Структурно-функциональные предпосылки формирования piРНК-продуцирующих локусов у Drosophila melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Оловников, Иван Алексеевич

• Оловников, Иван Алексеевич
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Оловников, Иван Алексеевич

Содержание

Введение

Список сокращений

Обзор литературы

I. РНК интерференция. Механизмы регуляции экспрессии с помощью коротких РНК

1а. Биогенез и функция siPHK и miPHK

16. Биохимический путь с участием piPHK

II. Биология piPHK кластеров

IIa. Происхождение piPHK в терминальных тканях Drosophila

piPHK кластеры фолликулярных клеток дрозофилы

piPHK кластеры в герминальных клетках яичника дрозофилы

piPHK кластеры в семенниках дрозофилы

116. Факторы, необходимые для активности piPHK кластеров. Структура

хроматина piPHK кластеров

IIb. Сравнение piPHK кластеров разных организмов

Материалы и методы

Результаты

I. Свойства коротких РНК, генерируемых трансгеном, встроенным в 41 эндогенный piPHK кластер

II. Исследование транспозонных piPHK кластеров с использованием 44 трансгенных конструкций

III. Исследование свойств генного piPHK кластера Traffic Jam

IV. Трансген- ассоциированные piPHK кластеры

Обсуждение

Выводы

Список литературы

Благодарности

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональные предпосылки формирования piРНК-продуцирующих локусов у Drosophila melanogaster»

Введение

Короткие РНК, ассоциированные с белками семейства Argonaute (Ago), играют важную роль в регуляции экспрессии генов на всех стадиях развития в большинстве изученных эукариот. Анализ коротких РНК из гонад различных животных, помимо уже известных siPHK (small interfering РНК) и miPHK (micro РНК), обнаружил отдельный класс коротких РНК, которые получили название piPHK (Piwi- interacting РНК) (Senti and Brennecke, 2010; Siomi et al., 2011). Как видно из их названия, биология piPHK неразрывно связана с белками подсемейства Piwi из семейства Ago. Главной функцией piPHK является защита генома от активности мобильных элементов (МЭ), повышенная экспрессия которых в предшественниках половых клеток может привести к высокой частоте транспозиций и передаче потомству инсерционных мутаций. piPHK позволяют подавлять экспрессию МЭ путем разрезания их мРНК за счет эндонуклеолитической активности белков Piwi, а также за счет процессов сайленсинга на транскрипционном уровне (Le Thomas et al., 2013; Shpiz et al., 2011; Sienski et al., 2012; Song et al., 2004).

Биогенез piPHK отличается от биогенеза siPHK и miPHK рядом особенностей. Наиболее важной из них является то, что большая часть piPHK происходит из дискретных локусов, лишенных генов, но обогащенных фрагментами разрушенных МЭ (Brennecke et al., 2007). Эти локусы, называемые piPHK кластерами, многочисленны (к примеру, -150 кластеров у дрозофилы) и могут быть протяженными (более 200 т.п.о.). В случае дрозофилы piPHK кластеры расположены, как правило, в перицентромерных или субтеломерных областях хромосом и суммарно составляют примерно 3.5% генома. piPHK кластеры являются центральным звеном piPHK пути, так как мутации, приводящие к нарушению их работы, приводят к остановке всего piPHK пути и драматическому повышению частоты транспозиции МЭ, вызывающей стерильность (Kalmykova et al., 2005; Klattenhoff et al., 2009; Savitsky et al., 2006; Zhang et al., 2012). Кроме того, piPHK кластеры обеспечивают адаптивность piPHK- ответа при инвазиях новых МЭ, ибо интеграция МЭ в эти локусы провоцирует синтез новых piPHK (Khurana et al., 2011).

На сегодняшний день остается непонятой не свойственная другим геномным локусам способность piPHK кластеров продуцировать короткие РНК. Исследование

структурно-функциональных особенностей piPHK кластеров осложняется их протяженностью и насыщенностью повторами.

Целью данной работы было изучение предпосылок формирования piPHK кластеров у Drosophila с помощью разнообразных трансгенных конструкций, содержащих фрагменты эндогенных piPHK кластеров либо МЭ. С помощью такого подхода была исследована роль геномной локализации и отдельных структурных элементов piPHK кластеров, необходимых для продукции piPHK.

Список Сокращений

Ago- Argonaute Ago3 - Argonaute 3 Armi - Armitage Aub - Aubergine

ВАС - bacterial artificial chromosome HP1 - heterochromatic protein 1 miPHK- micro РНК OSC - ovarian somatic cells piPHK - Piwi- interacting РНК pri-miPHK - primary micro РНК RdRP - RNA dependent RNA polymerase RISC - RNA induced silencing complex

RPM - reads per million (число коротких РНК/суммарная глубина библиотеки) siPHK - short interfering РНК Spn-E - Spindle-E TJ - Traffic Jam

TTS - transcription termination site (сайт терминации транскрипции)

дцРНК - двухцепочечная РНК

кДНК - комплементарная ДНК

МЭ - мобильный элемент

НТО - нетранслируемая область

ОРС - открытая рамка считывания

т.п.о. - тысячи пар оснований

Обзор литературы

I. РНК интерференция и родственные механизмы

1а. Биогенез и функция siPHK и miPHK

Обнаружение РНК-интерференции (РНКи) и родственных механизмов является наиболее крупным открытием в молекулярной биологии на протяжении последних десятилетий в связи с его биологической и практической значимостью (Fire et al., 1998; Hannon, 2002; Meister and Tuschl, 2004; Zamore, 2006). Роль этих механизмов в целом сводится к борьбе с РНК-вирусами и эндогенными ретроэлементами (собственно РНК-интерференция), регуляции экспрессии генов (miPHK путь) и подавлению экспрессии мобильных элементов (piPHK путь) (Aravin et al., 2001; Bartel, 2009; Reinhart et al., 2000; Siomi and Siomi, 2009; Vagin et al., 2006). Существуют также процессы, находящиеся на стыке этих путей, например сайленсинг генов на уровне хроматина у растений и некоторых животных (Castel and Martienssen, 2013; Voinnet, 2009). Однако независимо от функции того или иного пути, центральными компонентами всех них являются белки семейства Argonaute (Ago) и короткие РНК, с ними ассоциированные (Meister, 2013). В связи с тем, что белки семейства Ago имеют долгую эволюционную историю (они присутствуют также у прокариот), механизмы РНК-интерференции у эукариот зачастую очень сложны и многообразны. В этой главе мы рассмотрим собственно РНК-интерференцию у животных и родственный ей путь miPHK.

Явление РНК интерференции заключается в снижении уровня мРНК того или иного гена в присутствии двуцепочечной РНК (дцРНК), комплементарной этой мРНК. Трансфекция клеток или даже инкубация целого организма (например, Caenorhabditis elegans) в растворе, содержащем длинную двунитевую РНК, гомологичную определенному гену, приводит к существенному снижению количества его транскриптов. У некоторых организмов подобный однократный запуск РНК-интерференции способен стимулировать подавление экспрессии гена на протяжении многих поколений, тогда как у млекопитающих этот эффект является временным (Siomi and Siomi, 2009). На сегодняшний день подробно изучены этапы всего РНК-интерференционного пути. После транскрипции

комплементарных цепей определенного геномного локуса и экспорта РНК в цитоплазму, или после внедрения в клетку двунитевой РНК извне (вирусная или искусственная РНК), она подвергается нарезанию на короткие двунитевые РНК с помощью рибонуклеазы Dicer, фермента, родственного прокариотическим дцРНК-специфичным рибонуклеазам III типа (Bernstein et al., 2001; Czech et al., 2008; Ghildiyal et al., 2008). Dicerl дрозофилы способен надрезать дцРНК фактически любой последовательности. Неспецифичность Dicer, а также минимальные требования к последовательности на дальнейших этапах пути, приводят к универсальности РНК-интерференции, то есть позволяют подавлять экспрессию фактически любых генов за счет введения комплементарной им дцРНК (Dietzl et al., 2007; Ni et al., 2008). Короткие РНК длиной 20-24 нуклеотида, получающиеся в результате разрезания двунитевой РНК, имеют 3" выступающие концы длиной 2 нуклеотида на обеих концах (Bernstein et al., 2001). Как и многие другие нуклеазы, Dicer не связывается с субстратом и после надрезания высвобождает его в раствор. Это позволяет искусственно вызывать РНК-интерференцию с помощью трансфекции клеток короткими РНК с вышеуказанными свойствами (Elbashir et al., 2001). Такой способ может быть более эффективен, чем введение длинной двунитевой РНК, так как в некоторых типах клеток экспрессия Dicer находится на относительно низком уровне, что лимитирует продукцию коротких РНК для РНКи (Dietzl et al., 2007). Также, у млекопитающих длинные дцРНК (>50 п.о.) вызывают интерфероновый ответ, и трансфекция короткими РНК позволяет его избежать.

