Роль РНК-интерференции в подавлении транскрипции ретротранспозонов и тандемных повторов у D. melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Кленов, Михаил Сергеевич

• Кленов, Михаил Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кленов, Михаил Сергеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Задачи исследования

1.3. Научная новизна результатов исследования

1.4. Практическая ценность

1.5. Апробация работы

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ И РЕПРЕССИЯ ХРОМАТИНА

2.1. История изучения РНК-интерференции

2.2. Современные представления о механизме РНК-интерференции

2.3. Эндогенные короткие РНК у эукариот 21 , 2.4. Процессинг дцРНК - образование коротких РНК

2.5. Разрезание мРНК и подавление трансляции, направляемое короткими

2.6. Репрессия хроматина, направляемая короткими РНК

2.6.1. Общие представления о структуре хроматина

2.6.2. Короткие РНК и формирование гетерохроматина у дрожжей

2.6.3. РНК-интерференция и подавление транскрипции генов у растений

2.6.4. Косупрессия у растений

2.6.5. Метилирование ДНК и аппарат РНК-интерференции

2.6.6. РНК-сайленсинг на уровне хроматина у животных

2.7. РНК-интерференция и репрессия мобильных элементов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль РНК-интерференции в подавлении транскрипции ретротранспозонов и тандемных повторов у D. melanogaster»

