Взаимодействие белков-Аргонавтов бактерий Rhodobacter sphaeroides и Pseudooceanicola lipolyticus с нуклеиновыми кислотами. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Лисицкая Лидия Александровна

• Лисицкая Лидия Александровна
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Лисицкая Лидия Александровна

Список используемых сокращений

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Обобщенная схема РНК-интерференции и структура белков-Аргонавтов эукариот

2.2. Краткая история открытия белков-Аргонавтов прокариот

2.3. Биоинформатический анализ и разнообразие доменной организации белков-Аргонавтов прокариот

2.4. Связывание гидовых нуклеиновых кислот и распознавание комплементарной мишени

2.5. Распознавание некомплементарных участков мишени белками

pAgo

2.6. Функциональная активность белков-Аргонавтов прокариот

2.6.1. Функции каталитически-активных белков-Аргонавтов

2.6.2. Механизмы действия каталитически неактивных белков pAgo

2.7. Характеристика нуклеаз, закодированных в одном опероне с белками-Аргонавтами прокариот

2.7.1. Общие свойства нуклеаз надсемейства PD-(D/E)XK

2.8. Заключение

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Бактериальные штаммы и плазмиды

3.2. Питательные среды и антибиотики

3.3. Трансформация бактерий

3.4. Методы, использованные при работе с ДНК

3.4.1. Электрофорез в агарозном геле

3.4.2. Электрофорез ДНК и РНК в полиакриламидном геле

3.4.3. Очистка олигонуклеотидов с помощью электрофореза в ПААГ

3.5. Анализ комплексов RsAgo с нуклеиновыми кислотами методом задержки в геле

3.5.1. Поэтапная сборка комплексов RsAgo с олигонуклеотидами

3.5.2. Получение комплексов RsAgo с дцДНК

3.6. Анализ влияния RsAgo на транскрипцию in vitro

3.6.1. Получение транскрипционных матриц

3.6.2. Протоколы проведения транскрипции

3.7. Выделение белков, используемых в ходе работы

3.7.1. Электрофорез в денатурирующем геле для разделения белков

3.7.2. Выделение RsAgo

3.7.3. Выделение нуклеазы, ассоциированной с RsAgo

3.7.4. Выделение белков группы PliAgo

3.8. Синтез PliAgo-GFP для визуализации в клетках E. coli

3.9. Проверка активности нуклеазы, ассоциированной с RsAgo

3.10. Определение нуклеазной активности белков группы PliAgo

3.11. Анализ связывания PliAgo и dPliAgo с мишенями методом задержки в геле

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Исследование взаимодействий белка-Аргонавта RsAgo с РНК-гидами и ДНК-мишенями

4.1.1. Поэтапная сборка комплексов RsAgo c ДНК-мишенями

4.1.2. Анализ взаимодействий белка RsAgo c двуцепочечной ДНК-мишенью

4.1.3. Определение стабильности четверного комплекса RsAgo c РНК-гидом и ДНК-мишенью

4.2. Разработка системы in vitro для изучения влияния белка-Аргонавта RsAgo на транскрипцию

4.2.1. Влияние RsAgo на прохождение РНК-полимеразы на матрице с T7A1-промотором

4.2.2. Анализ взаимодействия РНКП с RsAgo в области промотора

4.3. Изучение нуклеазы, ассоциированной с белком RsAgo

4.3.1. Влияние ассоциированной нуклеазы на экспрессию RsAgo

4.3.2. Оптимизация условий выделения нуклеазы, ассоциированной с RsAgo

4.4. Исследование нуклеазной активности и специфичности белка-Аргонавта PliAgo

4.5. Определение параметров нуклеазной активности PliAgo in vitro

4.6. Анализ связывания белка-Аргонавта PliAgo с различными мишенями

4.7. Структурно-функциональный анализ белка PliAgo

4.7.1. Роль MID-домена в связывании гидов PliAgo и влияние мутаций в MID-кармане на нуклеазную активность

4.7.2. Участие аминокислотных остатков, расположенных рядом с активным центром PliAgo, в распознавании мишеней

4.7.3. Роль С-концевого участка PliAgo в каталитической активности

4.8. Заключение

5. ВЫВОДЫ

6. БЛАГОДАРНОСТИ

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

153

Список используемых сокращений

АТФ - аденозинтрифосфат

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДМСО - диметилсульфоксид

ДТТ - дитиотреитол

дцДНК - двуцепочечная ДНК

дцРНК - двуцепочечная РНК

мРНК - матричная РНК (messenger RNA)

нт - нуклеотид

НТФ - нуклеозидтрифосфат

оцДНК - одноцепочечная ДНК

ПААГ - полиакриламидный гель

п.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНКП - РНК-полимераза

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Ago - белок-Аргонавт (Argonaute)

AaAgo - белок-Аргонавт из Aquifex aeolicus

AfAgo - белок-Аргонавт из Archaeoglobus fulgidus

CbAgo - белок-Аргонавт из Clostridium butyricum

CpAgo белок-Аргонавт из Clostridium perfringens

CRISPR - clustered regularly interspaced short palindromic repeats,

короткие регулярно расположенные палиндромные повторы,

eAgo - эукариотические белки-Аргонавты

IbAgo - белок-Аргонавт из Intestinibacter bartlettii

KjAgo - белок-Аргонавт из Kordia jejudonensis

KmAgo - белок-Аргонавт из Kurthia massiliensis

LB - среда Лурия-Бертани: 1% NaCl, 1% бактотриптона, 0,5% дрожжевого экстракта

LrAgo - белок-Аргонавт из Limnothrix rosea

MjAgo - белок-Аргонавт из Methanocaldococcus jannaschii

ш1РНК - микроРНК

MpAgo - белок-Аргонавт из Marinitoga piezophila

NgAgo - белок-Аргонавт из Natronobacterium gregoryi

PDB - Protein Data Bank, база для хранения данных по 3D структуре

больших биологических молекул

pAgo - прокариотические белки-Аргонавты

PfAgo - белок-Аргонавт из Pyrococcus furiosus

piРНК - РНК, ассоциированные с белком PIWI

PIPES - пиперазин-^№-бис(2-этансульфоновая кислота)

PliAgo - белок-Аргонавт из Pseudooceanicola lipolyticus

PMSF - фенилметилсульфонил фторид

RsAgo - белок-Аргонавт из Rhodobacter sphaeroides

SeAgo - белок-Аргонавт из Synechococcus elongatus

siРНК - короткие интерферирующие РНК

TomAgo - белок-Аргонавт из Tateyamaria omphalii

TtAgo - белок-Аргонавт из Thermus thermophilus

1. ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Взаимодействие белков-Аргонавтов бактерий Rhodobacter sphaeroides и Pseudooceanicola lipolyticus с нуклеиновыми кислотами.»

Актуальность темы исследования

Исследования систем внутриклеточного иммунитета у эукариот и прокариот становятся всё более актуальными, так как эти системы не только играют ключевую роль в защите клеток от патогенов, но и являются источником новых инструментов для биотехнологии и медицины. Система РНК-интерференции эукариот играет важнейшую роль в защите клеток от вирусов и мобильных генетических элементов, а также участвует в регуляции экспрессии генов (Joshua-Tor, 2006; Peters and Meister, 2007; Pratt and MacRae, 2009). Основными действующими компонентами систем РНК-интерференции являются белки-Аргонавты, которые используют короткие гидовые РНК для распознавания и расщепления комплементарных РНК-мишеней. Белки-Аргонавты также найдены у прокариот. Они эволюционно родственны своим эукариотическим гомологам, но намного разнообразней по своей структуре, специфичности и предполагаемым механизмам действия (Makarova et al., 2009; Ryazansky et al., 2018; Swarts et al., 2014a). Однако, у прокариот отсутствуют пути РНК-интерференции, поэтому функции белков-Аргонавтов пока недостаточно ясны. Предполагают, что белки-Аргонавты прокариот являются основными компонентами иммунных систем, которые используют короткие ДНК или РНК для узнавания и уничтожения вирусной и плазмидной ДНК или РНК (Hur et al., 2014; Kaya et al., 2016; Kuzmenko et al., 2020; Makarova et al., 2009; Olovnikov et al., 2013). Такие черты Аргонавтов, как связывание гидовых нуклеиновых кислот и эндонуклеазная активность, напоминают активность связанных с РНК-гидами белков иммунной системы CRISPR-Cas (Abudayyeh et al., 2016; Strotskaya et al., 2017). Доказательств участия Аргонавтов в системе CRISPR пока нет, но в геномах некоторых видов бактерий присутствуют белки-Аргонавты, кодируемые в пределах оперона гена cas и использующие РНК-гиды для распознавания ДНК (Kaya et al., 2016).

На сегодня детально исследовано всего несколько белков-Аргонавтов прокариот. Большинство из них использует короткие гидовые 5'-фосфорилированные ДНК для расщепления ДНК-мишеней. В отличие от Cas-нуклеаз, белки-Аргонавты содержат один активный центр и расщепляют одну цепь ДНК. Для некоторых белков-Аргонавтов установлено нацеливание на плазмидные ДНК (CbAgo из Clostridium butyricum, TtAgo из Thermus thermophilus), участие в защите от бактериофагов (CbAgo) и возможное участие в декатенировании хромосом при репликации (TtAgo) (Jolly et al., 2020; Kuzmenko et al., 2020; Swarts et al., 2014b, 2015a; Zander et al., 2017). Для отдельных белков-Аргонавтов прокариот, связывающих ДНК-гиды, отмечено расщепление РНК-мишеней in vitro, но с гораздо меньшей эффективностью, чем расщепление ДНК-субстратов (Kaya et al., 2016; Kropocheva et al., 2021; Liu et al., 2021; Wang et al., 2008a). Некоторые прокариотические Аргонавты используют РНК-гиды для узнавания ДНК-мишеней, не обладая при этом нуклеазной активностью (белок RsAgo из Rhodobacter sphaeroides) (Olovnikov et al., 2013). Такие белки часто кодируются совместно с дополнительными нуклеазами, функции которых остаются неисследованными. Разнообразие специфичности и механизмов функционирования Аргонавтов определяют важность их дальнейшего изучения in vitro и in vivo.

Исследование взаимодействий белков-Аргонавтов с нуклеиновыми кислотами необходимо для понимания основ генетической регуляции в клетках и выяснения их роли в иммунной защите от чужеродных ДНК и РНК. Кроме того, способность Аргонавтов к программируемому расщеплению ДНК и РНК делает их перспективными инструментами для генной инженерии.

Степень разработанности темы

Принципы распознавания, молекулярные механизмы биогенеза коротких РНК- или ДНК-гидов, используемых прокариотическими белками-Аргонавтами, а также функции и механизмы ДНК- и РНК-интерференции в

клетках прокариот только начинают исследовать. В качестве объектов изучения нами выбраны белок-Аргонавт RsAgo из альфапротеобактерии R. sphaeroides (Cereibacter sphaeroides ATCC 17025), который не обладает нуклеазной активностью из-за замещения аминокислотных остатков в активном центре, и белок PliAgo из Pseudooceanicola lipolyticus, содержащий полноценный активный центр. RsAgo использует гидовые РНК для специфического распознавания комплементарных ДНК-мишеней, но механизмы процессинга нуклеиновых кислот RsAgo в клетке остаётся неизвестным (Liu et al., 2018b; Olovnikov et al., 2013). Показано, что RsAgo может вызывать расщепление плазмидной ДНК и влиять на транскрипцию in vivo (Olovnikov et al., 2013). Исследования связывания RsAgo с двунитевой ДНК и его влияния на транскрипцию in vitro ранее не проводились. Данные по белку PliAgo в литературе отсутствуют, исследование этого Аргонавта проводится впервые. В одном опероне с RsAgo и с PliAgo кодируются предполагаемые специфические нуклеазы, которые потенциально могли бы принимать участие в процессинге нуклеиновых кислот, но их функции остаются не исследованными. Цели и задачи

Цель работы - выявить особенности взаимодействий белков-Аргонавтов RsAgo Rhodobacter sphaeroides и PliAgo Pseudooceanicola lipolyticus с нуклеиновыми кислотами, определяющие их специфичность к определенным мишеням in vitro.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать связывание белка RsAgo с одноцепочечными и двуцепочечными ДНК-мишенями в системе in vitro.

