стволовых клеток

Рекрутирование СК костного мозга в поврежденную ткань - это одно из необходимых условий для регенерации. В процессе рекрутирования СК проходит многие этапы: мобилизация из костного мозга в кровоток, хоминг, движение по сосудам, адгезия на эндотелии, миграция через эндотелий (трансэндотелиальный переход) и, наконец, движение в пределах внеклеточного пространства к месту повреждения. Обеспечивает рекрутирование каскад биологически активных молекул. Основной молекулой рекрутирования считается фактор стромальных клеток (stromal cell-derived factor 1, SDF-1), другое название - хемокин подсемейства CXC (chemokine (C-X-C motif) ligand 12, CXCL12). У человека SDF-1 (или CXCL12) кодируется геном CXCL12.

В эмбриогенезе SDF-1 управляет миграцией разных типов стволовых клеток и играет важную роль в формировании органов [Lewellis S.W., Knaut H., 2012].

Во взрослом организме SDF-1 является хемоаттрактантом [Rankin S.M., 2012]. Мишенью для SDF-1 выступают ГСК и В-лимфоциты [Rankin S.M., 2012], ЭПК [Hiasa K. et al., 2004; Tang Y.L. et al., 2005], МСК и МЭПК [Kucia M. et al., 2006; Liu X. et al., 2011]. В основе мобилизации и самонаведения в постнатальный период лежит взаимодействие цитокина SDF-1 с рецептором (CXCR-4) на клетках костного мозга [Abbott J.D. et al., 2004; Ceradini D.J. et al., 2004]. Наиболее полно описана регуляция рекрутирования ГСК [Kavanagh D.P., Kalia N., 2011]. Полагают, что SDF-1 не дает ГСК раньше времени покинуть «нишу» в костном мозге, а с другой стороны, обеспечивает мобилизацию и высвобождение после травмы. Многие авторы отмечают схожесть основных узловых моментов взаимодействия

SDF-1 с CXCR-4 на ГСК и других субпопуляциях СК [Chavakis E. et al., 2008; Chen F.M. et al., 2011].

До определенного момента считалось, что SDF-1 взаимодействует только с рецептором CXCR4 (CXCL12-CXCR4) [Bleul C.C. et al., 1996]. Однако были получены доказательства связывания CXCL12 с CXCR7 [Bleul C.C. et al., 1996; Balabanian K. et al., 2005; Burns J.M. et al., 2006; Cruz-Orengo L. et al., 2011]. При этом активность хемокина связана с такими провоспалительными стимулами, как ЛПС, фактор некроза опухоли и ИЛ-1. Кроме этого, SDF-1 стимулирует пролиферацию, защищает злокачественные В-клетки от апоптоза при хроническом лим-фоцитарном лейкозе [Burger J.A. et al., 2000].

SDF-1 находится под контролем индуцируемого гипоксией фактора 1а (hypoxia-inducible factor-1а - HIF-1a) [Youn S.W. et al., 2011]. Гипоксия в костном мозге активирует SDF-1 и приводит к его связыванию с рецептором CXCR4, к примеру, на ГСК [Ceradini D.J. et al., 2004]. В результате модулируется экспрессия молекул адгезии, возрастает пролиферация и выживаемость клеток [Lataillade J.J. et al., 2000; Hidalgo A. et al., 2001; Liu X. et al., 2011]. В условиях гипоксии, индуцированной инсультом, возникающая гипоксия способствует секреции SDF-1 эн-дотелиальными клетками и тромбоцитами. Возникающий градиент концентрации хемокина способствует СХСК4-опосредованной мобилизации стволовых клеток костного мозга (в частности ГСК и ЭПК) в кровь и миграции к очагу поражения [Ceradini D.J. et al., 2004; Hiasa K. et al., 2004; Tang Y.L. et al., 2005; Massberg S. et al., 2006; Youn S.W. et al., 2011].

Механизм SDF-1-опосредованной мобилизации стволовых клеток костного мозга до конца не изучен. Многие исследователи утверждают, что в этот процесс вовлекаются и другие молекулы [Hiasa K. et al., 2004; Kwon S.M. et al., 2008; Bel-ema-Bedada F. et al., 2008; Si Y. et al., 2010; Li Y. et al., 2011]. Так, после SDF-1-опосредованной мобилизации стволовые клетки мигрируют и находятся в кровеносных сосудах зоны ишемической травмы, затем преодолевают CXCR4 десенсибилизацию, происходит миграция к очагу поражения и тканеспецифическая адгезия [Peled A. et al., 1999; Ceradini D.J. et al., 2004]. Не исключено участие в этом

процессе матриксной металлопротеиназы 9 (MMP9) стромальных клеток, которая участвует в ремодуляции внеклеточного матрикса [Heissig B. et al., 2002].

Оксид азота (NO) играет важную роль в гомеостазе сосудов. При повреждениях тканей эта сигнальная молекула принимает участие во взаимодействии SDF-1 и CXCR4 стволовых клеток костного мозга. Однако это участие опосредованное. Так, в ишемической ткани мыши эндотелиальная синтаза оксида азота (endothelial nitric oxidesynthase, eNOS) повышает экспрессию SDF-1, вовлекая в этот процесс цГМФ-зависимый механизм [Li N. et al., 2009]. Блокирование eNOS ингибирует SDF-1-опосредованный хоминг эндотелиальных прогениторных клеток [Hiasa K. et al., 2004]. Кроме этого, eNOS через ICAM-1- и CXCR4- зависимые механизмы участвует в адгезии клеток-предшественников эндотелиальных клеток на поверхности сосудистого эндотелия [Kaminski A. et al., 2008]. ICAM-1 представляет собой молекулу межклеточной адгезии 1 типа и принадлежит к суперсемейству иммуноглобулинов.

Notch-сигналинг принимает активное участие во многих процессах взрослого организма, в том числе в регуляции самообновления, экспансии, выживания и дифференцировки стволовых клеток [Varnum-Finney B. et al., 2000; Conboy I.M. et al., 2005; Mizutani K. et al., 2007]. На модели ишемического повреждения у мышей продемонстрирована важность взаимодействия Notchl с его лигандом Jagged для рекрутирования МСК и ЭПК костного мозга [Kwon S.M. et al., 2008; Li Y. et al., 2011]. По результатам своих исследований Wang Y.C. и соавт. выдвинули гипотезу о существовании Notch-опосредованной регуляции CXCR4 рецептора на клетках костного мозга [Wang Y.C. et al., 2009]. Уменьшение экспрессии CXCR4 рецептора на поверхности костномозговых МСК у Notch-нокаутных мышей отчасти подтверждают взаимодействие CXCR4 и Notch сигналинга [Li Y. et al., 2011].

Относящийся к группе CC-хемокинов (в-хемокинов) CCL2 (C-C motifligand 2) или MCP-1 представляет собой мощный фактор хемотаксиса моноцитов в организме млекопитающих. Цитокин контролирует активность клеток костного мозга, в частности, их миграцию к очагу воспаления. Рецептором для MCP-1 является CCR2 (C-C chemokine receptor type 2 или CD192 (кластер дифференциации 192)).

Продемонстрирована важность взаимодействия МСР-1 с рецептором CCR2 для хоминга и приживления в очаге поражения костномозговых стволовых клеток у мышей с ишемией миокарда [Belema-Bedada F. et al., 2008]. MCP-1-опосредованная миграция и хемотаксис мобильных клеток происходят за счет формирования ламелиподий от их тела путем сокращения внутренних нитей актина цитоскелета [Belema-Bedada F. et al., 2008]. Однако, по мнению ряда авторов, MCP-1/CCR2 путь сигналинга не столь распространен для стволовых клеток, как к примеру SDF-1/CXCR4 сигналинг. На это указывает незначительное количество CCR2 рецептора на поверхности ЭПК человека [Walenta K.L. et al., 2011].

В качестве молекул мобилизации и рекрутирования стволовых клеток костного мозга рассматриваются VEGF и G-CSF. На различных моделях патологии продемонстрировано содействие VEGF и G-CSF мобилизации СК в травмированную ткань, васкулогенезу и регенерации тканей [Hopkins S.P. et al., 1998; Hattori K. et al., 2001; Wu X. et al., 2008; Pitchford S.C. et al., 2009]. Создавая градиент концентрации хемокина в области травмы введением экзогенного G-CSF, можно снизить концентрацию SDF-1 в костном мозге у мышей, что способствует СХСЯ4-опосредованной мобилизации ГСК и ЭПК [Levesque J.P. et al., 2003; Pitchford S.C. et al., 2009].

Как известно, активность VEGF напрямую связана с экспрессией VEGFR на поверхности клеток костного мозга. Взаимодействие VEGF с VEGF-рецептором-2 (VEGFR-2) стимулирует миграцию и выживание в участке травмы ЭПК [Pitchford S.C. et al., 2009]. При этом возможно вовлечение VEGF в HIF-la-индуцированную неоваскуляризацию у мышей [Oladipupo S. et al., 2011]. В свою очередь, контакт VEGF с VEGF-рецептором-! (VEGFR-1) ингибирует мобилизацию ГСК. Между тем, существует опасность использования VEGF и G-CSF для терапии. У человека одновременно с действием на стволовые клетки VEGF и G-CSF способствуют мобилизации и миграции в зону поражения специфических клеток для поддержания ишемии конечностей и ишемического инсульта [Hasselblatt M. et al., 2007; Brandao D. et al., 2011].

Рекрутирование СК в область травмы сопровождается экспрессией множества молекул, которые участвуют в продвижении клеток по сосудам и адгезии, их трансэндотелиальной миграции и миграции во внеклеточном пространстве. В этой связи важны такие молекулы движения клеток, как селектины (Р-селектин, E-селектин) [Ruster B. et al., 2006; Thankamony S.P., Sackstein R., 2011], молекулы адгезии (VCAM-1/VLA-4, ICAM-1/ß2 интегрин) [Ruster B. et al., 2006; Yoon C.H. et al., 2006; Thankamony S.P., Sackstein R., 2011], хемокины или молекулы трансэндотелиальной миграции (CXCL9, CXCL16, CCL20, CCL25) [Chamberlain G. et al., 2011]. Особая роль для успешной клеточной миграции в поврежденной ткани принадлежит разрушающим внеклеточный матрикс ферментам/ингибиторам (ММР2, ММР9, тканевой ингибитор металлопротеиназы-2) [Ries C. et al., 2007; Tondreau T. et al., 2009]. В условиях травмы только согласованная работа всей этой сложной молекулярной сети позволяет собирать в поврежденном участке ткани определенный набор СК и вовлекать их в регенерацию.