На следующем этапе короткая дцРНК загружается в Ago с помощью так называемого RISC-loading комплекса (RNAi-Induced Silencing Complex- комплекс Ago, короткой РНК и ассоциированных факторов). Ago поддерживается в «открытой» форме (способной вмещать дуплекс) за счет энергии АТР, используемой комплексом Hsc70-Hsp90 (heat shock cognate protein 70 kDa- heat shock protein 90) (Iwasaki et al., 2010). Это происходит до тех пор, пока одна из нитей не высвободится. Выбор нити зависит от термодинамических свойств дуплекса и выбирается та нить, 5' конец которой имеет меньшую температуру плавления (Gu et al., 2011). Детали процесса расплетания дуплекса неизвестны. У дрозофилы процесс выбора цепи, которая попадет в RISC (guide strand) зависит от фактора R2d2 (Liu et al., 2003). Высвобожденные нити (passenger strands) также могут загружаться в Ago. RISC способен вызывать надрезание РНК, комплементарной короткой РНК,

находящейся в нем, - это событие лежит в основе РНКи (Zamore et al., 2000). Узнавание мишени происходит не за счет всей последовательности короткой РНК, а за счет нуклеотидов 2-8 с 5' конца, участка, называемого «seed region». В случае абсолютной комплементарности этих нуклеотидов Piwi домен Ago вызывает эндонуклеолиз мишени между нуклеотидами, комплементарными 8 и 9 нуклеотидам короткой РНК, образуя 5" фосфат и 3" ОН (Bartel, 2009). Интересно, что у человека всего один из четырех Ago (Ago2) имеет каталитически активный Piwi домен, тогда как оба Ago дрозофилы каталитически активны. Также в отличие от дрозофилы, где с siPHK связывается только Ago2, у человека роль Ago вырождена, и все четыре Ago связываются как с siPHK, так и с miPHK. Здесь важно отметить, что несмотря на существование так называемых эндо-siPHK, то есть siPHK, происходящих из эндогенных транскрилтов, мутации генов Drosophila, необходимых для РНКи, не летальны (Lee et al., 2004; Okamura et al., 2004). Известно, однако, что физиологическая роль РНКи состоит в защите от вирусов и эндогенных ретроэлементов (Li et al., 2002). Можно предположить, что эффекты мутаций РНКи, которые сложно уловить в лабораторных условиях, имеют гораздо более серьезные последствия в естественной среде обитания.

miPHK играют принципиально важную роль в развитии и нормальной физиологии большинства высших эукариот (Bartel, 2009). Так, мутации многих компонентов miPHK пути, включая гены miPHK, приводят к ранней остановке развития. В целом механизм биогенеза miPHK похож на вышеописанный механизм РНКи за исключением нескольких принципиальных деталей. В случае пути miPHK субстратом для Dicer являются самокомплементарные рибонуклеиновые шпильки, закодированные в геноме, которые формируют так называемые pri-miPHK (Reinhart et al., 2000). После транскрипции гена miPHK pri-miPHK надрезается эндорибонуклеазой III типа, Drosha, находящейся в ядерном комплексе microprocessor (Denli et al., 2004; Gregory et al., 2004). miPHK, закодированные в интронах (так называемые mirions), не подвергаются действию Drosha, т.к. вырезаются в процессе сплайсинга (Westholm and Lai, 2011). Получившаяся после сплайсинга шпилька экспортируется в цитоплазму, где за счет активности Dicer (в случае дрозофилы в данном случае работает Dicer 1, в отличие от Dicer2, вовлеченного в РНКи) и фактор loquacious (Loqs) она превращается в короткую двунитевую РНК (pre-miPHK) (Hutvagner et al., 2001; Yi et al., 2003). Стоит отметить, что подавляющее большинство двунитевых участков

miPHK имеют неспаренные нуклеотиды, что позволяет избегать разрушения части miPHK за счет эндонуклеолитической активности Ago во время селекции корректной нити. У млекопитающих в процесс выбора корректной нити вовлечен фактор TRBP (Chendrimada et al., 2005). Одна из нитей дуплекса становится miPHK, в то время как комплементарная нить носит название miPHK*. Интересно, что в некоторых случаях обе нити становятся разными miPHK и обнаруживаются в комплексах с Ago, способным к сайленсингу генов. Более того, для ряда генов miPHK показан биогенез miPHK из части, содержащей петлю, соединяющую противоположные цепи ствола miPHK (Bartel, 2009). Во многих организмах Ago, связывающиеся с miPHK, имеют активный каталитический центр, и при абсолютной комплементарности miPHK и мишени способны разрезать мРНК. Однако, в отличие от miPHK в растениях, у животных такие взаимодействия редки. Показано, что каталитическая активность Ago у позвоночных необходима для высвобождения miPHK* из некоторых эндогенных pre-miPHK (Cheloufi et al., 2010; Cifuentes et al., 2010). Загрузка Ago в таком случае происходит автономно и разрезанная miPHK* удаляется, как и в случае siRISC, нуклеазой СЗРО (Liu et al., 2009). miPHK, в отличие от siPHK, как правило имеют уридин на 5' конце, свойство также присущее определенным классам piPHK (см. следующие разделы). Как упоминалось выше, miPHK связываются со всеми четырьмя Ago человека (Dueck et al., 2012).

После загрузки miPHK в Ago (Agol в случае дрозофилы), этот комплекс (miRISC) способен вызывать подавление трансляции определенных мРНК за счет узнавания последовательностей, частично комплементарных miPHK (Bartel, 2009). Эти последовательности, как правило, находятся в 3' нетранслируемой области (НТО), и большинство мРНК в клетке регулируется как минимум несколькими miPHK (Baek et al., 2008). До сих пор нет определенного мнения по поводу конкретного механизма репрессии за счет miPHK: ряд исследований говорит о том, что главную роль в данном процессе играет деаденилирование и последующая деградация мишеней (удаление кэпа и 5"-3' экзонуклеолиз ферментом XRN1), в других работах показано, что RISC супрессирует трансляцию либо на стадии инициации, либо на стадии элонгации (Eulalio et al., 2008; Filipowicz et al., 2008; Huntzinger and Izaurralde, 2011). Для репрессии важна длина polyA хвоста (Moretti et al., 2012). По всей вероятности, miPHK влияет как на стабильность, так и на трансляцию мРНК. В нескольких работах показано, что на одних стадиях развития

доминирует супрессия трансляции, а на последующих- деаденилирование и деградация (Bazzim et al., 2012; Djuranovic et al., 2012). В процессе репрессии с помощью miPHK участвуют белки семейства GW, которые являются платформами для 1) связывания многих молекул Ago и 2) для рекрутирования белков, необходимых для репрессии, таких как РАВРС (poly(A)-binding protein С) и деаденилирующего комплекса CCR4-NOT (Meister, 2013).

16. Биохимический путь с участием piPHK

Как было указано выше, вторым классом белков Argonaute у животных являются белки семейства Piwi, экспрессия которых происходит в гонадах. Мутации Piwi белков приводят к стерильности в большинстве изученных моделей (Siomi et al., 2011). Они участвуют в посттранскрипционных и котранскрипционных механизмах супрессии генов, в первую очередь МЭ. В соответствии с этим при мутациях белков Piwi наблюдается мощное увеличение количества мРНК и белков, закодированных МЭ, и появление двунитевых разрывов в хромосомах, вызванных множественными транспозициями МЭ (Klattenhoff et al., 2007; Theurkauf et al., 2006; Vagin et al., 2006). Помимо тканеспецифичности и эволюционной обособленности белков семейства Piwi, piPHK путь имеет ряд интересных особенностей, как на уровне коротких РНК, связанных с Piwi белками, так и на уровне белковых взаимодействий В частности, у большинства изученных организмов в терминальных клетках экспрессируются несколько белков Piwi со своими уникальными свойствами Как правило, один из белков является ядерным и участвует в котранскрипционном сайленсинге (снижение уровня транскрипции определенных локусов за счет образования репрессирующих гистоновых модификаций) (Aravin et al, 2008; Carmell et al., 2007; Houwmg et al, 2008; Kuramochi-Miyagawa et al., 2008; Le Thomas et al., 2013; Shpiz et al., 2011; Sienski et al., 2012). В то же время другие Piwi белки находятся в цитоплазматической перинуклеарной структуре, называемой nuage (фр. nuage- облако) и участвуют в посттранскрипционном сайленсинге МЭ, а именно разрезании их мРНК за счет слайсерной активности piwi-домена (Aravin et al, 2008, Brennecke et al., 2007; Houwing et al, 2007; Li et al, 2009; Lim and Kai, 2007). Короткие РНК, связанные с белками семейства Piwi и называемые piPHK имеют длину 24-30 нт и

сильные предпочтения к определенным нуклеотидам в определенных позициях (см. следующую главу). piPHK чрезвычайно разнообразны по последовательности: например, при глубоком секвенировании коротких РНК из яичников дрозофилы можно детектировать десятки миллионов уникальных последовательностей. В принципе, siPHK также могут генерироваться из многих последовательностей, однако для endo-siPHK такого большого разнообразия не наблюдается; miPHK исчисляются сотнями у беспозвоночных и тысячами у млекопитающих (Czech et al., 2008; Kozomara and GriffithsJones, 2011; Tam et al., 2008). Картирование piPHK на геном показывает, что они происходят из дискретных локусов, которые, как правило, состоят из разрушенных копий МЭ (Brennecke et al., 2007). Эти локусы называются piPHK кластерами. Интересно, что в некоторых piPHK кластерах piPHK картируются на обе геномные цепи, тогда как в других только на одну. Биология piPHK кластеров детально рассматривается в следующей главе.