Общая характеристика работы 1.1. Актуальность проблемы В последнее время активно изучаются функции некодируюпщх РНК в регуляции экспрессии генов. Значительная часть генома эукариот транскрибируется с образованием РНК, не являющихся матрицами для синтеза белков. Одной из разновидностей некодирующих РНК являются молекулы двуцепочечной РНК (дцРНК) и образуемые в результате их процессинга «короткие РНК». дцРНК подавляют экспрессию гомологичных по нуклеотидной последовательности генов в ходе процесса РНК-интерференции (Fire et al., 1998). Способность дцРНК специфично репрессировать гомологичные гены широко применяется в настоящее время как метод функциональной геномики. В этом случае используются «экзогенные» дцРНК или короткие РНК, которые могут быть синтезированы in vitro или же транскрибироваться с интегрированных в геном конструкций (Наппоп, 2002; Нашюп, Rossi, 2004). Регуляторная роль эндогенных молекул дцРНК и коротких РНК долгое время оставалась невыясненной. Работы последних нескольких лет показали, что короткие РНК участвуют в регуляции экспрессии множества генов организма, а также в репрессии мобильных элементов и поддержании функциональной структуры протяженных участков генома (Наппоп, 2002; Аравин и др., 2002; Bartel, 2004; Lippman, Martienssen, 2004; Mello, Conte, 2004). Молекулярный механизм РНК-интерференции представляется следующим образом. Длинные молекулы дцРНК нарезаются в клетке нуклеазами семейства Dicer на короткие РНК длиной около 20-25 нуклеотидов (siPHK short interfering RNA). Затем siPHK могут включаться в состав РНП комплекса RISC (RNA induced silencing complex), который обеспечивает взаимодействие одной из цепей короткой РНК с комплементарньа1и молекулами РНК, присутствующими в цитоплазме клетки, в частности, мРНК (Наппоп, 2002; Аравин и др., 2002; Meister, ТизсЫ, 2004). Комплекс RISC осуществляет разрезание молекул мРНК-мишени в участках, полностью комплементарных коротким РНК, в результате чего мРНК деградирует. Механизм разрезания мРНК с помощью коротких РНК показан у больпшнства групп эукариот, включая животных, растения и микроорганизмы (Наппоп, 2002; Аравин и др., 2002). Наряду с постгранскрипционной репрессией мРНК в цитоплазме, короткие РНК могут подавлять транскрипцию гомологичного гена в ядре. РНП комплекс, содержащий siPHK, обозначемый в этом случае как RITS (RNA-induced initiation of transcriptional silencing) (Verdel et al., 2004), вызывает локальное изменение структуры хроматина (Stevenson, Jarvis, 2003; Lippman, Martienssen, 2004). У делящихся дрожжей S. pombe короткие РНК индуцируют метилирование лизинов К9 гистона НЗ в хроматине гомологичных генов (Volpe et al., 2002). У растений короткие РНК вызывают репрессию хроматина комплементарных им генов, происходящую как за счет метилирования гистонов, так и в результате метилирования цитозинов в ДНК (Mette et al., 2000). Возможность воздействия коротких РНК на хроматин гомологичных генов у животных остается мало изученной. Центральным компонентом всех РНП комплексов, содержащих короткие РНК (RISC, RITS), являются белки семейства Argonaute (Ago) (Hammond et al., 2001; Martinez, ТшсЫ, 2004; Liu et al., 2004; Verdel et al., 2004). Помимо Ago, в формировании У этих комплексов обнаружены участвует РНК-хеликазы 81РЬЖ, и другие РНКсвязывающие белки (Meister, TuscM, 2004). эукариот эндогенные соответствующие повторов могут последовательностям мобильных элементов и гетерохроматиновых Plasterk, 2003; Xie et al., 2004). Мобильные элементы (Djikeng et al., 2001; Llave et al., 2002a; Ambros et al., 2003; Aravin et al., 2003; Sijen, часто транскрибироваться как в прямом, так и в обратном направлении, что приводит к образованию дцРНК. Противоположенное направление транскрипции может определяться собственными «антисмысловыми» промоторами транспозонов или находящимися рядом с инсерцией элемента внешними промоторами (Lankenau et al., 1994). Источником дцРНК является также гетерохроматин, в котором мобильные элементы накапливаются в больших количествах и могут располагаться во взаимопротивоположенной ориентации (Lippman et al., 2004). Наличие дцРНК, гомологичных мобильным элементам, позволяет клеточному аппарату РНКинтерференции подавлять их экспрессию, которая зачастую вредна для организма, поскольку приводит к транспозициям и, как следствие, мутациям и хромосомным перестройкам (Tijsterman et al., 2002; Гвоздев, 2003). Нарушение системы РНКинтерференции у различных организмов, приводит к дерепрессии мобильных элементов, в том числе, ретротранспозонов у Drosophila melanogaster (Aravin et al., 2001). Однако остается невыясненным, участвует ли аппарат РНК-интерференции в репрессии хроматина ретротранспозонов у дрозофилы, или подавление экспрессии происходит исключительно на посттранскрипционном уровне в результате деградации транскриптов.Помимо подавления экспрессии мобильных элементов, эндогенные siPHK участвуют в регуляции собственных генов D. melanogaster. В семенниках самцов дрозофилы дцРНК, образующаяся в результате симметричной транскрипции повторов Su(Ste), направляет репрессию гомологичных повторов генов Stellate (Aravin et al., 2001). Удаление повторов Su(Ste) вызывает гиперэкспрессию генов Stellate и накопление в клетках сперматоцитов белковых агрегатов, представляющих, по-видимому, продукт трансляции Stellate, что приводит к стерильности самцов (Palumbo et al., 1994; Bozzetti et al., 1995). Дерепрессия генов Stellate, происходящая в результате делеции локуса Su(Ste), сопровождается исчезновением коротких РНК Su(Ste) (Aravin et al., 2001). Данных о том, каким образом короткие РНК Su(Ste) подавляют экспрессию генов Stellate: на посттранскринционном уровне, или же на уровне транскрипции, не было получено. 1.2. Задачи исследования Целью настоящей работы являлось исследование возможной роли аппарата РНК-интерференции в подавлении транскрипции и формировании репрессивной структуры хроматина ретротранспозонов и повторенных генов Stellate. Были поставлены следующие задачи: 1. Сравнить уровень экспрессии ретротранспозонов при мутациях в генах РНК-интерференции в терминальных и соматических тканях D. melanogaster. 2. Сравнить структуру хроматина ретротранспозонов в норме и при нарушении аппарата РНК-интерференции. 3. Проверить возможную роль повторов Su(Ste) в регуляции транскрипции генов Stellate. 4. Выяснить значение промотора и транскрибируемой области генов Stellate для осуществления их репрессии повторами Su(Ste)..3. Научная новизна результатов исследования Показана роль гена piwi, кодирующего консервативный белок семейства Argonaute, в регуляции экспрессии ретротранспозонов D. melanogaster. Обнаружено, что механизм РНК-интерференции направлен на репрессию ретротранспозонов, преимущественно, в клетках зародьппевого пути, но не в соматических тканях. Впервые продемонстрировано участие аппарата РНК-интерференции в формировании «молчащей» структуры хроматина ретротранспозонов у животных. Показано, что повторы Su(Ste), транскрибируемые с образованием дцРНК, подавляют транскрипцию гомологичных генов Stellate. В то же время обнаружено, что репрессия генов Stellate может происходить в отсутствии их собственного промотора, тогда как наличие гомологии с повторами Su(Ste) в транскрибируемой области Stellate необходимо для осуществления регуляции. Полученные данные впервые показывают роль «естественной» РНК-интерференции в регуляции транскрипции генов у животных. 1.4. Практическая ценность Полученные в работе данные позволяют приступить к детальному исследованию механизма модификации структуры хроматина, индуцируемой короткими РНК в герминальных тканях дрозофилы. Результаты исследования механизмов РНК-интерференции на D. melanogaster могут быгь распространены на клетки человека и использованы в биомедицинских исследованиях. 1.5. Апробация работы Работа апробирована на лабораторном семинаре в отделе молекулярной генетики клетки (ОМГК) ИМГ РАН и на кафедре Молекулярной биологии МГУ им. М.В. Ломоносова. Данные, представленные в работе, докладывались на 44 и 45 конференциях по дрозофиле (США, 2003, 2004), на конференциях, посвященных механизмам РНК-интерференции (Keystone symposia, США, 2002, 2003, 2004), на конференции «Современные проблемы молекулярной генетики» (ИМГ, 2002), на конференции по изучению гетерохроматина (Италия, 2003), на 3-ом Биохимическом Съезде (Санкт-Петербург, 2002) и на других конференциях (Киев, 2003: Пущине, 2003; Москва, 2004).Обзор литературы РНК-интерференция и репрессия хроматина 2.1. История иззения РНК-интерференции В 1998 году была обнаружена способность молекул дцРНК, инъецированных в организм нематоды elegans, эффисгивно подавлять экспрессию гомологичных по нуклеотидной последовательности генов (явление РНК-интерференции RNA interference, RNAi) (Fire et al., 1998; Timmons, Fire, 1998). Этот феномен был открыт в ходе экспериментов по подавлению генов при помощи искусственно синтезированных антисмысловых РНК. Предполагалось, что антисмысловая РНК в результате узнавания комплементарной мРНК препятствует ее трансляции. Антисмысловая РНК, действительно, снижала уровень экспрессии гомологичного гена, однако с очень низкой эффективностью. Оказалось, что инъекции контрольной смысловой РНК вызывают такой же эффект подавления экспрессии гена, как и инъекция антисмысловой РНК (Fire et al., 1998). Более тщательный анализ показал, что агентом, нарущающим экспрессию, является не смысловая или антисмысловая РНК, а двуцепочечная (дцРНК), небольщая доля которой образовывалась при транскрипции in vitro и присутствовала в качестве примеси в обоих препаратах. К тому времени был уже подробно исследован механизм действия дцРНК в клетках млекопитающих (Clemens, 1997), приводящий к прекращению трансляции всех мРНК, независимо от последовательности дцРНК. В отличие от эффекта дцРНК в клетках млекопитающих, РНК-интерференция степенью гомологии с введенной дцРНК. Первые эксперименты по РНК-интерференции у elegans выявили ряд характерных особенностей этого явления: дцРНК способна действовать в очень низких концентрациях. Расчеты показали, что эффеюивными оказываются концентрации, соответствующие всего нескольким молекулам дцРНК на клетку (Fire et al., 1998; Montgomery et al., 1998). у С elegans эффект подавления активности гена может наследоваться после инъекции дцРНК. В случае введения дцРНК, соответствующей гену, экспрессирующемуся в соматических тканях, эффект наследуется только в первом поколении и пропадает в последующих, однако в случае генов. 10 предполагает специфическое нарущение экспрессии только тех генов, которые обладают достаточно большой экспрессирующихся герминальных тканях, наследование может происходить в течение двух и более поколений (Grishok et al., 2000). эффективное подавление экспрессии наблюдалось только при использовании дцРНК, соответствующей экзонам, в том числе 5 и 3 нетранслируемьпл областям (UTR), но не нитронам или нетранскрибируемой промоторной части гена (Montgomery et al., 1998). Эти свойства позволили сформулировать первую модель РНКинтерференции, согласно которой дцРНК приводит к постгранскрипционной деградации гомологичной мРНК в цитоплазме, не затрагивая последовательность ДНК и структуру хроматина гена (т.е. не влияя на его транскрипцию) а также количество пре-мРНК в ядре. Субстехиометрическое действие дцРНК на мРНК объяснялось либо амплификацией активной формы сигнала, либо каталитическим действием дцРНК на многие молекулы мРНК, либо комбинацией обоих механизмов. В последующие годы эффективность РНК-интерференции была продемонстрирована у разнообразных животных (Kennerdell, Carthew, 1998; Lohmann et al., 1999; Ngo et al., 1998; Sanchez Alvarado, Newmark, 1999), a также у растений, грибов и простейших (см. для обзора Hannon, 2002; Аравин и др.,2003; Meister, Tuschl, 2004; Mello, Conte, 2004). Было предположено, что биологическое значение механизма РНК- интерференции состоит в борьбе с РНК-вирусами, которые могут реплицироваться с образованием дцРНК интермедиатов, а также в подавлении экспрессии и размножения подвижных элементов, для которых также обнаруживаются молекулы дцРНК (Tijsteraian et al., 2002). Уже сразу после открытия РНК-интерференция стала использоваться как мопщый и удобный способ специфического подавления экспрессии генов, исходя из их нуклеотидной последовательности, в том числе для массового скрининга генов (Bargmann, 2001; Barstead, 2001; Maeda et al., 2001; Piano et al., 2000). В настоящее время РНК-интерференция является одним из наиболее часто используемых подходов функциональной геномики (Hannon, Rossi, 2004; Novina, Sharp, 2004). Подавление экспрессии гена можно индуцировать как при помощи инъекций или другого способа доставки искусственно синтезированной дцРНК в организм, так и путем введения в геном трансгенных конструкций, кодирующих дцРНК. Одновременно начались исследования самого механизма РНК-интерференции с использованием как генетического, так и биохимического подходов. По мере выяснения действия дцРНК в клетках беспозвоночных оказалось, что феномен РНК11 интерференции имеет много общего с другим явлением, открытым за несколько лет до этого у растений косупрессией (Napoli et al., 1990; Van der Krol et al., 1990). Косупрессия была обнаружена в ходе опытов по трансгенозу растений дополнительными копиями генов с целью получить увеличение экспрессии и в результате необходимый фенотип. У трансгенных растений часто обнаруживалось не увеличение, а подавление экспрессии генов, причем в таких случаях оказывались подавленными не только введенные трансгены, но и нормально экспрессирующийся до этого клеточный ген, обладающий гомологией с введенными трансгенами (см. для обзора Baulcombe, 2004). Генетический подход к изучению РНК-интерференции и косупрессии у растений заключался в скринингах генов, необходимых для этих процессов (Ketting et al., 1999; Tabara et al., 1999; Fagard et al., 2000). Некоторые гены, мутации в которых нарушали процесс РНК-интерференции, оказались гомологичными генам, идентифицированным в скринингах на косупрессию. Оказалось, что такие гены кодируют белки, характеризующиеся наличием консервативных доменов, функции которых до этого не были известны (Tabara et al., 1999; Fagard et al., 2000). В дальнейшем, для этого семейства белков было принято обозначение Argonaute. Молекулярный механизм РНК-интерференции, на первых этапах, был исследован, в основном, с использованием бесклеточных систем, полученных из эмбрионов или культуры клеток Drosophila melanogaster (Tusclil et al., 1999; Zamore et al., 2000; Hammond et al., 2000; Bernstein et al, 2001; Elbashir et al., 2001a). Ha такой системе было показано, что искусственно синтезированная мРНК подвергается специфической деградации при добавлении в систему гомологичной дцРНК в ходе АТР-зависимой реакции (ТизсЫ et al., 1999; Zamore et al., 2000). Преинкубация дцРНК с экстрактом усиливала эффект РНК-интерференции, При проведении дальнейших экспериментов на бесклеточной системе оказалось, что при инициации РНК-интерференции происходит нарезание длинной молекулы дцРНК на короткие РНК размером 21-23 нт. (Zamore et al,, 2000), а на следующем этапе осуществляется расщепление соответствующей мРНК (Hammond et al., 2000; Zamore et al., 2000). Короткие молекулы РНК размером около 25 нуклеотидов были обнаружены также при изучении косупрессии у растений (Hamilton, Baulcombe, 1999). В этой работе было показано, что при различных случаях косупрессии, индуцированной трансгенами, в клетках растений обнаруживаются короткие смысловые и антисмысловые РНК, соответствующие по последовательности матричной РНКмишени, причем количество коротких РНК коррелирует с силой косупрессии. 