Регуляция экспрессии гетерохроматических генов Stellate y Drosophila melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Аравин, Алексей Алексеевич

• Аравин, Алексей Алексеевич
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Аравин, Алексей Алексеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Задачи исследования

1.3. Научная новизна результатов исследования

1.4. Практическая ценность

1.5. Апробация работы

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10 РНК ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ И РОДСТВЕННЫЕ ЯВЛЕНИЯ

2.1. Введение

2.2. Феноменология РНКи у животных и косупрессии у растений

2.3. Генетические исследования РНК интерференции

2.3.1. Скрининг генов, участвующих в РНКи

2.3.2. Роль генов гс1е и тШ; на разных этапах РНК интерференции у С. е

§апз

2.3.3. Другие гены, участвующие в РНКи у С. е

§апз

2.4. Биохимические исследования РНК интерференции

2.4.1. Первая стадия РНК интерференции - процессинг дцРНК

2.4.2. Вторая стадия РНК-интерференции - деградация мРНК

2.5. амплификация и поддержание сигнала при РНКи и косупрессии

2.6. Связь генетических и биохимических исследований: единая модель РНКи

2.7. Связь транскрипционного и пост-транскрипционного подавления экспрессии генов.

2.8. Естественные функции зависимого от гомологии подавления экспрессии генов в организме

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Биологические материалы

3.2. Использованные праймеры

3.3. Линии Drosophila melanogaster и генетические скрещивания

3.4. Трансформация эмбрионов Drosophila

3.5. Гистохимическая окраска органов на активность галакгтозидазы

3.6. Количественное определение активности галактозидазы

3.7. Стандартные молекулярно-биологические методы

3.8. Создание Ste-lacZ конструкций

3.9. Лигирование ДНК и трансформация клеток E.coli

3.10. Выделение плазмидной ДНК

3.11. Выделение ДНК из легкоплавких агарозных гелей

3.12. Выделение геномной ДНК Drosophila

3.13. Выделение тотальной РНК Drosophila

3.14. Southern-блот гибридизация

3.15. Northern-блот гибридизация длинных молекул РНК

3.16. Northern-блот гибридизация коротких молекул РНК

3.17. RT-PCR

3.18. Определение стартов транскрипции при помощи удлинения праймера (primer extension) и 5'-RACE

3.19. Детекция дцРНК Su(Ste)

3.20. РНК интерференция в культуре клеток Drosophila

3.21. Гибридизация с РНК in situ

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Регуляция экспрессии трансгенных конструкций Ste-lacZ

4.2. Проверка существования смысловых и антисмысловых транскриптов повторов Stellate и Su(Ste)

4.3. Образование дцРНК повторами SufSte)

4.4. Модель репрессии генов Stellate в культуре клеток D. melanogaster

4.5. Авторегуляция экспрессии повторов Su(Ste)

4.6. Локализация смысловых и антисмысловых транскриптов Stellate и SufSte)

4.7. Роль белков AUBERGINE и SPINDLE-E в репрессии различных повторяющихся элементов генома

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1. Транскрипция генов Stellate и повторов Su(Ste)

5.2. Механизм ^«(¡Л^-зависимой репрессии генов Stellate

5.2.1. Образование антисмысловой РНК

5.2.2. Образование коротких РНК Su(Ste) и роль белков AUBERGINE и SPINDLE-E

5.2.3. Локализация отдельных стадий механизма и уровень репрессии

5.2.4. Тканеспецифичность репрессии

5.3. Репрессия различных повторяющихся элементов генома

6. ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Регуляция экспрессии гетерохроматических генов Stellate y Drosophila melanogaster»