В отличие от РНКи и miPHK путей, множество деталей биогенеза piPHK неизвестно. Так, долгое время оставалось загадкой, какая нуклеаза надрезает транскрипты piPHK кластеров. Так как большинство факторов, мутации которых приводят к нарушению биогенеза piPHK, находятся в цитоплазме, предполагается, что первичный процессинг происходит именно здесь. Однако распознавание транскриптов, которые будут нарезаться на piPHK, и транспортировка их в определенные структуры в цитоплазме происходит уже в ядре (Zhang et al., 2012). Детали этого процесса изучены меньше. На сегодняшний день опубликован ряд работ, связывающий эффект мутаций белка Zucchini (Zuc) и потерю его нуклеазной активности с нарушением первичного процессинга piPHK, что указывает на его роль в биогенезе piPHK из транскриптов кластеров (Ipsaro et al., 2012; Nishimasu et al., 2012; Voigt et al., 2012). В фолликулярных клетках дрозофилы (см. ниже) первичный процессинг piPHK происходит в цитоплазме в гранулах, называемых Yb-bodies и содержащих факторы Yb и Armitage (Armi) (Saito et al., 2010). Интересно, что гомолог Armi у млекопитающих MOVIOLI, также необходим для биогенеза piPHK (Frost et al., 2010; Zheng et al., 2010), что указывает на высокую консервативность этого механизма. После надрезания транскриптов кластеров, предшественники piPHK связываются с Piwi белками, после чего происходит второй этап первичного процессинга, заключающийся в укорочении 3' конца предшественника до длины зрелой piPHK (24-30 нт для различных piPHK в различных организмах) за счет активности неизвестной белковой природы (так

называемый trimming) и 2 ' -О-метилировании, выполняемой ферментом Henl (Kawaoka et al., 2011b). Эти процессы, как и в РНКи и miPHK путях, происходят с помощью шаперона Hsp90, а также ко-шаперонов Shutdown (у дрозофилы) и FKBP6 (у млекопитающих) (Gangaraju et al., 2011; Olivieri et al., 2012; Preall et al., 2012; Specchia et al., 2010; Xiol et al., 2012). Другим важным классом белков, вовлеченных в piPHK путь, являются белки семейства Tudor, которых у дрозофилы и мыши насчитывается более двух десятков (Siomi et al., 2010). Главным доменом этих белков является Tudor домен, способный связывать диметилированные аргинины на ряде белков (Рек et al., 2012). Показано, что такие аргининовые мотивы находятся и на Piwi белках, они эффективно диметилируются фактором PRMT5 и связываются белками Tudor (Kirino et al., 2009; Nishida et al., 2009; Vagin et al., 2009). Таким образом, белки семейства Tudor, как правило, имеющие многократно повторенные Tudor домены, являются платформами для связывания многих аргинин-диметилированных белков, например, многих молекул Piwi белков. Однако конкретная роль большинства из этих белков, например Tudor, Tejas, SpnE, YB, boYB, Krimper, Vreteno у дрозофилы и TDRD1, TDRD2, TDRD4, TDRD6, TDRD7, TDRD9 у мыши, неясна (Handler et al., 2011; Nishida et al., 2009; Patil and Kai, 2010; Siomi et al., 2010; Zamparini et al., 2011). Недавно опубликованы две работы, в которых был проведен полногеномный скрининг генов, вовлеченных в piPHK путь у дрозофилы (Handler et al., 2013; Muerdter et al., 2013). Эти работы простимулируют составление единой картины событий биогенеза piPHK, которая на сегодня представлена лишь отдельными элементами мозаики.

Понимание биологии piPHK неразрывно связано с пониманием структурно-функциональных характеристик piPHK кластеров, находящихся в самом начале piPHK пути и определяющих набор МЭ, которые будут супрессированы при созревании половых клеток.

II. Биология piPHK кластеров

Па. Происхождение piPHK в терминальных тканях Drosophila

Наиболее полно роль piPHK изучена в яичниках Drosophila. Яичник дрозофилы состоит из овариол, каждая из которых является рядом яйцевых камер на последовательных стадиях развития (Рис.1). Яйцевая камера содержит терминальные клетки (ооцит и 15 питающих клеток, объединенных каналами) и фолликулярные клетки, окружающие ооцит и являющиеся соматическим компонентом. К моменту откладки яйца фолликулярные и питающие клетки в нем отмирают. На апикальном конце каждой овариолы расположен гермарий, в котором находятся соматические и половые стволовые клетки, потомки которых образуют яйцевые камеры. Главная ветвь piPHK пути работает в терминальных клетках яичника, т.к. в них экспрессируются все три белка подсемейства Piwi - ядерный белок Piwi, а также цитоплазматические факторы Aubergine (Aub) и Ago3 (Brennecke et al., 2007; Li et al., 2009). В фолликулярных клетках экспрессируется только один из трех белков подсемейства Piwi - собственно Piwi. Изучение популяций piPHK в яичниках мутантов Aub и Ago3 позволило разделить МЭ на три класса: регулируемые в терминальных клетках, в соматических клетках и смешанные. Эта классификация указывает на то, где происходит экспрессия МЭ и подавление их активности с помощью piPHK. Ниже будут рассмотрены структурно-функциональные особенности piPHK кластеров, активных в фолликулярных и терминальных клетках яичников, а также в семенниках Drosophila melanogaster.

piPHK кластеры фолликулярных клеток дрозофилы

Простейшей моделью piPHK пути являются фолликулярные клетки дрозофилы. Здесь не экспрессируются многие факторы терминального piPHK пути, необходимые для амплификации piPHK, комплементарных транспозонам (Lau et al., 2009; Malone et al., 2009). Здесь также нет околоядерной структуры nuage, характерной для половых клеток и содержащей множество компонентов piPHK пути. В фолликулярных клетках происходит лишь первичный процессинг piPHK (Kawaoka et al., 2011b; Malone et al., 2009). Сравнение популяций piPHK из целых яичников и отложенных яиц, в которых отсутствуют фолликулярные клетки, показало, что в фолликулярных клетках piPHK происходят в основном из перицентромерного локуса на Х-хромосоме, ранее известного как flamenco и необходимого для контроля активности ретровирус-подобных ретротранспозонов gypsy,

половые клетки

ЛЛАлАал-

22КЭ1

О о

20A (Flamenco)

Рис. 1. piPHK кластеры в яичнике Drosophila melanogaster. В верхней части рисунка дано схематическое изображение яичника дрозофилы; слева - общий вид; справа - строение овариолы. Указаны терминальные и фолликулярные клетки. Пунктирными стрелками вынесены схемы организации piPHK кластеров в терминальных (сверху) и соматических (снизу) клетках. На каждой схеме дан общий план хромосомы, где по вертикали обозначена плотность piPHK, имеющих уникальные места картирования в геноме. piPHK кластеры расположены преимущественно в перицентромерных районах хромосом Пунктирной линией вынесены увеличенные фрагменты крупных перицентромерных piPHK кластеров (для терминальных клеток это крупнейший кластер, расположенный в локусе 42АВ на хромосоме 2; для соматических клеток -расположенный в локусе 20А на Х-хромосоме, известный как flamenco), где стрелками обозначены ориентации фрагментов МЭ, а по вертикали показана плотность piPHK на геномных + (сверху) и - (снизу) цепях piPHK происходят из обеих цепей терминального кластера, но только из одной цепи соматического кластера.

ZAM, Idefix, экспрессирующихся в фолликулярных клетках и способных инфицировать половые клетки (Desset et al., 2003; Malone et al., 2009; Pelisson et al., 1994; Prud'homme et al., 1995). Это наблюдение было подтверждено секвенированием piPHK из яичников с

нарушенным терминальным piPHK путем (Li et al., 2009), а также из культуры соматических клеток яичника дрозофилы (ovarian somatic cells, OSC) (Lau et al., 2009; Saito et al., 2009). Подавляющее число уникальных piPHK из локуса flamenco картируются только на одну из цепей локуса, что предполагает их образование из длинного одноцепочечного транскрипта (Рис.1). Важно, что фрагменты МЭ в этом локусе находятся в противоположной ориентации относительно цепи, продуцирующей piPHK (Brennecke et al., 2007). Таким образом, достигается обогащение популяции теми piPHK, которые комплементарны мРНК активных транспозонов и, следовательно, могут их эффективно супрессировать (Pelisson et al., 2007).

Ранее было показано, что интеграция трансгенов в дистальную область flamenco нарушает работу локуса и активирует ретротранспозон gypsy, что указывало на присутствие дискретного промотора, который инициирует транскрипцию предшественника (Robert et al., 2001). Действительно, в таких мутантах количество piPHK из локуса flamenco резко снижается (Brennecke et al., 2007). Недавно на клетках OSC методом иммунопреципитации хроматина с последующим секвенированием (ChIP-seq) было показано наличие дискретного промотора РНК полимеразы II в дистальной области flamenco (Sienski et al., 2012). Для терминальных piPHK кластеров шелкопряда также показана зависимость их экспрессии от РНК полимеразы II (Kawaoka et al., 2012а; Kawaoka et al., 2012b). По-видимому, piPHK кластеры транскрибируются с помощью РНК полимеразы II у разных организмов.

