Роль локуса flamenco и генов hp1 в регуляции транспозиции ретротранспозонов группы gypsy y Drosophila melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат наук Лавренов, Антон Русланович

• Лавренов, Антон Русланович
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Лавренов, Антон Русланович

Оглавление

Список сокращений

¡.МОБИЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ И МЕХАНИЗМЫ

КОНТРОЛЯ ИХ ТРАНСПОЗИЦИИ (обзор литературы)

1.1 .Классификация МГЭ

1.2.Структура и механизм транспозиции ДКП ретротранспозонов

1.3.Механизмы регуляции транспозиции ретроэлементов

1.3.1.РНК-интерференци я

1.3.1.1.Пути РНК-интерференции, связанные с siPHK и miPHK

1.3.1.2.Путь РНК-интерференции, связанный с piPHK

1.3.2.Регуляция посредством участия белков семейства НР1

Н.МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Н.ЬМатериалы

II. 1.1 .Линии D. melanogaster и их характеристики

И. 1.2.Штаммы Escherichia coli

II. 1.3.Векторы

Н.2.Методы

II.2.1.Приготовление компетентных клеток Е. coli

П.2.2.Трансформация Е. coli

11.2.3.Выделение хромосомной ДНК

11.2.4.Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli

П.2.5.Сбор тканей для последующего выделения РНК

Н.2.6.Выделение тотальной РНК

II.2.7.Обработка ДНКазой

И.2.8.0братная транскрипция

Н.2.9.Полимеразная цепная реакция

П.2.10.Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

II.2.11 .Клонирование в плазмидах и получение векторных конструкций,

содержащих регуляторные области ретротранспозонов

Н.2.12.Электрофорез в агарозном геле

П.2.13.Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля

11.2.14.Секвенировани е

11.2.15.Получение рекомбинантных белков

II.2.16.Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии

MOPS

П.2.17.0краска полиакриламидных гелей красителем Coomassie G-250

П.2.18.Диализ растворов белков

11.2.19. Измерение концентрации белка

11.2.20. Анализ ДКН-связывающей активности рекомбинантного белка

HPla

III.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

III. 1 .Анализ транскрипции локуса flamenco

Ш.2.Молекулярно-генетический анализ сплайсинга локуса flamenco

Ш.З.Анализ экспрессии генов системы РНК-интерференции

II 1.4.Анализ роли белков семейства НР1 в регуляции транспозиции

ретротранспозонов группы gypsy

III.4.1.Анализ экспрессии генов семейства hp 1

III.4.2

Связывание белка HPla с нетранслируемыми областями

ретротранспозонов группы gypsy

III.4.2.1 Получение рекомбинантного белка HPla

III.4.2.2. Получение генетических конструкций, содержащих регуляторные

области ретротранспозонов группы gypsy

Ш.4.2.3Гель-шифт анализ

Заключение

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение 1

Список сокращений

ДКП - длинные концевые повторы мобильного генетического элемента

МГЭ - мобильный генетический элемент

миРНК (miPHK) - микроРНК

ОРС - открытая рамка считывания

п.н. - пары нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

dNTPs - дезоксинуклеозид-трифосфат

EDTA - ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

piPHK - РНК, взаимодействующие с белком Piwi

pri-miPHK - первичная (primary) миРНК

SDS - додецилсульфат натрия

MOPS - 3-[Ы-Морфолино]пропансульфоновая кислота

siPHK - малые интерферирующие РНК

SS - стабильная линия

ТАЕ - трис-ацетатный буфер

Tris - Трис - гидроксиметиленаминометан

UTR - untranslated region - нетранслируемая область гена

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль локуса flamenco и генов hp1 в регуляции транспозиции ретротранспозонов группы gypsy y Drosophila melanogaster»

Введение

Мобильные генетические элементы (МГЭ) имеют широкое распространение в геномах про- и эукариот и составляют значительную часть геномной ДНК многих изученных организмов. У эукариот выделяют 4 основных класса мобильных элементов: ДНК-транспозоны, LINE (длинные рассеянные ядерные элементы) и SINE (короткие рассеянные ядерные элементы), а также ДКП-ретротранспозоны (ретротранспозоны с длинными концевыми повторами) и эндогенные ретровирусы.

МГЭ могут существенно влиять на генетический материал хозяина. Перемещаясь внутри генома, они могут вызывать различные мутации [McClintock, 1953]. Таким образом, МГЭ играют важную роль в формировании генетической изменчивости. Некоторые МГЭ, такие как НЕТ-А и TART стали незаменимыми в поддержание теломер у дрозофилы. SINE и LINE элементы участвуют в процессах репарации двунитевых разрывов ДНК у дрожжей [Kidwell, Lisch, 1997].

Особый интерес для исследования представляют ДКП-ретротранспозоны с тремя открытыми рамками считывания (ОРС). По своей структуре они схожи с ретровирусами. Кодирующая часть ДКП-ретротранспозонов содержит ОРС, гомологичные ретровирусным генам gag, pol и env, поэтому их принято считать группой эндогенных ретровирусов. У Drosophila melanogaster данная группа представлена группой gypsy.

Высокая транспозиционная активность МГЭ опасна для организма, так как повышает частоту возникновения мутаций. По этой причине в геноме существуют механизмы, подавляющие транспозиции МГЭ.

Подавление экспрессии МГЭ у D. melanogaster может осуществляться как путем РНК-интерференции, так и путем непосредственной компактизации участков хромосом, содержащих МГЭ при активном участии белков семейства НР1 (heterochromatin protein 1). Известно, что эти два пути тесно связаны между собой: РНК-интерференция играет важную роль в формировании гетерохроматина и, по-видимому, направляет его формирование [Lippman, Martienssen, 2004]. Мутации в генах, задействованных в механизме РНК-интерференции, приводят к снижению уровня гистона НЗ, метилированного по лизину в 9-м положении (НЗК9), и к неправильной локализации гетерохроматиновых белков семейства НР1 на хромосомах [Moshkovich, Lei, 2010]. В свою очередь, белки семейства НР1 принимают активное участие в регуляции экспрессии кластеров малых РНК, необходимых для процесса РНК-интерференции [Klattenhofif, 2009; Basquin, 2014].

Линия SS [Ким и др., 1986; 1989] имеет мутантный фенотип flamenco, который характеризуется повышенной частой транспозиции МГЭ группы gypsy. Фенотип flamenco может быть обусловлен разными причинами. В генотипе линии SS может присутствовать мутация в локусе flamenco. Установлено, что flamenco контролирует транспозицию элемента gypsy . Локус flamenco локализован в перицентромерном районе X-хромосомы и представляет собой кластер-матрицу для считывания предшественника малых РНК, ассоциированных с белком PIWI (piPHK). Не исключено, что в генотипе линии SS имеются мутации в генах, задействованных в процессинге первичных транскриптов подобных кластеров. Также возможны нарушения со стороны генов семейства hpl.

Цели и задачи исследования

Целью работы было исследование механизмов регуляции транспозиции ретротранспозонов группы gypsy у Drosophila melanogaster. Были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ экспрессии на уровне транскрипции локуса flamenco, контролирующего транспозиции мобильных генетических элементов группы gypsy, в линии SS, мутантной по данному локусу.

2. Провести анализ экспрессии на уровне транскрипции генов системы РНК-интерференции piwi, ago3, zuc, aub в линии SS, мутантной по локусу flamenco .

3. Проанализировать экспрессию на уровне транскрипции генов hpla, hplb, hplc, hpld, hple, кодирующих гетерохроматиновые белки семейства Hpl, в линии SS D. melanogaster, мутантной по локусу flamenco.

4. Получить рекомбинантный белок HP 1а и проанализировать взаимодействие данного белка с регуляторными областями элементов группы gypsy.