1.3.4 Стволовые клетки при хронической обструктивной болезни лёгких

Лёгкое представляет собой сложный орган, в организации которого принимают участие более 40 различных дифференцированных типов клеток, при этом в разных анатомических областях легочной ткани выявлен свой предшественник (стволовая клетка) [Sueblinvong V., Weiss D.J., 2010; Kajstura J. et al., 2011]. Пребывая в малом количестве, СК наиболее часто локализуются в специализированных «нишах» внутри легочной ткани и/или сосудах. Считается, что СК способствуют физиологической регенерации легочной паренхимы в условиях нормальной жизнедеятельности. При развитии ХОБЛ происходит массированное разрушение микро- и макроструктуры лёгких. Поэтому вполне закономерно привлечение различных стволовых клеток для регенерации поврежденной легочной ткани.

Базальные клетки эпителия трахеи и бронхов. Еще в 1995 г. было показано, что эпителиальные клетки бронхов человека после трансплантации в оголенную трахею крысы способны дифференцироваться в большое количество клеточных

линий с различной способностью дифференцировки, в том числе и в железистые клетки [Engelhardt J.F. et al., 1995]. Эти эксперименты продемонстрировали огромный регенераторный потенциал клеток, который возможен только у СК. Дальнейшие исследования с использованием новых технологий, в том числе им-мунофенотипизации, расширили представления о СК трахеи и бронхов. Так, ба-зальные клетки эпителия трахеи и бронхов экспрессируют на своей поверхности CD44, CD49f, CD151, CD166, NGFR и EGFR, а в их цитозоле обнаружены цито-кератины СК5, СК14, СК17 и p63 [Nakajima M. et al., 1998; Evans M.J. et al., 2001; Rock J.R. et al., 2009; Ghosh M. et al., 2013]. После трансплантации эти клетки могут полностью восстановить эпителий. Так, в исследованиях Van de Laar E. и со-авт. базальные клетки эпителия трахеи человека с иммунофенотипом CD44+CK5+p63+ способны были восстановить поверхностный и слизистый эпителий после 5 недель культивирования на оголенной трахее [Van de Laar E. et al., 2014]. Трансплантация базальных клеток эпителия бронхов человека в поврежденные нафталином лёгкие мышей приводила к восстановлению эпителия [Ghosh M. et al., 2017]. В этой связи, базальные клетки эпителия трахеи и бронхов могут считаться стволовыми клетками.

Незрелые клетки трахеи и бронхов фенотипически и функционально многообразны. К примеру, известно, что у человека базальные клетки эпителия трахеи (CD44+CD166+NGFR+) и железистые клетки подслизистой основы трахеи (CD166+) in vitro демонстрируют одинаковую способность к самообновлению и дифференцировки в эпителиальные клетки [Hegab A.E. et al., 2012]. В свою очередь, базальные эпителиальные клетки с фенотипом CD151-CK5+CK14+TF+ обладают высоким митотическим индексом [Ghosh M. et al., 2013], а базальные эпителиальные клетки бронхов, экспрессирующие CD49f, NGFR, p63 способны как к самообновлению, так и к дифференцировке в ресничные и секреторные клетки трахеи [Rock J.R. et al., 2009].

Исследования Shaykhiev R. и соавт. показали, что эпидермальный фактор роста (EGF), действуя in vitro на рецепторы EGFR базальных клеток бронхов третьего и четвертого порядка, влияет на их дифференцировку, при этом наблюдается

экспрессия плоскоклеточных (CK14, CK6) и мезенхимальных маркеров (вимен-тин). С другой стороны, ухудшается их способность генерировать соединительный апикальный комплекс, необходимый для проницаемости эпителия [Shaykhiev R. et al., 2013].

Интересно, что курение табака увеличивает экспрессию EGF в реснитчатых клетках эпителия бронхов [Shaykhiev R. et al., 2013]. Базальные клетки человека (СК5+), выделенные из бронхов третьего и четвертого порядка у некурящих, после воздействия экстракта сигаретного дыма в экспериментах in vitro показали повышенную экспрессию амфирегулина (AREG, EGF-подобный фактор роста), увеличение пролиферации с экспрессией маркера пролиферирующих клеток Ki-67 и секрецию муцинов MUC5AC и MUC5B. У тех же базальных клеток после обработки амфирегулином снижается активность дифференцировки, что выражается в уменьшении образования новых ресничек на своей поверхности и, следовательно, приводит к нарушению образования плотных контактов с соседними клетками [Zuo W.L. et al., 2017]. Между тем, полученные из бронхов третьего и четвертого порядка некурящих добровольцев и пациентов с ХОБЛ базальные клетки человека с фенотипом CK5+p63+ показали сверхэкспрессию TROP-2 и увеличение мито-тической активности в условиях in vitro [Liu Q. et al., 2016]. Как известно, TROP-2 является трансмембранным гликопротеином и обеспечивает функционирование сигналинга клеточного выживания и пролиферации, и указывает на приобретение клетками стволовости [Shvartsur A., Bonavida B., 2015]. TROP-2 появляется при многих опухолях.

У курильщиков с нормальной функцией лёгких и пациентов с ХОБЛ уровень экспрессии амфирегулина в базальных СК6+ клетках лёгких также оказался выше, чем у здоровых некурящих добровольцев [Zuo W.L. et al., 2017]. Базальные СК6+ клетки выделены из бронхоальвеолярного лаважа. В базальных клетках (CK5+p63+) дыхательных путей, полученных при проведении лобэктомии у пациентов с ХОБЛ, обнаружено увеличение экспрессии TROP-2 по сравнению с некурящими добровольцами. Экспрессия TROP-2 коррелировала с экспрессией Ki-67 в эпителиальных клетках больных ХОБЛ [Liu Q. et al., 2016]. У больных ХОБЛ ко-

личество базальных клеток бронхов с фенотипом CK5+CK14+p63+, полученных посредством эндобронхиальной биопсии из вторичных бронхов, оказалось значительно меньше по сравнению с группой здоровых добровольцев.

Таким образом, у курильщиков и пациентов с ХОБЛ было обнаружено меньшее количество базальных стволовых клеток. Это обстоятельство воспринимается в качестве признака ранней стадии ХОБЛ и указывает на вовлечение ба-зальных стволовых клеток в патогенез заболевания [Ghosh M. et al., 2018].

Огволовые клетки подслизистой основы трахеи. Клетки подслизистой основы трахеи человека экспрессируют на своей поверхности антигены CK5, CK14, p63 и а-SMA [Wansleeben C. et al., 2013]. Из трахеи были выделены так называемые протоковые железистые стволовые клетки положительные по маркеру CD166 и негативные по антигенам CD44 и NGFR [Hegab A.E. et al., 2012]. Интересно, что CD166+CD44-NGFR- определялись у пациентов с облитерирующим бронхиоли-том после трансплантации лёгких [Swatek A.M. et al., 2018]. Этот факт немаловажен и может выступать в качестве маркера приживления лёгких и положительного прогностического маркера. К сожалению, данные о протоковых железистых стволовых клетках единичны, что не позволяет сформировать представления об участии этих клеток в патогенезе многих заболеваний лёгких, в том числе ХОБЛ.

Бронхоальвеолярные стволовые клетки. Мышиные бронхоальвеолярные стволовые клетки (БАСК) экспрессируют на своей поверхности пробелок сурфак-танта С (SP-C), маркер клеточного секретоглобина семейства 1а члена 1 (SCGB1A1), антигены стволовых клеток 1 (Sca-1) и CD34 [Kim C.F., Jackson E.L., Woolfenden A.E. et al., 2005]. Другие авторы идентифицировали бронхоальвео-лярные стволовые клетки как Sca-1+CD45.2-CD31- [Driscoll B. et al., 2012]. Мышиные БАСК в условиях in vitro способны к самообновлению и дифференцировке в несколько клеточных линий [Kim C.F. et al., 2005]. В лёгких мышей эти клетки обнаруживаются исключительно в участках перехода бронхов в альвеолы, находятся в покое в лёгких здоровых животных и размножаются в ответ на легочную травму [Kim C.F., 2007].

БАСК человека экспрессируют кадгерин-1, SP-C и виментин. При культивировании на подложке из фибробластов лёгких человека бронхоальвеолярные стволовые клетки способны создавать бронхоальвеолярные конструкции [Kato T. et al., 2015]. После трансплантации в поврежденное лёгкое мыши БАСК человека способны размножаться и дифференцироваться в эпителиальные и эндотелиаль-ные предшественники, которые, в свою очередь, частично восстанавливают поврежденные участки эпителия и эндотелия. Содержание БАСК у пациентов с ХОБЛ, курильщиков и здоровых добровольцев существенно не разнится [Lopez-Giraldo A. et al., 2018].

Альвеолярные стволовые клетки. Среди клеток альвеолярного эпителия аль-веоциты 2 типа демонстрируют характеристики стволовых клеток, включающие самообновление и способность дифференцироваться в альвеоциты 1 типа [Hogan В., 2018; Nabhan A.N. et al., 2018]. Локализацию этих клеток в альвеолах показал Chen R. с соавт. (2015) [Chen R. et al., 2015]. Альвеолярные стволовые клетки экспрессируют на своей поверхности молекулу адгезии EpCAM и пробелок сурфак-танта С (SP-C). После травмы мышиных лёгких вирусом гриппа H1N1 наблюдалось значительное увеличение числа альвеоцитов 1 и 2 типов и регенерация поврежденных альвеол [Zacharias W.J. et al., 2018].