12 Впоследствии, оказалось, что именно короткие РНК, образуюпщеся из длинных дцРНК дуплексов, являются активной формой сигнала при РНК-интерференции у животных и косупрессии у растений. Благодаря специально разработанной схеме удалось клонировать короткие РНК, образующиеся при процессинге дцРНК в бесклеточной системе из эмбрионов дрозофилы, оказалось, что около половины из них имеют размер 21 нт. (Elbashir et al., 2001а). Детальный анализ образующихся в результате процессинга дцРНК коротких РНК-дуплексов показал, что они характеризуются строго определенными параметрами: присутствием 5-концевого фосфата, З-концевой гидроксильный группы, а также 2 нт. выступающих 3 концов (Zamore et al., 2000; Elbashir et al., 2001a). Искусственно синтезированные дуплексы коротких РНК с 2-нт. выступающими 3 концами оказались эффективными в индукции РНК-интерференции у различных организмов, включая млекопитающих (Caplen et al., 2001; Elbashir et al., 2001b), У млекопитающих короткие РНК не вызывают неспецифичного интерферонового ответа, в отличие от более протяженных молекул дцРНК, а приводят к специфичной деградации гомологичных мРНК. Это позволило проводить дальнейшее изучение молекулярного механизма РНК-интерференции, в том числе и на культуре клеток млекопитающих (Elbashir et al., 2001b; Martinez et al., 2002; Chiu, Rana, 2002). Наличие у продуктов процессинга дцРНК 5-концевой фосфатной группы и 3концевого гидроксильного остатка свидетельствовало, что фермент, осуществляющий расщепление дцРНК при РНК-интерференции в эукариотических клетках, аналогичен эндорибонуклеазе РНКазе Ш прокариотическому ферменту, который расщепляет дцРНК. Такой фермент, найденный у многих видов бактерий и наиболее хорошо изученный у E.coli, играет роль в процессинге РНКпредшественников рибосомальной РНК (Fierro-Monti, Mathews, 2000). Анализ геномов D.melanogaster и C.elegans показал, что у этих организмов присутствуют гены, кодирующие домен РНКазыШ (Bernstein et al., 2001). Соответствующие белки, кроме того, содержат домены связывания дцРНК (dsRBD) (Fierro-Monti, Mathews, 2000). Функции одного из таких белков D. melanogaster были исследованы на системе in vitro (Bernstein et al., 2001). Добавление очищенного белка к дцРНК в присутствии АТР приводило к расщеплению субстрата на короткие 21-23 нт. РНК. Обнаруженная нуклеаза получила название Dicer (от англ. to dice нарезать в форме кубиков) (Bernstein et al., 2001). Дальнейшие исследования показали консервативную 13 роль белков семейства Dicer процессинге дцРНК и образовании коротких РНК во всех группах эукариот. Было продемонстрировано, что белки Dicer ответственны за производство коротких РНК у растений (Park et al., 2002; Finnegan et al., 2003), нематоды (Ketting et al., 2001; Knight, Bass, 2001; Grishok et al., 2001), дрозофилы и млекопитающих (Hutvdgner, et al., 2001; Zhang et al., 2002; Provost et al., 2002). Комплекс, осуществляющий деградацию мР1Ж, был впервые вьщелен из культуры клеток дрозофилы. Этот комплекс получил название RISC (RNA-induced silencing complex), так как было показано, что он содержит короткие РНК, образованные белком Dicer на предыдущей стадии РНК-интерференции (Hammond et al., 2000; Zamore et al., 2000). Обнаружение коротких РНК в процессах РНК-интерференции и косупрессии не было беспрецедентным. У elegans задолго до этого была найдена эндогенная короткая РНК Ип-4 длиной 22 нт. (Lee et al., 1993; Wightman et al., 1993). Было обнаружено, что lin-4 РНК является частично комплементарной к нескольким повторенным участкам в 3 UTR гена Ип-14, кодирующего белок, необходимый для раннего онтогенеза у С elegans, и экспрессирующийся только на строго определенной стадии развития (Lee et al., 1993; Wightman et al., 1993). При этом, оказалось, что комплементарные lin-4 последовательности в 3 UTR Ип-14 необходимы для регуляции экспрессии мРНК lin-14, а именно, для подавления ее трансляции на определенном этапе онтогенеза. Еще одна короткая РНК (let-7) длиной 22 нт., участвующая в регуляции трансляции мРНК другого «развитийного» гена у С elegans, была обнаружена в 2000 году (Reinhart et al., 2000; Slack et al., 2000). После открытия коротких РНК в процессе РНК-интерференции, стало понятно, что РНК lin-4 и Ш-7 могут образовываться из дцРНК предшественников с помощью такого же механизма, как и короткие РНК при РНК-интерференции, что, действительно, бьшо показано (Knight, Bass, 2001; Grishok et al., 2001; Hutvagner et al., 2001; Ketting et al., 2001). В результате клонирования коротких РНК из различных растений и животных было обнаружено, что у большинства многоклеточных эукариот существуют сотни видов эндогенных коротких РНК, участвующих в регуляции экспрессии определенных генов в ходе развития организмов (так назьшаемые микроРНК) (Pasquinelli et al., 2000; Lagos-Quintana et al., 2002; BashiruUah et al., 2003; Lim et al., 2003). МикроРНК регулируют экспрессию своих мРНК-мишеней либо за счет подавления их трансляции, либо за счет разрезания (см. для обзора Battel et al., 2004). Было показано, что тот или иной путь подавления определяется тем, насколько короткая молекула РНК комплементарна 14 мРНК-мишени. При полной комплементарности короткая РНК осуществляет разрезание гомологичной молекулы РНК, тогда как в случае частичной комплементарности происходит подавление трансляции (Hutvagner, Zamore, 2002), Эта закономерность наблюдается как для искусственно синтезированных коротких РНК-дуплексов, так и для эндогенных микроРНК (Hutvagner, Zamore, 2002; Saxena et al., 2003; Llave et al., 2002b). До некоторого момента все исследования механизма РНК-интерференции у животных были сфокусированы на изучении роли коротких РНК в посттранскрипционной репрессии комплементарных молекул мРНК, происходящей в результате их разрезания или подавления трансляции, В то же время, у растений было обнаружено, что молекулы дцРНК, наряду с репрессией мРНК в цитоплазме, могут подавлять транскрипцию гомологичного гена, вызьшая метилирование цитозинов в составе ДНК (Mette et al., 2000), Это явление было названо РНКзависимым метилированием ДНК, Позже было продемонстрировано, что короткие молекулы РНК могут индуцировать метилирование гистонов и формирование гетерохроматина у делящихся дрожжей S. ротЬе (Volpe et al., 2002; Schramke, AUsliire, 2003). Таким образом, бьш выявлен принципиально иной механизм действия дцРНК, который, однако, также предполагает специфическое влияние коротких РНК на экспрессию гомологичного гена. В настоящем обзоре кратко рассматривается механизм РНК-интерференции, происходящей на посттранскрипционном уровне, и более детально обсуждается участие дцРНК в подавлении транскрипции и репрессии хроматина. 2.2. Современные представления о механизме РНК-интерференции Общая модель механизма РНК-интерференции предполагает существование двух основных стадий (рис. 1), На первой стадии длинные молекулы дцРНК подвергаются в цитоплазме клеток процессингу нуклеазами семейства Dicer с образованием коротких РНК-дуплексов длиной 20-25 нт. (размер коротких РНК варьирует в зависимости от организма и типа коротких РНК). Короткие РНКдуплексы, как уже упоминалось, имеют структурные особенности, которые задаются белком Dicer и строго необходимы для функциональной активности коротких РНК: одноцепочечные выступающие динуклеотидные 3 ОН концы и фосфорилированные 5 концы (Bernstein et al., 2001; Elbashir et al., 2001a). Ha второй стадии происходит 15 расплетание дуплекса коротких РНК и одна из цепей включается в состав эффекторных РНП-комплексов. Короткая РНК в составе РНП-комплекса обнаруживает в клетке комплементарные ей нуклеиновые кислоты (мишени), после чего эффекторный комплекс катализирует ту или иную реакцию, направленную на подавление экспрессии мишени (рис. 1). Можно выделить 3 основных разновидности эффекторных РНП-комплексов, содержащих короткие РНК: комплекс RISC, осуществляющий разрезание РНК-мишени (которой может быть как мРНК, так и любая другая одноцепочечная РНК); комплекс, направляющий подавление трансляции мРНК также обозначается как RISC; а в том случае, если содержит микроРНК, обозначается как микроРНП; комплекс RITS, осуществляющий подавление транскрипции и репрессию хроматина. Комплексы RISC и микроРНП функционируют в цитоплазме, а комплекс RITS в ядре (рис. 1). Во всех случаях специфичность действия эффекторных определяется спариванием комплементарных нуклеиновых комплексов При кислот. посттранскрипционном механизме репрессии (комплексы RISC и микроРНП) спаривание происходит между короткой РНК и комплементарным участком в РНКмишени. В случае же комплексов RITS, обнаруживающих гомологичный локус в геноме, природа комплементарного взаимодействия остается невыясненной. Возможны два варианта того, как короткая РНК в составе RITS комплекса может «узнать» гомологичный ген (Verdel et al., 2004). Первый механизм предполагает гибридизацию молекулы короткой РНК непосредственно с ДНК. Второй возможный способ состоит в том, что короткая РНК взаимодействует с новообразованной (насцентной) РНК в ходе ее транскрипции или сразу после. Если в этот момент насцентная РНК находится в пространственной близости от кодирующего ее гена, то RITS комплекс может привлекать белки, осуществляющие репрессию хроматина этого гена и, следовательно, подавление транскрипции. Причины, определяюпще, в какой из трех типов эффекторных комплексов будет включаться короткая РНК после образования, остаются мало изученными. Мультибелковые эффекторные комплексы (RISC, микроРНП и RITS) различны по составу входящих в них белков, однако все они содержат белки семейства Argonaute (Ago) (Hammond et al., 2001; Окатш-а et al., 2004; Sigova et al., 2004; Verdel et al., 2004; Martinez, Tuschl, 2004; Liu et al., 2004). Гены, кодирующие белки этого семейства, были идентифицированы в 16 первых генетических скринингах компонентов РНК-интерференции, косупрессии и других процессов подавления генной экспрессии с участием дцРНК («РНК сайленсинга») у эукариот (ТаЬага et al., 1999; Fagard et al., 2000; Carmell et al., 2002; Catalanotto et al., 2002). Ha настоящий момент консервативные белки семейства Argonaute обнаружены у архей и практически у всех эукариот, за исключением почкующихся дрожжей S. cerevisiae. Мутации в генах, кодирующих Argonaute, нарушают дцРНК-зависимую деградацию мРНК (Hammond et al., 2001; Liu et al., 2004; Williams et al., 2002; Tabara et al., 1999; Okamura et al., 2004; Sigova et al., 2004), подавление трансляции при помощи коротких РНК (Bartel, 2004; Okamura et al., 2004; Grishok et al., 2001), a также вьпванное короткими РНК подавление транскрипции (Fagard et al., 2000; Volpe et al., 2002; Zilberaian et al., 2003), Различные группы эукариот имеют свои уникальные особенности аппарата РНКинтерференции. В частности, различия состоят в присутствии тех или иных эффекторных комплексов (таблица 1). Механизм разрезания мРНК с участием комплекса RISC показан у всех основных эукариотических модельных объектов (ТизсЫ et al., 1999; Elbashir et al., 2001a; Sigova et al., 2004). Механизм подавления трансляции обнаружен у большинства эукариот, но не у делящихся дрожжей S. pombe. Возможность подавления транскрипции генов с помощью дцРНК прямо показана, на данный момент, лишь для растений, S. pombe и на культуре клеток человека. На этих объектах было продемонстрировано, что образование коротких РНК, соответствующих активно транскрибируемому гену, приводит к снижению транскрипции, которое коррелирует с увеличением количества метилированных гистонов и, в случае растений и человека, с метилированием ДНК (Schramke, Allshire, 2003; Zilberman et al., 2003; Kawasaki, Taira, 2004). Прямой индукции транскрипционной репрессии при помощи гомологичной дцРНК у нематоды и дрозофилы показано не было. Тем не менее, ряд косвенных данных свидетельствует о том, что аппарат РНК-интерференции у этих организмов может влиять на структуру хроматина некоторых типов последовательностей (Pal-Bhadra et al., 2004; Grishok et al., 2005; Robert et al., 2005). 17 Dicer двунитевая РНК Dicer РНК шпилька расщепление и деградация мРНК подавление трансляции мРНК репрессия хроматиид II Чподявление транскрипции Г"Я в ЗДр| Рис. 1. Общий механизм РНК-интерференции. Молекулы дцРНК представляют собой РНК-шпильку или две комплементарные отожженные друг на друга цепи РНК. Длинные молекулы дцРНК нарезаются (процессируются) в клетке нуклеазами семейства РНКазы III Dicer на короткие двунитевые РНК длиной 20-25 нуклеотидов (siPHK short interfering RNAs). siPHK могут включаться в состав белкового комплекса RISC, который «выбирает» одну из комплементарных цепей РНК и обеспечивает ее взаимодействие с гомологичной мРНК. RISC осуществляет разрезание молекул мРНК-мишени в участках, полностью комплементарньпс коротким РНК, в результате чего мРНК деградирует. Если siPHK имеют несколько неспаренных с мРНК нуклеотидов, то мРНК не разрезается, но перестает транслироваться. Короткие РНК могут также осуществлять репрессию хроматина и подавление транскрипции гомологичного по нуклеотидной последовательности гена в ядре. Природа комплементарного взаимодействия (РНК-РНК или РНК-ДНК) в этом случае остается невыясненной. 