Научная новизна и практическая значимость работы

В работе проведен комплексный анализ экспрессии генов, участвующих в регуляции транспозиционной активности ретротранспозонов группы gypsy на линиях D. melanogaster с фенотипом flamenco-.

Проведен сравнительный анализ связывания белка HP 1а с нетранслируемыми областями ретротранспозонов группы gypsy.

Полученные данные могут быть использованы в дальнейшем для исследования вопросов, связанных с механизмами контроля ретроэлементов и ретровирусов в геноме эукариот.

Апробация результатов.

Работа прошла апробацию на VII, VIII и IX конференциях молодых ученых МБР РАН (Москва, 2011, 2012, 2013), XX и XXI международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013» и «Ломоносов-2014» (Москва) и семинарах лаборатории генетики животных Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Личное участие автора. Основная часть работы выполнена непосредственно автором. Эксперименты по измерению уровней экспрессии локуса flamenco и генов семейства hpl выполнялись совместно с аспирантом Потаповой М.В. и студентом магистратуры Шмельковой А.О. соответственно. Поставленные задачи решены с применением современных методов генетики. Выводы сделаны на основании собственных оригинальных данных.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 101 страницах, содержит 23 рисунка, 2 таблицы, 1 приложение и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 128 цитируемых источника.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК - 2, тезисов докладов и материалов конференций - 7.

I. МОБИЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ И МЕХАНИЗМЫ КОНТРОЛЯ ИХ ТРАНСПОЗИЦИИ (обзор литературы)

L1. Классификация МГЭ

Мобильные генетические элементы представляют собой последовательности ДНК, способные перемещаться внутри генома.

МГЭ имеют широкое распространение и составляют большую часть геномной ДНК многих изученных организмов. У эукариот выделяют 4 основных класса мобильных элементов: ДНК-транспозоны и ретроэлементы, такие как LINE (Длинные рассеянные ядерные элементы), SINE (короткие рассеянные ядерные элементы) и ДКП-ретротранспозоны.

Класс Механизм транспозиции Структура

ДНК транспозоны Используя транспозазу TIR 1 Transposa» | TIR*"4"^

LINE Через РНК посредник J— poly (A)

SINE 1Д. Г'! |)oh (A)

ДКП- ретротранспозоны

1 *У p—^ |Lü—

Рис.1. Классификация мобильных генетических элементов. У большинства ДНК-транспозоны распространены в меньшей

степени, чем ретроэлементы. В отличие от других классов МГЭ, транспозиция данных элементов осуществляется исключительно путем вырезания и последующего встраивания элемента. Автономные ДНК-транспозоны содержат ген, кодирующий фермент транспозазу. Транспозаза узнает короткие инвертированные повторы, имеющиеся на концах МГЭ, и осуществляет вырезание. При этом транспозаза может способствовать транспозиции неавтономных элементов, не содержащих в своей последовательности гена транспозазы. Увеличение копий ДНК-транспозонов происходит благодаря процессам рекомбинации и репликации.

Ретроэлементы осуществляют перемещение через РНК-посредник. Обратная транскриптаза, кодируемая элементами, синтезирует комплементарную ДНК (кДНК) на основе РНК ретротранспозона, а затем встраивает полученную копию в геном. Такой способ интеграции называют ретротранспозицией.

LINE-элементы имеют две открытые рамки считывания (ОРС1 и ОРС2). ОРС1 кодирует РНК-связывающий белок, а ОРС2 — нуклеазу и обратную транскриптазу. Транскрипция LINE инициируется с 5' промотора РНК-полимеразы II и терминируется поли-А хвостом на З'-конце.

SINE элементы намного короче LINE из-за отсутствия генов, кодирующих собственные ферменты. Хотя у SINE элементов имеются и промоторная область, и поли-А конец, для транспозиции SINE заимствуют обратные транскриптазы у LINE.

Ретроэлементы с ДКП составляют значительную часть геномов эукариот. По своей структуре они схожи с ретровирусами. Кодирующая часть ДКП-ретротранспозонов содержит три ОРС, гомологичные

ретровирусным генам gag, pol и env, поэтому их принято считать группой эндогенных ретровирусов.

МГЭ могут существенно влиять на генетический материал хозяина. Перемещаясь внутри генома, они могут вызывать различные мутации [McClintock, 1953]. Таким образом, МГЭ играют важную роль в формировании генетической изменчивости. Некоторые МГЭ, такие как НЕТ-А и TART стали незаменимыми в поддержание теломер у дрозофилы. SINE и LINE элементы участвуют в процессах репарации двунитевых разрывов ДНК у дрожжей [Kidwell, Lisch, 1997].

1.2. Структура и механизм транспозиции ДКП ретротранспозонов

Как упоминалось выше, ДКП-ретротранспозоны имеют схожее с ретровирусами строение и механизм репликации. С обоих концов они окружены длинными концевыми повторами (ДКП). В структуре ДКП разделяют три основные области U3, R и U5. Эти области играют важную роль при обратной транскрипции. В U3 (Unique 3' region) участке расположены элементы энхансера и промотора. В конце участка U3 и начале области R имеется ТАТА-бокс.

ТАТА-бокс служит промотором для транскрипции РНК-полимеразой II. В нетранслируемых областях элементов содержатся последовательности энхансеров, предположительно регулирующие количество производимой транскрипции. Транскрипция идет через всю длину ретроэлемента до пол и-А конца 3'LTR. Полученный транскрипт выступает матрицей для обратной транскрипции. Затравкой для обратной полимеразы служит тРНК, отжигающаяся в пpeдeлax5'LTR. Далее происходит синтез ДНК

копии с последующим вытеснением затравки, а затем частично деградирует матричная РНК. Оставшаяся матричная РНК служит затравкой для синтеза второй ДНК-цепи (рис.2).

-| U3 R U5|

|U3 R U5j~

RU5

транскрипция

_Ш R

U3 RU5

U3 R U5

Ф

из R U5

U3RU5

деградация конца РНК

U5

iPHK затравка синтеза первой цепи

U3 R

завершение синтеза 2-й нити

RU5

синтез 1-й нити ДНК

деградация нити РНК и затравливание синтеза 2-й нити ДНК

о

Рис.2. Схема репликации МГЭ. Объяснения в тексте.

Кодирующая часть ДКП-ретротранспозонов может содержать одну, две или три ОРС, гомологичные ретровирусным генам gag, pol и env.

Ген gag

Ген gag схож по структуре продукта с ретровирусным белком GAG, но не содержит консервативный РНК-связывающий мотив Cys-X2-His-X4-Cys, встречающийся у других ретроэлементов. Основной его функцией является формирование белково-нуклеиновых комплексов, которые сходны с вирусными частицами ретровирусов.

Ген pol

Так как ОРС, кодирующие продукты gag и pol, слегка перекрываются, экспрессия второй рамки считывания осуществляется в виде составного gag-pol-полипептида после сдвига рибосомы при трансляции. Продуктами гена pol являются следующие ферменты:

Протеаза.

Область гена pol способна кодировать белок, сходный по структуре с кислыми протеазами, такими как пепсин. Известно, что протеазы необходимы для транспозиции, однако механизм их действия изучен мало. Фермент осуществляет протеолиз полипротеинового предшественника, кодируемого ретротранспозоном. В результате протеолиза образуются более мелкие белковые продукты, соответствующие доменам протеазы, обратной транскриптазы, рибонуклеазы Н, интегразы [Hansen et al., 1992].

Обратная транскргттаза.

Аминокислотная последовательность обратной транскриптазы схожа с последовательностями ретровирусов и других ретроэлементов. Активность обратной транскриптазы влияет на транспозиционную активность элементов.

Рибонуклеаза Н.

Домен рибонуклеазы Н расположен непосредственно вблизи домена обратной транскриптазы. У ретровирусов рибонуклеаза Н и обратная транскриптаза функционируют в составе одного белка. Скорее всего, ретроэлементы в этом отношении также сходны с ретровирусами.