В лёгких человека присутствуют резидентные альвеолярные стволовые клетки, которые экспрессируют на своей поверхности маркеры мезенхимальных стволовых клеток (CD73, CD90, CD105, виментин), поверхностно-активные белки клеток альвеоцитов 2 типа (SP-A, SP-C, SP-D), но при этом негативны по CD117 и по маркерам гемопоэтических или эндотелиальных стволовых клеток (CD31, CD34, CD45, VEGFR-2). SP-C+CD90+ клетки располагаются исключительно в альвеолярных стенках здорового человека [Fujino N. et al., 2011]. В условиях in vitro у альвеолярных стволовых клеток (CD90+SP-C+) выявлен клоногенный потенциал и способность дифференцироваться в альвеоциты 1 и 2 типов под влиянием транс-ретиноевой кислоты [Horiguchi M. et al., 2014]. Тот же результат был получен в случае внесения в культуру альвеолярных стволовых клеток человека (CD90+SP-C+) синтетического ретиноида Am80 [Sakai H. et al., 2014]. Внутриклеточный сиг-

нальный путь PI3K/AKT/mTOR, центральными компонентами которого являются ферменты фосфоинозитид-3-киназа, киназы AKT и mTOR, участвует в механизме дифференцировки альвеолярных стволовых клеток человека [Horiguchi M. et al., 2014; Horiguchi M. et al., 2015]. Так, ингибиторы PI3K (такие как вортманнин), которые блокируют фосфорилирование Akt, индуцируют дифференцировку этих альвеолярных эпителиальных стволовых клеток в альвеоциты 1 и 2 типов.

Мезенхимальные стволовые клетки. Мезенхимальные стволовые клетки должны обладать определенным набором признаков: самоподдержанием при стандартных условиях культивирования, быть позитивными по CD73, CD90, CD105 и негативными по CD11b, CD14, CD19, CD34, CD45, HLA-DR, а также дифференцироваться в остеобласты, хондробласты, адипоциты и фиброциты [Dominici M. et al., 2006]. Подробная характеристика МСК костного мозга представлена нами выше. Легочные МСК (лМСК) экспрессируют CD44, CD73, CD90, CD105, CD146 и не экспрессируют маркеры эндотелия и моноцитов (CD45, CD34, CD14) [Ricciardi M. et al., 2012].

МСК выделены из бронхоальвеолярной жидкости (так называемые балМСК) у реципиентов в течение 1 года после трансплантации лёгких, при этом в брон-хоальвеолярной жидкости здоровых добровольцев они не обнаруживаются. Им-мунофенотип балМСК очень похож на лМСК (CD73+CD90+CD105+CD45"), при этом балМСК имеют высокую экспрессию a-SMA и не могут дифференцироваться в адипогенном направлении [Sinclair K.A. et al., 2016]. TGF-01 усиливает диф-ференцировку балМСК в фибробласты in vitro. Эти результаты показывают, что балМСК могут приобрести профибротический фенотип при поражении легочной ткани [Walker N. et al., 2011].

МСК лёгких человека считают важным регулятором регенерации травмированной легочной ткани [Foronjy R.F., Majka S.M., 2012]. Эта функция реализуется паракринно: путем производства фактора роста фибробластов 10 и фактора роста гепатоцитов (HGF) [Kato T. et al., 2015]. В мышиных моделях эмфиземы лёгких, вызванных введением эластазы, наблюдается значительное увеличение количества лМСК (CD44+CD73+CD90+) [Skurikhin E.G. et al., 2016]. На эластазной моде-

ли эмфиземы показано, что внутривенное и интратрахеальное введение лМСК и кмМСК способствует восстановлению легочной паренхимы, повышает выработку эпидермального фактора роста (EGF), HGF, VEGF и уменьшает воспалительную реакцию в дыхательных путях посредством подавления циклооксигеназы-2, инги-биции высвобождения протеаз клетками воспаления, вызывает пролиферацию альвеоцитов 1 и 2 типов и улучшает дыхательную функцию лёгких [Katsha A.M. et al., 2011; Liu X. et al., 2016; Cappetta D. et al., 2018].

Стромальные стволовые клетки жирового происхождения. Стромальные стволовые клетки жирового происхождения (ССКЖП) подобно МСК костного мозга экспрессируют на своей поверхности CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 и мультипотентны [Zuk P.A. et al., 2001; Watanabe H. et al., 2018]. ССКЖП обладают более высокой пролиферативной способностью [Kern S. et al., 2006] и иммуномо-дулирующей активностью, чем кмМСК [Strioga M. et al., 2012; Melief S.M. et al., 2013]. В жировой ткани эти клетки содержатся в гораздо большем количестве, чем в костном мозге.

После трансплантации ССКЖП мышам с эмфиземой, индуцированной эла-стазой, клетки накапливаются в лёгких и в течение длительного времени секрети-руют FGF-2 и HGF, при этом имеет место снижение продукции матриксных ме-таллопротеаз и сокращение площади эмфиземы [Shigemura N. et al., 2006; Kim Y.S. et al., 2014; Cho R.J. et al., 2017]. Трансплантация ССКЖП человека, предварительно обработанных in vitro пиоглитазоном (агонист PPAR-c), мышам в условиях введения эластазы или экстракта табачного дыма улучшает альвеолярную регенерацию и увеличивает уровни FGF2, HGF и VEGF в легочной ткани по сравнению с необработанными пиоглитазоном ССКЖП [Hong Y. et al., 2016].

Циркулирующие эндотелиальные прогениторные клетки. Эндотелиальные прогениторные клетки (ЭПК) крови экспрессируют на своей поверхности эндотелиальные маркеры CD31 и CD34, но отрицательны по CD14, CD41a, CD45, CD133 и CD235a [Mund J.A., Case J., 2011; Mund J.A. et al., 2012]. Клетки с иммунофено-типом CD31+CD34+CD45dimCD133+CD14"CD41a~CD235a~ демонстрируют ангио-генные свойства in vitro [Estes M.L. et al., 2010]. В других исследованиях у цирку-

лирующих ЭПК были обнаружены маркеры CD34, CD45dim и VEGFR-2 [Schmidt-Lucke C. et al., 2010]. Считается, что циркулирующие эндотелиальные прогени-торные клетки служат резервным пулом клеток для замены поврежденного эндотелия кровеносных сосудов в зрелом возрасте [Khakoo A.Y., Finkel T., 2005]. Снижение количества ЭПК повышает риск смерти у пациентов со стабильной ишемической болезнью сердца [Werner N. et al., 2005].

В настоящее время вклад ЭПК в патогенез ХОБЛ не ясен. Так, во многих исследованиях не использовали полную линейку антигенов ЭПК [Mund J.A., Case J., 2011]. С другой стороны, при исследовании СК человека невозможно исключить необходимую для поддержания больного лекарственную терапию. В этой связи, многие препараты, такие как статины [Dimmeler S. et al., 2001] и глюкокортикои-ды [Chen C. et al., 2013] вносят свои неизбежные коррективы в результат. Кроме этого, гипоксия [Peplow P.V., 2014] и сопутствующие заболевания (артериальная гипертензия, сахарный диабет и др.) также могут влиять на количество и функцию циркулирующих ЭПК [Maltais S. et al., 2011].

Kasahara Y. и его коллеги выдвинули гипотезу о том, что увеличение апопто-за эндотелиальных клеток в легочных капиллярах альвеолярных перегородок может играть негативную роль в патогенезе ХОБЛ [Kasahara Y. et al., 2000; 2001]. Подтверждает эту гипотезу гибель эндотелиальных клеток в следствие аутоиммунных процессов, зарегистрированная Caramori G. et al. (2011) в легочной ткани больных ХОБЛ [Caramori G. et al., 2011].

На лабораторных животных Yamada M. и соавт. показали, что циркулирующие ЭПК, характеризующиеся экспрессией CD34, CD133 и VEGFR-2, могут способствовать устранению повреждения лёгких [Yamada M. et al., 2004]. Можно предположить, что снижение уровня ЭПК в крови может способствовать развитию ХОБЛ. Действительно, в некоторых клинических исследованиях было обнаружено значительное снижение количества циркулирующих ЭПК у пациентов с ХОБЛ [Fadini G.P. et al., 2006; Palange P. et al., 2006]. Таким образом, ЭПК в крови можно использовать как маркеры состояния эндотелия в лёгких больных ХОБЛ,

не исключено, что, повышая уровень циркулирующих ЭПК, можно предотвратить или снизить темпы развития эмфиземы.

Обращает на себя внимание то обстоятельство, что количество и пролифера-тивная активность циркулирующих CD34+VEGFR2+ клеток были значительно снижены у пациентов со стабильной ХОБЛ и высокой степенью легочной артериальной гипертензии (> 25 мм рт. ст.) по сравнению с больными ХОБЛ без гипер-тензии и со здоровыми добровольцами. Количество этих клеток у пациентов со стабильной ХОБЛ и высокой степенью легочной артериальной гипертензии оказалось обратно пропорционально легочному артериальному давлению. Предполагается, что изменение числа ЭПК может быть связано с вовлечением в ХОБЛ легочных артерий [Liu P., Zhang H., Liu J. et al., 2016]. В другом исследовании, Peinado V.I. и коллеги, используя методы иммуногистохимии, продемонстрировали увеличение количества CD133+ клеток в легочной артерии у пациентов с лёгкой и умеренной ХОБЛ по сравнению со здоровыми добровольцами. CD133+ клетки были локализованы на эндотелиальной поверхности и в стенке сосудов, и указывали на их высокий потенциал в ремоделировании сосудов [Peinado V.I. et al., 2006].

В клиническое исследование Brittan M. и соавт. вошли пациенты с ХОБЛ и здоровые добровольцы без сопутствующих сердечно-сосудистых заболеваний. Авторы не выявили достоверных групповых различий в количестве клеток с фенотипом CD34+CD133+VEGFR-2+ и CD34+VEGFR-2+. Между тем, in vitro коло-ниеобразующая способность эндотелиальных клеток больных ХОБЛ была выше по сравнению с контрольной группой [Brittan M. et al., 2013]. При изучении циркулирующих в крови ЭПК других фенотипов было выявлено, что содержание CD34+CD45dimVEGFR-2+ -клеток и CD34+CD45dun -клеток у пациентов со стабильной ХОБЛ не отличается от такового у добровольцев [Janssen W.J. et al., 2014]. При этом число CD34+CD45+CD133+VEGFR-2+ оказалось значительно снижено у пациентов с ХОБЛ по сравнению с контролем. Эти изменения коррелировали с ОФВ1 и с площадью эмфиземы. Особенностью данного исследования было то, что пациенты с ХОБЛ и здоровые добровольцы получали статины.