Соматические клетки яичника дрозофилы продуцируют также piPHK из мРНК некоторых генов (Robine et al., 2009; Saito et al., 2009). Главным источником генных piPHK в этих клетках является ген, кодирующий транскрипционный фактор Traffic Jam (tj). Интересной особенностью генных piPHK является то, что они образуются преимущественно из 3" НТО мРНК. Генные piPHK также описаны для терминальных клеток дрозофилы, шелкопряда и мыши (Aravin et al., 2007; Brennecke et al., 2007; Kawaoka et al., 2009). В случае генов мыши также наблюдается продукция piPHK преимущественно из 3' НТО (Robine et al., 2009). На данный момент не ясно, играют ли биологическую роль генные piPHK дрозофилы или же они являются «ошибкой» piPHK процессинга. В пользу последнего варианта говорит их низкая представленность по сравнению с транспозонными piPHK и присутствие некоторого фонового количества piPHK практически из всех мРНК.

Как уже было упомянуто, Piwi является единственным ядерным представителем Piwi белков дрозофилы. В связи с этим было предположено, что в отличие от белков Aub и Ago3, локализованных в nuage и использующих свои каталитические центры для разрезания мРНК, комплементарных piPHK, Piwi вовлечен в подавление экспрессии МЭ на уровне изменения хроматина МЭ. Действительно, для супрессирующей активности Piwi важна его ядерная локализация, но не каталитическая «слайсерная» активность (Klenov et al., 2011; Saito et al., 2010; Sienski et al., 2012). Клетки OSC были использованы для демонстрации того, что Piwi вовлечен в процесс транскрипционного, а не посттранскрипционного сайленсинга МЭ (Sienski et al., 2012) (Рис. 2Б). Показано, что Piwi, загруженный piPHK, вызывает накопление хроматиновой метки, гистона НЗ, триметилированного по лизину 9 (НЗК9теЗ), на транскрибирующихся последовательностях МЭ, что приводит к нарушению связывания РНК-полимеразы II и ингибированию транскрипции (Le Thomas et al., 2013; Sienski et al., 2012). В этом процессе также задействован фактор Maelstrom (Mael), который необходим для сайленсинга мишеней, но не влияет на первичный биогенез piPHK. Таким образом, в фолликулярных клетках присутствует только ядерная ветвь piPHK-зависимого сайленсинга, которая преимущественно вызывает транскрипционное ингибирование активных транспозонов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Оловников, Иван Алексеевич, 2013 год

Список литературы

Aravin, A., Gaidatzis, D., Pfeffer, S., Lagos-Quintana, M., Landgraf, P., Iovino, N., Morris, P., Brownstein, M.J., Kuramochi-Miyagawa, S., Nakano, T., et al. (2006). A novel class of small RNAs bind to MILI protein in mouse testes. Nature 442, 203-207.

Aravin, A.A., and Bourc'his, D. (2008). Small RNA guides for de novo DNA methylation in mammalian germ cells. Genes & development 22, 970-975.

Aravin, A.A., Hannon, G.J., and Brennecke, J. (2007). The Piwi-piRNA pathway provides an adaptive defense in the transposon arms race. Science 318, 761-764.

Aravin, A.A., Klenov, M.S., Vagin, V.V., Bantignies, F., Cavalli, G., and Gvozdev, V.A. (2004). Dissection of a natural RNA silencing process in the Drosophila melanogaster germ line. Molecular and cellular biology 24, 6742-6750.

Aravin, A.A., Naumova, N.M., Tulin, A.V., Vagin, V.V., Rozovsky, Y.M., and Gvozdev, V.A. (2001). Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline. Current biology : CB 11, 10171027.

Aravin, A.A., Sachidanandam, R., Bourc'his, D., Schaefer, C., Pezic, D., Toth, K.F., Bestor, T., and Hannon, G.J. (2008). A piRNA pathway primed by individual transposons is linked to de novo DNA methylation in mice. Molecular cell 31, 785-799.

Arensburger, P., Hice, R.H., Wright, J.A., Craig, N.L., and Atkinson, P.W. (2011). The mosquito Aedes aegypti has a large genome size and high transposable element load but contains a low proportion of transposon-specific piRNAs. BMC genomics 12, 606.

Ashe, A., Sapetschnig, A., Weick, E.M., Mitchell, J., Bagijn, M.P., Cording, A.C., Doebley, A.L., Goldstein, L.D., Lehrbach, N.J., Le Pen, J., et al. (2012). piRNAs can trigger a multigenerational epigenetic memory in the germline of C. elegans. Cell 150, 88-99.

Baek, D., Villen, J., Shin, C., Camargo, F.D., Gygi, S.P., and Bartel, D.P. (2008). The impact of microRNAs on protein output. Nature 455, 64-71.

Bagijn, M.P., Goldstein, L.D., Sapetschnig, A., Weick, E.M., Bouasker, S., Lehrbach, N.J., Simard, M.J., and Miska, E.A. (2012). Function, targets, and evolution of Caenorhabditis elegans piRNAs. Science 337, 574-578.

Bartel, D.P. (2009). MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 136, 215-233.

Batista, P.J., Ruby, J.G., Claycomb, J.M., Chiang, R., Fahlgren, N., Kasschau, K.D., Chaves, D.A., Gu, W., Vasale, J.J., Duan, S., et al. (2008). PRG-1 and 21U-RNAs interact to form the piRNA complex required for fertility in C. elegans. Molecular cell 31, 67-78.

Bazzini, A.A., Lee, M.T., and Giraldez, A.J. (2012). Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science 336, 233-237.

Bernstein, E., Caudy, A.A., Hammond, S.M., and Hannon, G.J. (2001). Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 409, 363-366.

Betel, D., Sheridan, R., Marks, D.S., and Sander, C. (2007). Computational analysis of mouse piRNA sequence and biogenesis. PLoS computational biology 3, e222.

Blankenberg, D., Von Kuster, G., Coraor, N., Ananda, G., Lazarus, R., Mangan, M., Nekrutenko, A., and Taylor, J. (2010). Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists. Current protocols in molecular biology / edited by Frederick M Ausubel [et al] Chapter 19, Unit 19 10 11-21.

Bozzetti, M.P., Massari, S., Finelli, P., Meggio, F., Pinna, L.A., Boldyreff, B., Issinger, O.G., Palumbo, G., Ciriaco, C., Bonaccorsi, S., et al. (1995). The Ste locus, a component of the parasitic cry-Ste system of Drosophila melanogaster, encodes a protein that forms crystals in primary spermatocytes and mimics properties of the beta subunit of casein kinase 2.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92, 6067-6071.

Brennecke, J., Aravin, A.A., Stark, A., Dus, M., Kellis, M., Sachidanandam, R., and Hannon, G.J.

(2007). Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila. Cell 128, 1089-1103.

Brennecke, J., Malone, C.D., Aravin, A.A., Sachidanandam, R., Stark, A., and Hannon, G.J.

(2008). An epigenetic role for maternally inherited piRNAs in transposon silencing. Science 322, 1387-1392.

Bucheton, A. (1990). I transposable elements and I-R hybrid dysgenesis in Drosophila. Trends in genetics : TIG 6, 16-21.

Bushati, N., Stark, A., Brennecke, J., and Cohen, S.M. (2008). Temporal reciprocity of miRNAs and their targets during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila. Current biology : CB 18,501-506.

Campbell, C.L., Black, W.C.t., Hess, A.M., and Foy, B.D. (2008). Comparative genomics of small RNA regulatory pathway components in vector mosquitoes. BMC genomics 9, 425.

Carmell, M.A., Girard, A., van de Kant, H.J., Bourc'his, D., Bestor, T.H., de Rooij, D.G., and Hannon, G.J. (2007). MIWI2 is essential for spermatogenesis and repression of transposons in the mouse male germline. Developmental cell 12, 503-514.

Castel, S.E., and Martienssen, R.A. (2013). RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond. Nature reviews Genetics 14, 100-112.

Cecere, G., Zheng, G.X., Mansisidor, A.R., Klymko, K.E., and Grishok, A. (2012). Promoters recognized by forkhead proteins exist for individual 21U-RNAs. Molecular cell 47, 734745.

Chambeyron, S., Popkova, A., Payen-Groschene, G., Brun, C., Laouini, D., Pelisson, A., and Bucheton, A. (2008). piRNA-mediated nuclear accumulation of retrotransposon transcripts in the Drosophila female germline. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 14964-14969.

Cheloufi, S., Dos Santos, C.O., Chong, M.M., and Hannon, G.J. (2010). A dicer-independent miRNA biogenesis pathway that requires Ago catalysis. Nature 465, 584-589.