2.2. Феноменология РНКи у животных и косупрессии у растений 11

2.3. Генетические исследования РНК интерференции 162.3.1. Скрининг генов, участвующих в РНКи 162.3.2. Роль генов гс1е и тШ; на разных этапах РНК интерференции у С. е1е§апз182.3.3. Другие гены, участвующие в РНКи у С. е1е§апз 212.4. Биохимические исследования РНК интерференции 222.4.1. Первая стадия РНК интерференции - процессинг дцРНК 242.4.2. Вторая стадия РНК-интерференции - деградация мРНК 282.5. амплификация и поддержание сигнала при РНКи и косупрессии 312.6. Связь генетических и биохимических исследований: единая модель РНКи 382.7. Связь транскрипционного и пост-транскрипционного подавления экспрессии генов. 562.8. Естественные функции зависимого от гомологии подавления экспрессии генов в организме 643. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 723.1. Биологические материалы 723.2. Использованные праймеры 723.3. Линии Drosophila melanogaster и генетические скрещивания 723.4. Трансформация эмбрионов Drosophila 743.5. Гистохимическая окраска органов на активность галакгтозидазы 753.6. Количественное определение активности галактозидазы 753.7. Стандартные молекулярно-биологические методы 763.8. Создание Ste-lacZ конструкций 763.9. Лигирование ДНК и трансформация клеток E.coli 773.10. Выделение плазмидной ДНК 783.11. Выделение ДНК из легкоплавких агарозных гелей 783.12. Выделение геномной ДНК Drosophila 793.13. Выделение тотальной РНК Drosophila 793.14. Southern-блот гибридизация 803.15. Northern-блот гибридизация длинных молекул РНК 813.16. Northern-блот гибридизация коротких молекул РНК 833.17. RT-PCR 833.18. Определение стартов транскрипции при помощи удлинения праймера (primer extension) и 5'-RACE 853.19. Детекция дцРНК Su(Ste) 853.20. РНК интерференция в культуре клеток Drosophila 863.21. Гибридизация с РНК in situ 874. РЕЗУЛЬТАТЫ 904.1. Регуляция экспрессии трансгенных конструкций Ste-lacZ 904.2. Проверка существования смысловых и антисмысловых транскриптов повторов Stellate и Su(Ste) 964.3. Образование дцРНК повторами SufSte) 1014.4. Модель репрессии генов Stellate в культуре клеток D. melanogaster 1034.5. Авторегуляция экспрессии повторов Su(Ste) 1044.6. Локализация смысловых и антисмысловых транскриптов Stellate и SufSte) 1064.7. Роль белков AUBERGINE и SPINDLE-E в репрессии различных повторяющихся элементов генома 1105. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ1135.1. Транскрипция генов Stellate и повторов Su(Ste) 1135.2. Механизм ^«(¡Л^-зависимой репрессии генов Stellate 1185.2.1. Образование антисмысловой РНК 1205.2.2. Образование коротких РНК Su(Ste) и роль белков AUBERGINE и SPINDLE-E 1205.2.3. Локализация отдельных стадий механизма и уровень репрессии 1235.2.4. Тканеспецифичность репрессии 1255.3. Репрессия различных повторяющихся элементов генома 1266. ВЫВОДЫ 1297. ЛИТЕРАТУРА 130 БЛАГОДАРНОСТИ 143Список сокращенийдцРНК двуцепочечная РНКоцРНК одноцепочечная РНКнк. нуклеотидовп.н. пар нуклеотидовт.п.н. тысяч пар нуклеотидовРНКи РНК интерференцияDAPI 4',6-Diamidino-2-phenylindoleDIG диоксигенинHDGS homology-dependent gene silencing, зависимое от гомологии подавление экспрессии генов PTGS post-transcriptional gene silencing, пост-транскрипционное зависимое от гомологии подавление экспрессии генов TGS transcriptional gene silencing, транскрипционное зависимое от гомологии подавление экспрессии генов RdRP RNA-dependent RNA polymerase, РНК-зависимая РНК полимеразаsiRNA small interfering RNAstRNA small temporary RNA

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Аравин, Алексей Алексеевич

6. Выводы

1. Обнаружена антисмысловая транскрипция повторов Su(Ste), старт которой расположен в мобильном элементе hoppel. Смысловая и антисмысловая транскрипция повторов Su(Ste) приводит к образованию дцРНК и коротких 25-27 нк РНК. Присутствие коротких РНК, являющихся, по-видимому, продуктами процессинга дцРНК, коррелирует с репрессией генов Stellate.

2. Показано увеличение количества смысловых транскриптов Sii(Ste) в случае делеции большей части геномных копий этих повторов. Т.о. механизм репрессии с участием дцРНК может обеспечивать негативный аутогенный контроль экспрессии генов.

3. На модели культуры клеток D. melanogaster показано, что 90% гомология в нуклеотидной послеловательности между генами Stellate и повторами Su(Ste) достаточна для сильного подавления экспрессии при помощи дцРНК.

4. Показано, что 134 н.п. фрагмент из 5' области гена Stellate, включающий 33 н.п. транскрибируемой последовательности, достаточен для Su(Ste)-зависимого подавления экспрессии репортерной конструкции.

5. Показано, что мутация в одном из двух генов, участвующих в репрессии генов Stellate, приводит к активации экспрессии других повторяющихся элементов генома, в том числе ретротранспозонов в терминальных тканях D. melanogaster.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Аравин, Алексей Алексеевич, 2001 год

1. Al-Kaff, N. S., Covey, S. N., Kreike, M. M., Page, A. M„ Pinder, R., and Dale, P. J. (1998). Transcriptional and posttranscriptional plant gene silencing in response to a pathogen, Science 279, 2113-5.

2. Ambros, V. (1989). A hierarchy of regulatory genes controls a larva-to-adult developmental switch in C. elegans, Cell 57, 49-57.

3. Anandalakshmi, R., Marathe, R., Ge, X., Herr, J. M., Jr., Май, C., Mallory, A., Pruss, G., Bowman, L., and Vance, V. B. (2000). A calmodulin-related protein that suppresses posttranscriptional gene silencing in plants, Science 290, 142-4.

4. Aravin, A. A., Naumova, N. M., Tulin, A. V., Vagin, V. V., Rozovsky, Y. M., and Gvozdev, V. A. (2001). Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline, Curr Biol 11, 1017-27.

5. Balakireva, M. D., Shevelyov, Y. Y., Nurminsky, D., Livak, K. J., and Gvozdev, V. A. (1992). Structural organization and diversification of Y-linked sequences comprising Su(Ste) genes in Drosophila melanogaster, Nucleic Acids Res 20, 3731-6.

6. Bargmann, С. I. (2001). High-throughput reverse genetics: RNAi screens in Caenorhabditis elegans, Genome Biol 2.

7. Barstead, R. (2001). Genome-wide RNAi, Curr Opin Chem Biol 5, 63-6.

8. Bass, B. L. (2000). Double-stranded RNA as a template for gene silencing, Cell 101, 235-8.

9. Baulcombe, D. (2001). RNA silencing. Diced defence, Nature 409, 295-6.

10. Beclin, C., Berthome, R., Palauqui, J. C., Tepfer, M., and Vaucheret, H. (1998). Infection of tobacco or Arabidopsis plants by CMV counteracts systemic posttranscriptional silencing of nonviral (trans)genes, Virology 252, 313-7.

11. Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., and Hannon, G. J. (2001). Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference, Nature 409, 363-6.

12. Birchler, J. A., Bhadra, M. P., and Bhadra, U. (2000). Making noise about silence: repression of repeated genes in animals, Curr Opin Genet Dev 10, 211-6.

13. Bohmert, K., Camus, I., Bellini, C., Bouchez, D., Caboche, M., and Benning, C. (1998). AGOl defines a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development. EMBO J 17,170-80.

14. Bosher, J. M., Dufourcq, P., Sookhareea, S., and Labouesse, M. (1999). RNA interference can target pre-mRNA. Consequences for gene expression in a caenorhabditis elegans operon In Process Citation., Genetics 153, 1245-56.

15. Boutla, A., Delidakis, C., Livadaras, L, Tsagris, M., and Tabler, M. (2001). Short 5'-phosphorylated double-stranded RNAs induce RNA interference in Drosophila, Curr Biol 11, 1776-80.

16. Brigneti, G., Voinnet, 0., Li, W. X., Ji, L. H., Ding, S. W., and Baulcombe, D. C. (1998). Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana, Embo J 7 7, 6739-46.

17. Buttgereit, D., and Renkawitz-Pohl, R. (1993). Expression of beta 1 tubulin (beta Tub56D) in Drosophila testis stem cells is regulated by a short upstream sequence while intron elements guide expression in somatic cells., Mol Gen Genet 241, 263-70.

18. Caplen, N. J., Fle.enor, J., Fire, A., and Morgan, R. A. (2000). dsRNA-mediated gene silencing in cultured Drosophila cells: a tissue culture model for the analysis of RNA interference, Gene 252, 95-105.

19. Caplen, N. J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., and Morgan, R. A. (2001). Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems, Proc Natl Acad Sci U S A 98, 9742-7.

20. Catalonotto, C., Azzalin, G., Macino, G., and Cogoni, C. (2000). Gene silencing in worms and fungi, Nature 404, 245.

21. Cerutti, L., Mian, N., and Bateman, A. (2000). Domains in gene silencing and cell differentiation proteins: the novel PAZ domain and redefinition of the piwi domain In Process Citation., Trends Biochem Sci 25, 481-2.

22. Chaboissier, M. C., Bucheton, A., and Finnegan, D. J. (1998). Copy number control of a transposable element, the I factor, a LINE- like element in Drosophila, Proc Natl Acad Sci U S A 95, 11781-5.

23. Chandler, V. L., Eggleston, W. B., and Dorweiler, J. E. (2000). Paramutation in maize, Plant Mol Biol 43, 121-45.

24. Chang, J., and Taylor, J. (2002). In vivo RNA-directed transcription, with template switching, by a mammalian RNA polymerase, Embo J 27, 157-164.

25. Chuang, C. F., and Meyerowitz, E. M. (2000). Specific and heritable genetic interference by double-stranded RNA in Arabidopsis thaliana, Proc Natl Acad Sci (J S A 97, 4985-90.

26. Clemens, M. J. (1997). PKR—a protein kinase regulated by double-stranded RNA, Int J Biochem Cell Biol 29, 945-9.

27. Cogoni, C., and Macino, G. (1999a). Gene silencing in Neurospora crassa requires a protein homologous to RNA-dependent RNA polymerase, Nature 399, 166-9.

28. Cogoni, C., and Macino, G. (1999b). Homology-dependent gene silencing in plants and fungi: a number of variations on the same theme, Curr Opin Microbiol 2, 657-62.

29. Cogoni, C., and Macino, G. (1999c). Posttranscriptional gene silencing in Neurospora by a RecQ DNA helicase, Science 286, 2342-4.

30. Cox, D. N., Chao, A., Baker, J., Chang, L., Qiao, D., and Lin, H. (1998). A novel class of evolutionarily conserved genes defined by pivvi are essential for stem cell self-renewal, Genes Dev 12, 3715-27.

31. Dalmay, T., Hamilton, A., Mueller, E., and Baulcombe, D. C. (2000a). Potato virus X amplicons in arabidopsis mediate genetic and epigenetic gene silencing, Plant Cell 12, 369-79.

32. Dalmay, T., Hamilton, A., Rudd, S„ Angell, S„ and Baulcombe, D. C. (2000b). An RNA-dependent RNA polymerase gene in Arabidopsis is required for posttranscriptional gene silencing mediated by a transgene but not by a virus, Cell 101, 543-53.

33. Dalmay, T., Horsefield, R., Braunstein, T. H., and Baulcombe, D. C. (2001). SDE3 encodes an RNA helicase required for post-transcriptional gene silencing in Arabidopsis, Embo J 20, 2069-78.

34. Danilevskaya, O. N., Traverse, K. L., Hogan, N. C., DeBaryshe, P. G., and Pardue, M. L. (1999). The two Drosophila telomeric transposable elements have very different patterns of transcription, Mol Cell Biol 19, 873-81.