Интересны результаты сравнения динамики содержания CD34+CD133+VEGFR-2+ -клеток в крови больных ХОБЛ и больных раком лёгких. При раке лёгкого наблюдалось увеличение числа CD34+CD133+VEGFR-2+ -клеток через 2 часа после начала операции и возвращение их количества до предоперационного уровня спустя 24 часа. Изменений пула циркулирующих клеток больных ХОБЛ не были выявлены. Кроме этого, в условиях in vitro CD34+CD133+VEGFR-2+ -клетки крови больных раком лёгких формировали эндо-телиальные колонии, тогда как клетки пациентов с ХОБЛ характеризовались низкой колониеобразующей активностью [Takahashi T. et al., 2011].

Результаты более поздних клинических исследований дополнили характеристики CD34+CD133+VEGFR-2+ -клетки крови. В частности, в сообщении Liu X. и Xie C. (2012) указывается, что in vitro CD34+CD133+VEGFR-2+ -клетки, полученные из крови пациентов со стабильной ХОБЛ, продемонстрировали низкую про-лиферативную активность и значительное нарушение миграции в ответ на стимуляцию CXCR-12 [Liu X., Xie C., 2012]. Другие исследователи показали уменьшение количества ЭПК с фенотипом CD34+CD45dimCD133+ в крови пациентов с ХОБЛ по сравнению со здоровыми добровольцами, с другой стороны, число этих клеток в мокроте увеличивалось. Не исключено, что при ХОБЛ CD34+CD45dimCD133+ЭПК из крови мигрируют в лёгкие, возможно для регенерации эндотелия [Salter B.M. et al., 2016]. Тем не менее, в данном исследовании, у 25% больных ХОБЛ были обнаружены артериальная гипертензия, гиперлипиде-мия и в 17% случаев использовали статины. Это не исключает влияние этих факторов на клеточную миграцию.

Еще в одном исследовании авторами было показано, что у пациентов с ХОБЛ и эмфиземой лёгких CD34+CD31+CD133+CD144" ЭПК формируют значительно меньшее количество эндотелиальных колоний in vitro по сравнению с больными ХОБЛ без эмфиземы, курильщиками с нормальной функцией лёгких и здоровыми добровольцами. Однако достоверной корреляции между числом ЭПК, КОЕ и легочной эмфиземой не наблюдалось. Кроме этого, ЭПК больных ХОБЛ с эмфиземой и без эмфиземы продемонстрировали более низкую степень миграции после

стимуляция VEGF по сравнению со здоровыми добровольцами [Kim E.K. et al., 2012].

Циркулирующие фиброциты. Фиброциты - это стволовые клетки костного мозга, которые экспрессируют на своей поверхности CD11, CD13, CD14, CD34, CD45, CXCR4, и молекулы основного комплекса гистосовместимости II класса, но отрицательны по антигенам, идентифицирующим лимфоциты (CD3, CD4, CD8, CD19, CD25). Фиброциты способны вырабатывать коллагены 1 и 3 типов, фибро-нектин и виментин [Herzog E.L., Bucala R., 2010]. Большая популяция фиброцитов может экспрессировать CCR2, CCR3 и CCR7 [Dupin I. et al., 2016].

У здоровых людей количество фиброцитов составляет примерно 0,5% от общей фракции циркулирующих в крови лейкоцитов [Herzog E.L., Bucala R., 2010]. У лабораторных животных в условиях фиброзных поражений лёгких и у пациентов с легочным фиброзом фиброциты способны дифференцироваться in vitro в легочные фибробласты [Keeley E.C. et al., 2010]. Фиброциты распознаются и как мезенхимальные клетки, образующиеся из циркулирующих предшественников моноцитов и участвуют в ответе на травму: презентируют антиген и ремоделиру-ют поврежденные ткани [Bucala R., 2015].

В поврежденной ткани фиброциты могут дифференцироваться в миофиб-робласты, теряя при этом на своей поверхности CD34 и экспрессируя a-SMA [Herzog E.L., Bucala R., 2010]. В этих условиях фиброциты могут начать вырабатывать провоспалительные цитокины (ИЛ-6, ИЛ-8), стимулировать ангиогенез с продукцией матриксных металлопротеиназ и проангиогенных факторов (VEGF, PDGF) [Peng H., Herzog E., 2012; Florez-Sampedro L. et al., 2018]. Дифференциров-ка фиброцитов снижается в присутствии ФНО-а, ИЛ-12 и сывороточного амилоида Р и увеличивается при достаточных концентрациях ИЛ-4, ИЛ -13, TGF-ß1 и эндотелина-1 [Bucala R., 2012].

Выделяют две основные популяции циркулирующих фиброцитов. Фиброциты классического типа CD3 4+CD4 5medCD 14+COL-1H , и фиброциты миелоидного происхождения супрессорного типа CD34-CD45dimCD14-COL-1+ [Wright A.K. et al., 2017]. В настоящее время немного исследований посвящено изучению фибро-

цитов больных ХОБЛ. В частности, есть результаты, которые указывают на увеличение числа фиброцитов миелоидного происхождения супрессорного типа в крови больных ХОБЛ по сравнению с группой здоровых добровольцев, тогда как количество циркулирующих фиброцитов классического типа было неизменным [Wright A.K. et al., 2017].

1.3.5 Стволовые клетки при идиопатическом легочном фиброзе

Фибробласты. Накопление клеток с фибробластоподобной морфологией в очаге и депонирование коллагена выступают характерной особенностью любого фиброза. Предполагают несколько источников фибробласто-подобных клеток. Во-первых, в ответ на местные и/или системные профибротические стимулы изменяется экспрессия генов и наблюдается пролиферация резидентных стромаль-ных клеток [Vyalov S.L. et al., 1993]. Второй предлагаемый источник - это циркулирующие фиброциты [Abe R. et al., 2001; Hashimoto N. et al., 2004]. В-третьих, следует обратить внимание на эпителиальные клетки лёгких. Так, альвеоциты 2 типа вовлекаются в эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП), в результате чего трансформируются в фибробласты или в фибробластоподобные клетки [Willis B.C. et al., 2006; Corvol H. et al., 2009; Felton V.M. et al., 2009; Tanjore H. et al., 2011]. Считается, что при фиброзных поражениях около 50% фибробластов возникают в силу активации ЭМП. Это предположение основывается на результатах иммунногистохимического исследования препаратов фиброзированных лёгких и образцов клеток различных линий, в которых были получены доказательства ЭМП из альвеоцитов 2 типа [Kim K.K. et al., 2006; Tanjore H. et al., 2009; Degryse A.L. et al., 2010]. В свою очередь, Rock J.R. и соавт. не нашли доказательств перехода альвеолярных эпителиальных клеток в миофибробласты на клеточном и молекулярном уровне. Авторы утверждают, что блеомицин-индуцированное повреждение не приводит к повышению количества фибробластов, генерация альвеоцитов 1 и 2 типа объясняется их митотической активностью [Rock J.R. et al., 2011].

Мезенхимальные стволовые клетки. Среди стволовых клеток МСК, возможно, играют решающую роль в патогенезе и регенерации идиопатического легочного фиброза (ИЛФ). По современным представлениям МСК - это негемопоэти-ческие клетки мезодермального происхождения с фибробластоподобной морфологией, активно самообновляются, дифференцируются в мезенхимальные клеточные линии, участвуют в процессах регенерации [Wolf D., Wolf A.M., 2008; Weiss D.J., 2011; Rankin S.M., 2012].

Фундаментальные исследования костномозговых и легочных МСК ведутся с большой интенсивностью. Результаты этих исследований позволили говорить о неоднозначной роли различных мезенхимальных клеток в патогенезе ИЛФ и регенерации легочной ткани. На модели блеомицин-индуцированной травмы лёгких мышей Ortiz L.A. с соавт. показали миграцию костномозговых МСК, полученных от здоровых мышей, в область повреждения с приобретением эпителиального фенотипа (мезенхимально-эпителиальный переход, МЭП). Возможно, МЭП - это один из важных механизмов, уменьшающих воспаление и сдерживающих отложение коллагена в легочной ткани [Ortiz L.A. et al., 2003].

Использование этого же подхода другими авторами - трансплантационный тест, позволило расширить представление о противовоспалительных и регенераторных эффектах МСК. Так, в фиброзированных лёгких донорские МСК демонстрируют иммуносупрессивную активность, секретируют различные факторы: фактор стромальных клеток-1, моноцитарный хемотаксический протеин-3, VEGF [Kotton D.N., Fine A. 2008; Garcia-Gomez I. et al., 2010; Gimble J.M. et al., 2010]. Паракринной активностью МСК объясняют ангиогенез, защиту тканей от повреждения и восстановление клеток [Kondo K. et al. 2009; Hong S.J. et al., 2010]. Привлеченные в пораженные участки лёгких МСК могут ускорять процесс регенерации эпителия, дифференцируясь в альвеоциты 2 типа [Liu A. et al., 2014; Cai S.X. et al., 2015].

Kotton D.N., Summer R. и Fine A. (2004) оценили способность адгезирующих ^с/^клеток костного мозга дифференцироваться в клетки паренхимы лёгких [Kotton D.N. et al., 2004]. После клеточной терапии кс/^клетками в паренхиме

лёгких мышей в условиях введения блеомицина были обнаружены клетки, которые морфологически и фенотипически относились к альвеоцитам 1 типа. Это наблюдение ставит под сомнение точку зрения, что эпителиальные альвеолярные клетки 1 типа появляются только из регионарных (легочных) клеток-предшественников. Аналогичные результаты были получены при введении больным лабораторным животным костномозговых МСК здоровых доноров [Ortiz L.A. et al. 2003].

По данным Tzouvelekis A. и соавт. резидентные стволовые клетки мезенхи-мального происхождения обладают высокой пролиферативной активностью, мультипотентны и при повреждении лёгких лабораторных животных формируют de novo структурные дыхательные единицы, включающие бронхиолы, альвеолы и легочные сосуды [Tzouvelekis A. et al., 2011]. В других работах тех же авторов была проведена попытка избирательной дифференцировки донорских МСК различного происхождения в альвеолярные эпителиальные клетки, которая не имела положительного результата [Tzouvelekis A. et al., 2013]. В ответ на интратрахе-альное введение блеомицина популяция легочных МСК сокращается. Это коррелирует со степенью тяжести пневмофиброза, воспаления и сопутствующей артериальной легочной гипертензии [Jun D. et al., 2011].