Интеграза.

Интеграза - фермент, осуществляющий встраивание обратного транскрипта в геном хозяина. Механизм интеграции имеет три отличительные особенности:

1) Место встраивания ретровируса неспецифично и осуществляется путем незаконной рекомбинации.

2) Образуются прямые повторы нескольких оснований ДНК хозяина, которые фланкируют провирус, из-за дупликации короткой нуклеотидной последовательности в участке интеграции.

3) Интеграция ретровирусов происходит путем встраивания специфического участка вирусной ДНК в неспецифический сайт клеточной ДНК.

Ген env

Продуктами гена env являются компоненты, необходимые для взаимодействия вирусной частицы с рецепторами на мембране клетки. Первоначально было высказано предположение, что МГЭ gypsy является ретровирусом дрозофил, вскоре это было подтверждено экспериментами in vivo [Kim et al, 1994].

У Drosophila melanogaster выделяют три группы ретротранспозонов

gypsy, copia и BEL (рис.3).

Группа gypsy представлена транспозонами с одной, двумя или тремя ОРС, в то время как copia и BEL имеют лишь одну ОРС. Ретротранспозоны copia имеют консервативный домен в полипептиде, кодируемом pol ОРС. Группа BEL также имеет высококонсервативные домены пептидазы_А17.

Ш

тя

Рг RTl RNaseH In

г

BEL

! gag pol

Pi In RT2 RNase H

■ P°l i

Pi In RT2 RNase H

y copia

Л

V gypsy

Pi RTl RNaseH In Pi RTl RNaseH In

Рис. 3 Структурная организация ДКП-ретротранспозонов D. Melanogaster. RT - обратная транскриптаза, In - интеграза, Pr - протеаза. . [Nefedova, Kim, 2009]

В состав группы gypsy входят три подгруппы:

1) Элементы с одной ОРС, кодирующей gag-pol белковый предшественник, а также сплайсированная РНК, кодирующая только gag-белок [Brierley et al., 1990]. К этой подгруппе относятся micropia, blastopia, mdg и Invader.

2) Элементы 412, Blood, mdgl, Stalker, Tabor., которые содержат две слегка перекрывающиеся ОРС, кодирующие gag и /?о/-продукты.

3) Элементы gypsy, ZAM, Idefix, Tirant, Quasimodo, nomad (opus), 17.6, 297, rover (pregun), springer, gtwin, которые подобно ретровирусам способны образовывать нуклеопротеидные вирусоподобные или настоящие вирусные частицы, благодаря третьей ОРС, кодирующей env-подобный белок [Shiba et al., 1983, Syomin et al., 1993]. В эту подгруппу также входят элементы McClintock, qbert, HMS-Beagle и Burdock с двумя ОРС, являющиеся предшественниками или производными ретротранспозонов rover, ZAM, nomad и gypsy с тремя ОРС соответственно [Нефедова, 2009]. Transpac входит в данную подгруппу, так как имеет сходство не с отдельными элементами, но со всей подгруппой в целом.

Высокая транспозиционная активность МГЭ опасна для организма, так как повышает частоту возникновения мутаций. По этой причине в геноме существуют механизмы, подавляющие транспозиции МГЭ

1.3. Механизмы регуляции транспозиции ретроэлементов

Подавление экспрессии мобильных генетических элементов (МГЭ) у Drosophila melanogaster может осуществляться как путем РНК-интерференции, так и путем непосредственной компактизации участков хромосом, содержащих МГЭ.

1.3.1. РНК-интерференция

РНК-интерференция - механизм подавления экспрессии генов на посттранскрипционном уровне, вызванный появлением в клетке гомологичной двухцепочечной РНК (дцРНК).

Существует три основных пути РНК сайленсинга с участием трех различных популяций малых PHK-siPHK, микроРНК и piPHK.

1.3.1.1. Пути РНК-интерференции, связанные с siPHK и miPHK

Триггером механизма РНК-интерференции является дцРНК, которая может быть введена в клетку извне, образоваться в результате двунаправленной транскрипции гена, а в случае некоторых вирусов, появиться на определенных этапах их жизненного цикла.

РНКаза III Dicer процессирует дцРНК на siPHK и miPHK. Чтобы отщепить siPHK из дцРНК Dicer 2 необходимо узнать два 3'-выступающих нуклеотида и фосфат на 5'-конце у дцРНК. Отщепившаяся siPHK связывается с белком Ago 2, а затем включается в состав РНК-белкового комплекса siRISC, чтобы связаться с комплементарной мРНК. После связывания происходит разрезание и деградация мРНК. siPHK представляет собой двуцепочечную РНК длиной 20-23 нуклеотида с выступающими З'-концами. На каждой нуклеотидной цепи имеется фосфатная группа на 5'-конце и гидроксильная - на З'-конце. Субстратом для получения siPHK являются двуцепочечные РНК или РНК, содержащие шпильки (рис.4).

Другой класс малых РНК, miPHK, образуется в результате процессинга шпилечных структур РНК (pre-miPHK), кодируемых хозяйским геномом. Известно, что miPHK играют важную роль в процессах роста и развития [Abrahante et al., 2003; Brennecke et al., 2003;

Lee et al., 1993; Lin et al., 2003; Llave et al., 2002; Palatnik et al., 2003; Reinhart et al., 2000]. Гены miPHK транскрибируясь образуют транскрипт, называемый pri-miPHK (primary micro РНК). Стандартная pri-miPHK состоит из шпильки, имеющей дуплекс длиной порядка 33 нуклеотидов, концевую петлю и фланкирующие ее одноцепочечные участки. Комплекс Drosha/Pasha, состоящий из

эндо-/экзогенная дцРНК

Ago 2

Рис.4 Путь РНК-интерференции, связанный с siPHK. Объяснения в

тексте

РНКазы III и белка, связывающего двуцепочечную РНК, осуществляет вырезание из pri-miPHK 70-нуклеотидного шпилечного участка - рге-miPHK, имеющего фосфатную группу на 5'-конце и двухнуклеотидный выступ на 3'-конце. Субстратом комплекса Drosha/Pasha является шпилька с петлей, состоящей не менее чем из 10 нуклеотидов. Вырезанная рге-

miPHK переносится с помощью экспортина-5-ranGTP в цитоплазму. В цитоплазме с pre-miPHK связывается белок Dicer и вырезает 22-нуклеотидную miPHK, которая включается в комплекс miRISC. miPHK с составе RISC-комплекса способна узнавать не полностью гомологичные мРНК-мишени, не вызывая при этом их разрезания, а останавливая процесс трансляции [Humphreys et al., 2005] (рис.5).

Рис.5 Путь РНК-интерференции, связанный с miPHK. Объяснения в

тексте.

Данные пути РНК-интерференции могут пересекаться (Lee, 2004).

Дрозофила имеет два гена семейства Dicer - dicer-1 (dcr-1) и dicer-2 (dcr-2). Большинство ортологов Dicer содержат DExH-подобный АТФ-зависимый РНК-хеликазный домен и PAZ-домен, который так же можно найти в компонентах RISC.

Ген dicer-1 не содержит функционального хеликазного домена, а в гене dicer-2 нет PAZ домена (рис.6). Dcr-1 и Dcr-2 имеют разные биохимические активности. Поэтому Dcr-1 предпочтительнее процессирует шпилечные РНК в miPHK, a Dcr-2 - дцРНК в si РНК.

DCR-1

HELC

PAZ

RNI RNII DRB

224S

HELN

DCR-2

HELC

RNI RNII DRB 1722

Рис.6. Схемы белков Dcr-1 и Dcr-2. HELC - С - хеликазный домен, HELN -DExH-box, RN - Rnase 111,ВРВ-дцРНК-связывающий домен. PAZ (Piwi/Argonaute/Zwille, от названий белков, в которых этот домен был впервые обнаружен).