18 Посттранскрипционная Объект регуляция (расщепление мРНК) Подавление трансляции подавление транскрипции (репрессия хроматина) 5". pombe А. thaliana 9 9 elegans D. melanogaster H. sapiens Таблица 1. Распространение различных мезанизмов подавления экспрессии генов с участием коротких РНК у основных эукариотических модельных объектов Существуют некоторые другие аспекты механизма РНК-интерференции, характерные лишь для некоторых групп эукариот. Так, у elegans было обнаружено явление распространения сигнала РНК-интерференции, состоящее в том, что подавление экспрессии гена может происходить в любой ткани независимо от того, в какую ткань исходно была инъецирована дцРНК (Winston et al., 2002; Feinberg, Hunter, 2003). Например, введение в мьппечную ткань дцРНК, соответствующей последовательности мРНК зеленого белка GFP, приводит к подавлению экспрессии трансгена в нервной ткани. Явление распространения сигнала РНК-сайленсинга известно также у растений (Voinnet, Baulcombe, 1997; Baulcombe, 2004). У С elegans был идентифицирован трансмембранный белок S1D1, формирующий, по-видимому, активные межклеточные каналы для транспорта дцРНК (Winston et al., 2002). В то же время, у D. melanogaster такого механизма обнаружено не было, то есть у дрозофилы РНК-интерференция происходит «автономно» только в тех клетках, в которых присутствует дцРНК, инициирующая репрессию (Roignant et al., 2003). Интересно, что введение в геном дрозофилы трансгена, кодирующего белок 8Ш-1 из elegans, позволяет осуществлять 19 транспорт дцРНК между клетками и обеспечивает распространение сигнала РНКинтерференции у дрозофилы (Feinberg, Hunter, 2003). При РНК-интерференции у S. ротЪе, elegans и растений показана возможность зависимыми амплификации сигнала, (RdRp осуществляемой RNA-directed клеточными RNA РНКРНК-полимеразами polymerase), кодируемыми в геномах этих организмов (Smardon et al., 2000; Dalmay, et al., 2000; Mourrain et al., 2000; Volpe et al., 2002). RdRp способна синтезировать дцРНК на матрице однонитевой РНК. В некоторых случаях в качестве затравки для синтеза RdRp может использовать антисмысловую короткую РНК (Sijen et al., 2001а; Vaistij et al., 2002). Продукты реакции удлинения сами также представляют собой дцРНК. В соответствии с этим, они должны подвергаться дальнейшему процессингу с образованием "вторичных" молекул коротких РНК. Действительно, образование вторичных коротких РНК, не гомологичных исходной дцРНК, было показано при РНК-интерференции у С elegans (Sijen et al., 2001a). При этом было отмечено, что вторичные короткие РНК соответствуют исключительно 5 области относительно исходного сегмента дцРНК, что полностью соответствует модели праймирования мРНК первичными короткими РНК. Существование вторичных коротких РНК было доказано в элегантных экспериментах на С elegans (Sijen et al., 2001a; Alder et al., 2003). Была обнаружена способность дцРНК осуществлять деградацию некомплементарных последовательностей. При наличии в организме трансгена, состоящего из двух сегментов, инъекция дцРНК к одному из них приводила к деградации мРНК гена, содержащего только один из сегментов, который не соответствовал по последовательности инъецированной дцРНК. Этот феномен был назван транзитивной (transitive) РНК-интерференцией (Sijen et al., 2001а; Alder et al., 2003). Транзитивная РНК-интерференция имеет определенную направленность: деградации подвергается только сегмент, расположенный 5 (upstream), относительно исходной дцРНК, но не 3 (downstream). В то же время гены, кодирующие RdRp, не обнаружены в геномах дрозофилы и млекопитающих. Для этих организмов показано отсутствие возможности амплификации сигнала и транзитивной РНК-интерференции (Schwarz et al., 2002) 20 .3. Эндогенные короткие РНК у эукариот Эндогенные короткие РНК были выявлены, в основном, с помощью технологии «клонирования», которая состоит в получении кДНК библиотек всех клеточных РНК, находящихся в диапазоне размеров от 20 до 25 нт. и содержащих 3 ОН и 5 фосфат (Battel et al., 2004). Выделяют два класса эндогенных коротких РНК у эукариот: микроРНК и siPHK (short interfering RNA). МикроРНК образуются нуклеазой Dicer из кодируемых в геномах животных и растений РНК-предшественников, имеющих структуру шпильки. МикроРНК всегда представляет олигонуклеотид строго определенной последовательности, собой которая детерминируется структурой шпилечного предшественника (Battel et al,, 2004). В отличие от микроРНК, вырезаемых из предшественника-шпильки по строго определенным позициям, siPHK представляют собой статистический набор олигонуклеотидов, образующихся при процессинге длинных молекул дцРНК. Все короткие РНК, имеющие искусственное происхождение, в том числе искусственно синтезированные короткие РНК-дуплексы, принято также называть siPHK. Микро РНК обнаружены у животных и растений (Bartel et al., 2004). Напрмер, у D. melanogaster бьшо выявлено 77 генов, кодирующих 71 уникальную микроРНК (Aravin et al., 2003; Lai et al., 2003). У человека обнаружено около 200 генов микроРНК (Griffiths-Jones, 2004). Многие микроРНК консервативны около 1/3 микроРНК elegans имеют близкие гомологи у человека, отличающиеся не более чем на несколько нт., (Bartel et al., 2004). Некоторые микроРНК кодируются в нитронах генов, тогда как другие находятся в составе самостоятельных транскрипционных единиц. МикроРНК участвуют в регуляции экспрессии различных мРНК, связываясь, как правило, с комплементарными сайтами в 3 нетраслируемых областях. Так же как и siPHK, микроРНК могут разрезать мРНКмишень, если их нуклеотидные последовательности полностью комплементарны, или останавливать трансляцию, если комплементарность частичная (рис. 2) (Bartel et al., 2004; Hutvagner, Zamore, 2002). Описаны экзотические случаи, когда у растений микроРНК, комплементарная промотору, может подавлять транскрипцию гена (Вао et al., 2004). Мишенями микроРНК являются различные клеточные мРНК. Особенно большое число мишеней микроРНК бьшо обнаружено среди мРНК тканеспецифичных транскрипционных факторов, активных на определенных этапах 21 онтогенеза (Bartel et al., 2004). Мишени для большинства микроРНК остаются не идентифицированными. Эндогенные siPHK соответствуют, в основном, последовательностям различных мобильных элементов и гетерохроматиновых повторов (Llave et al., 2002а; Aravin et al., 2003). Известно крайне мало siPHK, соответствующих последовательностям «нормальных» генов организма. Этот факт представляется удивительным, поскольку существует огромное количество примеров транскрипщ1И генов в двух направлениях, в том числе, в одних и тех же клетках. 2.4. Процессинг дцРНК образование коротких РНК Ферменты, осуществляющие процессинг дцРНК, относятся к семейству Dicer и содержат домены РНКазы III и дцРНК связьтающие домены (Bernstein et al., 2001; Grishok et al., 2001; Basyuk et al., 2003; Lee et al., 2003; Lee et al., 2004). Образование микроРНК происходит в два этапа (рис. 2). На первом этапе нуклеаза Drosha, также как и Dicer, несущая домены РНКазы III осуществляет разрезание первичного транскрипта микроРНК с образованием шпилечного предшественника, имеющего, обычно, длину около 70 нт. (Lee et al., 2002; Lee et al., 2003). Этот этап происходит в ядре клетки. Предшественники микроРНК переходят затем в цитоплазму при участии экспортина 5 через ядерный канал-рецептор (Bohnsack et al., 2004; Lund et al., 2004; Yi et al., 2003). Белки семейства Dicer, активные в цитоплазме, участвуют в формировании зрелых микроРНК из шпилечных предшественников (рис. 2). Образование siPHK из длинных молекул дцРНК также осуществляют белки Dicer в цитоплазме (Lee et al., 2004; Xie et al., 2004). Многие эукариотические нуклеазы, процессирующие дцРНК, работают в гетеродимерных комплексах с дцРНК связывающими белками Drosha в клетках человека с DGCR-8 (Gregory et al., 2004; Han et al., 2004a; Landthaler et al., 2004), у D.melanogaster с Pasha (Denli et al., 2004); Dicer в растениях работают вместе с HYL1 и HEN1 (Boutet et al., 2003; Vazquez et al., 2004); в клетках человека с TRBP (Chendrimada Т. et al., 2005); у C.elegans с Rde4 (Tabara et al., 2002); у D.melanogaster с R2D2 (Liu et al., 2003) или Loq (Forstemann et al., 2005; Saito et al., 2005). Белок HENl в растениях необходим для метилирования 2ОН рибозы последнего нуклеотида на 3 конце микроРНК (Yu et al., 2005). В других случаях, дцРНК связьшающие белки нужны, очевидно, для инициации сборки эффекторного 22 комплекса (Forstemann К. et al., 2005; Liu et aL, 2003; Saito et al., 2005; Tabara et al., 2002), a также для выбора, какая из цепей дуплекса siRNA будет входить в состав RISC (Tomari et al., 2004a). У некоторых организмов показано существование нескольких белков Dicer, которые имеют различные функции. У D. melanogaster обнаружено два паралога: Dicer 1 продуцирует преимущественно микроРНК (Lee et al., 2004) и Dicer 2 необходим для нарезания длинных молекул дцРНК на siPHK (Lee et al., 2004; Liu et al., 2003; Pham et al., 2004). ген м и к р о Р Н К ;1ервичный транскрипт ц"ни1||||||Ц|ша1|и< И1„Г1И11,ШГ111111И111,11ц] шпилечный предшественник полная комплементарность микроРНК-мРНК частичная комплементарность микроРНК и З-UTR мРНК Рис. 2. Механизм образования и функционирования микроРНК. На первом этапе в ядре клетки нуклеаза Drosha осуществляет разрезание первичного транскрипта микроРНК с образованием шпилечного предшественника, имеющего, обычно, длину около 70 нт.. Белки семейства Dicer активны в цитоплазме, участвуют в формировании зрелых микроРНК из шпилечных предшественников. Лишь одна из двух цепей в дуплексе микроРНК включается в состав RISC, вторая деградирует. 23 .5. Разрезание мРНК и подавление трансляции, направляемое короткими РНК Лишь одна из двух цепей в дуплексе коротких РНК включается в состав RISC. Выбор цепи, которая будет включаться в Ш8С, определяется термодинамическими особенностями расплетания дуплекса (Khvorova et al., 2003; Schwarz et al., 2003). Для расплетания дуплекса с разных концов затрачивается разная энергия. Выбор цепи осуществляется в пользу той одноцепочечной РНК, 5 конец которой находится со стороны дуплекса, наиболее энергетически вьподной для расплетания (Khvorova et al., 2003; Schwarz et al., 2003). Одноцепочечная короткая РНК в составе RISC узнает гомологичную мРНК, после чего RISC разрезает мишень ровно посередине участка комплементарности между siPHK и мРНК (Elbashir et al., 2001а). На этапе расплетания дуплекса предполагается возможное участие РНК-хеликаз. Центральным белковым компонентом комплекса RISC являются белки семейства Argonaute (AGO) (Hammond et al., 2001; Martinez, Tuschl, 2004; Liu et al., 2004), характеризующиеся наличием доменов PAZ и PIWI (Cerutti et al., 2000). Функция PAZ домена состоит в специфическом связьшании siPHK (Song et al., 2003; Lingel et al., 2004; Ma et al., 2004). Главным вопросом при изучении RISC долгое время бьш поиск гипотетической нуклеазы, осуществляющей разрезание мРНК. Рентгеноструктурный анализ белка Argonaute из архей показал, что структура домена PIWI схожа со структурой РНКазы Н, осуществляющей разрезание РНК в РНК-ДНК дуплексах (Song et al., 2004) (рис. 3). Эти данные позволили предположить модель, согласно которой PIWI домен вьшолняет роль нуклезы в комплексе RISC (рис. 3). Белок AG0-2 у человека может осуществлять расщепление мРНК (Liu et al., 2004; Meister et al., 2004). Однако 3 других белка, принадлежащих к семейству Argonaute у человека, оказались не способны направлять нуклеазную реакцию, несмотря на то, что они содержат те же аминокислоты в предполагаемом активном центре домена PIWI, что и AG02 (Liu et al., 2004; Meister et al., 2004). Предполагается, что другие члены семейства Argonaute человека могут вьшолнять другие функции, в частности, подавление трансляции. Различные функции белков Argonaute показаны у D. melanogaster. белок Agol участвует в трансляционной репрессии, направляемой микроРНК, тогда как белок Ago2 осуществляет разрезание мРНК-мишеней (Okamura et al., 2004). Для двух других белков дрозофилы, также принадлежащих к семейству Argonaute (PIWI и AUB) показано участие в поддержании стабильности комплексов коротких РНК (Pal-Bhadra et al., 2002; 24 Aravin et al., 2004), однако их конкретные биохимические функции остаются невыясненными. Помимо AGO, в составе RISC комплексов у различных организмов был обнаружен ряд других белков. В комплексе RISC дрозофилы были найдены РНКсвязывающие белки VIG, dFXR, стафилококковая-микрококковая нуклеаза TudorSN, DEAD-box РНК-хеликаза RM62, а также рибосомальные белки (Caudy et al., 2002; Caudyetal., 2003). Обнаружение рибосомальных белков в составе RISC, а также тот факт, что, что RISC у дрозофилы и простейших ассоциирован с полисомами (Caudy et al., 2002; Hammond et al., 2001; Ishizuka et al., 2002; Kennerdell et al., 2002; Djikeng et al., 2001; Shi et al., 2004b), указывает на сходство (или даже на идентичность) комплексов, осуществляющих подавление трансляции и расщепление мРНК. Механизм подавления трансляции с помощью коротких РНК изучен намного хуже, чем разрезание мРНК. Трансляция блокируется более вероятно на стадии элонгации или терминации, чем на стадии инициации (Olsen, Ambros, 1999; Seggerson et al., 2002). Рис. 3. Схема белка Argonaute в комплексе с 81РЬЖ и мРНК-мишенью (Song et al., 2004). PAZ домен специфично удерживает 3 конец 81Р1Ж, PIWI домен привносит разрыв в комплементарный участок мРНК. 25 .6. Репрессия хроматина, направляемая короткими РНК 2.6.1. Общие представления о структуре хроматина Модификации гистонов в составе нуклеосом являются универсальным способом регуляции структуры хроматина и транскрипции генов эукариот. Разнообразие возможных модификаций гистонов и их сочетаний позволяет создать так называемый «гистоновый код» эпигенетические метки, специфически узнаваемые активирующими или репрессирующими факторами (Jenuwein, Allis, 2001). Например, одной из важных модификаций, характерной для неактивного хроматина, является метилирование лизина (К) гистона НЗ по положению 9 от Nконца молекулы МеШз(К9) (Litt et al., 2001; Peters et al., 2001; Nakayama et al., 2001). Напротив, в составе хроматина активно транскрибируемых генов гистон НЗ имеет, как правило, ацетилированный лизин 9 АсНз(К9), а также метилированный К4 МеНз(К4). Эти, а также многие другие модификации гистонов вьшолняют сходные функции репрессии или активации генов у дрожжей, нематоды elegans, дрозофилы, млекопитающих и растений (Lachner, Jenuwein, 2002; Strahl, Allis, 2000; Zhang, Reinberg, 2001; Kouzandes, 2002; Lachner et al., 2003). Неактивный хроматин у растений, некоторых грибов и у позвоночных, наряду с MetH3(K9), может быть ассоциирован с наличием 5-метил-цитозина в составе ДНК, что способствует дополнительной более глубокой репрессии. Однако метилирование ДНК является менее консервативным в эволюции способом эпигенетической регуляции по сравнению с «гистоновым кодом» и отсутствует (или практически отсутствует) у дрожжей, нематоды и дрозофилы (Bird, 2002; Tariq, Paszkowski, 2004; Lyko, 2001). Геномы эукариот содержат протяженные области активно транскрибируемого эухроматина и «молчащего» компактизованного гетерохроматина, который