Для поиска и разработки новых подходов лечения ИЛФ высока значимость изучения МСК лёгких и костного мозга в сравнительном аспекте. Однако таких работ единицы. Так, в экспериментах Jun D. и соавт. введение костномозговых МСК снижает активность фиброза и сопутствующую легочную гипертензию [Jun D. et al., 2011]. Авторы отмечают, что в отличие от легочных фибробластов костномозговые МСК не продуцируют провоспалительные медиаторы и не развиваются по профибротическому пути. Дополнительной характеристикой костномозговых МСК выступает снижение числа лимфоцитов и гранулоцитов в бронхоаль-веолярном пространстве и подавление пролиферации Т-эффекторных клеток.

В противовес представленным выше положительным эффектам костномозговых мезенхимальных клеток выступает их негативное влияние на фиброза лёг-ких[Мога A.L., Rojas M., 2008]. Механизмы их профибротической активности

разнообразны. Так, Hashimoto N. и соавт. показали миграцию в поврежденные лёгкие коллаген-продуцирующих фибробластов и участие их в фиброзе [Hashimoto N. et al., 2004]. При этом задействован паракринный механизм фиброза: МСК секретирует один из главных профибротических факторов TGF-P [Nemeth K. et al., 2010]. С другой стороны, наблюдается активация Wnt/p-catenin сигнального пути МСК, что приводит к их дифференцировке в фибробласты [Tang N. et al., 2014].

В заключение этого раздела главы следует заметить, что на сегодняшний день костномозговые МСК представляют как клеточную популяцию, рекомендованную для использования в клеточной терапии при хронических заболеваниях лёгких [Huleihel L. et al., 2013]. Подавляющее количество исследователей склоняются к тому, что МСК обладают огромным терапевтическим потенциалом. Единственным ограничением применения МСК в клеточной терапии для лечения ИЛФ является использование их в острую воспалительную и фиброзную фазы развития болезни [Li X. et al., 2017].

Эндотелиальные прогениторные клетки. Опубликованные данные экспериментальных и клинических исследований позволяют говорить о вовлечении эндо-телиальных прогениторных клеток костного мозга и крови в регенерацию эндотелия при фиброзных заболеваниях лёгких [Fadini G.P. et al., 2006; Caramori G. et al., 2010]. Фиброзированные участки ткани, как правило, характеризуются малым количеством кровеносных сосудов, в то время как области здоровой ткани насыщены капиллярами [Ebina M., Shimizukawa M., Shibata N. et al., 2004]. Ebina M. с коллегами показали привлечение ЭПК в здоровую ткань между фиброзированны-ми участками в целях неоваскулогенеза. Другие авторы указывают на значительное снижение ЭПК в крови и лёгких больных ИЛФ [Malli F. et al., 2013]. При этом наблюдается компенсаторное увеличение уровня VEGF в крови в целях привлечения в циркуляцию ЭПК из костного мозга. В легочной ткани также наблюдается повышение концентрации VEGF, что значительно ослабляет блеомицин-индуцированный фиброз лёгких у лабораторных животных [Murray L.A. et al., 2017].

Кроме восстановления эндотелиальных клеток ЭПК вовлекаются в диффе-ренцировку в гладкомышечные клетки. Такая плейотропная активность ЭПК приводит к гиперплазии интимы и сужению сосудов и, как следствие, к повышению сосудистого сопротивления [Zhu P. et al., 2006; Arciniegas E. et al., 2007; Barbera J.A., Peinado V.I., 2011].

Между тем, эндотелиальные прогениторные клетки могут оказать дополнительное влияние на развитие ИЛФ [Smadja D.M. et al., 2013]. По данным Biasi S.D. и коллег ЭПК участвуют в развитии фиброзных очагов. В таких случаях положительные качества проявляют пирфенидон и нинтенданиб. Эти препараты значительно сокращали циркулирующую фракцию ЭПК у пациентов с ИЛФ и таким образом блокировали описанный Smadja D.M. и др. (2013) механизм дополнительной индукции фиброгенеза эндотелиальными прогениторными клетками [Biasi S.D. et al., 2015].

Альвеолярные эпителиальные прогениторные клетки. Альвеолярный эпителий представляет собой достаточно динамичную ткань, которая активно реагирует на различные эндогенные и экзогенные стимулы. При повреждении эпителиальный слой дыхательных путей быстро восстанавливается. Высокая скорость регенерации эпителия основывается на резидентных эпителиальных прогениторных клетках [Crystal R.G. et al., 2008; Kajstura J. et al., 2011]. Эпителиальные прогени-торные клетки локализуются в специфических альвеолярных нишах и запрограммированы исключительно на эпителиальный путь дифференциации. Есть предложение ускорить регенерацию альвеолярного эпителия за счет модуляции сигнальных путей соответствующих стволовых клеток [Hind M., Maden M, 2011]. Однако об эндогенных молекулярных сигнальных системах, контролирующих дифферен-цировку альвеолярных эпителиальных прогениторных клеток, мало что известно [Crystal R.G. et al., 2008].

1.4 Notchl сигнальный путь

1.4.1 Общее представление

Notch является одним из наиболее широко используемых природой сигнальным путем, контролирующим процессы развития у животных. Notch-сигналинг определяет клеточную судьбу в эмбриогенезе и постнатальном развитии. Трансмембранный белок Notch был открыт в лаборатории Томаса Ханта Моргана в марте 1913 г. при изучении Drosophila melanogaster (D. melanogaster). Непосредственное участие сигнального пути Notch в онтогенезе показал Дональд Полсон в 30-е годы XX века. У гемизиготных по Notch эмбрионов D. melanogaster не развивались мезодерма и эндодерма, в то время как из большей части эктодермы формировались нервные клетки в ущерб гиподермальным клеткам. [Kidd S. et al., 1986]. Для Notch сигналинга характерна «латеральная ингибиция», т.е. состояние, когда каждая коммитированная клетка-предшественник в ходе дифференцировки передает контактирующим с ней клеткам сигналы, ингибирующие повторение ее судьбы, тормозя таким образом специализацию соседних клеток в характерном для нее направлении [Попов Б.В., 2010].

У млекопитающих продуцируется четыре различных рецептора Notch (Notch 1-4) и 5 лигандов семейств Delta (Dll 1, 3, 4) и Serrate (Jagged 1, 2) [Попов Б.В., 2010]. И рецепторы и лиганды являются крупными трансмембранными белками, поэтому передача сигнала от клетки к клетке может выполняться только при физическом контакте двух клеток, одна из которых несет лиганд, вторая - рецептор. Рецептор Notch синтезируется в эндоплазматическом ретикулуме и подвергается посттрансляционной модификации в аппарате Гольджи с вовлечением в процесс протеазы Furin. Далее рецептор переносится на поверхность клетки. После связывания рецептора с лигандом одного из семейств Delta / Serrate происходят кон-формационные изменения и внеклеточный домен Notch при помощи протеазы ADAM высвобождается от цитоплазматической мембраны. Образовавшийся комплекс лиганд-рецептор посредством эндоцитоза переносится в инициирующую

клетку с последующей деградацией. В клетке, получившей сигнал, образовавшаяся после протеолиза часть рецептора NEXT (Notch extracellular truncated form) подвергается протеолизу у-секретазой с образованием NICD (Notch intracellular domain), который транспортируется в ядро. В ядре NICD взаимодействует со связывающими ДНК транскрипционным фактором CSL (suppressor of hairless) и кофактором Mam / MAML1-3 (mastermind-like) [Borggrefe T., Liefke R., 2012]. В отсутствие NICD фактор CSL в комплексе с различными кофакторами связывается с ДНК и подавляет транскрипцию целевых генов сигнального пути Notch [Nagel A. C. et al., 2005]. При связывании NICD с CSL и Mam корепрессорный комплекс распадается, что приводит к снятию репрессии с генов Notch и активации транскрипции [Oswald F. et al., 2005]. Далее NICD подвергается фосфорилированию, что приводит к протеасомной деградации и терминации сигнала [Hubbard E. J. et al., 1997].

Целевыми генами сигнального пути Notch являются ген HES (Hairy / Enhancer of Split) и родственные ему гены (HEY, CHF, HRT, HERP). Главной функцией данных генов является ингибирование транскрипции нижележащих генов. В основном данные транскрипционные факторы поддерживают клетки в недифференцированном состоянии, однако в кератиноцитах активация Notch способствует активации пролиферации клеток [Capaccione K. M., Pine S. R., 2013].

По современным представлениям сигнальный путь Notch участвует в регуляции эмбриогенеза и поддержании постоянства всех органов и тканей взрослого организма. Однако его действие зависит от условий, в которых клетка находится в настоящий момент. В одной ситуации Notch может стимулировать пролиферацию стволовых клеток, в другой - их апоптоз или дифференцировку [Попов Б.В., 2010]. Например, в эмбриогенезе D. melanogaster сигнальный путь Notch способствует разделению специфических клеток в рамках одного зародышевого листка, а также формированию границ между разными типами тканей [Bray S. J., 2006]. При участии Notch происходит образование кровеносных сосудов в генетически детерминированных участках [Quaegebeur A. et al., 2011]. При созревании наблюдается снижение уровня экспрессии Notch в кроветворных клетках-

предшественниках [Ohishi K. et al., 2003]. Индукция эпителиально-мезенхимального перехода, в процессе которого эпителиальные клетки приобретают мезенхимальный фенотип и возможность к миграции, отчасти находится под контролем Notch [Mani S. A. et al., 2008].

Кроме представленного выше канонического пути активации Notch известен неканонический путь активации сигнала Notch. Неканоническая активация наиболее часто встречается при патологических состояниях, в то время как каноническая - в норме [Minter L. M., Osborne B. A., 2012]. В неканоническом пути происходит образование NICD после связывания Notch с растворимым лигандом, либо без участия лиганда. В последнем случае NICD может образоваться в результате активации Т-клеточного рецептора при дифференцировке Т-лимфоцитов в Т-хелперы [Gentle M. E. et al., 2012]. Однако наиболее часто встречается неканоническая активация Notch при канцерогенезе [Vacca A. et al., 2006; Lu J. et al., 2013].