Chen, Y., Pane, A., and Schupbach, T. (2007). Cutoff and aubergine mutations result in retrotransposon upregulation and checkpoint activation in Drosophila. Current biology : CB 17, 637-642.

Chendrimada, T.P., Gregory, R.I., Kumaraswamy, E., Norman, J., Cooch, N., Nishikura, K., and Shiekhattar, R. (2005). TRBP recruits the Dicer complex to Ago2 for microRNA processing and gene silencing. Nature 436, 740-744.

Cifuentes, D., Xue, H., Taylor, D.W., Patnode, H., Mishima, Y., Cheloufi, S., Ma, E., Mane, S., Hannon, G.J., Lawson, N.D., et al. (2010). A novel miRNA processing pathway independent of Dicer requires Argonaute2 catalytic activity. Science 328, 1694-1698.

Clough, E., Moon, W., Wang, S., Smith, K., and Hazelrigg, T. (2007). Histone methylation is required for oogenesis in Drosophila. Development 134, 157-165.

Cox, D.N., Chao, A., and Lin, H. (2000). piwi encodes a nucleoplasmic factor whose activity modulates the number and division rate of germline stem cells. Development 127, 503514.

Czech, B., Malone, C.D., Zhou, R., Stark, A., Schlingeheyde, C., Dus, M., Perrimon, N., Kellis, M., Wohlschlegel, J.A., Sachidanandam, R., et al. (2008). An endogenous small interfering RNA pathway in Drosophila. Nature 453, 798-802.

Das, P.P., Bagijn, M.P., Goldstein, L.D., Woolford, J.R., Lehrbach, N.J., Sapetschnig, A., Buhecha, H.R., Gilchrist, M.J., Howe, K.L., Stark, R., et al. (2008). Piwi and piRNAs act upstream of an endogenous siRNA pathway to suppress Tc3 transposon mobility in the Caenorhabditis elegans germline. Molecular cell 31, 79-90.

de Vanssay, A., Bouge, A.L., Boivin, A., Hermant, C., Teysset, L., Delmarre, V., Antoniewski, C., and Ronsseray, S. (2012). Paramutation in Drosophila linked to emergence of a piRNA-producing locus. Nature 490, 112-115.

Deng, W., and Lin, H. (2002). miwi, a murine homolog of piwi, encodes a cytoplasmic protein essential for spermatogenesis. Developmental cell 2, 819-830.

Denli, A.M., Tops, B.B., Plasterk, R.H., Ketting, R.F., and Hannon, G.J. (2004). Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature 432, 231-235.

Desset, S., Meignin, C., Dastugue, B., and Vaury, C. (2003). COM, a heterochromatic locus governing the control of independent endogenous retroviruses from Drosophila melanogaster. Genetics 164, 501-509.

Dietzl, G., Chen, D., Schnorrer, F., Su, K.C., Barinova, Y., Fellner, M., Gasser, B., Kinsey, K., Oppel, S., Scheiblauer, S., et al. (2007). A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature 448, 151-156.

Djuranovic, S., Nahvi, A., and Green, R. (2012). miRNA-mediated gene silencing by translational repression followed by mRNA deadenylation and decay. Science 336, 237240.

Dueck, A., Ziegler, C., Eichner, A., Berezikov, E., and Meister, G. (2012). microRNAs associated with the different human Argonaute proteins. Nucleic acids research 40, 98509862.

Elbashir, S.M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K., and Tuschl, T. (2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411,494-498.

Eulalio, A., Huntzinger, E., and Izaurralde, E. (2008). Getting to the root of miRNA-mediated gene silencing. Cell 132, 9-14.

Fanti, L., Giovinazzo, G., Berloco, M., and Pimpinelli, S. (1998). The heterochromatin protein 1 prevents telomere fusions in Drosophila. Mol Cell 2, 527-538.

Filipowicz, W., Bhattacharyya, S.N., and Sonenberg, N. (2008). Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight? Nature reviews Genetics 9, 102-114.

Findley, S.D., Tamanaha, M., Clegg, N.J., and Ruohola-Baker, H. (2003). Maelstrom, a Drosophila spindle-class gene, encodes a protein that colocalizes with Vasa and RDEl/AGOl homolog, Aubergine, in nuage. Development 130, 859-871.

Fire, A., Xu, S., Montgomery, M.K., Kostas, S.A., Driver, S.E., and Mello, C.C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811.

Frost, R.J., Hamra, F.K., Richardson, J.A., Qi, X., Bassel-Duby, R., and Olson, E.N. (2010). MOVIOLI is necessary for protection of spermatocytes against retro transposons by Piwi-interacting RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107, 11847-11852.

Gangaraju, V.K., Yin, H., Weiner, M.M., Wang, J., Huang, X.A., and Lin, H. (2011). Drosophila Piwi functions in Hsp90-mediated suppression of phenotypic variation. Nature genetics 43,153-158.

Gell, S.L., and Reenan, R.A. (2012). Mutations to the piRNA Pathway Component aubergine Enhance Meiotic Drive of Segregation Distorter in Drosophila melanogaster. Genetics.

Ghildiyal, M., Seitz, H., Horwich, M.D., Li, C., Du, T., Lee, S., Xu, J., Kittler, E.L., Zapp, M.L., Weng, Z., et al. (2008). Endogenous siRNAs derived from transposons and mRNAs in Drosophila somatic cells. Science 320, 1077-1081.

Girard, A., Sachidanandam, R., Hannon, G.J., and Carmell, M.A. (2006). A germline-specific class of small RNAs binds mammalian Piwi proteins. Nature 442, 199-202.

Gregory, R.I., Yan, K.P., Amuthan, G., Chendrimada, T., Doratotaj, B., Cooch, N., and Shiekhattar, R. (2004). The Microprocessor complex mediates the genesis of microRNAs. Nature 432, 235-240.

Grentzinger, T., Armenise, C., Brun, C., Mugat, B., Serrano, V., Pelisson, A., and Chambeyron, S. (2012). piRNA-mediated transgenerational inheritance of an acquired trait. Genome research 22, 1877-1888.

Gu, S., Jin, L., Zhang, F., Huang, Y., Grimm, D., Rossi, J.J., and Kay, M.A. (2011). Thermodynamic stability of small hairpin RNAs highly influences the loading process of different mammalian Argonautes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 9208-9213.

Gu, W., Lee, H.C., Chaves, D., Youngman, E.M., Pazour, G.J., Conte, D., Jr., and Mello, C.C. (2012). CapSeq and CIP-TAP Identify Pol II Start Sites and Reveal Capped Small RNAs as C. elegans piRNA Precursors. Cell 151, 1488-1500.

Gunawardane, L.S., Saito, K., Nishida, K.M., Miyoshi, K., Kawamura, Y., Nagami, T., Siomi, H., and Siomi, M.C. (2007). A slicer-mediated mechanism for repeat-associated siRNA 5' end formation in Drosophila. Science 315, 1587-1590.

Halic, M., and Moazed, D. (2010). Dicer-independent primal RNAs trigger RNAi and heterochromatin formation. Cell 140, 504-516.

Handler, D., Meixner, K., Pizka, M., Lauss, K., Schmied, C., Gruber, F.S., and Brennecke, J. (2013). The genetic makeup of the Drosophila piRNA pathway. Molecular cell 50, 762777.

Handler, D., Olivieri, D., Novatchkova, M., Gruber, F.S., Meixner, K., Mechtler, K., Stark, A., Sachidanandam, R., and Brennecke, J. (2011). A systematic analysis of Drosophila TUDOR domain-containing proteins identifies Vreteno and the Tdrdl2 family as essential primary piRNA pathway factors. The EMBO journal 30, 3977-3993.

Hannon, G.J. (2002). RNA interference. Nature 418, 244-251.

Houwing, S., Berezikov, E., and Ketting, R.F. (2008). Zili is required for germ cell differentiation and meiosis in zebrafish. The EMBO journal 27, 2702-2711.

Houwing, S., Kamminga, L.M., Berezikov, E., Cronembold, D., Girard, A., van den Elst, H., Filippov, D.V., Blaser, H., Raz, E., Moens, C.B., et al. (2007). A role for Piwi and piRNAs in germ cell maintenance and transposon silencing in Zebrafish. Cell 129, 69-82.

Huntzinger, E., and Izaurralde, E. (2011). Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nature reviews Genetics 12, 99-110.

Hutvagner, G., McLachlan, J., Pasquinelli, A.E., Balint, E., Tuschl, T., and Zamore, P.D. (2001). A cellular function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation of the let-7 small temporal RNA. Science 293, 834-838.

Ipsaro, J.J., Haase, A.D., Knott, S.R., Joshua-Tor, L., and Hannon, G.J. (2012). The structural biochemistry of Zucchini implicates it as a nuclease in piRNA biogenesis. Nature 491, 279-283.

Iwasaki, S., Kobayashi, M., Yoda, M., Sakaguchi, Y., Katsuma, S., Suzuki, T., and Tomari, Y. (2010). Hsc70/Hsp90 chaperone machinery mediates ATP-dependent RISC loading of small RNA duplexes. Molecular cell 39, 292-299.