2. Установить, влияет ли связывание RsAgo с двуцепочечными ДНК на транскрипцию.

3. Разработать способ выделения нуклеазы, кодируемой совместно с RsAgo.

4. Исследовать нуклеазную активность и специфичность белка PliAgo.

5. Определить оптимальные параметры гидовых молекул для нуклеазной активности PliAgo.

6. Исследовать связывание PliAgo с ДНК- и РНК-мишенями in vitro.

Научная новизна

В работе впервые показано образование комплекса белка RsAgo, загруженного гидовой РНК, с дцДНК in vitro, в отличие от предыдущих исследований Аргонавтов, которые проводились с оцДНК-мишенями. Установлено, что образование такого комплекса и узнавание целевой цепи ДНК невозможно без предварительного плавления дцДНК. Показано, что белок RsAgo способен защищать ассоциированные с ним нуклеиновые кислоты от действия нуклеаз in vitro. Разработана система для анализа влияния RsAgo на транскрипцию in vitro. Впервые получены очищенные препараты нуклеазы, ассоциированной с белком RsAgo.

Впервые описана уникальная специфичность белка-Аргонавта PliAgo: в отличие от всех известных Аргонавтов, он связывает гидовые молекулы ДНК для расщепления комплементарных РНК-мишеней, причем сайт расщепления расположен между 9 и 10 нт гида, в отличие от канонического сайта между 10 и 11 нт гида. Выявлены оптимальные параметры нуклеазной активности PliAgo. Установлено, что PliAgo обладает уникальным строением домена MID, который связывает фосфорилированный 5'-конец гидовой молекулы без участия катионов Mg2+ и C-конца белка. Показано, что белок PliAgo, загруженный ДНК-гидом, способен взаимодействовать как с РНК, так и с оцДНК-мишенями, но расщепляет только РНК. Показано, что С-конец PliAgo может быть модифицирован без нарушения нуклеазной активности, что позволяет получать его химерные производные, слитые с флуоресцентными белками. Полученные результаты существенно расширяют представления о разнообразии белков-Аргонавтов прокариот и механизмах их взаимодействий с ДНК- и РНК-субстратами.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные в работе данные впервые показывают, что, в отличие от CRISPR-Cas-нуклеаз, для взаимодействий белков-Аргонавтов с дцДНК необходимо ее предварительное плавление. Разработанный способ сборки комплексов Аргонавтов с дцДНК in vitro может быть использован для изучения механизмов узнавания ДНК Аргонавтами разных групп и для исследования их влияния транскрипцию и репликацию плазмидных и хромосомных субстратов. Метод выделения ассоциированной с RsAgo нуклеазы делает возможным изучение её взаимодействий с белком-Аргонавтом и функциональной активности.

Выявленная особенность белков группы PliAgo связывать ДНК-гиды и расщеплять РНК-мишени может иметь широкое практическое применение в биотехнологии для специфического расщепления и модификации РНК, распознавания неканонических нуклеотидов и ковалентных модификаций РНК, определения локализации РНК как in vitro, так и in vivo. Естественная специфичность таких белков делает их более пригодными для различных манипуляций с РНК по сравнению с ДНК-узнающими Аргонавтами. Полученные данные показывают возможность создания химерных вариантов PliAgo, слитых с другими функциональными доменами с C-конца, без потери нуклеазной активности. Дальнейшие исследования биологической роли PliAgo и его гомологов в клетках помогут раскрыть новые механизмы антифаговой защиты бактерий и регуляции экспрессии генов с участием этой группы Аргонавтов.

Методология и методы исследования

Работа выполнена на современном оборудовании с использованием разнообразных методов молекулярной биологии. Сконструированы экспрессионные плазмидные вектора, кодирующие белок PliAgo и его варианты с аминокислотными заменами и модификациями (в домене MID, в активном центре и рядом с ним, в С-конце белка), белок TomAgo Tateyamaria omphalii, нуклеазы R. sphaeroides, P. lipolyticus, T. omphalii. Получены

штаммы E. coli - продуценты рекомбинантных белков. Исследуемые белки очищены методами хроматографии. Сборка комплексов белков RsAgo и PliAgo с нуклеиновыми кислотами исследована методом задержки в геле. Влияние RsAgo на транскрипцию исследовано методами транскрипции in vitro. Нуклеазная активность белков и формирование продуктов реакции проанализированы методами электрофореза в полиакриламидных гелях в денатурирующих условиях.

Положения, выносимые на защиту

• RsAgo, связанный с гидовой РНК, образует комплексы с целевой двуцепочечной ДНК только при наличии расплавленного участка ДНК.

• Связанный с ДНК-мишенью RsAgo не является препятствием для прохождения РНК-полимеразы в разработанной системе in vitro.

• PliAgo использует ДНК-гиды длиной от 10 до 22 нуклеотидов для распознавания и расщепления РНК-мишеней между 9 и 10 положениями гидовой молекулы.

• PliAgo обладает необычным строением гид-связывающего кармана домена MID и связывает ДНК-гиды без участия катионов магния и С-конца белка.

• PliAgo способен связывать не только РНК, но и оцДНК-мишени, но не обладает по отношению к ним нуклеазной активностью.

• Наличие неспаренных нуклеотидов между гидом и мишенью в 5'-концевой части гида и в сайте расщепления нарушает расщепление РНК-мишени белком PliAgo, что делает перспективным его использование для специфического узнавания целевых РНК.

Степень достоверности и апробация результатов Все эксперименты, представленные в работе, были выполнены в нескольких повторностях, полученные результаты статистически достоверны и воспроизводимы.

По теме исследований опубликованы 4 статьи в международных рецензируемых научных изданиях:

1. Lisitskaya L., Aravin A.A. and Kulbachinskiy A. DNA interference and beyond: structure and functions of prokaryotic Argonaute proteins // Nat. Commun. - 2018. - P(1):5165. - 1-12.

2. Lisitskaya L., Petushkov I., Esyunina D., Aravin A. and Kulbachinskiy A. Recognition of double-stranded DNA by the Rhodobacter sphaeroides Argonaute protein // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2020. - 533(4). -1484-1489.

3. Lisitskaya L., Shin Y., Agapov A., Olina A., Kropocheva E., Ryazansky S., Aravin A.A., Esyunina D., Murakami K.S. and Kulbachinskiy A. Programmable RNA targeting by bacterial Argonaute nucleases with unconventional guide binding and cleavage specificity // Nat. Commun. - 2022. - 13. - 1-15.

4. Кропочева Е. В., Лисицкая Л. А., Агапов А. А., Мусабиров А. А., Кульбачинский А. В., Есюнина Д. М. Прокариотические белки-Аргонавты как инструмент биотехнологии // Молекулярная биология - 2022. - 56, № 6. -915-936.

Результаты работы были представлены на всероссийских и международных конференциях:

1. Lisitskaya L., Esyunina D., Komar A., Aravin A., Kulbachinskiy A. Analysis of a putative nuclease associated with the Argonaute protein from Rhodobacter sphaeroides // 45th FEBS Congress Abstracts, 1-16 July, 2021 - P04.209.

2. Лисицкая Л.А., Есюнина Д.М., Петушков И.В., Кульбачинский А.В. Разработка системы in vitro для изучения влияния белка-аргонавта Rhodobacter sphaeroides на транскрипцию // II объединенный научный форум: VI съезд физиологов СНГ, VI съезд биохимиков России, IX российский симпозиум «Белки и пептиды» (Сочи, Дагомыс, 1-6 октября 2019). Научные труды. Acta Naturae. Спецвыпуск. Том 2. - С. 32-33. -Участие в конкурсе молодых ученых.

3. Есюнина Д.М., Лисицкая Л.А., Нинова М.А., Аравин А.А., Кульбачинский А.В. Как белки-аргонавты бактерий узнают гены-мишени? // II объединенный научный форум: VI съезд физиологов СНГ, VI съезд биохимиков России, IX российский симпозиум «Белки и пептиды» (Сочи,

Дагомыс, 1-6 октября 2019). Научные труды. Acta Naturae. Спецвыпуск. Том 2. - С. 9-10.

4. Кузьменко А.В., Юдин Д.А., Кропочева Е.В., Лисицкая Л.А., Олина А.В., Огиенко А.Д., Кудинова А.Г., Петрова М.А., Рязанский С.С., Есюнина Д.М., Аравин А.А., Кульбачинский А.В. ДНК-интерференция и белки-аргонавты в клетках бактерий //II объединенный научный форум: VI съезд физиологов СНГ, VI съезд биохимиков России, IX российский симпозиум «Белки и пептиды» (Сочи, Дагомыс, 1-6 октября 2019). Научные труды. Acta Naturae. Спецвыпуск. Том 2. - С. 9.

5. Kuzmenko A., Yudin D., Olina A., Kropocheva E., Lisitskaya L., Oguienko A., Esyunina D., Ryazansky S., Kulbachinskiy A., Aravin A. Programmable DNA and RNA processing by prokaryotic Argonaute proteins // 84th Symposium: RNA control and regulation, May 29 - June 3, 2019, Cold Spring Harbor, NY, USA.

6. Лисицкая Л.А., Комар А.А., Есюнина Д.М. Выделение нуклеазы, ассоциированной с белком-аргонавтом бактерии Rhodobacter sphaeroides // Тезисы докладов тезисов VIII международной школы молодых ученых по молекулярной генетике «Генетическая организация и молекулярные механизмы функционирования живых систем», 19-23 ноября 2018, Москва - Звенигород. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. Спецвыпуск. 2019. T.37. - C. 36.

7. Lisitskaya L., Petushkov I., Esyunina D., Aravin A., Kulbachinskiy A. Interactions of a bacterial Argonaute protein with DNA targets in vitro // FEBS Open Bio. - 2018. - Т. 8. - №. S1. - С. Art. No. P. 18-108.

8. Лисицкая Л.А., Петушков И.В., Аравин А.А., Кульбачинский А.В., Есюнина Д. М. Изучение взаимодействия белка Аргонавта Rhodobacter sphaeroides с ДНК-мишенями // Сборник тезисов зимней молодежной школы ПИЯФ по биофизике и молекулярной биологии, 17-22 февраля 2018, Гатчина. - C. 66-67. - 3-е место в конкурсе докладов.

9. Esyunina D., Ninova M., Lisitskaya L., Kulbachinskiy A., Aravin A. RNAi in bacteria: mechanisms of guide RNA generation and target recognition // Abstract of papers presented at the EMBO/EMBL Symposium: The Non-Coding Genome. EMBL Advanced Training Centre (ATC), 13-16 September 2017, Heidelberg, Germany. - P.83.

Личное участие автора в проведении исследований

Автор принимал непосредственное участие в постановке задач, планировании экспериментов, анализе и обработке результатов. Основные экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены автором лично. При непосредственном участии автора выполнены эксперименты по определению границ расплавленного комплекса ДНК при связывании RsAgo методом перманганатного футпринтинга, связыванию гидовых ДНК PliAgo методом дот-блот анализа, визуализации PliAgo-GFP методами микроскопии, биоинформатический анализ гомологов PliAgo. Имена соавторов, участвовавших в проведении экспериментов, указаны в тексте диссертации и в соответствующих опубликованных работах.