1.4.2 Легочная патология

Существенную роль Notch-сигналинг играет в развитии и гомеостазе лёгких [Radtke F. et al., 2010; Xu K. et al., 2012]. Многочисленные исследования показывают, что активация этого сигнального пути и увеличение экспрессии Notch1 ин-гибирует дифференцировку и созревание клеток, а в процессе созревания клетки уменьшают экспрессию Notch [Walker L. et al., 2001; Zanotti S., Canalis E, 2013; Suresh S., Irvine A.E., 2015]. В экспериментах на эмбриональных лёгких показано, что добавление Notch-лиганда увеличивало содержание секреторных клеток в культуре клеток, в то время как ингибитор у-секретазы GSI значительно снижал их количество [Guseh J. et al., 2009]. Эти исследования показывают, что в эмбриогенезе высокая активность сигнального пути Notch1 выступает маркером диффе-ренцировки стволовых клеток в секретирующие линии клеток, но не в реснитчатые клетки [Shi Y. et al., 2013].

Согласно данным Rock J. и соавт. сигнальный путь Notch играет важную роль в различных легочных патологиях [Rock J. R. et al., 2011]. Симметричное де-

ление базальных стволовых клеток не зависит от Notch-сигналинга. Ранние клетки предшественники способны только к ограниченной пролиферации для поддержания популяции. Notch запускает дифференцировку базальных стволовых клеток в ранние клетки предшественники: эти клетки теряют поверхностные маркеры, характерные для базальных стволовых клеток, но при этом не экспрессиру-ют маркеры, характерные для дифференцированных клеток [Rock J. R. et al., 2011]. Повторная активация сигнального пути Notch у клеток предшественников, с большей вероятностью, направляет дифференцировку клеток предшественников в сторону секреторной популяции клеток, но не в направлении реснитчатых клеток [Rock J. R. et al., 2011].

Tilley A.E. и соавт. выявили низкую экспрессию различных компонентов пути Notch у больных ХОБЛ [Tilley A.E. et al., 2009]. Последующие исследования показали не столь однозначное состояние Notch у больных ХОБЛ. Так, у пациентов с ХОБЛ выявлено увеличение числа секреторных клеток в легочной ткани [Curran D., Cohn L., 2010], что закономерно приводит к увеличению слизи в дыхательных путях [Wang G. et al., 2012]. Boucherat О. и его коллеги сообщили, что уровни экспрессии Notch1 и эффекторных генов Hey2 значительно увеличиваются у пациентов с ХОБЛ [Boucherat O. et al., 2012]. Вероятно, сигнальный путь Notchl является главным регулятором деления бокаловидных клеток-предшественников [Guseh J. et al., 2009; Boucherat O. et al., 2012] и их дифференцировки в сторону реснитчатых или секреторных клеток.

Апоптоз эндотелиальных клеток тесно связан с Notchl-сигналингом [Chen Y. et al., 2012; Peng H. et al., 2013; Kang N. et al., 2015; Yang M. et al., 2015]. У нока-утных по Notch1-сигналингу лабораторных животных выявлена массовая апопто-тическая гибель клеток [Limbourg F. et al., 2005], тогда как избыточная экспрессия Notch1 защищает клетки от апоптоза [Qin X. et al., 2011].

Исследования Sinha К. и др. показали, что окислительный стресс может вызвать клеточный апоптоз [Sinha K. et al., 2013]. Производство активных форм кислорода также находится под контролем сигнального пути Notch [Cai W. et al., 2014; Small C. et al., 2014]. Сигнал Notch1 поддерживает низкий уровень окисли-

тельного стресса в клетках, а ингибирование Notch1 с использованием GSI приводит к увеличению генерации активных форм кислорода.

Бронхиальная астма характеризуется хроническим воспалением дыхательных путей с участием большого количества воспалительных клеток (эозинофилы, тучные клетки, Т-лимфоциты, нейтрофилы), клеток легочной ткани (гладкомышеч-ные клетки дыхательных путей, эпителиальные клетки) и множества медиаторов [Xu C. et al., 2011]. Дисбаланс в содержании клеток Т-хелперного типа в сторону Th2 клеток играет ведущую роль в развитии и прогрессировании некоторых форм астмы [Kallinich T. et al., 2007]. Многие авторы указывают на то, что сигнальная система Notch1 активно участвует в дифференцировке, созревании и активации Т-клеток [Zhang W. et al., 2013; Zhou M. et al., 2015]. Введение активированной аллели Notch1 CD4+ клеткам активирует экспрессию ИЛ-4 и других цитокинов Th2 профиля [Fang T. et al., 2007]. В свою очередь назначение GSI приводило к уменьшению цитокинов Th2 клеток с одновременным увеличением секреции ци-токинов Th1 профиля [Kang J. et al., 2009]. Эти исследования показывают, что блокировка сигнала Notch1 может положительно влиять на течение заболеваний, связанных с чрезмерной продукцией Th2 цитокинов.

Эозинофилы являются ключевыми эффекторными клетками в патогенезе аллергических заболеваний [Zhang H. et al., 2015]. У пациентов с астмой значительно увеличено число эозинофилов в бронхоальвеолярной лаважной жидкости, мокроте и эндобронхиальном биоптате [Gaurav R. et al., 2014]. Radke A. и соавт. получили доказательства активации Notch-рецептора и последующей транскрипции Notch-чувствительного гена Hes1 в эозинофилах, стимулированных ГМ-КСФ [Radke A. et al., 2009]. Сигнал Notch регулирует терминальную дифференцировку и последующие эффекторные фенотипы эозинофилов [Kang J. et al., 2005, Kang J. et al., 2007]. Системное введение GSI препятствует накоплению эозинофилов в дыхательных путях [Liu L. et al., 2015].

Интересные данные были получены при изучении Notch-сигналинга при пневмофиброзе. Как известно, фиброз лёгких характеризуется дисфункцией эпителиальных клеток, накоплением фибробластов и миофибробластов и формиро-

ванием внеклеточной матрицы [Loomis-King H. et al., 2013]. Дифференцировка фибробластов в а-гладкомышечный актин-продуцирующие клетки (a-SMA) представляет собой основную проблему в патогенезе идиопатического легочного фиброза [Garrison G. et al., 2013]. Этот процесс, а также эпителиально-мезенхимальный переход сопровождается высоким уровнем экспрессии Notchl [Liu T. et al., 2009, Chapman Н., 2011]. В ряде сообщений указывается, что инги-бирование Notch1 сигнального пути предотвращает эпителиально-мезенхимальный переход in vitro и in vivo [Namba T. et al., 2010; Shao S. et al., 2015].

Рак лёгких занимает 3 место в мире среди причин смертности. Это гетерогенная группа заболеваний, представлена в клинике преимущественно немелко-клеточной карциномой лёгких (НМРЛ) и мелкоклеточной карциномой лёгких (МРЛ) [Agalioti T. et al., 2014]. НМРЛ составляет около 85% от всех случаев рака лёгкого [Zhou C., 2014]. Существует значительный массив исследований, указывающий на связь Notch-сигналинга с раком лёгких. Прежде всего, необходимо отметить, что содержание белков Notch1 в аденокарциноме лёгкого значительно выше по сравнению со здоровыми лёгкими [Zhou M. et al., 2013]. Высокий уровень Notch1 у пациентов с НМРЛ объясняется потерей NUMB (ингибитор Notch). В 30% случаях НМРЛ не выявлен NUMB, что приводит к увеличению Notch активности [Westhoff B. et al., 2009]. В том же исследовании было показано, что примерно в 10% случаев клинически подтвержденного НМРЛ обнаруживается мутация Notch1, вызывающая активацию Notch. По мнению Zhou M. и коллег эта мутация Notch сигнального пути играет значительную роль в развитии карциномы лёгких. Кроме этого, сигнальный путь Notch является ценным биомаркером для прогнозирования прогрессирования НМРЛ и, что более высокая экспрессия сигналов Notch (в основном Notch1 и Notch3) связана с большей вероятностью метастазов и плохой выживаемостью пациентов с НМРЛ [Yuan X. et al., 2015].

При МРЛ наблюдается подавление сигнализации Notch1. Инактивирующие мутации в генах семейства Notch наблюдались в 25% случаев МРЛ [George J. et al., 2015]. Моделирование сверхэкспрессии Notch1 - это возможный подход к ин-

гибированию роста опухоли у человека и нарушению формирования нейроэндо-кринного фенотипа опухоли [Sriuranpong V. et al., 2001]. Подтверждение этому мы нашли в экспериментах на лабораторных животных. Так, активация Notch-сигналинга у мышей с МРЛ существенно уменьшила количество опухолевых клеток, блокировала экспрессию нейроэндокринных генов и увеличивала выживаемость животных [George J. et al., 2015]. Notchl может сдерживать инвазию и ме-тастазирование МРЛ опосредованно - через действие на ЭМП. Так, в культуре индукция Notchl в клетках МРЛ приводит к подавлению маркеров ЭМП и инги-бированию экспрессии гамма-ламинина, который способствует подвижности клеток [Hassan W. et al., 2014]. Как видно из приведенных выше данных, при немел-коклеточной карциноме лёгких Notchl-сигналинг выступает как промотор опухоли, а при мелкоклеточной карциноме лёгких может ингибировать опухолевый рост [Sriuranpong V. et al., 2001; Eliasz S. et al., 2010].

Влияние Notchl на рак лёгкого зависит от концентрации кислорода. В исследованиях Chen Y. и соавт. сообщается, что активация Notchl заметно усилена при гипоксических условиях [Chen Y. et al., 2007]. Ингибирование передачи сигналов Notchl введением GSI (y-secretase inhibitor) при гипоксии приводило к гибели клеток НМРЛ. Непосредственное введение активного лиганда Notchl предотвращало проапоптотический эффект GSI. С другой стороны, ингибирование Notch в нормоксическом лёгком не влияло на выживание клеток аденокарциномы. Результаты исследований Donnem T. и его коллег показали, что у прооперированных пациентов с диагнозом НМРЛ сосудистый эндотелиальный фактор роста коррелирует с Notchl, а их совместная экспрессия отражает гипоксию в легочной ткани [Donnem T. et al., 2010]. У больных НМРЛ без мутации TP53 высокий уровень Notchl указывает на высокий риск осложнений [Westhoff B. et al., 2009]. Ингибирование Notchl возможно будет способствовать p53-зависимому апоптозу клеток НМРЛ [Licciulli S. et al., 2013].