Jensen, S., Gassama, M.P., and Heidmann, T. (1999a). Cosuppression of I transposon activity in Drosophila by I-containing sense and antisense transgenes. Genetics 153, 1767-1774.

Jensen, S., Gassama, M.P., and Heidmann, T. (1999b). Taming of transposable elements by homology-dependent gene silencing. Nature genetics 21, 209-212.

Kalmykova, A.I., Klenov, M.S., and Gvozdev, V.A. (2005). Argonaute protein PIWI controls mobilization of retrotransposons in the Drosophila male germline. Nucleic acids research 33, 2052-2059.

Kawaoka, S., Arai, Y., Kadota, K., Suzuki, Y., Hara, K., Sugano, S., Shimizu, K., Tomari, Y., Shimada, T., and Katsuma, S. (2011a). Zygotic amplification of secondary piRNAs during silkworm embryogenesis. RNA 17, 1401-1407.

Kawaoka, S., Hara, K., Shoji, K., Kobayashi, M., Shimada, T., Sugano, S., Tomari, Y., Suzuki, Y., and Katsuma, S. (2012a). The comprehensive epigenome map of piRNA clusters. Nucleic acids research.

Kawaoka, S., Hayashi, N., Katsuma, S., Kishino, H., Kohara, Y., Mita, K., and Shimada, T. (2008a). Bombyx small RNAs: genomic defense system against transposons in the silkworm, Bombyx mori. Insect biochemistry and molecular biology 38, 1058-1065.

Kawaoka, S., Hayashi, N., Suzuki, Y., Abe, H., Sugano, S., Tomari, Y., Shimada, T., and Katsuma, S. (2009). The Bombyx ovary-derived cell line endogenously expresses PlWI/PIWI-interacting RNA complexes. RNA 15, 1258-1264.

Kawaoka, S., Izumi, N., Katsuma, S., and Tomari, Y. (2011b). 3' end formation of PIWI-interacting RNAs in vitro. Molecular cell 43, 1015-1022.

Kawaoka, S., Minami, K., Katsuma, S., Mita, K., and Shimada, T. (2008b). Developmentally synchronized expression of two Bombyx raori Piwi subfamily genes, SIWI and BmAG03 in germ-line cells. Biochemical and biophysical research communications 367, 755-760.

Kawaoka, S., Mitsutake, H., Kiuchi, T., Kobayashi, M., Yoshikawa, M., Suzuki, Y., Sugano, S., Shimada, T., Kobayashi, J., Tomari, Y., et al. (2012b). A role for transcription from a piRNA cluster in de novo piRNA production. RNA 18, 265-273.

Khurana, J.S., Wang, J., Xu, J., Koppetsch, B.S., Thomson, T.C., Nowosielska, A., Li, C., Zamore, P.D., Weng, Z., and Theurkauf, W.E. (2011). Adaptation to P element transposon invasion in Drosophila melanogaster. Cell 147, 1551-1563.

Kibanov, M.V., Egorova, K.S., Ryazansky, S.S., Sokolova, O.A., Kotov, A.A., Olenkina, O.M., Stolyarenko, A.D., Gvozdev, V.A., and Olenina, L.V. (2011). A novel organelle, the piNG-body, in the nuage of Drosophila male germ cells is associated with piRNAmediated gene silencing. Molecular biology of the cell 22, 3410-3419.

Kidwell, M.G., Kidwell, J.F., and Sved, J.A. (1977). Hybrid Dysgenesis in DROSOPHILA MELANOGASTER: A Syndrome of Aberrant Traits Including Mutation, Sterility and Male Recombination. Genetics 86, 813-833.

Kirino, Y., Kim, N., de Planell-Saguer, M., Khandros, E., Chiorean, S., Klein, P.S., Rigoutsos, I., Jongens, T.A., and Mourelatos, Z. (2009). Arginine methylation of Piwi proteins catalysed by dPRMT5 is required for Ago3 and Aub stability. Nature cell biology 11, 652-658.

Klattenhoff, C., Bratu, D.P., McGinnis-Schultz, N., Koppetsch, B.S., Cook, H.A., and Theurkauf, W.E. (2007). Drosophila rasiRNA pathway mutations disrupt embryonic axis specification through activation of an ATR/Chk2 DNA damage response. Developmental cell 12, 45-55.

Klattenhoff, C., Xi, H., Li, C., Lee, S., Xu, J., Khurana, J.S., Zhang, F., Schultz, N., Koppetsch, B.S., Nowosielska, A., et al. (2009). The Drosophila HP1 homolog Rhino is required for transposon silencing and piRNA production by dual-strand clusters. Cell 138, 1137-1149.

Klenov, M.S., Sokolova, O.A., Yakushev, E.Y., Stolyarenko, A.D., Mikhaleva, E.A., Lavrov, S.A., and Gvozdev, V.A. (2011). Separation of stem cell maintenance and transposon silencing functions of Piwi protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 18760-18765.

Kozomara, A., and Griffiths-Jones, S. (2011). miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic acids research 39, D152-157.

Kuramochi-Miyagawa, S., Kimura, T., Ijiri, T.W., Isobe, T., Asada, N., Fujita, Y., Ikawa, M., Iwai, N., Okabe, M., Deng, W., et al. (2004). Mili, a mammalian member of piwi family gene, is essential for spermatogenesis. Development 131, 839-849.

Kuramochi-Miyagawa, S., Kimura, T., Yomogida, K., Kuroiwa, A., Tadokoro, Y., Fujita, Y., Sato, M., Matsuda, Y., and Nakano, T. (2001). Two mouse piwi-related genes: miwi and mili. Mechanisms of development 108, 121-133.

Kuramochi-Miyagawa, S., Watanabe, T., Gotoh, K., Totoki, Y., Toyoda, A., Ikawa, M., Asada, N., Kojima, K., Yamaguchi, Y., Ijiri, T.W., et al. (2008). DNA methylation of retrotransposon genes is regulated by Piwi family members MILI and MIWI2 in murine fetal testes. Genes & development 22, 908-917.

Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., and Salzberg, S.L. (2009). Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome biology 10, R25.

Lau, N.C., Robine, N., Martin, R., Chung, W.J., Niki, Y., Berezikov, E., and Lai, E.C. (2009). Abundant primary piRNAs, endo-siRNAs, and microRNAs in a Drosophila ovary cell line. Genome research 19, 1776-1785.

Le Thomas, A., Rogers, A.K., Webster, A., Marinov, G.K., Liao, S.E., Perkins, E.M., Hur, J.K., Aravin, A.A., and Toth, K.F. (2013). Piwi induces piRNA-guided transcriptional silencing and establishment of a repressive chromatin state. Genes & development 27, 390-399.

Lee, H.C., Gu, W., Shirayama, M., Youngman, E., Conte, D., Jr., and Mello, C.C. (2012). C. elegans piRNAs mediate the genome-wide surveillance of germline transcripts. Cell 150, 78-87.

Lee, Y.S., Nakahara, K., Pham, J.W., Kim, K., He, Z., Sontheimer, E.J., and Carthew, R.W. (2004). Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways. Cell 117, 69-81.

Li, C., Vagin, V.V., Lee, S., Xu, J., Ma, S., Xi, H., Seitz, H., Horwich, M.D., Syrzycka, M., Honda, B.M., et al. (2009). Collapse of germline piRNAs in the absence of Argonaute3 reveals somatic piRNAs in flies. Cell 137, 509-521.

Li, H., Li, W.X., and Ding, S.W. (2002). Induction and suppression of RNA silencing by an animal virus. Science 296, 1319-1321.

Li, X.Z., Roy, C.K., Dong, X., Bolcun-Filas, E., Wang, J., Han, B.W., Xu, J., Moore, M.J., Schimenti, J.C., Weng, Z., et al. (2013). An ancient transcription factor initiates the burst of piRNA production during early meiosis in mouse testes. Molecular cell 50, 67-81.

Lim, A.K., and Kai, T. (2007). Unique germ-line organelle, nuage, functions to repress selfish genetic elements in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 6714-6719.

Liu, Q., Rand, T.A., Kalidas, S., Du, F., Kim, H.E., Smith, D.P., and Wang, X. (2003). R2D2, a bridge between the initiation and effector steps of the Drosophila RNAi pathway. Science 301, 1921-1925.

Liu, Y., Ye, X., Jiang, F., Liang, C., Chen, D., Peng, J., Kinch, L.N., Grishin, N.V., and Liu, Q. (2009). C3PO, an endoribonuclease that promotes RNAi by facilitating RISC activation. Science 325, 750-753.

Malone, C., Brennecke, J., Czech, B., Aravin, A., and Hannon, G.J. (2012). Preparation of small RNA libraries for high-throughput sequencing. Cold Spring Harbor protocols 2012, 10671077.

Malone, C.D., Brennecke, J., Dus, M., Stark, A., McCombie, W.R., Sachidanandam, R., and Hannon, G.J. (2009). Specialized piRNA pathways act in germline and somatic tissues of the Drosophila ovary. Cell 137, 522-535.

Meister, G. (2013). Argonaute proteins: functional insights and emerging roles. Nature reviews Genetics 14, 447-459.

Meister, G., and Tuschl, T. (2004). Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature 431, 343-349.