35. Dernburg, A. F., Zalevsky, J., Colaiacovo, M. P., and Villeneuve, A. M. (2000). Transgene-mediated cosuppression in the C. elegans germ line, Genes Dev 14, 157883.

36. Devlin, R., Bingham, B., and Wakimoto, B. (1990). The organization and expression of the light gene, a heterochromatic gene of Drosophila melanogaster., Genetics 125, 129-40.

37. Di Nocera, P. P., and Dawid, I. B. (1983). Transient expression of genes introduced into cultured cells of Drosophila, Proc Natl Acad Sci U S A 80, 7095-8.

38. Domeier, M. E., Morse, D. P., Knight, S. W., Portereiko, M., Bass, B. L., and Mango, S. E. (2000). A link between RNA interference and nonsense-mediated decay in Caenorhabditis elegans, Science 289, 1928-31.

39. Dorer, D., and Henikoff, S. (1994). Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila., Cell 77, 993-1002.

40. Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., and Manev, H. (2001). Intra-abdominal injection of double-stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system, Mol Psychiatry 6, 665-70.

41. Elbashir, S. M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K., and Tuschl, T. (2001a). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature 411, 494-8.

42. Elbashir, S. M., Lendeckel, W., and Tuschl, T. (2001b). RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs, Genes Dev 15, 188-200.

43. Elbashir, S. M., Martinez, J., Patkaniowska, A., Lendeckel, W., and Tuschl, T. (2001c). Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate, Embo J 20, 6877-88.

44. Elmayan, T., Balzergue, S., Beon, F., Bourdon, V., Daubremet, J., Guenet, Y., Mourrain, P., Palauqui, J. C., Vernhettes, S., Vialle, T., et al. (1998). Arabidopsis mutants impaired in cosuppression, Plant Cell 10, 1747-58.

45. Erdmann, V. A., Szymanski, M., Hochberg, A., de Groot, N., and Barciszewski, J. (1999). Collection of mRNA-like non-coding RNAs, Nucleic Acids Res 27, 192-5.

46. Escobar, M. A., Civerolo, E. L., Summerfelt, K. R., and Dandekar, A. M. (2001). RNAi-mediated oncogene silencing confers resistance to crown gall tumorigenesis, Proc Natl Acad Sci U S A 98, 13437-42.

47. Fierro-Monti, I., and Mathews, M. B. (2000). Proteins binding to duplexed RNA: one motif, multiple functions, Trends Biochem Sci 25, 241-6.

48. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., and Mello, C. C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans, Nature 391, 806-11.

49. Fortier, E., and Belote, J. M. (2000). Temperature-dependent gene silencing by an expressed inverted repeat in Drosophila, Genesis 26, 240-4.

50. Franke, A., and Baker, B. S. (1999). The roxl and rox2 RNAs are essential components of the compensasome, which mediates dosage compensation in Drosophila, Mol Cell 4, 117-22.

51. Gillespie, D. E., and Berg, C. A. (1995). Homeless is required for RNA localization in Drosophila oogenesis and encodes a new member of the DE-H family of RNA-dependent ATPases, Genes Dev 9, 2495-508.

52. Grishok, A., Tabara, H., and Mello, C. C. (2000). Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans, Science 287, 2494-7.

53. Guo, H. S., and Ding, S. W. (2002). A viral protein inhibits the long range signaling activity of the gene silencing signal, Embo J 21, 398-407.

54. Gvozdev, V. A., Kogan, G. L., Tulin, A. A., Aravin, A. A., Naumova, N. M., and Shevelyov, Y. Y. (2000). Paralogous stellate and Su(Ste) repeats: evolution and ability to silence a reporter gene, Genetica 109, 131-40.

55. Ha, I., Wightman, B., and Ruvkun, G. (1996). A bulged lin-4/lin-14 RNA duplex is sufficient for Caenorhabditis elegans lin-14 temporal gradient formation, Genes Dev 70,3041-50.

56. Hamilton, A. J., and Baulcombe, D. C. (1999). A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants In Process Citation., Science 286, 950-2.

57. Hammond, S. M„ Bernstein, E„ Beach, D., and Hannon, G. J. (2000). An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells, Nature 404, 293-6.

58. Hammond, S. M., Boettcher, S., Caudy, A. A., Kobayashi, R., and Hannon, G. J. (2001). Argonaute2, a link between genetic and biochemical analyses of RNAi, Science 293, 1146-50.

59. Hansen, S., Takada, S., Jacobson, R., Lis, J., and Tjian, R. (1997). Transcriptional properties of a cell type-specific TATA-binding protein. TRF. Cell 91, 71-83.

60. Harris, A. N., and Macdonald, P. M. (2001). Aubergine encodes a Drosophila polar granule component required for pole cell formation and related to eIF2C, Development 128, 2823-32.

61. Hearn, M., Hedrick, A., Grigliatti, T., and Wakimoto, B. (1991). The effect of modifiers of position-effect variegation on the variegation of heterochromatic genes of Drosophila melanogaster., Genetics 128, 785-97.

62. Henikoff, S., and Comai, L. (1998). A DNA methyltransferase homolog with a chromodomain exists in multiple polymorphic forms in Arabidopsis, Genetics 149, 307-18.

63. Howe, M., Dimitri, P., Berloco, M., and Wakimoto, B. (1995). Cis-effects of heterochromatin on heterochromatic and euchromatic gene activity in Drosophila melanogaster., Genetics 140, 1033-45.