1.5 Серотонин и его роль в воспалении и фиброзе

1.5.1 Общее представление о серотонине

По химическому строению медиатор серотониновой системы серотонин (5-гидрокситриптамин; 5-hydroxytryptamine, 5-HT) относится к биогенным аминам, классу триптаминов. Серотонин синтезируется из 5-гидрокситриптофана путем декарбоксилирования под влиянием фермента триптофандекарбоксилазы с участием витамина В6 [Green A.R., 2006; Maclean M.R., Dempsie Y., 2010]. Широкий спектр эффектов серотонина в ЦНС и вне ее объясняется разнообразием семейства 5-НТ рецепторов. В настоящее время идентифицированы семь типов рецепторов серотонина (5-HT1-7) и 15 их подтипов [Richter D.W. et al., 2003]. 5-KTR3 является ионотропным рецептором, остальные 5-НТ рецепторы - метабо-тропные рецепторы, семидоменные, связаны G-белками (G-protein coupled seven-transmembrane receptors (GPCR)).

В центральной нервной системе (ЦНС) 5-НТ выступает в качестве нейроме-диатора в нейронных синапсах, вовлекается в широкий спектр нейрофизиологических функций: эмоциональное, пищевое и половое поведение, деятельность дыхательного центра, обучение и память, цикл сон-бодрствование, терморегуляция [Mann D.A., Oakley F., 2013]. Наряду с гистамином серотонин участвует в формировании болевой реакции.

Вне ЦНС серотонин синтезируется энтерохромаффинными клетками кишечника и эндотелиальными клетками легочных артерий, депонируется в тромбоцитах и тучных клетках [Eddahibi S. et al., 2006; Morecroft I. et al., 2007; Dempsie Y., MacLean M.R., 2008; Maclean M.R., Dempsie Y., 2010]. Помимо синтеза амина эн-дотелиальные клетки экспрессируют на своей поверхности рецепторы серотонина [MacLean M.R., 2007; Dempsie Y., MacLean M.R., 2008; Kawahara K. et al., 2008; MaassenVan Den Brink A. et al., 2008; MacLean M.R, Dempsie Y., 2009]. В кишечнике серотонин участвует в регуляции сокращения гладких мышц и переваривании пищи. 5-НТ обнаружен в тромбоцитах крови и тучных клетках дыхательных

путей [Potenzieri C. et al., 2012]. 5-НТ участвует в вазоконстрикции и вазодилата-ции, развитии сердечно-сосудистой системы, молочных желез и выделении молока, сокращении матки и созревании ооцитов, обмене веществ, коагуляции и агрегации тромбоцитов [Lang P.A. et al., 2008; Berger M. et al., 2009]. Секретируемый тромбоцитами 5-НТ через специфические 5-HTR на поверхности сосудистых эн-дотелиальных и гладкомышечных клетках координирует активность межклеточных контактов [Cloutier N. et al., 2012].

1.5.2 Воспаление лёгких

Потеря большого массива клеток и тканевые повреждения активизируют систему замены мертвых и/или поврежденных клеток и последующую регенерацию [Wynn T.A., 2007]. Процесс регенерации поврежденных тканей разделяют на четыре отдельных этапа. Первый посттравматический этап характеризуется различными гомеостатическими изменениями, в том числе, в системе свертывания крови и коагуляции. Фаза свертывания сменяется миграцией клеток воспаления к участку травмы. Вслед за фазой воспаления усиливаются фибропролиферативные процессы, включающие, в том числе миграцию, пролиферацию и активацию фиб-робластов. В след за фибропролиферативным процессом наблюдается полная или частичная регенерация ткани и восстановление ее функции [Wynn T.A., 2007; Wynn T.A., 2011].

Активность иммунной системы во многом определяет серотониновая система [Ahern G.P., 2011]. Как известно, лейкоциты экспрессируют на поверхности рецепторы к серотонину. Неудивительно, что амин регулирует хемотаксис лейкоцитов, продукцию цитокинов [Abdouh M. et al., 2001; Boehme S.A. et al., 2003; Abdouh M. et al., 2004; Vega Lde L. et al., 2005; Kushnir-Sukhov N.M. et al., 2006; Yin J. et al., 2006; Cloez-Tayarani I., Changeux J.P., 2007; Leon-Ponte M. et al., 2007; Muller T. et al., 2009]. При воспалении 5-НТ не только привлекает, но и удерживает лейкоциты (лимфоциты, эозинофилы) в травмированном участке ткани, при

этом известно его хемотаксическое действие на тучные клетки [Boehme S.A. et al., 2003; Kushnir-Sukhov N.M. et al., 2006].

Взаимодействуя с 5-НТ3, 5-НТ4 и 5-HT7 рецепторами, серотонин увеличивает экспрессию ИЛ-6 дендритными клетками, которые, в свою очередь, активируют Т-клетки [Idzko M. et al., 2004; Muller T. et al., 2009]. Амин через 5-НТ3, 5-НТ4 и 5-HT7 рецепторы стимулируют секрецию RH-1ß, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12p40 и ФНО-а у моноцитов человека, предварительно обработанных ЛПС [Durk T. et al., 2005]. Взаимодействуя с 5-HT1 и 5-HT7 рецепторами серотонин ингибирует апоптоз моноцитов, что способствует воспалению [Soga F. et al., 2007].

Такой цитокин как ФНО-а играет ключевую роль в воспалении, а его секреция и сигнализация вносит определенный вклад в развитие многих воспалительных заболеваний. Так, в 2008 г. были обнародованы данные, что активация серо-тониновых 5-HT2A рецепторов селективным агонистом (R)-1-(2,5-dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropane ((R)-DOI) препятствует развитию воспаления в дуге аорты [Yu B. et al., 2008]. Интересно, что в кишечнике (R)-DOI блокирует ФНО-а-индуцированную экспрессию провоспалительных факторов клеточной адгезии (ICAM-1, VCAM-1), цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-1Ь) и хемокинов (MCP-1, CX3CL1), а также предотвращает ФНО-а-индуцированное увеличение циркулирующего в крови ИЛ-6 [Nau F.Jr. et al., 2013].

Как видно, в зависимости от условий серотонин может увеличивать или уменьшать секрецию провоспалительных цитокинов [Mossner R., Lesch K.P., 1998; Kubera M. et al., 2005]. Кроме этого, известна зависимость ответа Т-клеток от уровня серотонина. Если в малых концентрациях амин стимулирует пролиферацию Т-клеток и продукцию ИЛ-2 [Young M.R. et al., 1993], то его высокие концентрации ингибируют митоген-стимулированную пролиферацию Т-клеток и экспрессию ИЛ-2-рецептора [Slauson D.O. et al., 1984].

109

l.5.3 Фиброз лёгких

В здоровом организме уровень серотонина в лёгких и крови незначителен. Одна из физиологических функций серотонина и 5-HT2A и 5-HT2B рецепторов в этих условиях - это участие в легочной вазореактивности и бронхореактивности [Loric S. et al., 1995]. Кроме этого, амин стимулирует гиперпластические и гипертрофические изменения в клетках гладких мышц и миофибробластах лёгких [MacLean M.R. et al., 2000].

В l964 г. Oates J.A. с коллегами указал на зависимость фиброза от серотонина. При исследовании нейроэндокринной карциноидный опухоли человека авторы обнаружили значительную секрецию 5-НТ [Oates J.A. et al., l964]. Позднее было получено экспериментальное подтверждение этой гипотезы. Назначение ме-тисергида (l-метил-D-лизергиновая кислота бутанол-амид или UML-491, англ. methysergid), механизм действия которой связан с активацией 5-HT2B рецепторов, в качестве препарата для лечения головной боли вызывало легочной фиброз [Graham J.R., l967]. Примечательно, что этот индуцированный пневмофиброз был обратимым. При отмене лечения метисергидом фибротические изменения в лёгких у некоторых пациентов не были выявлены. В экспериментах внутрибрюшинное введение метисергида приводило к фиброзу лёгких у лабораторных животных [Reimund E., l987]. Фиброз лёгких индуцируется и другими лекарственными препаратами, например, метотрексатом [Van der Veen M.J. et al., l995]. Такой агонист 5-HT2B рецепторов как фенфлурамин (англ. fenfluramine) способствовал развитию фиброза [Fowles R.E. et al., 1998; Rothman R.B. et al., 2000; Setola V. et al., 2003]. Перголид и каберголин, используемые для лечения болезни Паркинсона, и структурно схожие с 5-HT2B, вызывали фиброз клапанов сердца [Antonini A., Poewe W., 2007].

Целый ряд хронических респираторных заболеваний (ИЛФ, легочная артериальная гипертензия, ХОБЛ, бронхиальный облитерирующий синдром, астма) приводит к фибротическим изменениям в легочной ткани [Wilson M.S., Wynn

T.A., 2009]. Фиброз лёгких развивается при системном склерозе [Almeida I. et al., 2011] и лучевой терапии области груди [Denham J.W., Hauer-Jensen M., 2002].

В настоящий момент известно, что серотонин секретируется тромбоцитами и тучными клетками. Действуя на эндотелиальные клетки, амин оказывает дополнительное вазоактивное действие на легочную артерию. Кроме этого, амин оказывает профиброгенное действие в лёгких, стимулируя пролиферацию фибробла-стов легочных артерий и миофибробластов [Lee S.L. et al., 1994; Welsh D.J. et al., 2004]. Активируя 5-HT2A рецепторы на интерстициальных клетках аортального клапана, серотонин может индуцировать синтез коллагена и секрецию TGF-01 [Jian B. et al., 2002; Xu J. et al., 2002].