Структура и объём работы

Диссертационная работа включает: список условных сокращений, введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы, список литературы и приложение. Работа изложена на 160 страницах, содержит 3 таблицы, 35 рисунков. Список литературы включает 183 источника.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Обобщенная схема РНК-интерференции и структура белков-Аргонавтов эукариот

Одним из ключевых механизмов функционирования геномов эукариот является РНК-интерференция - регуляция экспрессии генов с участием белков семейства Аргонавтов, которые узнают РНК-мишени с помощью комплементарных им малых гидовых РНК (Hammond et al., 2001; Meister, 2013). К начальным работам по РНК-интерференции относятся исследования асимметричного клеточного деления эмбрионов у нематоды Caenorhabditis elegans (Guo and Kemphues, 1995; Lee et al., 1993; Wightman et al., 1993), а также деления зародышевых стволовых клеток в яичнике дрозофилы (Lin and Spradling, 1997). Название «Аргонавты» впервые предложили Karen Bohmert и соавторы при изучении мутантного по этому гену фенотипа растений Arabidopsis thaliana с узкими розеточными листьями, напоминающими моллюска с таким именем (Bohmert et al., 1998). Полноценное понимание механизма РНК-интерференции началось только в 1998 г. с экспериментов Andrew Fire, Craig Mello и коллег, которые показали, что у C. elegans дцРНК запускают механизм посттранскрипционного специфичного сайленсинга генов (Fire et al., 1998). В 2006 г. за проведенные исследования они получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине. Через несколько лет был обнаружен транскрипционный сайленсинг центромер у делящихся дрожжей (Schizosaccharomyces pombe), зависящий от коротких РНК и компонентов пути РНК-интерференции (Bhattacharjee et al., 2019; Volpe et al., 2002). В дальнейшем было показано, что РНК-интерференция консервативна у подавляющего большинства эукариот и связана с различными процессами сайленсинга РНК, ранее описанными для грибов и растений, такими как косупрессия, процессинг транскрипта и посттранскрипционный сайленсинг генов. Кроме того, РНК-интерференция играет определенную роль в

эпигенетической регуляции геномов эукариот и действует как противовирусный механизм у растений, насекомых и млекопитающих (например, Ago2 и Ago4 (Adiliaghdam et al., 2020)). Компоненты пути РНК-интерференции вовлечены в широкий спектр клеточных функций, включая рост, развитие, апоптоз, а также в не физиологические процессы, такие как канцерогенез (Bhattacharjee et al., 2019).

Белки-Аргонавты связывают малые РНК (~20-30 нт) - такие как короткие интерферирующие РНК (siPHK), микроРНК (miPHK) или РНК, ассоциированные с белком PIWI ^РНК) (Aravin et al., 2006; Brennecke et al., 2007; Martinez et al., 2002), - и координируют последующие события сайленсинга генов, взаимодействуя с другими белковыми факторами (Meister, 2013). Образующиеся эффекторные комплексы распознают комплементарные РНК-мишени и могут расщеплять их из-за своей эндонуклеазной активности, либо выполняют другие функции, такие как независящая от расщепления дестабилизация РНК, репрессия транскрипции и трансляции через взаимодействия с другими белками (Moazed, 2009; Pratt and MacRae, 2009). Эти комплексы могут регулировать экспрессию генов хозяина, подавлять активность транспозонов или противостоять вирусным инфекциям (Baulcombe, 2004; Miesen et al., 2016b, 2016a; Mussabekova et al., 2017; Pumplin and Voinnet, 2013). Согласно современной классификации, в семействе Аргонавтов выделяют три группы (Hutvagner and Simard, 2008; Tolia and Joshua-Tor, 2007; Vaucheret, 2008). Первая группа состоит из AGO-подобных белков, которые широко распространены среди архей, бактерий и эукариот и участвуют в цитоплазматическом посттранскрипционном сайленсинге генов. Вторая группа включает в себя PIWI-подобные белки, которые встречаются преимущественно в герминальных клетках животных и подавляют экспрессию мобильных генетических элементов, и таким образом, вносят свой вклад в поддержание целостности генома (Aravin et al., 2006, 2001; Girard et al., 2006; Lau et al., 2006). Третья группа WAGO была определена исключительно для белков червей Caenorhabditis elegans.

Интересно отметить, что у разных видов организмов встречается разное количество и соотношение групп Аргонавтов. Например, у человека (Homo sapiens) имеется четыре белка, относящихся к группе AGO, и четыре - к группе PIWI (Ma et al., 2018; Meister, 2013). Различные пути РНК-интерференции могут работать в одном и том же организме и даже в одной клетке (Ghildiyal and Zamore, 2009). РНК-интерференция с участием белков группы AGO может осуществляться на двух альтернативных уровнях: на уровне РНК или хроматина (Liu et al., 2018a; Ma et al., 2018; Olina et al., 2018; Pezic et al., 2014; Verdel et al., 2004).

Малые siРНК процессируются ферментом Dicer (рибонуклеаза семейства РНКаза III) из экзогенных и эндогенных дцРНК в цитоплазме с образованием дуплекса двуцепочечной РНК (дцРНК) (20 - 30 нт), а ш1РНК процессируются из РНК-предшественников, содержащих структуру шпильки, эндонуклеазой Drosha в ядре (Ameres et al., 2007; Aravin et al., 2001, 2004; Brennecke et al., 2007; Denli et al., 2004; Lee et al., 2003; Vagin et al., 2006). Синтетические короткие интерферирующие РНК ^РНК) и микроРНК (ш1РНК) могут также процессироваться слайсерной активностью белка Ago2 без Dicer (Cheloufi et al., 2010; Cifuentes et al., 2010; Sun et al., 2018; Yang et al., 2010). При сборке эффекторного комплекса RISC (RNA-induced silencing complex; комплекс, отвечающий за подавление экспрессии генов с участием РНК) дуплекс РНК загружается в белок Ago, затем одна цепь дуплекса (пассажирская) высвобождается, а другая (гидовая) цепь остаётся связанной с белком (Bernstein et al., 2001; Carmell and Hannon, 2004; Ketting et al., 2001). Комплексы Аргонавтов с miРНК или siРНК (у дрозофил они связываются разными Аргонавтами) затем распознают целевую РНК по принципу комплементарности (Fôrstemann et al., 2007; Jinek and Doudna, 2009; Makarova et al., 2009; Tomari et al., 2007). В зависимости от вида гидовой РНК, результатом будет ингибирование трансляции, эндонуклеазное расщепление мишени или деградация целевой цепи, опосредованная дополнительными нуклеазами. Известно также распознавание транскриптов белком-

Аргонавтом без загрузки гидовой РНК, у дрозофилы этому способствует РНК-связывающий белок Smaug. С другой стороны, РНК-интерференция может проходить на уровне хроматина с помощью модификации гистонов или метилирования ДНК, что также является эффективным способом подавления или, в редких случаях, активации экспрессии генов (Hunt et al., 2018; Ma et al., 2018; Sienski et al., 2012; Le Thomas et al., 2013).

Белки группы PIWI связывают piРНК и формируют piRISC (комплекс, отвечающий за подавление экспрессии генов с участием piРНК) (Aravin et al., 2006, 2008; Sakakibara and Siomi, 2018). Существуют значительные различия между стандартным комплексом сайленсинга генов, содержащим белки AGO (RISC), и piRISC. Биогенез piРНК - это многоступенчатый процесс, начинающийся с транскрипции и начального процессинга РНК-предшественника в ядре, экспорта в цитоплазму, расщепления предшественника с последующим процессингом до зрелых piРНК и загрузкой в белки PIWI. Во время сборки piRISC в цитоплазме предшественники piРНК процессируются двумя механизмами: длинный одноцепочечный транскрипт либо загружается в белок PIWI (начинается цикл «пинг-понг», см. ниже), либо расщепляется со стороны 3'-конца эндонуклеазой Zucchini (Zucchini-зависимый биогенез piРНК) (MitoPLD у мышей) (Malone et al., 2009; Rogers et al., 2017). Дополнительно 3'-нуклеотиды могут обрезаться экзонуклеазами Nibbler или Trimmer и 3'-конец piРНК затем метилируется Hen1-метилазой для повышения стабильности (Czech et al., 2018; Matsumoto et al., 2016).

Комплексы «PIWI-piРНК» подавляют активность транспозонов двумя альтернативными механизмами в зависимости от белков группы PIWI (Malone and Hannon, 2009; Miesen et al., 2016a; Siomi et al., 2011). Первый механизм заключается в посттранскрипционном сайленсинге генов посредством цикла «пинг-понг» (Huang et al., 2017). У дрозофилы в этом процессе участвуют цитоплазматические белки Aub (Aubergine) и Ago3. Аналогичную функцию выполняют белки Miwi и Mili у мыши, и SIWI и

Ago3 у тутового шелкопряда. Характерными особенностями этого цикла являются наличие комплементарных пар piРНК (5'-конец одного фрагмента piРНК отстоит на 10 нуклеотидов от 5'-конца другого фрагмента) и генерация piРНК, содержащих остаток уридина в 1 положении и/или остаток аденина в 10 положении (Huang et al., 2017). Второй механизм -транскрипционный сайленсинг с участием белка Piwi дрозофилы и Miwi2 мыши, которые транслоцируются в ядро при загрузке piRNA и подавляют экспрессию транспозонов (Aravin et al., 2006; Czech et al., 2018; Pezic et al., 2014; Webster et al., 2015).

Эукариотические белки-Аргонавты состоят из шести доменов: N-концевого, L1 (linker 1), домена PAZ («Piwi-Argonaute-Zwille»), L2 (linker 2), домена MID (middle) и домена PIWI (рис. 2.1 А, Б) (Elkayam et al., 2012; Schirle and MacRae, 2012; Willkomm et al., 2015). PIWI-домен белков-Аргонавтов содержит консервативную каталитическую тетраду аминокислот DEDX (где X представляет собой аспарагиновую кислоту, гистидин или лизин), которая координирует два двухвалентных катиона, необходимых для катализа (Kaya et al., 2016; Makarova et al., 2009). MID имеет структурный мотив для связывания нуклеотидов - укладка Россманна (Swarts et al., 2014a). PAZ - небольшой домен (~140 аминокислотных остатков), который обнаружен как в белках eAgo, так и в белке Dicer, хотя в ходе эволюции они возникли независимо друг от друга (eAgo произошел от архейного белка Ago, а Dicer - от ERCC4-подобной хеликазы) (Koonin, 2017).

При исследовании третичной структуры эукариотических белков-Аргонавтов (eAgo) первым был закристаллизован домен PAZ белка Ago дрозофилы (Yan et al., 2003). Кристаллы полноразмерных белков сначала удалось получить только для прокариотических Аргонавтов (pAgo) архей Archaeoglobus fulgidus (AfAgo) (Parker et al., 2004), Pyrococcus furiosus (PfAgo) (Rivas et al., 2005; Song et al., 2004) и бактерии Aquifex aeolicus (AaAgo) (Ma et al., 2005; Yuan et al., 2005, 2006) (рис. 2.1 В).

Рисунок 2.1. Модульная структура белков-Аргонавтов. А - схема расположения доменов и их функции. Б - кристаллическая структура белка-Аргонавта hAgo2 (PDB: 4W5O, (Schirle and MacRae, 2012)). Аргонавты эукариот имеют шесть доменов: N-концевой, L1, PAZ, L2, MID и PIWI (показаны одинаковыми цветами в А и Б). Белок принимает «двулопастную» структуру: N-концевой и PAZ домены образуют одну «лопасть» и MID и PIWI домены формируют другую. Между лопастями расположен дуплекс из гидовой РНК и РНК-мишени. Розовым цветом указан ион магния в активном центре. В - первые кристаллические структуры белков-Аргонавтов прокариот. Слева - структура белка-Аргонавта AfAgo археи A. fulgidus (Parker et al., 2004), по центру - AaAgo бактерии A. aeolicus (Yuan et al., 2005), справа - PfAgo археи P. furiosus (Rivas et al., 2005). Снизу подписаны номера структур из PDB. Домены обозначены цветами, соответствующими панели А. Ион металла в активном сайте - фиолетовой сферой.

При изучении структуры комплекса AfAgo (содержит только MID- и PIWI-домены) с малыми РНК, которая имитирует взаимодействие 5'-конца гидовой цепи РНК с мРНК-мишенью, был обнаружен высококонсервативный

металл-связывающий сайт в MID, который связывает 5'-концевой нуклеотид гида (Ma et al., 2005; Parker et al., 2004, 2005, 2009). Анализ структуры белка PfAgo, филогенетически близкого к эукариотическим белкам-Аргонавтам, выявил схожесть домена PIWI с рибонуклеазой H, а также позволил определить консервативные аминокислотные остатки в активном центре белка, необходимые для каталитической активности (Rivas et al., 2005). На основе пространственного расположения доменов PAZ и PIWI PfAgo и AaAgo был предложен механизм расщепления мРНК с помощью гидовой siPHK (Rashid et al., 2007; Rivas et al., 2005; Song et al., 2004; Yuan et al., 2005, 2006). И только в 2012 г. были получены структуры Ago дрожжей Kluyveromyces polysporus (Nakanishi et al., 2012) и человека Ago2 (Bhattacharjee et al., 2019; Elkayam et al., 2012; Schirle and MacRae, 2012), а позже разрешены структуры hAgol и hAgo3 (Faehnle et al., 2013; Nakanishi et al., 2013; Park et al., 2017b).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Лисицкая Лидия Александровна, 2023 год

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

5. Abudayyeh O.O., Gootenberg J.S., Konermann S., Joung J., Slaymaker I.M., Cox D.B.T., Shmakov S., Makarova K.S., Semenova E., Minakhin L., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector // Science. - 2016. - 353(6299):aaf5573.