Morazzani, E.M., Wiley, M.R., Murreddu, M.G., Adelman, Z.N., and Myles, K.M. (2012). Production of virus-derived ping-pong-dependent piRNA-like small RNAs in the mosquito soma. PLoS pathogens 8, el002470.

Moretti, F., Kaiser, C., Zdanowicz-Specht, A., and Hentze, M.W. (2012). PABP and the poly(A) tail augment microRNA repression by facilitated miRISC binding. Nature structural & molecular biology 19, 603-608.

Moshkovich, N., and Lei, E.P. (2010). HP1 recruitment in the absence of argonaute proteins in Drosophila. PLoS genetics 6, el000880.

Motamedi, M.R., Verdel, A., Colmenares, S.U., Gerber, S.A., Gygi, S.P., and Moazed, D. (2004). Two RNAi complexes, RITS and RDRC, physically interact and localize to noncoding centromeric RNAs. Cell 119, 789-802.

Muerdter, F., Guzzardo, P.M., Gillis, J., Luo, Y., Yu, Y., Chen, C., Fekete, R., and Hannon, G.J. (2013). A genome-wide RNAi screen draws a genetic framework for transposon control and primary piRNA biogenesis in Drosophila. Molecular cell 50, 736-748.

Muyrers, J.P., Zhang, Y., Testa, G., and Stewart, A.F. (1999). Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination. Nucleic acids research 27, 1555-1557.

Nagao, A., Mituyama, T., Huang, H., Chen, D., Siomi, M.C., and Siomi, H. (2010). Biogenesis pathways of piRNAs loaded onto AG03 in the Drosophila testis. RNA 16, 2503-2515.

Ni, J.Q., Markstein, M., Binari, R., Pfeiffer, B., Liu, L.P., Villalta, C., Booker, M., Perkins, L., and Perrimon, N. (2008). Vector and parameters for targeted transgenic RNA interference in Drosophila melanogaster. Nature methods 5, 49-51.

Niki, Y., Yamaguchi, T., and Mahowald, A.P. (2006). Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103, 16325-16330.

Nishida, K.M., Okada, T.N., Kawamura, T., Mituyama, T., Kawamura, Y., Inagaki, S., Huang, H., Chen, D., Kodama, T., Siomi, H., et al. (2009). Functional involvement of Tudor and dPRMT5 in the piRNA processing pathway in Drosophila germlines. The EMBO journal 28,3820-3831.

Nishida, K.M., Saito, K., Mori, T., Kawamura, Y., Nagami-Okada, T., Inagaki, S., Siomi, H., and Siomi, M.C. (2007). Gene silencing mechanisms mediated by Aubergine piRNA complexes in Drosophila male gonad. RNA 13, 1911-1922.

Nishimasu, H., Ishizu, H., Saito, K., Fukuhara, S., Kamatani, M.K., Bonnefond, L., Matsumoto, N., Nishizawa, T., Nakanaga, K., Aoki, J., et al. (2012). Structure and function of Zucchini endoribonuclease in piRNA biogenesis. Nature 491, 284-287.

Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., and Siomi, M.C. (2004). Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes & development 18, 16551666.

Olivieri, D., Senti, K.A., Subramanian, S., Sachidanandam, R., and Brennecke, J. (2012). The cochaperone shutdown defines a group of biogenesis factors essential for all piRNA populations in Drosophila. Molecular cell 47, 954-969.

Pane, A., Jiang, P., Zhao, D.Y., Singh, M., and Schupbach, T. (2011). The Cutoff protein regulates piRNA cluster expression and piRNA production in the Drosophila germline. The EMBO journal 30, 4601-4615.

Pardue, M.L., and DeBaryshe, P.G. (2003). Retrotransposons provide an evolutionarily robust non-telomerase mechanism to maintain telomeres. Annu Rev Genet 37, 485-511.

Patil, V.S., and Kai, T. (2010). Repression of retroelements in Drosophila germline via piRNA pathway by the Tudor domain protein Tejas. Current biology : CB 20, 724-730.

Pek, J.W., Anand, A., and Kai, T. (2012). Tudor domain proteins in development. Development 139, 2255-2266.

Pelisson, A., Sarot, E., Payen-Groschene, G., and Bucheton, A. (2007). A novel repeat-associated small interfering RNA-mediated silencing pathway downregulates complementary sense gypsy transcripts in somatic cells of the Drosophila ovary. Journal of virology 81, 19511960.

Pelisson, A., Song, S.U., Prud'homme, N., Smith, P.A., Bucheton, A., and Corces, V.G. (1994). Gypsy transposition correlates with the production of a retroviral envelope-like protein under the tissue-specific control of the Drosophila flamenco gene. The EMBO journal 13, 4401-4411.

Preall, J.B., Czech, B., Guzzardo, P.M., Muerdter, F., and Hannon, G.J. (2012). shutdown is a component of the Drosophila piRNA biogenesis machinery. RNA 18, 1446-1457.

Prud'homme, N., Gans, M., Masson, M., Terzian, C., and Bucheton, A. (1995). Flamenco, a gene controlling the gypsy retrovirus of Drosophila melanogaster. Genetics 139, 697-711.

Rangan, P., Malone, C.D., Navarro, C., Newbold, S.P., Hayes, P.S., Sachidanandam, R., Hannon,

G.J., and Lehmann, R. (2011). piRNA production requires heterochromatin formation in Drosophila. Current biology : CB 21, 1373-1379.

Reinhart, B.J., Slack, F.J., Basson, M., Pasquinelli, A.E., Bettinger, J.C., Rougvie, A.E., Horvitz,

H.R., and Ruvkun, G. (2000). The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature 403, 901-906.

Robert, V., Prud'homme, N., Kim, A., Bucheton, A., and Pelisson, A. (2001). Characterization of the flamenco region of the Drosophila melanogaster genome. Genetics 158, 701-713.

Robine, N., Lau, N.C., Balla, S., Jin, Z., Okamura, K., Kuramochi-Miyagawa, S., Blower, M.D., and Lai, E.C. (2009). A broadly conserved pathway generates 3'UTR-directed primary piRNAs. Current biology : CB 19, 2066-2076.

Roche, S.E., and Rio, D.C. (1998). Trans-silencing by P elements inserted in subtelomeric heterochromatin involves the Drosophila Polycomb group gene, Enhancer of zeste. Genetics 149, 1839-1855.

Ronsseray, S., Josse, T., Boivin, A., and Anxolabehere, D. (2003). Telomeric transgenes and trans-silencing in Drosophila. Genetica 117, 327-335.

Rozhkov, N.V., Aravin, A.A., Zelentsova, E.S., Schostak, N.G., Sachidanandam, R., McCombie, W.R., Hannon, G.J., and Evgen'ev, M.B. (2010). Small RNA-based silencing strategies for transposons in the process of invading Drosophila species. RNA 16, 1634-1645.

Ruby, J.G., Jan, C., Player, C., Axtell, M.J., Lee, W., Nusbaum, C., Ge, H., and Bartel, D.P. (2006). Large-scale sequencing reveals 21U-RNAs and additional microRNAs and endogenous siRNAs in C. elegans. Cell 127, 1193-1207.

Saito, K., Inagaki, S., Mituyama, T., Kawamura, Y., Ono, Y., Sakota, E., Kotani, H., Asai, K., Siomi, H., and Siomi, M.C. (2009). A regulatory circuit for piwi by the large Maf gene traffic jam in Drosophila. Nature 461, 1296-1299.

Saito, K., Ishizu, H., Komai, M., Kotani, H., Kawamura, Y., Nishida, K.M., Siomi, H., and Siomi, M.C. (2010). Roles for the Yb body components Armitage and Yb in primary piRNA biogenesis in Drosophila. Genes & development 24, 2493-2498.

Saito, K., Nishida, K.M., Mori, T., Kawamura, Y., Miyoshi, K., Nagami, T., Siomi, H., and Siomi, M.C. (2006). Specific association of Piwi with rasiRNAs derived from retrotransposon and heterochromatic regions in the Drosophila genome. Genes & development 20, 2214-2222.

Savitsky, M„ Kwon, D., Georgiev, P., Kalmykova, A., and Gvozdev, V. (2006). Telomere elongation is under the control of the RNAi-based mechanism in the Drosophila germline. Genes Dev 20, 345-354.

Senti, K.A., and Brennecke, J. (2010). The piRNA pathway: a fly's perspective on the guardian of the genome. Trends in genetics : TIG 26, 499-509.

Shirayama, M., Seth, M., Lee, H.C., Gu, W., Ishidate, T., Conte, D., Jr., and Mello, C.C. (2012). piRNAs initiate an epigenetic memory of nonself RNA in the C. elegans germline. Cell 150, 65-77.

Shpiz, S., and Kalmykova, A. (2012). Control of telomere length in Drosophila. In Reviews on selected topics of telomere biology, B. Li, ed. (Rijeka, Intech), pp. 31-56.

Shpiz, S., Kwon, D., Rozovsky, Y., and Kalmykova, A. (2009). rasiRNA pathway controls antisense expression of Drosophila telomeric retrotransposons in the nucleus. Nucleic acids research 37, 268-278.