64. Hoyle, H., Hutchens, J., Turner, F., and Raff, E. (1995). Regulation of beta-tubulin function and expression in Drosophila spermatogenesis., Dev Genet 16, 148-70.

65. Hurst, L. (1992). Is Stellate a relict meiotic driver?, Genetics 130, 229-30.

66. Hutvagner, G., McLachlan, J., Pasquinelli, A. E., Balint, E., Tuschl, T., and Zamore, P. D. (2001). A cellular function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation of the let-7 small temporal RNA, Science 293, 834-8.

67. Jacobsen, S. E., Running, M. P., and Meyerowitz, E. M. (1999). Disruption of an RNA helicase/RNAse III gene in Arabidopsis causes unregulated cell division in floral meristems, Development 126, 5231-43.

68. Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. }., Cao, X., and Meyerowitz, E. M. (2000). Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis, Curr Biol 10, 17986.

69. Jeddeloh, J. A., Bender, J., and Richards, E. J. (1998). The DNA methylation locus DDM1 is required for maintenance of gene silencing in Arabidopsis, Genes Dev 12, 1714-25.

70. Jensen, S., Gassama, M. P., and Heidmann, T. (1999a). Cosuppression of I transposon activity in Drosophila by I-containing sense and antisense transgenes, Genetics 153, 1767-74.

71. Jensen, S., Gassama, M. P., and Heidmann, T. (1999b). Taming of transposable elements by homology-dependent gene silencing, Nat Genet 21, 209-12.

72. Jones, A. L., Thomas, C. L., and Maule, A. J. (1998). De novo methylation and co-suppression induced by a cytoplasmically replicating plant RNA virus, Embo J 7 7, 6385-93.

73. Jones, L., Hamilton, A. J., Voinnet, O., Thomas, C. L., Maule, A. J., and Baulcombe, D. C. (1999). RNA-DNA interactions and DNA methylation in post-transcriptional gene silencing, Plant Cell 11, 2291-301.

74. Jones, L., Ratcliff, F., and Baulcombe, D. C. (2001). RNA-directed transcriptional gene silencing in plants can be inherited independently of the RNA trigger and requires Metl for maintenance, Curr Biol 11,141-51.

75. Kalidas, S., and Smith, D. P. (2002). Novel genomic cDNA hybrids produce effective RNA interference in adult Drosophila, Neuron 33, 177-84.

76. Kalmykova, A., Dobritsa, A., and Gvozdev, V. (1997a). The beta CK2tes gene encodes the tissue-specific regulatory subunit of casein kinase 2 in Drosophila melanogaster., Biochemistry (Mosc) 62, 455-60.

77. Kalmykova, A., Dobritsa, A., and Gvozdev, V. (1997b). The Su(Ste) repeat in the Y chromosome and betaCK2tes gene encode predicted isoforms of regulatory beta-subunit of protein kinase CK2 in Drosophila melanogaster., FEBS Lett 416, 164-6.

78. Kalmykova, A. I., Dobritsa, A. A., and Gvozdev, V. A. (1998). Su(Ste) diverged tandem repeats in a Y chromosome of Drosophila melanogaster are transcribed and variously processed, Genetics 148, 243-9.

79. Kalmykova, A. I., Shevelyov, Y. Y., Dobritsa, A. A., and Gvozdev, V. A. (1997c). Acquisition and amplification of a testis-expressed autosomal gene, SSL, by the Drosophila Y chromosome, Proc Natl Acad Sci U S A 94, 6297-302.

80. Kasschau, K. D., and Carrington, J. C. (1998). A counterdefensive strategy of plant viruses: suppression of posttranscriptional gene silencing, Cell 95, 461-70.

81. Kelly, W. G., and Fire, A. (1998). Chromatin silencing and the maintenance of a functional germline in Caenorhabditis elegans, Development 125, 2451-6.

82. Kennerdell, J. R., and Carthew, R. W. (1998). Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway, Cell 95, 1017-26.

83. Kennerdell, J. R., and Carthew, R. W. (2000). Heritable gene silencing in Drosophila using double-stranded RNA, Nat Biotechnol 18, 896-8.

84. Ketting, R. F., Fischer, S. E., Bernstein, E., Sijen, T., Hannon, G. J., and Plasterk, R. H. (2001). Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C. elegans, Genes Dev 15, 2654-9.

85. Ketting, R. F., Haverkamp, T. H., van Luenen, H. G., and Plasterk, R. H. (1999). Mut-7 of C. elegans, required for transposon silencing and RNA interference, is a homolog of Werner syndrome helicase and RNaseD, Cell 99, 133-41.

86. Ketting, R. F., and Plasterk, R. H. (2000). A genetic link between co-suppression and RNA interference in C. elegans, Nature 404, 296-8.

87. Kiger, A. A., Jones, D. L., Schulz, C., Rogers, M. B., and Fuller, M. T. (2001). Stem cell self-renewal specified by JAK-STAT activation in response to a support cell cue, Science 294, 2542-5.

88. Kiger, A. A., White-Cooper, H., and Fuller, M. T. (2000). Somatic support cells restrict germline stem cell self-renewal and promote differentiation, Nature 407, 7504.

89. Knight, S. W., and Bass, B. L. (2001). A Role for the RNase III Enzyme DCR-1 in RNA Interference and Germ Line Development in C. elegans, Science 2, 2.