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Кленов, Михаил Сергеевич

6. выводы

Исследована роль аппарата РНК-интерференции в подавлении транскрипции и формировании репрессивной структуры хроматина ретротранспозонов и повторов семенник-специфичных генов Stellate у Drosophila melanogaster.

Установлено, что:

1. Мутация в гене piwî, кодирующем белок семейства Argonaute, приводит к увеличению количества транскриптов LTR-содержащих и LTR-несодержащих эндогенных ретротранспозонов. Мутации в генах РНК-интерференции piwi и spn-E вызывают возрастание экспрессии репортерной конструкции LTRcopia-lacZ. Дерепрессия эндогенных ретротранспозонов и конструкции LTRcopia-lacZ при мутациях piwi и spn-E происходит преимущественно в терминальных тканях дрозофилы.

2. Нарушение аппарата РНК-интерференции, вызванное мутацией в гене spn-Е, приводит к декомпактизации хроматина ретротранспозонов в яичниках, ассоциированной с увеличением количества ацетилированных по положению К9 гистонов НЗ и возрастанием количества компонента транскрипционного комплекса TFIID TAF250 (TAF1) в промоторах ретротранспозонов.

3. Удаление повторов Su(Ste), образующих короткие РНК, приводит к увеличению количества несплайсированных транскриптов паралогичных генов Stellate. Копии генов Stellate, расположенные в сайте 12Е, подвергаются более сильной дерепрессии при удалении Su(Ste) по сравнению с генами Stellate, находящимися в конститутивном гетерохроматине. Полученные данные указывают на существование механизма репрессии транскрипции Stellate с помощью коротких РНК.

4. Для осуществления репрессии генов Stellate локусом Su(Ste) необходимо наличие гомологии с Su(Ste) в транскрибируемой области генов Stellate. Регуляция экспрессии гена Stellate может осуществляться в отсутствии собственного промотора - если транскрипция направляется гетерологичным промотором.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кленов, Михаил Сергеевич, 2005 год

1. Гвоздев В.А. (2003) Мобильные гены и РНК-интерференция. Генетика, 39, 151-156.

2. Abad, J. P., De Pablos, В., Osoegawa, К., De Jong, P. J., Martin-Gallardo, A., and Villasante, A. (2004). TAHRE, a novel telomeric retrotransposon from Drosophila melanogaster, reveals the origin of Drosophila telomeres. Mol Biol Evol 21,1620-1624.

3. Akhtar, A. (2003). Dosage compensation: an intertwined world of RNA and chromatin remodelling. Curr Opin Genet Dev 13,161-169.

4. Albright, S. R., and Tjian, R. (2000). TAFs revisited: more data reveal new twists and confirm old ideas. Gene 242,1-13.

5. Alder, M. N., Dames, S., Gaudet, J., and Mango, S. E. (2003). Gene silencing in Caenorhabditis elegans by transitive RNA interference. Rna 9,25-32.

6. Ambros, V., Lee, R. C., Lavanway, A., Williams, P. Т., and Jewell, D. (2003). MicroRNAs and other tiny endogenous RNAs in C. elegans. Curr Biol 13, 807-818.

7. Andersen, A. A., and Panning, B. (2003). Epigenetic gene regulation by noncoding RNAs. Curr Opin Cell Biol 15,281-289.

8. Angell, S. M., and Baulcombe, D. C. (1997). Consistent gene silencing in transgenic plants expressing a replicating potato virus X RNA. Embo J16,3675-3684.

9. Aravin, A. A., Klenov, M. S., Vagin, V. V., Bantignies, F., Cavalli, G., and Gvozdev, V. A. (2004). Dissection of a natural RNA silencing process in the Drosophila melanogaster germ line. Mol Cell Biol 24,6742-6750.

10. Aravin, A. A., Lagos-Quintana, M., Yalcin, A., Zavolan, M., Marks, D., Snyder, В., Gaasterland, Т., Meyer, J., and Tuschl, T. (2003). The Small RNA Profile during Drosophila melanogaster Development. Dev Cell 5,337-350.

11. Aravin, A. A., Naumova, N. M., Tulin, A. V., Vagin, V. V., Rozovsky, Y. M., and Gvozdev, V. A. (2001). Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline. Curr Biol 11, 10171027.

12. Aufsatz, W., Mette, M. F., Matzke, A. J., and Matzke, M. (2004). The role of MET1 in RNA-directed de novo and maintenance methylation of CG dinucleotides. Plant Mol Biol 54,793-804.

13. Aufsatz, W., Mette, M. F., van der Winden, J., Matzke, M., and Matzke, A. J. (2002). HDA6, a putative histone deacetylase needed to enhance DNA methylation induced by double-stranded RNA. Embo J 21,6832-6841.

14. Balakireva, M. D., Shevelyov, Y. Y., Nurminsky, D., Livak, K. J., and Gvozdev, V. A. (1992). Structural organization and diversification of Y-linked sequences comprising Su(Ste) genes in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res 20,3731-3736.

15. Bannister, A. J., Zegerman, P., Partridge, J. F., Miska, E. A., Thomas, J. O., Allshire, R. C., and Kouzarides, T. (2001). Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature 410,120-124.

16. Bao, N., Lye, K. W., and Barton, M. K. (2004). MicroRNA binding sites in Arabidopsis class III HD-ZIP mRNAs are required for methylation of the template chromosome. Dev Cell 7,653-662.

17. Bargmann, C. I. (2001). High-throughput reverse genetics: RNAi screens in Caenorhabditis elegans. Genome Biol 2, REVIEWS 1005.

18. Barstead, R. (2001). Genome-wide RNAi. Curr Opin Chem Biol 5,63-66.

19. Bartee, L., Malagnac, F., and Bender, J. (2001). Arabidopsis cmt3 chromomethylase mutations block non-CG methylation and silencing of an endogenous gene. Genes Dev 15, 1753-1758.

20. Bartel, D. P. (2004). MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116,281-297.

21. Basyuk, E., Suavet, F., Doglio, A., Bordonne, R., and Bertrand, E. (2003). Human let-7 stem-loop precursors harbor features of RNase III cleavage products. Nucleic Acids Res 31,6593-6597.

22. Baulcombe, D. (2004). RNA silencing in plants. Nature 431,356-363.

23. Bernard, P., Maure, J. F., Partridge, J. F., Genier, S., Javerzat, J. P., and Allshire, R. C. (2001). Requirement of heterochromatin for cohesion at centromeres. Science 294, 25392542.

24. Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., and Hannon, G. J. (2001). Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 409,363-366.

25. Bird, A. (2002). DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev 16,6-21.

26. Bohnsack, M. T., Czaplinski, K., and Gorlich, D. (2004). Exportin 5 is a RanGTP-dependent dsRNA-binding protein that mediates nuclear export of pre-miRNAs. Rna 10, 185-191.

27. Braunstein, M., Sobel, R. E., Allis, C. D., Turner, B. M., and Broach, J. R. (1996). Efficient transcriptional silencing in Saccharomyces cerevisiae requires a heterochromatin histone acetylation pattern. Mol Cell Biol 16,4349-4356.

28. Breitwieser, W., Markussen, F. H., Horstmann, H., and Ephrussi, A. (1996). Oskar protein interaction with Vasa represents an essential step in polar granule assembly. Genes Dev 10, 2179-2188.

29. Bucheton, A., Busseau, I., Teninges, D. (2002) in Mobile DNAII, eds. Craig, N. L., Craigie, R., Gellert, M., Lambowitz, A. M. (ASM Press, Washington, DC), pp. 796-813.

30. Cao, X., Aufsatz, W., Zilberman, D., Mette, M. F., Huang, M. S., Matzke, M., and Jacobsen, S. E. (2003). Role of the DRM and CMT3 methyltransferases in RNA-directed DNA methylation. Curr Biol 13, 2212-2217.

31. Cao, X., and Jacobsen, S. E. (2002). Locus-specific control of asymmetric and CpNpG methylation by the DRM and CMT3 methyltransferase genes. Proc Natl Acad Sci U S A 99 Suppl 4, 16491-16498.

32. Cao, X., and Jacobsen, S. E. (2002). Role of the arabidopsis DRM methyltransferases in de novo DNA methylation and gene silencing. Curr Biol 12, 1138-1144.

33. Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., and Hannon, G. J. (2002). The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev 16,2733-2742.

34. Carrera, P., Johnstone, O., Nakamura, A., Casanova, J., Jackie, H., and Lasko, P. (2000). VASA mediates translation through interaction with a Drosophila yIF2 homolog. Mol Cell 5,181-187.

35. Catalanotto, C., Azzalin, G., Macino, G., and Cogoni, C. (2000). Gene silencing in worms and fungi. Nature 404,245.

36. Catalanotto, C., Azzalin, G., Macino, G., and Cogoni, C. (2002). Involvement of small RNAs and role of the qde genes in the gene silencing pathway in Neurospora. Genes Dev 16,790-795.

37. Caudy, A. A., Ketting, R. F., Hammond, S. M., Denli, A. M., Bathoorn, A. M., Tops, B. B., Silva, J. M., Myers, M. M., Hannon, G. J., and Plasterk, R. H. (2003). A micrococcal nuclease homologue in RNAi effector complexes. Nature 425,411-414.

38. Caudy, A. A., Myers, M., Hannon, G. J., and Hammond, S. M. (2002). Fragile X-related protein and VIG associate with the RNA interference machinery. Genes Dev 16, 24912496.

39. Cerutti, L., Mian, N., and Bateman, A. (2000). Domains in gene silencing and cell differentiation proteins: the novel PAZ domain and redefinition of the Piwi domain. Trends Biochem Sci 25,481-482.

40. Chan, S. W., Zilberman, D., Xie, Z., Johansen, L. K., Carrington, J. C., and Jacobsen, S. E. (2004). RNA silencing genes control de novo DNA methylation. Science 303,1336.

41. Chen, J., Sun, M., Kent, W. J., Huang, X., Xie, H., Wang, W., Zhou, G., Shi, R. Z., and Rowley, J. D. (2004). Over 20% of human transcripts might form sense-antisense pairs. Nucleic Acids Res 32,4812-4820.

42. Chendrimada, T. P., and Davis, A. J. (2005). Molecular cloning of chicken hepatic histidase and the regulation of histidase mRNA expression by dietary protein. J Nutr Biochem 16,114-120.

43. Chicas, A., Cogoni, C., and Macino, G. (2004). RNAi-dependent and RNAi-independent mechanisms contribute to the silencing of RIPed sequences in Neurospora crassa. Nucleic Acids Res 32,4237-4243.

44. Clemens, M. J. (1997). PKR—a protein kinase regulated by double-stranded RNA. Int J Biochem Cell Biol 29,945-949.

45. Cogoni, C., and Macino, G. (1999). Gene silencing in Neurospora crassa requires a protein homologous to RNA-dependent RNA polymerase. Nature 399,166-169.

46. Cogoni, C., and Macino, G. (1999). Homology-dependent gene silencing in plants and fungi: a number of variations on the same theme. Curr Opin Microbiol 2,657-662.

47. Cogoni, C., and Macino, G. (1999). Posttranscriptional gene silencing in Neurospora by a RecQ DNA helicase. Science 286,2342-2344.

48. Cook, H. A., Koppetsch, B. S., Wu, J., and Theurkauf, W. E. (2004). The Drosophila SDE3 homolog armitage is required for oskar mRNA silencing and embryonic axis specification. Cell 116, 817-829.

49. Cox, D. N., Chao, A., Baker, J., Chang, L., Qiao, D., and Lin, H. (1998). A novel class of evolutionarily conserved genes defined by piwi are essential for stem cell self-renewal. Genes Dev 12,3715-3727.

50. Cox, D. N., Chao, A., and Lin, H. (2000). piwi encodes a nucleoplasmic factor whose activity modulates the number and division rate of germline stem cells. Development 127, 503-514.

51. Dalmay, T., Hamilton, A., Rudd, S., Angell, S., and Baulcombe, D. C. (2000). An RNA-dependent RNA polymerase gene in Arabidopsis is required for posttranscriptional gene silencing mediated by a transgene but not by a virus. Cell 101,543-553.