6. Adiliaghdam F., Basavappa M., Saunders T.L., Harjanto D., Prior J.T., Cronkite D.A., Papavasiliou N. and Jeffrey K.L. A Requirement for Argonaute 4 in Mammalian Antiviral Defense // Cell Rep. - 2020 - 30 (6), 1690-1701.

7. Ameres S.L., Martinez J. and Schroeder R. Molecular Basis for Target RNA Recognition and Cleavage by Human RISC // Cell - 2007 - 130, 101-112.

8. Aravin A., Gaidatzis D., Pfeffer S., Lagos-Quintana M., Landgraf P., Iovino N., Morris P., Brownstein M.J., Kuramochi-Miyagawa S., Nakano T. et al. A novel class of small RNAs bind to MILI protein in mouse testes // Nature -2006 - 442, 203-207.

9. Aravin A.A., Naumova N.M., Tulin A. V., Vagin V. V., Rozovsky Y.M. and Gvozdev V.A. Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline // Curr. Biol. - 2001 - 11, 1017-1027.

10. Aravin A.A., Klenov M.S., Vagin V. V., Bantignies F., Cavalli G. and Gvozdev V.A. Dissection of a Natural RNA Silencing Process in the Drosophila melanogaster Germ Line // Mol. Cell. Biol. - 2004 - 24(15):6742-50.

11. Aravin A.A., Sachidanandam R., Bourc'his D., Schaefer C., Pezic D., Toth K.F., Bestor T. and Hannon G.J. A piRNA Pathway Primed by Individual Transposons Is Linked to De Novo DNA Methylation in Mice // Mol. Cell. -2008 - 2<5;31(6):785-99.

12. Bartel D.P. Metazoan MicroRNAs // Cell - 2018 - 173(1):20-51.

13. Basu R.S., Warner B.A., Molodtsov V., Pupov D., Esyunina D., Fernández-

Tornero C., Kulbachinskiy A., and Murakami K.S. Structural basis of transcription initiation by bacterial RNA polymerase holoenzyme // J. Biol. Chem. - 2014 - 289(35):24549-59.

14. Baulcombe D. RNA silencing in plants // Nature - 2004 - 431(7006), 356-363.

15. Bernstein E., Caudy A.A., Hammond S.M. and Hannon G.J. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference // Nature -2001- 409(6818):363-6.

16. Bhattacharjee S., Roche B., and Martienssen R.A. RNA-induced initiation of transcriptional silencing (RITS) complex structure and function // RNA Biol. -2019 - 16, 1133-1146.

17. Bohmert K., Camus I., Bellini C., Bouchez D., Caboche M. and Benning C. AGO1 defines a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development // EMBO J. - 1998 - 17, 170-180.

18. Brennecke J., Aravin A.A., Stark A., Dus M., Kellis M., Sachidanandam R. and Hannon G.J. Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in Drosophila // Cell - 2007 - 128, 1089-1103.

19. Burroughs A.M., Iyer L.M. and Aravind L. Two novel PIWI families: Roles in inter-genomic conflicts in bacteria and Mediator-dependent modulation of transcription in eukaryotes // Biol. Direct. - 2013 - 8:13.

20. Cao Y., Sun W., Wang J., Sheng G., Xiang G., Zhang T., Shi W., Li C., Wang Y., Zhao F. et al. Argonaute proteins from human gastrointestinal bacteria catalyze DNA-guided cleavage of single- and double-stranded DNA at 37 °C // Cell Discov. - 2019 - 5:38.

21. Carmell M.A. and Hannon G.J. RNase III enzymes and the initiation of gene silencing // Nat. Struct. Mol. Biol. - 2004 - 11(3):214-8.

22. Chang L., Sheng G., Zhang Y., Shao S., Wang Y. and Sun Y. AgoFISH: Cost-effective in situ labelling of genomic loci based on DNA-guided dTtAgo protein // Nanoscale Horizons - 2019 - 4, 918-923.

23. Cheloufi S., Dos Santos C.O., Chong M.M.W. and Hannon G.J. A dicer-independent miRNA biogenesis pathway that requires Ago catalysis // Nature -

2010 - 465, 584-589.

24. Chen G.R., Sive H. and Bartel D.P. A Seed Mismatch Enhances Argonaute2-Catalyzed Cleavage and Partially Rescues Severely Impaired Cleavage Found in Fish // Mol. Cell. - 2017 - 68(6): 1095-1107.

25. Cifuentes D., Xue H., Taylor D.W., Patnode H., Mishima Y., Cheloufi S., Ma E., Mane S., Hannon G.J., Lawson N.D. et al. A novel miRNA processing pathway independent of dicer requires argonaute2 catalytic activity // Science -2010 - 328(5986):1694-8.

26. Cui T.J., Klein M., Hegge J.W., Chandradoss S.D., van der Oost J., Depken M. and Joo C. Argonaute bypasses cellular obstacles without hindrance during target search // Nat. Commun. - 2019 - 10(1):4390.

27. Czech B., Munafo M., Ciabrelli F., Eastwood E.L., Fabry M.H., Kneuss E., and Hannon G.J. PiRNA-guided genome defense: From biogenesis to silencing // Annu. Rev. Genet. - 2018 - 52, 131-157.

28. Dahlgren C., Zhang H.Y., Du Q., Grahn M., Norstedt G., Wahlestedt C. and Liang Z. Analysis of siRNA specificity on targets with double-nucleotide mismatches // Nucleic Acids Res. - 2008 - 36.

29. Dayeh D.M., Cantara W.A., Kitzrow J.P., Musier-Forsyth K. and Nakanishi K. Argonaute-based programmable RNase as a tool for cleavage of highly-structured RNA // Nucleic Acids Res. - 2018 - 46, 1-13.

30. Denli A.M., Tops B.B.J., Plasterk R.H.A., Ketting R.F. and Hannon G.J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex // Nature -2004 - 432(7014):231-5.

31. Doench J.G. and Sharp P.A. Specificity of microRNA target selection in translational repression // Genes Dev. - 2004 - 18(5):504-11.

32. Doxzen K.W. and Doudna J.A. DNA recognition by an RNA-guided bacterial Argonaute // PLoS One - 2017 - 12, 1-14.

33. Du Q., Thonberg H., Wang J., Wahlestedt C. and Liang Z. A systematic analysis of the silencing effects of an active siRNA at all single-nucleotide mismatched target sites // Nucleic Acids Res. - 2005 - 33(5): 1671-7.

34. Dutta D., Shatalin K., Epshtein V., Gottesman M.E. and Nudler E. Linking RNA polymerase backtracking to genome instability in E. coli // Cell. - 2011 -146(4):533-43.

35. Dy R.L., Richter C., Salmond G.P.C. and Fineran P.C. Remarkable mechanisms in microbes to resist phage infections // Annu. Rev. Virol. - 2014 -1(1):307-31.

36. Elkayam E., Kuhn C.D., Tocilj A., Haase A.D., Greene E.M., Hannon G.J. and Joshua-Tor L. The structure of human argonaute-2 in complex with miR-20a // Cell - 2012 - 150, 100-110.

37. Enghiad B. and Zhao H. Programmable DNA-Guided Artificial Restriction Enzymes // ACS Synth. Biol. - 2017- 6, 752-757.

38. Faehnle C.R., Elkayam E., Haase A.D., Hannon G.J. and Joshua-Tor L. The Making of a Slicer: Activation of Human Argonaute-1 // Cell Rep. - 2013-3(6):1901-9.

39. Filius M., Cui T.J., Ananth A.N., Docter M.W., Hegge J.W., Van Der Oost J., and Joo C. High-Speed Super-Resolution Imaging Using Protein-Assisted DNA-PAINT // Nano Lett. - 2020 - 20, 2264-2270.

40. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E. and Mello C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans // Nature - 1998 - 391, 806-811.

41. Förstemann K., Horwich M.D., Wee L.M., Tomari Y. and Zamore P.D. Drosophila microRNAs Are Sorted into Functionally Distinct Argonaute Complexes after Production by Dicer-1 // Cell - 2007 - 130(2):287-97.

42. Fu L., Xie C., Jin Z., Tu Z., Han L., Jin M., Xiang Y. and Zhang A. The prokaryotic Argonaute proteins enhance homology sequence-directed recombination in bacteria // Nucleic Acids Res. - 2019 - 47, 3568-3579.

43. Gao M., Wei W., Li M.M., Wu Y.S., Ba Z., Jin K.X., Li M.M., Liao Y.Q., Adhikari S., Chong Z. et al. Ago2 facilitates Rad51 recruitment and DNA double-strand break repair by homologous recombination // Cell Res. - 2014 -24(5):532-41.

44. Garcia-Quintans N., Bowden L., Berenguer J. and Mencia M.. DNA interference by a mesophilic Argonaute protein, CbcAgo // F1000Research -2020 - 8, 321.

45. Ghildiyal M. and Zamore P.D. Small silencing RNAs: An expanding universe // Nat. Rev. Genet. - 2009 - 10, 94-108.

46. Girard A., Sachidanandam R., Hannon G.J. and Carmell M.A. A germline-specific class of small RNAs binds mammalian Piwi proteins // Nature - 2006 -442(7099): 199-202.

47. Globyte V., Kim S.H. and Joo C. Single-Molecule View of Small RNA-Guided Target Search and Recognition // Annu. Rev. Biophys. - 2018 - 47, 569-593.

48. Guo S. and Kemphues K.J. par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed // Cell - 1995 - 81, 611-620.

49. Guo X., Sun Y., Chen L., Huang F., Liu Q. and Feng Y. A Hyperthermophilic Argonaute From Ferroglobus placidus With Specificity on Guide Binding Pattern // Front. Microbiol. - 2021 - 12:654345.

50. Haley B. and Zamore P.D. Kinetic analysis of the RNAi enzyme complex // Nat. Struct. Mol. Biol. - 2004 - 11, 599-606.

51. Hall T.M.T. Structure and function of argonaute proteins // Structure - 2005 -13, 1403-1408.

52. Hammond S.M., Boettcher S., Caudy A.A., Kobayashi R. and Dou G.J.H. Argonaute2 a link between genetic and biochemical analyses of RNAi // Science - 2001 - 293, 1146-1151.

53. Hawley B.R., Lu W.T., Wilczynska A. and Bushell M. The emerging role of RNAs in DNA damage repair // Cell Death Differ. - 2017 - 24(4):580-587.

54. Hegge J.W., Swarts D.C. and Van Der Oost J. Prokaryotic argonaute proteins: Novel genome-editing tools? // Nat. Rev. Microbiol. - 2018 - 16, 5-11.

55. Hegge J.W., Swarts D.C., Chandradoss S.D., Cui T.J., Kneppers J., Jinek M., Joo C., and Van Der Oost J. DNA-guided DNA cleavage at moderate temperatures by Clostridium butyricum Argonaute // Nucleic Acids Res. - 2019

- 47, 5809-5821.

56. Huang F., Xu X., Dong H., Li N., Zhong B., Lu H., Liu Q. and Feng Y. Catalytic properties and biological function of a PIWI-RE nuclease from Pseudomonas stutzeri // Bioresour. Bioprocess - 2022 - 9:57.

57. Huang X., Fejes Toth K. and Aravin A.A. piRNA Biogenesis in Drosophila melanogaster // Trends Genet. - 2017 - 33(11):882-894.

58. Hunt E.A., Evans T.C. and Tanner N.A. Single-stranded binding proteins and helicase enhance the activity of prokaryotic argonautes in vitro // PLoS One -2018 - 13, 1-20.

59. Hur J.K., Zinchenko M.K., Djuranovic S. and Green, R. Regulation of Argonaute slicer activity by guide RNA 3' end interactions with the N-terminal lobe // J. Biol. Chem. - 2013 - 288, 7829-7840.

60. Hur J.K., Olovnikov I. and Aravin, A.A. Prokaryotic Argonautes defend genomes against invasive DNA // Trends Biochem. Sci. - 2014 - 39, 257-259.