90. Kovarik, A., Van Houdt, H., Holy, A., and Depicker, A. (2000). Drug-induced hypomethylation of a posttranscriptionally silenced transgene locus of tobacco leads to partial release of silencing, FEBS Lett 467, 47-51.

91. Kumar, M., and Carmichael, G. G. (1998). Antisense RNA: function and fate of duplex RNA in cells of higher eukaryotes, Microbiol Mol Biol Rev 62, 1415-34.

92. Maeda, I., Kohara, Y., Yamamoto, M., and Sugimoto, A. (2001). Large-scale analysis of gene function in Caenorhabditis elegans by high- throughput RNAi, Curr Biol 11, 171-6.

93. Marin, L., Lehmann, M., Nouaud, D., Izaabel, H., Anxolabehere, D., and Ronsseray, S. (2000). P-Element repression in Drosophila melanogaster by a naturally occurring defective telomeric P copy, Genetics 155, 1841-54.

94. Matz, M., Shagin, D., Bogdanova, E., Britanova, O., Lukyanov, S., Diatchenko, L., and Chenchik, A. (1999). Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step- out PCR, Nucleic Acids Res 27, 1558-60.

95. Matzke, M., Matzke, A. J., and Kooter, J. M. (2001a). RNA: guiding gene silencing, Science 293, 1080-3.

96. Matzke, M. A., Matzke, A. J., Pruss, G. J., and Vance, V. B. (2001b). RNA-based silencing strategies in plants, Curr Opin Genet Dev 77, 221-7.

97. McKee, B., Habera, L., and Vrana, J. (1992). Evidence that intergenic spacer repeats of Drosophila melanogaster rRNA genes function as X-Y pairing sites in male meiosis, and a general model for achiasmatic pairing., Genetics ¡32, 529-44.

98. McKee, B., and Karpen, G. (1990). Drosophila ribosomal RNA genes function as an X-Y pairing site during male meiosis., Cell 61, 61-72.

99. McKenzie, R. W., and Brennan, M. D. (1996). The two small introns of the Drosophila affinidisjuncta Adh gene are required for normal transcription, Nucleic Acids Res 24, 3635-42.

100. Merrill, C„ Chakravarti, D., Habera, L„ Das, S„ Eisenhour, L„ and McKee, B. (1992). Promoter-containing ribosomal DNA fragments function as X-Y meiotic pairing sites in D. melanogaster males., Dev Genet 13, 468-84.

101. Mette, M. F., Aufsatz, W., van Der Winden, J., Matzke, M. A., and Matzke, A. J. (2000). Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-stranded RNA, Embo J 19, 5194-5201.

102. Mette, M. F., Matzke, A. J., and Matzke, M. A. (2001). Resistance of RNA-mediated TGS to HC-Pro, a viral suppressor of PTGS, suggests alternative pathways for dsRNA processing, Curr Biol 11, 1119-23.

103. Mette, M. F., van der Winden, J., Matzke, M. A., and Matzke, A. J. (1999). Production of aberrant promoter transcripts contributes to methylation and silencing of unlinked homologous promoters in trans, Embo J 18, 241-8.

104. Michiels, F„ Gasch, A., Kaltschmidt, B„ and Renkawitz-Pohl, R. (1989). A 14 bp promoter element directs the testis specificity of the Drosophila beta 2 tubulin gene., EMBO J 8, 1559-65.

105. Minchiotti, G., and Di Nocera, P. P. (1991). Convergent transcription initiates from oppositely oriented promoters within the 5' end regions of Drosophila melanogaster F elements, Mol Cell Biol 11, 5171-80.

106. Montgomery, M. K., Xu, S., and Fire, A. (1998). RNA as a target of double-stranded RNA-mediated genetic interference in Caenorhabditis elegans, Proc Natl Acad Sci U S A 95, 15502-7.

107. Morel, J., Mourrain, P., Beclin, C., and Vaucheret, H. (2000). DNA methylation and chromatin structure affect transcriptional and post- transcriptional transgene silencing in Arabidopsis, Curr Biol 10, 1591-1594.

108. Muhlbach, H. P., and Sanger, H. L. (1979). Viroid replication is inhibited by alpha-amanitin, Nature 278, 185-8.

109. Ngo, H., Tschudi, C., Gull, K., and Ullu, E. (1998). Double-stranded RNA induces mRNA degradation in Trypanosoma brucei, Proc Natl Acad Sci U S A 95, 14687-92.

110. Nykanen, A., Haley, B., and Zamore, P. D. (2001). ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway, Cell 107, 309-21.

111. Palauqui, J. C., Elmayan, T., Pollien, J. M., and Vaucheret, H. (1997). Systemic acquired silencing: transgene-specific post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non- silenced scions, Embo J 16, 4738-45.

112. Palauqui, J. C., and Vaucheret, H. (1998). Transgenes are dispensable for the RNA degradation step of cosuppression, Proc Natl Acad Sci U S A 95, 9675-80.

113. Pal-Bhadra, M., Bhadra, U., and Birchler, J. A. (1997). Cosuppression in Drosophila: gene silencing of Alcohol dehydrogenase by white-Adh transgenes is Polycomb dependent see comments., Cell 90, 479-90.

114. Pal-Bhadra, M., Bhadra, U., and Birchler, J. A. (1999). Cosuppression of nonhomologous transgenes in Drosophila involves mutually related endogenous sequences, Cell 99, 35-46.