52. Dalmay, T., Horsefield, R., Braunstein, T. H., and Baulcombe, D. C. (2001). SDE3 encodes an RNA helicase required for post-transcriptional gene silencing in Arabidopsis. Embo J 20,2069-2078.

53. Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., and Hannon, G. J. (2004). Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature 432,231-235.

54. Dernburg, A. F., Zalevsky, J., Colaiacovo, M. P., and Villeneuve, A. M. (2000). Transgene-mediated cosuppression in the C. elegans germ line. Genes Dev 14,1578-1583.

55. Djikeng, A., Shi, H., Tschudi, C., and Ullu, E. (2001). RNA interference in Trypanosoma brucei: cloning of small interfering RNAs provides evidence for retroposon-derived 24-26-nucleotide RNAs. Rna 7, 1522-1530.

56. Dorer, D., and Henikoff, S. (1994). Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila. Cell 77,993-1002.

57. Elbashir, S. M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K., and Tuschl, T. (2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411,494-498.

58. Elbashir, S. M., Lendeckel, W., and Tuschl, T. (2001). RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev 15,188-200.

59. Elbashir, S. M., Martinez, J., Patkaniowska, A., Lendeckel, W., and Tuschl, T. (2001). Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. Embo J 20,6877-6888.

60. English, J. J., Mueller, E., and Baulcombe, D. C. (1996). Suppression of Virus Accumulation in Transgenic Plants Exhibiting Silencing of Nuclear Genes. Plant Cell 8, 179-188.

61. Feinberg, E. H., and Hunter, C. P. (2003). Transport of dsRNA into cells by the transmembrane protein SID-1. Science 301,1545-1547.

62. Feinberg, E. H., and Hunter, C. P. (2003). Transport of dsRNA into cells by the transmembrane protein SID-1. Science 301, 1545-1547.

63. Fierro-Monti, I., and Mathews, M. B. (2000). Proteins binding to duplexed RNA: one motif, multiple functions. Trends Biochem Sci 25,241-246.

64. Finnegan, E. J., and Kovac, K. A. (2000). Plant DNA methyltransferases. Plant Mol Biol 43,189-201.

65. Finnegan, E. J., Margis, R., and Waterhouse, P. M. (2003). Posttranscriptional gene silencing is not compromised in the Arabidopsis CARPEL FACTORY (DICER-LIKE 1) mutant, a homolog of Dicer-1 from Drosophila. Curr Biol 13, 236-240.

66. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., and Mello, C. C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans see comments. Nature 391, 806-811.

67. Freitag, M., Hickey, P. C., Khlafallah, T. K., Read, N. D., and Selker, E. U. (2004). HP1 is essential for DNA methylation in neurospora. Mol Cell 13,427-434.

68. Freitag, M., Lee, D. W., Kothe, G. O., Pratt, R. J., Aramayo, R., and Selker, E. U. (2004). DNA methylation is independent of RNA interference in Neurospora. Science 304,1939.

69. Fukagawa, T., Nogami, M., Yoshikawa, M., Ikeno, M., Okazaki, T., Takami, Y., Nakayama, T., and Oshimura, M. (2004). Dicer is essential for formation of the heterochromatin structure in vertebrate cells. Nat Cell Biol 6,784-791.

70. Gazzani, S., Lawrenson, T., Woodward, C., Headon, D., and Sablowski, R. (2004). A link between mRNA turnover and RNA interference in Arabidopsis. Science 306,1046-1048.

71. Gendrel, A. V., Lippman, Z., Yordan, C., Colot, V., and Martienssen, R. A. (2002). Dependence of heterochromatic histone H3 methylation patterns on the Arabidopsis gene DDM1. Science 297,1871-1873.

72. Gillespie, D. E., and Berg, C. A. (1995). Homeless is required for RNA localization in Drosophila oogenesis and encodes a new member of the DE-H family of RNA-dependent ATPases. Genes Dev 9,2495-2508.

73. Golubovsky, M. D., Konev, A. Y., Walter, M. F., Biessmann, H., and Mason, J. M. (2001). Terminal retrotransposons activate a subtelomeric white transgene at the 2L telomere in Drosophila. Genetics 158,1111-1123.

74. Gonzalez-Reyes, A., Elliott, H., and St Johnston, D. (1997). Oocyte determination and the origin of polarity in Drosophila: the role of the spindle genes. Development 124, 49274937.

75. Gowher, H., Leismann, O., and Jeltsch, A. (2000). DNA of Drosophila melanogaster contains 5-methylcytosine. Embo J19,6918-6923.

76. Gregory, R. I., Yan, K. P., Amuthan, G., Chendrimada, T., Doratotaj, B., Cooch, N., and Shiekhattar, R. (2004). The Microprocessor complex mediates the genesis of microRNAs. Nature 432,235-240.

77. Grewal, S. I. (2000). Transcriptional silencing in fission yeast. J Cell Physiol 184, 311-318.

78. Griffiths-Jones, S. (2004). The microRNA Registry. Nucleic Acids Res 32, D109-111.

79. Grishok, A., Sinskey, J. L., and Sharp, P. A. (2005). Transcriptional silencing of a transgene by RNAi in the soma of C. elegans. Genes Dev 19,683-696.

80. Grishok, A., Tabara, H., and Mello, C. C. (2000). Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans see comments. Science 287,2494-2497.

81. Hall, I. M., Noma, K., and Grewal, S. I. (2003). RNA interference machinery regulates chromosome dynamics during mitosis and meiosis in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A100,193-198.

82. Hall, I. M., Shankaranarayana, G. D., Noma, K., Ayoub, N., Cohen, A., and Grewal, S. I. (2002). Establishment and maintenance of a heterochromatin domain. Science 297, 22322237.

83. Hamilton, A., Voinnet, O., Chappell, L., and Baulcombe, D. (2002). Two classes of short interfering RNA in RNA silencing. Embo J 21,4671-4679.

84. Hamilton, A. J., and Baulcombe, D. C. (1999). A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science 286,950-952.

85. Hammond, S. M., Bernstein, E., Beach, D., and Hannon, G. J. (2000). An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature 404, 293296.

86. Hammond, S. M., Boettcher, S., Caudy, A. A., Kobayashi, R., and Hannon, G. J. (2001). Argonaute2, a link between genetic and biochemical analyses of RNAi. Science 293,11461150.

87. Han, J., Lee, Y., Yeom, K. H., Kim, Y. K., Jin, H., and Kim, V. N. (2004). The Drosha-DGCR8 complex in primary microRNA processing. Genes Dev 18,3016-3027.

88. Hannon, G. J. (2002). RNA interference. Nature 418,244-251.

89. Hannon, G. J., and Rossi, J. J. (2004). Unlocking the potential of the human genome with RNA interference. Nature 431,371-378.

90. Hansen, K. R., Burns, G., Mata, J., Volpe, T. A., Martienssen, R. A., Bahler, J., and Thon, G. (2005). Global effects on gene expression in fission yeast by silencing and RNA interference machineries. Mol Cell Biol 25,590-601.

91. Hay, B., Ackerman, L., Barbel, S., Jan, L. Y., and Jan, Y. N. (1988). Identification of a component of Drosophila polar granules. Development 103,625-640.

92. Hazelrigg, T., Levis, R., and Rubin, G. M. (1984). Transformation of white locus DNA in drosophila: dosage compensation, zeste interaction, and position effects. Cell 36,469-481.

93. Henikoff, S. (1990). Position-effect variegation after 60 years. Trends Genet 6,422-426.

94. Herr, A. J., Jensen, M. B., Dalmay, T., and Baulcombe, D. C. (2005). RNA polymerase IV directs silencing of endogenous DNA. Science 308,118-120.

95. Hirochika, H., Okamoto, H., and Kakutani, T. (2000). Silencing of retrotransposons in arabidopsis and reactivation by the ddml mutation. Plant Cell 12,357-369.

96. Hunter, C., Sun, H., and Poethig, R. S. (2003). The Arabidopsis heterochronic gene ZIPPY is an ARGONAUTE family member. Curr Biol 13,1734-1739.

97. Hutvagner, G., McLachlan, J., Pasquinelli, A. E., Balint, E., Tuschl, T., and Zamore, P. D. (2001). A cellular function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation of the let-7 small temporal RNA. Science 293, 834-838.

98. Jackson, J. P., Lindroth, A. M., Cao, X., and Jacobsen, S. E. (2002). Control of CpNpG DNA methylation by the KRYPTONITE histone H3 methyltransferase. Nature 416, 556560.

99. Jeddeloh, J. A., Stokes, T. L., and Richards, E. J. (1999). Maintenance of genomic methylation requires a SWI2/SNF2-like protein. Nat Genet 22,94-97.

100. Jenuwein, T., and Allis, C. D. (2001). Translating the histone code. Science 293, 10741080.

101. Johnson, L., Cao, X., and Jacobsen, S. (2002). Interplay between two epigenetic marks. DNA methylation and histone H3 lysine 9 methylation. Curr Biol 12, 1360-1367.

102. Jones, L., Hamilton, A. J., Voinnet, O., Thomas, C. L., Maule, A. J., and Baulcombe, D. C. (1999). RNA-DNA interactions and DNA methylation in post-transcriptional gene silencing. Plant Cell 11,2291-2301.

103. Jones, L., RatclifF, F., and Baulcombe, D. C. (2001). RNA-directed transcriptional gene silencing in plants can be inherited independently of the RNA trigger and requires Metl for maintenance. Curr Biol 11,747-757.

104. Kalmykova, A. I., Dobritsa, A. A., and Gvozdev, V. A. (1998). Su(Ste) diverged tandem repeats in a Y chromosome of Drosophila melanogaster are transcribed and variously processed. Genetics 148,243-249.

105. Kalmykova, A. I., Klenov, M. S., and Gvozdev, V. A. (2005). Argonaute protein PIWI controls mobilization of retrotransposons in the Drosophila male germline. Nucleic Acids Res 33,2052-2059.

106. Kankel, M. W., Ramsey, D. E., Stokes, T. L., Flowers, S. K., Haag, J. R., Jeddeloh, J. A., Riddle, N. C., Verbsky, M. L., and Richards, E. J. (2003). Arabidopsis MET1 cytosine methyltransferase mutants. Genetics 163,1109-1122.

107. Kanno, T., Mette, M. F., Kreil, D. P., Aufsatz, W., Matzke, M., and Matzke, A. J. (2004). Involvement of putative SNF2 chromatin remodeling protein DRD1 in RNA-directed DNA methylation. Curr Biol 14,801-805.

108. Kawasaki, H., and Taira, K. (2004). Induction of DNA methylation and gene silencing by short interfering RNAs in human cells. Nature 431,211-217.

109. Kazazian, H. H., Jr. (2004). Mobile elements: drivers of genome evolution. Science 303, 1626-1632.

110. Kelley, R. L., and Kuroda, M. I. (2000). Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting. Cell 103,9-12.

111. Kelly, W. G., and Fire, A. (1998). Chromatin silencing and the maintenance of a functional germline in Caenorhabditis elegans. Development 125,2451-2456.

112. Kennerdell, J. R., and Carthew, R. W. (1998). Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell 95,1017-1026.

113. Kennerdell, J. R., Yamaguchi, S., and Carthew, R. W. (2002). RNAi is activated during Drosophila oocyte maturation in a manner dependent on aubergine and spindle-E. Genes Dev 16, 1884-1889.

114. Ketting, R. F., Fischer, S. E., Bernstein, E., Sijen, T., Hannon, G. J., and Plasterk, R. H. (2001). Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C. elegans. Genes Dev 15,2654-2659.

115. Ketting, R. F., Haverkamp, T. H., van Luenen, H. G., and Plasterk, R. H. (1999). Mut-7 of C. elegans, required for transposon silencing and RNA interference, is a homolog of Werner syndrome helicase and RNaseD. Cell 99, 133-141.