Несмотря на специфичность Der-1 и Dcr-2, оба этих белка участвуют в siPHK-направленном подавлении активности генов. В обоих случаях требование не является абсолютным, белки взаимозаменяемы. Dcr-1 и Dcr-2 требуются для включения siPHK в siRISC, но играют разные роли. Dcr-2 требуется для формирования устойчивого комплекса siRNA-белка, который

содержит Dcr-2 и R2D2 [Liu et al., 2003; Pham et al., 2004]. Этот комплекс начинает собирание siRISC. Dcr-1 не является необходимым для формирования устойчивого комплекса инициатора, зато принимает участие в формировании устойчивого промежуточного звена, необходимого для сборки комплекса siRISC. Dcr-1 в пределах комплекса инициатора облегчает устойчивую ассоциацию других факторов и формирование промежуточного комплекса.

Dcr-1, но не Dcr-2, требуется для подавления активности гена с помощью miRNAs. Потеря функционального гена dicer-2 не сильно отражается на развитии дрозофилы. Вероятно потому, что Dcr-1 обладает слабой процессирующей дцРНК активностью, что восполняет потерю Dcr-2.

Dcr-1 способен включать miPHK в комплекс RISC с расщепляющей активностью, а также может включать si РНК в RISC, блокирующий трансляцию.

1.3.1.2. Путь РНК-интерференции, связанный с piPHK

Сайленсинг транспозонов на этапах зародышевого развития осуществляется Piwi interacting РНК (piPHK) [Malone and Hannon, 2009].

piPHK имеют длину 25-29 нуклеотидов, на 5'-конце имеют фосфатную группу и, как правило, остаток уридина [Saito et al. 2006; Vagin et al. 2006; Brennecke et al. 2007], a на З'-конце несут 2л-0-метил, который образуется с помощью РНК-метилтрансферазы семейства Hen-1 [Horwich et al., 2007]. Впервые они были обнаружены при изучении локуса Stellate, состоящего из повторяющихся копий гена, кодирующего гомолог киназы казеина II [Livak, 1990]. Последовательности piPHK соответствуют областям генома, сильно обогащенным мобильными элементами и

другими повторяющимися последовательностями [Aravin et al., 2003]. У дрозофилы основную часть piPHK составляет подкласс rasiPHK, то есть короткие РНК, образующиеся из ретротранспозонов и других повторов [Aravin et al., 2006]. piPHK ассоциированы со всеми белками семейства Piwi.

Механизм биогенеза piPHK плохо изучен. В терминальных тканях дрозофил, которые состоят из терминальных клеток и соматических фолликулярных клеток, окружающих их, работают различные пути биогенеза piPHK [Li et al., 2009; Malone et al., 2009]. Как отмечалось выше, большинство из уникальных piPHK получены из богатых транспозонами гетерохроматиновых локусов, таких как flamenco [Brennecke et al., 2007; Yin and Lin, 2007]. Кластеры piPHK содержат антисмысловые последовательности к мРНК активных транспозонов, эти аЕггисмысловые РНК ассоциированы с белками Piwi и Aubergine семейства PIWI [Brennecke et al., 2007; Gunawardane et al., 2007; Yin and Lin, 2007]. Смысловые РНК из кластеров piPHK ассоциируются с белком Argonaut (Ago3) [Brennecke et al., 2007; Gunawardane et al., 2007]. Транскрипты piPHK-кластеров экспортируются в цитоплазму, где множество факторов осуществляют биогенез piPHK. Большая часть открытых факторов располагаются в точке рядом с ядерной оболочкой клетки: Yb-тела у соматических клеток яичников и внутриклеточные гранулы в генеративных клетках. Yb-тела и внутриклеточные гранулы ассоциированы с митохондриями, а важный фактор биогенеза piPHK Zucchini интегрирован в мембрану митохондрии [Ipsaro et al., 2012; Nishimasu et al., 2012; Saito et al., 2010]. Антисмысловые РНК, связываясь с белками Piwi и Aubergine, осуществляют разрезание смысловой последовательности транскрипта активного транспозона на расстоянии 10 нуклеотидов от 5' конца. Продукты такого разрезания связываются с Ago3. Комплекс piRNA-Ago3 осуществляет вырезание

piPHK противоположной полярности, ассоциированной с Aub и Piwi, и т.д. Таким образом, в результате этого процесса в клетке накапливаются короткие смысловые и антисмысловые РНК, перекрывающиеся на 10 п.н. Этот процесс был назван «пинг-понг» (рис.7). После формирования piRISC комплексов происходит их транспортировка в ядро, где они осуществляют транскрипционный сайленсинг транспозонов [Sienski et al., 2012; Wang and Elgin, 2011; Le Thomas et al., 2013; Rozhkov et al., 2013].

3'-

5'U — -A —

разрезание

■N ■N

-5'

транокрипт кластера piPHK или транскрипт МЭ

Aub

5'U-

антисмысловая

piPHK

■3'

3'-

5'

АСЮЗ

транскрипт кластера piPHIC

-А-U-

•5'

разрезание

AG03

■5'

смысловая piPHKl

-3'

Рис.7 Модель механизма амплификации piPHK - «Пинг-понг». [Brennecke et al., 2007].

В качестве источника первичных piPHK у D. melanogaster может выступать локус flamenco. Первичные piPHK, образованные из

транскрипта локуса flamenco, являются «затравкой» для образования вторичных piPHK путем пинг-понг механизма уже с участием смысловых транскриптов канонических ретроэлементов [Brennecke et al., 2007].

Локус flamenco подвергается альтернативному сплайсингу. Предположительно, сплайсинг необходим для облегчения переноса транскриптов в перинуклеарное пространство DotCOM, где осуществляется их перенос в Yb-тело для дальнейшего процессинга на малые РНК (рис.8).

? + HPld

транскрипция piPHK кластера

i альтернативный сплайсинг

сайленсинг

Dot СОМ

— ядро

экспорт piPHK предшественника^ L

%

^ Shu

<9

Yb-body

Armi Fs(1)Yb

Vret SoYb Piwi

цитоплазма

импорт

комплекса piRISC

биогенез piPHK

Рис.8 Предположительная схема механизма контроля транспозиции ретротранспозонов у Drosophila melanogaster.

В процессе РНК-интерференции также задействованы белки семейства НР1. Гетерохроматиновые белки способны активировать

транскрипцию кластеров piPHK. Также было показано взаимодействие белков НР1 с белками PIWI. У некоторых мутантов по генам hpl наблюдается схожее с мутантами по генам РНК-интерференции фенотипическое проявление.

1.3.2. Регуляция посредством участия белков семейства НР1

У D.melanogaster, как и у многих эукариот, на долю гетерохроматина приходится значительная часть генома. В норме две хромосомы дрозофилы (Y и 4) почти целиком находятся в компактизованном состоянии. Несмотря на это, данные хромосомы содержат функциональные последовательности, транскрибирующиеся на определенных этапах онтогенеза [Sackton, Hartl, 2013]. Это подтверждает участие гетерохроматина в многоуровневой регуляции экспрессии генов.

Биологическая роль гетерохроматина в значительной степени остается не выявленной, и решение этого вопроса является одной из фундаментальных задач молекулярной генетики. Известно, что в этих районах локализуется большое количество повторяющихся последовательностей, основными представителями которых являются МГЭ.

Одним из первых негистоновым компонентом гетерохроматина, обнаруженным на политенных хромосомах D.melanogaster, стал белок Hp la (heterochromatin protein la) [James, Elgin, 1986]. В структуре Hp la (ген Su(var)2-5) выделяют три домена: хромодомен, хромотеневой и линкерный. Первые два домена являются высоко консервативными.