61. Hutvagner G. and Simard M.J. Argonaute proteins: Key players in RNA silencing // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2008 - 9, 22-32.

62. Javidi-Parsijani P., Niu G., Davis M., Lu P., Atala A. and Lu B. No evidence of genome editing activity from Natronobacterium gregoryi Argonaute (NgAgo) in human cells // PLoS One -2017- 12(5):e0177444.

63. Jinek M. and Doudna J.A. A three-dimensional view of the molecular machinery of RNA interference // Nature - 2009 - 457, 405-412.

64. Jolly S.M., Gainetdinov I., Jouravleva K., Zhang H., Strittmatter L., Bailey S.M., Hendricks G.M., Dhabaria A., Ueberheide B. and Zamore P.D. Thermus thermophilus Argonaute Functions in the Completion of DNA Replication // Cell - 2020 - 182, 1545-1559.e18.

65. Joshua-Tor L. The argonautes // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. - 2006 -71, 67-72.

66. Jung S.-R., Kim E., Hwang W., Shin S., Song J.-J. and Hohng S. Dynamic anchoring of the 3'-end of the guide strand controls the target dissociation of Argonaute-guide complex // J. Am. Chem. Soc. - 2013 - 135, 16865-16871.

67. Kaya E., Doxzen K.W., Knoll K.R., Wilson R.C., Strutt S.C., Kranzusch P.J., and Doudna J.A. A bacterial Argonaute with noncanonical guide RNA specificity // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2016 - 113, 4057-4062.

68. Ketting R.F., Fischer S.E.J., Bernstein E., Sijen T., Hannon G.J., and Plasterk R.H.A. Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C. elegans // Genes Dev. - 2001 -15(20):2654-9.

69. Khin N.C., Lowe J.L., Jensen L.M. and Burgio G. No evidence for genome editing in mouse zygotes & HEK293T human cell line using the DNA-guided Natronobacterium gregoryi Argonaute (NgAgo) // PLoS One - 2017 -12(6):e0178768.

70. Kim S.Y., Jung Y., and Lim D. Argonaute system of Kordia jejudonensis is a heterodimeric nucleic acid-guided nuclease // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2020 - 525, 755-758.

71. Kinch L.N., Ginalski K., Rychlewski L., and Grishin N. V. Identification of novel restriction endonuclease-like fold families among hypothetical proteins // Nucleic Acids Res. - 2005 - 33, 3598-3605.

72. Klenov M.S., Lavrov S.A., Stolyarenko A.D., Ryazansky S.S., Aravin A.A., Tuschl T., and Gvozdev V.A. Repeat-associated siRNAs cause chromatin silencing of retrotransposons in the Drosophila melanogaster germline // Nucleic Acids Res. - 2007 - 35, 5430-5438.

73. Klum S.M., Chandradoss S.D., Schirle N.T., Joo C. and MacRae I.J. Helix-7 in Argonaute2 shapes the microRNA seed region for rapid target recognition // EMBO J. - 2018 - 37, 75-88.

74. Knizewski L., Kinch L.N., Grishin N. V., Rychlewski L. and Ginalski K. Realm of PD-(D/E)XK nuclease superfamily revisited: Detection of novel families with modified transitive meta profile searches // BMC Struct. Biol. -2007 - 7, 1-9.

75. Koonin E. V. Evolution of RNA- and DNA-guided antivirus defense systems in prokaryotes and eukaryotes: Common ancestry vs convergence // Biol.

Direct - 2017 - 12, 1-14.

76. Koopal B., Potocnik A., Mutte S.K., Aparicio-Maldonado C., Lindhoud S., Vervoort J.J.M., Brouns S.J.J. and Swarts D.C. Short prokaryotic Argonaute systems trigger cell death upon detection of invading DNA // Cell - 2022 - 185, 1471-1486.e19.

77. Kropocheva E., Kuzmenko A., Aravin A.A., Esyunina D. and Kulbachinskiy A. A programmable pAgo nuclease with universal guide and target specificity from the mesophilic bacterium Kurthia massiliensis // Nucleic Acids Res. -2021 - 49, 4054-4065.

78. Kuramochi-Miyagawa S., Watanabe T., Gotoh K., Totoki Y., Toyoda A., Ikawa M., Asada N., Kojima K., Yamaguchi Y., Ijiri T.W. et al. DNA methylation of retrotransposon genes is regulated by Piwi family members MILI and MIWI2 in murine fetal testes // Genes Dev. - 2008 - 22(7):908-17.

79. Kuzmenko A., Yudin D., Ryazansky S., Kulbachinskiy A. and Aravin A.A. Programmable DNA cleavage by Ago nucleases from mesophilic bacteria Clostridium butyricum and Limnothrix rosea // Nucleic Acids Res. - 2019 - 47, 5822-5836.

80. Kuzmenko A., Oguienko A., Esyunina D., Yudin D., Petrova M., Kudinova A., Maslova, O., Ninova M., Ryazansky S., Leach D. et al. DNA targeting and interference by a bacterial Argonaute nuclease // Nature - 2020 - 587, 632-637.

81. Lahmy S., Pontier D., Bies-Etheve N., Laudie M., Feng S., Jobet E., Hale C.J., Cooke R., Hakimi M.A., Angelov D. et al. Evidence for ARGONAUTE4-DNA interactions in RNA-directed DNA methylation in plants // Genes Dev. -2016 - 30(23):2565-2570.

82. Lao Y.H., Li M., Gao M.A., Shao D., Chi C.W., Huang D., Chakraborty S., Ho T.C., Jiang W., Wang H.X. et al. HPV Oncogene Manipulation Using Nonvirally Delivered CRISPR/Cas9 or Natronobacterium gregoryi Argonaute // Adv. Sci. - 2018 - 5(7):1700540.

83. Lapinaite A., Doudna J.A. and Cate J.H.D. Programmable RNA recognition using a CRISPR-associated Argonaute // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2018

- 115, 3368-3373.

84. Lau N.C., Seto A.G., Kim J., Kuramochi-Miyagawa S., Nakano T., Bartel D.P., and Kingston R.E. Characterization of the piRNA complex from rat testes // Science - 2006 - 313(5785):363-7.

85. Lee R.C., Feinbaum R.L. and Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14 // Cell -1993 - 75, 843-854.

86. Lee S.H., Turchiano G., Ata H., Nowsheen S., Romito M., Lou Z., Ryu S.M., Ekker S.C., Cathomen, T., and Kim J.S. Failure to detect DNA-guided genome editing using Natronobacterium gregoryi Argonaute // Nat. Biotechnol. - 2016 -35(1): 17-18.

87. Lee Y., Ahn C., Han J., Choi H., Kim J., Yim J., Lee J., Provost P., Rädmark O., Kim S. et al. The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing // Nature - 2003 - 425(6956):415-9.

88. Li W., Liu Y., He R., Wang L., Wang Y., Zeng W., Zhang Z., Wang F., and Ma L. A programmable pAgo nuclease with RNA target preference from the psychrotolerant bacterium Mucilaginibacter paludis // Nucleic Acids Res. -2022 - 50, 5226-5238.

89. Lin H. and Spradling A.C. A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary // Development - 1997 - 124, 2463-2476.

90. Lisitskaya L., Aravin A.A. and Kulbachinskiy A. DNA interference and beyond: structure and functions of prokaryotic Argonaute proteins // Nat. Commun. - 2018 - 9(1):5165.

91. Lisitskaya L., Petushkov I., Esyunina D., Aravin A. and Kulbachinskiy A. Recognition of double-stranded DNA by the Rhodobacter sphaeroides Argonaute protein // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2020 - 533(4):1484-1489.

92. Lisitskaya L., Shin Y., Agapov A., Olina A., Kropocheva E., Ryazansky S., Aravin A.A., Esyunina D., Murakami K.S. and Kulbachinskiy A.

Programmable RNA targeting by bacterial Argonaute nucleases with unconventional guide binding and cleavage specificity // Nat. Commun. - 2022 - 13, 1-15.

93. Liu L.F. and Wang J.C. Supercoiling of the DNA template during transcription // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 1987 - 84, 7024-7027.

94. Liu W., Duttke S.H., Hetzel J., Groth M., Feng S., Gallego-Bartolome J., Zhong Z., Kuo H.Y., Wang Z., Zhai J. et al. RNA-directed DNA methylation involves co-transcriptional small-RNA-guided slicing of polymerase v transcripts in Arabidopsis // Nat. Plants - 2018a - 4(3): 181-188.

95. Liu Y., Esyunina D., Olovnikov I., Teplova M., Kulbachinskiy A., Aravin A.A., and Patel D.J. Accommodation of Helical Imperfections in Rhodobacter sphaeroides Argonaute Ternary Complexes with Guide RNA and Target DNA // Cell Rep. - 2018b - 24, 453-462.

96. Liu Y., Li W., Jiang X., Wang Y., Zhang Z., Liu Q., He R., Chen Q., Yang J., Wang L. et al. A programmable omnipotent Argonaute nuclease from mesophilic bacteria Kurthia massiliensis // Nucleic Acids Res. - 2021 -49(3):1597-1608.

97. Ma J.B., Yuan Y.R., Meister G., Pei Y., Tuschl T. and Patel D.J. Structural basis for 5' -end-specific recognition of guide RNA by the A. fulgidus Piwi protein // Nature - 2005 - 434, 666-670.

98. Ma X., Zuo Z., Shao W., Jin Y. and Meng Y. The expanding roles of Argonautes: RNA interference, splicing and beyond // Brief. Funct. Genomics -2018 - 17, 191-197.

99. Makarova K.S., Wolf Y.I., van der Oost J. and Koonin E. V. Prokaryotic homologs of Argonaute proteins are predicted to function as key components of a novel system of defense against mobile genetic elements // Biol. Direct -2009 - 4, 29.

100. Malone C.D. and Hannon G.J. Small RNAs as Guardians of the Genome // Cell - 2009 - 136(4):656-68.

101. Malone C.D., Brennecke J., Dus M., Stark A., McCombie W.R.,

Sachidanandam R., and Hannon G.J. Specialized piRNA Pathways Act in Germline and Somatic Tissues of the Drosophila Ovary // Cell - 2009 -137(3):522-35.

102. Martinez J., Patkaniowska A., Urlaub H., Lührmann R. and Tuschl T. Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi // Cell -2002 - 110, 563-574.

103. Matsumoto N., Nishimasu H., Sakakibara K., Nishida K.M., Hirano T., Ishitani R., Siomi H., Siomi M.C. and Nureki O. Crystal Structure of Silkworm PIWI-Clade Argonaute Siwi Bound to piRNA // Cell - 2016 - 167, 484-497.e9.

104. Meister G. Argonaute proteins: Functional insights and emerging roles // Nat. Rev. Genet. - 2013 - 14, 447-459.

105. Meister G., Landthaler M., Patkaniowska A., Dorsett Y., Teng G. and Tuschl T. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs // Mol. Cell - 2004 - 15, 185-197.

106. Menon S.K., Eilers B.J., Young M.J. and Lawrence C.M. The Crystal Structure of D212 from Sulfolobus Spindle-Shaped Virus Ragged Hills Reveals a New Member of the PD-(D/E)XK Nuclease Superfamily // J. Virol. -2010 - 84, 5890-5897.

107. Miesen P., Ivens A., Buck A.H. and van Rij R.P. Small RNA Profiling in Dengue Virus 2-Infected Aedes Mosquito Cells Reveals Viral piRNAs and Novel Host miRNAs. PLoS Negl. Trop. Dis. - 2016a - 10(2):e0004452.

108. Miesen P., Joosten J. and van Rij R.P. PIWIs Go Viral: Arbovirus-Derived piRNAs in Vector Mosquitoes // PLoS Pathog. - 2016b - 12(12):e1006017.

109. Miyoshi T., Ito K., Murakami R. and Uchiumi T. Structural basis for the recognition of guide RNA and target DNA heteroduplex by Argonaute // Nat. Commun. - 2016 - 7, 1-12.

110. Moazed D. Small RNAs in transcriptional gene silencing and genome defence // Nature - 2009 - 457(7228):413-20.

111. Mussabekova A., Daeffler L. and Imler J.L. Innate and intrinsic antiviral immunity in Drosophila // Cell Mol. Life Sci. - 2017 - 74(11):2039-2054.