116. Ketting, R. F., and Plasterk, R. H. (2000). A genetic link between co-suppression and RNA interference in C. elegans. Nature 404,296-298.

117. Khvorova, A., Reynolds, A., and Jayasena, S. D. (2003). Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. Cell 115,209-216.

118. Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., and Kakutani, T. (2004). One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation. Science 303,521-523.

119. Knight, S. W., and Bass, B. L. (2001). A role for the RNase III enzyme DCR-1 in RNA interference and germ line development in Caenorhabditis elegans. Science 293, 22692271.

120. Kogan, G. L., Epstein, V. N., Aravin, A. A., and Gvozdev, V. A. (2000). Molecular evolution of two paralogous tandemly repeated heterochromatic gene clusters linked to the X and Y chromosomes of Drosophila melanogaster. Mol Biol Evol 17,691-1 Oil.

121. Kouzarides, T. (2002). Histone methylation in transcriptional control. Curr Opin Genet Dev 12,198-209.

122. Kouzminova, E., and Selker, E. U. (2001). dim-2 encodes a DNA methyltransferase responsible for all known cytosine methylation in Neurospora. Embo J 20,4309-4323.

123. Ma, J. B., Ye, K., and Patel, D. J. (2004). Structural basis for overhang-specific small interfering RNA recognition by the PAZ domain. Nature 429, 318-322.

124. Maeda, I., Kohara, Y., Yamamoto, M., and Sugimoto, A. (2001). Large-scale analysis of gene function in Caenorhabditis elegans by high-throughput RNAi. Curr Biol 11,171-176.

125. Malagnac, F., Bartee, L., and Bender, J. (2002). An Arabidopsis SET domain protein required for maintenance but not establishment of DNA methylation. Embo J 21, 68426852.

126. Mallory, A. C., Mlotshwa, S., Bowman, L. H., and Vance, V. B. (2003). The capacity of transgenic tobacco to send a systemic RNA silencing signal depends on the nature of the inducing transgene locus. Plant J 35, 82-92.

127. Marathe, R., Anandalakshmi, R., Smith, T. H., Pruss, G. J., and Vance, V. B. (2000). RNA viruses as inducers, suppressors and targets of post-transcriptional gene silencing. Plant Mol Biol 43,295-306.

128. Martienssen, R. A., and Co lot, V. (2001). DNA methylation and epigenetic inheritance in plants and filamentous fungi. Science 293,1070-1074.

129. Martinez, J., and Tuschl, T. (2004). RISC is a 5' phosphomonoester-producing RNA endonuclease. Genes Dev 18,975-980.

130. Mason, J. M., Haoudi, A., Konev, A. Y., Kurenova, E., Walter, M. F., and Biessmann, H. (2000). Control of telomere elongation and telomeric silencing in Drosophila melanogaster. Genetica 109,61-70.

131. Meister, G., Landthaler, M., Patkaniowska, A., Dorsett, Y., Teng, G., and Tuschl, T. (2004). Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Mol Cell 75, 185-197.

132. Meister, G., and Tuschl, T. (2004). Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature 431,343-349.

133. Mello, C. C., and Conte, D., Jr. (2004). Revealing the world of RNA interference. Nature 431,338-342.

134. Melquist, S., and Bender, J. (2003). Transcription from an upstream promoter controls methylation signaling from an inverted repeat of endogenous genes in Arabidopsis. Genes Dev 17,2036-2047.

135. Melquist, S., Luff, B., and Bender, J. (1999). Arabidopsis PAI gene arrangements, cytosine methylation and expression. Genetics 153,401-413.

136. Mette, M. F., Aufsatz, W., van der Winden, J., Matzke, M. A., and Matzke, A. J. (2000). Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-stranded RNA. Embo J19,5194-5201.

137. Montgomery, M. K., Xu, S., and Fire, A. (1998). RNA as a target of double-stranded RNA-mediated genetic interference in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 15502-15507.

138. Morris, K. V., Chan, S. W., Jacobsen, S. E., and Looney, D. J. (2004). Small interfering RNA-induced transcriptional gene silencing in human cells. Science 305,1289-1292.

139. Motamedi, M. R., Verdel, A., Colmenares, S. U., Gerber, S. A., Gygi, S. P., and Moazed, D. (2004). Two RNAi complexes, RITS and RDRC, physically interact and localize to noncoding centromeric RNAs. Cell 119,789-802.

140. Nakayama, J., Rice, J. C., Strahl, B. D., Allis, C. D., and Grewal, S. I. (2001). Role of histone H3 lysine 9 methylation in epigenetic control of heterochromatin assembly. Science 292,110-113.

141. Napoli, C., Lemieux, C., and Jorgensen, R. (1990). Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell 2,279-289.

142. Ngo, H., Tschudi, C., Gull, K., and Ullu, E. (1998). Double-stranded RNA induces mRNA degradation in Trypanosoma brucei. Proc Natl Acad Sci U S A 95,14687-14692.

143. Nicolas, F. E., Torres-Martinez, S., and Ruiz-Vazquez, R. M. (2003). Two classes of small antisense RNAs in fungal RNA silencing triggered by non-integrative transgenes. Embo J 22,3983-3991.

144. Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., and Siomi, M. C. (2004). Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev 18, 16551666.

145. Olsen, P. H., and Ambros, V. (1999). The lin-4 regulatory RNA controls developmental timing in Caenorhabditis elegans by blocking LIN-14 protein synthesis after the initiation of translation. Dev Biol 216,671-680.

146. Onodera, Y., Haag, J. R., Ream, T., Nunes, P. C., Pontes, O., and Pikaard, C. S. (2005). Plant nuclear RNA polymerase IV mediates siRNA and DNA methylation-dependent heterochromatin formation. Cell 120,613-622.

147. Orlando, V., and Paro, R. (1993). Mapping Polycomb-repressed domains in the bithorax complex using in vivo formaldehyde cross-linked chromatin. Cell 75,1187-1198.

148. Pal-Bhadra, M., Bhadra, U., and Birchler, J. A. (1997). Cosuppression in Drosophila: gene silencing of Alcohol dehydrogenase by white-Adh transgenes is Polycomb dependent. Cell 90,479-490.

149. Pal-Bhadra, M., Bhadra, U., and Birchler, J. A. (2002). RNAi related mechanisms affect both transcriptional and posttranscriptional transgene silencing in Drosophila. Mol Cell 9, 315-327.

150. Pal-Bhadra, M., Leibovitch, B. A., Gandhi, S. G., Rao, M., Bhadra, U., Birchler, J. A., and Elgin, S. C. (2004). Heterochromatic silencing and HP1 localization in Drosophila are dependent on the RNAi machinery. Science 303,669-672.

151. Palumbo, G., Bonaccorsi, S., Robbins, L. G., and Pimpinelli, S. (1994). Genetic analysis of Stellate elements of Drosophila melanogaster published erratum appears in Genetics 1996 Jan;142(l):327. Genetics 138,1181-1197.

152. Pardue, M. L., and DeBaryshe, P. G. (1999). Drosophila telomeres: two transposable elements with important roles in chromosomes. Genetica 107, 189-196.

153. Pardue, M. L., and Debaryshe, P. G. (2000). Drosophila telomere transposons: genetically active elements in heterochromatin. Genetica 109,45-52.

154. Pardue, M. L., and DeBaryshe, P. G. (2003). Retrotransposons provide an evolutionarily robust non-telomerase mechanism to maintain telomeres. Annu Rev Genet 37,485-511.

155. Park, W., Li, J., Song, R., Messing, J., and Chen, X. (2002). CARPEL FACTORY, a Dicer homolog, and HEN1, a novel protein, act in microRNA metabolism in Arabidopsis thaliana. Curr Biol 12, 1484-1495.

156. Pham, J. W., Pellino, J. L., Lee, Y. S., Carthew, R. W., and Sontheimer, E. J. (2004). A Dicer-2-dependent 80s complex cleaves targeted mRNAs during RNAi in Drosophila. Cell 117,83-94.

157. Piano, F., Schetter, A. J., Mangone, M., Stein, L., and Kemphues, K. J. (2000). RNAi analysis of genes expressed in the ovary of Caenorhabditis elegans. Curr Biol 10, 16191622.

158. Pickford, A. S., Catalanotto, C., Cogoni, C., and Macino, G. (2002). Quelling in Neurospora crassa. Adv Genet 46,277-303.

159. Pollard T.D., Ernshaw W.C. (2002) in Cell Biology, Sanders Phylad-London-N.Y., pp. 210, 805.

160. Provost, P., Dishart, D., Doucet, J., Frendewey, D., Samuelsson, B., and Radmark, O. (2002). Ribonuclease activity and RNA binding of recombinant human Dicer. Embo J 21, 5864-5874.

161. Reinhart, B. J., and Bartel, D. P. (2002). Small RNAs correspond to centromere heterochromatic repeats. Science 297, 1831.

162. Reinhart, B. J., Slack, F. J., Basson, M., Pasquinelli, A. E., Bettinger, J. C., Rougvie, A. E., Horvitz, H. R., and Ruvkun, G. (2000). The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature 403,901-906.

163. Robert, V. J., Sijen, T., van Wolfswinkel, J., and Plasterk, R. H. (2005). Chromatin and RNAi factors protect the C. elegans germline against repetitive sequences. Genes Dev 19, 782-787.

164. Robertson, H., Preston, C., Phillis, R., Johnson-Schlitz, D., Benz, W., and Engels, W. (1988). A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster. Genetics 118,461-470.

165. Roignant, J. Y., Carre, C., Mugat, B., Szymczak, D., Lepesant, J. A., and Antoniewski, C. (2003). Absence of transitive and systemic pathways allows cell-specific and isoform-specific RNAi in Drosophila. Rna 9,299-308.

166. Ruiz, M. T., Voinnet, O., and Baulcombe, D. C. (1998). Initiation and maintenance of virus-induced gene silencing. Plant Cell 10,937-946.

167. Saito, K., Ishizuka, A., Siomi, H., and Siomi, M. C. (2005). Processing of Pre-microRNAs by the Dicer-1-Loquacious Complex in Drosophila Cells. PLoS Biol 3, e235.

168. Sanchez Alvarado, A., and Newmark, P. A. (1999). Double-stranded RNA specifically disrupts gene expression during planarian regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 5049-5054.

169. Sarot, E., Payen-Groschene, G., Bucheton, A., and Pelisson, A. (2004). Evidence for a piwi-dependent RNA silencing of the gypsy endogenous retrovirus by the Drosophila melanogaster flamenco gene. Genetics 166, 1313-1321.

170. Saxena, S., Jonsson, Z. O., and Dutta, A. (2003). Small RNAs with imperfect match to endogenous mRNA repress translation. Implications for off-target activity of small inhibitory RNA in mammalian cells. J Biol Chem 278,44312-44319.

171. Saze, H., Scheid, O. M., and Paszkowski, J. (2003). Maintenance of CpG methylation is essential for epigenetic inheritance during plant gametogenesis. Nat Genet 34,65-69.

172. Schotta, G., Ebert, A., Dorn, R., and Reuter, G. (2003). Position-effect variegation and the genetic dissection of chromatin regulation in Drosophila. Semin Cell Dev Biol 14, 67-75.

173. Schotta, G., Ebert, A., Krauss, V., Fischer, A., Hoffmann, J., Rea, S., Jenuwein, T., Dorn, R., and Reuter, G. (2002). Central role of Drosophila SU(VAR)3-9 in histone H3-K9 methylation and heterochromatic gene silencing. Embo J 21,1121-1131.

174. Schotta, G., Lachner, M., Peters, A. H., and Jenuwein, T. (2004). The indexing potential of histone lysine methylation. Novartis Found Symp 259,22-37; discussion 37-47, 163-169.

175. Schramke, V., and Allshire, R. (2003). Hairpin RNAs and retrotransposon LTRs effect RNAi and chromatin-based gene silencing. Science 301,1069-1074.