Хромодомен необходим для взаимодействия с хромосомными белками. Хромодомен имеет так называемый гидрофобный карман

(специфическая последовательность аминокислот), который участвует в белок-белковых взаимодействиях. Мутации, связанные с заменой аминокислот в гидрофобном кармане белков Hp 1а и POLYCOMB, нарушают их ассоциацию с хромосомми. Этот домен важен для взаимодействия Hp 1а с N-концом гистонового белка НЗ, когда последний неметилирован по лизину в позиции К9 [Bannister et al., 2001; Jacobs, Khorasanizadeh, 2002; Lachner et al., 2001; Nakayama et al., 2001].Также имеются доказательства прямого взаимодействия этого домена Нр1 с РНК [Piacentini et al., 2003].

В карбоксильном участке многих белков из хромо-суперсемейства имеется второй домен - хромотеневой домен. Присутствие только этого домена достаточно для связывания с гетерохроматином. Хромотеневой домен необходим для димеризации и взаимодействия с другими белками через имеющийся мотив PxVxL, где х - любая аминокислота [Smothers, Henikoff, 2000]. Достоверным партнером по взаимодействию является метилаза гистона НЗ Su(var)3-9HMTase. Принятая модель взаимодействия Нр1 с хроматином и распространение сигнала метилирования изображена на рис. 9. Этот механизм высоко консервативен и характерен для большинства эукариотических организмов, включая человека [Grewal, Elgin, 2002]. Область, расположенная между хромодоменом и хромотеневым доменом - линкерный домен - проявляет наименьшую консервативность аминокислотной последовательности. Помимо того, что этот домен соединяет два других домена Hpl, за счет него осуществляются несколько важных взаимодействий. Наряду с хромодоменом, он необходим для эффективного связывания с хроматином [Meehan et al., 2003]. В результате прямого контакта с ДНК, определяет правильный паттерн локализации на хромосоме [Smothers et al., 2001]. Фосфорилирование линкерного домена негативно сказывается на его ДНК-связывающую

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Лавренов, Антон Русланович, 2014 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Медведев Н.Н. Практическая генетика// 1968. 2 изд.

2. Лавренов А.Р., Нефедова Л.Н., Романова Н.И., Ким А.И.. Экспрессия генов семейства hpl и их возможная роль в формировании фенотипа flamenco у D. melanogaster//Биохимия. 2014. 79(11): 1554 -1560.

3. Нефедова Л.Н., Ким А.И. Эволюция эррантивирусов Drosophila melanogaster: от ретротранспозонов к ретровирусам// ЖОБ.2007

4. Урусов, Ф. А., Нефедова, Л. Н., Лавренов, А. Р., Романова, Н. И., Ким, А. И.. Генетический и молекулярный анализ комплементации локусов flamenco и piwi., // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2013. 381389.

5. Abel J., Eskeland R., Rafia G., Kremmer E.& Imhof A. Drosophila HP 1С is regulated by an autoregulatory feedback loop through its binding partner Woe. //PLoS ONE, 2009, 4: e5089.

6. Abrahante, J.E., Daul, A.L., Li, M., Volk, M.L., Tennessen, J.M., Miller, E.A., and Rougvie, A.E. The Caenorhabditis elegans hunch- back-like gene lin-57/hbl-l controls developmental time and is regulated by microRNAs. //Dev. Cell 2003, 4, 625-637.

7. Aravin, A.A., M. Lagos-Quintana, A. Yalcin, M. Zavolan, D. Marks, B. Snyder, T. Gaasterland, J. Meyer, and T. Tuschl. The small RNA profile during Drosophila melanogaster development. //Dev. Cell. 2003. 5:337-350.

8. Aravin, A., D. Gaidatzis, S. Pfeffer, M. Lagos-Quintana, P. Landgraf, N. Iovino,P. Morris, M.J. Brownstein, S. Kuramochi-Miyagawa, T. Nakano, et al. A novel class of small RNAs bind to MILI protein in mouse testes. // Nature. 2006. 442:203-207.

9. Badugu, R., Yoo, Y., Singh, P.c& Kellum, R. Mutations in the heterochromatin protein 1 (HP1) hinge domain affect HP1 protein interactions and chromosomal distribution. // Chromosoma, 2005, 113: 370-384.

10. Baldrich E., Dimitri P., Desset S., Leblanc P., Codipietro D., Vaury C. Genomic distribution of the retrovirus-like element ZAM in Drosophila. // Genetica. 1997;100(l-3):131-40.

11. Bannert, N.i£ Kurth, R. Retroelements and the human genome: New perspectives on an old relation. //PNAS, 2004, 101: 14572-14579.

12. Bannister, A., Zegerman, P., Partridge, J., Miska, E.& Thomas, J. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. //Nature, 2001, 410:120-124.

13. Basquin, D., Spierer, A., Begeot, F., Koryakov, D. E., Todeschini, A.-L., Ronsseray, S., Delattre, M.. The Drosophila Su(var)3-7 gene is required for oogenesis and female fertility, genetically interacts with piwi and aubergine, but impacts only weakly transposon silencing. // PloS One, 2014 9(5),

14. Brierley, C. and Flavell, A J. The retrotransposon copia controls the relative levels of its gene products post-transcriptionally by differential expression from its two major mRNAs. // Nucleic Acids Res. 1990. 18: 29472951

15. Brennecke, J., A.A. Aravin, A. Stark, M. Dus, M. Kellis, R. Sachidanandam, and GJ. Hannon. Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila. II Cell. 2007. 128:1089-1103.

16. Brennecke, J., Hipfner, D.R., Stark, A., Russell, R.B., and Cohen, S.M. bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid in Drosophila. //Cell.

2003.773, 25-36.

17. Brennecke, J., C.D. Malone, A.A. Aravin, R. Sachidanandam, A. Stark, and GJ. Hannon. An epigenetic role for maternally inherited piRNAs in transposon silencing. //Science. 2008. 322:1387-92.

18. Brower-Toland, B„ Findley, S., Jiang, L., Liu, L.& Yin, H.2007 Drosophila PIWI associates with chromatin and interacts directly with HP la. //Genes Development, 2007,21: 2300-2311.

19. Blumenstiel, J.P. and D.L. Hartl.. Evidence for maternally transmitted small interferingRNA in the repression of transposition in Drosophila virilis. //Proc Natl Acad Sci USA. 2005. 102: 15965-70.

20. Coffin, J., Hughes, S.c£ Varmus, H. Retroviruses. //Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997.

21. Conte, C., Dastugue, B.c£ Vaury, C. Coupling of Enhancer and Insulator Properties Identified in Two Retrotransposons Modulates Their Mutagenic Impact on Nearby Genes . // Molecular and Cellular Biology, 2002, 22: 1767-1777 .

22. Cordaux, R.c£ Batzer, M. The impact of retrotransposons on human genome evolution. //Nature Reviews Genetics, 2009, 10: 691-703.

23. Coustham, V., Bedet, C., Monier, K., Schott, S., Karali, M.& Palladino, F. The C. elegans HP1 homologue HPL-2 and the LIN-13 zinc finger protein form a complex implicated in vulval development. //Developmental Biology, 2006, 297: 308-322.

24. Crittenden, L., Salter, D.& Federspiel, M. Segregation, viral phenotype, and proviral structure of 23 avian leukosis virus inserts in the germ line of chickens. // Theoretical and Applied Genetics, 1989, 77: 505-515.

25. Dennis, C., Zanni, V., Brasset, E., Eymery, A., Zhang, L., Mteirek, R., ... Vaury, C. . "Dot COM", a nuclear transit center for the primary piRNA pathway in Drosophila. //PloS One, 2013, 8(9)

26. Desset, S., Meignin, C., Dastugue, B., & Vaury, C. COM, a heterochromatic locus governing the control of independent endogenous retroviruses from Drosophila melanogaster. // Genetics. 2003., 164(2), 501-9.