112. Nakanishi K., Weinberg D.E., Bartel D.P. and Patel D.J. Structure of yeast Argonaute with guide RNA // Nature - 2012 - 486, 368-374.

113. Nakanishi K., Ascano M., Gogakos T., Ishibe-Murakami S., Serganov A.A., Briskin D., Morozov P., Tuschl T. and Patel D.J. Eukaryote-Specific Insertion Elements Control Human ARGONAUTE // Slicer Activity. Cell Rep. - 2013 -3, 1893-1900.

114. Nelles D.A., Fang M.Y., O'Connell M.R., Xu J.L., Markmiller S.J., Doudna J.A. and Yeo G.W. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9 // Cell - 2016 - 165(2):488-96.

115. Nudler E. RNA polymerase backtracking in gene regulation and genome instability // Cell - 2012 - 149(7):1438-45.

116. Nykänen A., Haley B. and Zamore P.D. ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway // Cell - 2001 -107(3):309-21.

117. O'Connell M.R., Oakes B.L., Sternberg S.H., East-Seletsky A., Kaplan M. and Doudna J.A. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9 // Nature - 2014 - 516(7530):263-6.

118. Olina A., Kuzmenko A., Ninova M., Aravin A.A., Kulbachinskiy A. and Esyunina D. Genome-wide DNA sampling by Ago nuclease from the cyanobacterium Synechococcus elongatus // RNA Biol. - 2020 - 17, 677-688.

119. Olina A. V., Kulbachinskiy A. V., Aravin A.A. and Esyunina D.M. Argonaute Proteins and Mechanisms of RNA Interference in Eukaryotes and Prokaryotes // Biochem. - 2018 - 83(5):483-497.

120. Olovnikov I., Chan K., Sachidanandam R., Newman D.K. and Aravin A.A. Bacterial Argonaute Samples the Transcriptome to Identify Foreign DNA // Mol. Cell - 2013 - 51, 594-605.

121. Park J.H., Shin S.Y. and Shin C. Non-canonical targets destabilize microRNAs in human Argonautes // Nucleic Acids Res. - 2017a - 45(4):1569-1583.

122. Park M.S., Phan H.D., Busch F., Hinckley S.H., Brackbill J.A., Wysocki

V.H. and Nakanishi K. Human Argonaute3 has slicer activity. Nucleic Acids Res. - 2017b - 45, 11867-11877.

123. Parker J.S., Roe S.M. and Barford D. Crystal structure of a PIWI protein suggests mechanisms for siRNA recognition and slicer activity // EMBO J. -2004 - 23, 4727-4737.

124. Parker J.S., Roe S.M. and Barford D. Structural insights into mRNA recognition from a PIWI domain-siRNA guide complex // Nature - 2005 - 434, 663-666.

125. Parker J.S., Parizotto E.A., Wang M., Roe S.M. and Barford D. Enhancement of the Seed-Target Recognition Step in RNA Silencing by a PIWI/MID Domain Protein // Mol. Cell - 2009 - 33, 204-214.

126. Peters L. and Meister G. Argonaute Proteins: Mediators of RNA Silencing // Mol. Cell - 2007 - 26, 611-623.

127. Pezic D., Manakov S.A., Sachidanandam R. and Aravin A.A. piRNA pathway targets active LINE1 elements to establish the repressive H3K9me3 mark in germ cells // Genes Dev. - 2014 - 28, 1410-1428.

128. Pratt A.J. and MacRae I.J. The RNA-induced silencing complex: A versatile gene-silencing machine // J. Biol. Chem. - 2009 - 284, 17897-17901.

129. Proshkin S., Rachid Rahmouni A., Mironov A. and Nudler E. Cooperation between translating ribosomes and RNA polymerase in transcription elongation // Science - 2010 - 328(5977):504-8.

130. Pumplin N. and Voinnet O. RNA silencing suppression by plant pathogens: Defence, counter-defence and counter-counter-defence // Nat. Rev. Microbiol. - 2013 - 11(11):745-60.

131. Qi L.S., Larson M.H., Gilbert L.A., Doudna J.A., Weissman J.S., Arkin A.P., and Lim W.A. Repurposing CRISPR as an RNA-yuided platform for sequence-specific control of gene expression // Cell - 2013 - 152(5):1173-83.

132. Quax T.E.F., Claassens N.J., Söll D. and van der Oost J. Codon Bias as a Means to Fine-Tune Gene Expression // Mol. Cell. - 2015 - 59(2): 149-61.

133. Rashid U.J., Paterok D., Koglin A., Gohlke H., Piehler J. and Chen J.C.H.

Structure of Aquifex aeolicus argonaute highlights conformational flexibility of the PAZ domain as a potential regulator of RNA-induced silencing complex function // J. Biol. Chem. - 2007 - 282, 13824-13832.

134. Rivas F. V., Tolia N.H., Song J.J., Aragon J.P., Liu J., Hannon G.J. and Joshua-Tor L. Purified Argonaute2 and an siRNA form recombinant human RISC // Nat. Struct. Mol. Biol. - 2005 - 12, 340-349.

135. Rogers A.K., Situ K., Perkins E.M. and Toth K.F. Zucchini-dependent piRNA processing is triggered by recruitment to the cytoplasmic processing machinery // Genes Dev. - 2017 - 31(18):1858-1869.

136. Rozhkov N. V., Hammell M. and Hannon G.J. Multiple roles for Piwi in silencing Drosophila transposons // Genes Dev. - 2013 - 27(4):400-12.

137. Ryazansky S., Kulbachinskiy A. and Aravin A.A. The Expanded Universe of Prokaryotic Argonaute Proteins // MBio - 2018 - 9, 1-20.

138. Sakakibara K. and Siomi M.C. The PIWI-Interacting RNA Molecular Pathway: Insights From Cultured Silkworm Germline Cells // BioEssays - 2018 - 40(1).

139. Salomon W.E., Jolly S.M., Moore M.J., Zamore P.D. and Serebrov V. Single-Molecule Imaging Reveals that Argonaute Reshapes the Binding Properties of Its Nucleic Acid Guides // Cell - 2015 - 162, 84-95.

140. Schalk C., Cognat V., Graindorge S., Vincent T., Voinnet O. and Molinier J. Small RNA-mediated repair of UV-induced DNA lesions by the DNA damage-binding protein 2 and argonaute 1 // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2017 -114, E2965-E2975.

141. Schirle N.T. and MacRae I.J. The crystal structure of human argonaute2 // Science - 2012 - 336, 1037-1040.

142. Schirle N.T., Sheu-Gruttadauria J. and MacRae I.J. Structural basis for microRNA targeting // Science - 2014 - 346, 608-613.

143. Sheng G., Zhao H., Wang J., Rao Y., Tian W., Swarts D.C., Van Der Oost J., Patel D.J. and Wang Y. Structure-based cleavage mechanism of Thermusthermophilus argonaute DNA guide strand-mediated DNA target

cleavage // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2014 - 111, 652-657.

144. Sheng G., Gogakos T., Wang J., Zhao H., Serganov A., Juranek S., Tuschl T., Patel D.J. and Wang Y. Structure/cleavage-based insights into helical perturbations at bulge sites within T. thermophilus Argonaute silencing complexes // Nucleic Acids Res. - 2017 - 45, 9149-9163.

145. Sheu-Gruttadauria J. and MacRae I.J. Structural Foundations of RNA Silencing by Argonaute // J. Mol. Biol. - 2017 - 429(17):2619-2639.

146. Shiimori M., Garrett S.C., Graveley B.R. and Terns M.P. Cas4 Nucleases Define the PAM, Length, and Orientation of DNA Fragments Integrated at CRISPR Loci // Mol. Cell - 2018 - 70(5):814-824.

147. Sienski G., Donertas D. and Brennecke J. Transcriptional silencing of transposons by Piwi and maelstrom and its impact on chromatin state and gene expression // Cell - 2012 - 151(5):964-80.

148. Siomi M.C., Sato K., Pezic D. and Aravin A.A. PlWI-interacting small RNAs: The vanguard of genome defence // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2011 -12(4):246-58.

149. Song J., Hegge J.W., Mauk M.G., Chen J., Till J.E., Bhagwat N., Azink L.T., Peng J., Sen M., Mays J., et al. Highly specific enrichment of rare nucleic acid fractions using Thermus thermophilus argonaute with applications in cancer diagnostics // Nucleic Acids Res. - 2020 - 48(4):e19.

150. Song J.J., Smith S.K., Hannon G.J. and Joshua-Tor L. Crystal structure of argonaute and its implications for RISC slicer activity // Science - 2004 - 305, 1434-1437.

151. Steczkiewicz K., Muszewska A., Knizewski L., Rychlewski L. and Ginalski K. SURVEY AND SUMMARY: Sequence, structure and functional diversity of PD-(D/E)XK phosphodiesterase superfamily // Nucleic Acids Res. - 2012 -40, 7016-7045.

152. Strotskaya A., Savitskaya E., Metlitskaya A., Morozova N., Datsenko K.A., Semenova E. and Severinov K. The action of Escherichia coli CRISPR-Cas system on lytic bacteriophages with different lifestyles and development

strategies // Nucleic Acids Res. - 2017 - 45(4): 1946-1957.

153. Sun G., Wang J., Huang Y., Yuan C.W.Y., Zhang K., Hu S., Chen L., Lin R.J., Yen Y. and Riggs A.D. Differences in silencing of mismatched targets by sliced versus diced siRNAs // Nucleic Acids Res. - 2018 - 46(13):6806-6822.

154. Swarts D.C., Makarova K., Wang Y., Nakanishi K., Ketting R.F., Koonin E. V., Patel D.J. and Van Der Oost J. The evolutionary journey of Argonaute proteins // Nat. Struct. Mol. Biol. - 2014a - 21, 743-753.

155. Swarts D.C., Jore M.M., Westra E.R., Zhu Y., Janssen J.H., Snijders A.P., Wang Y., Patel D.J., Berenguer J., Brouns S.J.J. et al. DNA-guided DNA interference by a prokaryotic Argonaute // Nature - 2014b - 507, 258-261.

156. Swarts D.C., Koehorst J.J., Westra E.R., Schaap P.J. and Van Der Oost J. Effects of argonaute on gene expression in Thermus thermophilus // PLoS One

- 2015a - 10, 1-13.

157. Swarts D.C., Hegge J.W., Hinojo I., Shiimori M., Ellis M.A., Dumrongkulraksa J., Terns R.M., Terns M.P. and Van Der Oost J. Argonaute of the archaeon Pyrococcus furiosus is a DNA-guided nuclease that targets cognate DNA // Nucleic Acids Res. - 2015b - 43, 5120-5129.

158. Swarts D.C., Szczepaniak M., Sheng G., Chandradoss S.D., Zhu Y., Timmers E.M., Zhang Y., Zhao H., Lou J., Wang Y. et al. Autonomous Generation and Loading of DNA Guides by Bacterial Argonaute // Mol. Cell -2017 - 65, 985-998.e6.

159. Le Thomas A., Rogers A.K., Webster A., Marinov G.K., Liao S.E., Perkins E.M., Hur J.K., Aravin A.A. and Toth K.F. Piwi induces piRNA-guided transcriptional silencing and establishment of a repressive chromatin state // Genes Dev. - 2013 - 27(4):390-9.

160. Tolia N.H. and Joshua-Tor L. Slicer and the Argonautes // Nat. Chem. Biol.

- 2007 - 3(1):36-43.

161. Tomari Y., Du T. and Zamore P.D. Sorting of Drosophila Small Silencing RNAs // Cell - 2007 - 130(2):299-308.

162. Vagin V. V., Sigova A., Li C., Seitz H., Gvozdev V. and Zamore P.D. A

distinct small RNA pathway silences selfish genetic elements in the germline // Science - 2006 - 313(5785):320-4.

163. Vaucheret H. Plant ARGONAUTES // Trends Plant Sci. - 2008 - 1640:1-21.

164. Verdel A., Jia S., Gerber S., Sugiyama T., Gygi S., Grewal S.I.S. and Moazed D. RNAi-Mediated Targeting of Heterochromatin by the RITS Complex // Science - 2004 - 303(5658):672-6.

165. Volpe T.A., Kidner C., Hall I.M., Teng G., Grewal S.I.S. and Martienssen R.A. Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi // Science - 2002 - 297(5588): 1833-7.