Нейроэндокринные клетки лёгких синтезируют и секретируют серотонин [Johnson D.E., Georgieff M.K., 1989]. Пролиферативная активность нейроэндо-кринных клеток при легочной артериальной гипертензии коррелирует с распространением миофибробластов в легочных артериях. Предполагается, что в послеоперационный период у детей с легочной артериальной гипертензией эти клетки лёгких выступают в качестве основного источника амина.

Эпителиальные клетки лёгких пациентов с идиопатической легочной артериальной гипертензией в больших количествах экспрессируют Tryptophan hydroxylase 1 (tryptophan 5-monooxygenase) [Eddahibi S. et al., 2006]. Значительно выражен в лёгких уровень серотонинового транспортера (Serotonin transporter, SERT). Предполагается вовлечение SERT в стимуляцию пролиферации фибробла-стов и гладкомышечных клеток легочной артерии путем активации сигнального пути ERK (англ. extracellular signal-regulated kinase; Ras-ERK, MAPK/ERK) после интернализации серотонина (поглощения клеткой) [Maclean M.R., Dempsie Y., 2010]. ERK - это ключевой сигнальный путь MAPK. Свое название он получил от центральной MAP-киназы ERK, которая представлена двумя близкими по структуре белками, ERK1 и ERK2. Гормоны, факторы роста, хемокины и нейротранс-миттеры могут активировать ERK сигнальный путь. В конечном итоге передача сигнала по ERK пути приводит к выживанию, пролиферации и увеличению подвижности клеток [Mendoza M.C., et al., 2011].

До сих пор неизвестно, с какими из 5-НТ рецепторов связаны эффекты серо-тонина при легочной артериальной гипертензии и фиброзе лёгких. До 1993 года считалось, что опосредованное 5-ИТ2а рецепторами сужение сосудов легочной артерии при назначении антагониста серотониновых рецепторов кетансерина обладает некоторой клинической полезностью, особенно у пожилых людей [ОетоиЛп 1С. е1 а1., 1981]. Более поздние работы указывают на вклад 5-ИТ1В и 5-ИТ2в рецепторов в сосудосуживающий эффект [Могесгой I. е1 а1., 1999; ВитйгаБси Я. е1 а1., 2011; Ьаипау !М. е1 а1., 2002]. В своих исследованиях Konigshoff М.с коллегами сообщил о повышенной экспрессии 5-ИТ1а/в и 5-ИТ2В в лёгких у пациентов с ИЛФ и неспецифической интерстициальной пневмонией. При ИЛФ наблюдалось увеличение экспрессии 5-ИТ2А и 5-ИТ2В рецепторов в лёгких. 5-ИТ2А рецепторы были локализованы на фибробластах, в то время как 5-ИТ2В был найден главным образом на эпителиальных клетках [Konigshoff М., Эи-mitrascu Я., Ша1оу Б. е1 а1., 2010]. Антагонист 5-ИТ2а/в рецепторов тиругайд (terugide) значительно ограничивает продукцию TGF1 фибробластами у мышей. При введении в естественных условиях teгugide улучшает функцию лёгких, в условиях блеомицин-индуцированного фиброза лёгких интенсивность фиброгене-за падает. Эти данные подтвердили более ранние наблюдения Fabгe А. и коллег о том, что при блеомицин-индуцированном фиброзе лёгких повышается уровень серотонина в альвеолярной ткани, назначение антагониста 5-НТ2А рецепторов ке-тансерина и антагониста 5-ИТ2В рецепторов SB215505 ослабляет фибротические проявления ^аЬге А. et а1., 2008].

1.6 Кетансерин

Кетансерин (К^ашеппит) химическое название 3-[2-[4-(пара-

Кетансерин

О

I Фторбензоил) пиперидиншфтил]-2,4(1Н,ЗН)-хиназолиндион. Синонимы: Суфроксал, БегеЁгех, БиЁгеха!.

Кетансерин - это специфический антагонист 5-НТ2-рецепторов, оказывает умеренное а-адреноблокирующее действие. Активность кетансерина связана с блокадой эффектов серотонина. Сочетанное блокирующее влияние препарата на 5-НТ2^2)-гистаминовые и а1-адренергические рецепторы вызывает расширение кровеносных сосудов и антигипертензивное действие. Кетансерин применяют при лечении артериальной гипертензии, для купирования гипертонических кризов, при нарушениях периферического кровообращения (перемежающаяся хромота, болезнь Рейно и др.), тромбозах и в комплексной терапии хронических бронхитов. Нарушение серотониновой медиации кетансерином снижает содержание коллагена и проколлагена 1 в лёгких животных с пневмофиброзом, экспрессию мРНК проколлагена 3 и уровень трансформирующего фактора роста-ß! [Fabre A. et al., 2008].

Интересны результаты коррекции кетансерином нарушений, вызванных сигаретным дымом. Хроническая обструктивная болезнь лёгких (ХОБЛ) характеризуется воспалением и прогрессивным разрушением легочной ткани, ведущим к обструкции. Курение сигарет - это основная причина развития и прогрессирова-ния ХОБЛ. Окислительный стресс, вызванный избытком активных форм кислорода при действии сигаретного дыма, индуцирует продукцию ИЛ-8 в дыхательных путях [Crapo J. D., 2003]. Высокий уровень ИЛ-8 положительно коррелирует с дисфункцией дыхательных путей в условиях курения [Kodama T.A. et al. 2009]. В свою очередь, ИЛ-8 стимулирует миграцию нейтрофилов в лёгкие, что провоцирует дальнейшее развитие воспалительных реакций [Kunkel S.L. et al., 1991]. Известно, что уровень серотонина при ХОБЛ повышается. Взаимодействуя с 5-HTR, серотонин увеличивает секрецию провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8 эпителиальными клетками человека линии BEAS-2B и клетками альвеолярного эпителия II типа (AEC-II) [Bayer Н. et al. 2007]. В исследованиях Way Kwok Wai Lau с коллегами были получены доказательства того, что кетансерин подавляет индуцированную сигаретным дымом продукцию ИЛ-8 путем блокады p38, ERK1/2 MAPK и Nrf2 сигнального пути и частично блокирует уменьшение соот-

ношения глутатиона к окисленному глутатиону (rGSH/GSSG) [Lau W.K.W. et al., 2012].

Все представленные выше данные открывают новые перспективы в развитии противовоспалительной и антифибротической терапии при заболеваниях лёгких. Даже в контексте взаимно исключающих по этиологии и патогенезу хронических заболеваний лёгких - ИЛФ и ХОБЛ, целесообразно снижать активность серото-ниновой составляющей воспаления и фиброза. Это может быть достигнуто различными антагонистами 5-НТ рецепторов. Между тем, совершенно не ясно, как происходит взаимодействие серотонина и процессов, регламентирующих регенерацию поврежденной и разрушенной альвеолярной ткани при ИЛФ и ХОБЛ. Исследования, посвященные взаимодействию серотониновой системы с глубоким резервом регенерации, на сегодняшний день отсутствуют.

1.7 Дофамин и его роль в регуляции сосудистого гомеостаза

Основной функцией эндотелиального барьера является поддержание гомео-стаза. Барьерная функция эндотелия во многом базируется на межклеточных контактах и регулируется рядом молекул межклеточных контактов (катенины, кадге-рины) и других биологически активных молекул (гистамин, брадикинин, VEGF) [Alves N.G. et al., 2018].

Соединения между эндотелиальными клетками представлены адгезивными контактами (анг. Adherens junctions) и плотными контактами (анг. Tight junctions) [Campbell H.K. et al., 2017]. В формировании адгезивных контактов участвуют молекулы межклеточной адгезии: VE-кадгерин и катенины. VE-кадгерин состоит из внеклеточного, трансмембранного домена и цитоплазматической части. Внеклеточный домен обеспечивает гомофильную адгезию (взаимодействие с идентичным доменом). а- и ß-катенины опосредуют связь VE-кадгерина с цитоплазма-тическим скелетом.

Плотные контакты регулируют прохождение ионов и воды, белков и липи-дов. Они представлены трансмембранными белками окклюдином, клаудинами и

молекулами адгезии плотных контактов (анг. Junctional adhesión molecule). Ок-клюдин представляет собой белок с молекулярной массой 65 кДа. В структуре выделяют С-концевой домен (необходим для правильной сборки и функционирования молекулы), N-концевой домен (принимает участие в формировании барьерных свойств плотных контактов), четыре трансмембранных и два внеклеточных домена. Молекула окклюдина четыре раза пронизывает цитоплазматическую мембрану, внеклеточные домены образуют две экстрацеллюлярные петли [Feld-man G.J. et al., 2005].

Молекула клаудина - это белок с молекулярной массой 20-27 кДа, имеющий схожую с окклюдином структуру, но обладает более коротким N-концом. Внеклеточные домены образуют две петли, одна из которых больше второй. Клаудины регулируют параклеточную проницаемость альвеолярного эпителия для ионов, поддерживают гомеостаз альвеолярной жидкости [Wittekindt O.H, 2017].

Молекула адгезии плотных контактов представляет собой гликозилирован-ный белок с молекулярной массой 43 кДа и состоит из внеклеточного, трансмембранного домена и короткого С-конца [González-Mariscal L., Betanzos A., Nava P. et al., 2003]. Внеклеточные домены молекул взаимодействуют между собой, образуя контакты, при этом внутриклеточные домены связаны с цитоскелетом и регулируют функционирование и сборку молекул [Campbell H.K. et al., 2017].

Белки zonula occludens регулируют формирование адгезивных и плотных контактов. Структура белков zonula occludens представлена тремя PSD-95 / discs-large / Zonula occludens доменами, одним SH3-доменом и вариабельными U-доменами (анг. Unique) [Hardaker E.L. et al., 2010].

Проницаемость эндотелиального барьера повышают VEGF, ФНО-а, бради-кинин и гистамин. Механическое воздействие изменяет состояние эндотелиально-го барьера путем активации ионных каналов, Rho-киназы [Mehta D., Ravindran K., Kuebler W.M., 2014]. Фосфорилирование тирозина в составе VE-кадгерина, опосредованное VEGF, сопровождается эндоцитозом комплекса Р-катенин / VE-кадгерин и повышением сосудистой проницаемости [Gavard J., Gutkind J.S., 2006].