115. Palumbo, G., Bonaccorsi, S., Robbins, L. G., and Pimpinelli, S. (1994). Genetic analysis of Stellate elements of Drosophila melanogaster, Genetics 138, 1181-97.

116. Parrish, S., and Fire, A. (2001). Distinct roles for RDE-1 and RDE-4 during RNA interference in Caenorhabditis elegans, Rna 7, 1397-402.

117. Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., and Fire, A. (2000). Functional anatomy of a dsRNA trigger. Differential requirement for the two trigger strands in RNA interference, Mol Cell 6, 1077-87.

118. Pelissier, T., and Wassenegger, M. (2000). A DNA target of 30 bp is sufficient for RNA-directed DNA methylation, Rna 6, 55-65.

119. Piano, F., Schetter, A. J., Mangone, M., Stein, L., and Kemphues, K. J. (2000). RNAi analysis of genes expressed in the ovary of Caenorhabditis elegans, Curr Biol 10, 1619-22.

120. Rastelli, L., and Kuroda, M. I. (1998). An analysis of maleless and histone H4 acetylation in Drosophila melanogaster spermatogenesis, Mech Dev 71, 107-17.

121. Ratcliff, F. G., MacFarlane, S. A., and Baulcombe, D. C. (1999). Gene silencing without DNA. rna-mediated cross-protection between viruses, Plant Cell 11, 1207-16.

122. Reinhart, B. J., Slack, F. J., Basson, M., Pasquinelli, A. E., Bettinger, J. C., Rougvie, A. E., Horvitz, H. R., and Ruvkun, G. (2000). The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans, Nature -/03, 901-6.

123. Romano, N., and Macino, G. (1992). Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences, Mol Microbiol 6, 3343-53.

124. Ruiz, M. T., Voinnet, O., and Baulcombe, D. C. (1998). Initiation and maintenance of virus-induced gene silencing, Plant Cell 10, 937-46.

125. Sanchez Alvarado, A., and Newmark, P. A. (1999). Double-stranded RNA specifically disrupts gene expression during planarian regeneration, Proc Natl Acad Sci U S A 96, 5049-54.

126. Scadden, A. D., and Smith, C. W. (2001). RNAi is antagonized by AAel hyper-editing, EMBO Rep 2, 1107-11.

127. Schiebel, W., Haas, B., Marinkovic, S., Klanner, A., and Sanger, H. L. (1993a). RNA-directed RNA polymerase from tomato leaves. I. Purification and physical properties, J Biol Chem 268,11851-7.

128. Schiebel, W., Haas, B., Marinkovic, S., Klanner, A., and Sanger, H. L. (1993b). RNA-directed RNA polymerase from tomato leaves. II. Catalytic in vitro properties, J Biol Chem 268, 11858-67.

129. Sijen, T., Fleenor, J., Simmer, F., Thijssen, K. L., Parrish, S., Timmons, L., Plasterk, R. H., and Fire, A. (2001a). On the Role of RNA Amplification in dsRNA-Triggered Gene Silencing, Cell ¡07, 465-76.

130. Sijen, T., and Kooter, J. M. (2000). Post-transcriptional gene-silencing: RNAs on the attack or on the defense?, Bioessays 22, 520-31.

131. Sijen, T., Vijn, I., Rebocho, A., van Blokland, R., Roelofs, D., Mol, J. N., and Kooter, J. M. (2001b). Transcriptional and posttranscriptional gene silencing are mechanistically related, Curr Biol 11, 436-40.

132. Smalheiser, N. R., Manev, H., and Costa, E. (2001). RNAi and brain function: was McConnell on the right track?, Trends Neurosci 24, 216-8.

133. Smardon, A., Spoerke, J. M., Stacey, S. C., Klein, M. E., Mackin, N., and Maine, E. M. (2000). EGO-l is related to RNA-directed RNA polymerase and functions in germ- line development and RNA interference in C. elegans, Curr Biol 10, 169-178.

134. Smith, N. A., Singh, S. P., Wang, M. B., Stoutjesdijk, P. A., Green, A. G„ and Waterhouse, P. M. (2000). Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs, Nature 407, 319-20.

135. Stapleton, W., Das, S., and McKee, B. D. (2001). A role of the Drosophila homeless gene in repression of Stellate in male meiosis, Chromosoma 110, 228-40.

136. Stuckenholz, C., Kageyama, Y., and Kuroda, M. I. (1999). Guilt by association: non-coding RNAs, chromosome-specific proteins and dosage compensation in Drosophila, Trends Genet 15, 454-8.

137. Tabara, H., Sarkissian, M., Kelly, W. G., Fleenor, J., Grishok, A., Timmons, L., Fire, A., and Mello, C. C. (1999). The rde-1 gene. RNA interference, and transposon silencing in C. elegans, Cell 99, 123-32.

138. Thomas, C. L., Jones, L., Baulcombe, D. C., and Maule, A. J. (2001). Size constraints for targeting post-transcriptional gene silencing and for RNA-directed methyl ation in Nicotiana benthamiana using a potato virus X vector, Plant J 25, 417-25.

139. Tijsterman, M., Ketting, R. F., Okihara, K. L., Sijen, T., and Plasterk, R. H. A. (2002). RNA Helicase MUT-14-Dependent Gene Silencing Triggered in C. elegans by Short Antisense RNAs, Science 295, 694-697.