166. Wang, Y., Juranek S., Li H., Sheng G., Tuschl T., and Patel D.J. Structure of an argonaute silencing complex with a seed-containing guide DNA and target RNA duplex // Nature - 2008a - 456, 921-926.

167. Wang Y., Sheng G., Juranek S., Tuschl T. and Patel D.J. Structure of the guide-strand-containing argonaute silencing complex // Nature - 2008b - 456, 209-213.

168. Wang Y., Juranek S., Li H., Sheng G., Wardle G.S., Tuschl T. and Patel D.J. Nucleation, propagation and cleavage of target RNAs in Ago silencing complexes // Nature - 2009 - 461, 754-761.

169. Webster A., Li S., Hur J.K., Wachsmuth M., Bois J.S., Perkins E.M., Patel D.J. and Aravin A.A. Aub and Ago3 Are Recruited to Nuage through Two Mechanisms to Form a Ping-Pong Complex Assembled by Krimper // Mol. Cell - 2015 - 59, 564-575.

170. Wee, L.M., Flores-Jasso, C.F., Salomon, W.E., and Zamore, P.D. Argonaute divides Its RNA guide into domains with distinct functions and RNA-binding properties // Cell - 2012 - 151, 1055-1067.

171. Wei W., Ba Z., Gao M., Wu Y., Ma Y., Amiard S., White C.I., Danielsen J.M.R., Yang Y.G. and Qi Y. A role for small RNAs in DNA double-strand break repair // Cell - 2012 - 149(1): 101-12.

172. Westra, E.R., Buckling, A., and Fineran, P.C. CRISPR-Cas systems: Beyond adaptive immunity // Nat. Rev. Microbiol. - 2014 - 12(5):317-26.

173. Wightman B., Ha I., and Ruvkun G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans // Cell - 1993 - 75, 855-862.

174. Willkomm S., Zander A., Gust A. and Grohmann D. A prokaryotic twist on Argonaute function // Life - 2015 - 5, 538-553.

175. Willkomm S., Zander A., Grohmann D. and Restle T. Mechanistic insights into archaeal and human argonaute substrate binding and cleavage properties // PLoS One - 2016 - 11, 1-21.

176. Willkomm S., Oellig C.A., Zander A., Restle T., Keegan R., Grohmann D., and Schneider S. Structural and mechanistic insights into an archaeal DNA-guided Argonaute protein // Nat. Microbiol. - 2017a - 2, 1-7.

177. Willkomm S., Oellig C.A., Zander A., Restle T., Keegan R., Grohmann D., and Schneider S. Structural and mechanistic insights into an archaeal DNA-guided Argonaute protein // Nat. Microbiol. - 2017b - 2 /17035.

178. Willkomm S., Makarova K.S. and Grohmann D. DNA silencing by prokaryotic Argonaute proteins adds a new layer of defense against invading nucleic acids // FEMS Microbiol. Rev. - 2018 - 42, 376-387.

179. Wu H.Y., Shyy S., Wang J.C. and Liu L.F. Transcription generates positively and negatively supercoiled domains in the template // Cell - 1988 -53(3):433-40.

180. Wu Z., Tan S., Xu L., Gao L., Zhu H., Ma C. and Liang X.. NgAgo-gDNA system efficiently suppresses hepatitis B virus replication through accelerating decay of pregenomic RNA // Antiviral Res. - 2017 - 145, 20-23.

181. Yan K.S., Yan S., Farooq A., Han A., Zeng L. and Zhou M.M. Structure and conserved RNA binding of the PAZ domain // Nature - 2003 - 426, 469-474.

182. Yang S., Maurin T., Robine N., Rasmussen K.D., Jeffrey K.L., Chandwani R., Papapetrou E.P., Sadelain M., O'Carroll D. and Lai E.C. Conserved vertebrate mir-451 provides a platform for Dicer-independent, Ago2-mediated microRNA biogenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2010 -107(34):15163-8.

183. Yuan Y.R., Pei Y., Ma J.B., Kuryavyi V., Zhadina M., Meister G., Chen H.Y., Dauter Z., Tuschl T. and Patel D.J. Crystal structure of A. aeolicus argonaute, a site-specific DNA-guided endoribonuclease, provides insights into RISC-mediated mRNA cleavage // Mol. Cell - 2005 - 19, 405-419.

184. Yuan Y.R., Pei Y., Chen H.Y., Tuschl T. and Patel D.J. A Potential Protein-RNA Recognition Event along the RISC-Loading Pathway from the Structure of A. aeolicus Argonaute with Externally Bound siRNA // Structure - 2006 -14, 1557-1565.

185. Zander A., Holzmeister P., Klose D., Tinnefeld P. and Grohmann D. Single-molecule FRET supports the two-state model of argonaute action // RNA Biol.

- 2014 - 11, 45-56.

186. Zander A., Willkomm S., Ofer S., Van Wolferen M., Egert L., Buchmeier S., Stöckl S., Tinnefeld P., Schneider S., Klingl A. et al. Guide-independent DNA cleavage by archaeal Argonaute from Methanocaldococcus jannaschii // Nat. Microbiol. - 2017 - 2 :17034.

187. Zeng Z., Chen Y., Pinilla-Redondo R., A Shah S., Zhao F., Wang C., Hu Z., Zhang C., Whitaker R.J., She Q. et al. A Short Prokaryotic Argonaute Activates Membrane Effector to Confer Antiviral Defense // SSRN Electron. J.

- 2021 - 30(7):930-943.e6.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Приложение 1. Последовательности матриц, используемых для

экспериментов с RsAgo

Т7А1-5Ьо1Ч (ЩЖ+пЩЖ, 102 п.н.):

-35 -10 +1

5' ОААААТТТАТСАААААОАОТАТТСАСТТАААСТСТААССТАТАССАТАСТТАСАСССАТССАСАСССАСАССТССАСТАСТСАССТСАСТССАТТСССАТйС 3'

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I

3' СТТТТАААТАЕТТТТТСТСАТААСТСААТТТСАСАТТССАТАТССТАТСААТСТСССТАССТСТСССТСТССАССТСАТСАСТССАСТСАССТААСССТАСС 5'

I I I I I I I I I I I I I I I I I I

5' иСиААССиАиАСИШАСи 3' дКЫА Т7А1

Т7А1-8ЬоН-ЬиЬЫе (1ДПК-ШиЛТПу 102 п.н.):

Т7А1ЬиЬЫеИТ

5' (5ААААТТТАТСААААА(5АСТАТТаАСТТААА2 ТАСАСССАТССАСАССеАСАССТСеАСТАСТСАССТеАСТСеАТТССеАТСС 3'

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I

3' СТТТТАААТАСТТТТТСТС^ТААСТеААТТТСАСАТТСОАТАТССТАТОААТСТСССТАССТСТСССТСТССАССТаАТСАСТСаАСТСАССТААСССТАСС 5'

I I I I I I I I I I I I I I I I I I

5' иСЧААССиШАЕвШАСи 3' дКНА Т7А1

Т7А1-1опа ЩЦР-продукт, 249 п.н.):

-35 -10

5' ССТОАОААТАТТСТАОСАСАТСТТСТАОАААОАТСААТТСТАТТТйСАТССАСАТССССААААТТТАТСАААААСАСТАТТЕАСТТАААйТСТААССТАТАйОАТАСТ . .

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II

3' СОАСТСТТАТААСАТССТСТАОААСАТСТТТСТАСТТААСАТАААССТАйСТСТАССССТТТТАААТАСТТТТТСТСАТААСТСААТТТСАСАТТйСАТАТССТАТСА . .

I I I I I I I I I I I I I I I I I I

5' исиААССиАиА££АиАСи 3' дЕЫА Т7А1

+1

. . ТАСАСССАТССАСАСеСАСАССТССАСТАеТСАССТСАСТСеАТТесеАТСеССТеАеТССАТТСеСАТеСАТСТТССТеАААААСТСеАОССАТССеСААеАТСТСе.. 1111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111II

..АТСТСеСТАеСТСТСССТСТСеАеСТСАТСАеТССАСТСАССТААСССТАССССАСТСАССТААСССТАССТАСААССАСТТТТТОАОСТСеСТАССССТТСТАСАСС..

111111111111111111

5' тКЗСиСЙААААСиСеАбС 3' дКЫА ХЬо1

,.сесссестстссстАТАетеАетсвтАТТАсес 3' 111111111111111111111111111111111 ..ессоесеАеАеоеАТАТСАСтсАвсАТААтесе 5'

Приложение 2. Характеристика опубликованных структур белков pAgo и их комплексов с гидовой и целевой

нуклеиновыми кислотами

Ago / Организм Специфичность к нуклеиновым кислотам in vitro Структурные особенности С с ы л к и

Активный сайт MID-карман Связанные нуклеиновые кислоты PDB ID

Гид Мишень Каталитическая тетрада Позиция Glu-пальца; Me2+ Гид / мишень в структуре Схема (гидовая цепь, синяя; мишень, черная; неспаренные основания, подчеркнуты; нуклеотиды, не отображенные в структуре, серые)

AaAgo Aquifex aeolicus гипертермофильная бактерия ДНК РНК (ДНК неизвестно) D502E541 D571D683 Открытая Пустой Нет - 1YVU 1

Открытая Пустой Симметричный 22 нт РНК дуплекс 5 'P-AGACAGCAUAUAUGCUGUCUUU-3' 3'-UUUCUGUC GUAUAUACGACAGA-P5 ' Связан с поверхностью PAZ домена 2F8S 2

Открытая Пустой Симметричный 26 нт РНК дуплекс 5 'P-AGACAGCAUGCAUGCAUGCUGUCUUU-3' 3'-UUUCUGUC GUAC GUACGUACGACAGA-P5 ' Связан с поверхностью PAZ домена 2F8T

Открытая Пустой Нет - 2NUB 3

AfAgo Archaeoglobus fulgidus гипертермофильная архея ДНК (РНК) ДНК (РНК, низкая активность) Неактивным (G186, E221 r257 k394) , - Пустой Нет - 1W9H 4

5-P, Mn2+ Симметричный 16 нт РНК дуплекс 5 'P-UUCGACGCGUCGAAUU-3 ' 3 '-UUAAGCUGCGCAGCUU-P5 ' 2BGG 5

5'-P, Mg2+ Симметричный 21 нт РНК дуплекс 5 'P-AGACAGCAUUAUGCUGUCUUU-3 ' 3'-UUUCUGUCGUAUUACGACAGA-P5' 1YTU 6

5-P, Mn2+ Симметричный 16 нт ДНК дуплекс 5'P-TTCGACGCGTCGAATT-3' 3 '-TTAAGCTGCGCAGCTT-P5 ' 2W42 7

CbAgo Clostridium butyricum мезофильная бактерия ДНК (РНК, низкая активность) ДНК (РНК, низкая активность) D541,E577, D611, D727 Закрытая, мутант по Б541Л, Б611Л 5'-Р, Мв2+ 21 нт ДНК-г / 19 нт ДнК-м 5 'P-CGAGGTAGTAGGTTGTATAGT-3' 3'-TCTCCATCATCCAACATAT-5' 6QZK 8

MpAgo РНК ДНК (РНК, D446 £482 D515, N624 Открытая 5'-ОН 21 нт РНК-г 5'OH-UAUACAACCUACUACCUCAUU-3' 5I4A 9

Marinitoga piezophila термо-пьезофильная бактерия низкая активность) Открытая 5'-ОН 21 нт РНК-г / 21 нт ДНК-м 5 'OH-GGUACAACCUACUACCUCAUU-3' 3'-CCATGTTGGATGATGGAGTAA-P5' 5UX0 10

MjAgo ДНК ДНК D504 £541 D570 d688 Открытая Пустой Нет - 5G5S 11

Methanocaldo-coccus jannaschii Открытая 5' -Р, Ме2+ 21 нт ДНК-г 5 'P-TGAGGTAGTAGGTTGTATAGT-3 'I 5G5T

гипертермофильная архея

PfAgo ДНК ДНК D558 £596 D628 H745 Открытая Пустой Нет - 1U04 12

Pyrococcus furiosus Открытая Мп2+ Пустой Нет - 1Z25 13

гипертермофильная архея Открытая Пустой Нет 1Z26

RsAgo ШгоёоЬаМег (СегеЛаМег) яр1гаего1ёе8 РНК ДНК Неактивный (О529, £569 £[605 £746) Открытая 5'-Р, Мё2+