Shpiz, S., Olovnikov, I., Sergeeva, A., Lavrov, S., Abramov, Y., Savitsky, M., and Kalmykova, A. (2011). Mechanism of the piRNA-mediated silencing of Drosophila telomeric retrotransposons. Nucleic acids research 39, 8703-8711.

Sienski, G., Donertas, D., and Brennecke, J. (2012). Transcriptional silencing of transposons by Piwi and maelstrom and its impact on chromatin state and gene expression. Cell 151, 964980.

Siomi, H., and Siomi, M.C. (2009). On the road to reading the RNA-interference code. Nature 457, 396-404.

Siomi, M.C., Mannen, T., and Siomi, H. (2010). How does the royal family of Tudor rule the PlWI-interacting RNA pathway? Genes & development 24, 636-646.

Siomi, M.C., Sato, K., Pezic, D., and Aravin, A.A. (2011). PlWI-interacting small RNAs: the vanguard of genome defence. Nature reviews Molecular cell biology 12, 246-258.

Song, J.J., Smith, S.K., Hannon, G.J., and Joshua-Tor, L. (2004). Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science 305, 1434-1437.

Specchia, V., Piacentini, L., Tritto, P., Fanti, L., D'Alessandro, R., Palumbo, G., Pimpinelli, S., and Bozzetti, M.P. (2010). Hsp90 prevents phenotypic variation by suppressing the mutagenic activity of transposons. Nature 463, 662-665.

Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., and Grewal, S.I. (2005). RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 152-157.

Tam, O.H., Aravin, A.A., Stein, P., Girard, A., Murchison, E.P., Cheloufi, S., Hodges, E., Anger, M., Sachidanandam, R., Schultz, R.M., et al. (2008). Pseudogene-derived small interfering RNAs regulate gene expression in mouse oocytes. Nature 453, 534-538.

Theurkauf, W.E., Klattenhoff, C., Bratu, D.P., McGinnis-Schultz, N., Koppetsch, B.S., and Cook, H.A. (2006). rasiRNAs, DNA damage, and embryonic axis specification. Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology 71, 171-180.

Todeschini, A.L., Teysset, L., Delmarre, V., and Ronsseray, S. (2010). The epigenetic trans-silencing effect in Drosophila involves maternally-transmitted small RNAs whose production depends on the piRNA pathway and HP1. PLoS ONE 5, el 1032.

Tschiersch, B., Hofmann, A., Krauss, V., Dorn, R., Korge, G., and Reuter, G. (1994). The protein encoded by the Drosophila position-effect variegation suppressor gene Su(var)3-9 combines domains of antagonistic regulators of homeotic gene complexes. The EMBO journal 13,3822-3831.

Ushijima, Y., Inoue, Y.H., Konishi, T., Kitazawa, D., Yoshida, H., Shimaji, K., Kimura, H., and Yamaguchi, M. (2012). Roles of histone H3K9 methyltransferases during Drosophila spermatogenesis. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology 20, 319-331.

Vagin, V.V., Sigova, A., Li, C., Seitz, H., Gvozdev, V., and Zamore, P.D. (2006). A distinct small RNA pathway silences selfish genetic elements in the germline. Science 313, 320324.

Vagin, V.V., Wohlschlegel, J., Qu, J., Jonsson, Z., Huang, X., Chuma, S., Girard, A., Sachidanandam, R., Hannon, G.J., and Aravin, A.A. (2009). Proteomic analysis of murine Piwi proteins reveals a role for arginine methylation in specifying interaction with Tudor family members. Genes & development 23, 1749-1762.

van der Heijden, G.W., and Bortvin, A. (2009). Transient relaxation of transposon silencing at the onset of mammalian meiosis. Epigenetics : official journal of the DNA Methylation Society 4, 76-79.

Venken, K.J., Carlson, J.W., Schulze, K.L., Pan, H., He, Y., Spokony, R., Wan, K.H., Koriabine, M., de Jong, P.J., White, K.P., et al. (2009). Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster. Nature methods 6, 431-434.

Verdel, A., Jia, S., Gerber, S., Sugiyama, T., Gygi, S., Grewal, S.I., and Moazed, D. (2004). RNAi-mediated targeting of heterochromatin by the RITS complex. Science 303, 672676.

Voigt, F., Reuter, M., Kasaruho, A., Schulz, E.C., Pillai, R.S., and Barabas, O. (2012). Crystal structure of the primary piRNA biogenesis factor Zucchini reveals similarity to the bacterial PLD endonuclease Nuc. RNA 18, 2128-2134.

Voinnet, O. (2009). Origin, biogenesis, and activity of plant microRNAs. Cell 136, 669-687.

Volpe, A.M., Horowitz, H., Grafer, C.M., Jackson, S.M., and Berg, C.A. (2001). Drosophila rhino encodes a female-specific chromo-domain protein that affects chromosome structure and egg polarity. Genetics 159, 1117-1134.

Volpe, T.A., Kidner, C., Hall, I.M., Teng, G., Grewal, S.I., and Martienssen, R.A. (2002). Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi. Science 297, 1833-1837.

Westholm, J.O., and Lai, E.C. (2011). Mirtrons: microRNA biogenesis via splicing. Biochimie 93, 1897-1904.

Xiol, J., Cora, E., Koglgruber, R., Chuma, S., Subramanian, S., Hosokawa, M., Reuter, M., Yang, Z., Berninger, P., Palencia, A., et al. (2012). A role for Fkbp6 and the chaperone machinery in piRNA amplification and transposon silencing. Molecular cell 47, 970-979.

Yi, R., Qin, Y., Macara, I.G., and Cullen, B.R. (2003). Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs. Genes & development 17, 3011-3016.

Yoon, J., Lee, K.S., Park, J.S., Yu, K., Paik, S.G., and Kang, Y.K. (2008). dSETDBl and SU(VAR)3-9 sequentially function during germline-stem cell differentiation in Drosophila melanogaster. PloS one 3, e2234.

Zamore, P.D. (2006). RNA interference: big applause for silencing in Stockholm. Cell 127, 10831086.

Zamore, P.D., Tuschl, T., Sharp, P.A., and Bartel, D.P. (2000). RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 101, 25-33.

Zamparini, A.L., Davis, M.Y., Malone, C.D., Vieira, E., Zavadil, J., Sachidanandam, R., Hannon, G.J., and Lehmann, R. (2011). Vreteno, a gonad-specific protein, is essential for germline development and primary piRNA biogenesis in Drosophila. Development 138, 40394050.

Zhang, F., Wang, J., Xu, J., Zhang, Z., Koppetsch, B.S., Schultz, N., Vreven, T., Meignin, C., Davis, I., Zamore, P.D., et al. (2012). UAP56 couples piRNA clusters to the perinuclear transposon silencing machinery. Cell 151, 871-884.

Zhang, Z., Xu, J., Koppetsch, B.S., Wang, J., Tipping, C., Ma, S., Weng, Z., Theurkauf, W.E., and Zamore, P.D. (2011). Heterotypic piRNA Ping-Pong requires qin, a protein with both E3 ligase and Tudor domains. Molecular cell 44, 572-584.

Zheng, K., Xiol, J., Reuter, M., Eckardt, S., Leu, N.A., McLaughlin, K.J., Stark, A., Sachidanandam, R., Pillai, R.S., and Wang, P.J. (2010). Mouse MOVIOLI associates with Piwi proteins and is an essential component of the Piwi-interacting RNA (piRNA) pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107, 11841-11846.

Zofall, M., and Grewal, S.I. (2006a). RNAi-mediated heterochromatin assembly in fission yeast. Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology 71, 487-496.

Zofall, M., and Grewal, S.I. (2006b). Swi6/HPl recruits a JmjC domain protein to facilitate transcription of heterochromatic repeats. Molecular cell 22, 681-692.

Я выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю Алле Ивановне Калмыковой за незаменимую помощь при планировании, выполнении и написании работы, и Алексею Алексеевичу Аравину за полезные обсуждения и предоставленную возможность выполнить часть работы в его лаборатории. Я благодарен Сергею Шпизу, Сергею Рязанскому (ИМГ РАН) и Felix Muerder (CSHL) за помощь в экспериментах и анализе данных. Также большое спасибо за помощь в экспериментах Лаврову Сергею, Юрию Абрамову (ИМГ РАН), Antoine Molaro и Николаю Рожкову (CSHL). Отдельно благодарю Гвоздева Владимира Алексеевича, Коган Галину Львовну, сотрудников Лаборатории исследования геномных повторов эукариот ИМГ РАН и всего отдела молекулярной генетики клетки, а также членов лаборатории Алексея Аравина (Alexandre Webster, Adrien Le Thomas, Alicia Rogers, Ariel Chen, Dubravka Pezic, Edward Perkins, Evelyn Stuwe, Junho Hur, Katalin Fejes Toth, Ken Chan, Светлана Устюгова, Сергей Манаков, Ирина Мейнингер) за поддержку и обсуждение результатов на протяжении всего периода выполнения работы. Отдельное спасибо рецензентам этой работы за прочтение и критические замечания.

Благодарности