27. Ding, S.-W.C& Voinnet, O. Antiviral Immunity Directed by Small RNAs. // Cell. 2007. 130: 413-426.

28. Dohke, K., Miyazaki, S., Tanaka, K., Urano, T., Grewal, S.& Murakami, Y. Fission yeast chromatin assembly factor 1 assists in the replication-coupled maintenance of heterochromatin. //Genes Cells. 2008. 13: 1027-1043.

29. Dunn, C., Romanish, M., Gutierrez, L., van de Lagemaat, L.& Mager, D. Transcription of two human genes from a bidirectional endogenous retrovirus promoter// Gene, 2006. V. 366.

30. Eissenberg, J.<£ Hartnett, T. A heat shock-activated cDNA rescues the recessive lethality of mutations in the heterochromatin-associated protein HP1 of Drosophila melanogaster. //Mol. Gen. Genet., 1993, 240: 333-338.

31. Fablet M., McDonald J.F., Biermont C., Vieira C. Ongoing loss of the tirant transposable element in naturalpopulations of Drosophila simulans. //Gene, 2009, 375: 54-62

32. Fanti, L.& Pimpinelli, S. HP1: a functionally multifaceted protein. //Curr. Opin. Genet. Dev., 2008, 18: 169-174.

33. Fanti, L., Giovinazzo, G., Berloco, M.c£ Pimpinelli, S. The heterochromatin protein 1 prevents telomere fusions in Drosophila. //Mol. Cell,

1998,2: 527-538.

34. Font-Burgada, J., Rossell, D., Auer, H.& Azorin, F. Drosophila HPlc isoform interacts with the zinc-finger proteins WOC and relative-of-WOC to regulate gene expression. //Genes Development, 2008, 22: 3007-3023.

35. Fritz, J. Nod-like proteins in immunity, inflammation and disease. // Nature Immunology, 2006, 7: 1250 - 1257.

36. Gillespie, D.dt Berg, C. Homeless is required for RNA localization in Drosophila oogenesis and encodes a new member of the DE-H family of RNA-dependent ATPases. //Genes Development, 1995, 9: 2495-5208.

37. Goriaux, C., Desset, S., Renaud, Y., Vaury, C., & Brasset, E.. Transcriptional properties and splicing of the flamenco piRNA cluster. // EMBO Reports, 2014. /5(4), 411-8.

38. Greil, F., van der Kraan, I., Delrow, J., Smothers, J., de Wit, E., Bussemaker, H. et al. Distinct HP1 and Su(var)3-9 complexes bind to sets of developmentally coexpressed genes depending on chromosomal location. // Genes Development, 2003, 22: 2825-2838.

39. Grewal, S.c& Elgin, S. Heterochromatin: new possibilities for the inheritance of structure. //Curr. Opin. Genet. Dev., 2002, 12: 178-187.

40. Gunawardane, L.S., K. Saito, K.M. Nishida, K. Miyoshi, Y. Kawamura, T. Nagami, H. Siomi, and M.C. Siomi. A slicer-mediated mechanism for repeat-associated siRNA 5' end formation in Drosophila. //Science. 2007. 315:1587-1590.

41. Handler, D., Meixner, K., Pizka, M., Lauss, K., Schmied, C., Gruber, F. S., & Brennecke, J. The genetic makeup of the Drosophila piRNA pathway. //Molecular Cell, 2013. 50(5), 762-77.

42. Hansen L. J., Chalker D. L., Orlinsky K. J., Sandmeeyer S. B. Ty3 GAG3 and POL genes encode the components of intracellular particles. //J. Virol., 1992, V. 66, P. 1414-1424.

43. Havecker, E., Gao, X.& Voytas, D. The diversity of LTR retrotransposons. //Genome Biology. 2004. 5: 225.

44. Honda, S.& Selker, E. Direct interaction between DNA methyltransferase DIM-2 and HP1 is required for DNA methylation in Neurospora crassa. // Mol. Cell Biol., 2008. 28: 6044-6055.

45. Horwich, M.D., C. Li, C. Matranga, V. Vagin, G. Farley, P. Wang, and P.D. Zamore. The Drosophila RNA methyltransferase, DmHenl, modifies germline piRNAs and single-stranded siRNAs in RISC. //Curr. Biol. 2007. 17:1265-1272.

46. Huszar T.c& Imler J.-L. Chapter 6 Drosophila Viruses and the Study of Antiviral HostDefense. //Advances in Virus Research, 2008, V. 72: 227-265.

47. Humphreys D.T., B.J. Westman D.I. Martin, and T. Preiss. MicroRNAs controltranslation initiation by inhibiting eukaryotic initiation factor 4E/cap and poly(A) tail function. // Proc Natl Acad Sci U S A 2005. 102: 16961-6

48. Ipsaro J.J., Haase A.D., Knott S.R., JoshuaTor L., Hannon G.J. The structural biochemistry of Zucchini implicates it as a nuclease in piRNA biogenesis. //Nature 2012. 491: 279-283.

49. Ishizu H., Siomi H., & Siomi M. C.. Biology of PlWI-interacting RNAs: new insights into biogenesis and function inside and outside of germlines. // Genes & Development, 2012. V. 26(21), 2361-73.

50. Jacobs, S.c& Khorasanizadeh, S. Structure of HP1 chromodomain bound to a lysine 9-methylated histone H3 tail. // Science, 2002, 295: 20802083.

51. Jaenisch, R. Germ line integration and Mendelian transmission of the exogenous Moloney leukemia virus. // PNAS, 1976, 73: 1260-1264 .

52. Jaenisch, R., Jahner, D., Nobis, P., Simon, I., Lohler, J., Harbers, K. et al. Chromosomal position and activation of retroviral genomes inserted into the germ line of mice.//Cell, 1981,24: 519-529.

53. James, T.& Elgin, S. Identification of a nonhistone chromosomal protein associated with heterochromatin in Drosophilamelanogaster and its gene. // Mol. Cell Biol., 1986, 6: 3862-3872.

54. Jern, P.<£ Coffin, J. Effects of Retroviruses on Host Genome Function. //Annual Review of Genetics, 2008, 42: 709-732.

55. Jordan, 1.& McDonald, J. Evidence for the Role of Recombination in the Regulatory Evolution of Saccharomyces cerevisiae Ty Elements. // Journal of molecular evolution, 1998,47: 14-20.

56. Jurka, J., Kohany, O., Pavlicek, A., Kapitonov, V.& Jurka, M. Clustering, duplication and chromosomal distribution of mouse SINE retrotransposons. // Cytogenet Genome Res, 2005, 110: 117-123.

57. Kellum R, Alberts BM Heterochromatin protein 1 is required for correct chromosome segregation in Drosophila embryos. // J Cell Sci. 1995. 108(Pt 4), 1419-1431.

58. Kim, A., Belyaeva, E.& Aslanian, M. Autonomous transposition of gypsy mobile elements and genetic instability in Drosophilamelanogaster. II Molecular Genetics and Genomics, 1990, 224: 303-308.

59. Kim, A., Lyubomirskaya, N., Belyaeva, E., Shostack, N.c£ Ilyin, Y. The introduction of a transpositionally active copy of retrotransposon GYPSY into the Stable Strain of Drosophilamelanogaster causes genetic instability. //Molecular Genetics and Genomics , 1994, 242: All-All.

60. Kim, a, Terzian, C., Santamaria, P., Pelisson, a, Purd'homme, N., & Bucheton, a. (1994). Retroviruses in invertebrates: the gypsy retrotransposon is apparently an infectious retrovirus of Drosophila melanogaster. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 91(4), 12859.

61. Klattenhoff, C., Xi, H., Li, C., Lee, S.c£ Xu, J. The Drosophila HP1 homologue Rhino is the piRNA pathway, required for transposon silencing and piRNA production by dual strand clusters. //Cell, 2009.