альфа-протеобактерия

18 нт РНК-г/ 18 нт ДНК-м 5 'P-UUACAACCUACUACCUCG-3' 3 '-AATGTTGGATGATGGAGC-5' 5AWH 14

18 нт РНК-г/ 24 нт ДНК-м 5 'P-UUACUGCACAGGUGACGA-3' 3'- CAATGACGTGTCCACTGCTGT -5' 6D8P 15

18 нт РНК-г/ 24 нт ДНК-м 5 'P-UUACUGCACAGGUGACGA-3' 3'- CAAGACGTGTCCACTGCTGT -5' Некомплементарные нт (АЗ-АЗ' пара) 6D92

18 нт РНК-г/ 24 нт ДНК-м 5 'P-UUACUGCACAGGUGACGA-3' 3'- CAATGACGAGTCCACTGCTGT -5' Некомплементарные нт (А8-А8' пара) 6D95

18 нт РНК-г/ 24 нт ДНК-м 5 'P-UUACUGCACAGGUGACGA-3' 3'- CAATGACGGGTCCACTGCTGT -5' Некомплементарные нт (A8-G8' пара) 6D9K

18 нт РНК-г/ 24 нт ДНК-м 5 'P-UUACUGC GC AGGUGAC GA-3' 3'- CAATGACGAGTCCACTGCTGT -5' Не комплементарные нт (G8-A8' пара) 6D9L

18 нт РНК-г/ 26 нт ДНК-м t-3'A4', А5' 5'P-UUA CUGC АС AGGUGAC GA-3' 3'- CAAT GACGTGTCCACTGCTGT -5' AA Дополнительные аденозины выпячиваются из дуплекса (А-А петля) 6D8A

18 нт РНК-г/ 26 нт ДНК-м t-3'T4\ Т5' 5'P-UUA CUGCACAGGUGACGA-3' 3'- CAAT GACGTGTCCACTGCTGT -5' ТТ Дополнительные тимины выпячиваются из дуплекса (Т-Т петля) 6D8F

TtAgo ДНК ДНК (РНК, Б478,Б512, ^546 рбб° Открытая Пустой 10 нт ДНК-г 5 'Р-ТОАООТАОТА-3' ЗБЬБ 16

Thermus thermophilus низкая актив- Открытая 5'-Р, Ме2+ 21 нт ДНК-г 5 'Р-ТОАООТАОТАООТТОТАТАОТ-З' ЗБЬИ

термофильная бактерия ность) Открытая 5' -Р, Мв2+ 21 нт ДНК-г/ 12 нт ДНК-м 5 'Р-ТОАООТАОТАООТТОТАТАОТ-3' 3 '-£СТССАТСАТСС-5' 4N47 17

Открытая 5'-Р, Мв2+ 21 нт ДНК-г/ 15 нт ДНК-м 5 'Р-ТОАООТАОТАООТТОТАТАОТ-3' 3 '-£СТССАТСАТССААС-5' 4N41

Закрытая, 2 Ме2+ 5'-Р, Мв2+ 21 нт ДНК-г/ 19 нт ДНК-м 5'Р-ТОАООТАОТАООТТОТАТАОТ-3' 3'-£СТССАТСАТССААСАТАТ-5' Л Расщепление между позициями 10'-11'гида 4NCB

Закрытая, 2 Ме2+ 5'-Р, Ме2+ 21 нт ДНК-г/ 16 нт ДНК-м 5'Р-ТОАООТАОТАООТТОТАТАОТ-3' 3'-£СТССАТСАТССААСА-5' Л Расщепление между позициями 10'-11'гида 4NCA

Закрытая, 2 Мп2+ 5'-Р, Мп2+ 21 нт ДНК-г/ 19 нт ДНК-м 5'Р-ТОАООТАОТАООТТОТАТАОТ-3' 3'-£СТССАТСАТССААСАТАТ-5' Л Расщепление между позициями 10'-11'гида 4КРУ

Открытая 5'-Р, Мп2+ 21 нт ДНК-г/ 19 нт ДНК-м 5'Р-ТОАООТАОТАООТТОТАТАОТ-3' 3'-£СТССАТСАТ Л Расщепление между позициями 10'-11'гида и предварительно прогреты до 55°С перед кристаллизацией 4N76

Открытая 5-Р, Мв2+ 21 нт ДНК-г/ 20 нт РНК-м 5'Р-ТОАООТАОТАООТТОТАТАОТ-3' 3'-и£СиССАиСАСиСААСАиАи-5' Некомплементарные нт 10-11 позиции гида 3НХМ 18

Открытая, 5'-Р, Ме2+ 21 нт ДНК-г/ 20 нт РНК-м 5'Р-ТОАООТАОТАООТТОТАТАОТ-3' 3'-иОСиССАиСАСиСААСЛиЛи-5' Некомплементарные нт 10-11 позиции гида 3Е73 19

Открытая, мутант по Б546К 5' -Р, Мв2+ 21 нт ДНК-г/ 12 нт РНК-м 5 'Р-ТОАООТАОТАООТТОТАТАОТ-3' 3 '-ОСиССАиСАиСС-5' 3Н01 18

Закрытая, 2 Ме2+ 5'-Р, Mg2+ 21 нт ДНК-г/ 19 нт РНК-м 5 'Р-ТОАООТАОТАООТТОТАТАОТ-3' 3 '-ОСиССАиСАиССААСАиАи-5' 3НУЯ

Закрытая, Ме2+ 5'-Р, Мв2+ 21 нт ДНК-г/ 19 нт РНК-м 5 'Р-ТОАООТАОТАООТТОТАТАОТ-3' 3 '-ОСиССАиСАиССААСАиАи-5' 3НМ9

Закрытая, мутант по Б546Б 5'-Р, Мв2+ 21 нт ДНК-г/ 15 нт РНК-м 5 'Р-ТОАООТАОТАООТТОТАТАОТ-3' 3 '-ОСиССАиСАиССААС-5' 3ШЕ

Закрытая, Мв2+, мутант по Б478К 5'-Р, Ме2+ 21 нт ДНК-г/ 19 нт РНК-м 5'Р-ТОАООТАОТАООТТОТАТАОТ-3' 3'-GCUCCAUCAUCCЛЛCAUAU-5' 3НК2

Закрытая, 2 Ме2+ 5'-Р, Мв2+ 22 нт ДНК-г/ 19 нт ДНК-м 8-4А5 5 'Р-ТОАОАОТАОТАООТТОТАТАОТ-3' 3'-ОСТС_САТСАТССААСА 1АБ-5' Ослабленные уотсон-криковские пары 06-С5 5ХР8 20

Открытая, мутант по Б546К 5' -P 22 нт ДНК-г/ 19 нт ДНК-м g-5A6 5 'P-TGAGGATAGTAGGTTGTATAGT-3' 3'-GCTCC_ATCATCCAACA UAU -5' Ослабленные уотсон-криковские пары G5-C5 5XQ2

Открытая, мутант по Б546К 5' -P, Mg2+ 22 нт ДНК-г/ 19 нт ДНК-м g-7T8 5 'P-TGAGGTATGTAGGTTGTATAGT-3' 3'-GCTCCAT_CATCCAACA JAU-5' Ослабленные уотсон-криковские пары A7-T7, G9-C8 5XOU

Открытая, мутант по Б546К 5' -P, Mg2+ 21 нт ДНК-г/ 20 нт РНК-м t-6 ' U7' 5'P-TGAGGT AGTAGGTTGTATAGT-3' 3'-GCUCCA ACAUCCAACAUAU-5' U Урацил выпячивается из дуплекса; неканонические пары A-A, ослабленные уотсон-криковские пары T6-A6 5XPG

Открытая, мутант по Б546К 5'-P, Mg2+ 21 нт ДНК-г/ 20 нт РНК-м t-6' А7' 5'P-TGAGGT AGTAGGTTGTATAGT-3' 3'-GCUCCA UCAUCCAACAUAU-5' A Аденин выпячивается из дуплекса, ослабленные уотсон-криковские пары T6-A6 5XOW

Открытая, мутант по Б546К 5'-P, Mg2+ 21 нт ДНК-г/ 20 нт РНК-м t-9 ' U10' 5'P-TGAGGTAGT AGGTTGTATAGT-3' 3'-GCUCCAUCU GCCAACAUAU-5' U Урацил выпячивается из дуплекса 5XPA

Ссылки к Приложению 2

1. Yuan, Y.R. et al. Crystal structure of A. aeolicus argonaute, a site-specific DNA-guided endoribonuclease, provides insights into RISC-mediated mRNA cleavage. Mol Cell 19, 405-19 (2005).

2. Yuan, Y.R., Pei, Y., Chen, H.Y., Tuschl, T. & Patel, D.J. A potential protein-RNA recognition event along the RISC-loading pathway from the structure of A. aeolicus Argonaute with externally bound siRNA. Structure 14, 1557-65 (2006).

3. Rashid, U.J. et al. Structure of Aquifex aeolicus argonaute highlights conformational flexibility of the PAZ domain as a potential regulator of RNA-induced silencing complex function. J Biol Chem 282, 13824-32 (2007).

4. Parker, J.S., Roe, S.M. & Barford, D. Crystal structure of a PIWI protein suggests mechanisms for siRNA recognition and slicer activity. EMBOJ23, 472737 (2004).

5. Parker, J.S., Roe, S.M. & Barford, D. Structural insights into mRNA recognition from a PIWI domain-siRNA guide complex. Nature 434, 663-6 (2005).

6. Ma, J.B. et al. Structural basis for 5'-end-specific recognition of guide RNA by the A. fulgidus Piwi protein. Nature 434, 666-70 (2005).

7. Parker, J.S., Parizotto, E.A., Wang, M., Roe, S.M. & Barford, D. Enhancement of the seed-target recognition step in RNA silencing by a PIWI/MID domain protein. Mol Cell 33, 204-14 (2009).

8. Hegge J. W. et al. DNA-guided DNA cleavage at moderate temperatures by Clostridium butyricum Argonaute. Nucleic acids research 47, 11, 5809-5821 (2019).

9. Kaya, E. et al. A bacterial Argonaute with noncanonical guide RNA specificity. Proc Natl Acad Sci U S A 113, 4057-62 (2016).

10. Doxzen, K.W. & Doudna, J.A. DNA recognition by an RNA-guided bacterial Argonaute. PLoS One 12, e0177097 (2017).

11. Willkomm, S. et al. Structural and mechanistic insights into an archaeal DNA-guided Argonaute protein. Nat Microbiol 2, 17035 (2017).

12. Song, J.J., Smith, S.K., Hannon, G.J. & Joshua-Tor, L. Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science 305, 1434-7 (2004).

13. Rivas, F.V. et al. Purified Argonaute2 and an siRNA form recombinant human RISC. Nat Struct Mol Biol 12, 340-9 (2005).

14. Miyoshi, T., Ito, K., Murakami, R. & Uchiumi, T. Structural basis for the recognition of guide RNA and target DNA heteroduplex by Argonaute. Nat Commun 7, 11846 (2016).

15. Liu, Y. et al. Accommodation of helical imperfections in Rhodobacter sphaeroides Argonaute ternary complexes with guide RNA and target DNA. Cell Reports 24, 453-462 (2018).

16. Wang, Y., Sheng, G., Juranek, S., Tuschl, T. & Patel, D.J. Structure of the guide-strand-containing argonaute silencing complex. Nature 456, 209-13 (2008).

17. Sheng, G. et al. Structure-based cleavage mechanism of Thermus thermophilus Argonaute DNA guide strand-mediated DNA target cleavage. Proc Natl Acad Sci U S A 111, 652-7 (2014).

18. Wang, Y. et al. Nucleation, propagation and cleavage of target RNAs in Ago silencing complexes. Nature 461, 754-61 (2009).

19. Wang, Y. et al. Structure of an argonaute silencing complex with a seed-containing guide DNA and target RNA duplex. Nature 456, 921-6 (2008).

20. Sheng, G. et al. Structure/cleavage-based insights што helical perturbations at bulge sites within T. thermophilus Argonaute silencing complexes. Nucleic Acids Res 45, 9149-9163 (2017).