140. Timmons, L., and Fire, A. (1998). Specific interference by ingested dsRNA, Nature 395, 854.

141. Tulin, A. V., Naumova, N. M., Aravin, A. A., and Gvozdev, V. A. (1998). Repeated, protein-encoding heterochromatic genes cause inactivation of a juxtaposed euchromatic gene, FEBS Lett 425, 513-6.

142. Tulina, N., and Matunis, E. (2001). Control of stem cell self-renewal in Drosophila spermatogenesis by JAK- STAT signaling, Science 294, 2546-9.

143. Tuschl, T., Zamore, P. D., Lehmann, R., Bartel, D. P. and Sharp, P. A. (1999). Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro, Genes Dev 13, 31917.

144. Vanhee-Brossollet, C., and Vaquera, C. (1998). Do natural antisense transcripts make sense in eukaryotes?, Gene 211, 1-9.

145. Vaucheret, H., and Fagard, M. (2001). Transcriptional gene silencing in plants: targets, inducers and regulators, Trends Genet 77, 29-35.

146. Venables, J. P., and Eperon, I. (1999). The roles of RNA-binding proteins in spermatogenesis and male infertility, Curr Opin Genet Dev 9, 346-54.

147. Vielle-Calzada, J. P., Thomas, J., Spillane, C., Coluccio, A., Hoeppner, M. A., and Grossniklaus, U. (1999). Maintenance of genomic imprinting at the Arabidopsis medea locus requires zygotic DDM1 activity, Genes Dev 13, 2971-82.

148. Voinnet, O., Lederer, C., and Baulcombe, D. C. (2000). A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana, Cell 103, 15767.

149. Voinnet, O., Pinto, Y. M., and Baulcombe, D. C. (1999). Suppression of gene silencing: a general strategy used by diverse DNA and RNA viruses of plants, Proc Natl Acad Sci U S A 96, 14147-52.

150. Voinnet, O., Vain, P., Angell, S., and Baulcombe, D. C. (1998). Systemic spread of sequence-specific transgene RNA degradation in plants is initiated by localized introduction of ectopic promoterless DNA, Cell 95, 177-87.

151. Wakimoto, B., and Hearn, M. (1990). The effects of chromosome rearrangements on the expression of heterochromatic genes in chromosome 2L of Drosophila melanogaster., Genetics 125, 141-54.

152. Wang, M. B., and Waterhouse, P. M. (2000). High-efficiency silencing of a beta-glucuronidase gene in rice is correlated with repetitive transgene structure but is independent of DNA methylation, Plant Mol Biol 43, 67-82.

153. Wang, M. B., Wesley, S. V., Finnegan, E. J., Smith, N. A., and Waterhouse. P. M. (2001). Replicating satellite RNA induces sequence-specific DNA methylation and truncated transcripts in plants, Rna 7, 16-28.

154. Wassenegger, M., Heimes, S., Riedel, L., and Sanger, H. L. (1994). RNA-directed de novo methylation of genomic sequences in plants, Cell 76, 567-76.

155. Waterhouse, P. M., Graham, M. W., and Wang, M. B. (1998). Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA, Proc Natl Acad Sci U S A 95, 13959-64.

156. White-Cooper, H., Schafer, M., Alphey, L., and Fuller, M. (1998). Transcriptional and post-transcriptional control mechanisms coordinate the onset of spermatid differentiation with meiosis I in Drosophila., Development 125, 125-34.

157. Wianny, F., and Zemicka-Goetz, M. (2000). Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol 2, 70-75.

158. Wightman, B., Ha, I., and Ruvkun, G. (1993). Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin- 4 mediates temporal pattern formation in C. elegans, Cell 75, 855-62.

159. Wilson, J. E., Connell, J. E., and Macdonald, P. M. (1996). aubergine enhances oskar translation in the Drosophila ovary, Development 122, 1631-9.

160. Wu-Scharf, D., Jeong, B., Zhang, C., and Cerutti, H. (2000). Transgene and transposon silencing in chlamydomonas reinhardtii by a DEAH-Box RNA helicase, Science 290, 1159-63.

161. Wutz, A., Smrzka, O. W., Schweifer, N., Schellander, K., Wagner, E. F., and Barlow, D. P. (1997). Imprinted expression of the Igf2r gene depends on an intronic CpG island, Nature 389, 745-9.

162. Yang, D., Lu, H., and Erickson, J. W. (2000). Evidence that processed small dsRNAs may mediate sequence-specific mRNA degradation during RNAi in drosophila embryos, Curr Biol 10, 1191-200.

163. Yang, S., Tutton, S., Pierce, E., and Yoon, K. (2001). Specific double-stranded rna interference in undifferentiated mouse embryonic stem cells, Mol Cell Biol 21, 780716.

164. Zamore, P. D., Tuschl, T., Sharp, P. A., and Bartel, D. P. (2000). RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals, Cell 101, 25-33.

165. Zou, C., Zhang, Z., Wu, S., and Osterman, J. C. (1998). Molecular cloning and characterization of a rabbit eIF2C protein, Gene 211, 187-94.1. Благодарности

166. Особенно хочу поблагодарить Наталию Наумову, Василия Вагина, Михаила Кленова за помощь в работе и прекрасный коллектив.