62. Kwon, S. H., & Workman, J. L.. HPlc casts light on dark matter. //Cell Cycle. 2011a, 10(4), 625-630.

63. Kwon, S. H., & Workman, J. L.. The changing faces of HP1: From heterochromatin formation and gene silencing to euchromatic gene expression: HP1 acts as a positive regulator of transcription. // BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology, 2011 b. 33(4), 2809.

64. Lachner, M., O'Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K.c£ Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 protein. // Nature, 2001, 410: 116-120.

65. Le Thomas A, Rogers AK, Webster A, Marinov GK, Liao SE, Perkins EM, Hur JK, Aravin AA, Toth KF Piwi induces piRNA-guided transcriptional silencing and establishment of a repressive chromatin state. //Genes Dev 2013. 27: 390-399

66. Leblanc P., Desset S., Dastugue B., Vaury C. Invertebrate retroviruses: ZAM a new candidate in D.melanogaster. // EMBO J., 1997, 16:7521-31.

67. Lee, D. H., Li, Y., Shin, D.-H., Yi, S. A., Bang, S.-Y., Park, E. K., ... Kwon, S. H. DNA microarray profiling of genes differentially regulated by three heterochromatin protein 1 (HP1) homologs in Drosophila. // Biochemical and Biophysical Research Communications, 2013. 434(4), 820-828.

68. Lee Y. S., Nakahara K., Pham J. W., Kim K., He Z., Sontheimer E. J., and Carthew*R. W. Distinct Roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA Silencing Pathways. //Cell, April 2, 2004. 117. 69-81,

69. Levine MT, McCoy C, Vermaak D, Lee YCG Phylogenomic Analysis Reveals Dynamic Evolutionary History of the Drosophila Heterochromatin Protein 1 (HP1) Gene Family. // PLoS Genetics, 2012, 8: el002729.

70. Li, C., V.V. Vagin, S. Lee, J. Xu, S. Ma, H. Xi, H. Seitz, M.D. Horwich, M. Syrzycka, B.M. Honda, et al. Collapse of germline piRNAs in the absence of Argonaute3 reveals somatic piRNAs in flies. // Cell. 2009.137:509521. doi: 10.1016/j.cell.2009.04.027

71. Lin, S.Y., Johnson, S.M., Abraham, M., Vella, M.C., Pasquinelli, A. Gamberi, C., Gottlieb, E., and Slack, F.J. (2003). The C elegans hunchback homolog, hbl-1, controls temporal patterning and is a probable microRNA target. Dev. Cell 4, 639-650.

72. Liu, Q., Rand, T.A., Kalidas, S., Du, F., Kim, H.E., Smith, D.P., and Wang, X. R2D2, a bridge between the initiation and effector steps of the Drosophila RNAi pathway. // Science. 2003. 301, 1921-1925.

73. Lippman, Z., & Martienssen, R. (2004). The role of RNA

interference in heterochromatic silencing. // Nature, 431(7006), 364-70.

74. Llave, C., Xie, Z., Kasschau, K.D., and Carrington, J.C. (2002). Cleavage of Scarecrow-like mRNA targets directed by a class of Arabidopsis miRNA. // Science 297,2053-2056.

75. Malone, C.D., and GJ. Hannon. 2009. Small RNAs as guardians of the genome.//Cell. 136:656-668. doi:10.1016/j.cell.2009.01.045

76. Malone, C.D., J. Brennecke, M. Dus, A. Stark, W.R. McCombie, R. Sachidanandam, and G.J. Hannon. 2009. Specialized piRNA pathways act in germline and somatic tissues of the Drosophila ovary. //Cell. 137:522-535.

77. Mevel-Ninio, M., Pelisson, A., Kinder, J., Campos, A.& Bucheton, A. The flamenco Locus Controls the gypsy and ZAM Retroviruses and Is Required for Drosophila Oogenesis. // Genetics, 2007, 175: 1615-1624.

78. Marques, J.& Carthew, R. A call to arms: coevolution of animal viruses and host innate immune responses. I I TRENDS in Genetics, 2007, 23: 359-364.

79. Martin, S. Nucleic acid chaperone properties of ORFlp from the non-LTR retrotransposon, LINE-1. // RNA Biology, 2010, 7: 706-711.

80. McDonald, J., Matyunina, L., Wilson, S., King Jordan, I., Bowen, N.c£ Miller, W. LTR retrotransposons and the evolution of eukaryotic enhancers. // Genetics and Evolution, 1997, 6: 3-13 .

81. Meehan, R., Kao, C.& Pennings, S. HP1 binding to native chromatin in vitro is determined by the hinge region and not by the chromodomain //EMBO. 2003. 22: 3164-3174.

82. Meignin, C., Bailly, J.-L., Arnaud, F., Dastugue, B.c£ Vaury, C. The

5' Untranslated Region and Gag product of Idefix, a Long Terminal Repeat-Retrotransposon from Drosophila melanogaster, Act Together To Initiate a Switch between Translated and Untranslated States of the Genomic mRNA // Molecular and Cellular Biology. 2003. 23: 8246-8254 .

83. Minervini, C., Marsano, R., Casieri, R, Fanti, L., Caizzi, R., Pimpinelli, S. et al. Heterochromatin protein 1 interacts with 5'UTR of transposable element ZAM in a sequence-specific fashion // Gene. 2007. 393: 110.

84. Moshkovich, N., & Lei, E. P. HP1 recruitment in the absence of argonaute proteins in Drosophila // PLoS Genetics. 2010. 6(3)

85. Mugnier, N., Biemont, C.& Vieira, C. New Regulatory Regions of Drosophila 412 Retrotransposable Element Generated by Recombination // Molecular biology and evolution. 2005. 22: 747-757.

86. Nabirochkin, S., Ossokina, M., Heidmann, T.A Nuclear Matrix/Scaffold Attachment Region Co-localizes with the Gypsy Retrotransposon Insulator Sequence // Journal of Biological Chemistry. 1998. 273: 2473-2479.

87. Nakayama, J., Rice, J., Strahl, B., Allis, C.& Grewal, S. Role of histone H3 lysine 9 methylation in epigenetic control of heterochromatin assembly// Science. 2001. 292: 110-113.

88. Nefedova, L.N., Romanova, N.I., Kim A.I. Structural characterization of the DIP J gene in Drosophila melanogaster strains mutant for the flamenco gene// Genetica. 2007. 43: 70-77

89. Nefedova, L.N., Potapova, M.V., Romanova, N.I., Kim A.I. Analisis of the structure and expression of the DIP 1 gene gene in Drosophila

melanogaster strains mutant for the flamenco gene// Genetica. 2009. 45: 203208

90. Nefedova, L.N. & Kim, A.I. Molecular Phylogeny and Systematics of Drosophila Retrotransposons and Retroviruses// Molecular Biology. 2009. 43: 747-756

91. Nishimasu H, Ishizu H, Saito K, Fukuhara S, Kamatani MK, Bonne fond L,Matsumoto N, Nishizawa T, Nakanaga K, Aoki J, et al. Structure and function of Zucchini endoribonuclease in piRNA biogenesis// Nature. 2012. 491:284-287.

92. Olovnikov, I. A., Adyanova, Z. V., Galimov, E. R., Andreev, D. E., Terenin, I. M., Ivanov, D. S., Dmitriev, S. E. Key role of the internal 5'-UTR segment in the transcription activity of the human LI retrotransposon// Molecular Biology// 2007. 41(3), 453^158.

93. Palatnik, J.F., Allen, E., Wu, X., Schommer, C., Schwab, R., Carrington, J.C., and Weigel, D. Control of leaf morphogenesis by microRNAs// Nature. 2003. 425: 257-263.

94. Pelisson, A., Emeline Sarot, E., Payen-Groschene, G.& Bucheton, A. A Novel Repeat-Associated Small Interfering RNA-Mediated Silencing Pathway Downregulates Complementary Sense gypsy Transcripts in Somatic Cells of the Drosophila Ovary//Journal of Virology. 2007. 81: 1951-1960 .