176. Schupbach, T., and Wieschaus, E. (1991). Female sterile mutations on the second chromosome of Drosophila melanogaster. II. Mutations blocking oogenesis or altering egg morphology. Genetics 129,1119-1136.

177. Schwarz, D. S., Hutvagner, G., Du, T., Xu, Z., Aronin, N., and Zamore, P. D. (2003). Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell 115,199-208.

178. Schwarz, D. S., Hutvagner, G., Haley, B., and Zamore, P. D. (2002). Evidence that siRNAs function as guides, not primers, in the Drosophila and human RNAi pathways. Mol Cell 10,537-548.

179. Seggerson, K., Tang, L., and Moss, E. G. (2002). Two genetic circuits repress the Caenorhabditis elegans heterochronic gene lin-28 after translation initiation. Dev Biol 243, 215-225.

180. Shevelyov, Y. Y. (1992). Copies of a Stellate gene variant are located in the X heterochromatin of Drosophila melanogaster and are probably expressed. Genetics 132, 1033-1037.

181. Shi, H., Djikeng, A., Tschudi, C., and Ullu, E. (2004). Argonaute protein in the early divergent eukaryote Trypanosoma brucei: control of small interfering RNA accumulation and retroposon transcript abundance. Mol Cell Biol 24,420-427.

182. Sigova, A., Rhind, N., and Zamore, P. D. (2004). A single Argonaute protein mediates both transcriptional and posttranscriptional silencing in Schizosaccharomyces pombe. Genes Dev 18,2359-2367.

183. Sijen, T., Fleenor, J., Simmer, F., Thijssen, K. L., Parrish, S., Timmons, L., Plasterk, R. H., and Fire, A. (2001). On the role of RNA amplification in dsRNA-triggered gene silencing. Cell 107,465-476.

184. Sijen, T., and Plasterk, R. H. (2003). Transposon silencing in the Caenorhabditis elegans germ line by natural RNAi. Nature 426,310-314.

185. Sijen, T., Vijn, I., Rebocho, A., van Blokland, R., Roelofs, D., Mol, J. N., and Kooter, J. M. (2001). Transcriptional and posttranscriptional gene silencing are mechanistically related. Curr Biol 11,436-440.

186. Slack, F. J., Basson, M., Liu, Z., Ambros, V., Horvitz, H. R., and Ruvkun, G. (2000). The lin-41 RBCC gene acts in the C. elegans heterochronic pathway between the let-7 regulatory RNA and the LIN-29 transcription factor. Mol Cell 5,659-669.

187. Smardon, A., Spoerke, J. M., Stacey, S. C., Klein, M. E., Mackin, N., and Maine, E. M. (2000). EGO-1 is related to RNA-directed RNA polymerase and functions in germ-line development and RNA interference in C. elegans. Curr Biol 10,169-178.

188. Song, J. J., Smith, S. K., Hannon, G. J., and Joshua-Tor, L. (2004). Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science 305,1434-1437.

189. Soppe, W. J., Bentsink, L., and Koornneef, M. (1999). The early-flowering mutant efs is involved in the autonomous promotion pathway of Arabidopsis thaliana. Development 126,4763-4770.

190. Stapleton, W., Das, S., and McKee, B. D. (2001). A role of the Drosophila homeless gene in repression of Stellate in male meiosis. Chromosoma 110,228-240.

191. Stevenson, D. S., and Jarvis, P. (2003). Chromatin silencing: RNA in the driving seat. Curr Biol 13, R13-15.

192. Strahl, B. D., and Allis, C. D. (2000). The language of covalent histone modifications. Nature 403,41-45.

193. Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., and Grewal, S. I. (2005). RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production. Proc Natl Acad Sci U S A102, 152-157.

194. Svoboda, P., Stein, P., Anger, M., Bernstein, E., Hannon, G. J., and Schultz, R. M. (2004). RNAi and expression of retrotransposons MuERV-L and IAP in preimplantation mouse embryos. Dev Biol 269,276-285.

195. Swaminathan, J., Baxter, E. M., and Corces, V. G. (2005). The role of histone H2Av variant replacement and histone H4 acetylation in the establishment of Drosophila heterochromatin. Genes Dev 19, 65-76.

196. Tabara, H., Sarkissian, M., Kelly, W. G., Fleenor, J., Grishok, A., Timmons, L., Fire, A., and Mello, C. C. (1999). The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans In Process Citation. Cell 99,123-132.

197. Tabara, H., Yigit, E., Siomi, H., and Mello, C. C. (2002). The dsRNA binding protein RDE-4 interacts with RDE-1, DCR-1, and a DExH-box helicase to direct RNAi in C. elegans. Cell 109, 861-871.

198. Tamaru, H., and Selker, E. U. (2001). A histone H3 methyltransferase controls DNA methylation in Neurospora crassa. Nature 414,277-283.

199. Tamaru, H., and Selker, E. U. (2003). Synthesis of signals for de novo DNA methylation in Neurospora crassa. Mol Cell Biol 23,2379-2394.

200. Tang, G., Reinhart, B. J., Bartel, D. P., and Zamore, P. D. (2003). A biochemical framework for RNA silencing in plants. Genes Dev 17,49-63.

201. Tariq, M., and Paszkowski, J. (2004). DNA and histone methylation in plants. Trends Genet 20,244-251.

202. Tariq, M., Saze, H., Probst, A. V., Lichota, J., Habu, Y., and Paszkowski, J. (2003). Erasure of CpG methylation in Arabidopsis alters patterns of histone H3 methylation in heterochromatin. Proc Natl Acad Sci U S A100, 8823-8827.

203. Thummel, C., Boulet, A., and Lipshitz, H. (1988). Vectors for Drosophila P-element-mediated transformation and tissue culture transfection. Gene 74,445-456.

204. Tijsterman, M., Ketting, R. F., and Plasterk, R. H. (2002). The genetics of RNA silencing. Annu Rev Genet 36,489-519.

205. Timmons, L., and Fire, A. (1998). Specific interference by ingested dsRNA letter. Nature 395,854.

206. Tomancak, P., Guichet, A., Zavorszky, P., and Ephrussi, A. (1998). Oocyte polarity depends on regulation of gurken by Vasa. Development 125,1723-1732.

207. Tomari, Y., Du, T., Haley, B., Schwarz, D. S., Bennett, R., Cook, H. A., Koppetsch, B. S., Theurkauf, W. E., and Zamore, P. D. (2004). RISC assembly defects in the Drosophila RNAi mutant armitage. Cell 116, 831 -841.

208. Tomari, Y., Matranga, C., Haley, B., Martinez, N., and Zamore, P. D. (2004). A protein sensor for siRNA asymmetry. Science 306, 1377-1380.

209. Tulin, A. V., Kogan, G. L., Filipp, D., Balakireva, M. D., and Gvozdev, V. A. (1997). Heterochromatic Stellate gene cluster in Drosophila melanogaster: structure and molecular evolution. Genetics 146,253-262.

210. Turner, B. M., Birley, A. J., and Lavender, J. (1992). Histone H4 isoforms acetylated at specific lysine residues define individual chromosomes and chromatin domains in Drosophila polytene nuclei. Cell 69,375-384.

211. Tuschl, T., Zamore, P. D., Lehmann, R., Bartel, D. P., and Sharp, P. A. (1999). Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes Dev 13,3191-3197.

212. Vaucheret, H., Nnssaume, L., Palauqui, J. C., Quillere, I., and Elmayan, T. (1997). A Transcriptionally Active State Is Required for Post-Transcriptional Silencing (Cosuppression) of Nitrate Reductase Host Genes and Transgenes. Plant Cell 9, 14951504.

213. Vazquez, F., Gasciolli, V., Crete, P., and Vaucheret, H. (2004). The nuclear dsRNA binding protein HYL1 is required for microRNA accumulation and plant development, but not posttranscriptional transgene silencing. Curr Biol 14,346-351.

214. Verdel, A., Jia, S., Gerber, S., Sugiyama, T., Gygi, S., Grewal, S. I., and Moazed, D. (2004). RNAi-mediated targeting of heterochromatin by the RITS complex. Science 303, 672-676.

215. Vignali, M., Hassan, A. H., Neely, K. E., and Workman, J. L. (2000). ATP-dependent chromatin-remodeling complexes. Mol Cell Biol 20,1899-1910.

216. Voinnet, O., and Baulcombe, D. C. (1997). Systemic signalling in gene silencing. Nature 389,553.

217. Volpe, T., Schramke, V., Hamilton, G. L., White, S. A., Teng, G., Martienssen, R. A., and Allshire, R. C. (2003). RNA interference is required for normal centromere function in fission yeast. Chromosome Res 11,137-146.

218. Volpe, T. A., Kidner, C., Hall, I. M., Teng, G., Grewal, S. I., and Martienssen, R. A. (2002). Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi. Science 297, 1833-1837.

219. Wallrath, L. L., and Elgin, S. C. (1995). Position effect variegation in Drosophila is associated with an altered chromatin structure. Genes Dev 9,1263-1277.

220. Wassenegger, M., Heimes, S., Riedel, L., and Sanger, H. L. (1994). RNA-directed de novo methylation of genomic sequences in plants. Cell 76,567-576.

221. Wightman, B., Ha, I., and Ruvkun, G. (1993). Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell 75, 855-862.

222. Williams, R. W., and Rubin, G. M. (2002). ARGONAUTE1 is required for efficient RNA interference in Drosophila embryos. Proc Natl Acad Sci U S A 99,6889-6894.

223. Wilson, J. E., Connell, J. E., and Macdonald, P. M. (1996). aubergine enhances oskar translation in the Drosophila ovary. Development 122,1631-1639.

224. Winston, W. M., Molodowitch, C., and Hunter, C. P. (2002). Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science 295,2456-2459.

225. Winston, W. M., Molodowitch, C., and Hunter, C. P. (2002). Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science 295,2456-2459.

226. Wu-Scharf, D., Jeong, B., Zhang, C., and Cerutti, H. (2000). Transgene and transposon silencing in chlamydomonas reinhardtii by a DEAH-Box RNA helicase In Process Citation. Science 290,1159-1163.

227. Xie, Z., Johansen, L. K., Gustafson, A. M., Kasschau, K. D., Lellis, A. D., Zilberman, D., Jacobsen, S. E., and Carrington, J. C. (2004). Genetic and functional diversification of small RNA pathways in plants. PLoS Biol 2, El 04.

228. Yi, R., Qin, Y., Macara, I. G., and Cullen, B. R. (2003). Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs. Genes Dev 17,3011-3016.

229. Yu, B., Yang, Z., Li, J., Minakhina, S., Yang, M., Padgett, R. W., Steward, R., and Chen, X. (2005). Methylation as a crucial step in plant microRNA biogenesis. Science 307, 932935.

230. Zamore, P. D., Tuschl, T., Sharp, P. A., and Bartel, D. P. (2000). RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 101,25-33.

231. Zhang, H., Kolb, F. A., Brondani, V., Billy, E., and Filipowicz, W. (2002). Human Dicer preferentially cleaves dsRNAs at their termini without a requirement for ATP. Embo J 21, 5875-5885.

232. Zhang, Y., and Reinberg, D. (2001). Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev 15, 2343-2360.

233. Zhimulev, I. F., and Belyaeva, E. S. (2003). Intercalary heterochromatin and genetic silencing. Bioessays 25, 1040-1051.

234. Zilberman, D., Cao, X., and Jacobsen, S. E. (2003). ARGONAUTE4 control of locus-specific siRNA accumulation and DNA and histone methylation. Science 299,716-719.

235. Zilberman, D., Cao, X., Johansen, L. K., Xie, Z., Carrington, J. C., and Jacobsen, S. E. (2004). Role of Arabidopsis ARGONAUTE4 in RNA-directed DNA methylation triggered by inverted repeats. Curr Biol 14,1214-1220.1. Благодарности