95. Perrini, B., Piacentini, L., Fanti, L., Altieri, F., Chichiarelli, S., Berloco, M. et al. HP1 controls telomere capping, telomere elongation, and telomere silencing by two different mechanisms in Drosophila!I Mol Cell. 2004. 15:467-76.

96. Pham, J.W., Pellino, J.L., Lee, Y.S., Carthew, R.W., and Sontheimer, E.J. (2004). A Dicer-2-dependent 80S complex cleaves targeted mRNAs during

RNAi in Drosophila II Cell. 117: 83-94.

97. Potapova, M.V., Nefedova, L.N. & Kim, A.I. Analysis of the structure and expression of the claster of the Drosophila melanogaster genes DIP1, CG32500, CG32819, CG14476 in the flamenco gene region// Genetica. 2009. 45: 1324-1331

98. Prud'homme, S., Oriol, G.& Mallet, F. A Retroviral Promoter and a Cellular Enhancer Define a Bipartite Element Which Controls env ERVWE1 Placental Expression//Journal of Virology. 2004. 78: 12157-12168.

99. Reinhart, B.J., Slack, F.J., Basson, M., Pasquinelli, A.E., Bettinger, J.C., Rougvie, A.E., Horvitz, H.R., and Ruvkun, G. The 21-nt let-7 RNA regulates developmental timing in C. elegansll Nature. 2000. 403: 901-906

100. Robert, V., Prud'homme, N., Kim, A., et al. Characterisation of the flamenco region of the Drosophila melanogaster genome// Genetics. 2001. 158: 701-713

101. Rozhkov NV, Hammell M, Hannon GJ 2013. Multiple roles for Piwi in silencing Drosophila transposons// Genes Dev. 27: 400-412

102. Sackton, T.& Hartl, D. Meta-analysis reveals that genes regulated by the Y chromosome in Drosophila melanogaster are preferentially localized to repressive chromatin// Genome Biol Evol. 2013. 5: 255-266.

103. Saito, K., K.M. Nishida, T. Mori, Y. Kawamura, K. Miyoshi, T. Nagami, H. Siomi, and M.C. Siomi. Specific association of Piwi with rasiRNAs derived from retrotransposon and heterochromatic regions in the Drosophila genome// Genes Dev. 2006. 20:2214-2222.

104. Saito K, Ishizu H, Komai M, Kotani H, Kawamura Y, Nishida KM, Siomi H, Siomi MC Roles for the Yb body components Armitage and Yb in

primary piRNA biogenesis in Drosophila// Genes Dev. 2010. 24: 2493-2498

105. Sarot, E., G Payen-Groschene, A. Bucheton, and A. Pelisson. Evidence for a piwi dependent RNA silencing of the gypsy endogenous retrovirus by the Drosophila melanogaster flamenco gene// Genetics. 2004. 166: 1313-21.

106. Schwartzberg, P. The many faces of Src: multiple functions of a prototypical tyrosine kinase//Oncogene. 1998. 17: 1463-1468.

107. Sentmanat, M., Wang, S. H., & Elgin, S. C. R. Targeting heterochromatin formation to transposable elements in Drosophila: potential roles of the piRNA system// Biochemistry. Biokhimiia. 2013. 78(6), 562-71.

108. Shiba T., Seigo K. Retrovirus-like particles containing RNA homologous to the transposable element copia in D. melanogaster //Nature. 1983.302: 119-124.

109. Sienski G, Donertas D, Brennecke J Transcriptional silencing of transposons by Piwi and maelstrom and its impact on chromatin state and gene expression// Cell. 2012.151: 964-980

110. Smallwood, A., Esteve, P., Pradhan, S.cfc Carey, M. Functional cooperation between HP land DNMT1 mediates gene silencing// Genes Development. 2007. 21: 1169-1178.

111. Smothers, J.& Henikoff, S. The hinge and chromo shadow domain impart distinct targeting of HP 1-like proteins// Mol. Cell Biol. 2001. 21: 25552569.

112. Smothers, J.& Henikoff, S. The HP1 chromo shadow domain binds a consensus peptide pentamer//Current Biology. 2000. 10: 27-30.

113. Song, S. U., Gerasimova, T., Kurkulos, M., Boeke, J. D., Corces, V. G. An env-like protein encoded by a Drosophila retroelement: evidence that gypsy is an infectious retrovirus// Genes Dev. 1994. 8: 2046-2057.

114. Syomin BV, Kandror KV, Semakin AB, Tsuprun VL, Stepanov AS Presence of the gypsy (MDG4) retrotransposon in extracellular virus-like particles//FEBS Lett. 1993. 323: 285-288.

115. Talbert, P., LeCiel, C.& Henikoff, S. Modification of the Drosophila heterochromatic mutation Brown (dominant) by linkage alterations// Genetics. 1994. 136: 559-571.

116. Tcheressiz S., Calco V., Arnaud F. et al. Expression of the Idefix retrotransposon in early follicle cells in thegermarium of Drosophila melanogaster is determined by its LTR sequences and a specific genomic context// Mol. Genet. Genomics. 2002. 267: 133-141.

117. Thomas, }.& Schneider, S. Coevolution of retroelements and tandem zinc finger genes// Genome research. 2011. 11: 1800-1812.

118. Van de Lagemaat, L., Landry, J.-R., Magerl, D.& Medstrand, P. Transposable elements in mammals promote regulatory variation and diversification of genes with specialized functions// Trends in Genetics. 2003. 19:30-36.

119. Vaury, C., A. Bucheton and A. Pelisson. The beta-heterochromatic sequences flanking the I elements are themselves defective transposable elements // Chromosoma. 1989. 98: 215-224.

120. Vermaak, D. & Malik, H. Multiple Roles for Heterochromatin Protein 1 Genes in Drosophila/! Annual Review of Genetics.2009. 43: 467-492.

121. Vermaak, D., Henikoff, S., & Malik, H. Positive selection drives the

evolution of rhino, a member of the heterochromatin protein 1 family in Drosophilall PLoS Genetetics. 2005. 1: 96-108.

122. Volpe, T., Kidner, C., Hall, I., Teng, G., Grewal, S., & Martienssen, R. Drosophila rhino encodes a femalespecific chromo-domain protein that affects chromosome structure and egg polarity// Genetics. 2001. 159: 1117-1134.

123. Wang SH, Elgin SC 2011. Drosophila Piwi functions downstream of piRNA production mediating a chromatin-based transposon silencing mechanism in female germ line// Proc. Natl. Acad. Sci. 108: 21164-21169

124. Wilson, S., Matyunina, L., & McDonald, J. An enhancer region within the copia untranslated leader contains binding sites for Drosophila regulatory proteins// Gene. 1998. 209: 239-246.

125. Yasuhara, J., & Wakimoto, B. Oxymoron no more: the expanding world of heterochromatic genes//Trends Genet. 2006. 22: 330-338.

126. Yamamoto, M. T., A. Mitchelson, M. Tudor, K. O'Hare, J. A. Davies et al. Molecular and cytogenetic analysis of the heterochromatin-euchromatin junction region of the Drosophila melanogaster X chromosome using cloned DNA sequences// Genetics. 1990. 125: 821-832.

127. Yin, H., and H. Lin. An epigenetic activation role of Piwi and a Piwi associated piRNA in Drosophila melanogaster. // Nature. 2007. 450:304308.

128. Zhang, J., & Temin, H. Retrovirus recombination depends on the length of sequence identity and is not error prone //Journal of Virology. 1994. 68:2409-2414 .

129. Zhao, T., Heyduk, T., Allis, C. D., & Eissenberg, J. C.. Heterochromatin protein 1 binds to nucleosomes and DNA in vitro// The Journal

of Biological Chemistry 2000. 275(36).